AT519931A1 - Herstellung von armierter DNA - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von in rekombinanten Viruspartikeln armierter doppelsträngiger rekombinanter DNA durch Klonierung einer heterologen doppelsträngigen DNA-Sequenz in den Polylinker eines viralen Transfervektors, Co-Transfektion des so modifizierten Vektors zusammen mit linearisierter DNA des Virus in eine Wirtszellkultur zur Rekombination und Ausbildung von die heterologe DNA-Sequenz enthaltenden rekombinanten Viruspartikeln, dadurch gekennzeichnet, dass als viraler Transfervektor und als linearisierte DNA von einem Baculovirus stammende DNA-Komponenten eingesetzt werden und vor dem Klonieren der heterologen rekombinanten DNA-Sequenz die Polyhedrin-Promotorsequenz aus dem Baculovirus-Vektor entfernt wird, um nach der Co-Transfektion die Expression von Proteinen in den Wirtszellen zu verhindern und in der Wirtszellkultur "budded", d.h. geknospte, rekombinante Baculoviruspartikel entstehen zu lassen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von in Viruspartikeln armierter doppelsträngiger DNA.

STAND DER TECHNIK

Molekulargenetische Tests zur Analyse von Nucleinsäuren zählen in zahlreichen klinischen und Analysenlaboratorien inzwischen zum Standardprozedere. Nach der Extraktion von Nucleinsäuren aus klinischen Proben werden DNA- oder RNA-Stücke typischerweise mittels PCR oder RT-PCR amplifiziert und anschließend mittels diverser Verfahren zur Quantifizierung oder Sequenzvariation weiter analysiert. Um verlässliche und reproduzierbare Ergebnisse zu liefern, erfordern solche molekulargenetische Tests Vergleichsproben oder Kontrollen, die Nucleinsäuren enthalten, die zielspezifische positive Signale erzeugen, sowie negative Kontrollen und Reagenskontrollen, die keine positiven Signale ergeben. Die Kontrollproben werden als externe Kontrollen ("ECs") neben den Patientenproben laufen gelassen. Zur DNA-Quantifizierung werden positive Kontrollen in abgestuften Mengen als Standards eingesetzt (Heid et al., "Realtime quantitative PCR", Genome Res. 6(10), 986-994 (1996)).

Molekulargenetische Tests zum Nachweis und zur Quantifizierung von pathogenspezifischen Nucleinsäuren werden mit nicht zielspezifischen Nucleinsäuren als interne Amplifikationskontrollen ("ICs") komplementiert, die gemeinsam mit den Patientenproben - und zwar mit diesen vermischt - analysiert werden, um auf potenzielle Hemmung der Amplifikation zu testen. Je nach Konstruktionsweise der ICs können diese entweder mit denselben Primern wie das Pathogen-Ziel, d.h. kompetitiv, oder auch mittels eines eigenen Primersatzes amplifiziert werden. In molekulargenetischen Pathogentests sind ICs obligatorisch, da nur durch ihren Einsatz klar zwischen falschnegativen und tatsächlich negativen Testergebnissen unterschieden werden kann (Hoofar et al., "Making internal amplification control mandatory for diagnostic PCR", J. Clin. Microbiol. 41(12), 5835 (2003)).

Idealerweise sollten Kontrollen und Standards die folgenden Eigenschaften besitzen: Die Materialien dürfen für den Menschen nicht infektiös sein und während ihrer Herstellung und Verwendung keinerlei biologisches Risiko darstellen. Die Konstrukte müssen in klinischen Proben und unter den verschiedensten Bedingungen während der Lagerung und beim Transport stabil sein. Außerdem sollten molekulargenetische Tests mit solchen Kontrollen und Standards zur Gänze, d.h. von der DNA-Extraktion bis zur Amplifikation und zur Analyse, kontrolliert werden können. Und schließlich sollten Kontrollen und Standards in einfacher Weise und kostengünstig herstellbar sein, um ausreichende Mengen zu erschwinglichen Kosten bereitstellen zu können.

Abgesehen von der Gewinnung von sowohl ECs als auch ICs aus klinischen Proben, im Handel erhältlichen viralen oder bakteriellen Präparaten, aus definierten Zeillinien oder aus Patientenproben (z.B. aus bezüglich eines bestimmten Pathogens positiven Patientenproben für positive ECs), wobei die erhältlichen Mengen zumeist stark limitiert sind und zudem je nach Charge des Ausgangsmaterials starken Schwankungen unterliegen, können positive Kontrollen auch aus Plasmid-DNA oder RNA-Konstrukten erhalten werden, Letzteres beispielsweise nach In-vitro-Transkription (Stocher et al., "A simple approach to the generation of heterologous competitive internal Controls for real-time PCR assays on the LightCycler", J. Clin. Virol. 25 Suppl. 3, 47-53 (2002); Stocher und Berg, "Removal of template DNA from cRNA preparations by combined oligo(dT) affinity chromatography and DNase I digestion", Biotechniques 36(3), 480482 (2004)). Ungeschützte DNA- oder RNA-Konstrukte können sich allerdings während der Lagerung zersetzen und neigen auch in klinischen Proben vor der Nuclein-säureextraktion zur Zersetzung, weswegen sie üblicherweise erst nach der Nuclein-säureextraktion zugesetzt werden und somit nicht während des gesamten PCR-Tests zur Verfügung stehen.

Zur Verbesserung der Stabilität und Vereinfachung der Handhabung wurden ECs und ICs für RNA-Tests unter Anwendung von MS2-Bakteriophagen-Technologie hergestellt. Durch In-vitro-Transkription und -Translation wurde zielspezifische RNA mit entsprechenden viralen Kernproteinen ummantelt, wodurch so genannte "armierte" RNA erhalten wurde (Pasloske et al., "Armored RNA technology for production of ribonuclease-resistant viral RNA Controls and Standards", J. Clin. Microbiol. 36(12), 35903594 (1998)). Armierte RNA hat sich als beständig gegenüber Abbau durch RNase erwiesen und zeigte in klinischen Proben hohe Stabilität über mehrere Wochen. Unter

Verwendung von armierter RNA als IC können molekulargenetische Tests zur Gänze kontrolliert werden (Pasloske et al. 1998, s.o.; Walker-Peach et al., "Ribonuclease-resistant RNA Controls (armored RNA) for reverse transcription-PCR, branched DNA, and genotyping assays for hepatitis C virus", Clin. Chem. 45(12), 2079-2085 (1999)).

Zur Herstellung von DNA-Kontrollen mit gegenüber ungeschützter DNA erhöhter Stabilität wurden DNA-Konstrukte in diversen Arten von Phagen, wie z.B. T7-Bakteriopha-gen, Lambda-Phagen und filamentösen Phagen, verpackt (Pham et al., "Use of lambda phage DNA as a hybrid internal control in a PCR-enzyme immunoassay to detect Chlamydia pneumoniae", J. Clin. Microbiol. 36(7), 1919-1922 (1998); Stocher und Berg, "Internal control DNA for PCR assays introduced into lambda phage particles exhibits nuclease resistance", Clin. Chem. 50(11), 2163-2166 (2004); Dreier et al., "Use of bacteriophage MS2 as an internal control in viral reverse transcription-PCR assays", J. Clin. Microbiol. 43(9), 4551-4557 (2005); Gotsch etal., "Nuclease-resistant single-stranded DNSA Controls for nucleic acid amplification assays", J. Clin. Microbiol. 45(8), 25-2574 (2007); Meng et al., Nuclease-resistant double-stranded DNA Controls or Standards for hepatitis B virus nucleic acid amplification assays", Virol. J. 6, 226 (2009)). Obwohl die diversen Phagenkonstrukte in Lagerpuffern über längere Zeit stabil blieben und gegenüber DNase-Abbau geschützt waren, wurde in klinischen Proben wie etwa menschlichem Serum und Plasma eine auf nur wenige Tage begrenzte Stabilität festgestellt (Stocher und Berg, s.o.; Meng et al., s.o.). Außerdem waren manche dieser Konstrukte, wie z.B. jene in filamentösen Phagen, nur einzelsträngig und waren daher in Amplifikationstests mit doppelsträngiger DNA nur bedingt vergleichbar (Gotsch et al., s.o.).

Vor Kurzem wurde über die In-vitro-Verpackung von doppelsträngiger DNA in MS2-Viren-Kapside berichtet. Diese Konstrukte waren in fötalem Kälberserum über längere Zeit stabil, was gegenüber anderen DNA-Phagenkonstrukten eine deutliche Verbesserung darstellte (Zhang et al., "A novel method to produce armored double-stranded DNA by encapsulation of MS2 viral capsids", Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 70477057 (2015)). Nichtsdestotrotz ist Stabilität von derartig in ein virales Kapsid verpackter doppelsträngiger DNA ziemlich begrenzt.

Ziel der Erfindung war vor diesem Hintergrund die Bereitstellung einer neuen Verfahrens zur Herstellung heterologe doppelsträngige DNA enthaltender rekombinanter Viruspartikel mit gegenüber den bekannten Ausführungsformen erhöhter Stabilität.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Dieses Ziel erreicht die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von in rekombinanten Viruspartikeln armierter doppelsträngiger rekombinanter DNA durch Klonierung einer heterologen doppelsträn-gigen DNA-Sequenz in den Polylinker eines viralen Transfervektors, Co-Transfektion des so modifizierten Vektors zusammen mit linearisierter DNA des Virus in eine Wirtszellkultur zur Rekombination und Ausbildung von die heterologe DNA-Sequenz enthaltenden rekombinanten Viruspartikeln, wobei das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass als viraler Transfervektor und als linearisierte DNA von einem Baculovirus stammende DNA-Komponenten eingesetzt werden und vor dem Klonieren der heterologen rekombinanten DNA-Sequenz die Polyhedrin-Promotorsequenz aus dem Baculovirus-Vektor entfernt wird, um nach der Co-Transfektion die Expression von Proteinen in den Wirtszellen zu verhindern und in der Wirtszellkultur "budded", d.h. geknospte, rekombinante Baculoviruspartikel entstehen zu lassen.

Die Erfinder der gegenständlichen Erfindung haben nämlich überraschenderweise festgestellt, dass geknospte rekombinante Baculoviruspartikel, in denen eine heterologe doppelsträngige DNA verpackt und dadurch "armiert" ist, im Vergleich zum Stand der Technik außerordentlich hohe Stabilität aufweisen und dadurch für verschiedene, eingangs erwähnte Anwendungen bestens geeignet sind.

Diese Erkenntnis warangesichts der Tatsache besonders überraschend, dass die aus dem Stand der Technik bekannten natürlichen Baculoviruspartikel durchwegs Okklusionskörperchen ("occlusion bodies", OB) sind, die in aller Regel eine deutlich höhere Stabilität als die jeweiligen geknospten Viruspartikel ("budded") aufweisen und in der Natur der Verbreitung des Virus auf den nächsten Wirt dienen. Somit konnte der Fachmann zwar erwarten, dass durch die Verwendung von Baculoviren anstelle von weniger stabilen Virusfamilien wie Bakteriophagen rekombinante Viruspartikel mit höherer Stabilität erhältlich sein würden. Dass allerdings auch geknospte rekombinante Viruspartikel außerordentlich hohe Stabilität zeigen würden - und das sogar in HumanPlasma und -Serum, wie die späteren Beispiele belegen, obwohl Baculoviren in der Natur ausschließlich wirbellose Tiere (vor allem Insekten und insbesondere Mottenlarven) befallen - war hingegen äußerst überraschend.

In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die geknospten rekombinanten Baculoviruspartikel in einfacherWeise aus dem Überstand der Wirtszellkultur gewonnen.

Als Wirtszellkultur wird weiters vorzugsweise eine Insektenzelllinie in Kombination mit einem Baculovirus-Expressionssystem - ohne die Protein-Expressionskomponente, d.h. den Polyhedrin-Promotor - verwendet, zumal solche Expressionssysteme seit Jahren erprobt und im Handel erhältlich sind.

In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung durch das Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung erhältliche rekombinante Baculovirus-Partikel bereit, die eine heterologe doppelsträngige rekombinante DNA enthalten, und in einem dritten Aspekt der Erfindung die Verwendung solcher rekombinanter Baculovirus-Partikel in einem Verfahren zur DNA-Amplifikation oder -Analyse, vorzugsweise in PCR-, Hybridierungs-oder Sequenzierungs-Verfahren. Aufgrund ihrer hohen Stabilität sind die erfindungsgemäßen geknospten rekombinanten Baculovirus-Partikel in solchen Verfahren beispielsweise hervorragend als Referenzmaterial, Quantifizierungsstandard, Qualitätsstandard oder Rund-/Ringversuchsproben geeignet.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Nachstehend wird die vorliegende Erfindung anhand von nichteinschränkenden Beispielen und unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher beschrieben, die Folgendes darstellen.

Fig. 1 zeigt das Ergebnis der Elektrophorese des in den Beispielen verwendeten Ba-culovirus-Transfervektors pBacPAK8Ph_ mit deletierter Polyhedrin-Promotorsequenz.

Fig. 2 zeigt die PCR-Resultate der gemäß vorliegender Erfindung Baculovirus-armier-ten DNA;

Fig. 3 zeigt das Ergebnis eines mit der erfindungsgemäß Baculovirus- (BV-) armierten DNA durchgeführten Tests auf ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber DNase I;

Fig. 4 zeigt das Ergebnis eines mit der erfindungsgemäß armierten DNA durchgeführten Tests auf ihre Stabilität in Human-Plasma und -Serum;

Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der Verwendung der BV-armierten DNA als interne Kontrolle in PCR-Versuchen; und

Fig. 6 zeigt die Vektor-Karte des in Fig. 1 gezeigten Transfervektors.

BEISPIELE

Als Modell für das erfindungsgemäße Verfahren wurden rekombinante Viruspartikel des am besten untersuchten Baculovirus, Autographa californica multicapsid nucleo-polyhedrovirus (AcMNPV), hergestellt. Dabei wurden in Beispiel 1 Legionella-DNA, die als interne Kontrolle (IC) für legionellenspezifische PCR verwendet wird, und in Beispiel 2 ein DNA-Fragment, das die Prothrombinmutation 2021OA trägt und somit als Kontrolle in Tests auf die Prothrombinmutation G20210A dient, in einen entsprechenden baculoviralen Transfervektor kloniert.

Allgemeine Vorgangsweise

Zur Erzeugung rekombinanter BV-Partikel in denen DNA-Kontrollfragmente für molekulargenetische Tests als armierte DNA enthalten sind, wurde das BacPAK™-Baculo-virus-Expressionssystem (Takara-Clontech) verwendet. Proteinexpression des BV wurde durch Entfernung der Polyhedrin-Promotorsequenz des Transfervektors pBAc-PAK8 verhindert. Dies ergab den Vektor pBacPAK8Ph'. In BV-Partikel einzukapselnde DNA-Fragmente wurden in die den Polylinker von pBacPAK8Ph' kloniert und zur Rekombination und Produktion von rekombinanten BV zusammen mit linearisierter BV-DNA in SF21-Insektenzellen transfiziert. Überstände der mit der BV-DNA transfizierten SF21-Zellkulturen wurden geerntet, und die erhaltenen rekombinanten BV-Partikel als Kontrollen in klinischen bzw. analytischen PCRs näher untersucht. Dabei wird die DNase-Resistenz und die Kurzzeit- und Langzeitstabilität in menschlichem Plasma und menschlichem Serum bei verschiedenen Temperaturen gezeigt.

Klonierungsverfahren PCR-Fragmente wurden gemäß den Angaben des Herstellers in pCRII-TOPO (Thermo Fisher Scientific, Deutschland) kloniert. DNA-Restriktionen wurden gemäß den Angaben des Herstellers mithilfe von EcoRI, BsaBI und BamHI (New England Bio-Labs) mittels Inkubation über 1 bis 4 h bei 37 °C durchgeführt. Das Abstumpfen von klebrigen Enden wurde mithilfe des Quick Blunting Sets (New England BioLabs) durchgeführt, und Ligationen wurden mit dem Quick Ligation Set (New England BioLabs) vorgenommen, beides gemäß den Herstellerempfehlungen. Kompetente E. co//-Zellen (DH5a oder TOP10F', ThermoFisher Scientific) wurden mit 1 pl Ligationsgemisch hitzeschocktransformiert und auf Standard-LB-Agaroseplatten, ergänzt mit Ampicillin (50 pg/ml), ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden Klone ausgewählt und in 1 ml oder 8 ml Flüssigkulturen (Standard-LB-Medium mit 50 pg/ml Ampicillin) in einem geschüttelten Wasserbad bei 225 U/min und 37 °C über Nacht expandiert. Transformierte Bakterien wurden bei -70 °C in flüssigem Stickstoff gelagert. DNA-Präparierung

Plasmid-DNA wurde mithilfe des QIAprep Spin Miniprep-Plasmidsets (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Herstellerempfehlungen aus Bakterienkulturen mit bis zu 5 ml präpariert. DNA-Extrakte aus SF21-Kulturüberständen oder aus Analyseproben wurden auf dem MagNA Pure LC 2.0 Instrument unter Verwendung des MagNA Pure LC LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche, Wien, Österreich) durchgeführt, und die Elution wurde auf 50 μΙ eingestellt. DNA-Extraktion wurde ebenfalls auf dem QIAcube-Instrument unter Verwendung des QIAmp-DNA-Blut-Minisets gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. DNA-Konzentrationen wurden mittels Spektralphotometrie auf einem NanoPhotometer (Implen, München, Deutschland) bei λ 260 nm und λ 280 nm bestimmt. Plasmid-DNA und Proben-DNA wurden bei -20 °C gelagert.

Erzeugung rekombinanter Baculovirus-Partikel

Rekombinante BV-Partikel wurden unter Verwendung des modifizierten Transfervektors pBacPAK8Ph' (siehe "Ergebnisse") und des BacPAK™-Baculovirus-Expressions-systems (Takara-Clontech, Frankreich) im Wesentlichen gemäß den Angaben des

Herstellers mittels Co-Transfektion von verdauter BacPAK6-Virus-DNA und des entsprechenden pBacPAK8Ph'-Plasmids in die Insektenzelllinie SF21 hergestellt. Die SF21 -Zellen wurden in T25-Gewebekolben (Greiner, Österreich) in komplettem Grace-Medium, ergänzt mit 50 pg/ml Gentamycin (LifeTechnologies), bei 27 °C an der Luft gezüchtet. Für die Transfektionsversuche wurden die Zellen in 6-Well-Platten (Greiner) fast bis zur Konfluenz gezüchtet. Dann wurde das komplette Grace-Medium durch 1,5 ml Grace-Basismedium ersetzt. Das Transfektionsgemisch (100 μΙ), das pBac-PAKPh’ mit dem entsprechenden Insert (500 ng), 5 pl BacPAK8-Virus-DNA und 4 μΙ Bacfectin (Takara-Clontech) enthielt, wurde zu den Zellen zugetropft und diese 5 h lang bei 27 °C inkubiert. Danach wurden 1,5 ml komplettes Grace-Medium zugesetzt, und die Zellen wurden 3 d lang gezüchtet. Danach wurde der Überstand entfernt, und 1 ml davon wurde zu frischen, fast bis zur Konfluenz gezüchteten SF21-Zellen in 6-Well-Platten zugesetzt. Nach 2 d wurden die Zellen in einen T25-Kolben (Greiner) übertragen, komplettes Grace-Medium wurde zugesetzt, und sie wurden bis zur Konfluenz gezüchtet. Die Überstände wurden entfernt, bei 4 °C gelagert oder bei -70 °C in flüssigem Stickstoff in komplettem Grace-Medium mit 20 % DMSO eingefroren. Mit BV infizierte SF21-Zellen wurden gemäß den Angaben des Herstellers eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert.

Echtzeit-PCR PCR-Reaktionen wurden entweder auf einem LightCycler 2.0 (LC2.0) (Roche) oder auf einem Cobas-z480-Cycler (z480) (Roche) durchgeführt. BV-spezifische qPCR wurde mit BacA- und Bac2-Primer (Tabelle 1) auf einem Light-Cycler-2.0-lnstrument (LC2.0) durchgeführt. Fast Start DNA Master SYBR Green (Roche) wurde zu 4 mmol MgCb mit jeweils 0,2 pmol/l pro Primer zugesetzt. PCR wurde in 20-pl-Kapillaren (18 μΙ Mastermix und 2 μΙ Proben-DNA) durchgeführt. Das Zyklieren erfolgte 7 min lang bei 95 °C, gefolgt von 40 Zyklen von 0 s bei 95 °C, 10 s bei 62 °C und 20 s bei 72 °C. Das Schmelzen wurde 1 min lang bei 95 °C, 1 min lang bei 57 °C und 2 min lang bei 50 °C durchgeführt, gefolgt von einer Temperaturerhöhung auf 95 °C mit einer Rate von 0,2 °C/min. PCR-Produkte wurden durch kurzes

Zentrifugieren aus den Kapillaren gewonnen und über Standard-Agarosegelelektro-phorese analysiert. Für BV-Stabilitätsversuche wurde qPCR auf dem z480 in 96-Well-Platten unter Verwendung von 20 pl Mastermix MM480 (Roche, Wien, Österreich) und 5 μΙ ProbenDNA durchgeführt. Der Mastermix wurde jeweils mit 0,4 μΜ LegF- und LegR-Primern und 0,2 μΜ NeoTaq-Sonde (siehe Tabelle 1) ergänzt. Die Amplifikation erfolgte 10 min lang bei 95 °C, gefolgt von 45 Zyklen von 15 s bei 95 °C, 15 s bei 58 °C, 15 s bei 65 °C und 20 s bei 72 °C.

Klinische Legionellen-spezifische PCR wurde wie beschrieben auf einem LC2.0 durchgeführt (Raggam et al., "Qualitative detection of Legionelia species in bronchoalveolar lavages and induced sputa by automated DNA extraction and real-time polymerase chain reaction", Med. Microbiol. Immunol. 191(2), 119-125 (2002)). BV-Leg-IC wurde vor der DNA-Extraktion zugesetzt. Fast Start DNA Master-Hybridisierungssonden (Roche) wurden verwendet und jeweils zu 4 mM MgCb mit jeweils 0,2 pmol/l pro Primer (LegF und LegR) und 0,2 pmol/l Neo-spezifischen FRET-Hybridisierungssonden zugesetzt (siehe Tabelle 1). PCR wurde mit 15 μΙ Mastermix und 5 μΙ Proben-DNA durchgeführt. Die Amplifikation erfolgte 10 min lang bei 95 °C, gefolgt von 55 Zyklen mit 3 s bei 95 °C, 10 s bei 60 °C, 15 s bei 72 °C. Danach wurde das Schmelzen der Sonde 1 min lang bei 95 °C, 1 min bei 50 °C, 20 s bei 40 °C überwacht, gefolgt von Erhitzen auf 82 °C mit einer Rate von 0,2 °C/s. In manchen PCR-Reaktionen wurden die BV-spezifischen Primer anstelle der Legionellen-spezifischen Primer verwendet (siehe Tabelle 1). Die Genotypisierung der Prothrombin-Genmutation G20210A erfolgte gemäß den Arbeitsvorschriften von van den Bergh et al., "Rapid Single-tube geno-typing of the Factor V Leiden and Prothrombin mutations by real-time PCR using dual-color detection", Clin. Chem. 46, 1191-1195 (2000), auf einem LC2.0.

Sequenzierung

Die DNA-Sequenzierung wurde mittels BigDye®-Standard-Terminationstechnologie durchgeführt. Amplicons wurden mit ExoSAP-Lösung (Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland) versetzt. Sequenzierungsprodukte wurden unter Verwendung des

BigDye®-Terminatorsets v3.1 mit 0,5 μΜ der Primer mit dem folgenden Temperaturprotokoll erzeugt: 60 s Vorheizen auf 96 °C, gefolgt von 25 Zyklen mit 10 s bei 96 °C, 5 s bei 54 °C und 90 s bei 60 °C. Die Sequenzanalyse wurde auf einem ABI-3130-Instrument (Applied Biosciences, Darmstadt, Deutschland) gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Vorwärts gerichtete und reverse Sequenzen wurden mithilfe der SeqScape-Analysesoftware, v2.6, abgeglichen und analysiert. DNAse-l-Resistenz

Plasmid-DNA (pBacPAK8Ph’-Leg-IC) oder rekombinante BV-Leg (~ 1000 Kopien) wurde in 50 μΙ PCR-reinem Wasser, ergänzt mit 3 U DNase I (Qiagen) und RDD-Puffer (10x) 60 min lang bei 37 °C inkubiert. Die Volumen wurden auf 200 μΙ eingestellt, Proben wurden DNA-Extraktion unterzogen und mittels Legionellen-spezifischer qPCR unter Verwendung von Neo-spezifischen dualen Hybridisierungssonden (siehe Tabelle 1) analysiert (Stocheret al., s.o.; Raggam et al., s.o.).

Stabilität in Plasma und Serum EDTA-Plasma und Serum wurden mit Natriumazid in einer Endkonzentration von 0,1 % ergänzt. EDTA-Plasma und Serum wurden mit BV-Leg gespickt, um die angegebenen Konzentrationen zu erreichen. Für die 7-tägige Stabilität wurden drei Aliquoten mit jeweils 0,2 ml für jeden Zeitpunkt hergestellt und bei 4 °C oder bei Raumtemperatur (RT) gehalten. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden jeweils drei Aliquoten entnommen und bei -70 °C gelagert. Alle Proben wurden in einem einzelnen Durchlauf mittels Legionellen-spezifisches qPCR getestet. Für die Langzeitstabilität über 9 Wochen wurden EDTA-Plasma und Serum mit BV-Leg gespickt und bei RT oder 4 °C gehalten. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde das gepoolte Material für 5 min auf einem Labor-Rollmischer platziert, zwei Aliquoten von je 0,2 ml wurden entnommen und bei -70 °C gelagert. Alle Proben wurden in einem einzigen Durchlauf mittels Legionellen-spezifischer qPCR getestet.

Ergebnisse

Herstellung von Baculovirus-armierter DNA

Das Plasmid pBacPAK8 wurde mit BsaBI und BamHI restriktionsverdaut, die Enden wurden abgestumpft, und das Plasmid wurde durch Ligation ringgeschlossen. Das erhaltene pBacPAK8Ph' wurde mittels PCR mit den Baculovirus-Primern BacA for und Bac2 rev, gefolgt von Agarosegelelektrophorese und Sequenzierung bestätigt (siehe Fig. 1 und die Legende unter "Figurenbeschreibung"). Die Analysen zeigten, dass die Sequenz zwischen BP 1183-1256, die die Polyhedrin-Promotorsequenz enthält, fehlte (Matsuura et al., "Baculovirus expression vectors: the requirements for high level expression of proteins, including glycoproteins", J. Gen. Virol. 68, 1233-1250 (1987); Possee und Howard, "Analysis of the polyhedron gene promotor of the Autographa California nuclear polyhedrosis virus”, Nucl. Acid Res. 15(24), 10233-10248 (1987); Ghosh et al., "The host factor polyhedrin promotor binding protein (PPBP) is involved in transcription from baculovirus polyhedrin gene promotor", J. Virol. 72(9), 7484-7493 (1998)).

Anschließend wurde in Beispiel 1 eine bekannte IC für Legionellen-spezifische PCR als erstes Beispiel zur Erzeugung von BV-armierter DNA eingesetzt (Raggam et al., s.o.). Die IC wurde in die EcoRI-Stelle von pBacPAK8Ph' kloniert, und BV-Partikel wurden in SF21-Zellen erzeugt. Nach der zweiten Passage wurde aus den Überständen DNA präpariert, gefolgt von Baculovirus- (mit den Primern BacA for und Bac2 rev) und Legionellen-spezifischer PCR mit den Neo-Sonden (siehe Tabelle 1), was BV-armierte IC-DNA (BV-Leg) in hoher Ausbeute ergab. Der Überstand von scheintransfizierten SF21-Zellen zeigten kein Amplifikationssignal, weder bei der Legionellen-spe-ifischen, noch bei der Baculovirus-spezifischen PCR (siehe Fig. 2a und "Figurenbe-schreibung"). Zudem lieferte die Verwendung der pBacPAK8Ph -Vektor-DNA ohne Insert kein Legionellen-IC-spezifisches Amplifikationssignal. Dies zeigt, dass die IC-spe-zifische Neo-Sequenz sowie die Legionellen-PCR-spezifischen Primersequenzen in BV-Leg vorhanden waren.

Um zu untersuchen, ob die BV-armierte DNA als Standard für qPCR verwendet werden kann, erfolgte eine 10fache Reihenverdünnung von BV-Leg, wonach aus jeder

Probe DNA präpariert und Legionellen-spezifischer qPCR unterzogen wurde (siehe Fig. 2b und "Figurenbeschreibung"). Unter Verwendung von Kreuzpunkt- (CP-) Werten und linearer Regression wurde der Fehler von der LightCycler-Software mit 0,016 berechnet. Dies zeigt, dass BV-Leg reihenverdünnt werden kann, und BV-armierte DNA als Standard oder zur Kalibrierung in qPCR eingesetzt werden kann.

Als ein zweites Beispiel für eine BV-armierte DNA-Kontrolle wurde in Beispiel 2 eine mutierte Kontrolle für Tests auf die Prothrombinmutation G20210A unter Verwendung von Schmelzkurven zur Genotypisierung hergestellt. Die mutierte Sequenz wurde durch EcoRI-Verdau aus pCRII-TOPO ausgeschnitten und in die EcoRI-Stelle von pBacPAK8Ph' kloniert, und BV-Partikel wurden wie oben beschrieben hergestellt, um die BV-FII-Homo-Kontrolle zu erhalten. Die Wirksamkeit dieser Kontrolle wurde in einem entsprechenden Schmelzkurven-PCR-Test bewertet (siehe unten). DNase-l-Resistenz

Um die Nucleaseresistenz zu testen, wurde BV-Leg-armierte DNA aus Beispiel 1 einem DNase-l-Verdau unterzogen. Dieser zeigte, dass BV-Leg-armierte DNA von DNase I nicht abgebaut wird (siehe Fig. 3 und "Figurenbeschreibung"). Im Gegensatz dazu verringerte sich die Menge an gereinigter pBacPAK8Ph -DNA, die das Leg-IC-Fragment enthielt, um etwa 10 Größenordnungen. Bemerkenswerterweise kam es zu keiner Verschiebung der CP-Werte zwischen scheinbehandeltem BV-Leg und mit DNase I behandelter, BV-Leg-armierter DNA (Fig. 3).

Stabilität von BV-armierter DNA

Zur Bestimmung der Stabilität wurde die BV-Leg-armierte DNA anfänglich in menschlichem EDTA-Plasma und -Serum bei 4 °C und RT 7 d lang untersucht. Bei Verwendung von etwa 500 Kopien von BV-Leg aus Beispiel 1 war über 7 d hinweg kein Verlust an qPCR-Aktivität in Serum und Plasma zu beobachten - weder bei 4 °C noch bei Raumtemperatur (siehe Fig. 4A und 4B und "Figurenbeschreibung"). Die Varianzkoeffizienten zwischen den Proben in dreifacher Ausführung lagen im Bereich von 5 % bis etwa 15 % in Plasma bei 4 °C und RT und von etwa 5 % bis etwa 20 % in Serum bei 4 °C und RT (Daten nicht dargestellt).

Die Langzeitstabilität von BV-Leg wurde über einen Zeitraum von 9 Wochen untersucht. Bei Spickung von EDTA-Plasma und -Serum mit etwa 1200 Kopien/ml von BV-Leg blieb dieses in Plasma bei 4 °C und bei RT über den gesamten Zeitraum hinweg stabil (siehe Fig. 4C und 4D und "Figurenbeschreibung"). In Serum wurde die Stabilität etwa 4 Wochen lang getestet. Danach war ein gewisses Maß an Abbau zu beobachten, das bei RT ausgeprägter war als bei 4 °C.

Weiters wurde auch die Kurzzeitstabilität von BV-Leg bei 45 °C über 3 d hinweg untersucht, da dies die Standardbedingungen zur Bestätigung von Versandeignung darstellen. Bei Spickung von menschlichem Plasma mit etwa 2000 Kopien von BV-Leg war nach 3 d keinerlei Abbau zu beobachten. Im Gegensatz dazu war dieselbe Menge an BV-Leg in menschlichem Serum zu etwa 90 % abgebaut (siehe Fig. 4E und "Figurenbeschreibung"). Somit sollte ein Versand von BV-armierter DNA in EDTA-Plasma unter Standardbedingungen ohne jeglichen Materialverlust durchführbar sein.

Klinische PCR mit BV-armierten DNA-Kontrollen

Unter Anwendung des zuvor beschriebenen Verfahrens wurden zwei Beispiele für Kontrollen hergestellt. Für Legionellen-spezifische PCR wurde BV-Leg aus Beispiel 1 zu Legionellen-Proben aus dem entsprechenden Qualitätssicherungsprogramm (Instand e.V., Düsseldorf, Deutschland) zugesetzt. Danach wurde aus den Proben DNA präpariert unterzogen und mittels Legionellen-spezifischer PCR analysiert (Raggam et al., s.o.). Die PCR ergab die typischen Amplifikationskurven mit BV-Leg als konkurrierende IC (siehe Fig. 5a und "Figurenbeschreibung"). Infolgedessen wiesen die Legionellen-positiven Proben einen mittelmäßigen Anstieg der Fluoreszenz der IC auf, wohingegen Proben, die bezüglich Legionellen-spezifischer DN negativ A waren, einen starken Anstieg der IC-spezifischen Fluoreszenz zeigten.

Um die BV-FII-Homo-Kontrolle aus Beispiel 2 in einem klinischen Schmelzkurven-PCR-Test zu untersuchen, wurden Reserveproben aus dem entsprechenden Qualitätssicherungsprogramm (Referenzinstitut für Bioanalytik, Bonn, Deutschland) als Vergleich herangezogen. Die Genotypisierung mittels Schmelzkurven-PCR ergab, dass das Sondenschmelzen der Bezugsproben identisch mit der BV-armierten homozygoten DNA-FIl-Kontrolle aus Beispiel 2 der Erfindung waren (siehe Fig. 5b und "Figurenbeschreibung").

Figurenbeschreibung

Figur 1

Entfernung der Polyhedrin-Promotorsequenz aus pBacPAK8.

Das Plasmid pBacPAK8 wurde mit BamHI und BsaBI verdaut, die Fragmente wurden getrennt, die Enden wurden abgestumpft, und der Vektor wurde mittels Ligation zu pBacPAK8Ph" ringgeschlossen.

Fig. 1a: BV-spezifische PCR (mit den Primern BacA und Bac2) mit pBacPAK8, Wasser mit PCR-Reinheit als Blindprobe und pBacPAK8Ph.

Die Produkte wurden mittels 3 % Agarose-Gelelektrophorese aufgelöst; MG, Molekulargewichtsmarker.

Fig. 1 b: Screenshot des Elektropherogramms der Sequenzierung von pBacPAK8Ph'. PCR und Sequenzierung wurden mit den Primern BacA for und Bac2 rev durchgeführt und zeigten die Deletion der BP 1183-1256; Nummerierung gemäß dem Benutzerhandbuch des BacPAK™-Baculovirus-Expressionssystems (Takara-Clontech).

Figur 2

Fig. 2a: Echtzeit-PCR von BV-armierter DNA. BV-armierte, Leg/oneZ/a-spezifische IC-DNA (BV-Leg) aus Beispiel 1 wurde aus dem Überstand der transfizierten SF21-Zellen gewonnen, einer DNA-Reinigung unterzogen und mittels qPCR auf einem LightCycler 2.0 unter Verwendung von Baculovirus-spe-zifischen Primern (BacA for und Bac2 rev für Bac-PCR) oder LegZoneZZa-spezifischen Primern (LegF und LegR für Leg-PCR) amplifiziert. Die Neo-FRET-Hybridisierungs-sonden wurden für die Fluoreszenzdetektion der Neo-Sequenz verwendet. Der Screenshot zeigt die Amplifikationskurven. Als negative Kontrollen wurden DNA, die aus dem Überstand von scheintransfizierten SF21-Zellen gewonnen wurde, und DNA von pBacPAK8Ph' verwendet. Wasser mit PCR-Reinheit wurde als Reagenskontrolle eingesetzt.

Fig. 2b: Amplifikationskurven einer 10fach reihenverdünnten Probe der BV-Leg-IC. BV-Leg aus Beispiel 1 wurde in menschlichem Plasma verdünnt, und Proben wurden einer DNA-Extraktion und Legionellen-spezifischer qPCR mit Neo-Hybridisierungssonden auf dem LightCycler 2.0 unterzogen. Lineare Regression mittels der LightCycler-Software ergab einen Fehlerwert von 0,016.

Figur 3 DNase-l-Resistenz von BV-armierter DNA. BV-armierte DNA-Leg-IC (BV-Leg) und pBacPAK8Ph -Leg-IC (Plasmid-DNA) wurden mit DNase I ("+DNase") oder ohne DNase I 1 h lang bei 37 °C inkubiert, DNA-Reini-gung unterzogen und mittels Legionellen-spezifischer qPCR analysiert. PCR-positive Kontrolle bezieht sich auf Legionellen-spezifische positive Kontrolle, PCR-negative Kontrollen bestehen aus einer negativen Kontroll-DNA und einer Reagenskontrolle, die Wasser anstelle der Proben-DNA enthielt.

Figur 4

Stabilität von BV-armierter DNA in menschlichem Plasma und Serum.

Um die Kurzzeitstabilität bei 4 °C und RT zu untersuchen, wurden Plasma (Fig. 4A) und Serum (Fig. 4B) mit etwa 500 Kopien von BV-Leg aus Beispiel 1 gespickt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben gezogen und bei -70 °C gelagert. Für die Bewertung der Langzeitstabilität bei 4 °C und RT wurden etwa 1500 Kopien/ml von BV-Leg zu Plasma (Fig. 4C) und Serum (Fig. 4D) zugesetzt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Aliquoten entnommen und bei -70 °C gelagert. Zur Bestimmung der Kurzzeitstabilität bei 45 °C (Fig. 4E) wurden etwa 2000 Kopien/ml BV-Leg zu Plasma und Serum zugesetzt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben gezogen und bei -70 °C gelagert. Danach wurde aus allen Proben DNA präpariert und mittels Legionellen-spezifischer qPCR mit Neo-Taqman-Sonden analysiert (siehe Tabelle 1).

Figur 5

Fig. 5a: Verwendung von BV-Leg-IC in Legionellen-spezifischer PCR.

Screenshots zeigen die Amplifikationskurven der Legionellen-spezifischen Amplifikation (linkes Bild) und die für die spezifische Amplifikation der internen Kontrolle (rechtes

Bild). Die PCR wurde im konkurrierenden Duplex-Modus durchgeführt. Es sei erwähnt, dass der Anstieg der Fluoreszenz der Amplifikation der internen Kontrolle bei den Legionellen-positiven Proben aufgrund von Konkurrenz abgeflacht erscheint.

Fig. 5b: Homozygote BV-FII-Kontrolle aus Beispiel 2 in einem klinischen Test zur Bestimmung der Prothrombin-Genmutation A22023G.

Screenshot der Schmelzkurven nach Echtzeit-PCRaufdem LightCycler 2.0. Schmelztemperaturen: homozygote Fl l-Kontrolle, 54,25 °C; heterozygote Probe 54,23 °C und 61,16 °C; drei Proben von homozygotem BV-FII 54,20 °C, 54,25 °C, 54,26 °C; Fll-Wildtypkontrolle 61,09 °C, zwei Wildtypproben 61,10 °C, 61,15 °C.

Figur 6

Vektorkarte von pBacPAK8Ph'.

Die Karte wurde anhand der ursprünglichen pBacPAK8-Vektorkarte (Takara-Clontech) und den eigenen Sequenzdaten der Erfinder erstellt. Die Nummerierung der Restriktionsstellen wurde genau wie die Modifikation des Polylinkers entsprechend der Deletion der Basenpaare 1183-1256 angepasst.

Tabelle 1 Oligonucleotide

Name Sequenz Verweis

BacA for TGA GAC GCA CAA ACT AAT ATC AC GenBank Acc #: U02446

Bac2 rev CAA CAA CGC ACA GAA TCT AGC GenBank Acc #: U02446

LegF AGG GTT GAT AGG TTA AGA GC Raggam et al. 2002

LegR CCA ACA GCT AGT TGA CAT CG Raggam et al. 2002

Leg-Fla GTG GCG AAG GCG GCT ACC T Raggam et al. 2002

Leg-LCb TAC TGA CAC TGA GGC ACG AAA GCG T Raggam et al. 2002

NeoFL TGC ATA CGC TTG ATC CGG CT Stocher & Berg 2004b kurz68°Ca

NeoLCR CCT GCC CAT TCG ACC ACC AAG Stocher & Berg 2004b 705kurzc

Neo-Taqd CCT GCC CAT TCG ACC ACC AAG Stocher & Berg 2004b F2-vor CCG CTG GTA TCA AAT GGG van den Bergh et al. 2000 F2-rev CCA GTA GTA TTA CTG GCT CTT CCT G van den Bergh et al. 2000 F2-FL-wta CTC AGC GAG CCT CAA TG van den Bergh et al. 2000 F2-LC-Anker-Lb TCC CAG TGC TAT TCA TGG GCA GCT C van den Bergh et al. 2000 a Oligonucleotid, am 3‘-Ende markiert mit Fluorescein b Oligonucleotid, am 5‘-Ende markiert mit LC-Red640 und phosphoryliert am 3‘-Ende c Oligonucleotid, am 5‘-Ende markiert mit LC-Red705 und phosphoryliert am 3‘-Ende d Oligonucleotid, am 5‘-Ende markiert mit 6-FAM und am 3‘-Ende mit Black Hole Quencher-1

Diskussion

Unter Verwendung des BacPAK-Baculovirus-Expressionssystems (Takara-Clontech) wurde BV-armierte DNA hergestellt. Zuerst wurde das Plasmid pBacPAK8 modifiziert, um die Proteinexpression zu deaktivieren. Dazu wurde Sequenzabschnitt von BP1183 bis BP1256, der den Polyhedrin-Promotor umfasst, mittels Restriktionsverdau und Re-ligation entfernt (Matsuura et al., s.o.). Dieses Entfernen wurde mittels Elektrophorese dargestellt und durch Sequenzieren bestätigt (siehe Fig. 1). Somit wurde die Expression klonierter DNA-Fragmente in pBacPAK8Ph aufgrund der Entfernung der Polyhe-drin-Promotorsequenz deaktiviert. Die Entfernung der Sequenz führte zur Deletion der BamHI-Restriktionsstelle des Polylinkers, die sich davor am 3‘-Terminus des Polyhe-drin-Promotors befand. Alle weiteren Restriktionsstellen des Polylinkers wurden beibehalten, was das Klonieren einer Vielzahl von restringierten DNA-Fragmenten ermöglichte (siehe Fig. 6). Die gemäß vorliegender Erfindung klonierten Kontrollfragmente wiesen eine Größe von etwa 350 BP (IC-Leg aus Beispiel 1) und 310 BP (mutierte Fll-Kontrolle aus Beispiel 2) auf. Gemäß den Herstellerinformationen können jedoch um vieles größere Fragmente mit bis zu 25 KBP in pBacPAK8 kloniert werden. Somit sollte es möglich sein, mithilfe dieses modifizierten Baculovirus-Proteinexpressions-systems Baculovirus-armierte DNA verschiedenster Größe herzustellen.

Nach der Co-Transfektion von linearisierter defekter Baculovirus-DNA und in pBac-PAK8Ph' klonierter DNA in SF21-Zellen enthielten die Zellkulturüberstände nach 3 d Kultivierung ausreichende Mengen an geknospten rekombinanten BV-Partikeln. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die nahezu 100%ige Rekombinationseffizienz zwischen dem Transfervektor und der defekten Baculovirus-DNA zurückzuführen, weswegen eine Selektion bezüglich der rekombinanten BV-Partikel als überflüssig erachtet wurde (Kitts und Possee, "A method for producing recombinant baculovirus expression vec-tors at high frequency", Biotechniques 14, 810-817 (1993)). Das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene virale Material war nicht klonal. Allerdings lieferte die Verwendung der erfindungsgemäßen BV-Kontrollen in den PCR-Tests stets homogene Ergebnisse. Falls gewünscht, kann Klonalität des viralen Materials mittels Plaquereinigung und Infektion frischer SF21-Zellen erzielt werden. DNA aus den erhaltenen armierten DNA-Partikeln konnte ohne weiteres durch das klinische DNA-Routineextraktionsverfahren der Arbeitsgruppe der Erfinder extrahiert werden, wie dies für von Phagen abgeleitete Kontroll-DNA berichtet wurde (Stocher und Berg, s.o.; Meng et al., s.o.; Zhang et al., s.o.). Außerdem konnte aus BV-armier-ten DNA-Partikeln extrahierte DNA ohne weiteres als IC und EC in den analytischen molekulargenetischen Tests amplifiziert werden (siehe die Fig. 5a und 5b).

Haltbarkeitsversuche in menschlichem Plasma und Serum zeigten eine Kurzzeitstabilität über 7 d bei 4 °C und RT (siehe die Fig. 4A und 4B). In menschlichem Plasma wurde eine Langzeitstabilität bei 4 °C und bei RT über 9 Wochen hinweg beobachtet (siehe die Fig. 4C und 4D). In menschlichem Serum jedoch war nach 4-wöchiger Inkubation Abbau zu beobachten, der bei RT ausgeprägter war als bei 4 °C (siehe die Fig. 4C und 4D). Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung wurde die eingangs erwähnte in MS2-Phagen armierte DNA weder in menschlichem Plasma noch in menschlichem Serum getestet, sondern in fötalem Kälberserum, das mitunter eine andere Proteaseaktivität als menschliches Serum oder menschliches Plasma aufweist. Verglichen mit Berichten über in Phagen armierte DNA (Stocher und Berg, s.o.; Meng et al., s.o.) hat sich gezeigt, dass die gemäß vorliegender Erfindung erhaltene BV-armierte DNA in menschlichem Serum und in menschlichem Plasma sowohl bei 4 °C als auch bei RT eine merklich längere Stabilität aufwies.

Die Tests auf Stabilität bei Standardversandbedingungen ergab in menschlichem EDTA-Plasma eine Stabilität für 3 d. Im Gegensatz dazu wurde herausgefunden, dass etwa 90 % der BV-armierten DNA in menschlichem Serum nach drei Tagen bei 45 °C abgebaut waren (siehe Fig. 4E). Dies zeigt, dass BV-armierte DNA in EDTA-Plasma unter Standardbedingungen verschickt werden kann, wohingegen BV-armierte DNA in Serum entweder bei 4 °C oder gefroren verschickt werden muss.

Somit stellt die vorliegende Erfindung die Herstellung von doppelsträngiger, heterolo-ger, armierter DNA in geknospten Baculovirus-Partikeln bereit. Die erhaltene BV-armierte DNA konnte ohne weiteres mittels klinischer DNA-Standardextraktionsverfahren extrahiert werden, wies in klinischen PCR-Tests eine vorteilhafte Linearität und

Wirksamkeit auf, war gegenüber DNase-l-Verdau resistent und wies verglichen mit Phagen-armierter DNA eine deutlich erhöhte Stabilität in menschlichem Plasma und Serum auf. Somit sollte BV-armierte DNA in molekulargenetischen Tests als EC, Quantifizierungsstandards und IC Anwendung finden können, wobei letztere Anwendung die vollständige Überwachung der Eignung der Proben in klinischen molekulargenetischen Tests ermöglicht. Schließlich kann erfindungsgemäß BV-armierte DNA auch verwendet werden, um doppelsträngige DNA-Bezugs- bzw. -Referenzmaterialien zu erzeugen, z.B. für Qualitätssicherungs- und Materialstandardisierungsprogramme, wie sie bei verschiedenen Gesundheitsorganisationen, wie z.B. der WHO, in Gebrauch sind. BV ist zudem für Säugetiere nicht infektiös, weswegen erfindungsgemäß BV-armierte DNA weniger strengen Versandbedingungen unterliegen sollte als klinische Proben.

Claims (7)

1. PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zur Herstellung von in rekombinanten Viruspartikeln armierter dop pelsträngiger rekombinanter DNA durch Klonierung einer heterologen doppelsträngi-gen DNA-Sequenz in den Polylinker eines viralen Transfervektors, Co-Transfektion des so modifizierten Vektors zusammen mit linearisierter DNA des Virus in eine Wirtszellkultur zur Rekombination und Ausbildung von die heterologe DNA-Sequenz enthaltenden rekombinanten Viruspartikeln, . dadurch gekennzeichnet, dass als viraler Transfervektor und als linearisierte DNA von einem Baculovirus stammende DNA-Komponenten eingesetzt werden und vor dem Klonieren der heterologen rekombinanten DNA-Sequenz die Polyhedrin-Promotorsequenz aus dem Baculovirus-Vektor entfernt wird, um nach der Co-Transfektion die Expression von Proteinen in den Wirtszellen zu verhindern und in der Wirtszellkultur "budded", d.h. geknospte, rekombinante Baculoviruspartikel entstehen zu lassen.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die geknospten rekombinanten Baculoviruspartikel aus dem Überstand der Wirtszellkultur gewonnen werden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Wirtszellkultur eine Insektenzelllinie in Kombination mit einem Baculovirus-Expressionssystem verwendet wird.
4. 4. Rekombinante Baculovirus-Partikel, die eine heterologe doppelsträngige DNA enthalten und nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erhältlich sind.
5. 5. Verwendung von heterologe doppelsträngige DNA enthaltenden rekombinanten Baculovirus-Partikeln nach Anspruch 4 in einem Verfahren zur DNA-Amplifikation oder -Analyse.
6. 6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ein PCR-, Hybridierungs- oder Sequenzierungs-Verfahren ist.
7. 7. Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinanten Baculovirus-Partikel als Referenzmaterial, Quantifizierungsstandard, Qualitätsstandard oder Rund-/Ringversuchsproben eingesetzt werden. Wien, am* Hl Mai 2W Kepler Univers^tätsklinikum GmbH vertreten du^ch Di|/ tigUX A. Kolar Ausweis Nr. 396 Häupl & Ellmeyer KG Patentanwaltskanzlei