CN100379861C - 核酸扩增或检测用试剂的稳定化方法和保存方法 - Google Patents

核酸扩增或检测用试剂的稳定化方法和保存方法 Download PDF

Info

Publication number
CN100379861C
CN100379861C CNB028158156A CN02815815A CN100379861C CN 100379861 C CN100379861 C CN 100379861C CN B028158156 A CNB028158156 A CN B028158156A CN 02815815 A CN02815815 A CN 02815815A CN 100379861 C CN100379861 C CN 100379861C
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleotide
amplification
primer
dna
ribonucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB028158156A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1541267A (zh
Inventor
佐川裕章
上森隆司
向井博之
山本纯子
友野润
小林英二
榎龙嗣
浅田起代藏
加藤郁之进
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takara Bio Inc
Original Assignee
Takara Bio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takara Bio Inc filed Critical Takara Bio Inc
Publication of CN1541267A publication Critical patent/CN1541267A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100379861C publication Critical patent/CN100379861C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Abstract

利用嵌合寡核苷酸引物高灵敏度并特异地扩增样品中目标核酸所用的反应试剂的稳定化方法，及该反应试剂的长期保存方法；以及致病微生物和病毒的高灵敏度检测方法。

Description

核酸扩增或检测用试剂的稳定化方法和保存方法
技术领域
本发明涉及稳定和保存反应试剂的方法，所述反应试剂用于扩增和/或检测目标核酸的方法，所述目标核酸在遗传工程和临床医学领域是有用的。
背景技术
DNA合成在遗传工程领域的研究中可被用于多种用途。除短链DNA(如寡核苷酸)合成以外，大部分DNA合成采用酶法进行，其中利用了DNA聚合酶。典型方法是如美国专利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159所详细描述的聚合酶链反应(PCR)方法。另一个实例是如Trends in Biotechnology，10：146-152(1992)所描述的逆转录-PCR(RT-PCR)方法。
可选地，也可采用如EP320,308所描述的连接酶链反应(LCR)方法，或者如PCR Protocols，Academic Press Inc.，1990，pp.245-252所描述的以转录为基础的扩增体系(TAS)。上述四种方法需在高温和低温重复反应若干次，以再生下一个扩增循环所需的单链目标分子。由于反应受限于上述温度，所以应采用不连续相或循环来处理该反应体系。因此，这些方法需利用昂贵的热循环装置，该装置可随时间精确调节宽范围的温度。此外，该反应需要时间将温度调节至二或三个预定温度。损失时间的增加与循环数成比例。
为解决这些难题，已研究出可恒温进行核酸扩增的方法。其实例包括如JP-B 7-114718所描述的链替代扩增(SDA)方法、自维持序列复制(3SR)方法、如日本专利No.2650159所描述的以核酸序列为基础的扩增(NASBA)方法、转录介导的扩增(TMA)方法、如日本专利No.2710159所描述的Qβ复制酶方法，以及如美国专利No.5,824,517，WO 99/09211、WO 95/25180和WO 99/49081所描述的多种改良SDA方法。美国专利No.5,916,777描述了一种恒温酶促合成寡核苷酸的方法。在这种恒温扩增核酸或合成寡核苷酸方法的反应中，起自引物的延伸和/或将引物退火至单链延伸产物(或至原始目标序列)，继而从该引物的延伸平行地发生于恒温温育的反应混合物中。
在恒温核酸扩增方法当中，SDA方法是最终扩增DNA的体系中的一个实例。SDA方法是采用DNA聚合酶和限制性内切核酸酶，通过取代双链，扩增样品中目标核酸序列(和其互补链)的方法。该方法需四个用于扩增的引物，其中两个应被设计为含有供限制性内切核酸酶识别的位点。该方法需利用修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸作为大量合成DNA的底物。经过修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸的一个实例是(α-S)脱氧核糖核苷酸三磷酸，其α-位磷酸基团的氧原子被硫原子(S)所取代。如果按常规进行该反应，例如用于遗传试验，与利用该修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸相关的操作成本问题就变得严重了。此外，该方法中将修饰的核苷酸(如(α-S)脱氧核糖核苷酸)整合进扩增的DNA片段，可能破坏限制性内切酶对所扩增DNA片段的可切割性，例如，当在限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)分析中。
如美国专利No.5,824,517所描述的改良SDA方法是采用嵌合引物的DNA扩增方法，该嵌合引物由RNA和DNA组成，且作为基本要素具有DNA至少位于3’末端的结构。如WO 99/09211所描述的改良SDA方法需利用可生成3’凸出末端的限制性内切酶。如WO95/25180所描述的改良SDA方法需利用至少两对引物。如WO99/49081所描述的改良SDA方法需利用至少两对引物和至少一个修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸。另一方面，如美国专利No.5,916,777所描述的寡核苷酸合成方法包括采用3’末端具有核糖核苷酸的引物合成DNA，利用该引物完成反应，用内切核酸酶将一个缺口导入引物-延伸链的引物与延伸链之间以使其彼此分离，消化模板并回收引物以重复利用。为重复利用该方法中的引物，需从该反应体系分离出该引物，并再次将其退火至模板。此外，如WO 00/28082所描述的环介导恒温扩增(LAMP)方法需四个引物进行扩增，且该方法扩增的产物是不同大小的DNA，其中用于扩增的目标区域是重复的。
此外，采用嵌合寡核苷酸引物的恒温核酸扩增方法，如WO00/56877或WO 02/7139所描述的恒温和嵌合引物启动的核酸扩增(ICAN)方法是已知的。
由于上述方法所用的许多反应试剂在室温不稳定，因此大部分情况下试剂用于操作的同时需在冰上进行冷却。此外，由于大部分反应试剂应于4℃或以下、或-20℃或以下保存，因此需要严格注意保存方法。因而需要一种无需冰箱或制冷机，可于室温长期稳定保存反应试剂的稳定化和/或保存方法。
发明目的
本发明的主要目的是提供一种利用嵌合寡核苷酸引物高灵敏度、特异地扩增样品中目标核酸所用反应试剂的稳定化及长期保存方法，以及致病微生物或病毒的高灵敏度检测方法。
发明概述
发明人深入研究的结果是发现了一种在嵌合寡核苷酸引物、内切核酸酶和DNA聚合酶存在下扩增感兴趣的DNA区域，以检测病毒或致病微生物的高灵敏度方法。发明人进一步发现一种扩增感兴趣的DNA区域所用试剂的稳定化和长期保存方法。从而完成了本发明。
本发明的第一个方面涉及扩增和/或检测目标核酸所用反应试剂的稳定化方法，包括：
(a)将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链替代活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNase H混合，以制备反应混合物，其中的引物是与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补，并含有核糖核苷酸，以及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中至少一种的嵌合寡核苷酸引物，所述核糖核苷酸位于引物3’末端或3’末端一侧；和
(b)通过温育该反应混合物足以生成反应产物的时间以扩增目标核酸，
其中
(i)至少一种选自镁盐、嵌合寡核苷酸引物和酶(DNA聚合酶和/或RNase H)的试剂组分在反应前是与其它试剂组分分离的；及
(ii)含酶的试剂溶液的酶浓度被提高了，而该溶液的盐浓度未被提高，且另一试剂溶液的盐浓度被调整，以使彼此分离的试剂溶液混合后可达到扩增步骤所需的最佳盐浓度。
根据第一个方面，反应试剂可由两种试剂溶液组成：含嵌合寡核苷酸引物的试剂溶液；含酶(DNA聚合酶和/或RNase H)和镁盐的试剂溶液。含酶(DNA聚合酶和/或RNase H)的试剂溶液的盐浓度可等于或低于扩增步骤所需最佳盐浓度。含酶(DNA聚合酶和/或RNase H)的试剂溶液的酶浓度可高于扩增步骤所需酶浓度。含酶(DNA聚合酶和/或RNase H)的试剂溶液的酶浓度可被调整，以使彼此分离的试剂溶液混合后达到扩增步骤所需的最佳酶浓度。
本发明的第二个方面涉及扩增和/或检测目标核酸所用反应试剂的试剂盒，包括：
(a)将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链替代活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNase H混合，以制备反应混合物，其中的引物是与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补，并含有核糖核苷酸，以及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中至少一种的嵌合寡核苷酸引物，所述核糖核苷酸位于引物3’末端或3’末端一侧；和
(b)通过温育该反应混合物足以生成反应产物的时间以扩增目标核酸，
其中
(i)至少一种选自镁盐、嵌合寡核苷酸引物和酶(DNA聚合酶和/或RNase H)的试剂组分在反应前是与其它试剂组分分离的；及
(ii)含酶的试剂溶液的酶浓度被提高了，而该溶液的盐浓度未被提高，且另一试剂溶液的盐浓度被调整，以使彼此分离的试剂溶液混合后可达到扩增步骤所需的最佳盐浓度。
根据第二个方面，反应试剂可由两种试剂溶液组成：含嵌合寡核苷酸引物的试剂溶液；含酶(DNA聚合酶和/或RNase H)和镁盐的试剂溶液。含酶(DNA聚合酶和/或RNase H)的试剂溶液的盐浓度可等于或低于扩增步骤所需最佳盐浓度。含酶(DNA聚合酶和/或RNase H)的试剂溶液的酶浓度可高于扩增步骤所需酶浓度。含酶(DNA聚合酶和/或RNase H)的试剂溶液的酶浓度可被调整，以使彼此分离的试剂溶液混合后达到扩增步骤所需的最佳酶浓度。该试剂盒可含有用于调节分离的试剂溶液的混合物中盐浓度的试剂。
本发明的第三个方面涉及检测样品中致病微生物和/或病毒的方法，该方法包括：
(a)将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链替代活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNase H混合，以制备反应混合物，其中的引物是与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补，并含有核糖核苷酸，以及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中至少一种的嵌合寡核苷酸引物，所述核糖核苷酸位于引物3’末端或3’末端一侧；和
(b)通过温育该反应混合物足以生成反应产物的时间以扩增目标核酸；和
(c)检测(b)步骤中扩增的目标核酸，
其中嵌合寡核苷酸引物是用于检测致病微生物的嵌合寡核苷酸引物，可由下述通式表示，且致病微生物选自结核杆菌、HCV、衣原体、鸟分枝杆菌复合体、淋球菌(gonococcus)、HBV、HIV、金黄色葡萄球菌、支原体和MRSA：
通式：5’-dNa-Nb-dNc-3’
(a：11或更大值的整数；b：1或更大值的整数；c：0或者1或更大值的整数；dN：脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物；N：未修饰的核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸，其中dNa中部分dN可被N取代，且3’末端核苷酸可被修饰，从而不发生通过DNA聚合酶作用而进行的3’末端的延伸)。
根据第三个方面，反应混合物可进一步含有嵌合寡核苷酸引物，该引物具有与作为模板的核酸的核苷酸序列基本同源的序列。
本发明的第四个方面涉及用于检测致病微生物和/或病毒的引物，该引物选自：
(1)具有选自SEQ ID NOS：7、8、21、22、162、163、170和171之一的核苷酸序列，用于检测结核杆菌的嵌合寡核苷酸引物；
(2)具有选自SEQ ID NOS：15、16、81-86和88-91之一的核苷酸序列，用于检测HCV的嵌合寡核苷酸引物；
(3)具有选自SEQ ID NOS：17-20、121-127、130-135、167和167之一的核苷酸序列，用于检测衣原体的嵌合寡核苷酸引物；
(4)具有选自SEQ ID NOS：25-31之一的核苷酸序列，用于检测鸟分枝杆菌复合体的嵌合寡核苷酸引物；
(5)具有选自SEQ ID NOS：38-63、164和165之一的核苷酸序列，用于检测淋球菌的嵌合寡核苷酸引物；
(6)具有选自SEQ ID NOS：71-78之一的核苷酸序列，用于检测HBV的嵌合寡核苷酸引物；
(7)具有选自SEQ ID NOS：95-103之一的核苷酸序列，用于检测HIV的嵌合寡核苷酸引物；
(8)具有选自SEQ ID NOS：108-117之一的核苷酸序列，用于检测金黄色葡萄球菌的嵌合寡核苷酸引物；
(9)具有选自SEQ ID NOS：139-146之一的核苷酸序列，用于检测支原体的嵌合寡核苷酸引物；以及
(10)具有选自SEQ ID NOS：152-155之一的核苷酸序列，用于检测MRSA的嵌合寡核苷酸引物；
本发明的第五个方面涉及用于检测致病微生物和/或病毒的探针，该探针选自：
(1)选自特定区域，用于检测结核杆菌的探针，所述区域含有选自SEQ ID NOS：11、12和172之一的核苷酸序列；
(2)选自特定区域，用于检测HCV的探针，所述区域含有选自SEQ ID NOS：87和92之一的核苷酸序列；
(3)选自特定区域，用于检测衣原体的探针，所述区域含有选自SEQ ID NOS：128、136和168之一的核苷酸序列；
(4)选自特定区域，用于检测鸟分枝杆菌复合体的探针，所述区域含有选自SEQ ID NOS：32和33之一的核苷酸序列；
(5)选自特定区域，用于检测淋球菌的探针，所述区域含有选自SEQ ID NOS：64-68之一的核苷酸序列；
(6)选自特定区域，用于检测HBV的探针，所述区域含有选自SEQ ID NOS：79和80之一的核苷酸序列；
(7)选自特定区域，用于检测HIV的探针，所述区域含有选自SEQ ID NOS：104和105之一的核苷酸序列；
(8)选自特定区域，用于检测金黄色葡萄球菌的探针，所述区域含有选自SEQ ID NOS：118和119之一的核苷酸序列；
(9)选自特定区域，用于检测支原体的探针，所述区域含有选自SEQ ID NOS：147-149之一的核苷酸序列；以及
(10)选自特定区域，用于检测MRSA的探针，所述区域含有选自SEQ ID NSO：156和157之一的核苷酸序列。
本发明的第六个方面涉及用于第三个方面的检测致病微生物和/或病毒方法的试剂盒，其含有第四个方面的嵌合寡核苷酸引物。
第六个方面的试剂盒可进一步含有第五个方面的探针。
附图简述
图1是显示根据本发明方法扩增的DNA片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图2是显示根据本发明方法扩增的DNA片段的实时检测图。
图3是显示用于说明本发明方法所用试剂的保存稳定性测试结果的琼脂糖凝胶电泳图。
图4是显示用于说明本发明方法所用试剂的保存稳定性测试结果的放射自显影图。
图5是显示用于说明本发明方法所用试剂的保存稳定性测试结果的琼脂糖凝胶电泳图。
图6是显示用于说明本发明方法所用试剂的保存稳定性测试结果的琼脂糖凝胶电泳图。
图7是显示根据本发明方法扩增的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图。
发明详述
本文所用脱氧核糖核苷酸(也称为dN)指其糖部分由D-2-脱氧核糖组成的核苷酸。该脱氧核糖核苷酸包括，例如，以腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶为碱基部分的脱氧核糖核苷酸。此外，该脱氧核糖核苷酸也包括含有修饰碱基，如7-脱氮鸟苷(deazaguanosine)的脱氧核糖核苷酸，和脱氧核糖核苷酸类似物，如脱氧肌苷核苷酸。
本文所用核糖核苷酸(也称为N)指其糖部分由D-核糖组成的核苷酸。该核糖核苷酸包括以腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶为碱基部分的核糖核苷酸。该核糖核苷酸也包括修饰的核糖核苷酸，如α位磷酸盐基团的氧原子被硫原子所取代的修饰的核糖核苷酸(也称为(α-S)核糖核苷酸或(α-S)N)或其它衍生物。
本发明采用的嵌合寡核苷酸引物包括其核糖核苷酸被定位于该引物3’末端或3’末端一侧、在本发明方法中可被用于延伸核酸链、可被内切核酸酶裂解、可被用于引起链替代反应的任何嵌合寡核苷酸引物。
本文所用3’末端一侧指从核酸，如引物的中心到其3’末端的部分。同样，5’末端一侧指从核酸的中心到其5’末端的部分。
嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸，以及至少一种选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的物质。这种引物也包括含有未修饰的核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸的寡核糖核苷酸引物。
本发明方法所用嵌合寡核苷酸引物具有的核苷酸序列与作为模板的核酸的一部分核苷酸序列基本互补。并有助于在所采用条件下DNA链的延伸。此外，核糖核苷酸被定位于该嵌合寡核苷酸引物3’末端或3’末端一侧。该引物通常被设计为与待扩增区域上游部分，即3’到作为模板的核酸中待扩增区域对应的核苷酸序列部分互补。本文所用“基本互补的核苷酸序列”指在所采用反应条件下可退火至作为模板DNA的核苷酸序列。
本发明方法所用嵌合寡核苷酸引物可含有一个或多个修饰的核糖核苷酸。核糖核苷酸可以是未修饰的核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸，可定位于嵌合寡核苷酸引物3’末端或3’末端一侧，且可被内切核酸酶识别或裂解。该核糖核苷酸包括上述未修饰的核糖核苷酸和修饰的核糖核苷酸。未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸或其组合均可被用作本发明的嵌合寡核苷酸引物，只要其不破坏引物功能即可。该修饰的核糖核苷酸实例包括但不仅限于：与磷酸盐基团结合的氧原子被硫原子所取代的(α-S)核糖核苷酸、核糖2位上的羟基团被甲氧基团所取代的核糖核苷酸。此外，本发明方法所用的嵌合寡核苷酸引物可含有核苷酸类似物或其它物质。即本发明的嵌合寡核苷酸引物可含有更多的核苷酸类似物，只要该引物在DNA聚合酶作用下可从3’末端开始聚合酶延伸反应的功能未破坏即可。多个类型的核苷酸类似物可被用在组合中。可被采用的核苷酸类似物的实例包括但不仅限于：脱氧肌苷核苷酸、脱氧尿嘧啶核苷酸、含修饰的碱基如7-脱氮鸟苷的脱氧核糖核苷酸类似物、含核糖衍化物的核苷酸类似物等。此外，本发明所用的嵌合寡核苷酸可含有脱氧核苷酸、核糖核苷酸或含有不同修饰，如添加标记化合物的核苷酸类似物，只要其保留上述功能即可。
将核苷酸类似物整合进引物具有抑制引物自身高级结构形成的作用，并稳定与模板形成的退火结构的作用。可出于相同目的将核糖核苷酸整合进入引物中。尽管不是用来限制本发明，但为使引物不被非特异性内切核酸酶(RNase)消化，可优选采用修饰的核糖核苷酸如(α-S)核糖核苷酸。可通过采用，例如(α-S)核糖核苷酸三磷酸获得这种含有修饰的核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物，(α-S)核糖核苷酸三磷酸是通过采用如美国专利No.5,003,097所描述的硫化反应试剂(Glen Research)，或2-OMe-RNA-CE亚磷酰胺(phosphoramidite)试剂(Glen Research)方法制备的。
本发明扩增方法可采用的嵌合寡核苷酸引物可被设计为含有修饰的核糖核苷酸，从而具有抗内切核酸酶裂解的性能。扩增反应步骤中，这种引物在控制内切核酸酶的裂解位点方面是有用的。
本发明方法所用嵌合寡核苷酸引物的长度无特定限制，但优选的约12个核苷酸到约100个核苷酸，更为优选的约15个核苷酸到约40个核苷酸。该嵌合寡核苷酸的核苷酸序列与作为模板的核酸基本互补是优选的，这样可使其在所采用反应条件下退火至作为模板的核酸。该引物3’末端或3’末端一侧含有可被内切核酸酶识别的序列，下述步骤中利用到该内切核酸酶。
虽然不是用来限制本发明，例如，本发明的DNA合成方法中，具有可由下述通式表示结构的寡核苷酸可被用作引物：
通式：5’-dNa-Nb-dNc-3’
(a：11或更大的整数；b：1或更大的整数；c：0或者1或更大的整数；dN：脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物；N：未修饰的核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸，其中dNa中部分dN可被N取代，且3’末端的核苷酸可被修饰，以使通过DNA聚合酶作用后不发生3’末端的延伸)。
本发明所用嵌合寡核苷酸引物具有特定结构，该结构中，在含核糖核苷酸位点上，内切核酸酶识别或裂解因DNA聚合酶作用延伸自引物的DNA链(引物延伸链)，其核糖核苷酸定位于该嵌合寡核苷酸引物3’末端或3’末端一侧。尽管不是用来限制本发明，例如，当RNase H作用于自嵌合寡核苷酸引物延伸DNA而生成，并可由通式表示，且已退火至作为模板的核酸的双链DNA上时，该嵌合寡核苷酸引物在其核糖核苷酸部分被裂解。从而生成了在寡核苷酸引物和延伸合成的DNA链之间导入一个缺口的双链DNA。继而由DNA聚合酶从该缺口位点进行链替代反应。因此，本发明方法可采用任何可被用于从引物3’末端延伸核酸链、可被内切核酸酶裂解、且可连同DNA聚合酶进行链替代反应的嵌合寡核苷酸引物。此外，本发明的嵌合寡核苷酸引物包括其3’末端被修饰以避免DNA聚合酶作用的延伸发生，且在由内切核酸酶裂解生成的3’末端发生DNA延伸的嵌合寡核苷酸引物。
另外，该嵌合寡核苷酸引物的5’末端一侧可包括RNA聚合酶的启动子序列。这种RNA聚合酶的实例是T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
根据亚磷酰胺方法，利用例如，Applied Biosystems Inc.(ABI)的394型DNA合成仪可合成具有预期核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。可选地，合成该嵌合寡核苷酸引物可采用包括磷酸三酯方法、H-膦酸盐方法和硫代膦酸盐方法的任何方法。
可作用于如上述自嵌合寡核苷酸引物延伸DNA而生成、并已退火至作为模板的核酸的双链DNA，并裂解延伸链以进行链替代反应的酶是可被利用的。即该酶可在双链DNA的嵌合寡核苷酸引物部分生成缺口。本发明可用内切核酸酶的实例包括但不仅限于核糖核酸酶。核糖核酸酶当中，优选采用可作用于由DNA和RNA组成的双链核酸的RNA部分的核糖核酸内切酶H(RNase H)。具有上述活性的任何核糖核酸酶均可被优选地应用在本发明中，包括嗜温核糖核酸酶和耐热核糖核酸酶。例如，如下文实施例所描述，本发明方法中，约50℃到约70℃的反应可利用来源自大肠杆菌的RNase H。耐热核糖核酸酶可被优选地应用在本发明方法中。可优选采用的耐热核糖核酸酶实例包括但不仅限于，商业可提供核糖核酸酶HybridaseTMThermostable RNase H(Epicenter Technologies)，以及来源自杆菌属嗜热细菌、栖热属细菌、火球菌属细菌、栖热袍菌属细菌、古生球菌属细菌、甲烷球菌属细菌、热球菌属细菌等的RNase H。此外，优选采用天然存在的核糖核酸酶和变异体。
不限定RNase H为特定一种，只要其可被应用在本发明方法中即可。例如RNase H可来源自多种病毒、噬菌体、原核生物或真核生物。可为细胞RNase H或者病毒RNase H。细胞RNase H的实例是大肠杆菌RNase HI，病毒RNase H的实例是HIV-1 RNase H。本发明方法可采用I型、II型或III型RNase H。例如可优选，并不限制地采用来源自大肠杆菌的RNase HI，或来源自火球菌属细菌、古生球菌属细菌或热球菌属细菌的RNase HII。
本发明方法所用内切核酸酶，如RNase H的裂解反应效率可根据引物3’末端附近的核苷酸序列而变化，且影响所需DNA的扩增效率。因此，自然要设计适合所用RNase H的最佳引物。
本文所用术语“导入缺口”或“缺口化”指在内部将双链核酸的双链之一裂解。例如，RNase H作用于由DNA和含核糖核苷酸DNA组成的混合双链核酸，以选择性地在核糖核苷酸部分裂解双链中的含核糖核苷酸链，从而将缺口导入该混合双链核酸中。
已知特定条件下，一些DNA聚合酶具有内切核酸酶活性，如RNaseH活性。本发明方法可采用这种DNA聚合酶。一方面，可在允许表达RNase H活性的条件下，如Mn2+存在下采用DNA聚合酶。该情况中，无需添加RNase H便可进行本发明方法。Bca DNA聚合酶在含Mn2+缓冲液中可表现出RNase活性。上述方面并不被限制在使用BcaDNA聚合酶。本发明可采用已知具有RNase H活性的DNA聚合酶，如来源自特莫氏属栖热嗜热菌的Tth DNA聚合酶。
因此，在可表现RNase H活性的条件下可应用具有RNase H活性的DNA聚合酶。
PCR或类似反应所用的dNTPs(dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物)可被优选地用作核苷酸三磷酸，作为该方法中延伸反应的底物。另外，dUTP也可被用作底物。dNTPs可含有如7-脱氮(deaza)-dGTP的dNTP(脱氧核糖核苷酸三磷酸)类似物，dITP或相似物的三磷酸酯，只要可充当所用DNA聚合酶的底物即可。也可采用dNTP或其类似物的衍化物。具有功能基团的衍化物，如具有氨基的dUTP也可被包括其中。该方法用到嵌合寡核苷酸引物。根据常规合成方法，例如采用DNA合成仪可制备该引物。本发明方法可采用嵌合寡核苷酸引物和常规寡核苷酸引物的组合。
本发明方法中，如果所采用酶的活性可能在反应期间降低，可在反应期间进一步添加该酶。尽管不是用来限制本发明，例如在应用RNase H的反应期间可进一步添加来源自大肠杆菌的RNase H。该添加的酶可与反应开始时反应混合物中所包含酶一致，或者是表现相同活性的不同酶。因此，待添加酶的类型或属性未被限定为特定一种，只要反应期间该添加有效果，如提高检测灵敏度，或提高扩增产物的量即可。
本文所用DNA聚合酶指以DNA链为模板重新合成DNA链的酶。该DNA聚合酶包括天然存在的DNA聚合酶和具有上述活性的变体酶。例如，这种酶包括具有链替代活性的DNA聚合酶，缺乏5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶，以及具有逆转录酶活性或内切核酸酶活性的DNA聚合酶。
本文所用“链替代活性”指可引起链替代的活性，即以作为模板的核酸序列为基础进行DNA复制，同时取代该DNA链以释放已退火至模板链的互补链。另外，由于链替代而从作为模板的核酸释放的DNA链在本文称为“取代链”。
具有在DNA上的链替代活性的DNA聚合酶是可被采用的。尤其优选采用基本缺乏5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。
本发明可采用任何具有链替代活性的DNA聚合酶。其实例包括来源自杆菌属嗜热细菌，如热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax，下文称为B.ca)和嗜热脂肪芽孢杆菌(下文称为B.st)，并缺乏其5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的变体，以及来源自大肠杆菌(E.coli)的DNA聚合酶I的大片段(Klenow片段)。嗜温和耐热DNA聚合酶均可被优选地应用在本发明中。
B.ca是最佳生长温度约为70℃的嗜热细菌。已知来源自该细菌的Bca DNA聚合酶具有DNA依赖性的DNA聚合酶活性、RNA依赖性的DNA聚合酶活性(逆转录活性)、5’→3’外切核酸酶活性和3’→5’外切核酸酶活性。该酶可以是纯化自其原始来源的酶，或者为通过遗传工程技术获得的重组蛋白质。通过遗传工程技术或其它途径可对该酶进行修饰，如替代、缺失、加成或插入。这种酶的实例包括BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)，即缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶。
根据本发明被用作模板的核酸(DNA或RNA)可以从可能含有该核酸的任何样品中制备或分离而得。可选地，根据本发明该样品可被直接应用在核酸扩增反应中。可能含有该核酸的样品实例包括但不仅限于，来源自有机体的样品，如全血、血清、白细胞、尿、粪便、脑脊髓液、精液、唾液、组织(如癌性组织或淋巴结)和细胞培养(如哺乳动物细胞培养或细菌细胞培养)、含有核酸的样品如类病毒、病毒、细菌、真菌、酵母、植物和动物、怀疑被微生物如病毒或细菌污染或感染的样品(如食品或生物配方)、以及可能含有有机物的样品如土壤或污水。该样品可以是根据已知方法加工上述样品而获得的含核酸制剂。本发明可应用的该制剂的实例包括细胞破坏产物，或通过对该产物进行分部分离而获得的样品，该样品中的核酸，或特定核酸分子如mRNA已被富集的样品。此外，优选采用通过已知方法扩增样品所含核酸而获得的核酸，如DNA或RNA。
通过利用但不限于例如洗涤剂溶解、超声处理、玻璃珠或French压榨机震荡/搅拌，从上述原料中可制备含核酸制剂。一些情况中，进一步加工该制剂以纯化该核酸是有益的(如在内源核酸酶存在的情况下)。这些情况中，利用已知方法，如苯酚提取、层析、离子交换、凝胶电泳或密度-梯度离心对核酸进行纯化。
当希望扩增具有来源自RNA的序列的核酸时，以通过逆转录反应合成的cDNA作为模板可进行本发明方法，该逆转录反应以该RNA作为模板。任何RNA，只要可为其制得可应用于逆转录反应中的引物，均适用于本发明方法，包括样品中的总RNA、RNA分子，如mRNA、tRNA、rRNA以及特定RNA分子种类。
双链DNA，例如上述分离的基因组DNA或PCR片段，单链DNA，如通过逆转录反应从总RNA或mRNA制备的cDNA，以及由DNA和RNA组成的混合双链均可被优选地作为模板核酸应用在本发明中。双链DNA变性为单链DNA后，或者未经过如此变性的双链DNA均可被优选采用。
下文将详细描述本发明。
(1)扩增或检测本发明的目标核酸所用反应试剂的稳定化和长期保存方法
根据本发明的反应试剂可被用在采用至少一种嵌合寡核苷酸引物、内切核酸酶和DNA聚合酶扩增或检测目标核酸的方法中。
本发明的反应试剂可被用在采用两种引物，即与作为模板的核酸互补的嵌合寡核苷酸引物，和与取代链互补的另一个嵌合寡核苷酸引物进行的目标核酸扩增方法中。一个引物与作为模板的DNA链结合，引起链替代反应，而另一个引物则与链替代反应所释放的取代链结合，则启动另一个链替代反应。显然如果利用这一方面，由一个引物获得的反应产物可作为另一个引物的模板。因此，随着模板数量的增加，扩增产物数量以非线性方式增加。
以双链DNA为模板，并采用两种嵌合寡核苷酸引物的方法所用反应试剂例证了另一个方面。该方法中，尽管反应试剂根据反应条件而变化，在由引物开始的延伸反应期间，可能在模板延伸的链中间体之间发生模板转移，从而生成由被彼此退火的已合成引物延伸链组成的双链核酸。该双链核酸具有位于两端的嵌合寡核苷酸引物。继而可再次从两端引发包括链替代的互补链延伸反应。反应结果生成在一个末端具有该引物序列的扩增产物。此外，如果模板转移发生在反应期间，将再次生成与上述相似的双链核酸。
本发明的反应试剂可被用在特定核酸扩增方法中，该方法包括采用具有链替代活性的DNA聚合酶进行模板转移反应的步骤。模板转移反应中，在作为模板的双链核酸存在下，合成了与相应链的核苷酸序列基本互补的两个嵌合寡核苷酸引物和具有链替代活性的DNA聚合酶，以及与模板互补的两条引物延伸链。每条引物延伸链从模板到另一条引物延伸链的模板转移发生在合成该引物延伸链期间。
本文所用模板转移反应指当通过链替代反应从双链核酸两侧合成互补链时，DNA聚合酶转换模板，并合成互补链，其后以该互补链为模板，通过另外的DNA聚合酶重新合成另一条互补链的反应。换言之，模板转移反应指采用引物和具有链替代活性的DNA聚合酶对作为模板的双链核酸进行处理，从而生成与该模板互补的延伸链的反应，其中合成引物延伸链的DNA聚合酶在合成延伸链期间，积极地将该模板从原始模板转移至另一条引物延伸链上。引起模板转移反应的DNA聚合酶的活性可根据例如下文中的参考实施例3所描述方法进行测定，但该实施例对本发明不构成限制。
本发明优选采用链替代反应期间可引发模板转移反应的DNA聚合酶。例如，尤其优选采用缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶的变体酶。商业可提供的这种酶如BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)。也可根据日本专利No.2978001所描述方法从含有该酶基因的大肠杆菌HB101/Pu1205(FERM BP-3720)制备而得。
采用本发明反应试剂的目标核酸扩增方法中，可能生成待扩增区域彼此连接的聚合物。该聚合物具有在同一方向重复的许多待扩增区域的结构。基于电泳分析扩增产物而得的规则条带可观察到该聚合物。这种聚合物的生成被认为受待扩增区域、该区域大小、侧面区域、所用嵌合寡核苷酸引物的核苷酸序列、反应条件等影响。
上述聚合物含有许多待扩增区域。例如，当检测含待扩增区域的核酸时，该聚合物是有用的，因为在采用合适探针杂交后，该聚合物可被杂交到若干探针上，从而生成加强信号。通过采用限制性内切酶或连同相似物进行消化，可从该聚合物中获得作为单体的待扩增区域或其部分。
本发明扩增核酸方法的一个特征是不需要在该核酸合成期间上下调节温度。因此，本发明提供了一种恒温合成核酸的方法。许多常规核酸扩增方法需上下调节温度以从合成链离解目标。这些方法需特定反应设备，如适用于这一用途的热循环控制装置。然而，本发明方法仅利用可保持恒温的设备即可进行。如上所述，本发明方法可于单一温度下进行。优选的是通过选择反应温度和严格水平进行该方法，以减少引物的非特异性退火，并使该引物特异地退火至作为模板的核酸上。通过利用如上所述的耐热酶可使本发明方法在高温条件下进行，这对本发明不构成限制。另外，为维持高水平反应效率，在可充分保留所用酶活性的适当温度进行本发明方法是优选的。因此，尽管该反应温度根据所用酶而变化，优选的仍为约20℃到约80℃，更为优选的约30℃到约75℃，最为优选的约50℃到约70℃。采用比正常温度下反应所用引物长的引物是优选的，尤其是在高温条件下进行该反应时。通过提高反应温度带来的效果的一个实例是解决了作为模板的DNA形成二级结构的难题。即使以高GC含量的核酸为模板，该提高的反应温度也可实现预期核酸的扩增。此外，在扩增长链长度的区域方面，这一点同样有效。在约60bp到约20kbp的范围内，尤其是在约60bp到约1500bp的范围内可观察到这种效果。
通过根据作为模板的核酸的GC含量调节反应温度，可提高扩增效率。例如，尽管反应温度取决于待扩增链长度和引物的Tm值，但如以低GC含量的核酸为模板，可在50～55℃进行本发明的扩增反应。
本发明方法中利用具有逆转录酶活性的DNA聚合酶(如BcaBEST DNA聚合酶)使得仅采用单一酶便可方便地进行包括从RNA制备cDNA的步骤、从RNA开始进行的核酸扩增。可选地，本发明方法可采用通过单独进行的从RNA制备cDNA的步骤而获得的产物作为充当模板的DNA。
每一情况中，本发明方法中的反应均重复进行直到采用适当方法终止，例如钝化酶或降低反应温度，或直到该反应缺少一种底物。
本发明扩增核酸方法可被用于多种利用核酸扩增的实验过程，包括核酸检测、标记和测序。
此外，本发明扩增核酸方法可适用于原位扩增核酸方法、在固体底物如DNA芯片上扩增核酸的方法，或同时扩增许多区域的多重核酸扩增方法。
本发明扩增核酸方法中，引物的利用效率为约100％，这可能高于常规方法如PCR的引物效率的5～10倍。
本发明的核酸扩增方法可被用于产生与模板核酸的核苷酸序列高度匹配的扩增产物。当通过对所获扩增产物的核苷酸序列进行分析，以确定本发明方法中DNA合成的出错频率时，本发明方法扩增产物发现的错误的出现频率，与已知能高匹配度扩增核酸的LA-PCR的观察结果相当。换言之，本发明方法具有与LA-PCR相当的精确度。
通过直接从含目标核酸的样品扩增该核酸，可进行检测本发明目标核酸的方法。该情况中，不限定待扩增目标核酸的链长度为特定值。例如200bp或更短的区域，优选的150bp或更短的区域有效于灵敏地检测该目标核酸。通过将本发明的嵌合寡核苷酸引物设计为如上所述待扩增的链长度，可高度灵敏地检测到样品中的目标核酸。
另外，本发明的检测方法中，通过采用以N-二甘氨酸、Tricine、HEPES、磷酸盐或tris为缓冲组分的反应缓冲液，以及含亚精胺或丙烯二胺的退火溶液，即使从痕量核酸样品中也可更为灵敏地检测出目标核酸。该情况中，未限定所用内切核酸酶和DNA聚合酶为特定某种。例如，来源自大肠杆菌、火球菌属细菌、古生球菌属细菌的RNaseH与BcaBEST DNA聚合酶的组合是优选的。应该考虑的是内切核酸酶和DNA聚合酶的优选剂量单位可根据酶的类型而变化。这种情况中，可以检测灵敏度的增加或者扩增产物量的增加作为指标，调节缓冲液的组成和所添加酶的量。
本发明检测方法中，扩增目标核酸期间，可加入dUTP作为底物。因此如以dUTP为底物，就可能通过利用尿嘧啶N-糖苷酶(UNG)降解扩增产物以避免由于扩增产物遗留污染所导致的假阳性。
一些检测核酸的已知方法也可被用于检测目标核酸。这些方法的实例包括通过电泳检测具有特定大小的反应产物、以及通过探针杂交检测。此外，可优选采用结合应用磁珠的检测方法。在目标核酸扩增步骤期间生成的焦磷酸可被转化为不溶性物质，如镁盐，便可测定其浊度。电泳检测中通常用到荧光物质，如溴化乙锭。与探针杂交也可与电泳检测结合应用。可以用放射性同位素，或无放射性物质如生物素或荧光物质标记该探针。另外，该检测步骤中利用标记核苷酸可利于检测整合有该标记核苷酸的扩增产物，或者可增强对利用标记的检测有利的信号。荧光偏振方法、荧光能量共振转移(FRET)或类似方法也可被用于这种检测。通过构造一个合适检测体系可自动或定量检测目标核酸。另外，优选采用通过杂合色谱方法以肉眼进行的检测。
本发明检测方法中，也可采用核糖核苷酸(RNA)探针，或由核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸组成的嵌合寡核苷酸探针，这些探针由定位在可导致淬火状态距离的两种或以上荧光物质标记。该探针不发出荧光。当该探针退火至与其互补、从目标核酸扩增而得的DNA时，RNase H便将该探针消化。探针上荧光物质之间的距离便延长了，导致荧光的发射。因此，该荧光发射表明了目标核酸的存在。如果本发明扩增核酸方法采用RNase H，仅通过将该探针添加至反应混合物中，便可检测目标核酸。例如，FRET的一对探针：6-羧基荧光素(6-FAM)和N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)的组合，或一对非FRET的探针：6-羧基荧光素(6-FAM)和4-(4’-二甲基氨苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)的组合，可优选地作为标记探针的荧光物质。
本发明进一步提供了在上述检测目标核酸方法中所用的探针。未限定本发明的探针为特定某种，只要在常规杂交条件下，该探针可与本发明扩增核酸方法所扩增的目标核酸杂交即可。考虑到扩增产物的特定检测，探针在特定条件，例如本领域技术人员所知的严格杂交条件下进行杂交是优选的。该严格杂交条件在，例如T.Maniatis et al.(eds.)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd ed.，1989，ColdSpring Harbor Laboratory中有所描述。特定地，该严格条件示例如下：在含有0.5％SDS、5×Denhardt’s(0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％Ficoll 400)和100μg/ml鲑鱼精子DNA的6×SSC(1×SSC：0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)中，在低于所用探针Tm的温度，约25℃下温育4小时到过夜。为利于目标核酸的检测，探针可采用如上述具有标记的探针。
本发明在恒温条件下扩增核酸的方法无需利用如热循环控制装置的设备。本发明扩增方法中所用引物的数目可为一或两个，少于常规方法中所用引物的数目。由于PCR等方法所用试剂如dNTPs也可用于本发明方法，操作成本与常规方法相比是可降低的。因此，可优选采用本发明方法，例如，在常规进行检测的遗传测试领域。在短于PCR所用时间内，本发明方法提供了比PCR所能获得量多的扩增产物。因此，本发明方法可作为一种方便、快捷、灵敏的方法用于基因检测。
就用于制备本发明方法所用反应混合物的反应试剂而言，该反应混合物中所含各个组分可被分别保存。可选地，可制备将多种组分预先混合一起的预混液以方便操作。假设是这种反应试剂，考虑到该试剂稳定性，优选制备含可抑制反应、可消除该溶液中嵌合寡核苷酸引物基本功能的组合物的预混液。该预混液优选地含有不引起嵌合寡核苷酸引物聚合和/或降解的组合物，这对本发明不构成限制。本发明方法的一种实施方案中，例如，对本发明方法所用、核酸合成反应所需并包括的预混液而言，优选排除或可逆地钝化其中至少一种组分。例如，可排除或钝化至少一种选自DNA聚合酶、嵌合寡核苷酸引物、镁盐和dNTPs的组分，这对本发明不构成限制。通过上述方法，可在任何温度下稳定本发明方法所用反应试剂。另外，为抑制酶的失活，可将这些酶(DNA聚合酶和/或RNase H)分开。
因此，本发明包括由两种预混液组成的反应试剂，即，一种含有一种分离的组分(几种分离的组分)，另一种含有其它组分。任意地，该反应试剂可由三种或以上预混液组成。
上述稳定化方法可作为长期保存本发明方法所用反应试剂的方法。无特定限制涉及长期保存的形式，例如，制备以两部分组成形式的反应试剂是优选的，即嵌合寡核苷酸引物溶液和含有酶、镁盐和dNTPs的溶液，本发明长期保存方法的一种实施方案中，反应缓冲液优选地含有盐。本文所用盐浓度指几种盐的浓度，包括缓冲组分、镁盐和调节离子强度的盐(如乙酸钾)。根据所用DNA聚合酶和RNaseH的类型可适当调节所含盐的浓度。优选调节该盐浓度达到可使酶稳定的离子强度。该情况中，采用实施例4所描述方法可最优化该盐浓度。例如，含酶的反应缓冲液的盐浓度约为反应最终盐浓度的，如5倍或低于5倍，优选3倍或低于3倍，更为优选1.5倍或低于1.5倍，该实施例对本发明不构成限制。该浓度可等于或低于反应最终盐浓度。
例如，假设采用含Bca DNA聚合酶和来源自古生球菌属细菌的RNase H的反应体系，HEPES-氢氧化钾缓冲液的浓度可大于0mM直到160mM，优选的在从30mM～120mM范围内，更为优选的在32Mm～102mM范围内，但该实施例对本发明不构成限制。如以乙酸镁为镁盐，该浓度可大于0mM直到20mM，优选的在3mM～15mM范围内，更为优选的在4mM～13mM范围内。
如采用乙酸钾调节离子强度，该浓度可大于0mM直到500mM，优选的在90mM～360mM范围内，更为优选的在100mM～317mM范围内。用于调节盐浓度的盐浓度调节试剂可被任意单独包括。
嵌合寡核苷酸引物溶液可含有一种可调节反应混合物盐浓度的盐。该情况中，通过采用两种预混液可制备反应混合物。
如果制备基因扩增反应所用试剂，通常将引物溶解于低盐溶液的无菌水(如TE缓冲液)中，且需一个必需量以制备反应混合液(见Molecular Cloning，2nd ed.，14.18)。
根据本发明，通过在引物溶液中包括一种也是反应混合物组分的盐，可使含酶的预混液的盐浓度利于稳定该(这些)酶。
本发明的长期保存方法的另一种实施方案中，反应试剂是以由两个分离部分组成的形式(即嵌合寡核苷酸引物溶液和含酶、镁盐和dNTPs的反应缓冲液)，优选提高该反应缓冲液的酶浓度。根据所用DNA聚合酶和RNase H的类型，可适当调节所含酶的浓度。该情况中，采用实施例4所描述方法可最优化该浓度。例如，假设采用含BcaDNA聚合酶和来源自古生球菌属或热球菌属细菌的RNase H的反应体系，优选提高反应缓冲液中所含酶的浓度，只要不钝化所含酶即可。
反应试剂的一种实施方案中，借助该反应试剂可根据作为模板的核酸方便地改变引物，可采用不含引物但可用于溶解引物的溶液取代该引物溶液。
另一种实施方案中，可将dNTPs，而不是将嵌合寡核苷酸引物与其它组分分离，并在考虑酶稳定性的前提下测定两种预混液的盐浓度。
根据本发明，对含酶预混液中酶浓度与盐浓度之间的关系而言，优选设定酶浓度比率大于1的同时维持盐浓度比率约为1，定义反应的最终酶或盐浓度为1。
优选的，酶浓度比率(E)/盐浓度比率(S)大于1。该比例优选的为100≥E/S＞1，更为优选的为10≥E/S＞1，最为优选的为5≥E/S＞1。
根据本发明方法可在反应试剂中添加防腐剂或抗真菌剂。可利用商业可提供的防腐剂或抗真菌剂。可优选采用的实例包括但不仅限于，叠氮化钠、对羟苯甲酸及其盐和衍化物、硫柳汞和ProClin。当然，需要确定该防腐剂或抗真菌剂的浓度不会在保存或反应期间钝化反应试剂所含酶。
根据本发明长期保存方法，可保存反应试剂约1个月或更长时间。该情况中，对保存温度无特定限制，例如，该温度为50℃或低于50℃，优选的为30℃或低于30℃。
(2)本发明检测致病微生物和/或病毒的方法所用的引物
采用本发明的核酸扩增方法可检测样品中的目标核酸。该方法包括：
(a)将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链替代活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNase H混合以制备反应混合物，其中的引物是与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补，并含有核糖核苷酸，以及至少一种选自脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物、被定位于引物3’末端或3’末端一侧的核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物；
(b)通过温育该反应混合物足以生成反应产物的时间以扩增目标核酸；和
(c)检测(b)步骤扩增的目标核酸。
(a)步骤中如以RNA为模板，便可在某一步骤中进行逆转录反应和核酸扩增反应。尽管不是用来限制本发明，例如，可优选采用AMV RTase、MMLV RTase或RAV-2 RTase和Bca DNA聚合酶的组合作为逆转录酶和链替代型DNA聚合酶的组合。
本发明检测目标核酸方法可被用于区别目标核酸的核苷酸序列中的差异。该方面中，将所用的嵌合寡核苷酸引物设计为其3’末端部分被定位在与待区分目标核苷酸序列的特定碱基接近处。例如，设计为在该特定碱基和引物的3’末端碱基之间形成氢键。如该引物3’末端的核苷酸序列和模板核苷酸序列之间存在不匹配，采用该嵌合寡核苷酸引物进行扩增反应时，便不发生从目标核酸的扩增，且不生成扩增产物。采用本方法可获得与基因中特定碱基有关的信息，如点突变或单一核苷酸多态现象(SNP)。
对本发明不构成限制的实例如，选自下列、用于检测致病微生物和/或病毒的引物可被优选地应用在本发明检测目标核酸的方法中：
(1)具有选自SEQ ID NO：7、8、21、22、162、163、170和171之一的核苷酸序列，用于检测结核杆菌的嵌合寡核苷酸引物；
(2)具有选自SEQ ID NO：15、16、81-86和88-91之一的核苷酸序列，用于检测HCV的嵌合寡核苷酸引物；
(3)具有选自SEQ ID NO：17-20、121-127、130-135、166和167之一的核苷酸序列，用于检测衣原体的嵌合寡核苷酸引物；
(4)具有选自SEQ ID NO：25-31之一的核苷酸序列，用于检测鸟分枝杆菌复合体的嵌合寡核苷酸引物；
(5)具有选自SEQ ID NO：38-63、164和165之一的核苷酸序列，用于检测淋球菌的嵌合寡核苷酸引物；
(6)具有选自SEQ ID NO：71-78之一的核苷酸序列，用于检测HBV的嵌合寡核苷酸引物；
(7)具有选自SEQ ID NO：95-103之一的核苷酸序列，用于检测HIV的嵌合寡核苷酸引物；
(8)具有选自SEQ ID NO：108-117之一的核苷酸序列，用于检测金黄色葡萄球菌的嵌合寡核苷酸引物；
(9)具有选自SEQ ID NO：139-146之一的核苷酸序列，用于检测支原体的嵌合寡核苷酸引物；以及
(10)具有选自SEQ ID NO：152-155之一的核苷酸序列，用于检测MRSA的嵌合寡核苷酸引物；
选自下列、用于检测致病微生物和/或病毒的探针可被优选地应用在本发明检测方法中：
(1)选自特定区域，用于检测结核杆菌的探针，该区域含有选自SEQ ID NO：11、12和172之一的核苷酸序列；
(2)选自特定区域，用于检测HCV的探针，该区域含有选自SEQID NO：87和92之一的核苷酸序列；
(3)选自特定区域，用于检测衣原体的探针，该区域含有选自SEQ ID NO：128、136和168之一的核苷酸序列；
(4)选自特定区域，用于检测鸟分枝杆菌复合体的探针，该区域含有选自SEQ ID NO：32和33之一的核苷酸序列；
(5)选自特定区域，用于检测淋球菌的探针，该区域含有选自SEQ ID NO：64-68之一的核苷酸序列；
(6)选自特定区域，用于检测HBV的探针，该区域含有选自SEQID NO：79和80之一的核苷酸序列；
(7)选自特定区域，用于检测HIV的探针，该区域含有选自SEQID NO：104和105之一的核苷酸序列；
(8)选自特定区域，用于检测金黄色葡萄球菌的探针，该区域含有选自SEQ ID NO：118和119之一的核苷酸序列；
(9)选自特定区域，用于检测支原体的探针，该区域含有选自SEQ ID NO：147-149之一的核苷酸序列；以及
(10)选自特定区域，用于检测MRSA的探针，该区域含有选自SEQ ID NO：156和157之一的核苷酸序列。
(3)本发明的试剂盒
本发明的试剂盒含有如上文(2)所描述的嵌合寡核苷酸引物和/或探针。本发明提供了发明扩增核酸方法或检测核酸方法适用的试剂盒。一种实施方案中，该试剂盒为有包装形式，且含有关于链替代反应中DNA聚合酶和内切核酸酶用途的说明书。本发明方法优选采用包括具有链替代活性的DNA聚合酶、内切核酸酶、用于链替代反应的缓冲液的试剂盒。可选地，可根据说明书选择或采用商业可提供的具有链替代活性的DNA聚合酶和/或内切核酸酶。另外，以RNA为模板时，该试剂盒可含有适用于逆转录反应的试剂。DNA聚合酶可从上述本发明所用DNA聚合酶中选择。内切核酸酶可从上述内切核酸酶中选择。适用于链替代反应的缓冲液可含有以N-二甘氨酸、Tricine、HEPES、磷酸盐或tris为缓冲组分的反应缓冲液，和退火溶液。此外，该试剂盒可含有修饰的脱氧核糖核苷酸或三磷酸脱氧核苷酸类似物。
“说明书”印刷有描述使用该试剂盒方法的内容，如制备适用于链替代反应的试剂溶液的方法，推荐反应条件等。该说明书包括小册或散页形式的说明手册、贴附试剂盒的标签、容纳试剂盒的包装表面的使用说明书。该说明书也包括通过电子媒介如Internet公开或提供的信息。
除说明书和扩增反应所需试剂以外，检测目标核酸方法适用的试剂盒可含有适于扩增目标核酸的嵌合寡核苷酸引物，或检测该扩增目标核酸的试剂(如探针)。以根据本发明稳定化或长期保存反应试剂方法构成的反应试剂为组分的试剂盒是优选采用的。此外，本发明试剂盒可含有充当内部对照(I.C.)、用于判断假阴性的核酸。含下列物质的典型试剂盒对本发明不构成限制：具有SEQ ID NO：170和171的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物，具有SEQ ID NO：172的核苷酸序列、用于检测结核杆菌的探针，具有SEQ ID NO：169的核苷酸序列、作为内部对照的质粒，具有SEQ ID NO：173的核苷酸序列、用于检测内部对照的探针。另一个用于检测致病微生物和/或病毒的典型试剂盒同样可含有内部对照。
实施例
下列实施例更为详细地说明本发明，但对本发明的范围不构成限制。
参考实施例1
(1)如下计算本发明方法所用耐热RNase H的单位值。
将1mg的poly(rA)或poly(dT)(均获自Amersham PharmaciaBiotech)溶解于1ml含1mM EDTA的40mM tris-HCl(pH7.7)中，以制备poly(rA)溶液和poly(dT)溶液。
继而将该poly(rA)溶液(终浓度为20μg/ml)和poly(dT)溶液(终浓度为30μg/ml)添加至含有4mM MgCl2、1mM DTT、0.003％BSA和4％甘油的40mM tris-HCl(pH7.7)中。使该混合物于37℃反应10分钟后，将其冷却至4℃，以制备poly(rA)-poly(dT)溶液。将1μl经适当稀释的酶溶液添加至100μl该poly(rA)-poly(dT)溶液中。使该混合物于40℃反应10分钟。添加10μl 0.5M EDTA以终止反应。检测260nm处吸光度。作为对照，将10μl 0.5M EDTA添加至该反应混合物中，使相应混合物于40℃反应10分钟，继而检测吸光度。通过从缺乏EDTA的反应所获吸光度减去对照所获吸光度可得到一个数值(吸光度差值)。从而在吸光度差值的基础上测定通过酶反应从poly(rA)-poly(dT)杂合物释放的核苷酸浓度。
单位＝[吸光度差值×反应体积(ml)]/0.0152×(110/100)×稀释率]
参考实施例2：RNase H的制备
根据本发明所用的RNase H是依照WO 02/22831所描述方法制备的。特定地，培养大肠杆菌重组细胞，并如下从细胞中制备所感兴趣的RNase H。
(1)来源自激烈火球菌并具有RNase H活性的多肽
由质粒pPFU220转化的大肠杆菌JM109被命名并标示为大肠杆菌JM109/pPFU220，其中该质粒含有编码了来源自激烈火球菌并具有RNase H活性的多肽的DNA，并于2000年9月5日(原始保藏日期)保藏于International Patent Organism Depositary，National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM BP-7654。将由pPFU220转化的大肠杆菌JM109接种至含100μg/ml氨苄青霉素的2L LB培养基中，于37℃震荡培养16小时。培养后，将通过离心收集的细胞悬浮于66.0ml的超声缓冲液[50mMtris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯甲基磺酰氟]中，并进行超声处理。于12000rpm离心经超声处理的悬浮液10分钟，将所获上清液于60℃加热15分钟。继而再次于12000rpm离心10分钟，以收集上清液。如此便获得了61.5ml加热的上清液。
将该加热的上清液加样至经缓冲液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡过的RESOURSE Q柱(Amersham PharmaciaBiotech)，并采用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行色谱分析。结果RNase HII流过RESOURSE Q柱。
将60.0ml流出的RNase HII流分(fraction)加样至经缓冲液A平衡过的RESOURSE Q柱(Amer8ham Pharmacia Biotech)，并采用FPLC系统，以0～500mM NaCl线性梯度洗脱。以约150mM NaCl洗脱获得含RNase HII的流分。采用Centricon-10(Amicon)超滤浓缩2.0ml的RNase HII流分。将250μl浓缩液加样至经含有100mM NaCl、0.1mMEDTA的50mM tris-HCl(pH8.0)平衡过的Superdex 200凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)，并以相同缓冲液洗脱。结果在相当于17千道尔顿的分子量处洗脱出RNase HII。如参考实施例1所描述方法测定如此所获制备物的酶活。结果观察到该制备物具有RNase H活性。
(2)来源自horikoshii火球菌并具有RNase H活性的多肽
由质粒pPHO238转化的大肠杆菌JM109被命名并标示为大肠杆菌JM109/pPHO238，其中质粒含有编码了来源自horikoshii火球菌并具有RNase H活性的多肽的DNA，并于2001年2月22日(原始保藏日期)保藏于International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology，AIST TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM BP-7692。将由pPHO238转化的大肠杆菌JM109接种至含100μg/ml氨苄青霉素的1L LB培养基中，于37℃震荡培养16小时。培养后，将通过离心收集的细胞悬浮于34.3ml的超声缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯甲基磺酰氟]中，并进行超声处理。于12000rpm离心经超声处理的悬浮液10分钟，将所获上清液于80℃加热15分钟。继而再次于12000rpm离心10分钟，以收集上清液。如此便获得了33.5ml加热的上清液。
将该加热的上清液加样至经缓冲液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡过的RESOURSE Q柱(Amersham PharmaciaBiotech)，并采用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行色谱分析。结果RNase HII流过RESOURSE Q柱。
以2L缓冲液B(50mM tris-HCl(pH7.0)、1mM EDTA)对35.0ml流过的RNase HII流分进行2小时透析。重复两次以上该透析。将34.5ml透析的酶溶液加样至经缓冲液B平衡过的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)，并采用FPLC系统，以0～500mM NaCl线性梯度洗脱。以约155mM NaCl洗脱获得含RNase HII的流分。
将缓冲液B添加至4.0ml流分中，以使NaCl浓度为50mM。将该混合物加样至经含有50mM NaCl的缓冲液B平衡过的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)，并采用FPLC系统，以50～550mMNaCl线性梯度洗脱。结果以约160mM NaCl洗脱获得含RNase HII的流分。
采用Centricon-10(Amicon)超滤浓缩6.9ml的RNase HII流分。将250μl浓缩液分为两部分，加样至经含有100mM NaCl和0.1mMEDTA的50mM tris-HCl(pH7.0)平衡过的Superose 6凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)，并以相同缓冲液洗脱。结果在相当于24.5千道尔顿的分子量处洗脱出RNase HII。该分子量与单体形式RNase HII的分子量一致。如参考实施例1所描述方法测定如此所获制备物的酶活。结果观察到该制备物具有RNase H活性。
(3)来源自闪烁古生球菌并具有RNase H活性的多肽
由质粒pAFU204转化的大肠杆菌JM109被命名并标示为大肠杆菌JM109/pAFU204，其中该质粒含有编码了来源自闪烁古生球菌并具有RNase H活性的多肽的DNA，并于2001年2月22日(原始保藏日期)保藏于International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology，AIST TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM BP-7691。将由pAFU204转化的大肠杆菌JM109接种至含100μg/ml氨苄青霉素的2L LB培养基中，于37℃震荡培养16小时。培养后，将通过离心收集的细胞悬浮于37.1ml的超声缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯甲基磺酰氟]中，并进行超声处理。于12000rpm离心经超声处理的悬浮液10分钟，将所获上清液于70℃加热15分钟。继而再次于12000rpm离心10分钟，以收集上清液。如此便获得了40.3ml加热的上清液。
将该加热的上清液加样至经缓冲液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡过的RESOURSE Q柱(Amersham PharmaciaBiotech)，并采用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行色谱分析。结果RNase HII流过RESOURSE Q柱。
将流过的RNase HII流分加样至经缓冲液A平衡过的RESOURSES柱(Amersham Pharmacia Biotech)，并采用FPLC系统(AmershamPharmacia Biotech)进行色谱分析。结果RNase HII流过RESOURSE S柱。
以2L缓冲液B(50mM tris-HCl(pH7.0)、1mM EDTA)对40.0ml流过的RNase HII流分进行2小时的透析。重复两次以上该透析。将40.2ml透析的酶溶液加样至经含有50mM NaCl的缓冲液B平衡过的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)，并采用FPLC系统，以50～550mM NaCl线性梯度洗脱。结果以约240mM NaCl洗脱获得含RNase HII的流分。
采用Centricon-10(Amicon)超滤浓缩7.8ml的RNase HII流分。将约600μl的浓缩液分为四部分，并加样至经含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl(pH7.0)平衡过的Superose 6凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)，并以相同缓冲液洗脱。结果在相当于30.0千道尔顿的分子量处洗脱出RNase HII。该分子量与单体形式RNase HII的分子量一致。如参考实施例1所描述方法测定如此所获制备物的酶活。结果观察到该制备物具有RNase H活性。
(4)由质粒pTLI204转化的大肠杆菌HMS174(DE3)被命名并标示为大肠杆菌HMS174(DE3)/pTLI204，其中该质粒含有编码了来源自litoralis热球菌并具有RNase H活性的多肽的DNA，并于2001年2月22日(原始保藏日期)保藏于International Patend OrganismDepositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM BP-7693。将由pTLI204转化的大肠杆菌HMS174(DE3)接种至含100μg/ml氨苄青霉素的10mlLB培养基中，于37℃震荡培养过夜。培养后，如上述对通过离心收集的细胞进行加工以获得加热的上清液。如参考实施例1所描述方法测定如此所获加热的上清液的酶活。结果观察到该加热的上清液具有RNase H活性。
(5)来源自速生热球菌(Thermococcus celer)并具有RNase H活性的多肽
由质粒pTCE207转化的大肠杆菌HMS174(DE3)被命名并标示为大肠杆菌HMS 174(DE3)/pTCE207，其中该质粒含有编码了来源自速生热球菌并具有RNase H活性的多肽的DNA，并于2001年2月22日(原始保藏日期)保藏于International Patent Organism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，AISTTsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM BP-7694。培养由pTCE207转化的大肠杆菌HMS174(DE3)，并纯化所获细胞，以获得如(4)所描述的加热的上清液。如上文(4)中所描述方法测定如此所获加热的上清液的酶活。结果观察到该加热的上清液具有RNase H活性。
参考实施例3
检验本发明的扩增方法。
(1)采用pUC19上游150 PCR引物(SEQ ID NO：1)和pUC19下游PCR引物(SEQ ID NO：2)，并以100pg的pUC19质粒DNA为模板进行PCR。相应的扩增片段经过Microcon-100纯化，DNA钝端化试剂盒(Takara Shuzo)钝端化后，并被亚克隆进入质粒pUC19的HincII位点。将插入有该扩增片段的质粒用于转化大肠杆菌JM109。培养转化体。采用QIAGEN质粒微型试剂盒(Qiagen)从细胞中纯化获得插入有DNA的质粒，pUC19-150。以具有该插入DNA的质粒为模板，以及引物MCS-F(SEQ ID NO：3)和MCS-R(SEQ IDNO：4)进行PCR。采用Microcon-100(Millipore)对反应混合物进行纯化，获得534-bp的PCR扩增片段。制备得到含有15ngPCR片段、30pmol通过磷酸化作用于5’末端由[γ-32P]ATP标记的引物MR2(SEQ ID NO：5)，并加入无菌蒸馏水至5μl的反应混合液，和进一步含有30pmol引物MR2(SEQ ID NO：6)的反应混合液。于98℃加热-变性该反应混合液2分钟后，冷却至55℃。将含有1U BcaBESTDNA聚合酶的20μl反应混合液(42.5mM Tricine缓冲液(pH8.7)、12.5mM氯化钾、12.5mM硫酸铵、0.0125％BSA、1.25％DMSO、5mM乙酸镁、0.625mM各种dNTPs)添加至各个反应混合液中。使这些反应混合液于55℃反应15分钟。反应后，将2.5μl反应终止液(95％甲酰胺、20mM EDTA、0.05％溴酚蓝、0.5％二甲苯蓝)添加至5μl的各个反应混合液中。于94℃加热-变性这些混合液3分钟。将1.6μl各个反应混合液上样在含8M尿素的6％聚丙烯酰胺凝胶上，进行电泳，并采用BAS2000(Fujix)读出信号，以检测延伸自引物MR1的产物。结果如图1A所示。通过采用经过磷酸化作用被[γ-32p]ATP标记的引物MF2对M13mp18单链DNA(Takara Shuzo)进行测序，从而制备图1A中的序列条带，并将其用于确定延伸产物的长度。泳道1：引物MF2和MR1的组合；泳道2：MR1。
如图1A所示，通过向模板中仅添加引物MR1进行延伸反应，可检测从引物MR1延伸至模板末端的448-bp条带。另一方面除上述条带外，通过进一步添加引物MF2可检测与引物MR1和MF2结合的373-bp条带。由此证实由于模板转移到以延伸自引物MF2的链为模板的延伸中，使得以PCR扩增片段为模板，通过BcaBEST DNA聚合酶的作用，从MR1引物开始的延伸被转移了。此外，相似条件下采用Klenow DNA聚合酶作为具有链替代活性的中温DNA聚合酶时可观测到模板转移。另一方面采用不具有链替代活性的TaKaRa TaqDNA聚合酶(Takara Shuzo)或PyroBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)时则观测不到模板转移。
(2)采用模板DNA链，以及被退火于其上的引物检验模板转移反应。如下制备可被引物MF2和MR1退火的DNA片段。以质粒pUC19为模板，采用引物MCSF和RV(Takara Shuzo)或引物M4(TakaraShuzo)和MCSR进行PCR。采用Microcon-100纯化反应混合液，获得PCR扩增的片段MSCR-RV(236bp)和M4-MCSR(271bp)。与引物M4和RV结合的区域通常存在于两个PCR扩增片段中。
接着，如下制备模板-引物(2)-1，其中引物退火于其上的模板DNA链未彼此退火，和模板-引物(2)-2，其中引物退火于其上的模板DNA链已彼此退火。
(2)-1
使含有30ng MCSF-RV片段、40pmol 5’末端由[γ-32P]ATP通过磷酸化作用标记的引物MF2、终浓度为0.01％的丙烯二胺，并加入无菌蒸馏水至5μl的反应混合液，和含有30ng M4-MCSR片段、40pmol引物MR1、终浓度为0.01％的丙烯二胺，并加入无菌蒸馏水至5μl的反应混合液，分别于98℃加热-变性2分钟后，冷却至55℃。将2.5μl各个反应混合液混合一起，以制备模板-引物。
(2)-2
使含有15ng MCSF-RV片段、15ng M4-MCSR片段、20pmol 5’末端由[γ-32P]ATP通过磷酸化作用标记的引物MF2、20pmol引物MR1、终浓度为0.01％的丙烯二胺，并加入无菌蒸馏水至5μl的反应混合液于98℃加热-变性2分钟后，冷却至55℃，以制备模板-引物。
将20μl含有1U的BcaBEST DNA聚合酶的反应混合液(42.5mMTricine缓冲液(pH8.7)、12.5mM氯化钾、12.5mM硫酸铵、0.0125％BSA、1.25％DMSO、5mM乙酸镁、0.625mM各种dNTPs))添加至5μl各个模板-引物反应混合液中。使这些反应混合液于55℃反应15分钟。反应后，将2.5μl反应终止液(95％甲酰胺、20mM EDTA、0.05％溴酚蓝、0.5％二甲苯蓝)添加至5μl的各个反应混合液中。于94℃加热-变性这些混合液3分钟。将1.6μl各个反应混合液加样至含8M尿素的6％聚丙烯酰胺凝胶上，进行电泳，并采用BAS2000(Fujix)读出信号，以检测延伸自引物MF2的产物。结果如图1B所示。通过采用经过磷酸化作用被[γ-32P]ATP标记的引物MR1对M13mp18单链DNA进行测序，从而制备图1B中的序列条带，并将其用于确定延伸产物的长度。泳道1：未彼此退火的模板DNA链；泳道2：已彼此退火的模板DNA链。
如图1B所示，对已有引物退火于其上的未彼此退火的模板DNA链的模板-引物而言，仅检测到从引物MF2延伸至模板末端的161-bp条带，该模板-底物中。换言之，除上述条带外，检测到与引物MF2和MR1结合的223-bp条带为已有引物退火于其上的模板DNA链已彼此退火的模板-引物。由此证实如果已有引物退火于其上的模板DNA链已彼此退火，便可发生模板转移反应。
实施例1
以结核杆菌为实验材料验证本发明的检测方法。以注册于GenBank，编号为AL123456的结核杆菌基因组的核苷酸序列为基础，合成用于扩增结核杆菌基因组中相对低GC含量区域的引物K-F-1033-2(SEQ ID NO：7)和K-F-1133-2(SEQ ID NO：8)。与引物对相连并包括引物部分的区域长度为105bp。根据常规方法从干BCG疫苗(Nippon BCG Seizo)中提取作为模板的结核杆菌基因组DNA。于1μl无菌水中制备含100gf～10pg基因组DNA的系列稀释液。如下进行反应。简言之，制备终体积为25μl，含有终浓度如下物质的反应混合液：32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)；100mM乙酸钾；1％DMSO；0.01％BSA；4mM乙酸镁；500μM各种dNTPs；分别为50pmol的引物K-F-1033-2和K-F-1133-2；9.375U的Pfu RNaseHII、4.375U的Afu RNase HII或4U的Tli RNase H；2.75U的BcaBESTDNA聚合酶；1μl的一种模板；及蒸馏水。将该反应混合液置于已设定为62℃的Thermal Cycler Personal中温育60分钟。反应后，将3μl各个反应混合液加样至3.0％琼脂糖凝胶的电泳中。结果证实采用每种RNase HII和每种数量(100fg～10pg)的作为模板的基因组DNA均观测到有扩增产物。
实施例2
(1)验证采用RNA探针检测目标核酸的方法。选择结核杆菌作为实验材料。将1ng或100pg，实施例1中制备用作模板的BCG基因组DNA添加至50μl反应混合液中。采用DNA合成仪合成引物MTIS2F(SEQ ID NO：162)和MTIS2R(SEQ ID NO：163)，以及用于检测MTIS(SEQ ID NO：11)和MTIS-2(SEQ ID NO：12)的探针。每个探针分别在5’和3’末端具有荧光标记6-FAM(GlenResearch)和TAMRA(Glen Research)。除采用4U的BcaBEST DNA聚合酶和18.75U的Pfu RNase HII外，如实施例中所描述内容进行该反应。将5pmol的RNA探针添加至每个反应混合物中(终体积为50μl)。从50μl的每个反应混合物中取出25μl用于58℃的ICAN反应。采用Smart Cycler(Takara Shuzo)用于ICAN反应和扩增产物的检测。结果如图2A所示。图2A、B和C中，纵轴代表荧光强度，水平轴代表时间。如图2A所示，通过Smart Cycler的分析，采用1ng或100pg的模板DNA只能监测到所感兴趣的扩增片段。此外，证实两种探针均可被优选地用于实时检测。
(2)检验采用嵌入剂的一步法RT-ICAN检测系统。选择HCV基因组为实验材料。如下制备被用作模板的RNA。获得丙型肝炎患者同意后，采用TRIzol试剂(Life Technologies)并根据试剂所附说明书，从获得自患者的300μl血清中制备RNA样品，并将其最终溶解于20μl可注射用水中(Otsuka Pharmaceutical)。以该RNA样品为模板进行RT-PCR。如下进行反应。采用2μl RNA样品、分别为20pmol的引物SP6-HCV-F(SEQ ID NO：13)和T7-HCV-R(SEQ IDNO：14)，连同根据试剂盒所附手册使用的一步法RNA PCR试剂盒(Takara Shuzo)制备50μl反应混合液。将该反应混合液置于ThermalCycler Personal中，于50℃反应15分钟，于94℃反应2分钟，再经过40个反应循环如下：94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒。反应后，将反应混合液上样在2％SeaPlaque GTG琼脂糖凝胶上以进行电泳，并从凝胶切出所感兴趣的350-bp扩增产物。采用EASYTRAPVer.2(Takara Shuzo)并根据试剂盒所附说明书回收该DNA。以该回收的DNA为模板，采用竞争性RNA转录试剂盒(Takara Shuzo)并根据试剂盒所附说明书合成转录RNA。以该RNA为模板用于检验一步RT-ICAN。
添加相当于0、1×105、1×106或1×107个拷贝的模板RNA。制备终体积为50μl，含有终浓度如下物质的反应混合液：32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、1％DMSO、0.01％BSA、4mM乙酸镁、500μM各种dNTPs、50pmol分别以SEQ ID NO：15和16表示的引物、5U的Afu RNase HII、4U的BcaBEST DNA聚合酶、20U的RNase抑制物、2.5U的AMV RTase XL(Takara Shuzo)、1μl与给定拷贝数目相符的转录产物RNA，以及5μl作为嵌入剂的用蒸馏水稀释3000倍的SYBR Green I储存溶液的稀释液(SYBR GreenI nucleic acid Gel Stain、BioWhittaker Molecular Applications)。以25μl的每个反应混合液进行53℃的ICAN反应。ICAN反应和检测采用ABI PRISMTM7700系统(Applied Biosystems)。结果如图2B所示。如图2B所示，证实采用一步RT-ICAN方法可以实时方式检测到目标核酸。
(3)验证采用嵌入剂的ICAN检测体系。选择衣原体基因组作为实验材料。基于沙眼衣原体质粒的核苷酸序列(GenBank编号X06707)合成引物CT2F(SEQ ID NO：17)和CT2R(SEQ ID NO：18)。与该引物对相连包括引物部分的区域长度为109bp。另外，引物CT-FB19-3(SEQ ID NO：19)和CT-RB23-2(SEQ ID NO：20)也可作为扩增衣原体的引物。与该引物对相连包括引物部分的区域长度为107bp。制备终体积为50μl，含有终浓度如下物质的反应混合液：32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、1％DMSO、0.01％BSA、4mM乙酸镁、500μM各种dNTPs、分别为50pmol的引物CT2F和CT2R或引物CT-FB19-3和CT-RB23-2、35U的Afu RNaseHII、8U的BcaBEST DNA聚合酶、1μl样品和无菌水。将2.5μl作为嵌入剂的SYBR Green I储存溶液的3000倍稀释液添加至22.5μl每个反应混合液中，并使反应混合液于55℃进行ICAN反应。ICAN反应和检测采用的是Smart Cycler。结果如图2C所示。如图2C所示，证实采用含嵌入剂体系检测衣原体可以实时方式检测到目标核酸。
如上所述，证实本发明方法可被用于以实时方式特异地检测目标核酸。
实施例3
如下检验本发明方法所用试剂的保存稳定性。
(1)制备含有如下物质、ICAN反应所用预混液，并于4℃或30℃保存约一个月：1.6mM各种dNTPs、101mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、317mM乙酸钾、12.7mM乙酸镁、0.03％牛血清白蛋白、3.2％二甲亚砜、0.56U/μl的Afu RNase HII和0.35U/μl的BcaBEST DNA聚合酶。
将16.125μl含有两种50pmol用于检测结核杆菌的引物，即K-F-1033(68)(SEQ ID NO：21)和K-R-1133(68)(SEQ ID NO：22)的水溶液添加至7.875μl ICAN反应所用的预混液中。另外，将实施例1中制备的，1μl含有浓度为100pg/μl或10pg/μl的BCG基因组DNA的水溶液添加至该混合液中。使相应的混合液于64℃进行1小时的ICAN反应。反应后，将5μl每个反应混合液上样至3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，以证实扩增。于适当保存时期(按天计)后重复该过程，并基于从电泳观测到的ICAN扩增产物评估ICAN反应所用预混液的稳定性。结果如图3所示。图3是显示说明本发明预混液保存稳定性的电泳图。图3A显示了于4℃保存结果。泳道1：制备预混液后立即，100pgBCG基因组DNA；泳道2：制备后立即，10pg；泳道3：制备后9天，100pg；泳道4：制备后9天，10pg；泳道5：制备后18天，100pg；泳道6：制备后18天，10pg；泳道7：制备后28天，100pg；泳道8：制备后28天，10pg。
图3B显示于30℃保存结果。泳道1：制备预混液后立即，100pgBCG基因组DNA；泳道2：制备后立即，10pg；泳道3：制备后6天，100pg；泳道4：制备后6天，10pg；泳道5：制备后10天，100pg；泳道6：制备后10天，10pg。
如图3所示，证实该预混液从制备开始于4℃保存28天或更长时间后，仍可稳定进行ICAN反应。也证实该预混液从制备开始于30℃保存10天或更长时间后，仍可稳定进行ICAN反应。如此证实通过在如上所述条件下制备并保存反应所用预混液，可长期保存采用ICAN方法扩增所用试剂。
另外，制备含有3-、10-、或30倍量的Afu RNase HII的ICAN所用预混液，并在上述条件下使其经过保存测试，获得相似的结果。
实施例4
如下验证本发明方法所用试剂的稳定性和长期储存性。
(1)检验用于保存的预混液的组成。特定地，制备含有142mMHEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、444mM乙酸钾、0.044％牛血清白蛋白、4.44％二甲亚砜、0.8U/μl的Afu RNase HII和0.5U/μl的BcaBEST DNA聚合酶的溶液(I)。通过将下列物质添加至5.625μl溶液(I)中，制备预混液[A]、预混液[B]、预混液[C]和预混液[D]：预混液[A](无引物)：1μl的100mM乙酸镁和1.25μl的dNTPs；预混液[B](无dNTPs)：分别为1μl的两种用于检测结核杆菌的引物，K-F-1033(68)和K-R-1133(68)(50pmol/μl)，和1μl的100mM乙酸镁；预混液[C](无乙酸镁)：分别为1μl的K-F-1033(68)和K-R-1133(68)(50pmol/μl)，和1.25μl的10mM dNTPs；预混液[D]：1μl的100mM乙酸镁和1.25μl的10mM dNTPs。于30℃保存这些预混液2小时。将分别为1μl的K-F-1033(68)和K-R-1133(68)(50pmol/μl)添加至7.875μl预混液[A]中；将1.25μl的10mM dNTPs添加至8.625μl预混液[B]中；将1μl的100mM乙酸镁添加至8.875μl预混液[C]中。继而将可注射用水添加至预混液[A]、预混液[B]、预混液[C]或9.875μl预混液[D]中，使体积均达到24μl。将1μl浓度为100pg/μl的BCG基因组DNA添加至每个混合液中。于64℃温育所得混合液1小时。反应后，将分别为5μl的各个反应混合液加样至3％琼脂糖凝胶电泳，以证实扩增。结果证实对试剂稳定性而言，优选的是预混液[A]、预混液[B]和预混液[C]的组成。
(2)采用含有ICAN反应所必需所有组分，且排除引物、Mg2+等物质，用于保存的预混液验证保存期间的变化。特定地制备含有69mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、215mM乙酸钾、0.022％牛血清白蛋白、2.2％二甲亚砜、8.6mM乙酸镁、1.1mM各种dNTP、0.38U/μl的Afu RNase HII和0.24U/μl的BcaBEST DNA聚合酶、80kBq/μl[α-33P]-dATP(Amersham Pharmacia Biotech)和分别为5.2μM用于检测结核杆菌的两种引物，K-F-1033(68)和K-R-1133(68)的预混液(I)。另外，制备从预混液(I)中排除引物所得预混液(II)、从预混液(I)排除乙酸镁所得预混液(III)。于30℃保存2、5或20小时后从每种预混液中取出3μl样品，并于-20℃冷冻。将这些样品加样至15％丙烯酰胺凝胶电泳中。电泳进行1.5小时后，干燥凝胶，继而进行放射自显影。结果如图4所示。图4是显示放射自显影的图。泳道1：保存2小时的预混液(III)；泳道2：保存5小时的预混液(III)；泳道3：保存20小时的预混液(III)；泳道4：保存2小时预混液(II)；泳道5：保存5小时的预混液(II)；泳道6：保存20小时的预混液(II)；泳道7：保存2小时的预混液(I)；泳道8：保存5小时的预混液(I)；泳道9：保存20小时的预混液(I)。
如图4所示，证实通过从预混液(I)中排除引物或乙酸镁，从而将预混液(I)的组成改变为预混液(II)或预混液(III)的组成，可抑制保存期间预混液(I)中所检测到的大分子DNA的生成。因此，证实通过从反应混合液中排除嵌合寡核苷酸引物、镁盐或dNTPs可以抑制嵌合寡核苷酸引物的副反应，也可使试剂稳定。
(3)检验含有ICAN反应所必需、除引物外的所有组分的用于保存的预混液的浓度率(盐浓度)。特定地制备用于ICAN反应、含有下列物质的预混液A、B、C，并保存于30℃：预混液A：1.6mM各种dNTP、102mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、317mM乙酸钾、13mM乙酸镁、3.2％二甲亚砜、0.03％牛血清白蛋白、0.556U/μl的Afu RNase HII和0.349U/μl的BcaBEST DNA聚合酶；预混液B：1mM各种dNTP、64mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、200mM乙酸钾、8mM乙酸镁、2％二甲亚砜、0.02％牛血清白蛋白、0.35U/μl的Afu RNase HII和0.22U/μl的BcaBEST DNA聚合酶；预混液C：0.57mM各种dNTP、36mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、114mM乙酸钾、4.5mM乙酸镁、1.1％二甲亚砜、0.01％牛血清白蛋白、0.2U/μl的Afu RNase HII和0.125U/μl的BcaBEST DNA聚合酶。
将分别为50pmol，用于检测结核杆菌的引物K-F-1033(68)和K-R-1133(68)，以及加至24μl的注射用水添加至7.875μl预混液A、12.5μl预混液B或22μl预混液C中。继而添加1μl含有浓度为100pg/μl或10pg/μl的BCG基因组DNA的水溶液于其中。使所得混合液于64℃进行ICAN反应1小时。反应后，将分别为5μl的反应混合液加样到3％琼脂糖凝胶中进行电泳，以证实扩增。于适当间隔进行该过程，并基于从电泳观测到ICAN扩增产物，评估预混液的稳定性。结果如图5所示。图5是显示说明本发明预混液A、B和C的保存稳定性的电泳图。泳道1：预混液A，制备后13天，100pgBCG基因组DNA；泳道2：预混液A，制备后13天，10pg；泳道3：预混液B，制备后13天，100pg；泳道4：预混液B，制备后13天，10pg；泳道5：预混液C，制备后13天，100pg；泳道6：预混液C，制备后13天，10pg；泳道7：预混液B，制备后18天，100pg；泳道8：预混液B，制备后18天，10Pg；泳道9：预混液C，制备后18天，100pg；泳道10：预混液C，制备后18天，10pg。
如图5所示，证实该预混液A和B可于30℃分别保存约2和3周。预混液C在制备后18天或更久仍可被用于稳定进行ICAN反应。
因此，证实含酶反应缓冲液所含的盐浓度优选地约为反应时的最终盐浓度。特定地，该优选浓度为反应时的最终盐浓度的1.5倍或低于1.5倍。
(4)如果保存含酶溶液，通常通过提高酶浓度以提高该酶的稳定性。检验用于保存的预混物的稳定性。设计该用于保存的预混物，通过减少盐浓度或于反应前立即添加盐以补偿ICAN反应所用盐的不足，以保持高的酶浓度。特定地制备含有下列物质、用于ICAN反应的预混液，并于30℃保存：2.5mM各种dNTP、32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、4mM乙酸镁、0.05％牛血清自蛋白、0.875U/μl的Afu RNase HII和0.55U/μl的BcaBEST DNA聚合酶。
将19μl含有分别为50pmol，用于检测结核杆菌的引物K-F-1033(68)和K-R-1133(68)、33.64mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、105.22mM乙酸钾、4.21mM乙酸镁和1.32％二甲亚砜的水溶液添加至5μl预混液中，以进行ICAN反应。将1μl含有浓度为100pg/μl或10pg/μl的BCG基因组DNA的水溶液添加至该混合液中。使所得混合液于64℃进行ICAN反应1小时。反应后，将分别为5μl的反应混合液加样到3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，以证实扩增。
于适当间隔进行该过程，并基于从电泳观测到ICAN扩增产物，评估本发明预混液的稳定性。结果如图6所示。图6是显示说明本发明预混液保存稳定性的电泳图。泳道1：预混液制备后立即，100pg BCG基因组DNA；泳道2：制备后立即，10pg；泳道3：制备后21天，100pg；泳道4：制备后21天，10pg；泳道5：制备后25天，100pg；泳道6：制备后25天，10pg；泳道7：制备后32天，100pg；泳道8：制备后32天，10pg。
如图6所示，证实该预混液于30℃保存32天或更久后仍可被用于稳定进行ICAN反应。因此证实通过在上述条件下制备并保存反应所用预混液，可长期保存ICAN方法扩增所用试剂。
当采用BcaBEST DNA聚合酶和Tli RNase H组合，如上文(1)～(4)所述进行检验时获得类似的结果。
因此证实浓度比(酶浓度率/盐浓度率的比例)优选地大于1，定义反应的酶(DNA聚合酶和/或RNase H)或盐的最终浓度为1。此外，证实该比例优选地为5或小于5。
当以3-、10-、或30-倍增加RNase H的量，如上文(1)～(4)所述进行验证时获得相似结果。
实施例5
检验采用本发明方法对鸟分枝杆菌复合体的检测。首先，制备用于鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的阳性对照。根据BioTechniques，9(3)：298-300(1990)所描述方法，采用Ex Taq DNA聚合酶进行延伸反应，继而采用10个74-mer合成引物进行PCR，获得与来源自鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的16S RNA基因的部分序列相符，并具有SEQ IDNO：23和24核苷酸序列的560-bp扩增产物。采用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)将该扩增产物插入pT7 Blue T载体中。将该连接混合物用于转化大肠杆菌JM109，以制备用作鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的阳性对照的质粒。合成具有SEQ ID NO：25～31核苷酸序列的引物Myco-F-1、Myco-F-2、Myco-F-3、Myco-R-1、Myco-R-1-2、Myco-R-2I和Myco-R-2A。如下进行反应。简言之，制备终体积为25μl、含有终浓度如下物质的反应混合液：32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、1％DMSO、0.01％BSA、4mM乙酸镁、500μM各种dNTP、4.4U的Afu RNase HII或4U的TliRNase H、4U的BcaBEST DNA聚合酶、作为模板并用于鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的阳性对照的105拷贝、分别为25pmol的上游引物和下游引物。将该反应混合液置于已设定为55℃的热循环控制装置中温育60分钟。当以用于鸟分枝杆菌的阳性对照为模板时，基于采用任意一种RNase H和引物对：Myco-F-1和Myco-R-1；Myco-F-1和Myco-R-1-2；Myco-F-1和Myco-R-2A；Myco-F-2和Myco-R-1；Myco-F-2和Myco-R-1-2；Myco-F-2和Myco-R-2A；Myco-F-3和Myco-R-1；Myco-F-3和Myco-R-1-2；或Myco-F-3和Myco-R-2A的琼脂糖凝胶电泳观测到所感兴趣的101-bp、96-bp、96-bp、101-bp、96-bp、96-bp、106-bp、101-bp和101-bp的扩增产物。采用引物对Myco-F-1和Myco-R-2I；Myco-F-2和Myco-R-2I；或Myco-F-3和Myco-R-2I则观测不到任何扩增产物。
当以用于胞内分枝杆菌的阳性对照为模板时，基于采用任意一种RNase H和引物对：Myco-F-1和Myco-R-1；Myco-F-1和Myco-R-1-2；Myco-F-1和Myco-R-2I；Myco-F-2和Myco-R-1；Myco-F-2和Myco-R-1-2；Myco-F-2和Myco-R-2I；Myco-F-3和Myco-R-1；Myco-F-3和Myco-R-1-2；或Myco-F-3和Myco-R-2I的琼脂糖凝胶电泳观测到所感兴趣的101-bp、96-bp、96-bp、101-bp、96-bp、96-bp、106-bp、101-bp和101-bp的扩增产物。采用引物对Myco-F-1和Myco-R-2A；Myco-F-2和Myco-R-2A；或Myco-F-3和Myco-R-2A则观测不到任何扩增产物。
基于上述结果，证实采用可引起模板特异性反应的引物Myco-R-2I或Myco-R-2A可从胞内分枝杆菌区分出鸟分枝杆菌。采用均在5’末端标记有生物素的鸟分枝杆菌-探针(SEQ ID NO：32)或胞内分枝杆菌-探针(SEQ ID NO：33)，如下进行扩增片段的斑点杂交。简言之，使1μl各个反应混合液于98℃变性5分钟后，迅速在冰中冷却，并印迹到Hybond-NTM(Amersham Pharmacia Biotech)上。UV放射后，将该膜置于杂交袋中。于其中添加10ml杂交溶液(0.5M磷酸氢二钠(pH7.2)、1mM乙二胺四乙酸和7％十二烷基硫酸钠)。于42℃进行预杂交30分钟。使10μl含有浓度为100ng/μl鸟分枝杆菌-探针或胞内分枝杆菌-探针的溶液加热-变性后，添加至预杂交反应体系中。于42℃杂交60分钟后，在含有66.6mM氯化钠、66.6mM水合柠檬酸三钠和0.1％十二烷基硫酸钠的溶液中，于室温两次洗涤该膜五分钟。于42℃，在通过将2μl含有浓度为5mg/ml辣根过氧物酶链状抗生物素蛋白结合物(Pierce)的溶液添加至6ml洗涤缓冲液(0.3M氯化钠、17.3mM二水合磷酸二氢钠、2.5mM EDTA和0.1％十二烷基硫酸钠)中，制备而得混合液中温育该膜12分钟。室温下先以该洗涤缓冲液，继而以10ml 0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)洗涤该膜两次，并于含有5ml 0.1M柠檬酸盐缓冲液、5μl 3％过氧化氢和250μl含有浓度为2mg/ml N四甲联苯胺(TMB，Nacalai Tesque)的乙醇溶液的混合物中，暗处反应约10分钟。显色后，以去离子水终止该反应。
结果，只有采用5’末端标记有生物素的鸟分枝杆菌-探针可观测到扩增自鸟分枝杆菌阳性对照的扩增产物的信号，而采用5’末端标记有生物素的胞内分枝杆菌-探针则观测不到该信号。换言之，只有采用5’末端标记有生物素的胞内分枝杆菌-探针可观测到扩增自胞内分枝杆菌阳性对照的扩增产物的信号，而采用5’末端标记有生物素的鸟分枝杆菌-探针则观测不到该信号。基于这些结果，证实采用这些探针可从胞内分枝杆菌中区分出鸟分枝杆菌。
实施例6
检验采用本发明方法对淋球菌的检测。根据实施例5所描述方法，获得扩增自淋病奈氏球菌CppB基因、淋病奈氏球菌质粒pJD4基因和淋病奈氏球菌DNA胞嘧啶甲基转移酶(M.NgoMIII)基因，并具有SEQ ID NO：34～37核苷酸序列的560-bp片段。采用10个67-mer合成引物以相似方式从淋病奈氏球菌N-4胞嘧啶-特异性甲基转移酶基因扩增490-bp片段。将这些扩增产物插入pT7 Blue T载体，以构建阳性对照A、B、C和D。
合成具有SEQ ID NOS：38-63和164-165核苷酸序列的引物NEI-5103、NEI-5150、CppB-F1、CppB-F2、CppB-F3、CppB-R1、CppB-R2、CppB-R3、pJDB F-1、pJDB F-2、pJDB R-1、pJDB R-2、pJDBR-3、M.Ngo F-1、M.Ngo F-2、M.Ngo F-3、M.Ngo R-1、M.Ngo R-2、M.Ngo R-3、M.Ngo R-4、胞嘧啶F-1、胞嘧啶F-2、胞嘧啶F-3、胞嘧啶R-1、胞嘧啶R-2、胞嘧啶R-3、pJDB10F和pJDB10R。以阳性对照B的106拷贝为模板，采用一对引物NEI-5103和NEI-5150，在实施例5所描述条件下进行ICAN反应。结果基于采用任意一种RNaseH的琼脂糖凝胶电泳观测到69-bp扩增片段。将该扩增片段印迹到尼龙膜上，并采用5’末端标记有生物素的NEI-5130探针(SEQ ID NO：64)，并根据实施例5所描述方法进行斑点杂交。结果，观测到所感兴趣的信号。
相似地，以阳性对照A的106拷贝为模板，采用一对引物：CppB-F1和CppB-R1；CppB-F1和CppB-R2；CppB-F1和CppB-R3；CppB-F2和CppB-R1；CppB-F2和CppB-R2；CppB-F2和CppB-R3；CppB-F3和CppB-R1；CppB-F3和CppB-R2；或CppB-F3和CppB-R3，在实施例5所描述条件下进行ICAN反应。基于所有情况中的琼脂糖凝胶电泳均观测到所感兴趣的60-bp扩增片段。采用5’末端标记有生物素的NEI-CppB探针-1(SEQ ID NO：65)，并根据实施例5所描述方法进行扩增片段的斑点杂交。结果观测到所感兴趣的信号。
以阳性对照A的106拷贝为模板，采用一对引物：pJDB F-1和pJDB R-1；pJDB F-1和pJDB R-2；pJDB F-1和pJDB R-3；pJDB F-2和pJDB R-1；pJDB F-2和pJDB R-2；或pJDB F-2和pJDB R-3，在实施例5所描述条件下进行ICAN反应。基于所有情况中的琼脂糖凝胶电泳均观测到所感兴趣的91-bp扩增片段。采用一对引物pJDB10F和pJDB10R，在实施例5所描述条件下进行ICAN反应。基于采用任意一种RNase H的琼脂糖凝胶电泳均观测到所感兴趣的扩增片段71-bp。将该扩增片段印迹到尼龙膜上，并采用5’末端标记有生物素的NEI-CppB探针-2(SEQ ID NO：66)，并根据实施例5所描述方法进行斑点杂交。结果，观测到所感兴趣的信号。
相似地，以阳性对照C的106拷贝为模板，采用一对引物：M.NgoF-1和M.Ngo R-1；M.Ngo F-1和M.Ngo R-2；M.Ngo F-1和M.Ngo R-3；M.Ngo F-1和M.Ngo R-4；M.Ngo F-2和M.Ngo R-1；M.Ngo F-2和M.Ngo R-2；M.Ngo F-2和M.Ngo R-3；M.Ngo F-2和M.Ngo R-4；M.NgoF-3和M.Ngo R-1；M.Ngo F-3和M.Ngo R-2；M.Ngo F-3和M.Ngo R-3；或M.Ngo F-3和M.Ngo R-4，在实施例5所描述条件下进行ICAN反应。基于所有情况中的琼脂糖凝胶电泳均观测到所感兴趣的60-bp扩增片段。采用5’末端标记有生物素的M.Ngo-探针(SEQ ID NO：67)进行斑点杂交。结果观测到所感兴趣的信号。此外，以阳性对照D的106拷贝为模板，采用一对引物：胞嘧啶F-1和胞嘧啶R-1；胞嘧啶F-1和胞嘧啶R-2；胞嘧啶F-1和胞嘧啶R-3；胞嘧啶F-2和胞嘧啶R-1；胞嘧啶F-2和胞嘧啶R-2；胞嘧啶F-2和胞嘧啶R-3；胞嘧啶F-3和胞嘧啶R-1；胞嘧啶F-3和胞嘧啶R-2；或胞嘧啶F-3和胞嘧啶R-3，在实施例5所描述条件下进行ICAN反应。基于所有情况中的琼脂糖凝胶电泳均观测到所感兴趣的70-bp扩增片段。采用5’末端标记有生物素的胞嘧啶-探针(SEQ ID NO：68)进行斑点杂交。结果观测到所感兴趣的信号。
实施例7
检验采用本发明方法对人类乙型肝炎病毒(HBV)的检测。特定地根据实施例5所描述方法扩增由SEQ ID NOS：69和70表示的HBVX蛋白基因的560-bp部分，并将其插入pT7 Blue T载体中，作为HBV阳性对照1-T和HBV阳性对照1-G。合成具有SEQ ID NOS：71～78核苷酸序列的引物HBV-F-1、HBV-F-2、HBV-F-3、HBV-F-4、HBV-R-1、HBV-R-2、HBV-R-3和HBV-R-4。以HBV阳性对照1-G或HBV阳性对照1-T的106拷贝为模板，采用一对引物：HBV-F-1和HBV-R-1；HBV-F-1和HBV-R-2；HBV-F-2和HBV-R-1；或HBV-F-2和HBV-R-2，在实施例5所描述条件下进行ICAN反应。基于琼脂糖凝胶电泳观测到所感兴趣的扩增片段81-bp、76-bp、76-bp和71-bp。
以HBV阳性对照1-T或1-G的106拷贝为模板，采用一对引物：HBV-F-3和HBV-R-3；HBV-F-3和HBV-R-4；HBV-F-4和HBV-R-3；或HBV-F-4和HBV-R-4，在实施例5所描述条件下进行ICAN反应。基于琼脂糖凝胶电泳观测到所感兴趣的扩增片段84-bp、79-bp、78-bp和73-bp。将采用引物对HBV-F-1和HBV-R-1；HBV-F-1和HBV-R-2；HBV-F-2和HBV-R-1；和HBV-F-2和HBV-R-2获得的扩增片段印迹到尼龙膜上，并采用5’末端标记有生物素的HBV-探针1(SEQ IDNO：79)进行斑点杂交。结果观测到所感兴趣的信号。相似地，采用5’末端标记有生物素的HBV-探针2(SEQ ID NO：80)对采用引物对HBV-F-3和HBV-R-3；HBV-F-3和HBV-R-4；HBV-F-4和HBV-R-3；或HBV-F-4和HBV-R-4获得的扩增片段进行斑点杂交。结果观测到所感兴趣的信号。
实施例8
检验采用本发明方法对HCV进行的检测。制备终体积为50μl、含有终浓度如下物质的反应混合液：32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸镁、1％二甲亚砜、0-01％BSA、4mM乙酸镁、500μM各种dNTP、分别为50pmol的引物HCV-A2-S和HCV-A2-A；HCV-A4-S和HCV-A4-A；HCV-A4-S19和HCV-A4-A19；HCV-F1和HCV-R1；或HCV-F2和HCV-R2(SEQ ID NOS：81-86和88-89)、20U的Afu RNase HII或4U的Tli RNase H、4U的BcaBESTDNA聚合酶、20U的RNase抑制物、1-25U的AMV RTase XL，并以实施例2-(2)所描述RNA转录物的106拷贝为模板。反应后，将3μl每个反应混合液加样至3％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果采用任意一种RNase H观测到所感兴趣的扩增片段74-bp、76-bp、78-bp、61-bp和61-bp。采用5’末端标记有生物素的HCV-探针(SEQ ID NO：87)对采用引物对HCV-A2-S和HCV-A2-A；HCV-A4-S和HCV-A4-A；和HCV-A4-S19和HCV-A4-A19所获得的扩增片段进行斑点杂交。结果观测到所感兴趣的信号。相似地，采用5’末端标记有生物素的HCV-D探针(SEQ ID NO：92)对采用引物对HCV-F1和HCV-R1；HCV-F2和HCV-R2所获得的扩增片段进行斑点杂交。结果观测到所感兴趣的信号。
实施例9
检验本发明方法在一步RT-ICAN扩增方法中的应用。选择HIV作为实验材料。
(1)转录物RNA的制备
制备作为模板的转录物RNA。购买插入有HIV gag区域(ATCC40829)的质粒。以该质粒为模板，并采用引物对SP6-HIV-F(SEQ IDNO：93)和HIV-R(SEQ ID NO：94)和Ex Taq DNA聚合酶获得与HIV gag区域相符，约1.4kbp的PCR扩增产物。以该PCR扩增产物为模板，采用竞争性RNA转录试剂盒(Takara Shuzo)，并根据试剂盒所附说明书合成转录物RNA。采用该RNA为RNA模板，以检验一步RT-ICAN。
(2)采用一步RT-ICAN检测HIV所用引物的检验
合成具有SEQ ID NOS：95～103核苷酸序列的引物HIV-F1、HIV-F2、HIV-F3、HIV-F4、HIV-R1、HIV-R2、HIV-R3、HIV-R4和HIV-R4M。如下进行反应。简言之，制备终体积为25μl、含有终浓度如下物质的反应混合液：32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、1％DMSO、0.01％BSA、7mM乙酸镁、500μM各种dNTP、2.2U的Afu RNase HII或4U的T li RNase H、5.5U的BcaBESTDNA聚合酶、0.625U的AMV RTase XL，转录物RNA的106拷贝以及分别为25pmol的上游引物和下游引物。将该反应混合液置于已设定为55℃的热循环控制装置温育60分钟。基于采用任意一种RNase H和引物对：HIV-F1和HIV-R1；HIV-F2和HIV-R2；HIV-F2和HIV-R3；HIV-F2和HIV-R4；HIV-F2和HIV-R4M；HIV-F3和HIV-R2；HIV-F3和HIV-R3；HIV-F3和HIV-R4；HIV-F3和HIV-R4M；HIV-F4和HIV-R2；HIV-F4和HIV-R3；HIV-F4和HIV-R4；和HIV-F4和HIV-R4M的琼脂糖凝胶电泳观测到所感兴趣的扩增片段100-bp、74-bp、76-bp、72-bp、72bp、72bp、74bp、70bp、70bp、76bp、78bp、74bp和74-bp。采用5’末端标记有生物素的HIV-A探针(SEQ ID NO：104)或HIV-B探针(SEQ ID NO：105)对扩增片段进行斑点杂交。结果，如果在5’末端标记有生物素的HIV-A探针，观测到所感兴趣的针对采用引物对HIV-F1和HIV-R1所获扩增产物的信号，并且如果在5’末端标记有生物素的HIV-B探针，检测到所感兴趣的针对采用引物对HIV-F2和HIV-R2；HIV-F2和HIV-R3；HIV-F2和HIV-R4；HIV-F2和HIV-R4M；HIV-F3和HIV-R2；HIV-F3和HIV-R3；HIV-F3和HIV-R4；HIV-F3和HIV-R4M；HIV-F4和HIV-R2；HIV-F4和HIV-R3；HIV-F4和HIV-R4；HIV-F4和HIV-R4M所获扩增产物的信号。
实施例10
检验采用本发明方法对金黄色葡萄球菌的检测。从金黄色葡萄球菌凝固酶基因选择待扩增的关心区域。首先，采用引物coa-PCR-F(SEQID NO：106)和coa-PCR-R(SEQ ID NO：107)，以金黄色葡萄球菌基因组为模板，以及Ex Taq DNA聚合酶进行PCR，获得221-bp的扩增产物。将该扩增片段插入pT7 Blue T载体，以制备coa基因的阳性对照。
合成具有SEQ ID NOS：108～117核苷酸序列的引物coa-F1、coa-F2、coa-F3、coa-F4、coa-F5、coa-R1、coa-R2、coa-R3、coa-R4和coa-R5。以coa基因阳性对照的106拷贝为模板，采用一对引物：coa-F1和coa-R1；coa-F1和coa-R2；coa-F2和coa-R1；coa-F2和coa-R2；coa-F3和coa-R3；coa-F3和coa-R4；coa-F3和coa-R5；coa-F4和coa-R3；coa-F4和coa-R4；coa-F4和coa-R5；coa-F5和coa-R3；coa-F5和coa-R4；或coa-F5和coa-R5，在实施例5所描述条件下进行ICAN反应。结果基于采用任意一种RNase H的琼脂糖凝胶电泳观测到所感兴趣的扩增片段59-bp、69-bp、75-bp、85-bp、95-bp、101-bp、98-bp、89-bp、95-bp、92-bp、107-bp、113-bp和110-bp。采用5’末端标记有生物素的coa-A探针(SEQ ID NO：118)，根据实施例5所描述方法对采用引物对coa-F1和coa-R1；coa-F1和coa-R2；coa-F2和coa-R1；和coa-F2和coa-R2所获得的扩增产物进行斑点杂交。结果所有斑点均观测到所感兴趣的信号。相似地，采用5’末端标记有生物素的coa-B探针(SEQ ID NO：119)，根据实施例5所描述方法对采用引物对coa-F3和coa-R3；coa-F3和coa-R4；coa-F3和coa-R5；coa-F4和coa-R3；coa-F4和coa-R4；coa-F4和coa-R5；coa-F5和coa-R3；coa-F5和coa-R4；或coa-F5和coa-R5所获得的扩增产物进行斑点杂交。结果所有斑点均观测到所感兴趣的信号。
实施例11
(1)检验采用本发明方法对衣原体的检测。根据实施例5所描述方法，通过将符合部分衣原体基因的560-bp扩增片段(SEQ ID NO：120)插入pT7 Blue T载体，以制备衣原体阳性对照。合成具有SEQ IDNOS：121-127核苷酸序列的引物CT-FB19、CT-FB19-3、CT-FB-19-3-21、CT-FB19-3-23、CT-RB21、CT-RB23-2和CT-RB23-2-24。以衣原体阳性对照的106拷贝为模板，采用引物对：CT-FB19和CT-RB21；CT-FB19和CT-RB23-2；CT-FB19-3和CT-RB21、CT-FB19-3和CT-RB23-2；CT-FB19-3和CT-RB23-2-24；CT-FB-19-3-21和CT-RB23-2；CT-FB-19-3-21和CT-RB23-2-24；CT-FB19-3-23和CT-RB23-2；或CT-FB19-3-23和CT-RB23-2-24，在实施例5所描述条件下进行ICAN反应。结果基于采用任意一种RNase H的琼脂糖凝胶电泳观测到所感兴趣的扩增片段125-bp、116-bp、116-bp、107-bp、107-bp、107-bp、107-bp、107-bp和107-bp。采用5’末端标记有生物素的CT-探针(SEQ ID NO：128)，并根据实施例5所描述方法对扩增片段进行斑点杂交。结果所有斑点均观测到所感兴趣的信号。
(2)检验以另一区域为目标对衣原体的检测。根据上文(1)所描述方法，通过将符合部分衣原体隐性基因的560-bp扩增片段(SEQID NO：129)插入pT7 Blue T载体，制备衣原体阳性对照2。合成具有SEQ ID NOS：130-135和166-167核苷酸序列的引物CT-F1212-20、CT-F1212-21、CT-F1212-22、CT-R1272-20、CT-R1272-21、CT-R1272-22、CT-F1215-4R-22和CT-R1267-3R-18。以衣原体阳性对照2的106拷贝为模板，采用引物对：CT-F1212-20和CT-R1272-20；CT-F1212-20和CT-R1272-21；CT-F1212-20和CT-R1272-22、CT-F1212-21和CT-R1272-20；CT-F1212-21和CT-R1272-21；CT-F1212-21和CT-R1272-22；CT-F1212-22和CT-R1272-20；CT-F1212-22和CT-R1272-21；或CT-F1212-22和CT-R1272-22，在上文(1)所描述条件下进行ICAN反应。结果基于所有情况中采用任意一种RNase H的琼脂糖凝胶电泳观测到所感兴趣的61-bp扩增产物。采用5’末端标记有生物素的CT-1234探针(SEQ ID NO：136)，并根据实施例5所描述方法对扩增片段进行斑点杂交。结果所有斑点均观测到所感兴趣的信号。另外，采用引物对CT-F1215-4R-22和CT-R1267-3R-18进行ICAN反应。结果基于采用任意一种RNase H的琼脂糖凝胶电泳观测到所感兴趣的53-bp扩增产物。采用5’末端标记有生物素的CT-1236探针(SEQ ID NO：168)，并根据实施例5所描述方法对扩增片段进行斑点杂交。结果所有斑点均观测到所感兴趣的信号。
实施例12
检验采用本发明方法对肺炎支原体的检测。根据实施例5所描述方法，通过将与部分肺炎支原体ATPase操纵子基因相符的560-bp扩增片段(SEQ ID NOS：137和138)插入pT7 Blue T载体，制备肺炎支原体阳性对照A和肺炎支原体阳性对照B。合成具有SEQ IDNOS：139-146核苷酸序列的引物Myco-140、Myco140-22、Myco-706、MPF-910、Myco-190、Myco-190-22、Myco-850和MPR-1016。以肺炎支原体阳性对照A的106拷贝为模板，采用引物对：Myco-140和Myco-190；Myco140-22和Myco-190；Myco140-22和Myco-190-22；或Myco140和Myco-190-22，在实施例5所描述条件下进行ICAN反应。结果基于所有情况中采用任意一种RNase H的琼脂糖凝胶电泳观测到所感兴趣的63-bp扩增产物。以肺炎支原体阳性对照B的106拷贝为模板，采用引物对：Myco-706和Myco-850；或MPF-910和MPR-1016，在实施例5所描述条件下进行ICAN反应。结果基于采用任意一种RNase H的琼脂糖凝胶电泳观测到所感兴趣的85-bp和107-bp扩增产物。采用5’末端标记有生物素的Myco-170-探针(SEQID NO：147)，并根据实施例5所描述方法对采用引物对Myco-140和Myco-190；Myco140-22和Myco-190；Myco140-22和Myco-190-22；和Myco-140和Myco-190-22所扩增片段进行斑点杂交。结果所有斑点均观测到所感兴趣的信号。相似地，采用5’末端标记有生物素的Myco-730-探针(SEQ ID NO：148)对采用引物对Myco-706和Myco-850所扩增片段进行斑点杂交。结果观测到所感兴趣的信号。此外，采用5’末端标记有生物素的Myco-952-探针(SEQ ID NO：149)对采用引物对MPF-910和MPR-1016获得的扩增片段进行斑点杂交。结果观测到所感兴趣的信号。
实施例13
检验采用本发明方法对抗二甲氧基苯青霉素的金黄色葡萄球菌的检测。从MecA基因选择出待扩增的关心区域。根据实施例5所描述方法，通过将与部分MecA基因相符的560-bp扩增片段，MecA-A和MecA-B(SEQ ID NOS：150和151)插入pT7 Blue T载体中，制备MecA阳性对照A和B。以MecA阳性对照A的106拷贝为模板，采用引物对MecA-S525和MecA-A611，或以MecA阳性对照B的106拷贝为模板，采用引物对MecA-S1281和MecA-A1341，在实施例5所描述条件下进行ICAN反应。结果基于采用任意一种RNase H的琼脂糖凝胶电泳观测到106-bp和83-bp扩增片段。
将采用引物对MecA-S525和MecA-A611所获得扩增片段进行ICAN反应后，所获ICAN反应混合液1μl印迹到转移至尼龙膜Hybond-N上，并采用5’末端标记有生物素的MecA-A探针(SEQ IDNO：156)，根据实施例5所描述方法进行斑点杂交。此外，以相同方式将采用引物对MecA-S1281和MecA-A1341所获得扩增片段转移至印迹到尼龙膜上，并采用5’末端标记有生物素的MecA-B探针(SEQID NO：157)，进行斑点杂交。结果采用两种探针均观测到信号，证实扩增了所感兴趣的区域。
实施例14
验证本发明方法可应用的RNase H。
(1)基于载体质粒pDON-AI(Takara Shuzo)中包装区域的核苷酸序列合成具有SEQ ID NOS：158和159核苷酸序列的引物pDON-AI-1(22)和pDON-AI-2(23)。将总体积为25μl、包括1μl含下列物质：10fg的pDON-AI DNA或作为阴性对照的水、100pmol各种引物、0.5mM各种dNTPs、32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、4.0mM乙酸镁、0.01％牛血清白蛋白、1.0％二甲亚砜、2.64U的Bca DNA聚合酶和8.75、4.38、2.19、1.09、0.55或0.27U的Afu RNase HII、4.69、2.34、1.17、0.59、0.29、0.15或0.07U的PfuRNase HII、或14、7、3.5、1.75、0.875或0.438U的Pho RNase HII的溶液的反应混合液置于热循环控制装置中，于64℃温育1小时。反应后，采用3.0％琼脂糖凝胶电泳，对5μl每种反应混合液进行分析。结果采用无论多少单位的Afu RNase HII均观测到所感兴趣的扩增产物。此外，采用0.59～4.69U的Pfu RNase HII或1.75～14U的PhoRNase HII时观测到所感兴趣的扩增产物。基于这些结果，证实所有耐热RNase HIIs均可被优选地应用在本发明方法中。
(2)采用热循环控制装置，使总体积为50μl、包括含下列物质：基于小鼠可诱导NO合酶(iNOS)的mRNA的核苷酸序列合成的具有SEQ ID NOS：160和161核苷酸序列的两种引物各50pmol、1μl根据常规方法从商业可提供小鼠细胞制备的cDNA(相当于50ng的RNA)、5μl的10×Ex Taq缓冲液(Takara Shuzo)、1.25U的TaKaRaEx Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)和0.2mM各种dNTPs的反应混合液进行反应。程序如下：94℃ 1个循环2分钟；30个循环包括94℃30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒；72℃ 1个循环5分钟。将作为本发明方法的模板，并来源自小鼠iNOS cDNA的PCR扩增片断克隆进入质粒载体pT7 Blue T-vector(Novagen)。将总体积均为25μl、包括1μl含下列物质：10fg作为模板的质粒DNA或1ml作为阴性对照的水、分别为100pmol的两种引物NS5(SEQ ID NO：9)和NS6(SEQID NO：10)、0.5mM各种dNTPs、32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、4.0mM乙酸镁、0.01％牛血清白蛋白、1.0％二甲亚砜、2.64U的Bca DNA聚合酶和10、5、2.5、1.25、0.25、0.125U的詹氏甲烷球菌(Mja)RNase HII、Tce RNase HII或Tli RNaseHII的溶液的反应混合液置于热循环控制装置中，于62□温育1小时。根据Structure，8：897-904所描述方法制备Mja RNase HII。反应后，采用3.0％琼脂糖凝胶电泳，对5μl每种反应混合液进行分析。结果如图7所示。图7是显示采用三种类型的RNase H所获扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。图7A、7B和7C分别说明采用詹氏甲烷球菌RNase HII、速生热球菌RNase HII和litoralis热球菌RNase HII所获结果。泳道1：10U的RNase HII；泳道2：10U的RNase HII，阴性对照；泳道3：5U的RNase HII；泳道4：5U的RNase HII，阴性对照；泳道5：2.5U的RNase HII；泳道6：2.5U的RNase HII，阴性对照；泳道7：1.25U的RNase HII；泳道8：1.25U的RNase HII，阴性对照；泳道9：0.25U的RNase HII；泳道10：0.25U的RNase HII，阴性对照；泳道11：0.125U的RNase HII；和泳道12：0.125U的RNaseHII，阴性对照。
如图7所示，采用0.125～10U的Mja RNase HII、1～5U的TceRNase HII或0.125～5U的Tli RNase HII均观测到所感兴趣的扩增产物。基于这些结果，证实所有这些耐热RNase HII2均可被优选地应用在本发明方法中。
(3)除了采用不同类型和量的RNase H以外，在实施例5所描述反应条件下进一步检验本发明方法。以1U的litoralis热球菌RNaseHII或8.75U的速生热球菌RNase HII为RNase H。以HBV阳性对照1-T的106拷贝为模板，并采用实施例7中制备的引物对HBV-F-2和HBV-R-1进行扩增反应。结果，基于采用任意一种RNase H的琼脂糖凝胶电泳观测到所感兴趣的76-bp扩增片段。基于这些结果，证实两种RNase HII均可根据本发明被优选采用。
实施例15
采用含内部对照的反应体系验证本发明检测方法。首先，根据实施例5所描述方法制备结核杆菌的内部对照。根据BioTechniques，9(3)：298-300(1990)所描述方法，采用Ex Taq DNA聚合酶进行延伸反应，继而通过采用4个60-mer合成引物以获得具有SEQ IDNO：169核苷酸序列的169-bp扩增产物。采用DNA Ligation KitVer.2(Takara Bio)将该扩增产物插入pT7 Blue T载体中。将该连接混合物用于转化大肠杆菌JM109。以所得质粒作为结核杆菌的内部对照。合成具有SEQ ID NOS：170和171核苷酸序列的MTIS2F16和MTIS2RAAC。采用该引物对扩增的区域长度，包括引物部分在内为98bp。
如下进行反应。制备终体积为25μl、含有终浓度如下物质的反应混合液：32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、1％DMSO、0.01％BSA、0.1％丙烯二胺、4mM乙酸镁、500μM各种dNTP、分别为25pmol的引物MTIS2F16和MTIS2RAAC、结核杆菌内部对照的103拷贝、2.2U的Afu RNase HII或8U的Tli RNase H、11U的BcaBEST DNA聚合酶、1μl模板和无菌水。以实施例1中所用的0、1或10pg的BCG基因组DNA为模板。将该反应混合液置于已设定为60℃的Thermal Cycler Personal中温育60分钟。将ICAN反应后所获样品印迹到尼龙膜上，并采用5’末端标记有生物素，用于检测结核杆菌MTIS-S-PROBE(SEQ ID NO：172)的探针，或者5’末端标记有生物素，用于检测内部对照INTER-PROBE(SEQ IDNO：173)的探针，根据实施例5所描述方法进行斑点杂交。结果当将无添加BCG基因组DNA进行ICAN反应后所获样品印迹时，采用MTIS-S-PROBE未观测到任何信号，而采用INTER-PROBE则观测到信号。当将添加有1pg的BCG基因组DNA进行ICAN反应后所获样品印迹时，采用MTIS-S-PROBE观测到信号，而采用INTER-PROBE则未观测到任何信号。基于这些结果，证实如果扩增作为目标的BCG基因组，采用MTIS-S-PROBE可观测到信号，反之如果扩增内部对照，采用INTER-PROBE也可观测到信号。从而证实根据本发明方法，即使在内部对照存在条件下，也可特异地检测到目标核酸。
工业适用性
本发明提供了扩增目标核酸方法或检测目标核酸方法所用反应试剂的稳定化和长期保存方法，其中目标核酸的核苷酸序列中适于特定扩增的区域是通过采用了嵌合寡核苷酸引物进行DNA合成反应而得以扩增的，检测方法则包括对由通过扩增方法所获目标核酸扩增而得的片段的检测步骤。本发明也提供了用于高度灵敏和特异性检测或定量微生物(尤其是致病微生物)如病毒、细菌、真菌或酵母，检测目标核酸的方法，以及该方法所用嵌合寡核苷酸引物和探针。
序列表说明
SEQ ID NO：1：设计的寡核苷酸引物，被命名为pUC19上游150，以扩增部分质粒pUC19。
SEQ ID NO：2：设计的寡核苷酸引物，被命名为pUC19下游NN，以扩增部分质粒pUC19。
SEQ ID NO：3：设计的寡核苷酸引物，被命名为MCS-F，以扩增长DNA片段。
SEQ ID NO：4：设计的寡核苷酸引物，被命名为MCS-R，以扩增长DNA片段。
SEQ ID NO：5：设计的寡核苷酸引物，被命名为MF2，以扩增部分pUC19质粒DNA。
SEQ ID NO：6：设计的寡核苷酸引物，被命名为MR1，以扩增部分pUC19质粒DNA。
SEQ ID NO：7：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为K-F-1033-2，以扩增部分结核杆菌DNA。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：8：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为K-R-1133-2，以扩增部分结核杆菌DNA。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：9：设计的嵌合寡核苷酸引物，以扩增来源自小鼠的部分INOS编码序列。“核苷酸21～23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：10：设计的嵌合寡核苷酸引物，以扩增来源自小鼠的部分INOS编码序列。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：11：设计的寡核苷酸探针，被命名为MTIS，以检测扩增部分结核杆菌序列的DNA片段。
SEQ ID NO：12：设计的寡核苷酸探针，被命名为MTIS-2，以检测扩增部分结核杆菌序列的DNA片段。
SEQ ID NO：13：设计的寡核苷酸引物，被命名为SP6-HCV-F，以扩增部分HCV。
SEQ ID NO：14：设计的寡核苷酸引物，被命名为T7-HCV-R，以扩增部分HCV。
SEQ ID NO：15：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A2-S，以扩增部分HCV。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：16：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A2-A，以扩增部分HCV。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：17：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT2F，以扩增部分沙眼衣原体隐性质粒DNA。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：18：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT2R，以扩增部分沙眼衣原体隐性质粒DNA。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：19：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-FB19-3，以扩增部分沙眼衣原体隐性质粒DNA。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：20：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-RB23-2，以扩增部分沙眼衣原体隐性质粒DNA。“核苷酸21～23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：21：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为K-F-1033(68)，以扩增部分结核杆菌DNA。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：22：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为K-R-1133(68)，以扩增部分结核杆菌DNA。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：23：来源自鸟分枝杆菌的16S rRNA的核苷酸序列
SEQ ID NO：24：来源自胞内分枝杆菌的16S rRNA的核苷酸序列
SEQ ID NO：25：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-F-1，以扩增部分分枝杆菌16S rRNA。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：26：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-F-2，以扩增部分分枝杆菌16S rRNA。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：27：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-F-3，以扩增部分分枝杆菌16S rRNA。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：28：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-R-1，以扩增部分分枝杆菌16S rRNA。“核苷酸17～19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：29：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-R-1-2，以扩增部分分枝杆菌16S rRNA。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：30：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-R-2I，以扩增来源自胞内分枝杆菌的部分16S rRNA编码序列。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：31：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-R-2A，以扩增来源自鸟分枝杆菌的部分16S rRNA编码序列。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：32：设计的寡核苷酸探针，被命名为鸟分枝杆菌-探针，以检测扩增来源自鸟分枝杆菌的部分16S rRNA编码序列的DNA片段。
SEQ ID NO：33：设计的寡核苷酸探针，被命名为胞内分枝杆菌-探针，以检测扩增来源自胞内分枝杆菌的部分16S rRNA编码序列的DNA片段。
SEQ ID NO：34：来源自淋病奈氏球菌的CppB基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：35：来源自淋病奈氏球菌的pJD4质粒DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：36：来源自淋病奈氏球菌的M.NgoMIII基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：37：来源自淋病奈氏球菌的胞嘧啶甲基转移酶的核苷酸序列。
SEQ ID NO：38：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-5103，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分pJDB4质粒DNA。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：39：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-5150，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分pJDB4质粒DNA。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：40：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-CppB-F1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸17～19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：41：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-CppB-F2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：42：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-CppB-F3，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：43：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-CppB-R1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：44：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-CppB-R2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸17～19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：45：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-CppB-R3，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：46：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pJDB F-1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：47：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pJDB F-2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：48：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pJDB R-1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸13～15为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：49：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pJDB R-2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸14～16为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：50：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pJDB R-3，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸15～17为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：51：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为M.Ngo F-1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：52：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为M.Ngo F-2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：53：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为M.Ngo F-3，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因。“核苷酸17～19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：54：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为M.Ngo R-1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：55：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为M.Ngo R-2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因。“核苷酸17～19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：56：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为M.Ngo R-3，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：57：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为M.Ngo R-4，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：58：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为胞嘧啶F-1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分甲基转移酶基因。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：59：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为胞嘧啶F-2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分甲基转移酶基因。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：60：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为胞嘧啶F-3，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分甲基转移酶基因。“核苷酸17～19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：61：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为胞嘧啶R-1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分甲基转移酶基因。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：62：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为胞嘧啶R-2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分甲基转移酶基因。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：63：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为胞嘧啶R-3，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分甲基转移酶基因。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：64：设计的寡核苷酸探针，被命名为NEI-5130，以检测扩增来源自淋病奈氏球菌的部分pJDB4质粒的DNA片段。
SEQ ID NO：65：设计的寡核苷酸探针，被命名为NEI-CppB探针-1，以检测扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB编码序列的DNA片段。
SEQ ID NO：66：设计的寡核苷酸探针，被命名为NEI-CppB探针-2，以检测扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB编码序列的DNA片段。
SEQ ID NO：67：设计的寡核苷酸探针，被命名为M.Ngo-探针，以检测扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因编码序列的DNA片段。
SEQ ID NO：68：设计的寡核苷酸探针，被命名为胞嘧啶-探针，以检测扩增来源自淋病奈氏球菌的部分甲基转移酶编码序列的DNA片段。
SEQ ID NO：69：来源自乙型肝炎病毒的X-蛋白质的核苷酸序列
SEQ ID NO：70：来源自乙型肝炎病毒的X-蛋白质的核苷酸序列
SEQ ID NO：71：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-F-1，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸22～24为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：72：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-F-2，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：73：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-F-3，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：74：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-F-5，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸22～24为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：75：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-R-1，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：76：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-R-2，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸21～23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：77：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-R-3，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：78：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-R-4，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸22～24为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：79：设计的寡核苷酸探针，被命名为HBV-探针1，以检测扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质编码序列的DNA片段。
SEQ ID NO：80：设计的寡核苷酸探针，被命名为HBV-探针2，以检测扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质编码序列的DNA片段。
SEQ ID NO：81：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A2-S，以扩增部分丙型肝炎病毒基因。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：82：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A2-A，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：83：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A4-S，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸15～17为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：84：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A4-A，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：85：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A4-S19，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸17～19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：86：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A4-A19，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸17～19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：87：设计的寡核苷酸探针，被命名为HCV-C探针，以检测扩增部分丙型肝炎病毒的DNA片段。
SEQ ID NO：88：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-F1，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸17～19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：89：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-R1，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：90：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-F2，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：91：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-R2，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸17～19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：92：设计的寡核苷酸探针，被命名为HCV-D探针，以检测扩增丙型肝炎病毒的DNA片段。
SEQ ID NO：93：设计的寡核苷酸引物，被命名为SP6-HIV-F，以扩增来源自HIV的部分gag序列。
SEQ ID NO：94：设计的寡核苷酸引物，被命名为HIV-R，以扩增来源自HIV的部分gag序列。
SEQ ID NO：95：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-F1，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：96：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-F2，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：97：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-F3，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：98：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-F4，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：99：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-R1，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：100：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-R2，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：101：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-R3，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：102：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-R4，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：103：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-R4M，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：104：设计的寡核苷酸探针，被命名为HIV-A探针，以检测扩增来源自HIV的部分gag序列的DNA片段。
SEQ ID NO：105：设计的寡核苷酸探针，被命名为HIV-B探针，以检测扩增来源自HIV的部分gag序列的DNA片段。
SEQ ID NO：106：设计的寡核苷酸引物，被命名为coa-PCR-F，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。
SEQ ID NO：107：设计的寡核苷酸引物，被命名为coa-PCR-R，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。
SEQ ID NO：108：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-F1，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：109：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-F2，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸17～19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：110：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-F3，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：111：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-F4，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：112：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-F5，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：113：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-R1，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：114：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-R2，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：115：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-R3，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：116：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-R4，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：117：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-R5，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：118：设计的寡核苷酸探针，被命名为coa-A探针，以检测扩增来源自金黄色葡萄球菌的凝固酶基因的DNA片段。
SEQ ID NO：119：设计的寡核苷酸探针，被命名为coa-B探针，以检测扩增来源自金黄色葡萄球菌的凝固酶基因的DNA片段。
SEQ ID NO：120：来源自沙眼衣原体的隐性质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：121：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-FB19，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸17～19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：122：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-FB19-3，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：123：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-FB19-3-21，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：124：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-FB19-3-23，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸21～23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：125：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-RB21，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：126：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-RB23-2，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸21～23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：127：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-RB23-2-24，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸22～24为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：128：设计的寡核苷酸探针，被命名为CT-探针，以检测扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA的DNA片段。
SEQ ID NO：129：来源自沙眼衣原体的criptic质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：130：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-F1212-20，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：131：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-F1212-21，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：132：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-F1212-22，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：133：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-R1272-20，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：134：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-R1272-21，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：135：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-R1272-22，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：136：设计的寡核苷酸探针，被命名为CT-1234探针，以检测扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA的DNA片段。
SEQ ID NO：137：来源自肺炎支原体的ATPase操纵子的核苷酸序列
SEQ ID NO：138：来源自肺炎支原体的ATPase操纵子的核苷酸序列
SEQ ID NO：139：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-140，以扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：140：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-140-22，以扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：141：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-706，以扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：142：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MPF-910，以扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：143：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-190，以扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：144：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-190-22，以扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：145：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-850，以扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：146：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MPR-1016，以扩增来源自肺炎支原体的部分。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：147：设计的寡核苷酸探针，被命名为Myco170-探针，以检测扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子的DNA片段。
SEQ ID NO：148：设计的寡核苷酸探针，被命名为Myco730-探针，以检测扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子的DNA片段。
SEQ ID NO：149：设计的寡核苷酸探针，被命名为Myco952-探针，以检测扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子的DNA片段。
SEQ ID NO：150：来源自金黄色葡萄球菌的MecA基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：151：来源自金黄色葡萄球菌的MecA基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：152：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MecA-S525，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分MecA基因。“核苷酸21～23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：153：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MecA-A611，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分MecA基因。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：154：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MecA-S1281，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分MecA基因。“核苷酸21～23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：155：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MecA-A1341，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分MecA基因。“核苷酸21～23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：156：设计的寡核苷酸探针，被命名为MecA-A探针，以检测扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分MecA基因的DNA片段。
SEQ ID NO：157：设计的寡核苷酸探针，被命名为MecA-B探针，以检测扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分MecA基因的DNA片段。
SEQ ID NO：158：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pDON-AI-1(22)，以扩增部分pDON-AI质粒DNA。“核苷酸20～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：159：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pDON-AI-2(23)，以扩增部分pDON-AI质粒DNA。“核苷酸21～23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：160：设计的寡核苷酸引物，用以扩增来源自小鼠的部分iNOS编码序列。
SEQ ID NO：161：设计的寡核苷酸引物，用以扩增来源自小鼠的部分iNOS编码序列。
SEQ ID NO：162：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MTIS 2F，以扩增部分结核杆菌序列。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID N0：163：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MTIS 2R，以扩增部分结核杆菌序列。“核苷酸19～21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：164：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pJDB10F，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：165：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pJDB10R，以扩增来源自淋球菌的部分CppB基因。“核苷酸15～17为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：166：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-F1215-4R-22，以扩增部分沙眼衣原体隐性质粒DNA。“核苷酸19～22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：167：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-R1267-3R-18，以扩增部分沙眼衣原体隐性质粒DNA。“核苷酸16～18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：168：设计的寡核苷酸探针，被命名为CT-1236探针，以检测扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA的DNA片段。
SEQ ID NO：169：设计的核苷酸，作为结核杆菌鉴定所用的内部对照。
SEQ ID NO：170：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MTIS2F16，以扩增部分结核杆菌DNA。“核苷酸14～16为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：171：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MTIS2RAAC，以扩增部分结核杆菌DNA。“核苷酸18～20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
SEQ ID NO：172：设计的寡核苷酸探针，被命名为MTIS-S-PROBE，以检测扩增来源自结核杆菌的部分核苷酸序列的DNA片段。
SEQ ID NO：173：设计的寡核苷酸探针，被命名为INTER-PROBE，以检测扩增来源自结核杆菌的部分核苷酸序列的DNA片段。
序列表
<110>TAKARA BIO公司
<120>核酸扩增或检测用试剂的稳定化方法和保存方法
<130>663232
<150>JP 2001-177737
<151>2001-06-12
<150>JP 2001-249689
<151>2001-08-20
<160>173
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，被命名为pUC19上游150，以扩增部分质粒pUC19。
<400>1
ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatg    25
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，被命名为pUC19下游NN，以扩增部分质粒pUC19。
<400>2
gataacactg cggccaactt acttc    25
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，被命名为MCS-F，以扩增长DNA片段。
<400>3
ccattcaggc tgcgcaactg tt       22
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，被命名为MCS-R，以扩增长DNA片段。
<400>4
tggcacgaca ggtttcccga ct            22
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，被命名为MF2，以扩增部分pUC19质粒DNA。
<400>5
ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta    30
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，被命名为MR1，以扩增部分pUC19质粒DNA。
<400>6
tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt    30
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为K-F-1033-2，以扩增部分结核杆菌DNA。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>7
cagtacacat cgatccgguu c     21
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为K-R-1133-2，以扩增部分结核杆菌DNA。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>8
gatcgtctcg gctagtgcau ug    22
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，以扩增来源自小鼠的部分INOS编码序列。“核苷酸21~23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>9
ctcatgccat tgagttcatc aac    23
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，以扩增来源自小鼠的部分INOS编码序列。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>10
gctggtaggt tcctgttgtu uc     22
<210>11
<211>24
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为MTIS，以检测扩增部分结核杆菌序列的DNA片段。
<400>11
accuaugugu cgaccugggc aggg   24
<210>12
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID N0：12：设计的寡核苷酸探针，被命名为MTIS-2，以检测扩增部分结核杆菌序列的DNA片段。
<400>12
gaccucaccu augugucgac                                20
<210>13
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，被命名为SP6-HCV-F，以扩增部分HCV。
<400>13
ccatttaggt gacactatag aatactgatg ggggcgacac tccac    45
<210>14
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，被命名为T7-HCV-R，以扩增部分HCV。
<400>14
agctctaata cgactcacta tagggtcgca agcaccctat caggc     45
<210>15
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A2-S，以扩增部分HCV。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>15
ctttcttgga tcaacccg                                   18
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A2-A，以扩增部分HCV。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>16
aacactactc ggctagcagu                                 20
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT2F，以扩增部分沙眼衣原体隐性质粒DNA。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>17
ctggatttat cggaaaccuu    20
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT2R，以扩增部分沙眼衣原体隐性质粒DNA。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>18
aggcctctga aacgacuu    18
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-FB19-3，以扩增部分沙眼衣原体隐性质粒DNA。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>19
catacggttt tcctcgatga uu    22
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-RB23-2，以扩增部分沙眼衣原体隐性质粒DNA。“核苷酸21~23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>20
gatctacgca atggattttc auu    23
<210>21
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为K-F-1033(68)，以扩增部分结核杆菌DNA。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>21
gtacacatcg atccggttca gc    22
<210>22
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为K-R-1133(68)，以扩增部分结核杆菌DNA。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>22
gttgatcgtc tcggctagtg ca                                          22
<210>23
<211>560
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>23
gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac ggaaaggcct cttcggaggt  60
actcgagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggcaatctg ccctgcactt cgggataagc 120
ctgggaaact gggtctaata ccggatagga cctcaagacg catgtcttct ggtggaaagc 180
ttttgcggtg tgggatgggc ccgcggccta tcagcttgtt ggtggggtga cggcctacca 240
aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg tgtccggcca cactgggact gagatacggc 300
ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa gcctgatgca 360
gcgacgccgc gtgggggatg acggccttcg ggttgtaaac ctctttcacc atcgacgaag 420
gtccgggttt tctcggattg acggtaggtg gagaagaagc accggccaac tacgtgccag 480
cagccgcggt aatacgtagg gtgcgagcgt tgtccggaat tactgggcgt aaagagctcg 540
taggtggttt gtcgcgttgt                                             560
<210>24
<211>560
<212>DNA
<213>胞内分枝杆菌
<400>24
atcctggctc aggacgaacg ctggcggcgt gcttaacaca tgcaagtcga acggaaaggc  60
cccttcgggg gtactcgagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgggcaatc tgccctgcac 120
ttcgggataa gcctgggaaa ctgggtctaa taccggatag gacctttagg cgcatgtctt 180
taggtggaaa gcttttgcgg tgtgggatgg gcccgcggcc tatcagcttg ttggtggggt 240
gatggcctac caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag ggtgtccggc cacactggga 300
ctgagatacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc 360
aagcctgatg cagcgacgcc gcgtggggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca 420
ccatcgacga aggtccgggt tttctcggat tgacggtagg tggagaagaa gcaccggcca 480
actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggtgcgagc gttgtccgga attactgggc 540
gtaaagagct cgtaggtggt                                             560
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-F-1，以扩增部分分支杆菌16SrRNA。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>25
caatctgccc tgcacttcgg                                             20
<210>26
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-F-2，以扩增部分分支杆菌16SrRNA。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>26
caatctgccc tgcacuuc    18
<210>27
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>：设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-F-3，以扩增部分分支杆菌16SrRNA。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>27
gtgggcaatc tgcccugc     18
<210>28
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-R-1，以扩增部分分支杆菌16SrRNA。“核苷酸17~19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>28
cccacaccgc aaaagcuuu     19
<210>29
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-R-1-2，以扩增部分分支杆菌16SrRNA。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>29
accgcaaaag ctttccac      18
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-R-2I，以扩增来源自胞内分枝杆菌的部分16S rRNA编码序列。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>30
accgcaaaag ctttccaccu a    21
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-R-2A，以扩增来源自鸟结核分支杆菌的部分16S rRNA编码序列。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>31
accgcaaaag ctttccacca g     21
<210>32
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为鸟结核分支杆菌-探针，以检测扩增来源自鸟结核分支杆菌的部分16S rRNA编码序列的DNA片段。
<400>32
atgcgtcttg aggt              14
<210>33
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为胞内分枝杆菌-探针，以检测扩增来源自胞内分枝杆菌的部分16S rRNA编码序列的DNA片段。
<400>33
atgcgcctaa aggt                                                   14
<210>34
<211>560
<212>DNA
<213>淋病奈氏球菌
<400>34
cgctctgccg ctctaactcg gctgccaagc tcgctagctg ctgcgctaaa ctcgtgtttt  60
cctgctctag ctctgccaac ctttcgccca agtgcgttaa ggctttcatc attcgctgct 120
cgattgctgc gtgattgctc tctaattccg ctaacgcgtc cagcattcgc ttctcggtcg 180
ctacgcatac ccgcgttgct ttgctgttct cgactgggca attttccagt gtcaaacctt 240
tggtcttggt ttccaacagg tctagggtgc gctctgcttc ggctctctgc tgtttcaagt 300
cgtccagctc gttcttgacg ctccatatcg ctatgaacag ccctgctatg actatcaacc 360
ctgccgccga tatacctagc aagctccaca gatagggctt gaatactgcc ttgctcatgc 420
gtaactgccg ggcgtttata tcggcggtta ttttctgctc gctttgcttc aatgcctcgt 480
tgatattttt ccgtaacgtc tctaagtctg ctttcgtttg ttgctctatg ctggcggctt 540
cggtgcgtga tgtctgctcg                                             560
<210>35
<211>560
<212>DNA
<213>淋病奈氏球菌
<400>35
gttgatagcg gtagcaataa actaccctac tctttcgcta tccataccga taaaaataat  60
cataatcccc attgtcattt gatattttca gaacgccaac ttgacggcat agaccgtaca 120
gccgagcagt tttttaaacg tgctaatact aaatccccag aaaagggcgg agcgatgaaa 180
acggcagatt ttcgagatcg tgagtttatc caatctgtcc gaaaaacgtg gagagagcaa 240
gctaatcaag ccttagagca atacggatat gccgcacgaa ttgacgaacg tagctacaag 300
gaacaaggca tagagcaagc cccaagagca agaattgaca gggtaacgtg gcaagaattg 360
aaccgattag agcaagaaga acgccaaatc gtgcaagagc ttgcacttaa aggacaagaa 420
attaacaaag aaaaatccta cttgcagaaa atcgaagaaa aacaggctca aggaatgggc 480
aaatatgaat ccaaattcgc agctgcgttt tctaaattat cggaaagtgc cctaaaacac 540
gatttaagca acgaaaaaga                                             560
<210>36
<211>560
<212>DNA
<213>淋病奈氏球菌
<400>36
gccgatttgg atattgattg gaaattccca aaaagaacac attccgaaga caggttgaat  60
tgggaaaagt atgtaacggg ggaatactgg gaaaaacaca acgaacccaa aagattcaat 120
aaagatattg ctgaaaagtt acaaaaaaaa tacggtatat tcgaaccaga aaaaaaacct 180
tggcaaacgg taagggatac cttgtccgac atcccgcatc ctttggggaa tcataaaatt 240
acaggacatg aatataggga tggcgcaaga atttatcccg gacacacagg aagcgggata 300
gacgaaccgt ccaaaaccat taaagcaggt gggcatggcg ttcccggcgg agaaaatatg 360
attcgttatg atgatggaac agtcagatac tttaccagct atgaagcaaa acttcttcaa 420
acattccctg aagaatttgt catttctgga gcttggggag aagcaatgcg acaaattggc 480
aatgcggttc ctgtcaaatt gtcggaaatt ttaggcaaac atctgatggg ggtgttgtcg 540
gagaaaagca gcctgcacaa                                             560
<210>37
<211>490
<212>DNA
<213>淋病奈氏球菌
<400>37
tgtgattcag gtgaagggat gaaagatatc agaatactag atgcgtgctg tgggtctaga  60
atgttttggt tcgataaaaa ggaaccacat acgacataca tggatagacg tgaagaagaa 120
tttgaaattc acaaaaagaa aatcaatgtc aagccagata ttgttgcaga ttttcgagac 180
atgccatttg atgatgaaac atttaacctt gttgtatttg atccgccaca ccttctctgg 240
gcaggtcaga aatcattcat gcgtgcgcaa tatggtcaac tagacttgtt gacttggaga 300
ttagacttgc agcaaggttt tgaagaatgt ttcagagtat taaaaagagg tggaacactt 360
atttttaagt ggtcggatgc tcaagtaaat gttaaggaaa ttttggaatt agtcccacaa 420
aaaccacttt ttgggcaaca acgtgggaca actcactgga tggcttttat gaaattttag 480
gaggtattga                                                        490
<210>38
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-5103，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分pJDB4质粒DNA。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>38
taatcaagcc ttagagcaau ac    22
<210>39
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-5150，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分pJDB4质粒DNA。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>39
atgccttgtt ccttgtagcu ac     22
<210>40
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-CppB-F1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸17~19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>40
gctctaactc ggctgccaa         19
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-CppB-F2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>41
gctctaactc ggctgccaag    20
<210>42
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-CppB-F3，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>42
gctctaactc ggctgcca      18
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-CppB-R1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>43
tagagcagga aaacacgagu    20
<210>44
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-CppB-R2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸17~19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>44
tagagcagga aaacacgag    19
<210>45
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为NEI-CppB-R3，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>45
tagagcagga aaacacgagu u    21
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pJDB F-1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>46
ctttgcttca atgcctcguu     20
<210>47
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pJDB F-2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>47
ctttgcttca atgcctcguu g    21
<210>48
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pJDB R-1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸13~15为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>48
catcacgcac cgaag            15
<210>49
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pJDB R-2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸14~16为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>49
catcacgcac cgaagc           16
<210>50
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pJDB R-3，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸15~17为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>50
catcacgcac cgaagcc       17
<210>51
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为M.Ngo F-1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>51
acacacagga agcgggatag a    21
<210>52
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为M.Ngo F-2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>52
acacacagga agcgggauag    20
<210>53
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为M.Ngo F-3，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因。“核苷酸17~19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>53
acacacagga agcgggaua      19
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为M.Ngo R-1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>54
acgccatgcc cacctgcuuu    20
<210>55
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为M.Ngo R-2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因。“核苷酸17~19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>55
acgccatgcc cacctgcuu     19
<210>56
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为M.Ngo R-3，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>56
acgccatgcc cacctgcu     18
<210>57
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为M.Ngo R-4，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>57
acgccatgcc caccugc       17
<210>58
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为胞嘧啶F-1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分甲基转移酶基因。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>58
tatttgatcc gccacaccuu    20
<210>59
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为胞嘧啶F-2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分甲基转移酶基因。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>59
tatttgatcc gccacaccuu c    21
<210>60
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为胞嘧啶F-3，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分甲基转移酶基因。“核苷酸17~19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>60
tatttgatcc gccacaccu       19
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为胞嘧啶R-1，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分甲基转移酶基因。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>61
tctagttgac catattgcgc     20
<210>62
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为胞嘧啶R-2，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分甲基转移酶基因。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>62
tctagttgac catattgcgc a   21
<210>63
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为胞嘧啶R-3，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分甲基转移酶基因。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>63
tctagttgac catattgcgc ac    22
<210>64
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为NEI-5130，以检测扩增来源自淋病奈氏球菌的部分pJDB4质粒的DNA片段。
<400>64
gatatgccgc acgaattgac        20
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为NEI-CppB探针-1，以检测扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB编码序列的DNA片段。
<400>65
ctcgctagct gctgcgctaa         20
<210>66
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为NEI-CppB探针-2，以检测扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB编码序列的DNA片段。
<400>66
tccgtaacgt ctctaagtct    20
<210>67
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为M.Ngo-探针，以检测扩增来源自淋病奈氏球菌的部分M.NgoMIII基因编码序列的DNA片段。
<400>67
cgaaccgtcc aaaaccatt     19
<210>68
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为胞嘧啶-探针，以检测扩增来源自淋病奈氏球菌的部分甲基转移酶编码序列的DNA片段。
<400>68
ctctgggcag gtcagaaatc                                             20
<210>69
<211>560
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>69
ccttcccatg gctgctcggg tgtgctgcca actggatcct gcgcgggacg tcctttgtct 60
acgtcccgtc ggcgctgaat cccgcggacg acccgtctcg gggccgtttg ggcctctacc 120
gtcccttgct ttctctgccg ttccagccga ccacggggcg cacctctctt tacgcggtct 180
ccccgtctgt gccttctcat ctgccggacc gtgtgcactt cgcttcacct ctgcacgtcg 240
catggagacc accgtgaacg gccaccaggt cttgcccaag ctcttacata agaggactct 300
tggactctca gcaatgtcaa caaccgacct tgaggcatac ttcaaagact gtttgtttaa 360
agactgggag gagttggggg aggagattag gttaaaggtc tttgtactag gaggctgtag 420
gcataaattg gtctgttcac cagcaccatg caactttttc acctctgcct aatcatctca 480
tgttcatgtc ctactgttca agcctccaag ctgtgccttg ggtggctttg gggcatggac 540
attgacccgt ataaagaatt                                             560
<210>70
<211>560
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>70
ccttcccatg gctgctcggg tgtgctgcca actggatcct gcgcgggacg tcctttgtct  60
acgtcccgtc ggcgctgaat cccgcggacg acccgtctcg gggccgtttg ggcctctacc 120
gtcccttgct ttctctgccg ttccagccga ccacggggcg cacctctctt tacgcggtct 180
ccccgtctgt gccttctcat ctgccggacc gtgtgcactt cgcttcacct ctgcacgtcg 240
catggagacc accgtgaacg gccaccaggt cttgcccaag ctcttacata agaggactct 300
tggactctca gcaatgtcaa caaccgacct tgaggcatac ttcaaagact gtgtgtttaa 360
agactgggag gagttggggg aggagattag gttaaaggtc tttgtactag gaggctgtag 420
gcataaattg gtctgttcac cagcaccatg caactttttc acctctgcct aatcatctca 480
tgttcatgtc ctactgttca agcctccaag ctgtgccttg ggtggctttg gggcatggac 540
attgacccgt ataaagaatt                                             560
<210>71
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-F-1，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸22~24为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>71
gaggactctt ggactctcag caau                                        24
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-F-2，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>72
ctcttggact ctcagcaaug      20
<210>73
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-F-3，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>73
gaggcatact tcaaagacug u    21
<210>74
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-F-5，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸22~24为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>74
tacttcaaag actgtgtgtt taaa    24
<210>75
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-R-1，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>75
tcctcccagt ctttaaacam ac      22
<210>76
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-R-2，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸21~23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>76
ccagtcttta aacamacagt cuu    23
<210>77
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-R-3，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>77
gcctcctagt acaaagaccu u      21
<210>78
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HBV-R-4，以扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质基因。“核苷酸22~24为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>78
ctagtacaaa 8acctttaac cuaa   24
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为HBV-探针1，以检测扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质编码序列的DNA片段。
<400>79
caaccgacct tgaggcatac    20
<210>80
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为HBV-探针2，以检测扩增来源自乙型肝炎病毒的部分X-蛋白质编码序列的DNA片段。
<400>80
gactgggagg agttggggga    20
<210>81
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A2-S，以扩增部分丙型肝炎病毒基因。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>81
ctttcttgga tcaacccg     18
<210>82
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A2-A，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>82
aacactactc ggctagcagu    20
<210>83
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A4-S，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸15~17为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>83
ctttcttgga tcaaccc       17
<210>84
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A4-A，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>84
ccaacactac tcggcuag    18
<210>85
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A4-S19，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸17~19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>85
tcctttcttg gatcaaccc   19
<210>86
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-A4-A19，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸17~19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>86
cccaacacta ctcggcuag    19
<210>87
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为HCV-C探针，以检测扩增部分丙型肝炎病毒的DNA片段。
<400>87
ctcaatgcct ggagatttgg   20
<210>88
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-F1，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸17~19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>88
ctagccgagt agtgttggg     19
<210>89
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-R1，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>89
tcgcaagcac cctatcag      18
<210>90
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-F2，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>90
ctagccgagt agtgtugg      18
<210>91
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-R2，以扩增部分丙型肝炎病毒。“核苷酸17~19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>91
tcgcaagcac cctatcagg     19
<210>92
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为HCV-D探针，以检测扩增丙型肝炎病毒的DNA片段。
<400>92
gcgaaaggcc ttgtggtact    20
<210>93
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，被命名为SP6-HIV-F，以扩增来源自HIV的部分gag序列。
<400>93
ccat ttaggt gacactatag aataccagag gagctctctc gacg      44
<210>94
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，被命名为HIV-R，以扩增来源自HIV的部分gag序列。
<400>94
ccaacagccc tttttcctag                                  20
<210>95
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-F1，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>95
atgggtgcga gagcgucart                                  20
<210>96
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-F2，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>96
tagaagaaat gatgacagca ug    22
<210>97
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-F3，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>97
gaagaaatga tgacagcatg uc    22
<210>98
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-F4，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>98
aytagaagaa atgatgacag ca    22
<210>99
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-R1，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>99
ctccctgctt gcccatacua       20
<210>100
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-R2，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>100
cattgcctca gccaaaactc uu    22
<210>101
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-R3，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>101
ctcattgcct cagccaaaac uc    22
<210>102
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-R4，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>102
ttgcttcagc caaaactctu gc    22
<210>103
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为HCV-R4M，以扩增来源自HIV的部分gag序列。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>103
ttgcytcagc caaaacyctu gc   22
<210>104
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为HIV-A探针，以检测扩增来源自HIV的部分gag序列的DNA片段。
<400>104
gggaaaatta gatgcatggg a    21
<210>105
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为HIV-B探针，以检测扩增来源自HIV的部分gag序列的DNA片段。
<400>105
ggagtgggag gaccyrgcca      20
<210>106
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，被命名为coa-PCR-F，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。
<400>106
ctattttaga aggtcttgaa gg    22
<210>107
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，被命名为coa-PCR-R，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。
<400>107
gtattcacgg atacctgtac      20
<210>108
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-F1，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>108
caagcaactg aaacaaca     18
<210>109
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-F2，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸17~19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>109
tattgaagtt aaacctcaa    19
<210>110
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-F3，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>110
aacttgaaat aaaaccacaa    20
<210>111
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-F4，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>111
aaataaaacc acaaggtacu    20
<210>112
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-F5，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>112
gtagctcatc taaacuug      18
<210>113
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-R1，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>113
gttttgttaa attgcggu    18
<210>114
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-R2，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>114
atacttaggt gttttguu    18
<210>115
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-R3，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>115
tgtttcagtt gcttgagguu    20
<210>116
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-R4，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>116
ttctgttgtt tcagttgcuu    20
<210>117
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为coa-R5，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分凝固酶基因。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>117
tgttgtttca gttgcuug      18
<210>118
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为coa-A探针，以检测扩增来源自金黄色葡萄球菌的凝固酶基因的DNA片段。
<400>118
tcaaggagaa tcaagtgata    20
<210>119
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为coa-B探针，以检测扩增来源自金黄色葡萄球菌的凝固酶基因的DNA片段。
<400>119
agcttctcaa tatggtccg    19
<210>120
<211>560
<212>DNA
<213>沙眼衣原体
<400>120
atgcgttgtt aggtaaagct ctgatatttg aagactctac tgagtatatt ctgaggcagc  60
ttgctaatta tgagtttaag tgttctcatc ataaaaacat attcatagta tttaaatact 120
taaaagacaa tggattacct ataactgtag actcggcttg ggaagagctt ttgcggcgtc 180
gtatcaaaga tatggacaaa tcgtatctcg ggttaatgtt gcatgatgct ttatcaaatg 240
acaagcttag atccgtttct catacggttt tcctcgatga tttgagcgtg tgtagcgctg 300
aagaaaattt gagtaatttc attttccgct cgtttaatga gtacaatgaa aatccattgc 360
gtagatctcc gtttctattg cttgagcgta taaagggaag gcttgacagt gctatagcaa 420
agactttttc tattcgcagc gctagaggcc ggtctattta tgatatattc tcacagtcag 480
aaattggagt gctggctcgt ataaaaaaaa gacgagcaac gttctctgag aatcaaaatt 540
ctttctttga tgccttccca                                             560
<210>121
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-FB19，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸17~19为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>121
 tccgtttctc atacgguuu                                             19
<210>122
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-FB19-3，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>122
catacggttt tcctcgatga uu    22
<210>123
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-FB19-3-21，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>123
catacggttt tcctcgatga u     21
<210>124
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-FB19-3-23，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸21~23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>124
catacggttt tcctcgatga uuu    23
<210>125
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-RB21，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>125
agaaacggag atctacgcaa u      21
<210>126
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-RB23-2，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸21~23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>126
gatctacgca atggattttc auu    23
<210>127
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-RB23-2-24，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸22~24为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>127
gatctacgca atggattttc auug    24
<210>128
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为CT-探针，以检测扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA的DNA片段。
<400>128
tgagcgtgtg tagcgctgaa         20
<210>129
<211>560
<212>DNA
<213>沙眼衣原体
<400>129
gtcctctagt acaaacaccc ccaatattgt gatataatta aaattatatt catattctgt  60
tgccagaaaa aacactttta ggctatatta gagccaatct tctttgaagc gttgtcttct 120
cgagaagatt tatcgtacgc aaatatcatc tttgcggttg cgtgtcctgt gaccttcatt 180
atgtcggagt ctgagcaccc taggcgtttg tactccgtca cagcggttgc tcgaagcacg 240
tgcggggtta tcttaaaagg gattgcagct tgtagtcctg cttgagagaa cgtgcgggcg 300
atttgcctta accccaccat ttttccggag cgagttacga agacaaaacc tcttcgttga 360
ccgatgtact cttgtagaaa gtgcataaac ttctgaggat aagttataat aatcctcttt 420
tctgtctgac ggttcttaag ctgggagaaa gaaatggtag cttgttggaa acaaatctga 480
ctaatctcca agcttaagac ttcagaggag cgtttacctc cttggagcat tgtctgggcg 540
atcaaccaat cccgggcatt                                             560
<210>130
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-F1212-20，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>130
gtgtcctgtg accttcauua                                               20
<210>131
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-F1212-21，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>131
gtgtcctgtg accttcatua u        21
<210>132
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-F1212-22，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>132
gtgtcctgtg accttcatta ug       22
<210>133
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-R1272-20，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>133
tgtgacggag tacaaacgcc          20
<210>134
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-R1272-21，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>134
tgtgacggag tacaaacgccu      21
<210>135
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-R1272-22，以扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>135
tgtgacggag tacaaacgcc ua    22
<210>136
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为CT-1234探针，以检测扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA的DNA片段。
<400>136
tcggagtctg agcacccta                                              19
<210>137
<211>560
<212>DNA
<213>肺炎支原体
<400>137
aacagtagct aacactaatc acaaaaatga aagtgataag tttgtgattt ttgaacctca  60
accaccattg agccaaacta tccccaaacc agaggctgaa ccagttatag agcccgatgc 120
tgttgctaca ccacctgtgc agaatgccga ggtgcaaatt aagcctgaca gctccaaggg 180
tgtttacagt cctggtttta agttcaacac taactttatt cctaaagtaa atactaagta 240
tcggccgggc tatgatctta gctttgcctt aaagtttggt actagttgaa aagaagctta 300
tggtacaggt tggttaattg actggaagga tgttaagcag gacaacaaat ttactgctta 360
cttagctacc aacctccatg tagctgatag cttacgaaat aaagacgatt acaagcctta 420
caacaaggat ggtaatcaga aggagttttt acctggcgat atcaccactg aattttcttt 480
gggtaaatac attgatgccc aaactgtgca aaagttaact ccagagtacc aaaatcttaa 540
gcacctcaat aaccggaata                                             560
<210>138
<211>560
<212>DNA
<213>肺炎支原体
<400>138
gcacctcaat aaccggaata gtgatgcatt agtttcaatt caaacatcga agttaccaaa  60
aactgcttac actgccactg actttatcaa aactgctcag tacaaataca atcacatagt 120
gagtaacaca gtttatgagt tggacttatt ccaaaatgcc gtaagttacg ctgactttgc 180
ggtgttggaa ttagagttaa atttagccaa caatcgtgac cagcaaatct ttgacagttt 240
tataaatcca gcggtaactg cttacgaaaa gctaggtaac agtttgggtc tcttttccaa 300
cctgcaatta gatcagtatg ttgatgatac ccattatcta ttgggttatc cgttacttaa 360
acgtgaaaag acgtcttact gaaacttacc acagaagggt tatagttcac cactctatga 420
aaatagtaat aaggaagttt cgcgcataac gcgtaacatc cggaaagatg atgaaattcc 480
aggtagtcgt ttggtacaaa atcaaattaa ctatttaccc tttgcacaaa atgaccctaa 540
aggcgtaatg gactttagca                                             560
<210>139
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-140，以扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>139
attgagccaa actatcccca a                                            21
<210>140
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-140-22，以扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>140
attgagccaa actatcccca aa    22
<210>141
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-706，以扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>141
atcaaaactg ctcagtacaa au    22
<210>142
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MPF-910，以扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>142
ctcttttcca acctgcaatu ag    22
<210>143
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-190，以扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>143
gtagcaacag catcgggcucu      21
<210>144
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-190-22，以扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>144
gtagcaacag catcgggcuc ua    22
<210>145
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为Myco-850，以扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>145
cgtaacttac ggcattttgg aa    22
<210>146
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MPR-1016，以扩增来源自肺炎支原体的部分。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。
<400>146
ttctgtggta agtttcagta ag    22
<210>147
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为Myco170-探针，以检测扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子的DNA片段。
<400>147
ccagaggctg aaccagtta     19
<210>148
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为Myco730-探针，以检测扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子的DNA片段。
<400>148
caatcacata gtgagtaaca    20
<210>149
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为Myco952-探针，以检测扩增来源自肺炎支原体的部分ATPase操纵子的DNA片段。
<400>149
cattatctat tgggttatcc                                             20
<210>150
<211>560
<212>DNA
<213>金黄色葡萄球菌
<400>150
caggatcgta aaataaaaaa agtatctaaa aataaaaaac gagtagatgc tcaatataaa  60
attaaaacaa actacggtaa cattgatcgc aacgttcaat ttaattttgt taaagaagat 120
ggtatgtgga agttagattg ggatcatagc gtcattattc caggaatgca gaaagaccaa 180
agcatacata ttgaaaattt aaaatcagaa cgtggtaaaa ttttagaccg aaacaatgtg 240
gaattggcca atacaggaac acatatgaga ttaggcatcg ttccaaagaa tgtatctaaa 300
aaagattata aagcaatcgc taaagaacta agtatttctg aagactatat caacaacaaa 360
tggatcaaaa ttgggtacaa gatgatacct tcgttccact ttaaaaccgt taaaaaaatg 420
gatgaatatt taagtgattt cgcaaaaaaa tttcatctta caactaatga aacagaaagt 480
cgtaactatc ctctagaaaa agcgacttca catctattag gttatgttgg tcccattaac 540
tctgaagaat taaaacaaaa                                             560
<210>151
<211>560
<212>DNA
<213>金黄色葡萄球菌
<400>151
aaaaatgatt atggctcagg tactgctatc caccctcaaa caggtgaatt attagcactt  60
gtaagcacac cttcatatga cgtctatcca tttatgtatg gcatgagtaa cgaagaatat 120
aataaattaa ccgaagataa aaaagaacct ctgctcaaca agttccagat tacaacttca 180
ccaggttcaa ctcaaaaaat attaacagca atgattgggt taaataacaa aacattagac 240
gataaaacaa gttataaaat cgatggtaaa ggttggcaaa aagataaatc ttggggtggt 300
tacaacgtta caagatatga agtggtaaat ggtaatatcg acttaaaaca agcaatagaa 360
tcatcagata acattttctt tgctagagta gcactcgaat taggcagtaa gaaatttgaa 420
aaaggcatga aaaaactagg tgttggtgaa gatataccaa gtgattatcc attttataat 480
gctcaaattt caaacaaaaa tttagataat gaaatattat tagctgattc aggttacgga 540
caaggtgaaa tactgattaa                                             560
<210>152
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MecA-S525，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分MecA基因。“核苷酸21~23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>152
aaagaatgta tctaaaaaag auu                                         23
<210>153
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MecA-A611，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分MecA基因。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>153
aggtatcatc ttgtacccaa        20
<210>154
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MecA-S1281，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分MecA基因。“核苷酸21~23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>154
cgatggtaaa ggttggcaaa aag    23
<210>155
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MecA-A1341，以扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分MecA基因。“核苷酸21~23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>155
agtcgatatt accatttacc acu    23
<210>156
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为MecA-A探针，以检测扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分MecA基因的DNA片段。
<400>156
gcaatcgcta aagaactaag        20
<210>157
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为MecA-B探针，以检测扩增来源自金黄色葡萄球菌的部分MecA基因的DNA片段。
<400>157
ttggggtggt tacaacgtta        20
<210>158
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pDON-AI-1(22>，以扩增部分pDON-AI质粒DNA。“核苷酸20~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>158
actagctctg tatctggcgg ac    22
<210>159
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pDON-AI-2(23>，以扩增部分pDON-AI质粒DNA。“核苷酸21~23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>159
acgatcggga tttttggact cag    23
<210>160
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用以扩增来源自小鼠的部分iNOS编码序列。
<400>160
atgccattga gttcatcaac    20
<210>161
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物，用以扩增来源自小鼠的部分iNOS编码序列。
<400>161
 tcttggtggc aaagatgag    19
<210>162
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MTIS 2F，以扩增部分结核杆菌序列。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>162
tctcgtccag cgccgcuu     18
<210>163
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MTIS 2R，以扩增部分结核杆菌序列。“核苷酸19~21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>163
gacaaaggcc acgtaggcga a    21
<210>164
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pJDB10F，以扩增来源自淋病奈氏球菌的部分CppB基因。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>164
atgcctcgtt gatatttuuc      20
<210>165
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为pJDB10R，以扩增来源自淋球菌的部分CppB基因。“核苷酸15~17为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>165
cgaagccgcc agcauag          17
<210>166
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-F1215-4R-22，以扩增部分沙眼衣原体隐性质粒DNA。“核苷酸19~22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>166
tcctgtgacc ttcattatgu cg    22
<210>167
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<229>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为CT-R1267-3R-18，以扩增部分沙眼衣原体隐性质粒DNA。“核苷酸16~18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>167
cggagtacaa acgccuag                                                 18
<210>168
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为CT-1236探针，以检测扩增来源自沙眼衣原体的部分质粒DNA的DNA片段。
<400>168
ggagtctgag caccc                                                    15
<210>169
<211>169
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的核苷酸，作为结核杆菌鉴定所用的内部对照。
<400>169
ccacgatcgc tgatccggcc acagcccgtc ccgccgatct cgtccagcgc cgcttcggac   60
caccagcacc taaccggctg tgggtagcac ctccgatcgt tgtcagaagc tgggcagggt  120
tcgcctacgt ggcctttgtc accgacgcct acgctcgcag gatcctggg              169
<210>170
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MTIS2F16，以扩增部分结核杆菌DNA。“核苷酸14~16为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>170
tcgtccagcg ccgcuu       16
<210>171
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，被命名为MTIS2RAAC，以扩增部分结核杆菌DNA。“核苷酸18~20为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸。”
<400>171
caaaggccac gtaggcgaac    20
<210>172
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为MTIS-S-PROBE，以检测扩增来源自结核杆菌的部分核苷酸序列的DNA片段。
<400>172
gacctcacct atgtgtcgac    20
<210>173
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸探针，被命名为INTER-PROBE，以检测扩增来源自结核杆菌的部分核苷酸序列的DNA片段。
<400>173
cctccgatcg ttgtcagaag    20

Claims (11)

1.扩增和/或检测目标核酸的方法中所用的反应试剂的稳定化方法，包括：
(a)将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链替代活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNA酶H混合，以制备反应混合物，其中的引物是与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补，并含有选自核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸；核糖核苷酸和核苷酸类似物；或核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸以及核苷酸类似物中至少一种的嵌合寡核苷酸引物，所述核糖核苷酸位于引物3’末端或3’末端一侧；并
(b)通过温育该反应混合物足以生成反应产物的时间以扩增目标核酸，
其中
(i)至少一种选自镁盐、嵌合寡核苷酸引物和DNA聚合酶和/或RNaseH的试剂组分在反应前是与其它试剂组分分离的；及
(ii)含DNA聚合酶和/或RNA酶H的试剂溶液的酶浓度被提高，而该溶液的盐浓度未被提高，且另一试剂溶液的盐浓度被调整，以使彼此分离的试剂溶液混合后可达到扩增步骤所需的最佳盐浓度。
2.根据权利要求1的方法，其中反应试剂由两种试剂溶液组成：含嵌合寡核苷酸引物的试剂溶液；含DNA聚合酶和/或RNA酶H和镁盐的试剂溶液。
3.根据权利要求1的方法，其中含DNA聚合酶和/或RNA酶H的试剂溶液的盐浓度等于或低于扩增步骤所需最佳盐浓度。
4.根据权利要求1的方法，其中含DNA聚合酶和/或RNA酶H的试剂溶液的酶浓度高于扩增步骤所需酶浓度。
5.根据权利要求4的方法，其中含DNA聚合酶和/或RNA酶H的试剂溶液的酶浓度被调整，以使彼此分离的试剂溶液混合后可达到扩增步骤所需的最佳酶浓度。
6.扩增和/或检测目标核酸的方法所用反应试剂的试剂盒，包括：
(a)将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链替代活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNA酶H混合，以制备反应混合物，其中的引物是与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补，并含有选自核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸；核糖核苷酸和核苷酸类似物；或核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸以及核苷酸类似物中至少一种的嵌合寡核苷酸引物，所述核糖核苷酸位于引物3’末端或3’末端一侧；并
(b)通过温育该反应混合物足以生成反应产物的时间以扩增目标核酸，
其中
(i)至少一种选自镁盐、嵌合寡核苷酸引物和DNA聚合酶和/或RNA酶H的试剂组分在反应前是与其它试剂组分分离的；及
(ii)含DNA聚合酶和/或RNA酶H的试剂溶液的酶浓度被提高，而该溶液的盐浓度未被提高，且另一试剂溶液的盐浓度被调整，以使彼此分离的试剂溶液混合后可达到扩增步骤所需的最佳盐浓度。
7.根据权利要求6的试剂盒，其中反应试剂由两种试剂溶液组成：含嵌合寡核苷酸引物的试剂溶液；含DNA聚合酶和/或RNA酶H和镁盐的试剂溶液。
8.根据权利要求6的试剂盒，其中含DNA聚合酶和/或RNA酶H的试剂溶液的盐浓度等于或低于扩增步骤所需的最佳盐浓度。
9.根据权利要求6的试剂盒，其中含DNA聚合酶和/或RNA酶H的试剂溶液的酶浓度高于扩增步骤所需的酶浓度。
10.根据权利要求9的试剂盒，其中含DNA聚合酶和/或RNA酶H的试剂溶液的酶浓度被调整，以使彼此分离的试剂溶液混合后可达到扩增步骤所需的最佳酶浓度。
11.根据权利要求6的试剂盒，其含有用于调节分离的试剂溶液的混合物中盐浓度的试剂。
CNB028158156A 2001-06-12 2002-06-12 核酸扩增或检测用试剂的稳定化方法和保存方法 Expired - Fee Related CN100379861C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001177737 2001-06-12
JP177737/2001 2001-06-12
JP249689/2001 2001-08-20
JP2001249689 2001-08-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1541267A CN1541267A (zh) 2004-10-27
CN100379861C true CN100379861C (zh) 2008-04-09

Family

ID=26616789

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028158156A Expired - Fee Related CN100379861C (zh) 2001-06-12 2002-06-12 核酸扩增或检测用试剂的稳定化方法和保存方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20050059000A1 (zh)
EP (1) EP1396538A4 (zh)
JP (1) JPWO2002101042A1 (zh)
KR (1) KR20040007620A (zh)
CN (1) CN100379861C (zh)
AU (1) AU2002311183B2 (zh)
CA (1) CA2450397A1 (zh)
EA (1) EA006679B1 (zh)
WO (1) WO2002101042A1 (zh)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120045747A1 (en) * 2010-08-23 2012-02-23 Samsung Techwin Co., Ltd. Kit for detecting hepatitis b virus and method for detecting hepatitis b virus using the same
CN101142316A (zh) * 2005-03-09 2008-03-12 牧岩生命工学研究所 小干扰rna和包含它的用于治疗乙型肝炎的药物组合物
CA2627490A1 (en) * 2005-11-07 2007-05-18 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Chlamydia trachomatis specific oligonucleotide sequences
DE102006028101B4 (de) * 2006-06-19 2014-02-13 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zur Analyse von amplifizierten Nukleinsäuren
CA2653988C (en) * 2007-04-13 2017-05-30 Abbott Laboratories Primer and probe sequences for detecting chlamydia trachomatis
US20140038174A1 (en) * 2011-04-26 2014-02-06 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and Methods for Detecting and Identifying Nucleic Acid Sequences in Biological Samples
WO2009108693A2 (en) 2008-02-25 2009-09-03 The Government Of The United States Of America , As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Composition and methods for rapid detection of hiv by loop- mediated isothermal amplification (lamp)
US10760074B2 (en) * 2008-09-03 2020-09-01 Takara Bio Inc. Composition for detection of RNA
JP5608997B2 (ja) * 2009-03-31 2014-10-22 東洋紡株式会社 保存安定性に優れた核酸増幅検出試薬キット
US20120100545A1 (en) * 2009-07-03 2012-04-26 Tan Tock Seng Hospital Method and/or primers for the detection of mycobacterium tuberculosis
JP6550649B2 (ja) 2014-09-11 2019-07-31 タカラバイオ株式会社 耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼの利用方法
US11299777B2 (en) 2016-04-04 2022-04-12 Nat Diagnostics, Inc. Isothermal amplification components and processes
US9617587B1 (en) * 2016-04-04 2017-04-11 Nat Diagnostics, Inc. Isothermal amplification components and processes
CN110527713B (zh) * 2019-07-02 2024-01-30 黄天谊 一种折叠引物的pcr扩增方法
CN111424100A (zh) * 2020-02-25 2020-07-17 宁波明舟生物科技有限公司 一种肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的检测方法
CN112501324A (zh) * 2020-11-26 2021-03-16 广州迪澳生物科技有限公司 一种基于环介导等温扩增检测结核分枝杆菌复合群及非结核分枝杆菌复合群的引物、试剂盒
CN112941208B (zh) * 2021-01-28 2023-07-14 四川大学 一种用于食品中沙门氏菌的现场快速检测方法
CN112941148A (zh) * 2021-03-03 2021-06-11 通用生物系统（安徽）有限公司 一种核酸引物保存液的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002016639A1 (fr) * 2000-08-23 2002-02-28 Takara Bio Inc. Procede d'amplification d'acide nucleique

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4957858A (en) * 1986-04-16 1990-09-18 The Salk Instute For Biological Studies Replicative RNA reporter systems
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) * 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
CA1340807C (en) * 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
DE69131891T2 (de) * 1990-02-16 2000-06-15 Hoffmann La Roche Verbesserungen in der spezifität und zweckmässigkeit der polymerase-kettenreaktion
US5455166A (en) * 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
DK0590327T3 (da) * 1992-09-11 2003-07-28 Hoffmann La Roche Påvisning af nukleinsyrer i blod
WO1995025180A1 (en) * 1994-03-16 1995-09-21 Gen-Probe Incorporated Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
US5916777A (en) * 1995-06-07 1999-06-29 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using 3'-ribonucleotide primers
FR2737223B1 (fr) * 1995-07-24 1997-09-12 Bio Merieux Procede d'amplification de sequences d'acide nucleique par deplacement, a l'aide d'amorces chimeres
GB9717061D0 (en) * 1997-08-13 1997-10-15 Tepnel Medical Ltd Amplification of nucleic acids
EP1873260B1 (en) * 1998-11-09 2009-03-18 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Process for synthesizing nucleic acid
NO308925B1 (no) * 1999-03-15 2000-11-13 Dimension Technologies As FremgangsmÕte og apparat for stereoprojeksjon av bilder
WO2000056877A1 (fr) * 1999-03-19 2000-09-28 Takara Shuzo Co., Ltd. Procede d'amplification d'une sequence d'acide nucleique
NZ517121A (en) * 1999-09-13 2004-05-28 Nugen Technologies Inc Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002016639A1 (fr) * 2000-08-23 2002-02-28 Takara Bio Inc. Procede d'amplification d'acide nucleique

Also Published As

Publication number Publication date
US20050059000A1 (en) 2005-03-17
EA006679B1 (ru) 2006-02-24
JPWO2002101042A1 (ja) 2005-04-07
WO2002101042A1 (fr) 2002-12-19
CA2450397A1 (en) 2002-12-19
EA200400021A1 (ru) 2004-04-29
CN1541267A (zh) 2004-10-27
EP1396538A4 (en) 2005-10-26
AU2002311183B2 (en) 2007-03-01
KR20040007620A (ko) 2004-01-24
EP1396538A1 (en) 2004-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100379861C (zh) 核酸扩增或检测用试剂的稳定化方法和保存方法
US5849497A (en) Specific inhibition of the polymerase chain reaction using a non-extendable oligonucleotide blocker
KR100735131B1 (ko) 핵산 증폭 방법
KR100682576B1 (ko) 핵산 서열 증폭 방법
JP3140937B2 (ja) 好熱酵素を用いる鎖置換増幅法
EP0401037B1 (en) Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US11499180B2 (en) Primer extension target enrichment and improvements thereto including simultaneous enrichment of DNA and RNA
JP5401080B2 (ja) 核酸増幅方法
WO2003100019A2 (en) Nested pcr employing degradable primers
KR20040028991A (ko) 핵산 증폭 방법
EP0415755B1 (en) Process for controlling contamination of oligonucleotide-dependent nucleic acid amplification reactions
JP6029636B2 (ja) Ｒｎａの検出方法
KR20030071854A (ko) 증폭 핵산 및 그의 고정화물
US20070298415A1 (en) Method of Amplifying Nucleic Acid
JP5546109B2 (ja) 核酸の塩基配列の識別方法
JP2007228977A (ja) 核酸増幅又は検出反応用試薬の安定化方法ならびに保存方法
EP3735476B1 (en) Method for determining the presence or absence of m. tuberculosis, m. bovis and m. bovis bcg in a sample
CN100432237C (zh) 用于扩增核酸序列的方法
CA3181841A1 (en) Isothermal real-time pcr method for determining presence of a pre-determined nucleic acid sequence of a bacterium of the mollicutes class in a sample
CN117721228A (zh) mecA基因扩增用引物对、mecA基因检测试剂盒及mecA基因检测方法
KR101414403B1 (ko) 패니바실러스 폴리믹사 검출방법

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20080409

Termination date: 20100612