CN111424100A - 一种肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的检测方法 - Google Patents

一种肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了细菌检测技术领域的一种肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的检测方法，肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体包括以下三对引物：肺炎军团菌的检测引物如下：上游引物：5’‑AGGGTTGATAGGTTAAGAGC‑3’下游引物：5’‑ABGGTCAGATAATACTGGTTGAC‑3’；脑膜炎奈瑟菌的检测引物如下：上游引物：5’‑GCTGGCGCCGCTGGCAACAAAATTC‑3’下游引物：5’‑CTTCTGCAGATTGCGGCGTGCCGT‑3’；肺炎支原体的检测引物如下：上游引物：5’‑GAAGCTTATGGTACAGGTTGG‑3’下游引物：5’‑ATTACCATCCTTTCTTGTAAGG‑3’；该三种细菌的检测采用的是全基因合成的方法，将肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的保守序列构建到pJET1.2载体中，再转化到DH5a感受态中，挑取单菌落摇菌，作为标准品进行后续PCR检测实验，从而提高了细菌的检测准确性。

Description

一种肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的检测方法
技术领域
本发明涉及细菌检测技术领域，具体为一种肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的检测方法。
背景技术
军团菌病是由革兰染色阴性的嗜肺军团杆菌引起的一种以肺炎为主的全身性疾病，1976年被确认。嗜肺军团菌是引起军团菌肺炎最重要的一种。军团菌存在于水和土壤中，常经供水系统、空调和雾化吸入而被吸入，引起呼吸道感染，亦可呈小的暴发流行。
脑膜炎双球菌(学名Neisseria meningitidis)，又名脑膜炎奈瑟菌或脑脊髓膜炎双球菌，简称为脑膜炎球菌，是一种革兰氏阴性菌，因其所导致的脑膜炎而闻名，亦会造成脑膜炎球菌血症(一种致命性的败血症)。它只感染人类，并无寄生的动物，是唯一令细菌性感染脑膜炎成为流行病的病菌。
支原体肺炎患者虽然自感症状较重，但胸部体检一般无明显异常体征。鼻部轻度鼻塞、流涕，咽中度充血。耳鼓膜常有充血，约15％有鼓膜炎。颈淋巴结可肿大。约10％～15％病例发生少量胸腔积液。除呼吸系统的表现外，支原体肺炎可伴发多系统、多器官损害。皮肤损害可表现为斑丘疹、结节性红斑、水疱疹等。胃肠道系统可见呕吐、腹泻和肝功损害。
现有的肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的序列构建存在严重的问题就是在转化时缺少DH5a，从而不能够作为标准品使用，为此我们提出一种肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的检测方法，以解决上述背景技术中提出的肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的序列构建在转化时缺少DH5a，从而不能够作为标准品使用的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的检测方法，肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体包括以下三对引物：
肺炎军团菌的检测引物如下：
上游引物：5’-AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’
下游引物：5’-ABGGTCAGATAATACTGGTTGAC-3’；
构建到载体中的序列
CAATGGCTGCAACCGATGCCACATCATTAGCTACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTTAAAAATCAAGGCATAGATGTTAATCCGGAAGCAATGGCTAAAGGCATGCAAGACGCTATGAGTGGCGCTCAATTGGCTTTAACCGAACAGCAAATGAAAGACGTTCTTAACAAGTTTCAGAAAGATTTGATGGCTAAGCGTACTGCTGAATTCAATAAGAAAGCGGATGAAAATAAAGTAAAAGGGGAAGCCTTTTTAACTGAAAACAAAAACAAGCCAGGCGTTGTTGTATTGCCAAGTGGTTTGCAATACAAAGTAATCAATTCTGGAAATGGTGTTAAACCCGGAAAATCGGATACAGTCACTGTCGAATATACTGGTCGTCTGATTGATGGTACCGTTTTTGACAGTACCGAAAAAACTGGTAAGCCAGCAACGTTCCAGGTTTCACAAGTTATCC；
LP-Fi TGCCAAGTGGTTTGCAATACAAAG
LP-Ri AACGGTACCATCAATCAGACGACC 110bp
脑膜炎奈瑟菌的检测引物如下：
上游引物：5’-GCTGGCGCCGCTGGCAACAAAATTC-3’
下游引物：5’-CTTCTGCAGATTGCGGCGTGCCGT-3’；
构建到载体中的序列：
TATTATGATTTGGGAAGCGCCGCCGGCAGTATTGTTTGGTGGTGGCCTTTCTTCGATGGGCTCGGGTAGTGCGCATCAAACTAAGTTGCCAGAGCAGTTGGTCACGGCACGTGGTACGGTTTCTGTGCCGTTTGTTGGCGATATTTCGGTGGTCGGTAAAACGCCTGGTCAGGTTCAGGAAATTATTAAAGGCCGCCTGAAAAAAATGGCCAATCAGCCACAAGTGATGGTGCGTTTGGTGCAGAATAATGCGGCGAATGTGTCGGTGATTCGTGCTGGGAATAGTGTGCGTATGCCGCTGACGGCAGCCGGTGAGCGTGTGTTGGATGCGGTGGCTGCGGTAGGTGGTTCAACGGCAAATGTGCAGGATACGAATGTGCAGCTGACACGTGGCAATGTAGTACGAACTGTTGCCTTGGAAGATTTAGTTGCAAATCCGCGACAAAATATTTTGCTGCGTCGCGGTGATGTGGTTACCATGATTACCAATCCCTATACCTTTACGTCTATGGGTGCGGTGGGGAGAACACAAGAAATCGGTTTTTCAGCCAGAGGCTTATCGCTTTCTGAAG
Nme-Fi TGGCTGCGGTAGGTGGTTCAA 65.9
Nme-Ri ATTTTGYCGCGGATTKGCKACYA 63.9 116bp
肺炎支原体的检测引物如下：
上游引物：5’-GAAGCTTATGGTACAGGTTGG-3’
下游引物：5’-ATTACCATCCTTTCTTGTAAGG-3’；
构建到载体中的序列：
TTCTCATCCTCACCGCCACCGCCTCCCTCGCGACGGGACTCACCGTAGTGGGACACTTCACAAGTACCACCACGACGCTCAAGCGCCAGCAATTTAGCTACACCCGCCCTGACGAGGTCGCGCTGCGCCACACCAATGCCATCAACCCGCGCTTAACCCCGTGAACGTATCGTAACACGAGCTTTTCCTCCCTCCCCCTCACGGGTGAAAATCCCGGGGCGTGGGCCTTAGTGCGCGACAACAGCGCTAAGGGCATCACTGCCGGCAGTGGCAGTCAACAAACCACGTATGATCCCACCCGAACCGAAGCGGCTTTGACCGCATCAACCACCTTTGCGTTACGCCGGTATGACCTCGCCGGGCGCGCCTTATACGACCTCGATTTTTCGAAGTTAAACCCGCAAACGCCCACGCGCGACCAAACCGGGCAGATCACCTTTAACCCCTTTGGCGGCTTTGGTTTGAGTGGGGCTGCACCCCAACAGTGAAACGAGGTCAAAAACAAGGTCCCCGTCGAGGTGGCGCAAGACCCCTCCAATCCCTACCGGTTTGCCGTTTTACTCGTGCCGCGCAGCGTGGTGTACTATGAGCAGTTGCAAAGGGGGTTGGGCTTACCACAGCAGCGAACCGAGAGTGGTCAAAATACTTCCACCACCGGGGCAATGTTTGGCTTGAAGGTGAAGAACGCCGAGGCGGACACCGCGAAGAGCAATGAAAAACTCCAGGGCGCTGAGGCCACTGGTTCTTCAACCACATCTGGATCTGGCCAATCCACCCAACGTGGGGGTTCGTCAGGGGACACCAAAGTCAAGGCTTTAAAAATAGAGGTGAAAAAGAAATCGGACTCGGAGGACAATGGTCAGCTGCAGTTAGAAAAAAATGATCTCGCCAACGCTCCCATTAAGCGGAGCGAGGAGTCGGGTCAGTCCGTCCAACTCAAGGCGGACGATTTTGGTACTGCCCTTTCCAGTTCGGGATCAGGCGGCAACTCCAATCCCGGTTCCCCCACCCCCTGAAGGCCGTGGCTTGCGACTGAGCAAATTCACAAGGACCTCCCCAAATGATCCGCCTCGATCCTGATTCTGTACGATGCGCCTTATGCGCGCAACCGTACCGCCATTGAC。
优选的，所述PCR反应体系如下：0.2ul FastTaq DNA polymerase(2U/ul)，1ulDTT(100mM)，2.5ul 10*PCR buffer(Mg2+free)，3ul MgCl2(25mM)，1ul dNTP(10mM)，2ulLP-Fi(10uM)，2ul LP-Ri(10uM)，1ul Nme-Fi(10uM)，1ul Nme-Ri(10uM)，2ul MPN-Fi(10uM)，2ul MPN-Ri(10uM)，0.2ul Eva Green，Water补足至25ul。
优选的，所述PCR反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性15s；60℃，退火20s；72℃延伸15s；反应40个循环；72℃延伸5min。
优选的，所述步骤如下：基因序列的QC：对所需合成的基因全序列进行分析，检查基因内部是否含有复杂二级结构和重复序列；根据序列的具体情况设计合成方案；根据基因序列分析的结果，进行单链oligo的设计及合成；利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因；将肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的保守序列构装入pJET1.2载体并转化至感受态细胞DH5α。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该三种细菌的检测采用的是全基因合成的方法，将肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的保守序列构建到pJET1.2载体中，再转化到DH5a感受态中，挑取单菌落摇菌，作为标准品进行后续PCR检测实验，从而提高了细菌的检测准确性。
附图说明
图1为本发明实验结果表；
图2为本发明实验结果表。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的检测方法，肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体包括以下三对引物：
肺炎军团菌的检测引物如下：
上游引物：5’-AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’
下游引物：5’-ABGGTCAGATAATACTGGTTGAC-3’；
脑膜炎奈瑟菌的检测引物如下：
上游引物：5’-GCTGGCGCCGCTGGCAACAAAATTC-3’
下游引物：5’-CTTCTGCAGATTGCGGCGTGCCGT-3’；
肺炎支原体的检测引物如下：
上游引物：5’-GAAGCTTATGGTACAGGTTGG-3’
下游引物：5’-ATTACCATCCTTTCTTGTAAGG-3’。
PCR反应体系如下：0.2ul FastTaq DNA polymerase(2U/ul)，1ul DTT(100mM)，2.5ul 10*PCR buffer(Mg2+free)，3ul MgCl2(25mM)，1ul dNTP(10mM)，2ul LP-Fi(10uM)，2ul LP-Ri(10uM)，1ul Nme-Fi(10uM)，1ul Nme-Ri(10uM)，2ul MPN-Fi(10uM)，2ul MPN-Ri(10uM)，0.2ul Eva Green，Water补足至25ul(其中LP：Nme：MPN＝2：1：2)。
PCR反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性15s；60℃，退火20s；72℃延伸15s；反应40个循环；72℃延伸5min。
步骤如下：基因序列的QC：对所需合成的基因全序列进行分析，检查基因内部是否含有复杂二级结构和重复序列；根据序列的具体情况设计合成方案；根据基因序列分析的结果，进行单链oligo的设计及合成；利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因；将肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的保守序列构装入pJET1.2载体并转化至感受态细胞DH5α。
工作原理：根据肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的保守序列设计PCR引物，以灭活的肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体为模板进行PCR，琼脂糖胶回收目的片段；使用SalI酶切回收的目的片段，同时使用SalI酶切pJET1.2载体，琼脂糖胶回收酶切的目的片段；使用T4 DNA Ligase将酶切的PCR片段及酶切的pJET1.2载体连接起来，转化到DH5a感受态中；挑取单菌落摇菌，提质粒验证重组质粒中是否目的片段。
虽然在上文中已经参考实施例对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施例中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。

Claims (4)

1.一种肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的检测方法，其特征在于：肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体包括以下三对引物：
肺炎军团菌的检测引物如下：
上游引物：5’-AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’
下游引物：5’-ABGGTCAGATAATACTGGTTGAC-3’；
脑膜炎奈瑟菌的检测引物如下：
上游引物：5’-GCTGGCGCCGCTGGCAACAAAATTC-3’
下游引物：5’-CTTCTGCAGATTGCGGCGTGCCGT-3’；
肺炎支原体的检测引物如下：
上游引物：5’-GAAGCTTATGGTACAGGTTGG-3’
下游引物：5’-ATTACCATCCTTTCTTGTAAGG-3’。
2.根据权利要求1所述的一种肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的检测方法，其特征在于：PCR反应体系如下：0.2ul FastTaq DNA polymerase(2U/ul)，1ul DTT(100mM)，2.5ul 10*PCR buffer(Mg2+free)，3ul MgCl2(25mM)，1ul dNTP(10mM)，2ul LP-Fi(10uM)，2ul LP-Ri(10uM)，1ul Nme-Fi(10uM)，1ul Nme-Ri(10uM)，2ul MPN-Fi(10uM)，2ul MPN-Ri(10uM)，0.2ul Eva Green，Water补足至25ul。
3.根据权利要求1所述的一种肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的检测方法，其特征在于：PCR反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性15s；60℃，退火20s；72℃延伸15s；反应40个循环；72℃延伸5min。
4.根据权利要求1所述的一种肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的检测方法，其特征在于：步骤如下：基因序列的QC：对所需合成的基因全序列进行分析，检查基因内部是否含有复杂二级结构和重复序列；根据序列的具体情况设计合成方案；根据基因序列分析的结果，进行单链oligo的设计及合成；利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因；将肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的保守序列构装入pJET1.2载体并转化至感受态细胞DH5α。
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