CN108239672A - 一种检测军团菌并区分嗜肺军团菌的检测试剂盒 - Google Patents

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CN108239672A CN201611207887.7A CN201611207887A CN108239672A CN 108239672 A CN108239672 A CN 108239672A CN 201611207887 A CN201611207887 A CN 201611207887A CN 108239672 A CN108239672 A CN 108239672A
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吴大治
夏懿
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Abstract

本发明提供一种检测军团菌并区分嗜肺军团菌的检测试剂盒，利用TaqMan探针多色荧光PCR技术，选择在16S rRNA基因和mip基因序列位点分别设计军团菌特异性的引物探针和嗜肺军团菌特异性引物探针，对引物探针以及扩增体系进行优化验证，确定扩增效果最优的引物探针序列、引物探针的最优组合、最优扩增体系组分浓度以及试验运行程序，检测过程仅凭不同荧光标记的探针检测就能检测出军团菌并对其中的嗜肺军团菌进行区分；同时本发明还引入了人工构建的内参对照，用于避免检测结果的假阴性。本发明的检测结果稳定可靠，试剂盒使用方便，检测灵敏度高，适合于环境、疾控以及临床中军团菌和嗜肺军团菌的快速检测。

Description

一种检测军团菌并区分嗜肺军团菌的检测试剂盒
技术领域
本发明为一种检测军团菌并区分嗜肺军团菌的检测试剂盒。
背景技术
军团菌（Legionella spp）是非典型肺炎(Atypical pneumonias)的主要病原菌之一，军团菌于该病首发于1976年的美国一次军人聚会，故称作军团病。次年从死者肺组织中分离出一种新的病原体，1978年国际上正式将该病原体命名为嗜肺军团菌。军团菌不仅能产生多种毒素和酶，还能诱导人末梢血单核细胞产生前凝血因子活性物质，有助于感染过程中发生播散性血管内凝血。肺部感染后细菌合成的毒素、酶可逆行经支气管、淋巴管及血行播散到其他部位。少数细胞免疫功能低下者，本菌可引起菌血症。军团病常见的多系统脏器损伤主要由毒血症引起，细菌直接侵犯肺外器官组织的情况少见。产生的多种酶和毒素是导致患者死亡的主要原因。军团菌除暴发流行外，多半为散发性社区获得性肺炎。军团菌占社区获得性肺炎的2%～6% ，但在入院的TCU获得性肺炎患者中却占12%～23%，为第二位,仅次于肺炎链球菌，是重症肺炎的重要病原菌，且研究发现，嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)检出率最高，在临床上引起的危害也比其它军团菌属细菌更严重。
军团菌的营养要求苛刻，生长缓慢，在氧气含量低的情况下生长速度会进一步减慢，因此军团菌的最终鉴定需要综合它的生物学特性进行综合分析，即形态、生化性状、分子生物学检测、抗体检测（IFA、ELISA）。(1)显微镜检查：涂片革兰染色及Gimenez 染色，但意义不大(2) 抗体检测作为检测军团菌感染临床常用手段，检测病人血清中抗军团菌IgM及IgG 抗体可以做出特异性诊断。但检测的灵敏度不够，也有出现交叉反应而导致假阳性结果的产生。抗体检测的另一局限性是无法对新出现的血清型进行鉴定，需要制作新的抗体血清。(3)通过传统生化反应观察菌落形态、染色特征和某些生化反应，可以将军团菌鉴定到属的水平。但是大部分传统的生化实验对军团菌都是惰性的。近年来，随着分子生物学的进展，实时荧光PCR技术在病原体检测中得到广泛应用，和传统PCR电泳检测方法比较具有许多优点：(1)其采用的闭管检测消扩增产物污染问题，提高了检测准确度；(2)PCR体系中增加了荧光探针，提高了检测特异性和灵敏度；(3)操作迅速，无需传统PCR的后处理检测步骤，自动化程度高。如果在反应体系中引入内参照和双波长荧光探针，还能监测因样品中可能的PCR抑制剂引起的检测结果假阴性。
目前，临床实验室中已经有利用荧光PCR检测军团菌并区分嗜肺军团菌的报道，例如Templeton等(J Clin Microbiol，2003(41)：4016-4021)利用分子信标(MolecularBeacon)多色荧光PCR技术检测军团菌16S rRNA、mip基因以及外标内参基因PhHV，将嗜肺军团菌和其它军团菌相区分。Stolhaug等(Appl Environ Microbiol，2006(72)：6394-6398)利用FRET探针荧光PCR技术检测军团菌16SrRNA基因，并通过扩增产物的熔解曲线分析将嗜肺军团菌和其它军团菌相区分；但可以分析，由于不同血清型菌株基因序列变化，嗜肺军团菌熔解曲线可能会因特征不明显而导致结果无法判断。
本发明提供一种检测军团菌并区分嗜肺军团菌的检测试剂盒，利用TaqMan探针多色荧光PCR技术，选择在细菌中序列保守、拷贝数较多的16S rRNA基因序列作为靶位点设计军团菌特异性的引物探针，同时选择选择军团菌基因组中保守性较好的mip基因序列设计嗜肺军团菌特异性引物探针，在两个靶位点分别设计多对引物探针进行验证优化，确定了引物探针的最优组合。同时对扩增体系中的重要组分及扩增程序进行试验优化，确定扩增效果最优的引物探针序列、最优扩增体系以及试验运行程序，检测过程无需荧光PCR后的熔解曲线分析而仅凭不同荧光标记的探针检测就能检测出军团菌并对其中的嗜肺军团菌进行区分；同时本发明还引入了人工构建的内参照系统，用于避免检测结果的假阴性。和现有区分检测非嗜肺与嗜肺军团菌的公开技术比较，本发明的检测结果稳定可靠，试剂盒使用方便，检测灵敏度高，适合于环境、疾控以及临床中军团菌和嗜肺军团菌的快速检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测军团菌并区分嗜肺军团菌的检测试剂盒，其特征在于，基于军团菌靶序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2设计多对引物探针，并对所设计的引物探针进行试验验证、浓度优化，同时对扩增体系中的重要组分及扩增程序进行优化，确定扩增效果最优的引物探针序列、最优扩增体系以及试验运行程序。通过TaqMan探针多波长荧光PCR技术单管扩增检测痰液及肺泡灌洗液中军团菌，并对其中的嗜肺军团菌进行区分鉴别。
本发明的技术方案为：提供一种检测军团菌并区分嗜肺军团菌的检测试剂盒，采用一步法荧光PCR技术对军团菌进行核酸定性检测。在使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法纯化试剂（核酸提取及纯化试剂（产品型号：体液DNA））对痰液、支气管肺泡灌洗液以及环境样本进行全自动核酸提取后，直接配制反应体系进行扩增，反应体系配制方便，扩增程序步骤简便，扩增时间短，无需进行熔解曲线分析或者PCR产物开盖电泳，并且体系中引入了dUTP-UNG酶系统防止产物污染。本发明方法操作简便、检测灵敏、结果明晰、可靠性高。
1.实时荧光PCR引物探针的设计与优化
通过对GenBank中军团菌属16SrRNA基因和mip基因序列查询，用分子生物学专业软件对各种来源军团菌、嗜肺军团菌基因序列进行比对后发现，其中序列SEQ ID No.1在所有军团菌属细菌中较为保守并且与其他属细菌有明显不同，而序列SEQ ID No.2在所有军团菌属细菌中多态性较好而在嗜肺军团菌中则较为保守。因此，按照TaqMan荧光PCR设计的原则，基于SEQ ID No.1和SEQ ID No.2序列，各设计多组军团菌属特异性引物探针、嗜肺军团菌特异性引物探针，通过试验验证、优化，选择效果较好的引物探针用于军团菌和嗜肺军团菌荧光PCR检测。确认的最优引物和探针碱基序列组合，军团菌引物序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的序列，嗜肺军团菌引物序列可以为SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7的序列；军团菌荧光探针可以为SEQ ID No.8序列，其5’端标记FAM荧光基团；嗜肺军团菌荧光探针可以为SEQ ID No.9序列，其5’端标记HEX；两条探针3’端标记BHQ1淬灭基团，序列如下：
上游引物序列为：
5’-CTTAACCTGGGACGGTCAG-3’，如SEQ ID No.3所示；
5’-CTYAACCTGGGCAGGTCAG-3’，如SEQ ID No.4所示；
5’-AGGCATAGATGTTAATCCGGAAG-3’，如SEQ ID No.6所示。
下游引物序列为：
5’-CTTTCGTGCCTCAGTGTCAGTA-3’，如SEQ ID No.5所示；
5’-GTCTTTCATTTGYTGTTCGGTT-3’，如SEQ ID No.7所示。
探针序列为：
5’-TAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCC-3’，5’端标记FAM(6-羧基荧光素)，3’端标记BHQ1(BlackHoleQuencher)，如SEQ ID No.8所示；
5’-CCAATTGAGCGCCACTCATAGCGT-3’，5’端标记HEX(6-羧基六氯荧光素)、JOE(6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素)或VIC荧光基团，3’端标记BHQ1，如SEQ ID No.9所示。
本发明的另一方面是采用了人工构建的内参对照系统，用于监测样本的提取和扩增，避免检测结果假阴性，内参对照系统包括内参引物、探针和内参DNA，内参DNA为人工合成的DNA序列，引物和探针序列如下：
5’-CCCTGAATGCGGMTAATC-3’，如SEQID No.10所示；
5’-ATTGTCACCATAAGCAGCC-3’，如SEQ IDNo.11所示；
5’-TTCAGCGAGCGTGGGACATCAGG-3’，5’端标记Cy5荧光基团，3’端标记BHQ3，如SEQIDNo.12所示。
通过试验验证、优化，最后选择出七条引物三条探针，引物探针由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，合成后用无菌双蒸水溶解至浓度为50μM，-20℃保存。
2. 试剂盒制备
含有上述引物和探针的军团菌核酸检测试剂盒 (荧光PCR法)(32人份)，其主要组分如下：
(1)PCR缓冲液288μl，主要组分及反应终浓度：Tris-HCl(pH8.3) 15mM、KCl 75mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.3mM、MgCl2 3mM。配制方法：在54ml超纯水中依次加入10xPCRBuffer 75.0ml，100mM dATP、100mM dGTP、100mM dCTP、100mM dUTP各1.5ml，0.1mol/LMgCl2 15ml,振荡混匀,终体积为150.0 ml，分装后即为试剂盒中缓冲液。
(2)引物探针 256μl，主要组分及反应终浓度：军团菌及嗜肺军团菌引物各0.3μM、探针各0.2μM，内参引物各0.15μM，内参探针为0.1μM。配制方法：在26.48ml灭菌超纯水中分别加入720μl 50pmol/μl引物SEQ ID No.3（终浓度为1.125 pmol/μl），720μl 50pmol/μl引物SEQ ID No.4（终浓度为1.125 pmol/μl），720μl 50pmol/μl引物SEQ ID No.5（终浓度为1.125 pmol/μl），720μl 50pmol/μl引物SEQ ID No.6（终浓度为1.125 pmol/μl），720μl50pmol/μl引物SEQ ID No.7（终浓度为1.125 pmol/μl），360μl 50pmol/μl 引物SEQ IDNo.10（终浓度为0.563 pmol/μl），360μl 50pmol/μl 引物SEQ ID No.11（终浓度为0.563pmol/μl），480μl 50pmol/μl 探针SEQ ID No.8（终浓度为0.75 pmol/μl），480μl 50pmol/μl 探针SEQ ID No.9（终浓度为0.75 pmol/μl），240μl 50pmol/μl 探针SEQ ID No.12（终浓度为0.375 pmol/μl），分装后即为试剂盒中引物探针。
(3)DNA聚合酶96μM，其中每个反应用量：Taq DNA聚合酶1.2U、UNG酶0.05U。配制方法：在45.4ml酶稀释液（外购）中加入Taq-DNA聚合酶（5U/μl）4 ml和UNG酶（1U/μl）600μl，颠倒多次混匀,终体积为50.0ml。
(4)内参对照160μl，主要为合成的质粒，配制方法为：用TE溶液将质粒根据已知浓度，稀释至104 copies/ml，旋涡震荡混匀10分钟，分装后即为内参。
(5)阴性对照 200μl，为灭菌的甘油生理盐水。
(6)阳性对照和临界阳性对照200μl，甘油生理盐水稀释的的含嗜肺军团菌片段的质粒，配制方法为：用含20%甘油的生理盐水溶液将质粒根据已知浓度，分别稀释至105copies/ml、103 copies/ml，旋涡震荡混匀10分钟，分装后即为阳性对照和临界阳性对照。
(7)将上述组分(1)-(6)分别进行抽检，检验合格后进行包装。
(8)上述组装的试剂盒在-20℃保存，冻融次数应小于3次。
由(1)-(3)及模板配制的30μl反应体系，加入提取的样本后各组分浓度为：Tris-HCl(pH8.3) 15mM、KCl 75mM、dNTPs(ATP、dGTP、dCTP、dUTP)均为0.3mM、MgCl2 3mM，军团菌及嗜肺军团菌引物为0.3μM、探针各0.2μM，内参引物为0.2μM，内参探针为0.1μM，每个反应含Taq DNA聚合酶1.2U、UNG酶0.05U。
3.试剂盒使用方法
本发明试剂盒在样本检测过程中使用方法之一如下：
(1)样本提取
取临床采集的咽拭子、痰液、支气管肺泡灌洗液(咽拭子先用1ml生理盐水漂洗、痰液先用4％NaOH等体积混匀液化)，将咽拭子漂洗液、液化痰液和支气管肺泡灌洗液分别吸取200μl置于核酸提取板的A1-H1、A7-H7孔中，加入样本前应先在A1-H1、A7-H7孔中加入5μl内参，按照提取试剂盒说明书的要求设置自动提取程序进行核酸提取，提取板的A5-H5、A11-H11孔为提取的核酸用于荧光PCR扩增检测。试剂盒阴性和阳性对照处理方法和样品液相同。
(2)扩增检测
按照发明内容中的方法，启封试剂盒，将各组分冻融振荡混匀后配制反应预混液，其配制方法如下：
a 按反应样本数（反应样本数＝待检样品数＋对照品3个＋1）n配制反应液：取PCR反应液n×9μl、引物探针n×8μl、DNA聚合酶n×3μl于一离心管中混匀；低速离心数秒，按20μl/管分装到反应管中，再分别加入10μl提取待检测的核酸；
b 取样本提取物、对照品提取物各10μl分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置全自动荧光PCR仪上；
c 荧光PCR反应程序如下：
[1] 50℃ 2 min
[2] 94℃ 5 min
[3] 94℃ 10 s
[4] 60℃ 45 s
[5] Go to [3] ，5 cycles
[6] 94℃ 10 s
[7] 60℃ 45 s
[8] Go to [6] ，40 cycles
在第[7]步采集FAM、JOE和CY5通道荧光信号
[9] End
d 仪器PCR程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值。
CY5通道检测结果应符合下表要求：
FAM通道和JOE通道检测Ct值满足：35<Ct<40时应复检，样本检测结果解释如下表：
4. 有益效果
本发明根据上述位点设计多对引物探，通过试验验证选择最优的引物探针组合，并对反应体系和扩增条件进行优化，研制成军团菌核酸检测试剂盒 (荧光PCR法 )，其主要特点如下：
(1) 采用特异性靶序列并据此设计引物探针并通过荧光 PCR 扩增，以不同荧光标 记的探针实时检测同一靶序列而检测军团菌，并区分嗜肺军团菌，试剂盒检测灵敏度高，结果稳定可靠。
(2) 引入内参对照，可以监测提取和扩增整个过程，可以尽可能的避免假阳性和假阴性结果。
(3)扩增体系中的 dUTP-UNG 酶系统更进一步避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性。
本发明方法原理是基于TaqMan水解探针荧光PCR原理，以16s rRNA和mip基因靶位点，采用特异性引物探针，经一步法荧光PCR实验，可快速、准确的判断军团菌和嗜肺军团菌特异性核酸片段是否存在。作为一种军团菌和嗜肺军团菌核酸快速检测的手段，本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于疾控和临床中军团菌和嗜肺军团菌的快速鉴定。
具体实施方式
以下为该发明结合具体的实施例，进一步阐述本发明。
实施例1军团菌核酸检测试剂盒(荧光PCR法)
1.引物探针合成
委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成引物探针，合成的引物探针序列具体如下：
上游引物序列为：
5’-CTTAACCTGGGACGGTCAG-3’，如SEQ ID No.3所示；
5’-CTYAACCTGGGCAGGTCAG-3’，如SEQ ID No.4所示；
5’-AGGCATAGATGTTAATCCGGAAG-3’，如SEQ ID No.6所示；
5’-CCCTGAATGCGGMTAATC-3’，如SEQ ID No.10所示。
下游引物序列为：
5’-CTTTCGTGCCTCAGTGTCAGTA-3’，如SEQ ID No.5所示；
5’-GTCTTTCATTTGYTGTTCGGTT-3’，如SEQ ID No.7所示；
5’-ATTGTCACCATAAGCAGCC-3’，如SEQ ID No.11所示。
探针序列为：
5’-TAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCC-3’，5’端标记FAM(6-羧基荧光素)，3’端标记BHQ1(BlackHoleQuencher)，如SEQ ID No.8所示；
5’-CCAATTGAGCGCCACTCATAGCGT-3’，5’端标记HEX(6-羧基六氯荧光素)、JOE(6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素)或VIC荧光基团，3’端标记BHQ1，如SEQ ID No.9所示；
5’-TTCAGCGAGCGTGGGACATCAGG-3’，5’端标记Cy5荧光基团，3’端标记BHQ3，如SEQ IDNo.12所示。
合成后用无菌双蒸水溶解至浓度为50μM，-20℃保存。
2.PCR缓冲液配制，在54ml超纯水中依次加入10xPCR Buffer 75.0ml，100mMdATP、100mM dGTP、100mM dCTP、100mM dUTP各1.5ml，0.1mol/L MgCl2 15ml,振荡混匀,终体积为150.0 ml，288μl分装。
3.引物探针配制，在26.48ml灭菌超纯水中分别加入720μl 50pmol/μl引物SEQ IDNo.3（终浓度为1.125 pmol/μl），720μl 50pmol/μl引物SEQ ID No.4（终浓度为1.125pmol/μl），720μl 50pmol/μl引物SEQ ID No.5（终浓度为1.125 pmol/μl），720μl 50pmol/μl引物SEQ ID No.6（终浓度为1.125 pmol/μl），720μl 50pmol/μl引物SEQ ID No.7（终浓度为1.125 pmol/μl），360μl 50pmol/μl 引物SEQ ID No.10（终浓度为0.563 pmol/μl），360μl 50pmol/μl 引物SEQ ID No.11（终浓度为0.563 pmol/μl），480μl 50pmol/μl 探针SEQID No.8（终浓度为0.75 pmol/μl），480μl 50pmol/μl 探针SEQ ID No.9（终浓度为0.75pmol/μl），240μl 50pmol/μl 探针SEQ ID No.12（终浓度为0.375 pmol/μl），分装后即为试剂盒中引物探针。
4.DNA聚合酶，在45.4ml酶稀释液（外购）中加入Taq-DNA聚合酶（5U/μl）4 ml和UNG酶（1U/μl）600μl，颠倒多次混匀,终体积为50.0ml，96μl分装。
5.内参对照，主要为合成的质粒，配制方法为：用TE溶液将质粒根据已知浓度，稀释至104 copies/ml，旋涡震荡混匀10分钟，160μl分装。
6.阴性对照 200μl，为灭菌的甘油生理盐水。
7.阳性对照和临界阳性对照，甘油生理盐水稀释的的含嗜肺军团菌片段的质粒，配制方法为：用含20%甘油的生理盐水溶液将质粒根据已知浓度，分别稀释至105 copies/ml、103 copies/ml，旋涡震荡混匀10分钟，200μl分装。
8.将上述组分2-7分别进行抽样检验，检验合格后进行包装。
9.上述组装的试剂盒在-20℃保存，冻融次数应小于3次。
制备工艺简述如下：
(1)合成的引物探针定量配制、浓度检测、抽样质检。
(2)将PCR缓冲液、Taq酶、核酸提取液、内参照无菌分装，抽样质检。
(3)将阴性、阳性对照品进行浓度测定、分装，抽样质检。
(4)组装成品试剂盒，保存于-20℃。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海星耀医学科技发展有限公司
上海复星医药（集团）股份有限公司
郭圣明 吴大治 夏 懿
<120> 一种检测军团菌并区分嗜肺军团菌的检测试剂盒
<130> 军团菌检测
<140> cn
<141> 2016-12-15
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 209
<212> DNA
<213> Legionella pneumophila
<220>
<221> SEQ ID No.1
<222> (1)..(209)
<400> 1
gcgtaaaggg tgcgtaggtg gttgcttaag ttatctgtga aattcctggg cttaacctgg 60
gacggtcaga taatactggt tgactcgagt atgggagagg gtagtggaat ttccggtgta 120
gcggtgaaat gcgtagagat cggaaggaac accagtggcg aaggcggcta cctggcctaa 180
tactgacact gaggcacgaa agcgtgggg 209
<210> 2
<211> 277
<212> DNA
<213> SEQ ID No.2
<220>
<221> SEQ ID No.2
<222> (1)..(277)
<400> 2
agcaatcaag gcatagatgt taatccggaa gcaatggcta aaggcatgca agacgctatg 60
agtggcgctc aattggcttt aaccgaacag caaatgaaag acgttcttaa caagtttcag 120
aaagatttga tggctaagcg tactgctgaa ttcaataaga aagcggatga aaataaagta 180
aaaggggaag cctttttaac tgaaaacaaa aacaagccag gcgttgttgt attgccaagt 240
ggtttgcaat acaaagtaat caattctgga aatggtg 277
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> artifical
<220>
<221> SEQ ID No.3
<222> (1)..(19)
<400> 3
cttaacctgg gacggtcag 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> artifical
<220>
<221> SEQ ID No.4
<222> (1)..(19)
<400> 4
ctyaacctgg gcaggtcag 19
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> artifical
<220>
<221> SEQ ID No.5
<222> (1)..(22)
<400> 5
ctttcgtgcc tcagtgtcag ta 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> artifical
<220>
<221> SEQ ID No.6
<222> (1)..(23)
<400> 6
aggcatagat gttaatccgg aag 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> artifical
<220>
<221> SEQ ID No.7
<222> (1)..(22)
<400> 7
gtctttcatt tgytgttcgg tt 22
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> artifical
<220>
<221> SEQIDNo.8
<222> (2)..(26)
<223> b=FAM;d=BHQ
<400> 8
btagccgcct tcgccactgg tgttccd 27
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> artifical
<220>
<221> SEQID No.9
<222> (2)..(25)
<223> b=HEX;d=BHQ
<400> 9
bccaattgag cgccactcat agcgtd 26
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> artifical
<220>
<221> SEQ ID No.10
<222> (1)..(18)
<400> 10
ccctgaatgc ggmtaatc 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> artifical
<220>
<221> SEQ ID No.11
<222> (1)..(19)
<400> 11
attgtcacca taagcagcc 19
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> artifical
<220>
<221> SEQIDNo.12
<222> (2)..(24)
<223> b=cy5;d-bhq
<220>
<221> SEQIDNo.12
<222> (2)..(24)
<223> b=cy5;d=bhq
<400> 12
bttcagcgag cgtgggacat caggd 25

Claims (9)

1.本发明为一种检测军团菌并区分嗜肺军团菌的检测试剂盒，其特征在于，基于军团菌靶序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2设计多对引物探针，并对所设计的引物探针进行试验验证、浓度优化，同时对扩增体系中的重要组分及扩增程序进行优化，确定扩增效果最优的引物探针序列、最优扩增体系以及试验运行程序，通过TaqMan探针多波长荧光PCR技术单管扩增检测痰液及肺泡灌洗液中军团菌，并对其中的嗜肺军团菌进行区分鉴别。
2.如权利要求1所述，其特征在于，所用靶序列SEQ ID No.1为军团菌16Sr RNA基因中能用于区分军团菌的保守序列，所用靶序列SEQ ID No.2为军团菌mip基因中能用于特异性区分嗜肺军团菌的保守序列，根据SEQ ID No.1序列优化设计后的引物能扩增其连续145-160个核苷酸，根据SEQ ID No.2序列优化设计后的引物能扩增其连续和90-98个核苷酸，设计的两种TaqMan探针荧光水解探针能分别检测军团菌和嗜肺军团菌，所述引物长度为18～24个核苷酸、探针长度24～26个核苷酸。
3.如权利要求2所述，其特征在于，试剂盒所用的军团菌引物序列可以为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的序列，嗜肺军团菌引物序列可以为SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7的序列；军团菌荧光探针可以为SEQ ID No.8序列，其5’端标记FAM荧光基团；嗜肺军团菌荧光探针可以为SEQ ID No.9序列，其5’端标记HEX；两条探针3’端标记BHQ1淬灭基团；引物探针序列也可以是上述序列同源性大于85％以上。
4.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，引入了一个人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性，内参对照系统包括内参探针和内参DNA。
5.如权利要求4所述，其特征在于，内参引物、探针分别采用SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12序列，探针5’端标记Cy5荧光基团，3’端标记BHQ3淬灭基团；内参探针也可以是和上述序列同源性大于85％以上的序列。
6.如权利要求1所述方法和引物探针建立的试剂盒，包括PCR缓冲液、引物探针、DNA聚合酶、内参对照、阴性对照、阳性对照以及临界阳性对照。
7.如权利要求1所述方法和引物探针建立的试剂盒，其特征在于按照以下浓度配制成的反应体系进行扩增反应：Tris-HCl(pH8.3) 15mM、KCl 75mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.3mM、MgCl2 3mM、引物各0.3μM、军团菌荧光探针和嗜肺军团菌荧光探针及内参荧光探针各0.2μM、Taq DNA聚合酶1.2U、UNG酶0.05U。
8.如权利要求1所述试剂盒在军团菌和嗜肺军团菌快速鉴定中的应用，包括以下步骤：(1)样本处理提取模板DNA，样本为痰液、咽拭子、支气管肺泡灌洗液等临床样本或水、空气样品；(2)模板DNA扩增检测，以荧光PCR仪上三个检测通道扩增模板的荧光信号强弱和循环阈值来判断样品中军团菌和嗜肺军团菌存在，从而检测样品中军团菌，并对其中的嗜肺军团菌进行区分辨别。
9.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述的荧光PCR最优扩增程序如下：
[1] 50℃ 2 min
[2] 94℃ 5 min
[3] 94℃ 10 s
[4] 60℃ 45 s
[5] Go to [3] ，5 cycles
[6] 94℃ 10 s
[7] 60℃ 45 s
[8] Go to [6] ，40 cycles
在第[7]步采集FAM、JOE和CY5通道荧光信号
[9] End。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111424100A (zh) * 2020-02-25 2020-07-17 宁波明舟生物科技有限公司 一种肺炎军团菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎支原体的检测方法

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