CN109402240A9 - 核酸释放剂、核酸pcr扩增方法和pcr扩增试剂盒 - Google Patents

核酸释放剂、核酸pcr扩增方法和pcr扩增试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种核酸释放剂、核酸PCR扩增方法和PCR扩增试剂盒，包括Tris-HCl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇和强碱；其中，Tris-HCl的摩尔浓度为0.5mM～500mM，氯化钠的摩尔浓度为20mM～500mM，吐温20的体积百分比为0.1％～2％，曲拉通X-100的体积百分比为0.1％～3％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为0.1％～3％，氯化钾的质量浓度为5mg/mL～8mg/mL，强碱的质量浓度为2mg/mL～50mg/mL。该核酸释放剂可以使含有RNA的样品在室温下直接释放出RNA，且能够与PCR反应液直接混合进行PCR扩增，无需进行复杂的核酸提取和纯化过程即可完成扩增。

Description

核酸释放剂、核酸PCR扩增方法和PCR扩增试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种核酸释放剂、核酸PCR扩增方法和PCR 扩增试剂盒。
背景技术
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)是一种用于扩增特定的核酸片段的分子 生物学技术，其最大特点，是能将微量的核酸进行大量的富集和增加，从而达到便于检测微 量核酸的目的。其中在医学诊断上常用的PCR方法主要是基于双荧光探针的实时荧光定量 PCR(qPCR)方法，利用qPCR方法进行体外诊断的靶标主要包括人基因组DNA、DNA病 毒、细菌、真菌和RNA病毒等。而由于RNA的结构为单链结构，不稳定且容易降解，因此 在样品的处理过程当中要求非常高，需要较为复杂的方法对待扩增的RNA样品进行前处理和 核酸提取并纯化，得到纯净的核酸后，方能进行检测得到稳定的结果。
发明内容
基于此，有必要提供一种可简化RNA样品PCR扩增方法的核酸释放剂。
一种核酸释放剂，包括Tris-HCl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通X-100、乙基苯基 聚乙二醇和强碱；其中，Tris-HCl的摩尔浓度为0.5mM～500mM，氯化钠的摩尔浓度为 20mM～500mM，氯化钾的质量浓度为5mg/mL～8mg/mL，吐温20的体积百分比为0.1％～2％， 曲拉通X-100的体积百分比为0.1％～3％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为0.1％～3％，强碱 的质量浓度为2mg/mL～50mg/mL。
本发明的核酸释放剂通过一定比例的强碱使细胞裂解释放核酸，而氯化钠和氯化钾则通 过协调细胞膜内外离子平衡来对核酸起保护作用，Tris-HCl用于保证细胞裂解时pH值的稳定 且能够较好地与后续扩增时的PCR反应液兼容；曲拉通X-100一方面可以很好地对核酸特别 是单链的RNA起到保护作用，使RNA能够在碱性环境中得以保存，另一方面曲拉通X-100 和氯化钾在一定配比下可以降低强碱环境对PCR反应中酶的抑制作用，从而保证RNA的扩 增效率；吐温20和乙基苯基聚乙二醇可对逆转录酶起到保护作用，使逆转录酶在碱性环境中 正常工作。通过上述各组分的协同作用，本发明的核酸释放剂可以使含有RNA的样品在室温 下直接释放出RNA，避免因加热产生气溶胶导致的样品污染问题，并有效防止RNA在碱性 环境中的降解，更重要的是能够与PCR反应液直接混合进行PCR扩增，无需进行复杂的核 酸提取和纯化过程即可完成扩增，真正实现一室化、无污染、简单快速的RNA扩增检测，而 且检测灵敏度高，重复性良好。
在其中一个实施例中，还包括甜菜碱和牛血清白蛋白，且在所述核酸释放剂中，所述甜 菜碱的质量浓度为0.1mg/mL～20mg/mL，所述牛血清白蛋白的质量浓度为 5mg/mL～100mg/mL。
在其中一个实施例中，还包括蛋白酶K和十二烷基硫酸锂，且在所述核酸释放剂中，所 述蛋白酶K的质量浓度为0.02mg/mL～1.5mg/mL，所述十二烷基硫酸锂的质量浓度为 0.4mg/mL～30mg/mL。
本发明还提供了一种核酸PCR扩增方法，包括以下步骤：将上述核酸释放剂与样品混合， 于25℃～60℃放置2min～10min，然后加入PCR反应液进行PCR扩增。
在其中一个实施例中，在将所述核酸释放剂与样品混合之前，还包括样品的预处理步骤： 将样品与聚乙二醇混合，然后离心取沉淀。
在其中一个实施例中，对所述样品中的肠道病毒进行PCR扩增的条件为：
逆转录反应：48℃～52℃反应28min～32min；
热变性反应：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；
扩增反应：93℃～97℃反应13s～17s，53℃～57℃反应28s～32s，若干个循环；
冷却：23℃～27℃反应8s～12s。
在其中一个实施例中，对所述样品中的丙型肝炎病毒进行PCR扩增的条件为：
预变性和酶激活：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；
逆转录反应：58℃～62℃反应28min～32min；
热变性反应：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；
扩增反应：93℃～97℃反应13s～17s，58℃～62℃反应28s～32s，若干个循环；
冷却：23℃～27℃反应8s～12s。
在其中一个实施例中，对所述样品中的呼吸道病毒进行PCR扩增的条件为：
逆转录反应：48℃～52℃反应28min～32min；
热变性反应：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；
扩增反应：93℃～97℃反应13s～17s，58℃～62℃反应28s～32s，若干个循环；
冷却：23℃～27℃反应8s～12s。
在其中一个实施例中，对所述样品中的呼吸道细菌进行PCR扩增的条件为：
UDG酶反应：48℃～52℃反应1.9min～2.1min；
热变性反应：92℃～96℃反应2.9min～3.1min；
扩增反应：92℃～96℃反应8s～12s，58℃～62℃反应18s～22s，若干个循环；
延伸及荧光采集：73℃～77℃反应18s～22s；
溶解曲线：62℃～75℃。
本发明还提供了一种PCR扩增试剂盒，包括上述核酸释放剂和PCR反应液。
附图说明
图1为实施例1～25的实时荧光定量PCR扩增曲线；
图2为实施例26～50的实时荧光定量PCR扩增曲线；
图3为实施例51～70的实时荧光定量PCR扩增曲线；
图4为实施例71～90的实时荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施 例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地， 提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人 员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施 例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列 项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例的核酸释放剂，包括Tris-HCl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通X-100、 乙基苯基聚乙二醇和强碱；其中，Tris-HCl的摩尔浓度为0.5mM～500mM，氯化钠的摩尔浓 度为20mM～500mM，氯化钾的质量浓度为5mg/mL～8mg/mL，吐温20的体积百分比为0.1％～ 2％，曲拉通X-100的体积百分比为0.1％～3％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为0.1％～3％， 强碱的质量浓度为2mg/mL～50mg/mL。
为了达到裂解的效果，裂解液需要呈碱性，而RNA在碱性环境中极易被降解，同时针对 RNA的PCR扩增检测需要用到逆转录酶，相对于热稳定性较好的TaqDNA聚合酶，逆转录 酶较为脆弱，在碱性环境中容易被抑制，无法达到逆转录的效果。因此，RNA在裂解液中一 般无法直接进行PCR扩增检测。目前针对RNA样品的PCR扩增检测的前处理方法主要有煮 沸裂解法和磁珠法。煮沸裂解法是通过煮沸使样品中的核酸在裂解缓冲液的作用下释放出来， 溶解在裂解缓冲液中，沸水浴裂解细胞的同时，使细胞的蛋白质与染色体变性。然后通过离 心沉淀去除变性的蛋白质和其他杂质，回收上清液中的核酸用于PCR扩增。然而，经高温煮 沸，蛋白凝固使部分核酸被包裹并随离心沉淀丢失，直接导致上清液中模板核酸量减少，使 后续扩增检测灵敏度下降。同时，煮沸加热极容易产生气溶胶，导致样品污染，从而在后续 的检测中产生假阳性的结果。磁珠法是通过裂解液裂解细胞，游离出来的核酸分子被特异的 吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁 场作用下，使磁性颗粒与液体分开，再用洗脱液洗脱，得到纯净的核酸。但磁珠法操作复杂， 且对样本量的要求一般在200～600微升，仪器设备的要求也非常高，限制了其推广和使用。
针对上述机理，本实施例的核酸释放剂通过一定比例的强碱使细胞裂解释放核酸，而氯 化钠和氯化钾则通过协调细胞膜内外离子平衡来对核酸起保护作用，Tris-HCl用于保证细胞 裂解时pH值的稳定且能够较好地与后续扩增时的PCR反应液兼容；曲拉通X-100一方面可 以很好地对核酸特别是单链的RNA起到保护作用，使RNA能够在碱性环境中得以保存，另 一方面曲拉通X-100和氯化钾在一定配比下可以降低强碱环境对PCR反应中酶的抑制作用， 从而保证RNA的扩增效率；吐温20和乙基苯基聚乙二醇可对逆转录酶起到保护作用，使逆 转录酶在碱性环境中正常工作。通过上述各组分的协同作用，该核酸释放剂可以使含有RNA 的样品在室温下直接释放出RNA，避免因加热产生气溶胶导致的样品污染问题，并有效防止 RNA在碱性环境中的降解，更重要的是能够与PCR反应液直接混合进行PCR扩增，无需进 行复杂的核酸提取和纯化过程即可完成扩增，真正实现一室化、无污染、简单快速的RNA扩 增检测，而且检测灵敏度高，重复性良好。可以理解，该核酸释放剂不仅可用于RNA样品的 PCR扩增检测，也适用于DNA样品或RNA、DNA混合样品的多重联合扩增检测。
具体地，强碱为氢氧化钠或氢氧化钾等，可根据需要选择。
在一个具体示例中，核酸释放剂还包括甜菜碱和牛血清白蛋白，且在核酸释放剂中，甜 菜碱的质量浓度为0.1mg/mL～20mg/mL，牛血清白蛋白的质量浓度为5mg/mL～100mg/mL。通 过添加一定比例的甜菜碱和牛血清白蛋白，可以协同曲拉通X-100更好地在碱性条件下对 RNA进行保护，以及防止聚合酶和逆转录酶变性，从而确保RNA的快速释放和扩增，实现 RNA样品的快速检测。
在一个具体示例中，核酸释放剂还包括蛋白酶K和十二烷基硫酸锂，且在核酸释放剂中， 蛋白酶K的质量浓度为0.02mg/mL～1.5mg/mL，十二烷基硫酸锂的质量浓度为 0.4mg/mL～30mg/mL。通过添加一定比例的蛋白酶K和十二烷基硫酸锂，可以变性降解RNase， 从而进一步保护RNA防止其降解。
本发明一实施例的核酸PCR扩增方法，包括以下步骤：将上述核酸释放剂与样品混合， 于25℃～60℃放置2min～10min，然后加入PCR反应液进行PCR扩增。
本实施例的核酸PCR扩增方法针对RNA等核酸样品实现了免提取纯化直接进行扩增的 操作，即将上述核酸释放剂加入到样品中，使核酸从细胞中释放出来，然后直接加入PCR反 应液进行PCR扩增例如实时荧光定量PCR，无需进行煮沸加热或提取纯化等过程，就能够完 成对核酸样品的扩增检测，真正实现一室化、无污染、简单快速的RNA扩增检测，而且检测 灵敏度高，重复性良好。
在一个具体示例中，核酸释放剂与样品的体积比为1∶1～5。可选地，样品类型包括血清、 血浆、口咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、粪便等多种类型，与核酸释放剂混合后可以直接 对接下游的PCR扩增或基因芯片等检测方法。
在一个具体示例中，PCR反应液包括脱氧核糖核苷三磷酸、上游引物、下游引物、DNA 聚合酶、逆转录酶和扩增缓冲液等。可以理解，根据PCR反应类型和目的的不同，PCR反应 液的组成可以根据需要进行选择，不限于此，例如进行实时荧光定量PCR时，PCR反应液还 包括荧光探针或荧光染料等。
在一个具体示例中，在将核酸释放剂与样品混合之前，还包括样品的预处理步骤：将样 品与聚乙二醇(PEG)溶液混合，然后离心取沉淀。具体地，聚乙二醇的种类为PEG-6000， 浓度为体积百分比0.5％～5％。将聚乙二醇作为核酸沉降剂，可以用于处理复杂样品，对于以 游离形式存在的RNA病毒，能够有效捕获，增加后期的检测灵敏度，同时不影响PCR的反 应体系，可以显著提高RNA快速PCR检测的性能。例如对于含有高盐溶液的细胞保存液、 病毒保存液或已经溶血的血液样品等，可取50～5000微升样品，等体积加入PEG溶液，以 3000～13000rpm/min进行离心1～10分钟，弃去上清取沉淀，然后再加入50～100微升的核酸 释放剂。
在一个具体示例中，对样品中的肠道病毒进行PCR扩增的条件为：
逆转录反应：48℃～52℃反应28min～32min；
热变性反应：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；
扩增反应：93℃～97℃反应13s～17s，53℃～57℃反应28s～32s，若干个循环；
冷却：23℃～27℃反应8s～12s。
在一个具体示例中，对样品中的丙型肝炎病毒(HCV)进行PCR扩增的条件为：
预变性和酶激活：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；
逆转录反应：58℃～62℃反应28min～32min；
热变性反应：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；
扩增反应：93℃～97℃反应13s～17s，58℃～62℃反应28s～32s，若干个循环；
冷却：23℃～27℃反应8s～12s。
在一个具体示例中，对样品中的呼吸道病毒进行PCR扩增的条件为：
逆转录反应：48℃～52℃反应28min～32min；
热变性反应：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；
扩增反应：93℃～97℃反应13s～17s，58℃～62℃反应28s～32s，若干个循环；
冷却：23℃～27℃反应8s～12s。
在一个具体示例中，对样品中的呼吸道细菌进行PCR扩增的条件为：
UDG酶反应：48℃～52℃反应1.9min～2.1min；
热变性反应：92℃～96℃反应2.9min～3.1min；
扩增反应：92℃～96℃反应8s～12s，58℃～62℃反应18s～22s，若干个循环；
延伸及荧光采集：73℃～77℃反应18s～22s；
溶解曲线：62℃～75℃。
可以理解，PCR扩增的条件不限于上述具体示例，根据不同的PCR类型和目的可进行相 应调整。
本发明一实施例的PCR扩增试剂盒，包括上述核酸释放剂和PCR反应液。本实施例的 PCR扩增试剂盒针对RNA等核酸样品实现了免提取纯化直接进行扩增的操作，即将上述核 酸释放剂加入到样品中，使核酸从细胞中释放出来，然后直接加入PCR反应液进行PCR扩 增例如实时荧光定量PCR，无需进行煮沸加热或提取纯化等过程，就能够完成对核酸样品的 扩增检测，真正实现一室化、无污染、简单快速的RNA扩增检测，而且检测灵敏度高，重复 性良好。
以下为具体实施例。
一、肠道病毒检测
实施例1～25：准备25份肠道病毒咽拭子样品(病毒保存液基质)，分别取100μL样品于 12000rpm/min离心10min，弃去上清并加入50μL核酸释放剂，静置10min，然后取10μL与 40μL PCR反应液混合进行实时荧光定量PCR扩增，扩增曲线如图1所示。实施例1～25所用 核酸释放剂包括Tris-HCl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇、 甜菜碱、牛血清白蛋白、蛋白酶K、十二烷基硫酸锂和氢氧化钠。其中，Tris-HCl的摩尔浓 度为0.5mM，氯化钠的摩尔浓度为500mM，吐温20的体积百分比为0.1％，曲拉通X-100 的体积百分比为3％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为0.1％，氯化钾的质量浓度为8mg/mL， 氢氧化钠的质量浓度为2mg/mL，甜菜碱的质量浓度为20mg/mL，牛血清白蛋白的质量浓度 为5mg/mL，蛋白酶K的质量浓度为1.5mg/mL，十二烷基硫酸锂的质量浓度为0.4mg/mL。
对比例1～25：采用磁珠法对上述25份样品进行处理并进行实时荧光定量PCR扩增。对 比例26～35：与实施例1～10基本相同，区别在于核酸释放剂中不包括吐温20和乙基苯基聚 乙二醇。
对比例36～45：与实施例11～20基本相同，区别在于核酸释放剂中不包括曲拉通X-100。 对比例46～50：与实施例21～25基本相同，区别在于核酸释放剂中曲拉通X-100的体积百分 比为8％，氯化钾的质量浓度为15mg/mL。
各实施例和对比例的Ct值如表1所示，PCR扩增的条件为：
逆转录反应：50℃反应30min；
热变性反应：95℃反应1min；
扩增反应：95℃反应15s，55℃反应30s，45个循环；
冷却：25℃反应10s。
表1
根据检测结果可知，对比例1～25和实施例1～25均能检测出肠道病毒的阳性样本，结果 一致率达100％，准确性较好，而对比例26～50则无法稳定成功地检测出肠道病毒的阳性样本。 另外Ct数值越小说明检测灵敏度越高，对比Ct值可知采用本发明核酸释放剂及核酸PCR扩 增方法的实施例在RNA样品扩增检测中的灵敏度与磁珠法的灵敏度相当。
二、呼吸道细菌联检
实施例26～50：准备25份呼吸道痰液样本(生理盐水基质)，分别取5μL样品加入5μL 核酸释放剂，静置10min，然后加入40μL PCR反应液混合进行实时荧光定量PCR扩增，扩 增曲线如图2所示。所用核酸释放剂包括Tris-HCl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通X-100、 乙基苯基聚乙二醇、甜菜碱、牛血清白蛋白、蛋白酶K、十二烷基硫酸锂和氢氧化钠。其中， Tris-HCl的摩尔浓度为500mM，氯化钠的摩尔浓度为20mM，吐温20的体积百分比为2％， 曲拉通X-100的体积百分比为0.1％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为3％，氯化钾的质量 浓度为5mg/mL，氢氧化钠的质量浓度为50mg/mL，甜菜碱的质量浓度为0.1mg/mL，牛血清 白蛋白的质量浓度为100mg/mL，蛋白酶K的质量浓度为0.02mg/mL，十二烷基硫酸锂的质 量浓度为30mg/mL。
对比例51～75：采用磁珠法对上述25份样品进行处理并进行实时荧光定量PCR扩增。
各实施例和对比例的Ct值如表2所示，PCR扩增的条件为：
UDG酶反应：50℃反应2min；
热变性反应：94℃反应3min；
扩增反应：94℃反应10s，60℃反应20s，45个循环；
延伸及荧光采集：75℃反应20s；
溶解曲线：62℃～75℃。
表2
对比例51～63 实施例26～38 对比例64～75 实施例39～50
样本1 35.36 31.34 样本14 23.35 24.14
样本2 29.47 24.54 样本15 36.03 32.69
样本3 30.18 31.1 样本16 36.2 35.99
样本4 37.23 36.56 样本17 36.02 35.95
样本5 33.21 28.44 样本18 33.44 33.2
样本6 27.94 25.69 样本19 38.34 38.32
样本7 26.58 24.945 样本20 30.76 29.145
样本8 31.19 30.495 样本21 36.49 30.85
样本9 33.64 29.675 样本22 26.22 25.925
样本10 37.95 34.455 样本23 23.01 22.96
样本11 32.68 24.13 样本24 31.39 27.32
样本12 27.58 23.355 样本25 29.26 24.015
样本13 34.14 32.605
根据检测结果可知，对比例和实施例均能检测出呼吸道细菌的阳性样本，结果一致率达 100％，准确性较好。另外Ct数值越小说明检测灵敏度越高，对比Ct值可知采用本发明核酸 释放剂及核酸PCR扩增方法的实施例在细菌多重扩增检测中的灵敏度与磁珠法的灵敏度相 当。也说明本发明的核酸释放剂及核酸PCR扩增方法不仅仅适用于RNA样品的扩增检测， 同时也可应用于DNA样品的扩增检测。
三、HCV病毒检测
实施例51～70：准备20份HCV血清样品，分别取15μL样品加入5μL核酸释放剂，静 置10min，然后与30μL PCR反应液混合进行实时荧光定量PCR扩增，扩增曲线如图3所示。 所用核酸释放剂包括Tris-HCl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二 醇、甜菜碱、牛血清白蛋白和氢氧化钠。其中，Tris-HCl的摩尔浓度为200mM，氯化钠的摩 尔浓度为250mM，吐温20的体积百分比为1％，曲拉通X-100的体积百分比为2％，乙基苯 基聚乙二醇的体积百分比为2％，氯化钾的质量浓度为7mg/mL，氢氧化钠的质量浓度为 25mg/mL，甜菜碱的质量浓度为10mg/mL，牛血清白蛋白的质量浓度为60mg/mL。
实施例91～110：使用与实施例51～70相同的HCV血清样品，分别取15μL样品加入5μL 核酸释放剂，静置10min，然后与30μL PCR反应液混合进行实时荧光定量PCR扩增，所用 核酸释放剂与实施例1～25所用核酸释放剂相同。
各实施例的Ct值如表3所示，PCR扩增的条件为：
预变性和酶激活：95℃反应1min；
逆转录反应：60℃反应30min；
热变性反应：95℃反应1min；
扩增反应：95℃反应15s，60℃反应30s，45个循环；
冷却：25℃反应10s。
表3
根据图3可知，采用本发明核酸释放剂及核酸PCR扩增方法的实施例均能检测出HCV 病毒的阳性样本，稳定性较好。另外，从表3可以看到实施例51～70的检测灵敏度略差于实 施例91～100，说明实施例51～70采用的核酸释放剂的效果略逊于实施例91～100采用的核酸 释放剂。
四、呼吸道病毒检测
实施例71～90：准备20份呼吸道病毒咽拭子样品(生理盐水基质)，分别取100μL样品 于12000rpm/min离心10min，弃去上清并加入50μL核酸释放剂，静置10min，然后取10μL 与40μL PCR反应液混合进行实时荧光定量PCR扩增，扩增曲线如图4所示。所用核酸释放 剂包括Tris-HCl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇和氢氧化钠。 其中，Tris-HCl的摩尔浓度为400mM，氯化钠的摩尔浓度为150mM，吐温20的体积百分比 为0.8％，曲拉通X-100的体积百分比为1.2％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为1.5％，氯 化钾的质量浓度为6mg/mL，氢氧化钠的质量浓度为15mg/mL。
实施例111～130：使用与实施例71～90相同的呼吸道病毒咽拭子样品，分别取100μL样 品于12000rpm/min离心10min，弃去上清并加入50μL核酸释放剂，静置10min，然后取10μL 与40μL PCR反应液混合进行实时荧光定量PCR扩增，所用核酸释放剂与实施例51～70所用 核酸释放剂相同。
各实施例的Ct值如表4所示，PCR扩增的条件为：
逆转录反应：50℃反应30min；
热变性反应：95℃反应1min；
扩增反应：95℃反应15s，60℃反应30s，45个循环；
冷却：25℃反应10s。
表4
实施例111～120 实施例71～80 实施例121～130 实施例81～90
样本1 23.64 26.05 样本11 27.56 28.69
样本2 25.97 28.77 样本12 28.67 29.61
样本3 29.55 31.28 样本13 26.22 28.32
样本4 30.52 32.65 样本14 27.88 29.78
样本5 28.10 28.55 样本15 31.36 31.54
样本6 31.69 34.12 样本16 30.69 33.69
样本7 25.19 26.12 样本17 29.89 29.47
样本8 30.26 32.36 样本18 30.79 32.34
样本9 28.96 31.59 样本19 29.20 32.69
样本10 31.60 31.35 样本20 33.59 33.06
根据图4可知，采用本发明核酸释放剂及核酸PCR扩增方法的实施例均能检测出呼吸道 病毒的阳性样本，稳定性较好。另外，从表4可以看到实施例71～90的检测灵敏度略差于实 施例111～130，说明实施例71～90采用的核酸释放剂的效果略逊于实施例111～130采用的核 酸释放剂。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中 的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾， 都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因 此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不 脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因 此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种核酸释放剂，其特征在于，包括Tris-HCl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通 X-100、乙基苯基聚乙二醇和强碱；其中，Tris-HCl的摩尔浓度为0.5mM～500mM，氯化钠的 摩尔浓度为20mM～500mM，氯化钾的质量浓度为5mg/mL～8mg/mL，吐温20的体积百分比 为0.1％～2％，曲拉通X-100的体积百分比为0.1％～3％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为 0.1％～3％，强碱的质量浓度为2mg/mL～50mg/mL。
2.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于，还包括甜菜碱和牛血清白蛋白，且 在所述核酸释放剂中，所述甜菜碱的质量浓度为0.1mg/mL～20mg/mL，所述牛血清白蛋白的 质量浓度为5mg/mL～100mg/mL。
3.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于，还包括蛋白酶K和十二烷基硫酸 锂，且在所述核酸释放剂中，所述蛋白酶K的质量浓度为0.02mg/mL～1.5mg/mL，所述十二 烷基硫酸锂的质量浓度为0.4mg/mL～30mg/mL。
4.一种核酸PCR扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1～3任一项所述 的核酸释放剂与样品混合，于25℃～60℃放置2min～10min，然后加入PCR反应液进行PCR 扩增。
5.根据权利要求4所述的核酸PCR扩增方法，其特征在于，在将所述核酸释放剂与样 品混合之前，还包括样品的预处理步骤：将样品与聚乙二醇混合，然后离心取沉淀。
6.根据权利要求4所述的核酸PCR扩增方法，其特征在于，对所述样品中的肠道病毒 进行PCR扩增的条件为：
逆转录反应：48℃～52℃反应28min～32min；
热变性反应：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；
扩增反应：93℃～97℃反应13s～17s，53℃～57℃反应28s～32s，若干个循环；
冷却：23℃～27℃反应8s～12s。
7.根据权利要求4所述的核酸PCR扩增方法，其特征在于，对所述样品中的丙型肝炎 病毒进行PCR扩增的条件为：
预变性和酶激活：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；
逆转录反应：58℃～62℃反应28min～32min；
热变性反应：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；
扩增反应：93℃～97℃反应13s～17s，58℃～62℃反应28s～32s，若干个循环；
冷却：23℃～27℃反应8s～12s。
8.根据权利要求4所述的核酸PCR扩增方法，其特征在于，对所述样品中的呼吸道病 毒进行PCR扩增的条件为：
逆转录反应：48℃～52℃反应28min～32min；
热变性反应：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；
扩增反应：93℃～97℃反应13s～17s，58℃～62℃反应28s～32s，若干个循环；
冷却：23℃～27℃反应8s～12s。
9.根据权利要求4所述的核酸PCR扩增方法，其特征在于，对所述样品中的呼吸道细 菌进行PCR扩增的条件为：
UDG酶反应：48℃～52℃反应1.9min～2.1min；
热变性反应：92℃～96℃反应2.9min～3.1min；
扩增反应：92℃～96℃反应8s～12s，58℃～62℃反应18s～22s，若干个循环；
延伸及荧光采集：73℃～77℃反应18s～22s；
溶解曲线：62℃～75℃。
10.一种PCR扩增试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的核酸释放剂和 PCR反应液。
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109402240B (zh) * 2019-01-08 2020-08-25 圣湘生物科技股份有限公司 核酸释放剂、核酸pcr扩增方法和pcr扩增试剂盒
CN111139313B (zh) * 2020-01-15 2022-08-02 深圳市尚维高科有限公司 一种高效快速检测及定量血清或血浆核酸的试剂盒及方法
CN111254188A (zh) * 2020-02-06 2020-06-09 成都导胜生物技术有限公司 一种用于直接pcr扩增的组织液、扩增体系及试剂盒
CN111218502B (zh) * 2020-04-23 2020-07-21 圣湘生物科技股份有限公司 提升qPCR检测性能的组合物、反应液、用途及方法
CN112266910A (zh) * 2020-12-04 2021-01-26 南京求臻基因科技有限公司 一种核酸释放剂及其核酸释放方法
CN112980831B (zh) * 2020-12-28 2022-11-25 广州凯普医药科技有限公司 一种拭子样本核酸释放剂
CN113025686B (zh) * 2021-03-12 2023-07-28 江苏吉诺思美精准医学科技有限公司 一种病毒rna释放剂、试剂盒及其应用
CN113337642A (zh) * 2021-06-22 2021-09-03 中国人民解放军陆军军医大学 一种检测新型冠状病毒的rt-pcr试剂盒
WO2023011660A1 (en) * 2021-08-06 2023-02-09 Sansure Biotech Inc. Compositions for liquefying a viscous biological sample, combination products, liquefying agents, and kits thereof, and methods and application thereof
CN114107442B (zh) * 2022-01-27 2022-05-27 圣湘生物科技股份有限公司 粘性生物样本液化释放组合产品、试剂盒、液化释放方法及核酸的提取、扩增和检测方法
CN113444719A (zh) * 2021-08-11 2021-09-28 上海芃龄医疗科技有限公司 一种核酸释放剂以及核酸释放的方法
CN116218835A (zh) * 2021-12-02 2023-06-06 圣湘生物科技股份有限公司 免洗涤提取核酸的组合物、试剂盒、方法及用途
CN114181932B (zh) * 2021-12-03 2022-12-20 无锡百泰克生物技术有限公司 核酸释放剂及其应用
CN114196522A (zh) * 2022-02-18 2022-03-18 深圳市尚维高科有限公司 一种一步法核酸检测方法及其所用的密封性核酸检测装置
CN114672541B (zh) * 2022-03-21 2024-02-02 生工生物工程（上海）股份有限公司 一种核酸释放液、试剂盒及核酸释放的方法
CN114717225A (zh) * 2022-04-14 2022-07-08 苏州天隆生物科技有限公司 一种用于全血样本的处理液及包含其的试剂盒与扩增方法
CN114736991B (zh) * 2022-05-18 2023-11-17 圣湘生物科技股份有限公司 一步法检测致泻性病毒的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN117106772B (zh) * 2023-10-25 2024-01-26 青岛金域医学检验实验室有限公司 一种用于病毒核酸检测的样本释放剂

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2161337A1 (en) * 1993-05-06 1994-11-24 Denis R. Henrard Direct lysis buffer and the detection of hiv-1 plasma viremia
EP1438419A2 (en) * 2001-10-26 2004-07-21 Immunivest Corporation Multiparameter analysis of comprehensive nucleic acids and morphological features on the same sample
WO2004041285A1 (en) * 2002-10-31 2004-05-21 Amgen Inc. Antiinflammation agents
CN1188530C (zh) * 2003-05-16 2005-02-09 浙江大学医学院附属第一医院 Sars病毒的基因检测试剂盒及检测方法
WO2007146197A1 (en) * 2006-06-09 2007-12-21 Xing-Xiang Li Methods and reagents for virus isolation and detection
CN108866169A (zh) * 2011-07-06 2018-11-23 探索诊断投资公司 病毒和细菌病原体的直接扩增和检测
CN104450674A (zh) * 2013-09-24 2015-03-25 上海艾迪康医学检验所有限公司 核酸提取保存液
CN105734044A (zh) * 2014-12-08 2016-07-06 苏州新波生物技术有限公司 用于核酸提取纯化的漂洗液
CN104928402B (zh) * 2015-06-15 2018-03-27 菲鹏生物股份有限公司 荧光定量pcr检测核酸分子的方法
WO2017088169A1 (en) * 2015-11-27 2017-06-01 Coyote Bioscience Co., Ltd. Methods and systems for nucleic acid amplification
CN107299097A (zh) * 2017-05-25 2017-10-27 北京立科技发展有限公司 一种微量核酸释放剂、制备方法及其应用
CN106987588B (zh) * 2017-05-27 2020-02-14 济凡生物科技（北京）有限公司 一种病毒/细菌的裂解液及荧光定量pcr检测方法
CN107022651B (zh) * 2017-06-02 2021-01-29 辽宁润基生物科技有限公司 一种快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒及其检测方法
CN109402240B (zh) * 2019-01-08 2020-08-25 圣湘生物科技股份有限公司 核酸释放剂、核酸pcr扩增方法和pcr扩增试剂盒

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