CN112980831B - 一种拭子样本核酸释放剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种拭子样本核酸释放剂。其成分中添加了非离子表面活性剂异山梨醇二甲醚和渗透剂N‑正烷基苯并异噻酮唑酮。本发明的核酸释放剂既可快速释放核酸,无需进行核酸的提取纯化步骤,而且兼具样本保存功能。拭子样本采集后置于核酸释放剂中,室温静置2~30min即可直接用于PCR等分子生物学实验,且对后续核酸检测不产生影响,采集的样本可常温保存14天核酸不降解,另外最低检测限可达100copies/mL。产品安全可靠,操作简单、快速,适用于急诊、发热门诊、现场大量快速筛查等核酸检测场景。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域。更具体地,涉及一种拭子样本核酸释放剂。
背景技术
常规病原微生物的核酸检测需经过核酸提取步骤,这使得核酸检测过程耗时 较长,不能满足快速检测需要。核酸释放剂可用于快速裂解各类常见样本,无需 核酸的提取纯化步骤,样本裂解物可直接作为模板进行扩增反应,目前已在病原 微生物检测领域普遍使用。但现有核酸释放剂存在操作不够简便,或不能同时满 足样本保存的需要,以及核酸释放仍不够快速等问题。
中国专利CN 109402240 A公开了一种核酸释放剂、核酸PCR扩增方法和 PCR扩增试剂盒,该核酸释放剂可在室温下直接释放出RNA并满足后续检测, 但不能同时满足保存样本的需要。中国专利CN 111925941 A公开了一种能够免 提取的病毒核酸样本保存液,但其在检测前病毒需经56℃以上孵育30分钟灭活, 仍不够简便。
因此,尤其在当前新冠防疫背景下,持续开发和优化核酸释放剂对病原微生 物的实际检测工作有重要意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是为克服上述现有核酸释放剂产品的不足,提供 一种能快速释放拭子样本DNA或RNA的核酸释放剂,当样本采集后,立即将 样本与核酸释放剂混合,室温静置2-30min,即可吸取样本进行核酸检测,且不 影响后续PCR检测反应,操作简便,特别适合一些在急诊、发热门诊等情景的 核酸检测。同时本发明所提供的核酸释放剂也可作为鼻咽拭子样本的保存液,可 常温保存14天保护核酸不被降解。
本发明的目的是提供一种拭子样本核酸释放剂。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
常规核酸提取试剂中的主要成分为细胞裂解剂,常用的细胞裂解剂如尿素、 SDS等的残留会对后续PCR反应产生明显的抑制,不能满足核酸释放剂的使用 要求,除上述试剂外,一些较为温和的表面活性剂也可满足细胞裂解的需要,因 此本发明所述核酸释放剂中复配了多种表面活性剂。在尝试了多种配方后,最终 确定了本发明所述核酸释放剂的主要成分:异山梨醇二甲醚和N-正烷基苯并异 噻酮唑酮。试验结果显示,本发明所述核酸释放剂能达到快速释放核酸但不影响 后续PCR反应的要求,同时也能满足样本保存的需要。
优选地,所述核酸释放剂中异山梨醇二甲醚的浓度为0.05~2g/L。
优选地,所述核酸释放剂中N-正烷基苯并异噻酮唑酮的浓度为0.05~2g/L。
优选地,所述核酸释放剂的pH值为7~9。
进一步优选地,所述核酸释放剂的pH值为7.5~8.5。
优选地,所述核酸释放剂中还含有阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、 酶保护剂、变性剂、酶稳定剂、Mg离子、pH调节剂。
进一步优选地,所述阳离子表面活性剂可以是CTAB、十六烷基溴化吡啶或 聚氧乙烯脂肪胺中的一种或几种;
所述非离子表面活性剂可以是NP40、蔗糖脂肪酸酯、曲拉通、十二烷基醇 聚氧乙烯醚硫酸钠或十二烷基硫酸铵中的一种或几种;
所述酶保护剂可以是明胶、亚精胺或甜菜碱中的一种或几种;
所述变性剂可以是chaps、叠氮钠或盐酸胍中的一种或几种;
所述酶稳定剂可以是PVP、DMSO或PEG6000中的一种或几种;
所述Mg离子可以是MgCl2、MgSO4、或C4H6O4Mg·4H2O等;
所述pH调节剂可以是NaOH或Na2CO3等。
优选地,所述核酸释放剂中各组分浓度为:所述阳离子表面活性剂0.05~ 2g/L、非离子表面活性剂0.05~6g/L、酶保护剂0.05~2g/L、变性剂0.05~2g/L、 酶稳定剂0.05~4g/L、Mg离子0.1~3g/L。
更优选地,所述核酸释放剂中各组分浓度为:所述阳离子表面活性剂0.05~0.5g/L、非离子表面活性剂0.05~1.5g/L、酶保护剂0.05~0.5g/L、变性剂0.05~ 0.5g/L、酶稳定剂0.05~1g/L、Mg离子0.1~0.5g/L。
最优选地,所述核酸释放剂中各组分浓度为:所述阳离子表面活性剂0.1g/L、 非离子表面活性剂0.3g/L、酶保护剂0.1g/L、变性剂0.1g/L、酶稳定剂0.2g/L、 Mg离子0.2g/L。
作为一种优选的实施方案,更优选地,本发明所述核酸释放剂由异山梨醇二 甲醚、N-正烷基苯并异噻酮唑酮、CTAB、NP40、蔗糖脂肪酸酯、曲拉通、chaps、 明胶、PVP、DMSO、MgCl2、NaOH和水组成。优选地,所述核酸释放剂中各 组分的可选浓度范围:异山梨醇二甲醚为0.05~2g/L,N-正烷基苯并异噻酮唑酮 为0.05~2g/L,CTAB为0.05~2g/L,NP40为0.05~2g/L,蔗糖脂肪酸酯为0.05~ 2g/L,曲拉通为0.05~2g/L,chaps为0.05~2g/L,明胶为0.05~2g/L,PVP为 0.05~2g/L,DMSO为0.05~2g/L,MgCl2为0.1~3g/L,NaOH为0.05~2g/L。
更优选地,所述核酸释放剂中各组分的优选浓度范围:异山梨醇二甲醚为 0.05~0.5g/L,N-正烷基苯并异噻酮唑酮为0.05~0.5g/L,CTAB为0.05~0.5g/L, NP40为0.05~0.5g/L,蔗糖脂肪酸酯为0.05~0.5g/L,曲拉通为0.05~0.5g/L, chaps为0.05~0.5g/L,明胶为0.05~0.5g/L,PVP为0.05~0.5g/L,DMSO为0.05~ 0.5g/L,MgCl2为0.1~0.5g/L,NaOH为0.05~0.5g/L。
最优选地,所述核酸释放剂中各组分的最佳浓度:异山梨醇二甲醚为0.1g/L, N-正烷基苯并异噻酮唑酮为0.1g/L,CTAB为0.1g/L,NP40为0.1g/L,蔗糖脂 肪酸酯为0.1g/L,曲拉通为0.1g/L,chaps为0.1g/L,明胶为0.1g/L,PVP为0.1g/L, DMSO为0.1g/L,MgCl2为0.2g/L,NaOH为0.1g/L。
本发明具有以下有益效果:
本发明所述核酸释放剂可以对保存的样本进行核酸的快速释放。当样本采集 后,可立刻将样本与所述核酸释放剂混合,室温静置2~30min,即可吸取样本 裂解物进行核酸检测,操作方便快捷,且不会对后续PCR反应造成影响,检测 限可以达到100copies/mL。
同时本发明所述核酸释放剂又可作为拭子样本的保存剂,可常温保存14天 保护核酸不被降解。
附图说明
图1为本发明核酸释放剂检测新冠N基因的检测效果(单位:copies/mL)。
图2为本发明核酸释放剂检测新冠ORF1ab基因的检测效果(单位: copies/mL)。
图3为对比组检测新冠N基因的检测效果(单位:copies/mL)。
图4为对比组检测新冠ORF1ab基因的检测效果(单位:copies/mL)
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本 发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技 术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1核酸释放剂的配制
1、本发明经过了大量的探索和尝试,最终得到核酸释放效果最快最好、保 存功能最优的本发明核酸释放剂,固将该配方作为正式配方使用。
核酸释放剂1配方(如表1,正式配方)如下:异山梨醇二甲醚、N-正烷基 苯并异噻酮唑酮、CTAB、NP40、蔗糖脂肪酸酯、曲拉通、chaps、明胶、PVP、 DMSO、MgCl2、NaOH和ddH2O。将MgCl2配制成百分比浓度为20%的母液, 其余各组分分别配制成百分比浓度为10%的母液,每个组分各吸取1mL母液后 混合,加ddH2O补至1L,混合后的溶液震荡混匀即为成品核酸释放剂,pH为 8±0.5。
表1核酸释放剂1(正式配方)
注:所有母液的溶剂为ddH2O。
另外,以下展示了部分失败配方作为对比。
核酸释放剂2配方(如表2,失败配方):此配方与正式配方的区别在于将 异山梨醇二甲醚和N-正烷基苯并异噻酮唑酮替换成NaCl和山梨醇,配制方法均 相同。
表2核酸释放剂2配方(失败配方)
核酸释放剂3配方(如表3,失败配方):此配方与正式配方的区别在于将 异山梨醇二甲醚和N-正烷基苯并异噻酮唑酮替换成甘露醇和甘油,配制方法均 相同。
表3核酸释放剂3配方(失败配方)
核酸释放剂4配方(如表4,失败配方):此配方与正式配方的区别在于将 N-正烷基苯并异噻酮唑酮替换成聚乙二醇,配制方法均相同。
表4核酸释放剂4配方(失败配方)
实施例2病毒核酸的提取和扩增
1、以实施例1中表1-4所示四个核酸释放剂配方作为实验材料验证其核酸 释放功能。
检测样本:将新冠假病毒分别用上述核酸释放剂稀释至106copies/mL,105copies/mL,104copies/mL,103copies/mL,102copies/mL,然后常温放置约10min 后,吸取5μL体积的样本用新冠检测试剂盒检测。
检测结果如图1(新冠N基因检测,所用试剂盒为明德生物新型冠状病毒 2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法))和图2(新冠ORF1ab基因检测, 所用试剂盒为明德生物新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)) 所示,本发明核酸释放剂1处理后的样本可用新冠检测试剂盒检出,且检测限可 以达到100copies/mL。
而其余核酸释放剂处理后的样本未能用新冠检测试剂盒检出,表明这些配方 达不到快速释放核酸的效果(如图3和图4所示)。
2、核酸释放所需时间与保存效果的考察
以实施例1中四个核酸释放剂配方作为实验材料对其核酸释放所需时间与 对核实样本保存效果进行考察。
利用上述相同的方法,将新冠假病毒用核酸释放剂稀释至100copies/mL, 分为多个重复样本,然后分别常温放置1min、2min、5min、15min、20min、30min、 1天、2天、3天、5天、10天、12天、14天后,吸取5μL体积的样本用新冠检 测试剂盒检测。
结果显示(如表5),1min实验组信号较弱,可视作未成功检出;2min及 以上的实验组均可成功检出。
表5
常温放置时间 | 配方1 | 配方2 | 配方3 | 配方4 |
1min | - | - | - | - |
2min | + | - | - | - |
5min | + | - | - | - |
15min | + | - | - | - |
20min | + | - | - | - |
25min | + | - | - | + |
30min | + | + | + | + |
1天 | + | + | + | + |
2天 | + | + | + | + |
3天 | + | + | - | + |
5天 | + | - | - | + |
10天 | + | - | - | - |
12天 | + | - | - | - |
14天 | + | - | - | - |
注:+代表检出,-代表未检出。
结果表明,在核酸释放速度方面,本发明核酸释放剂显著优于对比配方,所 需时间最短可至2min;而对样本的保存与核酸保护方面,本发明核酸释放剂也 显著优于对比配方,保存时间可达14天。
实施例3拭子样本的收集保存与检测
1、鼻咽拭子采集
1)患者头部后仰(约70度),保持不动。
2)用拭子棒估测耳根到鼻孔距离。
3)自鼻孔垂直面部方向插入,深入距离最少应达耳垂部位到鼻尖长度的一 半。遇到阻力后即到达后鼻咽,应停留数秒吸取分泌物(一般要求15~30s), 应旋转拭子3~5次,宜轻轻旋转取出拭子,拭子头浸入装有保存液液的收集管 中。
4)顶端处折断无菌拭子杆,尾部弃去,旋紧管盖并用封口膜封闭。
2、口腔咽拭子采集
1)嘱患者先用生理盐水或清水漱口。
2)将拭子放入无菌生理盐水中湿润。
3)瞩患者坐下,头后倾,张大嘴,并发“啊”音。
4)用压舌板固定舌头,拭子越过舌根到咽后壁及扁桃体隐窝、侧壁等处。
5)应先用拭子适度用力来回擦拭双侧咽扁桃体至少3次,然后再咽后壁至 少3次,3~5次为宜。
6)取出拭子,避免触及舌头、悬垂体、口腔粘膜和唾液。
7)将拭子头浸入含样本保存液中。
8)靠近顶端处折断无菌拭子杆,尾部弃去,旋紧管盖并用封口膜封闭。
3、拭子样本的保存与检测
参考实施例2的方法,将样本由新冠假病毒换为上述采集的拭子样本。
测试结果如表6所示。
表6
注:+代表检出,-代表未检出。
结果表明,在对拭子样本的核酸释放速度方面,以及对样本的保存与核酸保 护方面都非常好,核酸释放所需时间最短可至2min,保存时间可达14天。
实施例4核酸释放剂配比的优化
我们对核酸释放剂各组分配比进行了大量的考察实验,方法参考实施例2。 结果显示,本发明核酸释放剂的配方浓度如表7所示:
表7
注:溶剂为ddH2O。
以下展示部分配方的检测结果(如表8和表9)
表8
表9
注:+代表检出,-代表未检出。
实施例5其它核酸释放剂成功配方
除实施例1中所述正式配方外,本发明在大量的探索和尝试过程中也发现了 其它成功配方(如表10~表12)。采用实施例2所述方法对其释放效果进行考 察,结果(如表13)发现下述核酸释放剂也能实现核酸的快速释放。下述核酸 释放剂的配制方法与实施例1相同。
表10核酸释放剂5(成功配方)
注:所有母液的溶剂为ddH2O。
表11核酸释放剂6(成功配方)
注:所有母液的溶剂为ddH2O。
表12核酸释放剂7(成功配方)
注:所有母液的溶剂为ddH2O。
结果显示(如表13),1min实验组信号较弱,可视作未成功检出;2min及 以上的实验组均可成功检出,与正式配方核酸释放剂的效果一致。
表13
常温放置时间 | 配方5 | 配方6 | 配方7 |
1min | - | - | - |
2min | + | + | + |
5min | + | + | + |
15min | + | + | + |
20min | + | + | + |
25min | + | + | + |
30min | + | + | + |
1天 | + | + | + |
2天 | + | + | + |
3天 | + | + | + |
5天 | + | + | + |
10天 | + | + | + |
12天 | + | + | + |
14天 | + | + | + |
注:+代表检出,-代表未检出。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种核酸释放剂,其特征在于,所述核酸释放剂内含有异山梨醇二甲醚,N-正烷基苯并异噻酮唑酮,阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、酶保护剂、变性剂、酶稳定剂、Mg离子、pH调节剂;
所述非离子表面活性剂是NP40、蔗糖脂肪酸酯、曲拉通、十二烷基醇聚氧乙烯醚硫酸钠或十二烷基硫酸铵中的至少两种。
2.根据权利要求1所述核酸释放剂,其特征在于,异山梨醇二甲醚的浓度为0.05~2g/L。
3.根据权利要求1所述核酸释放剂,其特征在于,N-正烷基苯并异噻酮唑酮的浓度为0.05~2g/L。
4.根据权利要求1-3任一所述核酸释放剂,其特征在于,pH值为7~9。
5.根据权利要求1所述核酸释放剂,其特征在于,所述阳离子表面活性剂是CTAB、十六烷基溴化吡啶或聚氧乙烯脂肪胺中的一种或几种,所述酶保护剂是明胶、亚精胺或甜菜碱中的一种或几种,所述变性剂是chaps、叠氮钠或盐酸胍中的一种或几种,所述酶稳定剂是PVP、DMSO或PEG6000中的一种或几种,所述Mg离子是MgCl2、MgSO4、或C4H6O4Mg·4H2O,所述pH调节剂是NaOH或Na2CO3。
6.根据权利要求1所述核酸释放剂,其特征在于,所述阳离子表面活性剂浓度为0.05~2g/L、非离子表面活性剂浓度为0.05~6g/L、酶保护剂浓度为0.05~2g/L、变性剂浓度为0.05~2g/L、酶稳定剂浓度为0.05~4g/L、Mg离子浓度为0.1~3g/L。
7.根据权利要求1所述核酸释放剂,其特征在于,所述核酸释放剂由异山梨醇二甲醚、N-正烷基苯并异噻酮唑酮、CTAB、NP40、蔗糖脂肪酸酯、曲拉通、chaps、明胶、PVP、DMSO、MgCl2、NaOH和水组成。
8.根据权利要求7所述核酸释放剂,其特征在于,所述核酸释放剂中各组分的浓度范围:异山梨醇二甲醚为0.05~2g/L,N-正烷基苯并异噻酮唑酮为0.05~2g/L,CTAB为0.05~2g/L,NP40为0.05~2g/L,蔗糖脂肪酸酯为0.05~2g/L,曲拉通为0.05~2g/L,chaps为0.05~2g/L,明胶为0.05~2g/L,PVP为0.05~2g/L,DMSO为0.05~2g/L,MgCl2为0.1~3g/L,NaOH为0.05~2g/L。
9.根据权利要求8所述核酸释放剂,其特征在于,所述核酸释放剂中各组分的浓度范围:异山梨醇二甲醚为0.05~0.5g/L,N-正烷基苯并异噻酮唑酮为0.05~0.5g/L,CTAB为0.05~0.5g/L,NP40为0.05~0.5g/L,蔗糖脂肪酸酯为0.05~0.5g/L,曲拉通为0.05~0.5g/L,chaps为0.05~0.5g/L,明胶为0.05~0.5g/L,PVP为0.05~0.5g/L,DMSO为0.05~0.5g/L,MgCl2为0.1~0.5g/L,NaOH为0.05~0.5g/L。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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