CN111925941B

CN111925941B - 一种病毒保存液及其应用

Info

Publication number: CN111925941B
Application number: CN202011014171.1A
Authority: CN
Inventors: 刘淑君; 殷剑峰; 肖欢欢; 王春香
Original assignee: Jiangsu Kangwei Century Biotechnology Co ltd; Beijing Jianwei Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Beijing Jianwei medical laboratory Co.,Ltd.; Jiangsu Kangwei century Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2020-09-24
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2040-09-24
Also published as: CN111925941A

Abstract

本发明公开了一种能够保存免提取的病毒核酸样品的保存液。本发明的保存液采用非离子型表面活性剂温和裂解细胞释放病毒核酸，提供的核酸稳定缓冲液在常温运输和保存以及高温灭活病毒处理过程中有效保证病毒核酸免遭降解，降低检测假阴性结果。而且，本发明的病毒保存液中不含PCR抑制剂，可免核酸提取操作，直接作为样本模板进行后续（RT‑）PCR核酸检测实验，大大简化病毒检测流程和时间，有效提高疫情防控的反应速度和有效性。

Description

一种病毒保存液及其应用

技术领域

本发明涉及一种病毒保存液，特别涉及一种能够能保存免提取的病毒核酸样品的保存液，属于分子生物学技术领域。

背景技术

2019年底爆发的病毒感染性肺炎（COVID-19）对全人类的健康造成巨大威胁，并造成重大经济损失。快速、准确的病原诊断是有效治疗、病情监测和控制疾病蔓延的重要前提。目前，通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）筛查和确诊病患是新冠肺炎防控的主要手段。如何保证核酸检测结果的及时性和准确性对当前疫情防控具有非常重大的意义。

病毒（Virus）是一种具有比较原始的生命形态和生命特征的非细胞生物，通常由基因组和外壳蛋白构成。病毒的核酸是最难以稳定保存的生物分子之一，主要在于其存在自降解和生物酶导致的降解。因此，病毒核酸样本的保存和运输通常是决定病毒样本质量及其检测质量的关键因素，尤其是RNA病毒。因此，通常含有RNA病毒的样本建议存放于专用的病毒保存液中，并在冷藏状态下（即4℃或更低温度）保存。在烈性传染的病原核酸临床检测中，临检人员易受到传染病原暴露的威胁，需要采取严格的防护设备和措施以降低临检人员感染风险。鉴于新型冠状病毒感染聚集性发病，感染性极强，且有重症病例，并有死亡病例，根据国家卫健委颁布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》规定，感染性材料或活病毒在实验活动过程中要按照病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物进行管理，在采用可靠的方法灭活后（例如将样品在 56℃孵育30- 45分钟或更高温度进行病毒灭活）可在BSL-1实验室操作。但是由于RNA核酸不稳定的特点，高温灭活过程可能造成病原核酸降解，进而影响检测的准确性，造成假阴性的结果。自新冠肺炎疫情发生以来，核酸检测假阴性率过高一直是各方关注的焦点，以荧光定量RT-PCR作为检测手段的新冠病毒检测的阳性率目前仅有30%—50%，极大的增加了疫情控制的难度。因此，如何在保护临检人员安全的基础上有效保存、运输病原样本，并保证后续核酸检测结果的准确性，临床上对病原核酸样本采集和保存提出了更高的要求。

此外，由于病毒保存主要是解决样本保存和运输中的问题，后续检测是以病毒核酸分离提取为前提，样本在实施PCR等核酸检测之前需要分离提纯等步骤以除去样本中的蛋白变性剂、去垢剂等裂解试剂，这增加了实验操作步骤和样本受到污染的几率。随着核酸扩增技术的发展，直接扩增技术已经开始普遍应用于核酸检测分析中，而传统的病毒保存试剂中常含有（RT-）PCR抑制剂，如果直接与PCR试剂混合，会抑制核酸扩增，因此，非免提取型病毒保存液在对接后续的直接扩增技术方面受到限制。

中国专利CN111321123A “一种免核酸提取的病毒保存液”中提供了一种包含A和B两种组分的免核酸提取DNA/RNA病毒保存液，其原理是通过A组分（pH为1.0-5.0）提供的酸性缓冲液条件下，高活性的酸性蛋白酶释放DNA/RNA核酸，使病毒毒力下降或变成无毒，再通过包含中性或偏碱性缓冲液的B组分（pH为7.0-9.0）中和A组分中的酸性缓冲液，从而使酸性蛋白酶失活，避免酸性蛋白酶对PCR等核酸扩增的不利影响。但是，DNA在酸性环境下很容易降解，特别是在pH小于5的强酸性条件下，非常不利于病毒DNA核酸的保存，即使对于RNA的保存，强酸性条件也是不利的，因此，该病毒保存液虽然能做到免核酸提取，但是其对病毒的保存效果有待进一步提高。

中国专利CN109402240A9 “核酸释放剂、核酸PCR扩增方法和PCR扩增试剂盒”公布了一种可简化RNA样品PCR扩增方法的核酸释放剂，可以使含有RNA的样品在室温下直接释放出RNA，并且能够与PCR反应液直接混合进行PCR扩增，但是在将所述核酸释放剂与病毒样品混合之前，还包括样品的预处理步骤：将样品与聚乙二醇混合，然后离心取沉淀，这增加了样本处理的步骤。此外，所述核酸释放剂中含有蛋白酶K和强碱氢氧化钠等成分，也可能会对后续PCR产生不利影响。

中国专利CN110982876A “病毒核酸检测的预处理方法、预处理液、试剂盒及其用途”中提供了一种免提取的病毒样本预处理液，将存放在预处理液中的样本与核酸释放剂（CN109402240A9提供）和qPCR扩增试剂混合（带有样本的预处理液：核酸释放剂：PCR扩增试剂=10:10:30），能够在不需要对样本进行核酸提取或纯化的情况下，直接搭配强碱性质下的样本核酸释放剂和高兼容性的扩增体系进行直接的样本核酸扩增检测，但是该专利所述预处理液包括大约10 mM的EDTA-2Na，由于在PCR反应体系中0.5mM EDTA残留即可显著降低PCR产量，1mM EDTA即可完全抑制PCR反应，因此该专利提供的病毒样本预处理液可能对后续PCR扩增产生不利影响，进而影响病毒检测灵敏度，可能会造成假阴性的结果。此外，所述预处理液只是作为病毒样本预处理，需要与专利CN109402240A9提供的核酸释放剂组合使用才能释放病毒核酸作为PCR检测的模板。

鉴于以上技术存在的问题，本发明提供一种免核酸提取的病毒保存液，该保存液采用非离子型表面活性剂温和裂解细胞释放病毒核酸，提供的核酸稳定缓冲液在常温运输和保存以及高温灭活病毒处理过程中有效保证病毒核酸免遭降解，降低检测假阴性结果。此外，样本保存液中不含PCR抑制剂，可免核酸提取操作，直接作为样本模板进行后续（RT-）PCR核酸检测实验。本发明方法将对病毒的核酸检测从原本相对繁琐的方法（包括步骤：1）采集样本；2）加入病毒专用保存液，冷冻运输；3）病毒经56℃以上孵育30分钟灭活；4）核酸提取；5）（RT-）PCR检测）改进到一种相对简单的方法（包括步骤：1）采集样本；2）加入病毒保存液，常温运输和保存；3）病毒经56℃以上孵育30分钟灭活；4）（RT-）PCR检测），大大简化病毒检测流程和时间，有效提高疫情防控的反应速度和有效性。

发明内容

从理论上，病毒保存液一般包含细胞裂解剂、核酸酶抑制剂、核酸稳定剂、抗菌剂和抗氧化抑制剂，这些试剂组分协同作用可以有效灭活样本中的病原微生物并高效释放和保存核酸。但是这些试剂组分如胍盐、EDTA、SDS和尿酸的存在或者残留会对后续的PCR扩增过程产生明显的抑制，0.005%的SDS或0.5mM EDTA残留即可显著降低PCR产量，0.01%的SDS、1mM EDTA或0.1-1ng/μL的酸类物质即可完全抑制PCR反应。因此，为了达到既能有效裂解细胞释放和保存病毒核酸，又能在免提取的条件下使保存液中的有效成分不会对后续PCR核酸检测产生不利影响，本发明提供一种免提取的病毒保存液，并将之应用于病毒核酸PCR检测中。本发明提供的病毒保存液采用非离子型表面活性剂温和裂解细胞释放核酸，提供的核酸稳定缓冲液能在常温运输保存以及56℃高温灭活处理过程中有效保证病毒核酸稳定，免遭降解，降低检测假阴性结果。此外，保存液中不含EDTA、SDS等强PCR抑制剂，并加入BSA、DMSO等PCR反应增强剂，保存的病毒样本溶液免提取操作，可直接作为样本模板进行后续的病毒核酸（RT-）PCR检测，简化病毒检测流程和时间，有效提高疫情防控的反应时效。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种免核酸提取的病毒保存液，包括以下组分：细胞裂解剂、核酸稳定剂、还原剂和/或PCR反应增强剂，保存液的pH值在7到9之间。

所述细胞裂解剂可以为吐温20、吐温80、NP-40和Triton-100等非离子表面活性剂中的一种或几种，能够温和破坏细胞或病毒释放核酸。本发明优选0.05-1％（质量/体积）的Triton-100。 Triton -100是一种比较温和的非离子型表面活性剂，可以溶解脂质，破坏蛋白质-脂质以及脂质-脂质之间的连接，使蛋白质溶解和分离，但却保留了蛋白质的天然构象、功能以及它们的相互作用。

所述还原剂可以为二硫苏糖醇（DTT）或Tris(2-carboxyethyl)phosphine HCl（TCEP盐酸盐）的一种或两种，可使病毒外壳蛋白破裂，并降低DNA核酸的二聚化。本发明优选1-10 mM 的DTT和/或5-30 mM TCEP·HCl。其中DTT是一种小分子有机还原剂，作为常用的还原剂，其还原力受pH值的影响，只在pH值大于7的情况下能够发挥还原作用，常作为蛋白质裂解试剂；DTT还有抗氧化作用，它能保护酶分子上的还原性基团，稳定酶的活性；此外，DTT还有一定RNA酶抑制剂活性，抑制RNA酶对RNA病毒核酸的损伤。TCEP是一种非常有效的硫醇类还原剂，与DTT相比，稳定性好，在空气中不怕氧化，并且在很宽的PH值范围内（pH有效工作范围为1.5-9.0）都可以选择性定量地还原哪怕水溶性很差的烷基类二硫化合物。

所述核酸稳定剂可以为有机缓冲溶液和/或无机缓冲溶液，其中有机溶液可以为Tris、乙醇胺、三乙醇胺、甘氨酸、甘氨酸、甘露糖或柠檬酸三钠等，无机溶液可以为碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐或硼酸盐。本发明优选终浓度为10 mM–200 mM的 Tris- HCl，可以提供足够的缓冲环境，使核酸保持稳定，避免脱氨基的发生。

所述PCR反应增强剂可以为BSA、DMSO、甘油中的一种或多种，其中BSA是酶的稳定剂，能减轻不利环境因素如加热、表面张力及化学因素引起的酶的分解变性，并能防止酶非特异性吸附到管壁而损失；甘油和DMSO能促进核酸二级结构的打开，特别适用于GC含量高、二级结构复杂的模板扩增，可以增强PCR特异性，抑制引物二聚体的形成。本发明优选1 -10μg/μl 的BSA、体积分数0.1%-5% 的DMSO和体积分数1%-10%的甘油。

在一些实施例中，病毒保存液可包含以下成分（在溶液总量中）：10–200 mM Tris-HCl、0.05-1％（w/v）的Triton-100、1-10 mM 的DTT和/或5-30 mM TCEP·HCl，保存液pH值7-9。其中Triton-100作为温和的非离子型去污剂替代SDS和胍盐等强蛋白变性剂，用于裂解细胞释放病毒核酸；Tris-HCl缓冲液维持了pH缓冲环境，维持释放出来的核酸保持稳定；DTT和TCEP·HCl作为还原剂和蛋白质裂解试剂，可使病毒外壳蛋白破裂，并作为RNA酶抑制剂保护病毒RNA核酸免遭降解。试剂中没有SDS、胍盐、EDTA、尿酸等PCR抑制剂，样本保存溶液可以直接作为模板进行PCR核酸检测，无需核酸提取操作，可以兼容大部分PCR扩增试剂。

在一些实施例中，病毒保存液还可进一步包括PCR反应增强剂：1–10μg/μl 的BSA、0.1%–5%（v/v）的DMSO和1%–10%（v/v）的甘油。

在一些实施例中，所述病毒保存液还可进一步包括核酸保护肽，所述核酸保护肽的序列优选为KWRSALSRWSLWRVPSWSR；所述多肽的浓度为5-30μM，优选为10μM；所述核酸保护肽能够进一步延长核酸保护的时间，为后续样本进一步复核、研究提供有力支持。

本申请发明人在研究中发现，虽然本发明的保存液能够提供优于之前已有保存液的核酸保存效果，但不管是本申请保存液还是已有保存液，都难以长时间有效保护核酸样本。为了能够更长时间的保护核酸样本，为后续进行复检确认或相关检测的科学研究，本申请发明人特别设计了一种核酸保护短肽，该短肽能够对核酸有一定吸附保护能力，有效防止其降解，有效延长核酸样本的保存时间，理论上，这种多肽可以用于大多数核酸保存液。

本发明的第二方面，提供一种病毒样本采集保存和PCR检测方法，采用本发明第一方面提供的病毒保存液保存采集的病毒鼻咽拭子样本，病毒高温灭活处理后，不需要核酸提取步骤，取适量样本保存溶液直接作为模板进行PCR检测。其中病毒样本可以为DNA病毒，也可以为RNA病毒，样品类型可以是含有上述病毒的拭子（例如咽拭子、鼻拭子、口腔拭子、肛拭子、创口拭子等），也可以为体液（例如血液、淋巴液、灌洗液、泪液、唾液、痰液、尿液）或其他形式的样品，后续病毒核酸检测可以为PCR扩增，也可以为RT-PCR扩增，或一代、二代测序等其它核酸分子检测技术。具体步骤为：1）采集病毒拭子；2）加入0.5-1mL病毒保存液，室温放置1-10分钟使病毒核酸释放；3）50-60℃处理10-30分钟进一步灭活病毒；4）取出10-25μL作为模板，加入（RT-）PCR体系（20-50μL）中进行病毒核酸检测。

综上所述，本发明提出了一种免提取的病毒灭活保存液，能够有效实现含有病毒样本的常温保存运输，并在50-60℃高温病毒灭活处理过程中阻止病毒核酸降解，并且不需提取步骤即可直接加入PCR扩增试剂体系中进行基因扩增检测。

具体实施方式

实施例1：一种病毒保存液配方

本发明免提取病毒样本保存液的配方组分为：Tris-HCl、Triton-100、DTT、TCEP·HCl、BSA、DMSO和甘油。其中Tris HCl的终浓度为10–200 mM，优选50-100 mM，最优选以约50mM的浓度存在；Triton-100终浓度为0.05-1％（质量/体积），优选0.2-0.5%，最优选0.5%；DTT的终浓度为1-10 mM，优选2-5 mM，最优选4mM；TCEP·HCl终浓度为5-30 mM，优选10-20mM，最优选10mM；BSA的终浓度为1–10μg/μl，优选2-5μg/μl，最优选4μg/μl；DMSO的终浓度为0.1%–5%（v/v），优选1-2%，最优选1%；甘油的终浓度为1%–10%（v/v），优选2-5%，最优选2%；病毒保存液pH值7-9，优选pH值为7-7.5。具体配方见表1，其中实施例配方为本申请实施例中实际试验使用配方。

表1. 病毒保存液配方

实施例2：病毒保存液在DNA病毒核酸保存中的应用

本实施例中，以猪圆环病毒（PCV，DNA病毒，对人不具有感染性）作为模型，检测本发明提供的病毒保存液对DNA病毒样本的保存效果，并对保存的样本进行PCR核酸检测。

实验组：采用上述实施例1中优选的实施例配方的病毒保存液保存PCV病毒；

对照组1：采用专利CN110982876A发明的病毒预处理液（包含Tris-HCl的浓度为100 mM、EDTA-2Na的浓度为10 mM、氯化钠的浓度为0.9%（w/v）、Rnasin的浓度为20U/mL，Proclin 950的浓度为0.04%（v/v））保存PCV病毒，PCR检测前将带有DNA病毒的预处理液：核酸释放剂：PCR扩增试剂以10:10:30比例混合，然后进行qPCR检测，其中核酸释放剂包含0.5mM Tris-HCl、500mM氯化钠、8mg/mL氯化钾、0.1％吐温20、3％曲拉通X-100、0.1％乙基苯基聚乙二醇、 20mg/mL甜菜碱、5mg/mL牛血清白蛋白、1.5mg/mL蛋白酶K、0.4mg/mL十二烷基硫酸锂和2mg/mL氢氧化钠。

对照组2：采用专利CN111321123A发明的A组分（包含50nM的乙酸-乙酸钠缓冲液，pH 3.5；吐温20，体积百分比浓度为1％；胰蛋白酶50mg/mL）保存PCV病毒，PCR检测前采用B组分（包含0.7M Tris-乙酸缓冲液，pH 8）和A组分以1:1的体积比进行混合，然后作为模板进行qPCR检测。

分别使用实验组的病毒保存液、对照组1的病毒预处理液、对照组2的A组分稀释猪PCV病毒原液成10^-3,10^-4,10^-5,10^-6,10^-7和10^-8稀释梯度，将稀释好的病毒保存样本分别放置于37℃恒温培养箱、4℃冰箱和-80℃冰箱，于第7天取出，进行56℃灭活处理30分钟，实验组直接取10-25μl作为模板（模板加入量不超过PCR总体系的50%）直接进行qPCR检测；对照组1带有DNA病毒的预处理液与核酸释放剂和PCR扩增试剂以10:10:30比例混合，然后进行qPCR检测；对照组2带有DNA病毒的A组分与B组分以1:1的体积比进行混合，然后作为模板进行qPCR检测。

使用康为世纪qPCR检测试剂（CW0957）对保存的PCV病毒样本核酸进行荧光定量PCR检测，以健康猪的鼻拭子样本提取核酸作为阴性对照，具体操作参考说明书。反应体系采用15μl PCR反应液（包括反应缓冲液、扩增引物、酶、无核酸酶水）+ 10 μl样本模板。在ABI7500（美国Thermofisher公司）型荧光定量PCR仪上进行PCV核酸检测，反应条件如下：94℃ 10 min→94 ℃ 15 s, 60℃30 s（40 个循环），SYBR通道。所有检测均进行 3 次重复，取平均循环阈值（cycling threshold，Ct）进行计算。

结果如表2所示，与对照组相比，实验组的病毒保存液对PCV病毒保存效果更好。实验组的免提取病毒保存液在不同保存温度条件下（-80℃、4℃和37℃）和56℃灭活处理过程中均能有效保存PCV病毒核酸（DNA核酸），保存的PCV病毒样本可直接用于后续PCR扩增检测，其灵敏度可以达到10^-8稀释梯度。对照组1的病毒预处理液在不同温度保存和56℃灭活处理过程中能有效保护病毒样本核酸，但是与实验组相比，Ct值平均偏大2-3，检测灵敏度10^-7稀释梯度，推测可能是病毒预处理液中残留的EDTA和核酸释放剂中的蛋白酶K等成分，部分影响了qPCR扩增效果；对照组2的A溶液由于其强酸性的缓冲条件，不能在样本保存和56℃灭活处理过程中有效保存病毒DNA核酸，保存的样本用于直接扩增效果不好，与实验组相比，qPCR扩增Ct值明显偏大，并且检测灵敏度只能达到10^-5稀释梯度。

表2. PCR检测病毒保存液对猪PCV病毒核酸（DNA病毒）的保存效果

实例3：病毒保存液在RNA病毒核酸保存中的应用

本实施例中，以禽IBV病毒（冠状病毒，RNA病毒，对人不具有感染性）作为模型，检测本发明提供的病毒保存液对RNA病毒样本核酸的保存效果，并对保存的样本进行RT-PCR核酸检测。

实验组：采用上述实施例1中优选的病毒保存液保存IBV病毒；

对照组1：采用专利CN110982876A发明的病毒预处理液（包含Tris-HCl的浓度为100 mM、EDTA-2Na的浓度为10 mM、氯化钠的浓度为0.9%（w/v）、Rnasin的浓度为20U/mL，Proclin 950的浓度为0.04%（v/v））保存IBV病毒，PCR检测前将带有RNA病毒的预处理液：核酸释放剂：RT-PCR扩增试剂以10:10:30比例混合，然后进行RT-qPCR检测，其中核酸释放剂包含0.5mM Tris-HCl、500mM氯化钠、8mg/mL氯化钾、0.1％吐温20、3％曲拉通X-100、0.1％乙基苯基聚乙二醇、 20mg/mL甜菜碱、5mg/mL牛血清白蛋白、1.5mg/mL蛋白酶K、0.4mg/mL十二烷基硫酸锂和2mg/mL氢氧化钠。

对照组2：采用专利CN111321123A发明的A组分（包含0.1M的乙酸-乙酸钠缓冲液，pH 4.5；2％吐温20，100mg/mL胃蛋白酶）保存IBV病毒，PCR检测前采用B组分（包含1.0MTris-HCl缓冲液，pH 8.9）和A组分以1:1的体积比进行混合，然后作为模板进行RT-qPCR检测。

分别使用实验组的病毒保存液、对照组1的病毒预处理液、对照组2的A组分稀释禽IBV病毒原液成10^-3,10^-4,10^-5,10^-6,10^-7和10^-8稀释梯度，将稀释好的病毒保存样本分别放置于37℃恒温培养箱、4℃冰箱和-80℃冰箱，于第7天取出，进行56℃灭活处理30分钟，实验组直接取10-25μl作为模板（模板加入量不超过RT-PCR总体系的50%）直接进行RT-qPCR检测；对照组1带有RNA病毒的预处理液与核酸释放剂和PCR扩增试剂以10:10:30比例混合，然后进行RT-qPCR检测；对照组2带有RNA病毒的A组分与B组分以1:1的体积比进行混合，然后作为模板进行RT-qPCR检测。

使用康为世纪qPCR检测试剂（CW2207）对提取得到的核酸样本进行一步法反转录荧光定量PCR（RT-PCR）检测，以健康的鸡的拭子样本提取核酸作为阴性对照，具体操作参考说明书。反应体系采用15μl PCR反应液（包括反应缓冲液、扩增引物、探针、酶、无核酸酶水）+ 10 μl样本模板。在ABI7500（美国Thermofisher公司）型荧光定量PCR仪上进行IBV核酸检测，反应条件如下：50 ℃ 15 min→94℃ 10 min→94 ℃ 15 s, 60℃30 s（40 个循环），FAM通道。所有检测均进行 3 次重复，取平均Ct值进行计算。

结果如表3所示，与对照组相比，实验组的病毒保存液对IBV病毒保存效果更好。实验组的免提取病毒保存液在不同保存温度条件下（-80℃、4℃和37℃）和56℃灭活处理过程中均能有效保存IBV病毒核酸（RNA核酸），保存的IBV病毒样本可直接用于后续RT-qPCR检测，其灵敏度最好；对照组1的病毒预处理液虽然也能保护病毒样本RNA核酸，但是与实验组相比，RT-qPCR扩增的Ct值明显偏大；对照组2的A组分溶液对病毒RNA核酸的保存效果不佳，保存的样本用于直接扩增效果不好，Ct值明显偏大，并且检测灵敏度也不好。

表3. RT-qPCR检测病毒保存液对禽IBV病毒核酸（RNA病毒）的保存效果

实例4：病毒保存液在RNA病毒核酸保存中的应用

实验组1：采用上述实施例1中优选的病毒保存液保存IBV病毒；

实验组2：在上述实施例1中优选的病毒保存液中添加10μM核酸保护多肽，所述多肽序列如 KWRSALSRWSLWRVPSWSR所示。

分别使用实验组的病毒保存液、对照组1的病毒预处理液、对照组2的A组分稀释禽IBV病毒原液成10^-4, 10^-6和10^-8稀释梯度，将稀释好的病毒保存样本分别放置于37℃恒温培养箱、4℃冰箱和-80℃冰箱，于第14和21天取出，进行56℃灭活处理30分钟，实验组直接取10-25μl作为模板（模板加入量不超过RT-PCR总体系的50%）直接进行RT-qPCR检测；对照组1带有RNA病毒的预处理液与核酸释放剂和PCR扩增试剂以10:10:30比例混合，然后进行RT-qPCR检测；对照组2带有RNA病毒的A组分与B组分以1:1的体积比进行混合，然后作为模板进行RT-qPCR检测。

结果如表4所示，与对照组相比，实验组1和2的病毒保存液对IBV病毒保存效果更好；尤其是添加核酸保护肽的实验组2,保存14天和21天后进行病毒核酸检测，相比于未添加核酸保护肽的实验组1，其Ct值普遍小1-3个Ct，即使在21天时，虽然Ct数值略有增大，但其检测准确度基本无变化，检测效果远优于对照组1和2，说明本发明提供的短肽能够为核酸提供良好的保护效果。

表4. RT-qPCR检测病毒保存液对禽IBV病毒核酸（RNA病毒）的保存效果

结论：综合以上结果我们得出，本发明提供的免提取病毒保存液（实验组）可用于下游直接PCR扩增核酸检测，检测灵敏度好。此外，与现有技术相比，本发明提供的免提取病毒保存液对病毒核酸的保存效果最好，在室温甚至37℃保存7天（甚至到21天）和50-60℃高温灭活处理后，均能有效保证病毒DNA和RNA核酸的有效检出，能更好地应用于大量DNA/RNA病毒样本的快速筛查检测中，为疫情的防控防治提供有力的物质支撑。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液由以下组分组成：10–200 mM Tris -HCl、0.05-1％（w/v）的Triton-100、1-10 mM 的DTT、5-30 mMTCEP·HCl、1–10μg/μl 的BSA、0.1%–5%（v/v）的DMSO、1%–10%（v/v）的甘油、5-30μM的核酸保护肽和水；其中所述保护肽序列为KWRSALSRWSLWRVPSWSR；所述病毒保存液的pH值为7-9。

2.根据权利要求1所述的病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液由以下组分组成：50mM Tris -HCl、0.5％（w/v）的Triton-100、4 mM 的DTT和10mM TCEP·HCl，4μg/μl 的BSA、1%（v/v）的DMSO、2%（v/v）的甘油、10μM的核酸保护肽和水。

3.一种病毒样本采集保存方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）采集病毒拭子；

（2）将病毒拭子加入权利要求1-2任一项所述的病毒保存液保存。