CN113736916A - 用于快速检测新型冠状病毒的荧光定量pcr试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明揭示了一种用于快速检测新型冠状病毒的荧光定量PCR试剂盒，包括具有样本保存液的采样管及含有两对用于SARS‑CoV‑2靶标核酸扩增检测的引物、两条检测探针、一对用于内参核酸序列扩增检测的引物和一条内参检测探针，所述样本保存液中包括：氯化钠、氯化钾、葡萄糖、碳酸氢钠、异硫氰酸胍或盐酸胍。本发明的有益效果体现在：可以直接将采集后的样本加入扩增检测体系中，直接进行检测，减免了采样到检测间的抽提过程，大大降低了操作人员感染的风险，且提高了样本检测效率。缩短了对样本处理时间的同时还减少了操作所需要的设备及试剂，降低了检测成本。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于快速检测新型冠状病毒的荧光定量PCR试剂盒及其应用。
背景技术
冠状病毒是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，直径约 80-120nm，目前只感染人、鼠、猪、猫、犬、禽类脊椎动物。新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)经确认为新的变种，可引起病毒性肺炎，轻者发热干咳，重者呼吸困难甚至休克。现在市场上广泛用于检测目前流行的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的方法是通过核酸抽提纯化然后进行定量PCR的方法。其检测周期长，样本处理复杂。需要有专业人员进行样本抽提或者使用昂贵的自动化设备进行样本抽提，无论从人力还是物力上都给检测带来了负担。
市面上现有的新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸荧光定量PCR检测试剂盒一般需要对采集到的样本进行核酸提取，然后对提取出的RNA进行扩增检测。需要使用专门的核酸抽提设备及核酸抽提试剂盒。有部分产品宣称免提取，也需要将采集到的样本加入样本裂解释放剂中，进行10-30分钟的孵化反应，使核酸从病毒样本中释放，然后再将含有样本的保存液加入PCR扩增试剂中反应。虽然较正常抽提的方法简便，但依然需要对样本进行和裂解液的孵化处理，同时需要一定的孵化反应时间
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于快速检测新型冠状病毒的荧光定量PCR试剂盒及其应用。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
用于快速检测新型冠状病毒的荧光定量PCR试剂盒，包括具有样本保存液的采样管及含有两对用于SARS-CoV-2靶标核酸扩增检测的引物、两条检测探针、一对用于内参核酸序列扩增检测的引物和一条内参检测探针，所述样本保存液中包括：氯化钠、氯化钾、葡萄糖、碳酸氢钠、异硫氰酸胍或盐酸胍。
优选地，所述样本保存液中还包括：ProClin 950防腐剂。
优选地，所述样本保存液中含有0.8～1％的氯化钠、0.045～0.1％的氯化钾、0.12～0.2％的葡萄糖、0.04～0.1％碳酸氢钠、0.01～0.3M的异硫氰酸胍或者盐酸胍。
优选地，其中，用于SARS-CoV-2靶标核酸扩增检测的引物的核苷酸序列分别如SEQID NO.1—SEQ ID NO.4所示；两条检测探针分别为SARS-CoV-2 ORF1ab检测探针和SARS-CoV-2 N gene检测探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；用于内参核酸序列扩增检测的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；所述内参检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
优选地，所述检测探针和内参检测探针均携带荧光标记物。
优选地，所述SARS-CoV-2 ORF1ab检测探针在5’端使用FAM荧光标记， 3’端使用BHQ1标记；SARS-CoV-2 N gene检测探针在5’端使用HEX荧光标记，3’端使用BHQ1标记；内参检测探针在5’端使用CY5荧光标记3’端使用BHQ3标记。
优选地，以上任意一种试剂盒在免提取快速检测新型冠状病毒的荧光定量 PCR检测中的应用。
本发明的有益效果体现在：本发明可以直接将采集后的样本加入扩增检测体系中，直接进行检测，无需额外的设备和提取试剂，减免了采样到检测间的抽提过程，进一步减少人工操作含有SARS-CoV-2的咽拭子、鼻拭子或者唾液样本的时间和操作，大大降低了操作人员感染的风险，且提高了样本检测效率。缩短了对样本处理时间的同时还减少了操作所需要的设备及试剂，降低了检测成本。
具体实施方式
本发明的目的、优点和特点，将通过下面优选实施例的非限制性说明进行解释。这些实施例仅是应用本发明技术方案的典型范例，凡采取等同替换或者等效变换而形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。
本发明揭示了一种用于快速检测新型冠状病毒的荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒，所述试剂盒包括具有样本保存液的采样管及检测试剂。所述样本保存液中含有0.8-1％的氯化钠、0.045-0.1％的氯化钾、0.12-0.2％的葡萄糖、0.04-0.1％碳酸氢钠、0.01-0.3M的异硫氰酸胍或者盐酸胍、proclin95防腐剂，将采集样品后的鼻拭子或者咽拭子直接投入到采样管中，所述样本保存液可以有效裂解样品中的病毒或细胞，并保护其中的RNA不会快速降解。
为防止样品粘在管盖上，可以将采集后的样本充分涡旋混匀，在 2000-3000rpm瞬时离心后再用于扩增检测。
当采用唾液样本时，可以将采集后的唾液拭子直接投入到Bi-CoVTM set的采样管中。将采集后的样本充分涡旋混匀，2000-3000rpm瞬时离心，防止样品粘在管盖上。此时样品即可直接用于扩增检测。
本发明的试剂盒包括两对用于SARS-CoV-2靶标核酸扩增检测的引物、两条检测探针、一对用于内参核酸序列扩增检测的引物和一条内参检测探针，具体如表1所示：
表1：本发明试剂盒中的探针及引物对应序列表
PCR扩增
7μl新型冠状病毒核酸检测液(1-50mM Tris-HCl、0.4-4mM硫酸铵、 0.1-10mM氯化钾、0.5-5mM氯化镁、1-5mM dNTP、1-20％甘油、1-4％BSA、 0.1-5μM引物、0.1-5μM探针)和1μl酶混合液(2-100U逆转录酶，0.5-5U DNA 聚合酶，0.1-2U UNG酶，0.5-10U RNA酶抑制剂)充分混合，涡旋摇匀， 2000-3000rpm瞬时离心0.5-1分钟。再将8μl上述混合溶液分装到每个PCR管中，然后在每个PCR管中加入17μl使用一次性所述具有样本保存液的采样管采集的鼻拭子或咽拭子样本或5-10μl使用Bi-CoVTM set采集的唾液样本，加水补齐至25μl体积。用盖子盖住试管，混合并离心。即可进行PCR扩增反应。
PCR反应管放置在实时PCR仪器中。优选地，PCR热循环程序如下：
*荧光数据收集
其中新型冠状病毒核酸检测液中含有的引物及探针序列如下：
其中，所述SARS-CoV-2ORF1ab检测探针在5’端使用FAM荧光标记，3’端使用BHQ1标记；SARS-CoV-2N基因检测探针在5’端使用HEX荧光标记， 3’端使用BHQ1标记；内参检测探针在5’端使用CY5荧光标记3’端使用 BHQ3标记。荧光通道检测选择：选择FAM、HEX/VIC通道和CY5通道。从 3-24次循环中获取荧光信号进行基线调整。
核酸提取与免抽提检测下限确定
使用所述具有样本保存液的采样管稀释BEI SARS-Related Coronavirus 2,Isolate USA-WA1/2020，Gamma-Irradiated(NR-52287，Lot 70039067)标准品至 1x104copies/mL，5000copies/mL，2500copies/mL，1250copies/mL，625copies/mL，312.5copies/mL，156.25copies/mL进行提取(140μL样本进行提取，洗脱体积为50μL)和使用所述具有样本保存液的采样管稀释BEI SARS-Related Coronavirus 2,Isolate USA-WA1/2020，Gamma-Irradiated(NR-52287，Lot 70039067)标准品至1x104 copies/mL，5000copies/mL，2500copies/mL，1250 copies/mL，625copies/mL，312.5copies/mL，156.25copies/mL进行直接加样，在ABI7500实时荧光定量PCR系统上进行扩增检测。获得的结果如下：
使用312.50copies/mL的标准品进行最低检测限(LOD)的确认，同样在 ABI7500实时荧光定量PCR系统上进行扩增检测，具体比较数据如下：
根据数据显示，无论样本进行提取或是免提取，试剂盒对312.50copies/mL 的样本进行检测，检测的阳性率均为95％，即提取或免提取的试剂盒最低检测限均为312.50copies/mL，说明本试剂盒在免抽提的操作下，对新型冠状病毒 SARS-CoV-2的检测性能和抽提处理相当。
免抽提检测过程中干扰物研究
使用采集样本过程中可能存在的内源性或外源性干扰物，加入到所述具有样本保存液的采样管稀释的BEI SARS-Related Coronavirus 2，Isolate USA-WA1/2020，Gamma射线灭活处理(NR-52287，Lot 70039067)标准品中，直接进行加样扩增检测，测试内源性或外源性干扰物是否会对本发明所述的新型冠状病毒检测试剂造成干扰。所得的数据见下表：
从检测结果来看，20ng/μL的人基因组DNA、或含终浓度1％的柠檬酸钠抗凝管收集的血液、或含终浓度1％粘蛋白(Mucin Bovine Submaxillary)、或含金黄色葡萄球菌、或含终浓度为9.1×106Cells/ml流感嗜血杆菌、或含终浓度为1.6×105TCID50/ml的人类偏肺病毒、或含终浓度为7.5×105CFU/ml的肺炎支原体、或含终浓度为0.6mg/ml妥布霉素、或含终浓度为2％莫匹罗星、或含终浓度为1％的含盐洗鼻剂、或含终浓度为1％的羟甲唑啉、或含终浓度为 1/2inches2/ml消毒湿巾、或含终浓度为1％的RNaseZapTM、或含终浓度为1％的重组核糖核酸酶抑制剂(RNaseOutTM)、或含终浓度为5％的漂白剂、或含终浓度为5％的乙醇，这些干扰物对本发明所述的一种用于实现免提取快速针对新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸的荧光定量PCR的检测试剂盒均没有明显抑制。
唾液样本免抽提检测下限确定
使用唾液和Bi-CoV Set按照1：1进行混合，然后将混合液作为稀释液，稀释FNV-2019-ncov-abEN(复百澳(苏州)生物科技有限公司，FNV2001，批号：20200302)假病毒和细胞混合液至6000copies/mL，3000copies/mL，1500 copies/mL，600copies/mL，300copies/mL，150copies/mL，直接加样5μL，在 ABI7500实时荧光定量PCR系统上进行扩增检测。获得的结果如下：
| 样本浓度(copies/ml) | 检出阳性样本数 | 检出阴性样本数 | 阳性率 |
| 6000 | 16 | 0 | 100.00％ |
| 3000 | 16 | 0 | 100.00％ |
| 1500 | 16 | 0 | 100.00％ |
| 600 | 5 | 11 | 31.25％ |
| 300 | 3 | 13 | 18.75％ |
| 150 | 1 | 15 | 6.25％ |
从结果来看，直接使用Bi-CoV Set进行唾液样本收集，然后直接将唾液样本进行上样扩增检测，依然在免去核酸提取的步骤，直接检测出下限至1500 copies/mL的可以得到较好的结果。从数据来看，可以做到1500copies/mL的检测灵敏度，满足了目前市面上样本初筛的灵敏度需求。且唾液采样便利，有利于患者进行无痛、便捷采样。
使用临床样本将本发明免核酸提取试剂盒和含核酸提取对比试剂盒进行检测结果比较
使用443例咽拭子或鼻拭子临床样本，对本发明所述的一种用于快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的核酸免提取荧光定量PCR试剂盒和含核酸提取的新冠荧光定量PCR检测试剂盒进行性能对比。
阳性符合率＝152/159x100％＝95.6％，(95％CI：88.0％-99.1％)
阴性符合率＝67/70x100％＝99.2％，(95％CI：88.7％-99.9％)
从临床样本数据来看，本发明所述免提取检测试剂盒对比含核酸提取步骤检测试剂盒，阳性符合率，阴性符合率均大于95％，一致性好。通过本次对比实验，证明本发明所述试剂盒可以直接用于检测鼻拭子或者咽拭子的样本，大大降低了检测的时间，提高了检测效率。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神和基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州锐讯生物科技有限公司
<120> 用于快速检测新型冠状病毒的荧光定量PCR试剂盒及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> SARS-CoV-2 ORF1ab上游引物(SARS-CoV-2 ORF1ab)
<400> 1
tacttgtgta tgctgctgac c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> SARS-CoV-2 ORF1ab下游引物(SARS-CoV-2 ORF1ab)
<400> 2
aagcacgtag tgcgtttatc t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> SARS-CoV-2 N基因上游引物(SARS-CoV-2)
<400> 3
gaggacaagg cgttccaatt a 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> SARS-CoV-2 N基因下游引物(SARS-CoV-2)
<400> 4
gtctggtagc tcttcggtag ta 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> SARS-CoV-2 ORF1ab探针(SARS-CoV-2 ORF1ab)
<400> 5
tgctatgcac gctgcttctg gtaa 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> SARS-CoV-2 N基因探针(SARS-CoV-2)
<400> 6
acaccaatag cagtccagat gacca 25
<210> 7
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 内参基因上游引物()
<400> 7
ttgtggccag tggagataac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 内参基因下游引物()
<400> 8
gtttgggctt cacaccattc 20
<210> 9
<211> 27
<212> DNA/RNA
<213> 内参基因探针()
<400> 9
agctccgggt cttaggctat aatcaca 27
Claims (7)
1.用于快速检测新型冠状病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包括具有样本保存液的采样管及含有两对用于SARS-CoV-2靶标核酸扩增检测的引物、两条检测探针、一对用于内参核酸序列扩增检测的引物和一条内参检测探针，所述样本保存液中包括：氯化钠、氯化钾、葡萄糖、碳酸氢钠、异硫氰酸胍或盐酸胍。
2.如权利要求1所述的用于快速检测新型冠状病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述样本保存液中还包括：ProClin950防腐剂。
3.如权利要求2所述的用于快速检测新型冠状病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述样本保存液中含有0.8~1%的氯化钠、0.045~0.1%的氯化钾、0.12~0.2%的葡萄糖、0.04~0.1% 碳酸氢钠、0.01~0.3M的异硫氰酸胍或者盐酸胍。
4.如权利要求3所述的用于快速检测新型冠状病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：其中，用于SARS-CoV-2靶标核酸扩增检测的引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.4所示；两条检测探针分别为SARS-CoV-2 ORF1ab检测探针和SARS-CoV-2 Ngene检测探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；用于内参核酸序列扩增检测的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；所述内参检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
5.如权利要求4所述的用于快速检测新型冠状病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述检测探针和内参检测探针均携带荧光标记物。
6.如权利要求5所述的用于快速检测新型冠状病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述SARS-CoV-2 ORF1ab检测探针在5’端使用FAM荧光标记，3’端使用BHQ1标记；SARS-CoV-2 N gene检测探针在5’端使用HEX荧光标记，3’端使用BHQ1标记；内参检测探针在5’端使用CY5荧光标记3’端使用BHQ3标记。
7.如权利要求1-6中任意一种试剂盒在免提取快速检测新型冠状病毒的荧光定量PCR检测中的应用。
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Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105145545A (zh) * | 2015-07-27 | 2015-12-16 | 北京泛生子生物科技有限公司 | 用于常温条件下长期保存和运输组织样本的核酸保护液 |
| US20190144919A1 (en) * | 2016-06-07 | 2019-05-16 | Drawbridge Health, Inc. | Methods and devices for storing or stabilizing molecules |
| CN110982876A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-04-10 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 病毒核酸检测的预处理方法、预处理液、试剂盒及其用途 |
| CN111118225A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-05-08 | 苏州锐讯生物科技有限公司 | 新型冠状病毒核酸检测微滴式数字pcr试剂盒及其应用 |
| CN111500775A (zh) * | 2020-04-29 | 2020-08-07 | 上海市计量测试技术研究院 | 一种SARS-CoV-2病毒的RNA标准物质的制备方法 |
| CN111676314A (zh) * | 2020-02-10 | 2020-09-18 | 清华大学 | 基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒2019-nCoV核酸定量检测试剂盒 |
| CN111690642A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-09-22 | 福建百斯特基因检测有限公司 | 一种病毒采样液组合物及采样方法 |
| CN111778314A (zh) * | 2020-07-23 | 2020-10-16 | 创芯国际生物科技(广州)有限公司 | 一种呼吸道病毒核酸采样试剂盒及其应用 |
| CN111925941A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-11-13 | 北京健为医学检验实验室有限公司 | 一种病毒保存液及其应用 |
| CN112322697A (zh) * | 2020-11-09 | 2021-02-05 | 苏州乾康基因有限公司 | 一种dna样本保存液及其制备方法与应用 |
| CN112626169A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-09 | 苏州白垩纪生物科技有限公司 | 用于保存生物样本中核酸的样本保存液及其使用方法 |
| CN112662731A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-04-16 | 杭州金域医学检验所有限公司 | 一种冠状病毒样本保存液及其应用 |
-
2021
- 2021-08-25 CN CN202110979884.XA patent/CN113736916A/zh active Pending
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105145545A (zh) * | 2015-07-27 | 2015-12-16 | 北京泛生子生物科技有限公司 | 用于常温条件下长期保存和运输组织样本的核酸保护液 |
| US20190144919A1 (en) * | 2016-06-07 | 2019-05-16 | Drawbridge Health, Inc. | Methods and devices for storing or stabilizing molecules |
| CN111676314A (zh) * | 2020-02-10 | 2020-09-18 | 清华大学 | 基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒2019-nCoV核酸定量检测试剂盒 |
| CN111118225A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-05-08 | 苏州锐讯生物科技有限公司 | 新型冠状病毒核酸检测微滴式数字pcr试剂盒及其应用 |
| CN110982876A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-04-10 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 病毒核酸检测的预处理方法、预处理液、试剂盒及其用途 |
| CN111500775A (zh) * | 2020-04-29 | 2020-08-07 | 上海市计量测试技术研究院 | 一种SARS-CoV-2病毒的RNA标准物质的制备方法 |
| CN111690642A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-09-22 | 福建百斯特基因检测有限公司 | 一种病毒采样液组合物及采样方法 |
| CN111778314A (zh) * | 2020-07-23 | 2020-10-16 | 创芯国际生物科技(广州)有限公司 | 一种呼吸道病毒核酸采样试剂盒及其应用 |
| CN111925941A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-11-13 | 北京健为医学检验实验室有限公司 | 一种病毒保存液及其应用 |
| CN112322697A (zh) * | 2020-11-09 | 2021-02-05 | 苏州乾康基因有限公司 | 一种dna样本保存液及其制备方法与应用 |
| CN112662731A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-04-16 | 杭州金域医学检验所有限公司 | 一种冠状病毒样本保存液及其应用 |
| CN112626169A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-09 | 苏州白垩纪生物科技有限公司 | 用于保存生物样本中核酸的样本保存液及其使用方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LELDE KALNINA ET AL.: "A simple, safe and sensitive method for SARS‐CoV‐2 inactivation and RNA extraction for RT‐qPCR", 《APMIS》 * |
| YINHUA ZHANG ET AL.: "Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride", 《BIOTECHNIQUES》 * |
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