CN111676314A

CN111676314A - 基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒2019-nCoV核酸定量检测试剂盒

Info

Publication number: CN111676314A
Application number: CN202010085389.XA
Authority: CN
Inventors: 祝令香; 王楠; 王芳; 郭永; 刘烨; 杨文军; 高娜; 王栋; 卢临萍; 朱宏艳; 单梦冰; 游晓朝
Original assignee: Xinyi Manufacturing Technology Beijing Co ltd; Tsinghua University
Current assignee: Xinyi Manufacturing Technology Beijing Co ltd; Tsinghua University
Priority date: 2020-02-10
Filing date: 2020-02-10
Publication date: 2020-09-18

Abstract

本发明提供一种基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒2019‑nCoV核酸定量检测试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增新型冠状病毒2019‑nCoV RNA的orf1ab基因15300‑15400nt的上游引物和下游引物，和用于扩增新型冠状病毒2019‑nCoV RNA的N基因27800‑27960nt的上游引物和下游引物；以及检测上述二个基因具有两种不同荧光标记的三条探针，其中二条不同荧光标记的探针检测同一个基因，另一条标记荧光的探针检测另一个基因。本发明筛选到上述两组高效特异的引物探针组合，其中orf1基因是用于确认病毒阳性的基因，可作为特异性的确认基因；N基因是用于筛查病毒阳性的基因，可用于初步筛选基因。

Description

基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒2019-nCoV核酸定量检测试剂盒

技术领域

本发明涉及数字PCR技术领域，具体涉及基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒2019-nCoV核酸定量检测试剂盒。

背景技术

目前一线临床检测中疑似病例越来越多，检测方法的准确性十分重要。因此高灵敏度、高准确性的对病毒进行检测是病毒防控的重要一步。因此，新型冠状病毒2019-nCoV核酸定量检测，尤其是高灵敏度定量检测具有重要的应用价值。

基于微液滴的数字PCR技术(Digital PCR,dPCR)是近年来发展出的一个新型的高灵敏度检测和定量核酸的技术。数字PCR技术具有灵敏度高、准确性强、反应全封闭和全集成等技术优点，将在核酸检测和分子诊断领域发挥巨大的应用价值。本发明基于微液滴数字PCR技术，实现对新型冠状病毒2019-nCoV核酸的准确定量，针对重大疫情检测准确性的需求，具有重要应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒 2019-nCoV核酸定量检测系统，它能够实现对新型冠状病毒2019-nCoV核酸的精准绝对定量。

在一种实施方式中，基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒2019- nCoV核酸定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：用于扩增新型冠状病毒2019- nCoV RNA的orf1ab基因15300-15400nt的上游引物和下游引物，和用于扩增新型冠状病毒2019-nCoV RNA的N基因27800-27960nt的上游引物和下游引物；以及，检测上述二个基因具有两种不同荧光标记的三条探针，其中二条不同荧光标记的探针检测同一个基因，另一条标记荧光的探针检测另一个基因。

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括：非感染的线性化双链质粒的质控标准品和检测所述质控标准品的探针，所述质控标准品的探针与检测所述新型冠状病毒2019-nCoV的特异探针组合无交叉反应。

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括：用于扩增和检测人管家基因的引物和探针，其作为内对照质控样本质量、提取、逆转录和PCR检测过程。

在一种实施方式中，所述人管家基因是人ABL1基因，用于扩增所述 ABL1基因的上游引物是SEQ ID NO： 5:TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTA；和下游引物是SEQ ID NO：6:GCTTCACACCATTCCCCATTGT；和探针是SEQ ID NO：10: AAGCTCCGGGTCTTAG。

在一种实施方式中，所述试剂盒包括检测orf1ab基因上游引物SEQ ID NO：1:CCTTATGGGTTGGGATTATC；和下游引物SEQ ID NO： 2:AGCAAGAACAAGTGAGGC；和探针SEQ IDNO：7: AATGTGATAGAGCCATGC。

在一种实施方式中，所述试剂盒包括检测N基因上游引物SEQ ID NO： 3:CTTGTTTTCTTAGGAATCATCAC；和下游引物SEQ ID NO：4: ACATATGGTTGATGTTGAGTACA；和探针SEQ ID NO： 8:CTGTAGCTGCATTTCACCA和SEQ ID NO：9: CTGTAGCTGCATTTCACCA。

在一种实施方式中，检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的orf1ab基因特异探针为SEQ ID NO.7：5'-FAM-AATGTGATAGAGCCATGC-3'-MGB，其中羧基端用FAM标记，羟基端用MGB标记；N基因特异探针为SEQ ID NO.8： 5'-FAM-CTGTAGCTGCATTTCACCA-3'-MGB及SEQ IDNO.9：5'-VIC- CTGTAGCTGCATTTCACCA-3'-MGB；其中羧基端为FAM标记和VIC标记2 种，羟基端为MGB标记，以将数字PCR扩增信号在二维散点图上位置与orf1ab 基因的散点位置分开。所述特异探针的终浓度为50-2000uMnM。

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括：PCR反应缓冲液，其包含脱氧核糖核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dUTP，其中dATP、dCTP、dGTP的终浓度均为100-400nmol/L，dUTP终浓度为300-1000nmol/L；以及0.1-1.5U UNG，1-10U/μl DNA聚合酶；以及逆转录反应缓冲液，其包括逆转录酶和 RNase抑制剂。在本发明的试剂盒中包含U尿嘧啶DNA糖基化酶UNG，UNG 酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP 可以起到预防PCR产物污染的作用。本发明的试剂盒中包含逆转录酶和 RNase抑制剂，逆转录酶将新型冠状病毒2019-nCoV RNA转化为cDNA，而 RNase抑制剂用于去除RNase污染，提高检测灵敏度。

在一种实施方式中，所述PCR反应缓冲液还包含25-100mmol/L Tris.HCl, 5-25mmol/L氯化钾，1-10mmol/L硫酸铵，和0.5-5mmol/L氯化镁。

在一种实施方式中，所述PCR反应缓冲液还包含60-80mmol/L Tris.HCl, 8-15mmol/L氯化钾，3-6mmol/L硫酸铵，和1.5-3mmol/L氯化镁。

本发明中探针的5’端标记的荧光染料可以是6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、FAM、HEX和Cy5(cyanine-5)等等；探针的 3’端标记的染料可以是BHQ(black hole quencher)1、2、3，MGB(Minor Groove Binding Molecule)等等。

另外，本发明中内对照基因可以选择其他人管家基因，例如GAPDH基因、 RPP30基因等。

本发明分析了多条新型冠状病毒2019-nCoV核酸序列，选择高度保守区域设计引物和探针，最终筛选到上述两组高效特异的引物探针组合，其中orf1 基因是用于确认病毒阳性的基因，N基因是用于筛查病毒阳性的基因，由于 N基因序列相对变异性较高，所以可能与其他冠状病毒例如SARS等具有一定同源性，从而可用于初步筛选基因，而ORF1ab基因在2019-nCoV已测序的全基因组序列中非常保守，因此，可作为特异性的确认基因。

在本发明中两种基因用总共两种标记的三条探针检测，其中一个基因用两种不同荧光标记的探针进行检测，另外一个基因用一种荧光标记的探针进行检测，以将两种基因的数字PCR扩增信号在二维散点图上位置区分开来。通过二维散点图上两种基因检测的不同情况，确认两个基因不同的扩增情况，如果两个基因双扩增可以确认样本阳性，如果仅有单基因扩增则为疑似阳性。因此，该方法具有检测步骤简便，可对新型冠状病毒进行准确定量检测，而且通过双基因扩增进一步确认样本阳性的优势，具有一定应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明实施例1的检测样本的结果图，其中高FAM信号液滴团是orf1ab和N基因双扩增液滴，低FAM信号液滴团是orf1ab和N基因单扩增液滴。

图2是本发明实施例2测定空白检测限(LOB)的结果图；只有内参基因有扩增信号。

图3是本发明实施例3测定线性范围的线性曲线。

具体实施方式

为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。

实施例1微液滴数字PCR定量检测新型冠状病毒2019-nCoV DNA

核酸提取：使用临床样本进行实验，使用病毒核酸提取试剂盒(Qiagen) 进行核酸提取，操作步骤按照试剂盒说明书进行。提取的核酸于-20℃保存，长期保存于-80℃。

PCR反应体系配制：用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的微液滴数字 PCR反应条件如下：PCR扩增反应混合物包括：RT预混液A、RT预混液B (新羿制造科技(北京)有限公司)、200-1000nM引物和100-800nM检测探针(序列如表1所示)、模板RNA(通过提取试剂进行提取)2ul、补水到 30ul，将试剂混匀。

表1.用于检测新型冠状病毒2019-_nCoV的引物和探针序列

用样本制备仪(新羿制造科技(北京)有限公司)根据使用说明书进行微液滴制备。然后将含有微液滴的8联排管放到PCR仪上进行扩增，扩增条件设定如下表2：

表2.数字PCR扩增条件

PCR完毕后，用芯片分析仪(新羿制造科技(北京)有限公司)参照仪器使用说明书进行液滴检测和数据分析。检测结果如图1所示，其中高FAM 信号是orf1ab基因和N基因在同一个液滴中同时双扩增结果，而低FAM信号是orf1ab基因单扩增结果，双阳处是N基因单扩增结果，orf1ab基因和N 基因双扩增可以确认样本阳性，如果仅有单基因扩增则为疑似阳性。因此，该方法具有检测步骤简便，可对新型冠状病毒进行准确定量检测，而且通过双基因扩增进一步确认样本阳性的优势，具有一定应用价值。

实施例2：空白检测限LOB和最低检测限LOD测定

参见实施例进行一步法RT数字PCR反应，用阴性样本RNA对检测体系测定其LOB，共使用8份阴性样本进行测定，结果如下表3和图2所示，计算的LOB为7拷贝。LOD为13拷贝。

表3 8份阴性样本进行测定结果

计算公式如下(参考文献1)：

LOB＝μ+1.645μ^1/2+0.8，μ为检测到的阳性液滴数的平均值

LOD＝[1.645+(1.645^2+4LOB)^0.5]^2/4

参考文献：Milbury CAet al.Determining lower limits of detection ofdigital PCR assays for cancer-related gene mutations.Biomol DetectQuantif.2014Aug 20；1(1):8-22.

实施例3：线性范围及LOD的确定

使用质粒标准品配制不同浓度(1E5、1E4、1000、100、40、10拷贝/ul) 的参考品样本，测定检测体系的线性范围，用灵敏度参考品(10拷贝/ul)多次测定，确定其最低检测限LOD，反应过程如实施例1所述。

结果如图3，在1E5到10拷贝，均呈线性关系，R2值为1，说明线性关系良好，检测灵敏度到10拷贝/体系，然后进一步用10拷贝/ul的灵敏度参考品重复检测8次，均能稳定检测出来，因此，确定本系统的LOD为10 拷贝/体系。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

序列表

<110> 清华大学

新羿制造科技（北京)有限公司

<120> 基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒2019-nCoV核酸定量检测试剂盒

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccttatgggt tgggattatc 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agcaagaaca agtgaggc 18

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttgttttct taggaatcat cac 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acatatggtt gatgttgagt aca 23

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggagataac actctaagca taacta 26

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcttcacacc attccccatt gt 22

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aatgtgatag agccatgc 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctgtagctgc atttcacca 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctgtagctgc atttcacca 19

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aagctccggg tcttag 16

Claims

1.基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒2019-nCoV核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：用于扩增新型冠状病毒2019-nCoV RNA的orf1ab基因15300-15400nt的上游引物和下游引物，和用于扩增新型冠状病毒2019-nCoV RNA的N基因27800-27960nt的上游引物和下游引物；以及，检测上述二个基因具有两种不同荧光标记的三条探针，其中二条不同荧光标记的探针检测同一个基因，另一条标记荧光的探针检测另一个基因。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：用于扩增和检测人管家基因的引物和探针，其作为内对照质控样本质量、提取、逆转录和PCR检测过程。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述人管家基因是人ABL1基因，用于扩增所述ABL1基因的上游引物是SEQ ID NO：5:TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTA；和下游引物是SEQ ID NO：6:GCTTCACACCATTCCCCATTGT；和探针是SEQ ID NO：10:AAGCTCCGGGTCTTAG。

4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测orf1ab基因上游引物SEQ ID NO：1:CCTTATGGGTTGGGATTATC；和下游引物SEQ ID NO：2:AGCAAGAACAAGTGAGGC；和探针SEQ ID NO：7:AATGTGATAGAGCCATGC。

5.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测N基因上游引物SEQ ID NO：3:CTTGTTTTCTTAGGAATCATCAC；和下游引物SEQ ID NO：4:ACATATGGTTGATGTTGAGTACA；和探针SEQ ID NO：8:CTGTAGCTGCATTTCACCA和SEQ ID NO：9:CTGTAGCTGCATTTCACCA。

6.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的orf1ab基因特异探针为SEQ ID NO.7：5'-FAM-AATGTGATAGAGCCATGC-3'-MGB，其中羧基端用FAM标记，羟基端用MGB标记；N基因特异探针为SEQ ID NO.8：5'-FAM-CTGTAGCTGCATTTCACCA-3'-MGB及SEQ ID NO.9：5'-VIC-CTGTAGCTGCATTTCACCA-3'-MGB；其中羧基端为FAM标记和VIC标记2种，羟基端为MGB标记。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：PCR反应缓冲液，其包含脱氧核糖核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dUTP，其中dATP、dCTP、dGTP的终浓度均为100-400nmol/L，dUTP终浓度为300-1000nmol/L；以及0.1-1.5U UNG，1-10U/μl DNA聚合酶；以及逆转录反应缓冲液，其包括逆转录酶和RNase抑制剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应缓冲液还包含25-100mmol/L Tris.HCl,5-25mmol/L氯化钾，1-10mmol/L硫酸铵，和0.5-5mmol/L氯化镁。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应缓冲液还包含60-80mmol/LTris.HCl,8-15mmol/L氯化钾，3-6mmol/L硫酸铵，和1.5-3mmol/L氯化镁。