CN110982876A - 病毒核酸检测的预处理方法、预处理液、试剂盒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒核酸检测领域。具体地，本发明提供了一种用于病毒核酸检测的预处理方法，所述方法包括将含有样本的预处理液与核酸释放剂和qPCR扩增试剂混合，其中，所述预处理液包括：Tris‑HCl、EDTA‑2Na、氯化钠、核糖核酸酶抑制剂和抗生素；其中，所述预处理液的pH为6.5~8.0。使用本发明的方法配置的核酸检测反应液，能够直接进行qPCR，提高检测效率，缩短检测时间。

Description

病毒核酸检测的预处理方法、预处理液、试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及病毒样本的核酸检测领域；特别地，涉及一种病毒样本预处理方法和预处理液，用于对DNA/RNA病毒进行预处理。
背景技术
现行传统的病毒预处理液主要有两种方式：基于Hank's基质的预处理液和基于胍盐的预处理液。Hank's液是病毒运送的常见的平衡盐溶液（Balanced Salt Solution，BSS）。受各种因素的影响，Hank's液保存呼吸道病毒（如流感病毒、新冠病毒等）只能保存数个小时，数个小时之后病毒形态就会受到影响，进而会影响到病毒的核酸检测效率，如果时间再延长一些，那么还很容易滋生细菌、真菌，导致Hank's液pH值下降，加速病毒降解，所以很难用于病毒的长期保存与核酸检测。而基于胍盐的病毒预处理液中的盐酸胍或者Rnasin的浓度相对而言较高（3-5M），高浓度的胍盐适用于常温下的病毒灭活。但是由于胍盐浓度太高，对于诸如磁珠法的核酸提取或纯化有很大的抑制作用，需要多次洗涤或者用于离心柱的方式才可进行。
样本免提取的核酸释放及扩增技术（Extraction Free Nucleic Acid Releaseand Amplification Technology，EFNART）,简称“一步法”技术，是指在不需要对样本进行核酸提取或纯化的情况下，直接搭配强碱性质下的样本核酸释放剂和高兼容性的扩增体系，进行直接的样本核酸扩增检测。这样的“一步法”操作将大大节省病毒核酸检测尤其是RNA病毒的检测时间，预计相比较传统的核酸提取后的扩增方法，该发明可以节省60%以上的时间，检测效率提升50%。
在发生重大疫情（例如，2019-2020年发生的新冠2019-nCoV疫情）的时候，更加倾向于一步法检测，可以节省检测时间，提高效率，会对整个疫情的攻克带来巨大的贡献。
但是，现行常见的病毒预处理液，例如Hank's和基于胍盐的预处理液均不能很好的用于后续的一步法检测，从而很难用于病毒样本的快速检测和筛查的应用场景中。
因此，本领域需求一种能够很好适配于基于一步法的病毒核酸检测的样本预处理液。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供一种用于病毒核酸检测的预处理方法，所述方法包括将存放在预处理液中的样本与核酸释放剂和qPCR扩增试剂混合，
其中，所述预处理液包括：Tris-HCl、EDTA-2Na、氯化钠、核糖核酸酶抑制剂和抗生素；
其中，所述预处理液的pH为6.5~8.0。
在本发明中，Tris-HCl可以约10~约200mM的浓度存在，优选以约80~约120mM的浓度存在，最优选以约100mM的浓度存在。
在本发明中，EDTA-2Na可以约8~约50mM的浓度存在，优选以约10~约15mM的浓度存在，最优选以约10mM的浓度存在。
在本发明中，氯化钠可以约0.5%~约2%（w/v）的浓度存在，优选以约0.8~约1%（w/v）的浓度存在，最优选以约0.9%（w/v）的浓度存在。
在本发明中，“核糖核酸酶抑制剂”是指能够对核糖核酸酶进行抑制，使其失活的化学物质。包括但不限于焦碳酸二乙酯（DEPC）、RNA酶的蛋白质抑制剂（RNasin）、氧钒核糖核苷复合物、SDS等。
在本发明中，核糖核酸酶抑制剂（RNase抑制剂）可以约2U/mL~约800U/mL的浓度存在，例如，为约40U/mL、约50U/mL、约100U/mL；优选地，以约10~约30U/mL的浓度存在；最优选地，以20U/mL的浓度存在。
在本发明中，pH值的范围为6.5~8.0，优选为7.0~8.0，最优选为7.5。
抗生素包括但不限于Proclin类抗生素（如Proclin 300和Proclin 950）和NaN3。
例如，在使用Proclin 300作为抗生素的情况下，其浓度可以为约0.01%（v/v）；又例如，在使用Proclin 950作为抗生素的情况下，其浓度可以为约0.04%（v/v）；但本发明不限于此。
在一个具体的实施方案中，所述预处理液为Tris-HCl的浓度为100mM、EDTA-2Na的浓度为10mM、氯化钠的浓度为0.9%（w/v）、核糖核酸酶抑制剂的浓度为20U/mL，Proclin 950的浓度为0.04%（v/v）；
并将上述预处理液调至pH值为7.5。
如本文所使用的，“样本”是指可能含有病毒的样本。所述样本可来源于人或动物的血液、粪便、尿液、口腔上皮细胞、脱落细胞、口腔拭子、咽拭子等。
本发明中提及的“预处理”是指对样本进行检测之前的处理，尤其指在对样本进行（基于一步法的）核酸检测前的处理。
本发明中提及的“预处理液”是指对病毒样本进行预处理的液体。
在本发明中，病毒可为DNA病毒或RNA病毒。
在一个优选地实施方案中，所述病毒为RNA病毒。
在更优选地实施方案中，所述病毒为冠状病毒（如2019新型冠状病毒）、呼吸道合胞病毒、肠道病毒。
使用本发明的预处理方法配置的核酸检测反应液，能够直接进行qPCR，无需提取或纯化过程，提高检测效率，缩短检测时间。该发明中采用的抗生素和核糖核酸酶抑制剂可以用于DNA病毒和RNA病毒的预处理，可以避免在常温状态下因为细菌等多种微生物的生长影响病毒保存的活性。RNA病毒由于随处可在的RNA酶的原因，更容易降解，使用本发明的方法同时避免医学采样过程中（口腔上皮细胞、脱落细胞、咽拭子等多种样本类型）由于样本本身或者采样耗材本身带来的对RNA的破坏，非常有利于RNA病毒的长期保存和检测。
需要说明的是，在本发明的预处理液处理的样品不进行存放而是直接（即处理后0hr）进行EFNART检测的情况下，如下文实施例中所证实的，本发明预处理液的组分具有增强RT-PCT的作用。
在第二方面，本发明提供了一种对样本中病毒核酸进行检测的方法，包括使用前述方法配置的反应液直接进行qPCR扩增而检测。
样本释放剂是指能够释放样本中核酸的化学试剂。例如强酸性或强碱性的化学试剂。示例性的样本释放剂可以是包括0.01~0.5mmol/L莎梵婷（surfactin）、100~200mmol/L氯化钾、50~200mmol/L氯化锂、质量/体积比为0.1%~1%十二烷基硫酸三乙醇胺、体积/体积比为0.1%~1%乙基苯基聚乙二醇（NP-40）、质量/体积比为0.01%~2%十二烷基磺酸钠、体积/体积比为0.05%~1%乙醇等组分中的一种或几种，但本发明不限于此。
qPCR扩增试剂是指用于实时荧光定量核酸扩增检测的试剂。本领域技术人员能够理解qPCR扩增试剂通常含有DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液等。例如当检测对象为RNA时，还可进一步包括逆转录酶。不难理解，本领域技术人员可以根据具体需要（例如病毒的种类，含量等），确定PCR反应试剂的成分和浓度。
本发明中提及的“一步法”是指样本免提取的核酸释放及扩增技术（ExtractionFree Nucleic Acid Release and Amplification Technology, EFNART）。其是指在不需要对样本进行核酸提取或纯化的情况下，直接搭配强碱性质下的样本核酸释放剂和高兼容性的扩增体系，进行直接的样本核酸扩增检测。
在基于一步法对样本中的病毒核酸进行检测时，将存在于保存液或预处理液中的样本、样本释放剂和qPCR反应液混合后直接扩增。混合可以本领域中通常比例进行。在示例性的实施方案中，在于保存液或预处理液中的样本、样本释放剂和qPCR反应液可以约5:5:40、约10:10:30或者约5:15:30（v/v）的比例存在，但本发明不限于此。
第三方面，本发明提供一种用于病毒核酸检测的预处理液，所述预处理液包括：
Tris-HCl、EDTA-2Na、氯化钠、核糖核酸酶抑制剂和抗生素；
其中，所述预处理液的pH为6.5~8.0。
在本发明中，Tris-HCl可以约10~约200mM的浓度存在，优选以约80~约120mM的浓度存在，最优选以约100mM的浓度存在。
在本发明中，EDTA-2Na可以约8~约50mM的浓度存在，优选以约10~约15mM的浓度存在，最优选以约10 mM的浓度存在。
在本发明中，氯化钠可以约0.5%~约2%（w/v）的浓度存在，优选以约0.8~约1%（w/v）的浓度存在，最优选以约0.9%（w/v）的浓度存在。
在本发明中，核糖核酸酶抑制剂（RNase抑制剂）可以约2U/mL~约800U/mL的浓度存在，优选以约10~约30U/mL的浓度存在，最优选以20U/mL的浓度存在。
在本发明中，pH值的范围为6.5~8.0，优选为7.0~8.0，最优选为7.5。
抗生素包括但不限于Proclin类抗生素（如Proclin 300和Proclin 950）和NaN3。
例如，在使用Proclin 300作为抗生素的情况下，其浓度可以为约0.01%（v/v）；又例如，在使用Proclin 950作为抗生素的情况下，其浓度可以为约0.04%（v/v）；但本发明不限于此。
在一个具体的实施方案中，所述预处理液为Tris-HCl的浓度100mM、EDTA-2Na的浓度10mM、氯化钠的浓度为0.9%（w/v）、核糖核酸酶抑制剂的浓度为20U/mL，Proclin 950的浓度为0.04%（v/v）；
并将上述预处理液调至pH值为7.5。
在一些具体实施方案中，病毒可为DNA病毒或RNA病毒。
在一个优选地实施方案中，所述病毒为RNA病毒。
在更优选地实施方案中，所述病毒为冠状病毒（如2019新型冠状病毒）、呼吸道合胞病毒、肠道病毒。
第四方面，本发明提供一种预处理液在制备用于检测病毒的一步法核酸扩增检测试剂盒中的用途。
第五方面，本发明提供一种基于一步法的病毒核酸检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述的预处理液。
进一步地，所述试剂盒还包括样本释放剂和qPCR扩增试剂。
附图说明
图1为本发明预处理方法预处理的样品的梯度稀释的2019新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸室温保存72小时之后“一步法”检测的结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1 本发明用于呼吸道合胞病毒（RSV）口咽拭子样本预处理和快速检测
为了测评该发明中的病毒预处理液，将该发明的病毒预处理液（Tris-HCl的浓度为100mM、EDTA-2Na的浓度为10mM、氯化钠的浓度为0.9%（w/v）、RNasin浓度为20U/mL，Proclin950的浓度为0.04%（v/v））与生理盐水以及商品化的病毒预处理液进行对比分析。对比的方法为用临床诊断为阳性的呼吸道合胞病毒（RSV）咽拭子样本进行稀释（1:9，v/v）预处理，预处理条件为室温25℃，分别在预处理时间的0小时/24小时/48小时和72小时进行样本的直接扩增，通过Ct值对比在室温预处理条件下的实时荧光定量PCR（real-time qPCR）的检测效率，来评价不同预处理液对病毒预处理效果的影响。qPCR扩增检测的方式为上述的EFNART“一步法”技术，利用带有样本的预处理液：核酸释放剂：PCR扩增试剂=10:10:30的方式，直接在PCR扩增管中进行real-time qPCR扩增检测。
实时荧光定量PCR（Real-time qPCR）扩增检测程序如表1所示，结果如表2所示。
Figure 836410DEST_PATH_IMAGE001
Figure 169433DEST_PATH_IMAGE002
上述结果表明，对于该发明中的病毒预处理方式，在室温下预处理24小时，对于梯度稀释的RSV样本能够很好的进行预处理，并且可以直接用于EFNART的方式进行检测，基于生理盐水基质的预处理方式，长时间预处理后，Ct值会拖后，病毒的核酸得到了一定的降解，影响了扩增效率。反而市面上常用的Hanks预处理液和胍盐预处理液在该方案中均不能提供有效的病毒预处理和PCR扩增检测的方式。
实施例2 本发明用于2019新型冠状病毒（2019-nCoV）样本纯化后核酸预处理和快速检测
为了测评该发明中的病毒预处理液，将该发明的病毒预处理液（Tris-HCl的浓度为100mM、EDTA-2Na的浓度为10mM、氯化钠的浓度为0.9%（w/v）、RNasin的浓度为20U/mL，Proclin 300的浓度为0.01%（v/v））与生理盐水以及商品化的病毒预处理液进行对比分析。对比的方法为用临床诊断为阳性的2019新型冠状病毒（2019-nCoV）的核酸进行稀释（1:9，v/v）预处理，预处理条件为室温25℃，分别在预处理时间的0小时/24小时/48小时和72小时进行样本的直接扩增，通过Ct值对比在室温预处理条件下的实时荧光定量PCR（real-timeqPCR）的检测效率，来评价不同预处理液对病毒预处理效果的影响。qPCR扩增检测的方式为上述的EFNART“一步法”技术，利用带有核酸的预处理液：核酸释放剂：PCR扩增试剂=10:10:30的方式，直接在PCR扩增管中进行real-time qPCR扩增检测。结果如表3所示。用于该发明中的病毒预处理方法梯度稀释的2019新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸室温保存72小时，“一步法”检测的结果如图1所示。
Figure 32347DEST_PATH_IMAGE003
上述结果表明，对于该发明中的病毒预处理方式，在室温下预处理24小时，对于梯度稀释的2019-nCoV核酸能够很好的进行预处理，并且可以直接用于EFNART的方式进行检测，基于生理盐水基质的预处理方式，长时间预处理后，Ct值会拖后，病毒的核酸得到了一定的降解，影响了扩增效率。反而市面上常用的Hanks预处理液和胍盐预处理液在该方案中均不能提供有效的病毒预处理和PCR扩增检测的方式。
实施例3 本发明用于肠道病毒通用性（EV）咽拭子样本预处理和快速检测
为了测评该发明中的病毒预处理液，将该发明的病毒预处理液（Tris-HCl的浓度为100mM、EDTA-2Na的浓度为10mM、氯化钠的浓度为0.9%（w/v）、SDS的浓度为0.1%，Proclin950的浓度为0.04%（v/v））与生理盐水以及商品化的病毒预处理液进行对比分析。对比的方法为用临床诊断为阳性的肠道病毒通用型（EV）咽拭子样本进行稀释（1:9，v/v）预处理，预处理条件为室温25℃，分别在预处理时间的0小时/24小时/48小时和72小时进行样本的直接扩增，通过Ct值对比在室温预处理条件下的实时荧光定量PCR（real-time qPCR）的检测效率，来评价不同预处理液对病毒预处理效果的影响。qPCR扩增检测的方式为上述的EFNART“一步法”技术，利用带有样本的预处理液：核酸释放剂：PCR扩增试剂=10:10:30的方式，直接在PCR扩增管中进行real-time qPCR扩增检测。结果如表4所示：
Figure 194338DEST_PATH_IMAGE004
上述结果表明，对于该发明中的病毒预处理方式，在室温下预处理24小时，对于梯度稀释的EV样本能够很好的进行预处理，并且可以直接用于EFNART的方式进行检测，基于生理盐水基质的预处理方式，长时间预处理后，Ct值会拖后，病毒的核酸得到了一定的降解，影响了扩增效率。反而市面上常用的Hanks预处理液和胍盐预处理液在该方案中均不能提供有效的病毒预处理和PCR扩增检测的方式。
实施例4 本发明的病毒预处理液对于RNA病毒的预处理能力
相对于DNA病毒，由于RNA病毒的预处理和检测有更高的要求，更容易受到环境因素的影响。尤其是预处理过程中使用的耗材中含有RNA酶的存在的情况下，对RNA病毒的检测有着至关重要的影响。为了测评该发明中的病毒预处理液（Tris-HCl的浓度为100mM、EDTA-2Na的浓度为10mM、氯化钠的浓度为0.9%（w/v）、Rnasin的浓度为20U/mL，Proclin 950的浓度为0.04%（v/v））对RNA病毒的预处理效果，将该发明的病毒预处理液预处理的2019新型冠状病毒（2019-nCoV）样本提取的核酸分成两份(A/B)，同时制备一份近在生理盐水中预处理的同等浓度的2019新型冠状病毒（2019-nCoV）样本提取的核酸(C)，分别往A和C溶液中加入0.25μg/mL Rnase A,将三种含有2019-nCoV核酸的溶液进行室温（25℃）预处理24小时，然后采用EFNART“一步法”技术对该发明中的预处理液进行对RNA病毒的预处理和检测。检测方式如下：利用带有核酸的预处理液：核酸释放剂：PCR扩增试剂=10:10:30的方式，直接在PCR扩增管中进行real-time qPCR扩增检测。结果如表5所示。
Figure 52572DEST_PATH_IMAGE005
通过上述实验证明，以预处理的核酸样品D为参照的情况下，该发明中加入0.25μg/mL Rnase A对2019-nCoV的核酸检测效果无影响，该发明中的有效组分能够消化RNA酶，减少RNA酶对实验检测的影响，能够保证对RNA病毒直接检测的有效率。以预处理的核酸样品C来看，实验条件中加入的0.25μg/mL Rnase A能够消化降解实验中的RNA，因此对RNA病毒的直接检测造成很大的影响，引起漏检的风险。
实施例5 本发明的病毒预处理液用于乙型肝炎病毒（HBV）血清样本预处理和快速检测
为了测评该发明中的病毒预处理液在DNA病毒保存和扩增检测的作用，将该发明的病毒预处理液（Tris-HCl的浓度为100 mM、EDTA-2Na的浓度为10 mM、氯化钠的浓度为0.9%（w/v）、Rnasin的浓度为20U/mL，Proclin 950的浓度为0.04%（v/v））与生理盐水以及商品化的病毒预处理液进行对比分析。对比的方法为用临床诊断为阳性的乙型肝炎病毒（HBV）的血清样本进行稀释（1:9，v/v）预处理，预处理条件为室温25℃，分别在预处理时间的0小时/24小时/48小时和72小时进行样本的直接扩增，通过Ct值对比在室温预处理条件下的实时荧光定量PCR（real-time qPCR）的检测效率，来评价不同预处理液对DNA病毒预处理效果的影响。qPCR扩增检测的方式为上述的EFNART“一步法”技术，利用带有DNA病毒的预处理液：核酸释放剂：PCR扩增试剂=10:10:30的方式，直接在PCR扩增管中进行real-time qPCR扩增检测。结果如表6所示。
Figure 9027DEST_PATH_IMAGE006
上述结果表明，对于该发明中的病毒预处理方式，虽然最开始的设计针对于RNA病毒用于“一步法”扩增的病毒保存基质，但同时也可以用于DNA病毒的保存和一步法扩增检测。
实施例6 本发明的病毒预处理液的各种组分的有效性的验证
为了验证本发明中的各种组分的有效性，将该发明中的相关组分进行调整降低后对样本保存进行预处理对比试验，单独优化组分分别包括核糖核酸酶抑制跟抗生素、EDTA-2Na等，调整的各种组分的浓度如表7。调整不同浓度配置成的预处理液对呼吸道合胞病毒（RSV）进行室温保存24小时后直接进行qPCR扩增检测，通过Ct值对比在室温预处理条件下的实时荧光定量PCR（real-time qPCR）的检测效率，来评价不同预处理液对病毒预处理效果的影响。qPCR扩增检测的方式为上述的EFNART“一步法”技术，利用带有样本的预处理液：核酸释放剂：PCR扩增试剂=10:10:30的方式，直接在PCR扩增管中进行real-time qPCR扩增检测。
Figure 93658DEST_PATH_IMAGE007
通过上述实验，该发明中的化学组分是必需成分，并且在该发明中的浓度中对RNA病毒的预处理和一步法RT-PCR检测中表现最优。

Claims (12)

1.一种用于病毒核酸检测的预处理方法，所述方法包括将存放在预处理液中的样本与核酸释放剂和qPCR扩增试剂混合，
其中，所述预处理液包括：Tris-HCl、EDTA-2Na、氯化钠、核糖核酸酶抑制剂和抗生素；
其中，所述预处理液的pH为6.5~8.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述预处理液中，Tris-HCl的浓度为10~200mM，EDTA-2Na的浓度为8~50mM，氯化钠的浓度为0.5%~2% （w/v），核糖核酸酶抑制剂的浓度为2U/mL~800U/mL，并且抗生素的浓度为0.005~0.05%。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述预处理液中，Tris-HCl的浓度为80~120mM、EDTA-2Na的浓度为10~15mM、氯化钠的浓度为0.8~1%（w/v）、核糖核酸酶抑制剂的浓度为10~30U/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法所制备的反应液可直接进行qPCR扩增检测。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，所述病毒为DNA病毒和RNA病毒，优选为RNA病毒，更优选为冠状病毒，如2019新型冠状病毒。
6.一种用于病毒核酸检测的预处理液，所述预处理液包括：Tris-HCl、EDTA-2Na、氯化钠、核糖核酸酶抑制剂和抗生素；
其中，所述预处理液的pH为6.5~8.0。
7.根据权利要求6所述的预处理液，其中，在所述预处理液中，Tris-HCl的浓度为10~200mM，EDTA-2Na的浓度为8~50mM，氯化钠的浓度为0.5%~2%（w/v），核糖核酸酶抑制剂的浓度为2U/mL~800U/mL，并且抗生素的浓度为0.005~0.05%。
8.根据权利要求6所述的预处理液，其中，在所述预处理液中，Tris-HCl的浓度为80~120mM、EDTA-2Na的浓度为10~15mM、氯化钠的浓度为0.8~1%（w/v）、核糖核酸酶抑制剂的浓度为10~30U/mL。
9.根据权利要求6~8中任一项所述的预处理液，其中，所述病毒为DNA病毒和RNA病毒，优选为RNA病毒，更优选为冠状病毒，如2019新型冠状病毒。
10.权利要求6~9中任一项所述的预处理液在制备用于检测病毒的一步法核酸扩增检测试剂盒中的用途。
11.基于一步法的病毒核酸检测的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求6~9中任一项所定义的预处理液。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括样本释放剂和qPCR扩增试剂。
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