CN115896245A

CN115896245A - 一种基于微流控芯片的全自动核酸提取、多重聚合酶链式反应的快速检测方法

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Publication number: CN115896245A
Application number: CN202211709529.1A
Authority: CN
Inventors: 李娜; 方彬彬
Original assignee: Tongguan Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Tongguan Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-29
Filing date: 2022-12-29
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明的目的在于提供一种基于微流控芯片的全自动核酸提取、多重聚合酶链式反应(PCR)的快速检测方法，并对所述微流控芯片中的洗涤液、PCR扩增体系进行了优化，使得吸附于核酸纯化硅胶膜上的核酸洗涤彻底，降低了蛋白质、脂质以及盐等杂质成分含量，抑制非特异性产物的产生，增强特异性产物的扩增效率，避免假阴性结果的出现。优选地，所述微流控芯片增设出气口过滤器，净化排出的气体，有利于保护操作者的安全，并且环境友好。

Description

一种基于微流控芯片的全自动核酸提取、多重聚合酶链式反应的快速检测方法

技术领域

本发明属于诊断试剂领域，更具体地，本发明涉及一种微流控芯片方式结合多重聚合酶链式反应(PCR)技术，快速、自动化检测核酸样本的方法和试剂。

背景技术

核酸扩增检测主要步骤包含：核酸提取、裂解、清洗、纯化、扩增、检测等，步骤较多，目前核酸检测技术是分步进行，其中核酸提取需要人工或者采用核酸提取设备完成，核酸检测则需要另外的核酸检测分析设备完成，需要仪器多，而且操作繁琐，使得核酸检测仍是需要人工参与的“精细活”，因此，需要一种全自动核酸检测的设备。

目前公开的一些核酸检测设备中主要采取离心柱法提取核酸，其基本原理是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来，然后把释放出的核酸特异地吸附在离心柱的核酸吸附膜(如硅胶膜)上，这种膜只对核酸有较强的亲和力和吸附力，对其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类则基本不吸附，因而在离心时能被甩出柱子，再通过漂洗液对离心柱进行漂洗以去除杂质，最后通过洗脱液把吸附在核酸吸附膜上的核酸洗脱下来，即可得到纯化的核酸，以用于后续的核酸扩增检测。但是这种设备和检测方法仍然存在以下缺陷：1、吸附于核酸纯化硅胶膜上的核酸洗涤不够彻底，存在蛋白质、脂质以及盐等杂质成分，导致杂质含量偏高。2、核酸检测过程容易对样本核酸造成污染，对实验室环境要求较高，操作难度大，对操作人员要求高。3、当待扩增的模板非常复杂，或引物浓度极低时，无法扩增出所有目标特异性产物，出现假阴性结果。

因此，本领域亟待一些优化的技术手段，以改变以上技术现状。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用微流控芯片结合多重聚合酶链式反应(PCR)快速、自动化检测样本的方法。所述方法对PCR扩增体系进行了优化，增强了特异性产物的扩增效率，抑制了非特异性产物的产生，避免了假阴性结果的出现。在优选的方式中，所述方法还对用于PCR的洗涤液进行了优化，使得吸附于核酸纯化硅胶膜上的核酸洗涤彻底，降低了蛋白质、脂质以及盐等杂质成分含量。较佳的方式中，所述微流控芯片还设置出气口过滤器，净化排出的气体，有利于保护操作者的安全，并且环境友好。

在本发明的第一方面，提供一种使用微流控芯片进行PCR扩增的方法，所述方法包含：

(1)提供微流控芯片，其包括进液腔、含有核酸吸附膜的核酸提取腔、含有预混的RT-PCR反应体系的PCR扩增试剂腔、PCR反应腔；

(2)将样本溶液注入所述进液腔；

(3)使进液腔的样本溶液进入核酸提取腔，与核酸吸附膜接触；核酸吸附膜吸附样本溶液中的核酸；洗涤核酸吸附膜去除杂质，从核酸吸附膜洗脱核酸，得到纯化后的核酸；

(4)使纯化后的核酸进入PCR扩增试剂腔，与预混的RT-PCR反应体系混合；使混合液进入PCR反应腔，进行逆转录及PCR扩增；

其中，所述预混的RT-PCR反应体系包括逆转录试剂、扩增试剂、PCR增强剂、引物；可选地还包括探针；所述PCR增强剂是甜菜碱和二甲基亚砜(DMSO)的组合物。

在一种或多种实施方式中，步骤(3)中，所述洗涤核酸吸附膜包括采用洗涤液I和洗涤液II洗涤；

其中，所述洗涤液I中包含：1.0M～2.5M的异硫氰酸胍；20～60％乙醇(优选为30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％乙醇)；以及，1mM～20mM的Tris-HCl(优选8mM～12mM的Tris-HCl，更优选10mM的Tris-HCl)；较佳地，所述洗涤液I的pH值为6～7(优选是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0mM，更优选是6.6mM)；

其中，所述洗涤液II中包含：0.001M～0.05M的Tris(优选0.01M的Tris)，和0.01M～0.5M的NaCl(优选0.1M的NaCl)，以及60～90％的乙醇(优选60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％的乙醇)；较佳地，所述洗涤液II的pH值为7～8(优选pH7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0，更优选是pH7.5)。

在一种或多种实施方式中，步骤(3)中，所述洗涤核酸吸附膜还包括采用洗涤液III洗涤；所述洗涤液III为90～100％的乙醇(优选为90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的乙醇)。

在一种或多种实施方式中，所述微流控芯片上包括机械按压囊泡1和机械按压囊泡2，分别装有洗涤液I和洗涤液II，先通过机械按压囊泡1使洗涤液Ⅰ进入核酸提取腔、对核酸吸附膜进行冲洗，再通过机械按压囊泡2使洗涤液Ⅱ进入核酸提取腔、对核酸吸附膜进行冲洗。

在一种或多种实施方式中，所述微流控芯片上包括机械按压囊泡3，装有洗涤液III，通过机械按压囊泡3使洗涤液ⅠII进入核酸提取腔、对核酸吸附膜进行冲洗。

在一种或多种实施方式中，步骤(2)～(4)中，样本或含有样本的溶液在芯片上的流动或转移，通过芯片上的流通通道来实现。

在一种或多种实施方式中，较佳地，通过压力驱动所述流动或转移。

在一种或多种实施方式中，所述压力包括机械压力。

在一种或多种实施方式中，步骤(4)中，核酸与预混的RT-PCR反应体系的混合可在超声作用下进行。

在一种或多种实施方式中，步骤(3)中，洗涤核酸吸附膜后，还包括：针对核酸吸附膜进行烘干处理；优选烘干的温度为60～100℃，更优选70℃；优选烘干时间为1～5min，更优选2min。

在一种或多种实施方式中，步骤(3)中，洗涤核酸吸附膜后，以洗脱液从核酸吸附膜洗脱核酸，所述洗脱液为含有0.001M～0.05M Tris(优选0.01M Tris)、pH值为7～9(优选pH值为8.5)的水溶液。

在一种或多种实施方式中，所述甜菜碱的终浓度为0.5～3M，所述DMSO的含量(体积百分比)为5～20％；优选所述甜菜碱的终浓度为1.0～2.5M(如1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0、2.2M)，更优选所述甜菜碱的终浓度为1.0～1.5M，所述DMSO的含量(体积百分比)为5～15％(如6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％)，优选所述DMSO的含量(体积百分比)为5～10％(如6％、7％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％)。

在一种或多种实施方式中，所述的样本为来自病原体的核酸样本或含有病原体核酸的样本；可选地，所述的样本为来自病毒的核酸样本或含有病毒核酸的样本；可选地，所述病毒为腺病毒(AdV)、人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、博卡病毒(BOV)、鼻病毒(RV)、HKU1病毒(HKU1)、NL63病毒(NL63)、SARS病毒(SARS)、副流感病毒1型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4)、猴痘病毒(MPXV)；

优选所述病毒为呼吸道合胞病毒(HRSV)A型、B型；

更优选所述病毒的正向引物包含：

a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1、4、7所示的正向引物；或，

b)核苷酸序列与SEQ ID NO:1、4、7具有90％以上序列同一性且具有a)限定的功能的正向引物；

所述病毒的反向引物包含：

c)核苷酸序列如SEQ ID NO:2、5、8所示的反向引物；或，

d)核苷酸序列与SEQ ID NO:2、5、8具有90％以上序列同一性且具有c)限定的功能的反向引物；

所述病毒的探针包含：

e)核苷酸序列如SEQ ID NO:3、6、9所示的探针；或，

f)核苷酸序列与SEQ ID NO:3、6、9具有90％以上序列同一性且具有c)限定的功能的探针。

在一种或多种实施方式中，步骤(4)之后，还包括对PCR产物进行分析的步骤，以确定所述扩增产物的存在情况(定性)或存在量(定量)。

在一种或多种实施方式中，所述使用微流控芯片进行PCR扩增的方法为“非诊断性”的方法，所述方法不以获得疾病诊断结果为直接目的。

在一种或多种实施方式中，所述对PCR产物进行分析的步骤以确定所述扩增产物的存在情况(定性)或存在量(定量)方法为“非诊断性”的方法，所述方法不以获得疾病诊断结果为直接目的。

在本发明的第二方面，提供一种PCR增强剂，其特征在于，所述PCR增强剂是甜菜碱和二甲基亚砜(DMSO)的组合物。优选所述甜菜碱的终浓度为0.5～3M，所述二甲基亚砜的含量(体积百分比)为5～20％。更优选所述甜菜碱的终浓度为1.0～2.5M，所述二甲基亚砜的含量(体积百分比)为5～15％。

在本发明的第三方面，提供所述的PCR增强剂的用途，用于增加PCR扩增反应中所需PCR产物的产量，和/或减少PCR扩增反应中的非特异性产物。

在本发明的第四方面，提供一种用于核酸提取的洗涤液，其特征在于，所述洗涤液包含洗涤液I和洗涤液II；

其中所述洗涤液I中包含：

1.0M～2.5M的异硫氰酸胍；

20～60％乙醇，优选为30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％乙醇；以及

1mM～20mM的Tris-HCl，优选8mM～12mM的Tris-HCl，更优选10mM的Tris-HCl；

所述洗涤液II中包含：

0.001M～0.05M的Tris，优选0.01M的Tris；

0.01M～0.5M的NaCl，优选0.1M的NaCl；以及

60～90％的乙醇，优选60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％的乙醇。

在一种或多种实施方式中，所述洗涤液I的pH值为6～7，优选是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0，更优选是6.6；所述洗涤液II的pH值为7～8，优选是7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0，更优选是7.5。

在一种或多种实施方式中，所述洗涤液还包含洗涤液III，所述洗涤液III为90～100％的乙醇，更优选为90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的乙醇。

在本发明的第五方面，提供一种微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括：进液腔、核酸提取腔、PCR扩增试剂腔、PCR反应腔；

所述进液腔用于注入或存储样本溶液；

所述核酸提取腔含有核酸吸附膜，所述核酸吸附膜用于吸附样本溶液中的核酸；

所述PCR扩增试剂腔用于存储预混的RT-PCR反应体系；所述预混的RT-PCR反应体系包括逆转录试剂、扩增试剂、PCR增强剂、引物；可选地还包括探针；所述PCR增强剂是甜菜碱和二甲基亚砜(DMSO)的组合物

所述PCR反应腔用于进行逆转录及PCR扩增。

在一种或多种实施方式中，所述微流控芯片还包括：囊泡1、其中装有洗涤液I，囊泡II、其中装有洗涤液II；可选的，还包括：囊泡III，其中装有洗涤液III；

在一种或多种实施方式中，所述微流控芯片还包括：洗脱液，用于从核酸吸附膜洗脱核酸。

在本发明的第六方面，提供一种试剂盒，其包含本发明所述的PCR增强剂，和/或本发明所述的洗涤液。

在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包含(a)样本处理质控，用于监测PCR扩增反应。

在一种或多种实施方式中，所述样本处理质控(SPC)包括引物、探针。

在一种或多种实施方式中，所述样本处理质控(SPC)的引物、探针被整合于所述微流控芯片的PCR扩增试剂腔。具体的，在样本处理过程中，SPC与样本一起被提取核酸然后分液到PCR扩增反应腔室内进行扩增。

在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包含(b)核酸吸附膜。

在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包含(c)预混的RT-PCR反应体系；更佳地，所述预混的RT-PCR反应体系包括逆转录试剂、扩增试剂、PCR增强剂、引物(正向引物、反向引物)；可选地还包括探针。

在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包含(d)核酸洗脱液。

在一种或多种实施方式中，所述试剂盒含有微流控芯片；更佳地所述芯片有多个腔或囊泡，所述PCR增强剂、洗涤液以及(a)-(d)的试剂被整合于所述微流控芯片的腔或囊泡中。

在一种或多种实施方式中，所述质控的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

在一种或多种实施方式中，所述逆转录试剂包括(但不限于)：逆转录酶；较佳地包括(但不限于)M-MLV逆转录酶。

在一种或多种实施方式中，所述扩增试剂包括(但不限于)：DNA聚合酶(如热启动Taq DNA聚合酶等)、dNTPs以及反应缓冲液等；较佳地包括(但不限于)：PCR Buffer、NTPs、Tris HCl缓冲液、(NH₄)₂SO₄、MgCl₂；较佳地还包括KCl。

在一种或多种实施方式中，所述扩增试剂中还包括核糖核酸酶抑制剂。

在一种或多种实施方式中，所述扩增试剂中还包括UNG酶。

在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包含(但不限于)选自如下的一种或多种试剂：裂解液、结合液；较佳地其可被整合于所述微流控芯片的腔中。

在一种或多种实施方式中，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或4所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或5所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3或6所示。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、本发明微流控芯片的结构示意图。201进液腔进样口，202进气口，203阀门A，204核酸提取腔(内部包埋核酸吸附膜)，205PCR定量腔，206阀门B，207透气孔A，208PCR反应腔，209PCR扩增试剂(冻干)腔，210废液腔，211排气孔B(包含排气口空气过滤器)，212囊泡座(分别为囊泡1、2、3、4)，213储液腔，214透气孔C。

图2、检测呼吸道合胞病毒A型的PCR扩增曲线图。A：对照组；B：添加终浓度为1.5M甜菜碱；C：添加终浓度为10％DMSO；D：添加终浓度为1.5M甜菜碱、10％DMSO。

图3、检测呼吸道合胞病毒A型的PCR扩增曲线图。E：添加终浓度为0.5M甜菜碱、5％DMSO；F：添加终浓度为1.0M甜菜碱、8％DMSO；G：添加终浓度为1.5M甜菜碱、10％ DMSO。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，提供一种使用微流控芯片方式结合多重聚合酶链式反应(PCR)快速、自动化检测核酸样本(如病毒等)的检测方法。所述方法对PCR扩增体系进行了优化，从而抑制非特异性产物的产生，增强特异性产物的扩增效率，避免假阴性结果的出现。优选地所述方法还对洗涤液进行了优化，使得吸附于核酸纯化硅胶膜上的核酸洗涤彻底，降低了蛋白质、脂质以及盐等杂质成分含量。优选地，所述微流控芯片增设出气口过滤器，净化排出的气体，有利于保护操作者的安全，并且环境友好。

一步法RT-PCR

本发明基于一步法RT-qPCR基本原理：临床样本经过微流控芯片内预包埋的核酸提取试剂提纯出总RNA后，在逆转录酶下逆转录成互补DNA(cDNA)。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应，通过荧光染料或荧光标记的具有特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，可以实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。一步法RT-qPCR中cDNA合成与PCR反应在同一缓冲液体系及酶中进行，因此，称为“一步法”。

本发明中，所述的“核酸样本”没有特别的限制，可以是各种需要进行PCR扩增的“核酸样本”。

本发明中，所述的PCR扩增可以是以获得扩增产物为目的。在一些方式中，还进一步包括：确定扩增产物中目的核酸的存在情况或存在量，获得定性或定量的检测结果。

术语“定量聚合酶链式反应”、“qPCR”，也称为实时聚合酶链式反应(RT-qPCR)，实时监测来自PCR反应的DNA产物的积累。RT-qPCR是基于聚合酶链式反应(PCR)的分子生物学实验室技术，它用于扩增并且同时定量靶DNA分子。可以在PCR中扩增和检测特定序列的甚至一个拷贝。PCR反应以指数方式生成DNA模板的拷贝。这导致起始靶序列的量和在任何特定循环下累积的PCR产物的量之间的定量关系。由于与模板、试剂限制或焦磷酸盐分子的积累一起发现的聚合酶反应的抑制剂，所以PCR反应最终停止以指数速率生成模板(即平台期)，使得PCR产物的终点定量不可靠。因此，重复的反应可以生成可变量的PCR产物。只有在PCR反应的指数期期间才有可能回推以便确定模板序列的起始量。PCR产物积累时的测量(即实时定量PCR)允许在反应的指数期进行定量，并且因此消除与常规PCR相关的变异性。在实时PCR测定中，通过荧光信号积累来检测阳性反应。对于DNA样品中的一个或多个特异性序列，定量PCR能够进行检测和定量两者。数量可以是拷贝的绝对数量或是当归一化到DNA输入或额外的归一化基因时的相对量。

微流控芯片中还包含样本处理质控(SPC)，也称为“全流程质控”、“内质控”或“检测样本处理质控SPC”。SPC的引物和探针预先包埋于PCR扩增反应室中。在样本处理过程中，SPC与样本一起被提取核酸然后分液到PCR扩增反应腔室内进行扩增。SPC用于监测样本采集、提取过程的质量及监测PCR反应中是否存在抑制剂，从而实现在全封闭反应体系中对整个检测过程的监控，可有效监控假阴性的发生。

如本发明所述，术语“Ct值”又叫“循环阈值”，是指RT-qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数(Cycle Threshold)。C代表Cycle，T代表Threshold。即，Ct值就是RT-qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时，所对应的循环数。如本发明所述，当RT-qPCR法测得的Ct值在15～35/38这个范围时，表示检测出的结果为阳性。具体的，SPC检测Ct值≤35.0时，判断SPC为阳性。检测样本Ct值≤38.0时，判断检测样本为阳性。

所述“假阴性”是指检测样本为阳性，但检测结果为阴性的错误，对应的，“假阳性”是指检测样本为阴性，但检测结果为阳性的错误。如本发明所用，当待扩增的模板非常复杂，或引物浓度极低时，无法扩增出所有目标特异性产物，就会出现假阴性结果。

本发明的微流控芯片/试剂盒

本发明的微流控芯片中，所包含的试剂可以是固态的、半固态或液态的，本领域技术人员可以对所述试剂的状态进行改变以使之适于进行本发明的PCR检测。在优选的方式中，可以以冻干状态包埋于微流控芯片的各个腔室内并且提前按照核酸提取、PCR扩增、扩增产物分析这几个步骤预设各个腔室的位置，各个腔室之间具有转移腔，以便通过转移腔将腔室内的液体转移到其目标位置。微流控芯片的自动控制采用气动压力执行，微流控芯片内液体的混合利用超声振动进行混匀。本发明的微流控芯片的外壳上还设置有进气口，排气口，以及排气口空气过滤器。本发明微流控芯片的结构示意图如图1所示。

使用本发明的微流控芯片进行检测时，由于检测所需要的所有试剂均是预先包埋于微流控芯片内的，检测时微流控芯片仍始终保持密封状态，操作者只需要在微流控芯片外进行样本裂解，操作简单。测试后，通过本发明的微流控芯片的外壳上的排气口空气过滤器，可以进一步净化排出的气体，有利于保护操作者的安全，并且环境友好。

本发明的微流控芯片中包含核酸提取试剂、逆转录和PCR扩增试剂。

所述核酸提取试剂包含裂解液、结合液、核酸吸附膜、洗涤液、洗脱液。

所述裂解液中包含异硫氰酸胍，其可使细胞裂解，从待测样本中释放出来的核酸成分。异硫氰酸胍的浓度可以为1.0M～5.0M，例如可以为1.0M～2.5M。所述裂解液还包含有一定浓度(例如10mM)的Tris-HCl，一定浓度(例如20-500mM)乙二胺四乙酸，一定浓度(例如0.5-5M)尿素以及1-2％ Triton X-100。

所述结合液是指可以与裂解液中释放出来的核酸相结合的溶液，例如可以是70％乙醇或异丙醇。

所述核酸吸附膜是指能吸附核酸的膜，例如核酸硅胶膜(Silica membrane)，硅胶膜表面的硅醇基团呈弱酸性，其水化后带负电。当溶液中存在一定浓度的阳离子、低pH后，形成的阳离子桥能够中和核酸和硅醇基团之间的表面负电荷，从而使核酸牢固地吸附在硅胶膜表面。

所述洗涤液是指除去吸附在硅胶膜表面的蛋白质、脂质以及盐等杂质成分的一种缓冲液。本发明提供了两种洗涤液的配方，分别适用于2步法和3步法。

适用于2步法的洗涤液中包含洗涤液I、洗涤液II，其中，洗涤液I中包含一定浓度(例如1.0M～2.5M)的异硫氰酸胍，20～60％(例如20％，25％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，45％，50％，55％，60％)乙醇，以及可选的一定浓度(例如1mM～20mM，1mM～15mM，5mM～15mM，8mM～12mM，10mM)Tris-HCl；洗涤液II中包含可选的一定浓度的(例如0.001M～0.05M，优选0.01M)Tris，可选的一定浓度的(例如0.01M～0.5M，优选0.1M)NaCl，以及60～90％(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％)乙醇。所述洗涤液I的pH值为6～7，可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0，优选是6.6。所述洗涤液II的pH值为7～8，可以是7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0，优选是7.5。

适用于3步法的洗涤液中不仅包含2步法洗涤液中的洗涤液I、洗涤液II，还包含洗涤液III，所述洗涤液III为90～100％(例如90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％，优选为100％)乙醇。

为防止乙醇的残留，本发明增加了在使用洗涤液后对核酸纯化硅胶膜位置处进行烘干的步骤，烘干的温度为60～100℃，优选70℃；烘干时间为1～5min，优选2min。

所述洗脱液是指低盐、高pH值的水溶液，当使用洗脱液时，由于硅胶膜的硅醇基团与DNA磷酸基团之间的静电排斥，硅胶膜释放核酸分子，从而进行核酸的洗脱。如本发明所用，所述洗脱液是一定浓度的(例如0.001M～0.05M，优选0.01M)Tris，洗脱液的pH值为7～9，可以是7、7.5、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0，优选是8.5。

所述逆转录和PCR扩增试剂是根据一步法RT-PCR反应提前预混的反应体系。本领域技术人员可以根据需要配制合适的反应体系，常见的反应体系中包含PCR Buffer、TrisHCl缓冲液、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgCl₂、dNTPs、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、UNG酶、核糖核酸酶抑制剂、引物和探针。

对于引物和探针，本发明中以呼吸道合胞病毒(HRSV)A型和B型的引物和探针为例，但并不意味着限制。本领域技术人员可以根据检测疾病种类的需要，选择特异性的引物和探针。可以检测的疾病种类包含但不限于：腺病毒(AdV)、人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、博卡病毒(BOV)、鼻病毒(RV)、HKU1病毒(HKU1)、NL63病毒(NL63)、SARS病毒(SARS)、副流感病毒1型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4)、猴痘病毒(MPXV)。

本领域技术人员可以对目标核酸序列进行广泛的病毒基因组序列比对分析，选定各种病毒的特异性序列，设计出针对相应基因片段的逆转录引物、PCR引物和特异性核酸探针。部分病毒，如腺病毒、博卡病毒，无需设计逆转录引物，这些都是本领域技术人员已知的。

如本发明所用，用于HRSV检测的引物和探针如SEQ ID NO:1～9所示。

具体的，所述引物对包含正向引物和反向引物。如本文所用，所述的“正向引物”(也称上游引物，Forward primer，F)是沿着负链进行不间断延长的。与之相对应的，“反向引物”(也称下游引物，Reverse primer，R)是沿着正链进行不间断延长的。如本文所用，所述的“逆转录引物”(Primer，P)是在逆转录反应，RNA逆转录为cDNA的过程中应用的引物。

本发明所提供的正向引物可以包含：

a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1、4、7所示的正向引物；或，

b)核苷酸序列与SEQ ID NO:1、4、7具有90％以上序列同一性且具有a)限定的功能的正向引物。

具体的，所述b)中的核苷酸序列具体指：如SEQ ID NO:1、4、7所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，或者在5’末端和/或3’末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，且具有核苷酸如SEQ ID NO:1、4、7所示的功能的正向引物。所述b)中的核苷酸序列可与SEQ IDNO:1具有90％、93％、95％、97％、或99％以上的同一性。

本发明所提供的反向引物可以包含：

c)核苷酸序列如SEQ ID NO:2、5、8所示的反向引物；或，

d)核苷酸序列与SEQ ID NO:2、5、8具有90％以上序列同一性且具有c)限定的功能的反向引物。

具体的，所述d)中的核苷酸序列具体指：如SEQ ID NO:2、5、8所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸或标签而得到的，或者在5’末端和/或3’末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸或标签而得到的，且具有核苷酸如SEQ ID NO:2、5、8所示的功能的反向引物。所述d)中的核苷酸序列可与SEQ ID NO:2、5、8具有90％、93％、95％、97％、或99％以上的同一性。

本发明所提供的探针可以包含：

e)核苷酸序列如SEQ ID NO:3、6、9所示的探针；或，

具体的，所述f)中的核苷酸序列具体指：如SEQ ID NO:3、6、9所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸或标签而得到的，或者在5’末端和/或3’末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸或标签而得到的，且具有核苷酸如SEQ ID NO:3、6、9所示的功能的探针。所述f)中的核苷酸序列可与SEQ ID NO:3、6、9具有90％、93％、95％、97％、或99％以上的同一性。

本发明的逆转录和PCR扩增试剂中还包含PCR增强剂。所述“PCR增强剂”是指增加所需PCR产物的产量或减少非特异性产物的试剂，根据用途的不同，可以分为用于扩增高GC含量或形成复杂二级结构模板的PCR增强剂，用于保护DNA聚合酶活性和稳定性的PCR增强剂，用于优化引物和模板结合的PCR增强剂。其中，用于扩增高GC含量或形成复杂二级结构模板的PCR增强剂包含但不限于：甜菜碱、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、甘油；用于保护DNA聚合酶活性和稳定性的PCR增强剂包含但不限于BSA、明胶、非离子型的去污剂；用于优化引物和模板结合的PCR增强剂包含但不限于：硫酸铵、氯化四甲胺。

如本发明所用，所述“PCR增强剂”是甜菜碱和二甲基亚砜(DMSO)的组合物。在所述组合物中，所述甜菜碱的终浓度为0.1～3M、0.5～3M、0.1～1.5M、0.5～1.5M、1.0～2M或1.0～1.5M，所述DMSO的含量(体积百分比)为3～20％、4～20％、5～15％、6～15％、7～15％、8～15％、3～10％、4～10％、5～10％、6～10％、7～10％或8～10％。

如本发明所用，术语“包含”或“包含”包含了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。术语“基本上由……构成”指在组合物中，除了包含甜菜碱和二甲基亚砜(DMSO)之外，还可包含少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。

如本发明所用，所述“组合物”包含“联用”，即，将甜菜碱和二甲基亚砜(DMSO)联合使用，包含同时、依次、先后使用。

本发明的检测方法

本发明提供了一种使用本发明的微流控芯片检测核酸样本(如病毒，具体例如呼吸道合胞假病毒)的方法。

本发明所述的方法包含：

(2)将样本溶液注入所述进液腔；

具体的，可以分为2步法和3步法。

所述2步法的检测方法在所述步骤(3)中包含2步对核酸吸附膜进行洗涤去除杂质的步骤：

步骤(A)：通过机械按压囊泡1使洗涤液Ⅰ进入核酸提取腔、对核酸吸附膜进行冲洗；

步骤(B)：通过机械按压囊泡2使洗涤液Ⅱ进入核酸提取腔、对核酸吸附膜进行冲洗；

其中，机械按压囊泡1和机械按压囊泡2位于所述微流控芯片上，分别装有洗涤液I和洗涤液II。

所述3步法的检测方法包含2步法中的所有步骤，在步骤(3)中还包含：步骤(C)和步骤(D)：

步骤(C)：通过机械按压囊泡3使洗涤液III进入核酸提取腔、对核酸吸附膜进行冲洗；

步骤(D)：针对核酸吸附膜进行烘干处理；烘干的温度70℃；烘干时间为2min；

其中，机械按压囊泡3位于所述微流控芯片上，装有洗涤液III。

也即，所述3步法的检测方法在所述步骤(3)中包含3步对核酸吸附膜进行洗涤去除杂质的步骤，分别为步骤(A)、步骤(B)、步骤(C)，还包括对核酸吸附膜进行烘干处理的步骤(D)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、本发明的全自动核酸提取用的微流控芯片和提取方法

1、本发明的微流控芯片

本发明的微流控芯片基于一步法RT-qPCR基本原理：临床样本经过微流控芯片内预包埋的核酸提取试剂提纯出总RNA后，在逆转录酶下逆转录成互补DNA(cDNA)。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应，通过荧光染料或荧光标记的具有特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，可以实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。一步法RT-qPCR中cDNA合成与PCR反应在同一缓冲液体系及酶中进行，因此，称为“一步法”。

本发明的微流控芯片以微流控芯片的形式呈现，微流控芯片中所有的试剂均以冻干状态包埋于微流控芯片的各个腔室内并且提前按照核酸提取、PCR扩增、扩增产物分析这几个步骤预设了各个腔室的位置，各个腔室之间具有转移腔，以便通过转移腔将腔室内的液体转移到其目标位置。微流控芯片的自动控制采用气动压力执行，微流控芯片内液体的混合利用超声振动进行混匀。本发明的微流控芯片的外壳上还设置有进气口，排气口，以及排气口空气过滤器。

本发明中所用试剂和材料均可商购获得，或可以通过商购获得的试剂配制获得。

(1)核酸提取试剂：

1)裂解液、结合液：

裂解液：2.5M异硫氰酸胍,10mM Tris-HCl，20-500mM乙二胺四乙酸，

0.5-5M尿素以及1-2％ Triton X-100，所述裂解液的pH为8.0-9.0。

结合液：70％乙醇。

2)洗涤液：包含洗涤液I、洗涤液II，其中，

洗涤液I:1.0M异硫氰酸胍，10mM Tris-HCl，37％乙醇，pH6.6。

洗涤液II：Tris 0.01M，NaCl 0.1M，70％乙醇，pH7.5。

本发明新增洗涤液III：100％乙醇；同时新增步骤：在使用洗涤液III后对核酸纯化硅胶膜位置处进行烘干70℃，2min。

3)洗脱液：Tris 0.01M，pH8.5。

4)核酸吸附膜：是能吸附核酸的膜，本发明中使用的是核酸硅胶膜(Silicamembrane)。

(2)逆转录和PCR扩增试剂体系：

本发明所述逆转录试剂、PCR扩增试剂、引物探针均以冻干状态分别包埋于微流控芯片的相应腔室内，预混的RT-PCR反应体系包含：PCR Buffer(10×)、包含30mM Tris HCl缓冲液(pH8.3)、50mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、2.5mM MgCl₂、0.2mM dNTPs、8U/反应的M-MLV逆转录酶、2.3U/反应的热启动Taq DNA聚合酶、0.4U/反应的UNG酶以及16U/反应的核糖核酸酶抑制剂、引物探针。

本实施例中以呼吸道合胞病毒(HRSV)A型和B型的引物探针为例，但并不意味着限制。本领域技术人员可以根据检测疾病种类的需要，选择特异性的引物探针。

本实施例中以呼吸道合胞病毒(HRSV)A型和B型的引物探针为例，但并不意味着限制。本领域技术人员可以根据检测疾病种类的需要，选择特异性的引物探针。查找和比对若干条呼吸道合胞病毒(HRSV)A型和B型的RNA序列，对选择的呼吸道合胞病毒核壳体蛋白(Nucleocapsid protein,N)的高度保守区域用于HRSV检测引物探针的设计。引物探针如下：

SEQ ID NO:1HRSV-A-F 5'-GTGGCAGTAGAGTTGAAGGGAT-3'

SEQ ID NO:2HRSV-A-R 5'-TGATTTTGCTAAGACTCCCCAC-3'

SEQ ID NO:3HRSV-A-P 5'-ATGAATGCCTATGGTGCAGGGCAA-3'

SEQ ID NO:4HRSV-B-F 5'-GCTTGACATCAGAAATACAAGTCA-3'

SEQ ID NO:5HRSV-B-R 5'-ATTACAAGTGCTGCTATACACAGT-3'

SEQ ID NO:6HRSV-B-P 5'-AGAGATGGGAGAAGTGGCTCCAGA-3'

SEQ ID NO:7SPC-F 5’-GAACTGGCGACGTGACTGT-3’

SEQ ID NO:8SPC-R 5’-TACTTTGTAAGCCTGTGAACGC-3’

SEQ ID NO:9SPC-P 5’-ATCCATTCAGCGACCCCGTTAGC-3’

F表示正向引物(Forward)，R表示反向引物(Reverse)，P表示探针(Probe)。

进一步，本发明的微流控芯片中还包含样本处理质控(SPC)，用于监测样本采集、提取过程的质量及监测PCR反应中是否存在抑制剂，从而实现在全封闭反应体系中对整个检测过程的监控，可有效监控假阴性的发生。本发明针对作为质控的非人源的人工合成的外源序列设计引物探针，质控引物序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8及相应的荧光探针SEQ ID NO:9。

本发明在反应体系中新增PCR增强剂，所述PCR增强剂为终浓度0.5-1.5M甜菜碱、5-10％ DMSO的混合试剂。

(3)扩增产物分析

用于本发明中的PCR扩增时使用的仪器为Day6 IO1800,PCR扩增时使用的分析软件为：IO1800全自动PCR分析仪软件。

2、本发明的提取方法

1)将包含呼吸道合胞假病毒样本与裂解结合液在微流控芯片外混合后注入微流控芯片进液腔；

2)注入微流控芯片进液腔的混合液体在注入的过程中流经包埋于微流控芯片内的核酸吸附膜，核酸吸附膜可以选择性吸附核酸片段，而蛋白质和其它杂质不会被吸附；

3)通过机械按压囊泡1使包含囊泡中的洗涤液Ⅰ对核酸吸附膜进行冲洗；

4)通过机械按压囊泡2使包含囊泡中的洗涤液Ⅱ对核酸吸附膜再次进行冲洗(2步法洗涤)；

注：2步法则跳过下述步骤5和步骤6。

5)通过机械按压囊泡3使包含囊泡中的洗涤液Ⅲ对核酸吸附膜再次进行冲洗，将残留的蛋白质，细胞碎片等杂质去除(3步法洗涤)；

6)针对核酸核酸吸附膜进行烘干处理，70℃，2min(3步法洗涤)；

7)最后用洗脱液将纯净的核酸从滤膜上洗脱下来，即可得到纯化后的核酸。

洗脱后的核酸通过机械压力进入PCR扩增试剂腔室，溶解预先包埋于内部的PCR试剂，在超声的作用下混匀后，分液到PCR反应腔内，进行PCR的扩增。

实施例2、本发明的微流控芯片中洗涤液的改进

针对核酸检测设备中存在的吸附于核酸纯化硅胶膜的核酸洗涤不够彻底，存在蛋白质、脂质以及盐等杂质成分，导致杂质含量偏高的问题，经过多次实验，发明人发现：该缺陷的主要问题出现在核酸纯化硅胶膜上吸附的盐成分清洗不干净。

因此，本发明改进了微流控芯片中的核酸提取纯化试剂，通过设计三种不同的洗涤液进行三次洗涤，同时采用升温的方式对核酸纯化硅胶膜上的酒精进行加热，促进酒精挥发，可以解决上述问题，提高核酸提取量和纯度。

发明人使用呼吸道合胞A型假病毒样本对采用2步法和3步法洗涤所获得的核酸提取量和纯度进行了对比，结果如表1所示，结果显示，使用3步法洗涤时，提取获得的核酸浓度更大(7.45：4.21)ng/ul，纯度更高(1.89：1.51)，后续进行PCR扩增时的CT值更小(22.25：25.55)。

表1本发明微流控芯片2步法与3步法的测试结果。

发明人使用呼吸道合胞A型假病毒样本对3步法洗涤时使用的洗涤液III乙醇的不同浓度(50％、80％、100％)进行了对比，结果如表2所示。结果显示，使用50％～100％浓度的乙醇，相比于2步法，均能够获得更高浓度的核酸，纯度更高，后续进行PCR扩增时的CT值更小；其中，当洗涤液III乙醇的浓度为100％时效果最好。

表2本发明微流控芯片中样本在不同浓度乙醇的洗涤液III中测试结果

实施例3、本发明的微流控芯片中PCR扩增试剂的改进

针对核酸检测方法中，当待扩增的模板非常复杂，或引物浓度极低时，无法扩增出所有目标特异性产物，出现假阴性结果的问题，发明人经过长期而深入的研究，发现通过在聚合酶链式反应体系中添加特定种类和特定含量的PCR增强剂，与其他的PCR扩增反应成分一起以冻干的状态包埋于微流控芯片上的PCR试剂腔内，在PCR扩增过程中可以显著增强多重PCR特异性产物的扩增效果。

下述以呼吸道合胞病毒检测中使用甜菜碱和DMSO的组合作为PCR增强剂为例，用以说明PCR增强剂在解决上述技术问题中的效果。需要说明的是，本实施例中使用的PCR增强剂以甜菜碱和DMSO的组合为例，但并不意味着限制。本领域技术人员可以根据需要，选择合适的PCR增强剂。

所述PCR增强剂能够促进某些“引物-模板”退火，降低带有二级结构的DNA的变性温度，同时可以减少PCR反应中引物二聚体的形成，特别是能减少多重PCR反应体系中引物二聚体的形成，从而抑制非特异性产物的产生，增强特异性产物的扩增效率，即使待扩增的模板为非常复杂的模板，也可以在极低的引物浓度下成功扩增出所有目标特异性产物,另外该扩增增强剂能够增强基于微流控芯片的核酸扩增反应中荧光染料的信号强度，提高荧光染料作为扩增指示剂在微流控芯片上应用的可靠性。

1、样本处理

分别取含有呼吸道合胞病毒A和B型的中阳性混合假病毒样本，浓度为3*10^4Tu/ml，以及弱阳性混合假病毒样本，浓度为3*10^2Tu/ml各50μl，每个样本中加入终浓度为9*10^3Tu/ml的SPC，依次加入125ul的裂解液和125ul的结合液，剧烈涡旋，得到待测预处理物。预包埋于微流控芯片PCR扩增腔内的PCR扩增试剂分别按照表3所述的体系加工成冻干状态。其中，预混RT-PCR反应体系为实施例1(2)中的预混RT-PCR反应体系，1x表示不稀释。

表3PCR扩增试剂体系

2、样本检测

将待测预处理样本载入微流控芯片，将微流控芯片放入IO1800 PCR扩增仪后，仪器会自动执行以下检测步骤：

A.核酸的纯化

B.将经过纯化的核酸与冻干的PCR扩增试剂混合

C.将定义的洗脱/预混液等份转移到不同的反应室

D.在每个反应室中进行实时的多重RT-PCR反应，RT-PCR反应程序如表4所示。

提示：如果检测到目标分析物，则会在每个反应室中直接检测到荧光增加，其中HRSV-A(呼吸道合胞A型病毒)对应FAM荧光通道，HRSV-B(呼吸道合胞B型病毒)对应CY5荧光通道，质控(SPC)对应HEX荧光通道，检测靶标和荧光通道的对应关系如表5所示。

表4RT-PCR反应程序

表5检测靶标和对应的荧光通道

反应结束后，根据扩增曲线，得到不同通道的Ct值。SPC样本可以监测RT-PCR反应中与样本相关抑制作用。SPC在阴性样本中应为阳性；而在阳性样本中可为阴性或阳性。

1.质控标准：SPC在阴性样本中，HEX通道检测Ct值≤35.0时，则判断SPC为阳性。

2.呼吸道合胞病毒A型阳性判断：FAM通道检测Ct值≤38.0时，则判断该样本为呼吸道合胞病毒A型RNA阳性。

3.呼吸道合胞病毒B型阳性判断：CY5通道检测Ct值≤38.0时，则判断该样本为呼吸道合胞病毒B型RNA阳性。

添加终浓度为1.5M甜菜碱的体系1，添加终浓度为10％ DMSO的体系2，添加终浓度为1.5M甜菜碱、10％ DMSO的体系3以及未添加甜菜碱和DMSO的对照组，RT-PCR检测的Ct值结果如表6所示，中阳性样本中合胞病毒B型的扩增曲线如图2所示。

表6中阳性、弱阳性混合样本中体系1、2、3和对照组RT-PCR反应Ct值

从表6的Ct值上可以看出，添加终浓度为1.5M甜菜碱、10％ DMSO的体系3，无论在中阳性混合样本中还是弱阳性混合样本中，均能正确检出阳性结果，且体系3的Ct值显著小于未添加甜菜碱和DMSO的对照组。

从如图2所示的扩增曲线分析，添加终浓度为1.5M甜菜碱、10％ DMSO的体系3，扩增曲线平台期对应的荧光信号值显著高于未添加甜菜碱和DMSO的对照组，也高于单独的1.5M甜菜碱组、单独的10％DMSO组。说明，当甜菜碱与DMSO组合时，产生了协同的PCR增强效果。

接下来，发明人对甜菜碱与DMSO组合的浓度进行了探究，取来源于浓度为3*10^3Tu/ml的呼吸道合胞病毒A和B型的混合假病毒样本50μl，样本中加入终浓度为9*10^3Tu/ml的SPC，依次加入125ul的裂解液和125ul的结合液，剧烈涡旋，得到待测预处理物。预包埋于微流控芯片PCR扩增腔内的PCR扩增试剂分别按照表7所述的体系加工成冻干状态。其中，预混RT-PCR反应体系为实施例1(2)中的预混RT-PCR反应体系，1x表示不稀释。其他方法和步骤与实施例3的1、2部分类似。RT-PCR检测的合胞病毒B型的扩增曲线如图3所示。

表7PCR扩增试剂体系

从如图3所示的扩增曲线分析，添加终浓度为1.5M甜菜碱、10％ DMSO的反应体系，扩增曲线平台期对应的荧光信号值高于添加终浓度为0.5M甜菜碱、5％ DMSO的反应体系以及添加终浓度为1.0M甜菜碱、8％ DMSO的反应体系。说明，终浓度为1.5M甜菜碱、10％ DMSO的体系6的PCR增强效果更好。

综合Ct值和图2-3所示扩增曲线的结果可以看出，终浓度为0.5-1.5M甜菜碱、5-10％DMSO的PCR增强剂，可以增强DNA聚合酶、引物和模板的结合，增加PCR特异性扩增，同时可在基于微流控芯片的应用上增强核酸扩增反应中荧光染料的信号强度，提高荧光染料作为核酸扩增反应指示剂在微流控芯片上应用的可靠性，避免假阴性结果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims

1.一种基于微流控芯片的全自动核酸提取、多重聚合酶链式反应的快速检测方法，所述方法包含：

(2)将样本溶液注入所述进液腔；

其中，所述预混的RT-PCR反应体系包括逆转录试剂、扩增试剂、PCR增强剂、引物；可选地还包括探针；所述PCR增强剂是甜菜碱和二甲基亚砜的组合物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述洗涤核酸吸附膜包括采用洗涤液I和洗涤液II洗涤；

其中，所述洗涤液I中包含：1.0M～2.5M的异硫氰酸胍；20～60％乙醇；以及，1mM～20mM的Tris-HCl；较佳地，所述洗涤液I的pH值为6～7；

其中，所述洗涤液II中包含：0.001M～0.05M的Tris，和0.01M～0.5M的NaCl，以及60～90％的乙醇；较佳地，所述洗涤液II的pH值为7～8；

较佳地，步骤(3)中，所述洗涤核酸吸附膜还包括采用洗涤液III洗涤；所述洗涤液III为90～100％的乙醇；

较佳地，所述微流控芯片上包括机械按压囊泡1和机械按压囊泡2，分别装有洗涤液I和洗涤液II，先通过机械按压囊泡1使洗涤液Ⅰ进入核酸提取腔、对核酸吸附膜进行冲洗，再通过机械按压囊泡2使洗涤液Ⅱ进入核酸提取腔、对核酸吸附膜进行冲洗；

较佳地，所述微流控芯片上包括机械按压囊泡3，装有洗涤液III，通过机械按压囊泡3使洗涤液ⅠII进入核酸提取腔、对核酸吸附膜进行冲洗。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，洗涤核酸吸附膜后，还包括：针对核酸吸附膜进行烘干处理；优选烘干的温度为60～100℃，更优选70℃；优选烘干时间为1～5min，更优选2min；或

步骤(3)中，洗涤核酸吸附膜后，以洗脱液从核酸吸附膜洗脱核酸，所述洗脱液为含有0.001M～0.05M Tris、pH值为7～9的水溶液。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述甜菜碱的终浓度为0.5～3M，所述二甲基亚砜的含量为5～20％；优选所述甜菜碱的终浓度为1.0～2.5M，所述二甲基亚砜的含量为5～15％。

5.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述的样本为来自病原体的核酸样本或含有病原体核酸的样本；可选地，所述的样本为来自病毒的核酸样本或含有病毒核酸的样本；可选地，所述病毒为腺病毒、人偏肺病毒、流感病毒A型、流感病毒B型、呼吸道合胞病毒、博卡病毒、鼻病毒、HKU1病毒、NL63病毒、SARS病毒、副流感病毒1型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、副流感病毒IV型、猴痘病毒；

优选所述病毒为呼吸道合胞病毒A型、B型；

更优选所述病毒的正向引物包含：

a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1、4、7所示的正向引物；或，

所述病毒的反向引物包含：

c)核苷酸序列如SEQ ID NO:2、5、8所示的反向引物；或，

所述病毒的探针包含：

e)核苷酸序列如SEQ ID NO:3、6、9所示的探针；或，

f)核苷酸序列与SEQ ID NO:3、6、9具有90％以上序列同一性且具有c)限定的功能的探针；

和/或，步骤(4)之后，还包括对PCR产物进行分析的步骤，以确定所述扩增产物的存在情况或存在量。

6.一种PCR增强剂，其特征在于，所述PCR增强剂是甜菜碱和二甲基亚砜的组合物；

优选所述甜菜碱的终浓度为0.5～3M，所述二甲基亚砜的含量为5～20％；

更优选所述甜菜碱的终浓度为1.0～2.5M，所述二甲基亚砜的含量为5～15％。

7.如权利要求6所述的PCR增强剂的用途，用于增加PCR扩增反应中所需PCR产物的产量，和/或减少PCR扩增反应中的非特异性产物。

8.一种用于核酸提取的洗涤液，其特征在于，所述洗涤液包含洗涤液I和洗涤液II；

其中所述洗涤液I中包含：

1.0M～2.5M的异硫氰酸胍；

所述洗涤液II中包含：

0.001M～0.05M的Tris，优选0.01M的Tris；

0.01M～0.5M的NaCl，优选0.1M的NaCl；以及

60～90％的乙醇，优选60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％的乙醇；

较佳地，所述洗涤液I的pH值为6～7，优选是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0，更优选是6.6；所述洗涤液II的pH值为7～8，优选是7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0，更优选是7.5；

较佳地，所述洗涤液还包含洗涤液III，所述洗涤液III为90～100％的乙醇，优选为90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的乙醇。

9.一种微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括：进液腔、核酸提取腔、PCR扩增试剂腔、PCR反应腔；

所述进液腔用于注入或存储样本溶液；

所述PCR扩增试剂腔用于存储预混的RT-PCR反应体系；所述预混的RT-PCR反应体系包括逆转录试剂、扩增试剂、PCR增强剂、引物；可选地还包括探针；所述PCR增强剂是甜菜碱和二甲基亚砜的组合物；

所述PCR反应腔用于进行逆转录及PCR扩增；

较佳地，所述微流控芯片还包括：囊泡1、其中装有洗涤液I，囊泡II、其中装有洗涤液II；可选的，还包括：囊泡III，其中装有洗涤液III；

较佳地，所述微流控芯片还包括：洗脱液，用于从核酸吸附膜洗脱核酸。

10.一种试剂盒，其包含如权利要求6所述的PCR增强剂，和/或如权利要求9所述的洗涤液；

较佳地，所述试剂盒中还包含(a)样本处理质控，用于监测PCR扩增反应；更佳的，所述样本处理质控包括引物、探针；可选的，所述引物、探针被整合于所述微流控芯片的PCR扩增试剂腔；

较佳地，所述试剂盒中还包含(b)核酸吸附膜；

较佳地，所述试剂盒中还包含(c)预混的RT-PCR反应体系；更佳地，所述预混的RT-PCR反应体系包括逆转录试剂、扩增试剂、PCR增强剂、引物；可选地还包括探针；

较佳地，所述试剂盒中还包含(d)核酸洗脱液；

较佳地，所述试剂盒含有微流控芯片；更佳地所述芯片有多个腔或囊泡，所述PCR增强剂、洗涤液以及(a)-(d)的试剂被整合于所述微流控芯片的腔或囊泡中。