CN1901939A - 利用反义iap寡聚物和化疗剂治疗增生性疾病 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了针对XIAP，HIAP－1或HIAP－2的反义寡聚物和化疗剂，以及包含它们的组合物和试剂盒用于治疗增生性疾病的用途。

Description

利用反义IAP寡聚物和化疗剂治疗增生性疾病
发明背景
本发明涉及癌症及其它增生性疾病的治疗。
一种细胞死亡的方式被称为凋亡，或程序性细胞死亡。凋亡通常是发育和维持健康组织的正常部分。这一过程可能发生的很快，以至于难以检测到。
现在已经知道凋亡路径在胚胎发育，病毒致病，癌症，自身免疫紊乱，神经变性疾病和其它疾病中起关键性的作用。凋亡反应衰竭牵涉到癌症，自身免疫紊乱，例如红斑狼疮和多发性硬化的发展和病毒感染，其中病毒感染包括那些与疱疹病毒，痘病毒和腺病毒相关的病毒感染。
近年来，凋亡在癌症中的重要性已经变得明朗。在二十世纪七十年代后期促生长致癌基因的鉴定引起了对细胞增殖几乎普遍的聚焦关注，使细胞增殖支配癌症生物学研究多年。长期存在的信条一直认为，抗癌症治疗应优先靶向相对于”正常细胞″的快速分裂的癌细胞。这种解释并不全然令人满意，因为一些生长迟缓的肿瘤容易治疗，而许多快速分裂的肿瘤类型却对抗癌治疗具有极强的抵抗力。现在癌症领域的发展已经通向了癌症生物学的新模式，在新模式中认为不能执行正常路径的程序性细胞死亡导致了肿瘤形成。正常细胞可以通过各种生长因子从邻近细胞接受连续的反馈，当从该环境中移出时，正常细胞会″自杀″。由于某种原因，癌细胞会忽视这些命令，继续不适当的增殖。现在相信许多癌症治疗，包括放疗和许多以前认为通过使细胞受损起作用的化疗，实际上是通过触发凋亡起作用。
虽然这种抗性的决定因素现在仍在调查中，但正常细胞类型和癌细胞类型都显示出对凋亡触发信号广泛的敏感性。许多正常细胞对半数致死剂(sub-lethal)量的放射线或细胞毒性化学制剂的反应是出现暂时的生长延滞，而附近的癌细胞此时则会发生凋亡。在给定剂量出现的差异效果为成功的抗癌治疗提供了决定性的治疗窗。因此，肿瘤细胞对凋亡的抗性以癌症治疗失败的主要原因出现并不令人惊讶。
已经鉴定了几种有效的能抑制凋亡的内源性蛋白质，包括哺乳动物中的Bcl-2和IAP蛋白家族。IAP家族的某些成员可直接抑制终末效应器——胱冬酶(caspases)，即参与执行细胞死亡的casp-3和casp-7，以及关键的线粒体起始胱冬酶——casp-9，casp-9对介导癌症化疗诱导的细胞死亡很重要。IAPs是唯一已知的内源胱冬酶抑制剂，因此在调节凋亡中起重要作用。
已经假设IAPs促进了一些癌症的发展，而且在MALT淋巴瘤中已经鉴定出涉及一个特别IAP(cIAP2/HIAP1)的假设的表示原因的染色体易位。近来在患有急性髓性白血病的患者中已经显示升高的XIAP，预后差和存活时间短之间存在相关性。而且，XIAP在NCI小组的许多肿瘤细胞系中都呈高度过量表达。
因此，需要改进的癌症治疗方法，特别是那些能够诱导癌细胞发生凋亡，并不考虑这种细胞中提供的抗凋亡信号的治疗方法。
发明概述
通常，本发明描述了有用的诱导细胞内凋亡的方法。本发明的方法在治疗癌症及其它增生性疾病方面有用。
本发明描述了一种通过施用反义IAP核碱基(nucleobase)寡聚物和化疗剂治疗患有增生性疾病，例如癌症的患者的方法。可同时或在彼此相距28天内施用(例如，在21天内，14天内，7天内，1天内或1小时内)化疗剂和反义IAP核碱基寡聚物，施用的总量足以治疗患者。反义IAP核碱基寡聚物会减少产生的IAP蛋白的量，使通常表达IAP的细胞发生凋亡。通过提供特定地与一种或多种编码IAP的多核苷酸杂交的核碱基寡聚物就可以实现这一点。核碱基寡聚物与IAP多核苷酸(例如RNA，DNA)的特异性杂交会干扰IAP多核苷酸的正常功能，因此会降低产生的IAP蛋白的量。通过特定地与靶目标杂交调整靶核酸功能的核酸分子一般被称为″反义治疗分子″。
可以使用任何能降低IAP表达水平的反义IAP核碱基寡聚物，一方面，核碱基寡聚物长度为八到三十个碱基，并包括选自SEQ ID NOs：1-99，143，147，151，163-260，287，289和300-460的序列的至少八个连续碱基。
在某些实施例中，核碱基寡聚物包括选自SEQ ID NOs：1-99，143，147，151，163-260，287，289和300-460的序列核碱基寡聚物。希望是由上述的一个或多个SEQ ID NOs.组成(或基本由其组成)。例如，核碱基寡聚物可以包括选自SEQ ID NOs 97，98，99，143，147，151，287和289，SEQ IDNOs 300-389，或SEQ ID NOs 390-460的序列。在一个特别合乎需要的实施例中，本发明描述了具有十一个DNA残基的核碱基寡聚物，其中在DNA残基两侧都侧接了四个2′-O-甲基RNA残基，核碱基寡聚物由下列序列中的一个组成：5′-AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3′(SEQ ID NO：155)；5′-ACACGACCGCTAAGAAACA-3′(SEQ ID NO：16)；5′-ACAGGACTACCACTTGGAA-3′(SEQ ID NO：157)；5′-UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3′(SEQ ID NO：27)；5′-GCUGAGTCTCCATATUGCC-3′(SEQ ID NO：141)；5′-UCGGGTATATGGTGTCUGA-3′(SEQ ID NO：41)；5′-AAGC ACTGCACTTGGUCAC-3′(SEQ ID NO：47)；5′-CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3′(SEQ ID NO：51)；5′-ACCCTGGATACCATTUAGC-3′(SEQ ID NO：63)；5′-UGUCAGTACATGTTGGCUC-3′(SEQ ID NO：161)和5′-UGCACCCTGGATACCAUUU-3′(SEQ ID NO：151)。
在另一个实施例中，反义IAP核碱基寡聚物的长度可达30碱基，并包括选自SEQ ID NOs：461-490的序列的至少八个连续碱基。
能够与化疗剂结合施用的其它反义IAP核碱基寡聚物是那些在高严谨条件下能与编码IAP多肽的多核苷酸杂交的寡聚物，其中IAP多肽选自NAIP(Bircl)，HIAP1(cIAP2，API2，MIHC，hITA)，HIAP2(cIAP1，MIHB)，XIAP(hILP，hILP1，MIHA，API3)，存活蛋白(survivin)(TIAP，MIHD，API4)，livin(KIAP，ML-IAP，cIAP3，HIAP3)和hILP2(Ts-IAP，TIAP)。
在本发明的方法中使用的核碱基寡聚物可以包括至少一个修饰键(例如硫代磷酸酯，磷酸甲酯，磷酸三酯，二硫代磷酸酯或phosphoselenate连接)，修饰的碱基(例如5-甲基胞嘧啶)，和/或修饰的糖部分(例如2′-氧-甲氧乙基或2′-氧-甲基)。在一个实施方案中，寡聚物是嵌和寡聚物(例如，包含通过硫磷酰或磷酸二酯键连接在一起的DNA残基的寡核苷酸，其中DNA残基的两侧都侧接了至少一个，两个，三个或四个通过硫磷酰连接在一起的2′-氧-甲基RNA残基)。
另一个方面，本发明描述了增强细胞内凋亡的方法。这些方法包括同时或在彼此相距28天内给细胞施用反义IAP核碱基寡聚物和化疗剂的步骤，施用的总量足以增强凋亡。细胞可以在体外(ex vivo)或在活体内。在一个实施方案中，细胞是癌细胞(例如人癌细胞)，淋巴或骨髓来源的细胞。
癌症可以是，例如：急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、骨髓发育不良综合征、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、何杰金(Hodgkin’s)病、Waldenstrom氏巨球蛋白血症、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、Wilm氏瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑(脊)膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤或成视网膜细胞瘤。治疗癌症时，同时也施用一种或多种另外的化疗剂，生物效应调节剂和/或化学致敏剂是可取的。希望的情形是施用核碱基寡聚物的28天内施用一种或多种这些制剂。
可以通过相同或不同的途径来施用化疗剂和核碱基寡聚物。可以使用任何能使目的位点药物达到有效量的给药途径，特别可取的途径是静脉内施用和瘤内施用。
另一方面，本发明描述了包括化疗剂和反义IAP核碱基寡聚物的药物组合物，其中化疗剂和反义IAP核碱基寡聚物的总量加在一起足以治疗患有增生性疾病(例如癌症)的患者。如果需要，药物组合物可以更进一步地包括另外的组分(例如：胶态分散系统)。
本发明也描述了通过给患者施用化疗剂和催化RNA分子，或编码这种催化RNA分子的表达载体来治疗患有增生性疾病，例如患有癌症，淋巴组织增生紊乱的患者的方法，其中化疗剂和催化RNA分子可同时施用，或在彼此相距28天内施用，它们的总量加在一起足以治疗患者。在可取的实施例中，催化RNA分子包括，在其结合臂中，至少八个连续的相当于反义IAP核碱基寡聚物的碱基(例如表2，3，7，8和9中的任何一个的碱基序列)。希望的RNA分子可以位于锤头状基序中，也可以位于发夹结构，δ肝炎病毒，组I内含子，VS RNA或RNaseP RNA基序中。
本发明也描述了通过给患者施用化疗剂和具有21--29个核碱基的双链RNA分子来治疗患有癌症或淋巴组织增生紊乱的患者的方法，其中至少八个连续的核碱基相当于反义IAP核碱基寡聚物(例如表2，3，7，8和9中的任何一个的碱基序列)。可同时或在彼此相距28天内施用化疗剂和双链RNA分子，使用的总量加在一起足以治疗患者。
另一方面，本发明也描述了通过给患者施用化疗剂和具有50--70个碱基的双链RNA分子来治疗患有癌症或淋巴组织增生紊乱的患者的方法，其中RNA分子具有一个长度为21--29个碱基的第一域，碱基包含相当于反义IAP核碱基寡聚物(例如表2，3，7，8和9中的任何一个的碱基序列)的至少八个连续的核碱基；与第一域互补的第二域以及位于第一域和第二域之间，使第一域和第二域能形成双链RNA分子的环状域。可同时或在彼此相距28天内施用化疗剂和双链RNA分子，施用的总量加在一起足以治疗患者。
本发明也描述了几种试剂盒。这种试剂盒包括(i)长度为八到三十个核碱基之间的反义IAP核碱基寡聚物；(ii)化疗剂；和(iii)给患有增生性疾病的患者施用化疗剂和反义IAP核碱基寡聚物的说明书，其中化疗剂和反义IAP核碱基寡聚物的总量加在一起足以治疗增生性疾病。
本发明的另一个试剂盒包括(i)长度为八到三十个碱基之间的反义IAP核碱基寡聚物；(ii)给患有增生性疾病的患者施用化疗剂和反义IAP核碱基寡聚物的说明书，其中化疗剂和反义IAP核碱基寡聚物的的总量加在一起足以治疗增生性疾病。
然而本发明的另一个试剂盒包括(i)本发明的组合物(如上所述)；(ii)给患有增生性疾病的患者施用组合物的说明书，其中组合物的量足以治疗增生性疾病。
″核碱基寡聚物″指包括至少八个通过连接基团连接在一起的核碱基形成的链的化合物。天然和非天然的寡核苷酸，修饰或未修饰的，以及寡核苷酸模拟物，例如肽核酸(PNA)，锁核酸(locked nucleic acids)(LNA)和阿拉伯核酸(arabinonucleic acid)(ANA)都包括在该定义的范围内。在本发明的核碱基寡聚物中可以使用多种核碱基和连接基团，包括下文标题为″寡核苷酸及其它核碱基寡聚物″的部分中详细描述那些核碱基和连接基团。
″蛋白质″或″多肽″或″多肽片段″指不论是否发生了翻译后修饰(例如糖基化作用或磷酸化作用)的任何超过两个氨基酸的链，它构成天然多肽或肽的全部或一部分，或者构成非天然多肽或肽。
凋亡指细胞死亡的过程，在该过程中，濒死细胞显示出一组容易表征的生物化学标志，包括细胞膜起泡，细胞体皱缩，染色质凝缩和DNA梯状条带(laddering)。
″IAP基因″指具有至少一个BIR域，通过其它胞内或胞外递送方法供给时能调整(抑制或增强)细胞或组织凋亡的多肽的编码基因(例如，参见美国专利No.5,919,912)。在优选实施例中，IAP基因是与人或鼠XIAP，HIAP1或HIAP2(美国专利No.6,156,535中对每一个都进行了描述)中的至少一个具有大约50％或更高核苷酸序列同一性(例如至少85％，90％或95％)的基因。优选的测定同一性的序列区域是编码至少一个BIR域和锌指域的区域。哺乳动物IAP基因包括分离自任何来源的哺乳动物的核苷酸序列。优选的哺乳动物是人。
″IAP蛋白″或″IAP多肽″指IAP基因编码的多肽或其片段。IAP多肽包括NAIP(Bircl)，HIAP1(cIAP2，API2，MIHC，hITA)，HIAP2(cIAP1，MIHB)，XIAP(hILP，hILP1，MIHA，API3)，存活蛋白(survivin)(TIAP，MIHD，API4)，livin(KIAP，ML-IAP，cIAP3HIAP3)和hILP2(Ts-IAP，TIAP)。
″IAP生物活性″指IAP多肽在体内或体外产生的任何活性。
″增强凋亡″指增加给定的细胞群体(例如癌细胞、淋巴细胞、成纤维细胞，或任何其它细胞)中发生凋亡的细胞的数量。应理解在一个给定的测定方法中，增强凋亡的化合物产生的凋亡增强程度会发生变化，但本领域技术人员能够确定统计学上显著的凋亡水平变化，而该变化能鉴定出IAP限制的能增强凋亡的其它核碱基寡聚物。优选地，″增强凋亡″指相对于未施用本发明的核碱基寡聚物，但其它处理的方式实质上相似的情形，发生凋亡的细胞数目增加10％，更优选增加25％或更多，最优选增加至少一倍。监测的样品优选是那些通常凋亡不充分的细胞样品(即癌细胞)。这里描述了检测凋亡水平变化(即增强或减弱)的方法。
抑制靶基因(例如，IAP)表达的核碱基寡聚物指相对于未处理的对照组，能减少至少大约5％的靶mRNA的量或靶mRNA编码的蛋白质的量的寡聚物，更优选减少至少大约10％，25％，甚至50％。测量mRNA和蛋白水平的方法为本领域所熟知；在这里描述了示例性方法。
″杂交″指互补碱基之间的氢键连结，可以是Watson-Crick，Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键连结。例如：腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢键形成配对的互补碱基。
″增生性疾病″指由于不适当的高水平细胞分裂，不适当的低水平凋亡或两者引起或导致的疾病。癌症是增生性疾病的一个实例，癌症的实例包括但不限于白血病(例如急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病(acutepromyelocytic leukemia)、急性髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(何杰金氏病，非何杰金氏病)、Waldenstrom氏巨球蛋白血症、重链疾病以及实体瘤，例如肉瘤和癌(如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌(pancreatic cancer)、乳腺癌(breastcancer)、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、Wilm氏瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑(脊)膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤或成视网膜细胞瘤)。淋巴组织增生紊乱也被认为是增生性疾病。
优选地，本发明的方法中使用的核碱基寡聚物存在于一般不经受足够凋亡的细胞中时能够增强凋亡和/或降低IAP mRNA或蛋白水平。相对于对照，增加量优选为至少10％，更优选为25％，最优选为1倍或1倍以上。本发明的方法中使用的合乎需要的核碱基寡聚物包括大约8--30个碱基。在某些实施方案中，至少八个连续的碱基来源于选自SEQ ID NOs：1-99，143，147，151，163-260，287，289，300-490的序列。本发明的核碱基寡聚物也可以包含，例如，与编码IAP多肽的多核苷酸互补的另外的20，40，60，85，120或更多个连续的碱基。核碱基寡聚物(或其一部分)可以包含修饰的骨架。硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，及其它修饰的骨架本领域已经公知。核碱基寡聚物也可以包含一个或多个非天然连接。
″患者″指任何动物(例如：人)。可以利用本发明的方法，组合物和试剂盒进行治疗的非人患者包括马、狗、猫、猪、山羊、兔子、仓鼠、猴子、豚鼠(guinea pigs)、大鼠、小鼠、蜥蜴(lizard)、蛇、羊、牛、鱼和鸟。
″化疗剂″指用来杀死癌细胞或减慢癌细胞生长的试剂。因此，细胞毒性剂和细胞生长抑制剂都被认为是化疗剂。示例性化疗剂有紫杉烷类(taxanes)(例如，紫杉醇、多西它赛(doxetaxel)、RPR109881A、SB-T-1213、SB-T-1250、SB-T-101187、BMS-275183、BRT 216、DJ-927、MAC-321、IDN5109和IDN5390)、长春花生物碱(vinca alkaloids)(例如，长春花新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、脱乙酰长春花碱(vindesine)、长春氟宁(vinflunine)、长春瑞滨(vinorelbine)和脱水长春碱(anhydrovinblastine))、多拉司它汀(dolastatins)(多拉司它汀-10、多拉司它汀-15、ILX651、T2T-1027、symplostatin1、symplostatin3和LU103793)、隐藻素(cryptophycins)(例如，隐藻素1和隐藻素52)、埃博霉素(epothilones)(例如，埃博霉素A、埃博霉素B、脱氧埃博霉素B和埃博霉素B内酰胺)、艾榴素(eleutherobin)、discodermolide、2-epi-discodermolide、2-des-methyldiscodermolide、5-hydroxymethyldiscodermolide、19-des-aminocarbonyldiscodermolide、9(13)-cyclodiscodermolide和laulimalide。其它的化疗剂列见下表1。
″生物效应调节剂″指能促进或恢复免疫系统抵抗病原体能力的试剂。一些，但不是全部的生物效应调节剂可以减慢癌细胞的生长，因此也被认为是化疗剂。生物效应调节剂的实例有干扰素(α，β，γ)、白细胞介素-2、利妥昔单抗(rituximab)和曲妥单抗(trastuzumab)。
″化学致敏剂″指使肿瘤细胞对化疗效应更敏感的试剂。
″淋巴组织增生紊乱″指淋巴系统的细胞(例如，T细胞和B细胞)出现异常增殖的紊乱。
″核酶″指具有酶活性，对靶RNA分子具有位点特异性和切割能力的RNA。核酶可用于降低多肽的表达。例如Turner et al(Adv.Exp.Med.Biol.465：303-318，2000)和Norris et al(Adv.Exp.Med.Biol.465：293-301，2000)描述了利用核酶降低多肽表达的方法。
″报告基因″指编码表达可以被测定的多肽的基因；这种多肽包括但不限于葡糖醛酸酶(GUS)、荧光素酶、氯霉素转乙酰酶(CAT)和β-半乳糖苷酶。
″启动子″指足以指导转录的多核苷酸。
″操作性连接″指当适当的分子(例如，转录活化蛋白质)连接到第二多核苷酸上时，第一多核苷酸靠近指导第一多核苷酸转录的第二多核苷酸。
从下文中描述的优选实施例和权利要求书可以明显看出本发明的其它特征和优点。
附图简述
图1A-1L是显示相对于总蛋白，反义XIAP寡核苷酸对XIAP蛋白表达的影响的图(图1A、1C、1E、1G、1I和1K)。图1B、1D、1F、1H、1J和1L是显示与模拟转染结果相比较的，用于将上述XIAP蛋白质结果标准化的每一个寡核苷酸转染的总蛋白浓度值的图。
图2A-2C是显示单独或联合使用的各种反义XIAP寡核苷酸对XIAPRNA(图2A)和蛋白质(图2B)的影响的图。图2C是显示与模拟转染结果相比较的，用于将图2B中显示的XIAP蛋白质结果标准化的每一个寡核苷酸转染的总蛋白浓度值的图。
图3和4图是显示31nM(图3)或63nM(图4)的4x4混合骨架(MBO)FG8或E12寡核苷酸的影响的图。在一天，或连续两天或三天里用125nMMBOs和Lipofectamine 2000转染H460肺癌细胞18小时。在标明的时间处收集用于蛋白质印迹分析的样品。实施光密度扫描，参照GAPDH将XIAP蛋白水平标准化，并与设置为100％的模拟对照进行比较。标明的百分比表示相对于特异性混杂(scrambled)对照的XIAP蛋白质下降的百分比。
图5A-5D是显示反义XIAP寡核苷酸对细胞成活力的影响(图5A，5C和5D)，以及阿霉素(adriamycin)存在时的化学致敏作用的图(图5B)。
图6是显示寡核苷酸在体外介导H460细胞中特异性XIAP mRNA下调的图。图中描绘的是单独用Lipofectamine 2000(LFA)处理，或用Lipofectamine 2000与1.2O M(μM)的F3、G4、C5、AB6、DE4或D7一起，或用各自的反极性(RP)或混杂的(SC)寡核苷酸对照处理的H460细胞的XIAP mRNA水平。在转染6小时后实施实时RT-PCR，定量检测XIAPmRNA的相对量。显示的所有数据都是从典型实验中获得的三重数据的均数±标准差(SD)。在相同实验条件保持的未处理细胞(对照)中的XIAPmRNA水平被定为数值1。
图7是显示用各种的PS-XIAP寡核苷酸转染后的H460细胞中的XIAPRNA水平的图。用1uM的PS寡核苷酸和Lipofectamine 2000转染H460人肺癌细胞6小时。然后收集细胞进行Taqman分析。
图8是显示用4X4MBOs转染9小时后的H460细胞中的XIAP RNA水平的图。利用62.5nM至1uM的4X4MBOs和Lipofectamine 2000转染H460细胞9小时。然后收集细胞进行Taqman分析。
图9是显示用4X4MBOs转染24小时后的H460细胞中的XIAP蛋白质knockdown的图。用1uM的1uM 4X4MBOs和Lipofectamine 2000转染H460细胞24小时。然后收集细胞进行蛋白质印迹分析。实施光测密扫描，参照肌动蛋白将XIAP蛋白水平标准化，并与设置为100％的特异混杂(sm、rm)对照进行比较。
图10A和10B是显示反义寡核苷酸在体外介导H460细胞中的XIAP蛋白质特异性下调的简图。其中描述了用Lipofectamine 2000单独(LFA)处理的H460细胞，或者用LFA和1.2uM XIAP寡核苷酸F3，G4或C5，或它们各自的寡核苷酸对照(RP，SC)处理的H460细胞中的XIAP蛋白水平。采用免疫印迹来分析XIAP蛋白水平(图10A)，采用光密度法对蛋白质含量进行定量(图10B)。参照细胞的肌动蛋白水平将XIAP水平标准化，并与未处理的对照(CNT)水平进行比较。
图11A和11B是显示XIAP寡核苷酸介导的胱冬酶活化效应的简图。其中显示了与对照与相比，1.2uM的XIAP寡核苷酸F3，G4或C5，或它们各自的RP和SC ODN对照对转染的H460细胞中的前胱冬酶-3，PARP(全长(116kDa)和加工后的(85kDa))(图10A)的表达，以及Bcl-2和Bax蛋白水平(图10B)的影响。通过蛋白质印迹分析(western blotting)蛋白质的表达。参照细胞的肌动蛋白水平将Bcl-2和Bax蛋白水平标准化，并通过光密度法进行定量。用两个或三个独立实验的平均数来显示Bcl-2/Bax的比值，对照细胞(CNT)中的比值设置为1。
图12A和12B是显示XIAP寡核苷酸特异性诱导凋亡的简图。测量用1.2uM的XIAP G4 AS寡核苷酸，G4 SC寡核苷酸的处理的H460细胞或未处理的对照(CNT)中诱导的凋亡。图12A显示了用碘化丙啶(propidiumiodide)(PI)染色和流细胞计数法测定的具有亚-GO/Gl(凋亡的)DNA含量的细胞的百分比。图12B显示了DAPI染色的寡核苷酸处理的H460细胞的核形态学。箭头表示具有核DNA凝缩或断裂的特征性凋亡形态学的细胞。
图13A是显示XIAP G4 AS寡核苷酸处理对H460细胞成活力的影响的图。用浓度逐渐增加的单独的LFA，或LFA与G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸形成的寡核苷酸复合物处理细胞，在处理24小时后通过MTT法确定细胞成活力。数据代表三个独立实验的平均数±SD。
图13B是显示存在或不存在阿霉素(DOX)，紫杉酚，vinorelbine(VNB)或依托扑沙(Etoposide)(Etop)时，用0.4uM的LFA，以及LFA与G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸的复合物处理后通过MTT法测定的死亡的H460细胞的百分比的图。数据代表三个独立实验的平均数±SD。
图14是显示用XIAP AS 2x2 MBOs和长春瑞滨处理的小鼠体内H460肿瘤相对生长的图。对携带皮下H460细胞异种移植的SCID-RAG2小鼠实施瘤内注射寡核苷酸，剂量为50ug/g肿瘤质量。将这些治疗与施用长春瑞滨联合。
图15是显示用XIAP AS PS寡核苷酸进行全身治疗的小鼠体内平均H460细胞肿瘤大小的图。相对于对照，通过系统给药方式(I.P.)(腹膜内)给皮下植入了H460细胞异种移植物的SCID-RAG2小鼠施用XIAP AS PS寡核苷酸能降低肿瘤大小。
图16是显示用XIAP AS PS寡核苷酸进行全身治疗的小鼠体内的MDA-MB-435/LCC6人乳腺癌细胞(LCC细胞)肿瘤大小的图。相对于对照，通过系统给药方式(腹膜内)给乳房脂垫内植入了LCC6细胞异种移植物的雌性SCID-RAG2小鼠施用XIAP AS PS寡核苷酸能降低肿瘤大小。
图17是显示G4寡核苷酸对肿瘤生长和肿瘤XIAP蛋白水平的体内影响的简图。显示了系统施用的裸XIAP G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸对雄性SCID-RAG2小鼠体内皮下H460细胞异种移植物生长的抗肿瘤效力。所有数据用均数±SEM(n＝6只小鼠/组)表示。
图18A和18B是描述用G4 AS寡核苷酸，G4 SC寡核苷酸或单独的载体处理21天后，通过蛋白质印迹分析和光密度法定量获得的SCID-RAG2小鼠体内的H460肿瘤异种移植物中的XIAP蛋白质表达水平的简图。参照细胞肌动蛋白水平将XIAP水平标准化。所有数据用均数±SD(n＝3)表示。
图19A和19B显示系统施用15mg/kg的XIAP G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸21天后，G4寡核苷酸对植入到SCID-RAG2小鼠体内的H460肿瘤的病理组织学的体内影响的显微照片。图19A描绘了用苏木精和伊红染色的肿瘤切片。图19B是显示肿瘤切片中的泛素表达的免疫组织化学图片。显示了有代表性的肿瘤显微照片。内在的比例尺标记为100um。
图20A和20B是显示长春瑞滨(VNB)与XIAP寡核苷酸联合施用时，体内效力增强的图。在SCID-RAG2小鼠体内确定了有或没有XIAP G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸时，长春瑞滨对H460肿瘤异种移植物的抗肿瘤效力。图20A描述了单一试剂的抗肿瘤活性，图20B描述了VNB和G4寡核苷酸联合的抗肿瘤活性。用均数±SEM(n＝6只小鼠/组)表示所有数据。
图21是显示HIAP1寡核苷酸对HIAP1 RNA水平的影响的图。
图22A和22B是显示蛋白质印迹的密度计扫描的简图，该图显示了HIAP1寡核苷酸对细胞阻断放线菌酮诱导的HIAP1蛋白质上调的能力的影响。
图23是显示HIAP1寡核苷酸对细胞毒性影响的图，其中利用总蛋白来进行测定。
图24是显示验证HIAP1寡核苷酸APO 2序列特异性的图。
图25是显示HIAP1寡核苷酸化学致敏耐药SF295恶性胶质瘤的效应的图。
发明详述
本发明描述了通过联合施用本发明的碱基(nucleobase)寡聚物和化疗剂，例如细胞毒性剂，细胞生长抑制剂或生物效应调节剂来增强细胞凋亡的方法。希望的情形是同时或彼此相距28天内施用两种试剂。在某些实施方案中，化疗剂是破裂或稳定微管的试剂。例如：化疗剂可以是紫杉烷或长春花生物碱。如果需要，也可以施用化学致敏剂(即，使增殖细胞对化疗更敏感的试剂)。可以用上述试剂的任何组合来形成药物组合物。这些药物组合物可用来治疗增生性疾病，例如癌症或淋巴组织增生紊乱，或增生性疾病的症状。本发明的核碱基寡聚物/化疗剂组合也可以与放疗联合，用于治疗癌症或其它增生性疾病。
活化癌细胞的凋亡为改进患者对常规化疗或放疗的反应提供了可能有用的新途径。就直接抑制胱冬酶和凋亡的能力来说，XIAP是IAP基因家族中最有效的成员。我们通过反义(AS)寡核苷酸研究了XIAP下调对非小细胞肺癌(NCI-H460)体外和体内生长的影响。在培养的H460人肺癌细胞中，寡核苷酸G4 AS被确定为最有效的化合物，通过实时RT-PCR和蛋白质(western)印迹确定它能有效下调XIAP mRNA55％，下调蛋白水平达60％，浓度为1.2uM时能诱导60％的细胞死亡。相反，混杂的对照G4寡核苷酸几乎不能导致XIAP损失，引起的细胞死亡也不到10％。前胱冬酶-3和PARP蛋白质的降解，以及显著的核DNA凝缩和片断化已经显示用1.2uM的G4 AS处理可导致凋亡。而且，XIAP AS寡核苷酸可以使H460细胞对阿霉素，紫杉酚，长春瑞滨和依托扑沙的细胞毒性影响敏感。在动物模型中，我们证明通过腹腔内给药进行全身治疗时，15mg/kg的G4 AS对SCID/RAG2免疫缺陷小鼠的异种移植模型中的人H460肿瘤具有显著的序列特异性生长抑制效果。系统性施用AS ODN伴随着肿瘤异种移植物中XIAP蛋白质下调85％。将15mg/kg的G4 AS与5mg/kg的长春瑞滨结合能显著抑制肿瘤生长，效果超过单独施用一种试剂的效果。这些研究表明XIAP的下调是肺癌细胞的有效死亡信号，而且在体外能诱导凋亡，在体内能抑制肿瘤生长。这些研究支持IAPs是治疗人非小细胞肺癌和其它实体瘤的适宜靶标的观点。
治疗
可以在通常实施癌症治疗的任何地方：家里，医生的办公室，诊所，医院的门诊部或者医院来提供这种治疗。治疗通常从医院开始，这样以便医生能够密切观察治疗的效果，并作出任何必须的调整。治疗的持续时间取决于待治疗的癌症的种类，患者的年龄和状况，患者疾病的分期和类型，以及患者的身体对治疗的反应。可以以不同的间隔(例如每日，每周或每月)来给药。为了使患者的身体有构建健康新细胞和恢复体力的机会，可以采用包括间断期的断续周期来实施治疗。
依据癌症的种类和它的发展阶段，治疗可用于减慢癌症的扩散，减慢癌症的生长，杀死或延滞(arrest)已经从原发肿瘤处扩散到身体其它部分的癌细胞，减轻癌症引起的症状或防止癌症在第一位点出现。
这里使用的术语″癌症″或″赘生物″(neoplasm)或″赘生性细胞″指以异常方式增殖的细胞集合。癌症生长不受控制，而且呈进行性，在通常不引起或导致正常细胞增殖停止的情况下会发生。
为了给遭受细胞过度增殖引起的疾病折磨的患者施用化合物，可以利用常规的制药实践来提供适当的配方或组合物。可以在患者出现症状之前就开始给药。可以采用任何适当的途径来给药，例如：可以是肠胃外、静脉内、动脉内、皮下、瘤内、肌内、颅内、眶内、眼用、心室内、肝内、囊内、鞘内、脑池内(intracisternal)、腹膜内、鼻内、气溶胶、栓剂或口服给药。例如：治疗的剂型可以是液体溶液或悬浮液形式；口服剂型可以是用片剂或胶囊形式；鼻内剂型可以是粉剂、滴鼻剂或气溶胶形式。
例如在″Remington：The Science and Practice of Pharmacy″Ed.A.R.Gennaro，Lippincourt Williams & Wilkins，Philadelphia，PA，2000中已经找到本领域制造这些剂型的公知方法。例如肠胃外给药的剂型可以包含赋形剂，无菌水或盐水，聚二醇，例如聚乙二醇，植物油或氢化萘。也可以用生物相容性的可生物降解的丙交酯聚合物，丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物来控制化合物的释放。适合于IAP调节化合物的其它可能有用的肠胃外药物递送系统包括乙烯-醋酸乙烯共聚物颗粒，渗透泵，可植入的浸渍系统和脂质体。吸入剂的剂型可以包含赋形剂，例如，乳糖，或者是包含如聚氧乙烯-9-月桂基醚，甘油胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或者是适合以滴鼻剂或凝胶形式给药的油性溶液。
可以给病人施用治疗有效量(例如，防止，消除或者减少病理状况的量)的这些制剂来提供对疾病或状况的治疗。本发明的核碱基寡聚物的优选剂量可能取决于象紊乱的类型和程度，特殊患者的总体健康状态，化合物赋形剂的组成和给药途径这样的变量。
如上所述，如果愿意，可以将本发明的核碱基寡聚物治疗与治疗增生性疾病的治疗方法(例如：放疗、外科手术或化疗)联合使用。
上述的任何使用方法中都希望通过静脉内给药来施用本发明的核碱基寡聚物，或者将本发明的核碱基寡聚物应用到需要凋亡发生的位点(例如：通过注射)。
寡核苷酸及其它核碱基寡聚物
至少两种寡核苷酸：即具有磷酸二酯(PO)或硫代磷酸酯(PS)键的多聚脱氧核苷酸会导致RNase H切割RNA。虽然2′-OMe-RNA序列对RNA靶呈现出高亲合力，但这些序列不是RNase H的底物。可取的寡核苷酸是以包含寡聚脱氧核苷酸缺口的2′修饰寡核苷酸为基础的寡核苷酸，其中一些或全部核苷酸之间的键被改变为对核酸酶具有抗性的硫代磷酸酯。膦酸甲酯修饰的存在增加了寡核苷酸对靶RNA的亲合力，因此降低了IC50。这些修饰也增加了修饰的寡核苷酸对核酸酶的抗性。应当理解本发明的方法和试剂可以和任何可能发展的技术，包括共价闭合多反义(covalently-closedmultiple antisense)(CMAS)寡核苷酸(Moon et al.，Biochem J.346：295-303，2000；PCT公开号WO 00/61595)，带状反义(ribbon-type antisense)(RiAS)寡核苷酸(Moon et al.，J.Biol.Chem.275：4647-4653，2000；PCT公开号WO00/61595)和大量环状反义寡核苷酸(美国专利公开号US 2002/0168631 A1)联合使用。
本领域已经公知核苷是核碱基-糖结合物。核苷的碱基部分通常是杂环形碱基。这种杂环碱基中最普通的两类是嘌呤和嘧啶。核苷酸是进一步包括共价连接到核苷糖部分的磷酸基的核苷。对于那些包含五呋喃糖(pentofuranosyl sugar)的核苷，磷酸基可以连接到糖的2′，3′或5′羟基部分。在形成寡核苷酸时，磷酸基共价连接彼此相邻的核苷形成线形聚合物。线形聚合体结构的各个末端可以依次更进一步地连接在一起形成环状结构；通常优选开放的线形结构。通常认为磷酸基在寡核苷酸结构内部形成寡核苷酸骨架。RNA和DNA的正常连接或骨架是3′-5′磷酸二酯键。
在本发明中有用的优选核碱基寡聚物的具体实例包括含有修饰的骨架或非天然核苷间连接的寡核苷酸。在说明书中已经定义，具有修饰骨架的核碱基寡聚物包括那些在骨架中保留磷原子和那些在骨架中不含有磷原子的寡聚物。为了与说明书相符合，核苷间骨架中没有磷原子的修饰的寡核苷酸也被认为是核碱基寡聚物。
具有修饰的寡核苷酸骨架的核碱基寡聚物包括，例如：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯，氨烷基磷酸三酯、甲基及其它烷基磷酸盐，包括3′-烯基膦酸盐和手性膦酸盐、亚磷酸盐(phosphinate)、磷酰胺酯(phosphoramidate)，包括3′氨基磷酰胺酯(3′-aminophosphoramidate)和氨烷基磷酰胺酯(aminoalkylphosphoramidates)、硫羧磷酰胺酯(thionophosphoramidates)、硫羧烷基膦酸盐(thionoalkyphosphonates)、硫羧烷基磷酸三酯(thionoalkylhosphotriesters)、boranophosphates，其具有正常3′-5′键和它们的2′-5′连接类似物，以及具有相反极性的寡聚物，在具有相反极性的寡聚物中，采用3′-5′方向连接5′-3′方向或者2′-5′方向连接5′-2′方向的方式连接相邻的核苷单元对。也包括各种盐，混合盐和游离酸形式的核碱基寡聚物。教导如何制备上述含磷连接的典型的美国专利包括，但不限于美国专利3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361和5,625,050，在此将每一篇文献都引入作为参考。
具有修饰的不包含磷原子的寡核苷酸骨架的核碱基寡聚物具备由短链烷基或环烷基核苷间连接，混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接，或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接形成的骨架。这些包含那些具有吗啉代连接(在核苷的糖部分中形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；formacetyl和thioformacetyl骨架；methylene formacetyl和thioformacetyl骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸盐骨架；methyleneimino和methylenehydrazino骨架；磺酸盐和磺胺骨架；氨化物骨架；以及其它具有混合的N，O，S和CH2组成部分的骨架。教导如何制备上述寡核苷酸的典型的美国专利有美国专利：5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,521,063；5,506,337；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,677,439；5,698,685和6,365,577，在此将每一篇文献引入作为参考。
在其它的核碱基寡聚物中，糖和核苷间连接，即骨架都被新基团替换。保留碱基(nucleobase)单元用于和IAP杂交。一个这样的核碱基寡聚物被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含有酰胺的骨架替换，特别地被氨乙基甘氨酸(aminoethylglycine)骨架替换。保留了碱基，而且碱基可直接或间接地与骨架酰胺部分的aza氮原子结合。例如，在″Peptide Nucleic Acids：Protocols and Applications″Ed.P.E.Nielsen，HorizonPress，Norfolk，United Kingdom，1999中描述了制造和使用这些核碱基寡聚物的方法。教导如何制备PNAs的典型的美国专利包含，但不限于美国专利5,539,082；5,714,331和5,719,262，在此将每一篇文献引入作为参考。在Nielsen et al.，Science，1991，254，1497-1500中能找到对PNA化合物的更进一步的教导。
在本发明的特别实施例中，核碱基寡聚物具有硫代磷酸酯骨架和杂原子骨架核苷，特别是CH2-NH-O-CH2-，-CH2-N(CH3)-O-CH2-(被称为亚甲基(methylimino)或MMI骨架)，-CH2-O-N(CH3)-CH2-，-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-。在其它的实施例中，寡核苷酸具有美国专利5,034,506中描述的吗啉代骨架结构。
核碱基寡聚物也可能包含一个或多个取代的糖部分。核碱基寡聚物在2′位置包括下列中的一个：OH；F；O-，S-或N-烷基；O-，S-或N-烯基；O-，S-或N-炔基(alkynyl)；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可能是取代或未被取代的C1-C10的烷基或C2-C10的烯基和炔基。特别优选的是O[(CH2)nO]mCH3，O(CH2)nOCH3，O(CH2)nNH2，O(CH2)nCH3，O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1至大约10。其它优选的核碱基寡聚物在2′位置包含下列中的一个：C1-C10低分子烷基，取代的低分子烷基，烷芳基，芳烷基，O-烷芳基或O-芳烷基，SH，SCH3，OCN，Cl，Br，CN，CF3，OCF3，SOCH3，SO2CH3，ONO2，NO2，NH2，杂环烷基(heterocycloalkyl)，杂环烷芳基(heterocycloalkaryl)，氨烷基氨基(aminoalkylamino)，聚氨烷基(polyalkylamino)，取代的甲硅烷基，RNA切割基团，报告基团，插入剂，改进核碱基寡聚物药物代谢动力学性能的基团，以及其它具有类似性能的取代基。优选的修饰是2′-氧-甲基和2′--甲氧乙氧基)(2′-O-CH2CH2OCH3，也被称为′-O-(2-甲氧乙基)或2′-MOE)。另一个可取的修饰是2′-双甲氨基氧乙氧基(dimethylaminooxyethoxy)(即O(CH2)2ON(CH3)2)，也称为2′-DMAOE。其它修饰包括2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟代(2′-F)。也可以在寡核苷酸或其它核碱基寡聚物上的其它位置进行类似的修饰，特别是在3′末端核苷酸上的糖的3′位置，或者在2′-5′连接的寡核苷酸内和5′末端核苷酸的5′位置。核碱基寡聚物也可以具有糖模拟物，例如用环丁基部分代替五呋喃糖(pentofuranosyl)。教导如何制备这种修饰的糖结构的代表性的美国专利包括，但不限于美国专利：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633和5,700,920，在此将每一篇文献的全部内容引入作为参考。
核碱基寡聚物也可以包含碱基修饰或置换。这里使用的″未修饰的″或″天然的″碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的碱基包括其它合成的和天然的碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基及其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基及其它烷基衍生物；2-硫脲嘧啶(thiouracil)，2-硫胸腺嘧啶(thiothymine)和2-硫胞嘧啶(thiocytosine)；5-halouracil和胞嘧啶；5-丙炔尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫脲嘧啶；8-halo、8-氨基、8-硫醇，8-硫烷基，8-羟基及其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-halo(例如，5-溴基)，5-三氟甲基及其它5-取代的脲嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-去氮杂鸟嘌呤(deazaguanine)和7-去氮杂腺嘌呤(deazaadenine)；3-去氮杂鸟嘌呤(deazaguanine)和3-去氮杂腺嘌呤(deazaadenine)。更进一步的碱基包括美国专利3,687,80中公开的那些碱基，以及The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，pp.858-859，Kroschwitz，J.I.，Ed.，John Wiley & Sons，1990中公开的碱基，Englisch et al.，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613中公开的碱基和Sanghvi，Y.S.，Chapter 15，Antisense Research and Applications，pp.289-302，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，Ed.，CRC Press，1993中公开的碱基。这些碱基中的某些碱基对增加本发明的反义寡核苷酸的结合亲合力特别有用。其中包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶(azapyrimidines)，N-2，N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基嘌呤(aminopropyl adenine)，5-丙炔尿嘧啶(propynyluracil)和5-丙炔胞嘧啶(propynylcytosine)。已经显示5-甲基胞嘧啶置换使核酸二重稳定性增加了0.6-1.2℃(degree.C)(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，eds.，Antisense Research and Applications，CRCPress，Boca Raton，1993，pp.276-278)，因此是合乎需要的碱基替换，特别是与2′-氧-甲氧乙基或2′-氧-甲基糖修饰结合时更是如此。教导如何制备上面提到的某些修饰的碱基，以及其它修饰的碱基的代表性的美国专利包括美国专利：4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941和5,750,692，在此将每一篇文献引入作为参考。
本发明的核碱基寡聚物的另一种修饰涉及用化学方法将增强寡核苷酸活性，增强细胞分布或细胞摄取量的一个或多个部分或共轭物连接到核碱基寡聚物上。这种部分包括，但不限于脂质部分，例如胆固醇部分(Letsingeret al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：6553-6556，1989)，胆酸(Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let，4：1053-1060，1994)，硫醚，例如己基-S-三苯甲基巯基化合物(tritylthiol)(Manoharan et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660：306-309，1992；Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，3：2765-2770，1993)，硫胆固醇(thiocholesterol)(Oberhauser et al.，Nucl.Acids Res.，20：533-538：1992)，脂肪链，例如十二二醇(dodecandiol)或十一烷基基残基(Saison-Behmoaras et al.，EMBO J.，10：1111-1118，1991；Kabanov et al.，FEBS Lett.，259：327-330，1990；Svinarchuk et al.，Biochimie，75：49-54，1993)，磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙铵(triethylammonium)1，2-二-氧-十六烷基-rac-甘油基-3-氢-膦酸盐(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，36：3651-3654，1995；Shea et al.，Nucl.Acids Res.，18：3777-3783，1990)，多胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.，Nucleosides & Nucleotides，14：969-973，1995)，金刚烷胺乙酸(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，36：3651-3654，1995)，棕榈酰部分(Mishra et al.，Biochim.Biophys.Acta，1264：229-237，1995)，十八胺或己氨基-羧基-羟胆固醇部分(Crooke et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，277：923-937，1996)。教导如何制备这种核碱基寡聚物共轭物的代表性的美国专利有4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,828,979；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,948,882；4,958,013；5,082,830；5,109,124；5,112,963；5,118,802；5,138,045；5,214,136；5,218,105；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,414,077；5,416,203；5,451,463；5,486,603；5,510,475；5,512,439；5,512,667；5,514,785；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,578,717；5,578,718；5,580,731；5,585,481；5,587,371；5,591,584；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；5,608,046和5,688,941，在此将每一篇文献引入作为参考。
本发明也包括是嵌合化合物的核碱基寡聚物。″嵌合的″核碱基寡聚物是包含两个或更多个化学独特区域的核碱基寡聚物，特别是寡核苷酸，其中每一个化学独特区域由至少一个单体单元组成，当核碱基寡聚物是寡核苷酸时，单体单元是核苷酸。这些核碱基寡聚物典型地包含至少一个核碱基寡聚物被修饰的区域，该修饰使核碱基寡聚物对核酸酶降解的抗性增加，使细胞对核碱基寡聚物的摄取量增多，和/或使核碱基寡聚物对靶核酸的结合亲合力增高。核碱基寡聚物的另外区域可以作为能切割RNA：DNA或RNA：RNA杂交体的酶的底物。举例来说，RNase H是能切割RNA：DNA双链体中的RNA的细胞核酸内切酶。因此，激活RNase H可导致RNA靶标被切割，从而能大大增强核碱基寡聚物抑制基因表达的效率。因此，当使用嵌合的核碱基寡聚物时，与和相同目标区杂交的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸相比，用较短的核碱基寡聚物经常可以获得可比较的结果。
两个或更多个如上所述的核碱基寡聚物的复合结构可以形成本发明嵌合的核碱基寡聚物。当这种核碱基寡聚物是寡核苷酸时，在本领域也被称为杂交体或gapmers。教导如何制备这种杂交结构的典型的美国专利有美国专利：5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356和5,700,922,在此将每一篇文献全部引入作为参考。
可以利用公知的固相合成方法，象常规方便地制备出可在本发明中使用的核碱基寡聚物。几家供应商，包括，例如Applied Biosystems(Foster City，CA)在出售适合于这种合成的设备。可以另外使用或替换使用任何其它的适合这种合成的工具。已经公知可利用类似的方法制备寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基衍生物。
也可以通过掺合，包封，结合或其它方式将本发明的核碱基寡聚物联合到其它分子，分子结构或化合物的混合物中，具体实例有有助于摄取，分布和/或吸收的脂质体，受体靶分子，口服剂型，直肠给药剂型，局部给药剂型或其它剂型。教导如何制备有助于这种摄取，分布和/或吸收的剂型的代表性的美国专利有美国专利：5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575和5,595,756，，在此将每一篇文献引入作为参考。
本发明的核碱基寡聚物包括任何药学上可接受的盐、酯、或这种酯的盐、或任何给施用患者时能够提供(直接地或间接地)生物学活性代谢物或其残留物的其它化合物。相应地，公开内容也涉及本发明的化合物的前药和药学上可接受的盐，这种前药的药学上可接受的盐及其它生物等效物。
术语″前药″指以非活性形式被制备，在体内或细胞内通过内源酶或其它的化学制剂和/或条件的作用能转变为活性形式(例如药物)的治疗剂。特别地，可以参照PCT WO93/24510或WO94/26764中公开的方法，将本发明的前药形式的寡核苷酸制备成SATE[(S-乙酰-2-硫乙基)磷酸盐]衍生物。
术语″药学上可接受的盐″指那些能保留母化合物的希望的生物活性，又不产生不希望的毒理学影响的盐。用金属或胺，例如碱和碱土金属或有机胺可以形成药学上可接受的碱添加盐。用作阳离子的金属的实例有钠、钾、镁、钙等等。适当的胺的实例有N，N′-二苄乙烯二胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、二环己胺(dicyclohexylamine)、乙二胺茶碱、N-methylglucamine和procaine(例如参见Berge et al.，J.Pharma Sci.，66：1-19，1977)。用常规方式使游离酸和足量想要的碱接触产生盐制备出酸性化合物的碱添加盐。按照常规方式使盐接触酸，并分离游离酸可再生游离酸。游离酸在某些物理性能方面，例如极性溶剂中的溶解度不同于它们各自的盐形式，但在其它方面，对本发明的目的来说，盐相当于它们各自的游离酸。这里使用的″药物添加盐″包括本发明的组合物的一种组分的药学可接受的酸式盐。这包括胺的有机或无机酸盐。优选的酸性盐有盐酸盐、醋酸盐、水杨酸盐、硝酸盐和磷酸盐。其它适当的药学可接受盐为本领域技术人员大家所熟知，包括多种无机和有机体酸的碱式盐，例如无机酸，如：盐酸、氢溴酸、硫酸或磷酸；有机羧酸、磺酸、磺酸(sulfo)或膦酸或N取代的氨基磺酸、例如乙酸、丙酸、glycolic acid、琥珀酸、马来酸、hydroxymaleic acid、甲基马来酸、延胡索酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、草酸、葡糖酸、葡萄糖二酸、葡糖醛酸、柠檬酸、安息香酸、肉桂酸、扁桃酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、2-邻乙酰氧基苯甲酸、双羟萘酸(embonic acid)、烟酸或异烟酸；氨基酸，例如自然界中蛋白质合成涉及的20个α氨基酸，例如谷氨酸或天门冬氨酸，以及苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯磺酸、4-甲基苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1，5-二磺酸、2-或3-磷酸甘油酸、葡糖-6-磷酸、N-环己氨磺酸(形成环己氨磺酸盐)，或其它的有机酸化合物，例如抗坏血酸。也可以用药学可接受的阳离子来制备化合物的药学可接受盐。适当的药学可接受的阳离子为本领域技术人员所熟知，包括碱性、碱土、铵和季铵阳离子。碳酸盐或碳酸氢盐(hydrogen carbonate)也可以。
对于寡核苷酸及其它的核碱基寡聚物，适当的药学可接受盐包括(i)由阳离子，例如钠、钾、铵、镁、钙、多胺，例如精胺和亚精胺等等形成的盐；(ii)由无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等形成的酸添加盐；(iii)由有机酸，例如，乙酸、草酸、酒石酸、丁二酸、马来酸、延胡索酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、安息香酸、鞣酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、p-甲苯磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸等等；和(iv)由基本的阴离子，例如氯、溴和碘形成的盐。
本发明也包括含有本发明的核碱基寡聚物的药物组合物和剂型。可以采用多种方法施用本发明的药物组合物，给药方法取决于需要局部治疗还是全身治疗，以及待治疗的区域。给药可以是局部给药(包括眼给药和粘膜给药，粘膜给药包括阴道给药和直肠给药)，肺给药，例如包括通过喷雾器吸入或吹入粉剂或气溶胶，气管内、鼻内、表皮和经皮给药)、口服，或肠胃外给药。肠胃外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内注射，浸渍给药，或颅内，例如鞘内或心室内给药。
锁核酸
锁(locked)核酸(LNAs)是能用于本发明的核碱基寡聚物。LNAs包含限制核苷酸类似物的呋喃核糖环的柔韧性的2′-O，4′-C亚甲桥，因此能将核苷酸类似物锁定为刚性二环N型构象。LNAs对某些外切核酸酶和内切核酸酶显示出改进的抗性，而且能活化RNAse H，可以合并到几乎任何核碱基寡聚物中。而且，可以利用标准的亚磷酰胺合成规程来制备包含LNA的核碱基寡聚物。在PCT WO99/14226和公开号为US2002/0094555 A1美国专利申请中可以找到关于LNAs的其它附加细节，在此将每一篇文献引入作为参考。
阿拉伯核酸(Arabinonucleic acid)
阿拉伯核酸(ANAs)也可以用于本发明的方法和试剂中。ANAs是以D-阿拉伯糖代替天然的D-2′-脱氧核糖为基础的核碱基寡聚物。未衍生化的ANA类似物对RNA具有和硫代磷酸酯类似的结合亲合力。当用氟衍生阿拉伯糖(2′F-ANA)时，会导致结合亲合力的增强，形成的ANA/RNA和F-ANA/RNA双链体中的结合RNA能高效发生选择性水解。利用单纯的L糖在这些类似物的末端进行衍生作用可以使它们在细胞培养基中保持稳定。例如在Damha et al.，Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids 20：429-440，2001中讨论了ANAs用于治疗的用途。
核碱基寡聚物的递送
我们在这里证明裸寡核苷酸能进入肿瘤细胞并抑制IAP表达。但是，所希望的可能是利用有助于将寡核苷酸或其它核碱基寡聚物递送到细胞的剂型(例如参见美国专利5,656,611，5,753613，5,785,992，6,120,798，6,221,959，6,346,613和6,353,055，在此将每一篇文献引入作为参考)。
核酶
包括本发明的反义IAP序列的催化RNA分子或核酶可用于抑制活体内IAP多核苷酸的表达。将核酶序列包含在反义RNAs内使它们具备了切割RNA的活性，因此增加了构建物的活性。在Haseloff et al.，Nature 334：585-591，1988和公开号为2003/0003469 A1的美国专利申请中描述了靶RNA特异的核酶的设计和使用，在此将每一篇文献引入作为参考。
因此，本发明也描述了那些在结合臂中含有反义RNA的催化性RNA分子，其中反义RNA具有相当于表1，2，6和7中所列出的任何一个序列的八至十九个连续碱基。在本发明的优选实施例中，催化核酸分子是在锤头状或发夹式基序中形成的，但也可以在δ肝炎病毒，组I内含子或RNasePRNA(与RNA引导序列相关)或脉孢菌VS RNA的基序中形成。Rossi et alAIDS Research和Human Retroviruses，8：183，1992中描述了这种锤头状基序的实例。美国专利5,527,895；5,856,188和6,221,661中，以及Hampel and Tritz，Biochemistry，28：4929，1989和Hampel et al，Nucleic Acids Research，18：299，1990中都描述了发夹式基序的实例。Perrotta and Been，Biochemistry，31：16，1992中描述了δ肝炎病毒基序的实例。Guerrier-Takada et al，Cell，35：849，1983中描述了RNaseP基序。Collins et al(Saville and Collins，Cell 61：685-696，1990；Saville and Collins，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8826-8830，1991；Collins and Olive，Biochemistry 32：2795-2799，1993)描述了脉孢菌(Neurospora)VS RNA核酶基序。这些特异的基序并不限制本发明，本领域技术人员将认识到在本发明的酶核酸分子中重要的所有基序是那些具有与靶基因RNA的一个或多个区域互补的特异性底物结合部位的基序，以及那些具有位于底物结合位点内或底物结合位点周围，能赋予该分子RNA切割活性的的核苷酸序列的基序。
RNA干扰
本发明的核碱基寡聚物可以用在双链RNAs中来实施RNA干扰(RNAi)介导的IAP表达下调(knock-down)。RNAi是降低细胞的特定目的蛋白质表达的方法(Tuschl，Chembiochem 2：239-245，2001；Sharp，Genes & Devel.15：485-490，2000；Hutvagner and Zamore，Curr.Opin.Genet.Devel.12：225-232，2002和Hannon，Nature 418：244-251，2002中进行了综述)。在RNAi中，典型的情形是在转录后通过细胞中双链RNA(dsRNA)的存在来触发基因沉默。这些dsRNA在细胞内被处理成较短的被称为小干扰RNAs(siRNAs)的片段。通过dsRNAs转染或通过采用基于质粒的表达系统的siRNAs表达将siRNAs引入细胞内正逐渐地被用于在哺乳动物细胞中产生功能缺失表型。
在本发明的一个实施例中，制备了包含发明核碱基寡聚物的八至十九个连续碱基的双链RNA(dsRNA)分子。dsRNA可以是形成双链的两条分离的RNA链，或者是能自身形成双链(小发夹式(sh)RNA)的单一RNA链。典型地，dsRNAs长大约21或22个碱基对，但如果需要也可以更短些或更长些(达到大约29个碱基)。利用标准技术(例如化学合成或体外转录)可以制备dsRNA。例如，从Ambion(Austin，TX)和Epicentre(Madison，WI)可以获得试剂盒。在Brummelkamp et al.Science 296：550-553，2002；Paddison et al.Genes & Devel.16：948-958，2002；Paul et al.Nature Biotechnol.20：505-508，2002；Sui et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：5515-5520，2002；Yu et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6047-6052，2002；Miyagishi et al.Nature Biotechnol.20：497-500，2002和Lee et al.Nature Biotechnol.20：500-505，2002中描述了在哺乳动物细胞中表达dsRNA的方法，在此将每一篇文献引入作为参考。
小发夹式RNAs由具有任选的3′UU突出部分的茎环结构组成。但也可以有一些变化，茎可以在21-31bp之间变化(希望的是在25-29bp之间)，环可以在4-30bp之间变化(希望的是在4-23bp之间)。为了在细胞内表达shRNAs，可以使用包含聚合酶III H1-RNA，tRNA或U6启动子，供茎-环RNA插入的克隆位点和4-5胸腺嘧啶转录终止信号的质粒载体。聚合酶III启动子通常具有界限清楚的起始和中止位点，它们的转录物缺少聚(A)尾。通过聚胸腺嘧啶区域来定义这些启动子的终止信号，典型地转录产物在第二尿嘧啶核苷之后被切割。这个位点的切割在表达的shRNA中产生与合成的siRNAs的3′突出部分相似的3′UU突出部分。在上面引用的参考文献中描述了另外的在哺乳动物细胞中表达shRNA的方法。
化疗剂
在治疗癌症及其它赘生物时，将核碱基寡聚物与一种或多种破裂或稳定微管的化疗剂结合使用特别有效。在下文中将更详细地描述微管破裂剂(例如，长春花生物碱)和微管稳定剂(例如，紫杉烷类)。
长春花生物碱和相关化合物
能够与本发明的核碱基寡聚物联合，用于治疗癌症及其它赘生物的长春花生物碱包括长春新碱、长春碱、长春酰胺、长春氟宁、长春瑞滨和无水长春碱。
多拉司它汀(dolastatins)是主要在长春花碱结合域干扰微管蛋白的寡肽。这些化合物也可以与本发明的核碱基寡聚物联合用于治疗癌症及其它赘生物。多拉司它汀包括多拉司它汀-10(NCS 376128)、多拉司它汀-15、ILX651、TZT-1027、symplostatin 1、symplostatin 3和LU103793(西马多丁)。
隐藻素(cryptophycins)(例如，隐藻素1和隐藻素52)(LY355703)在长春花碱结合域内结合微管蛋白并诱导G2/M延滞和凋亡。这些化合物中的任何一种可以与本发明的核碱基寡聚物联合用于治疗癌症及其它赘生物。
在美国专利6,458,765；6,433,187；6,323,315；6,258,841；6,143,721；6,127,377；6,103,698；6,023,626；5,985,837；5,965,537；5,955,423；5,952,298；5,939,527；5,886,025；5,831,002；5,741,892；5,665,860；5,654,399；5,635,483；5,599,902；5,530,097；5,521,284；5,504,191；4,879,278和4,816,444中，以及公开号为2003/0153505 A1；2003/0083263 A1和2003/0055002 A1的美国专利中描述了其它的可与本发明的核碱基寡聚物联合用于治疗癌症及其它赘生物的破裂微管的化合物，在此将每一篇文献引入作为参考。
紫杉烷类及其它稳定微管的化合物
紫杉烷类，例如紫杉醇、多西它赛(doxetaxel)、RPR109881A、SB-T-1213、SB-T-1250、SB-T-101187、BMS-275183、BRT 216、DJ-927、MAC-321、IDN5109和IDN5390可以与本发明的核碱基寡聚物联合用于治疗癌症及其它赘生物。在本发明的方法和组合物中也可以使用紫杉烷类似物(例如，BMS-184476、BMS-188797)和功能上相关的非紫杉烷类(例如，埃博霉素(epothilones)(例如，埃博霉素A、埃博霉素B(EP0906)、脱氧埃博霉素B和埃博霉素B内酰胺(BMS-247550))、艾榴素(eleutherobin)、discodermolide、2-epi-discodermol、2-des-methyldiscodermolide、5-hydroxymethyldiscodermolide、19-des-aminocarbonyldiscodermolide、9(13)-cyclodiscodermolide和laulimalide)。
在美国专利6,624,317；6,610,736；6,605,599；6,589,968；6,583,290；6,576,658；6,515,017；6,531,497；6,500,858；6,498,257；6,495,594；6,489,314；6,458,976；6,441,186；6,441,025；6,414,015；6,387,927；6,380,395；6,380,394；6,362,217；6,359,140；6,306,893；6,302,838；6,300,355；6,291,690；6,291,684；6,268,381；6,262,107；6,262,094；6,147,234；6,136,808；6,127,406；6,100,411；6,096,909；6,025,385；6,011,056；5,965,718；5,955,489；5,919,815；5,912,263；5,840,750；5,821,263；5,767,297；5,728,725；5,721,268；5,719,177；5,714,513；5,587,489；5,473,057；5,407,674；5,250,722；5,010,099和4,939,168中，以及公开号为2003/0186965 A1；2003/0176710 Al；2003/0176473 A1；2003/0144523 A1；2003/0134883 A1；2003/0087888 A1；2003/0060623 A1；2003/0045711 A1；2003/0023082 A1；2002/0198256 A1；2002/0193361 A1；2002/0188014 A1；2002/0165257 A1；2002/0156110 A1；2002/0128471 A1；2002/0045609 A1；2002/0022651 A1；2002/0016356 A1；2002/0002292 A1的美国专利中描述了其它的可与本发明的核碱基寡聚物联合用于治疗癌症及其它赘生物的稳定微管的化合物，在此将每一篇文献引入作为参考。
其它可以与反义IAP碱基化合物一起施用的化疗剂如表1。
表1
  烷化剂  环磷酰胺(Cyclophosphamide)白消安(Busulfan)异磷酰胺(Ifosfamide)苯丙氨酸氮芥(Melphalan)六甲密胺(Hexamethylmelamine)二胺硫磷(Thiotepa)苯丁酸氮芥(Chlorambucil)二甲三氮咪唑酰胺(Dacarbazine)卡莫司汀(carmustine)   罗莫司丁(lomustine)丙卡巴肼(procarbazine)六甲密胺(altretamine)磷雌氮芥(Estramustinephosphate)双氯乙基甲胺(mechlorethamine)链唑霉素(streptozocin)替莫唑胺(temozolomide)司莫司丁(semustine)
  铂剂  顺铂(Cisplatin)奥沙利铂(Oxaliplatin)硫酸铂(Spiroplatinum)Carboxyphthalatoplatinum四铂(Tetraplatin)Ormiplatin异丙铂(Iproplatin)   碳铂(carboplatinum)ZD-0473(AnorMED)洛铂[lobaplatin(Aetema)]沙铂[satraplatin(JohnsonMatthey)]BBR-3464(Hoffmann-LaRoche)SM-11355(Sumitomo)AP-5280(Access)
  抗代谢物(Antimetabolites)  5-氮杂胞苷(Azacytidine)2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷(gemcitabine)卡培它滨(Capecitabine)5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)氟尿嘧啶脱氧核苷(Floxuridine)2-氯脱氧腺苷(2-chlorodeoxyadenosine)6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)阿糖胞苷(Cytarabin)2-氟脱氧胞啶(2-fluorodeoxycytidine)甲氨喋呤(methotrexate)Idatrexate   拓优得(tomudex)曲美沙特(trimetrexate)脱氧柯福霉素(deoxycoformycin)氟达拉滨(fludarabine)喷司它丁(pentostatin)雷替曲塞(raltitrexed)羟基脲(hydroxyurea)地西它滨(decitabine)(SuperGen)clofarabine(Bioenvision)伊罗夫文(irofulven)(MGIPharma)DMDC(Hoffmann-LaRoche)ethynlcytidine(Taiho)
  拓扑异构酶抑制剂  安吖啶(amsacrine)表柔比星(epirubicin)鬼臼乙叉甙(etoposide)鬼臼噻吩甙或盐酸米托蒽醌   卢比替康(rubitecan)(SuperGen)依沙替康敏使朗(exatecanmesylate)(Daiichi)
  (teniposide or mitoxantrone)依立替康(irinotecan)(CPT-11)7-乙基-10-羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin)托泊替康(Topotecan)dexrazoxanet(TopoTarget)pixantrone(Novuspharma)rebeccamycin类似物(Exelixis)BBR-3576(Novuspharma)   quinamed(ChemGenex)gimatecan(Sigma-Tau)diflomotecan(Beaufour-lpsen)TAS-103(Taiho)依沙芦星(elsamitrucin)(Spectrum)J-107088(Merck & Co)BNP-1350(BioNumerik)CKD-602(Chong KunDang)KW-2170(Kyowa Hakko)
  抗肿瘤抗生素   放线菌素(dactinomycin)(actinomycinD)阿霉素(doxorubicin)(adriamycin)脱氧比星(deoxyrubicin)戊柔比星(valrubicin)柔红霉素(daunorubicin)(daunomycin)表柔比星(epirubicin)therarubicin去甲氧基柔红霉素(idarubicin)柔红霉素苯腙(rubidazone)光辉霉素(plicamycinp)甲基丝裂霉素(porfiromycin)cyanomorpholinodoxorubicin盐酸米托蒽醌(mitoxantrone)(novantrone)   氨萘非特(amonafide)azonafide蒽吡唑(anthrapyrazole)oxantrazole洛索蒽醌(losoxantrone)硫酸博来霉素(bleomycinsulfate)(blenoxane)博来霉素酸(bleomycinicacid)博来霉素(bleomycin A)博来霉素(bleomycin B)丝裂霉素(mitomycin C)MEN-10755(Menarini)GPX-100(GemPharmaceuticals)
  抗裂剂   紫杉醇(Paclitaxel)紫杉萜(Docetaxel)秋水仙碱(Colchicine)长春碱(Vinblastine)长春新碱(vincristine)长春瑞滨(vinorelbine)长春酰胺(vindesine)多拉司它汀-10(dolastatin 10)(NCI)多拉司它汀(rhizoxin(Fujisawa)米伏布林(mivobulin)(Warner-Lambert)米伏布林(cemadotin)(BASF)RPR 109881 A(Aventis)TXD 258(Aventis)埃博霉素B(Novartis)T 900607(Tularik)T 138067(Tularik)隐藻素52(cryptophycin 52)(EliLilly)长春氟宁(vinflunine)(Fabre)auristatin PE(TeikokuHormone)BMS 247550(BMS)BMS 184476(BMS)BMS 188797(BMS)taxoprexin(Protarga)   SB 408075(GlaxoSmithKline)E7010(Abbott)PG-TXL(CellTherapeutics)IDN 5109(Bayer)A 105972(Abbott)A 204197(Abbott)LU 223651(BASF)D 24851(ASTAMedica)ER-86526(Eisai)考布它汀A4(combretastatinA4)(BMS)isohomohal chondrin-B(PharmaMar)ZD 6126(AstraZeneca)PEG-紫杉醇(Enzon)AZ10992(Asahi)IDN-5109(Indena)AVLB(PrescientNeuroPharma)azaepothilone B(BMS)BNP-7787(BioNumerik)CA-4前药(OXiGENE)多拉司它汀-10(dolastatin-10)(NIH)CA-4(OXiGENE)
  芳香酶抑制剂   氨鲁米特(aminoglutethimide)来曲唑(letrozole)   依西美坦(exemestane)阿它美坦(atamestane)
  阿那曲唑(Anastrazole)福美坦(formestane)   (BioMedicines)YM-511(Yamanouchi)
  胸腺嘧啶核苷酸合酶抑制剂   培美曲塞(pemetrexed)(Eli Lilly)ZD-9331(BTG)   阿它美坦(nolatrexed)(Eximias)CoFactorTM(BioKeys)
  DNA拮抗剂   trabectedin(PharmaMar)葡磷酰胺(glufosfamide)(BaxterInternational)白蛋白+32P(IsotopeSolutions)thymectacin(NewBiotics)edotreotide(Novartis)   马磷酰胺(mafosfamide)(BaxterInternational)apaziquone(SpectrumPharmaceuticals)O6苄基鸟嘌呤(O6 benzylguanine)(Paligent)
  法呢酰基转移酶抑制剂   arglabin(NuOncology Labs)lonafamib(Schering-Plough)BAY-43-9006(Bayer)   tipifamib(Johnson &Johnson)perillyl alcohol(DORBioPharma)
  泵抑制剂   CBT-1(CBA Pharma)tariquidar(Xenova)MS-209(Schering AG)   zosuquidar trihydrochloride(Eli Lilly)biricodar dicitrate(Vertex)
  组蛋白乙酰转移酶抑制剂   tacedinaline(Pfizer)SAHA(Aton Pharma)MS-275(Schering AG)   pivaloyloxymethyl butyrate(Titan)缩酚酸肽(depsipeptide)(Fujisawa)
  金属蛋白酶抑制剂   新伐司它(Neovastat)(AetemaLaboratories)马马司它(marimastat)(BritishBiotech)   CMT-3(CollaGenex)BMS-275291(Celltech)
  核糖核苷还原酶抑制剂   gallium maltolate(Titan)triapine(Vion)   tezacitabine(Aventis)didox(Molecules forHealth)
  TNF-α激动剂/拮抗剂   维鲁利秦(virulizin)(LorusTherapeutics)CDC-394(Celgene)   revimid(Celgene)
  内皮素A受体拮抗剂   阿曲生坦(atrasentan)(Abbott)ZD-4054(AstraZeneca)   YM-598(Yamanouchi)
  视黄酸受体激动剂   芬维A胺(fenretinide)(Johnson &Johnson)LGD-1550 Ligand)   阿利维A酸(alitretinoin)(Ligand)
  免疫调节剂   干扰素(Interferon)oncophage(Antigenics)GMK(Progenies)腺癌疫苗(Biomira)CTP-37(AVI BioPharma)IRX-2(lmmuno-Rx)PEP-005(Peplin Biotech)synchrovax疫苗(CTL Immuno)   dexosome therapy(Anosys)pentrix(Australian CancerTechnology)ISF-154(Tragen)癌疫苗(Intercell)norelin(Biostar)BLP-25(Biomira)
  黑瘤疫苗(melanoma vaccine)(CTL Immuno)p21 RAS疫苗(GemVax)   MGV(Progenies)β-alethine(Dovetail)CLL therapy(Vasogen)
  激素和抗激素药   雌激素结合型雌激素(conjugatedestrogens)炔雌醇(ethinyl estradiol)三对甲氧苯氯乙烯(chlortrianisen)idenestrol己酸羟孕酮(hydroxyprogesteronecaproate)甲羟孕酮(medroxyprogesterone)睾丸酮(testosterone)丙酸睾丸酮(testosteronepropionate)氟甲睾酮(fluoxymesterone)甲基睾丸酮(methyltestosterone)乙烯雌酚(diethylstilbestrol)甲地孕酮(megestrol)三苯氧胺(tamoxifen)toremofine地塞米松(dexamethasone)   泼尼松(prednisone)甲基泼尼松龙(methylprednisolone)泼尼松龙(prednisolone)氨苯哌酮(aminoglutethimide)醋酸亮丙瑞林(leuprolide)戈舍瑞林(goserelin)leuporelin比卡鲁胺(bicalutamide)氟它胺(flutamide)善得定(octreotide)尼鲁米特(nilutamide)邻氯苯对氯苯二氯乙烷(mitotane)P-04(Novogen)2-甲氧雌甾二醇(methoxyestradiol)(EntreMed)阿佐昔芬(arzoxifene)(EliLilly)
  光促因子   它拉泊芬(talaporfin)(LightSciences)Theralux(Theratechnologies)莫特沙芬钆(motexafin gadolinium)(Pharmacyclics)   Pd-bacteriopheophorbide(Yeda)lutetium texaphyrin(Pharmacyclics)海棠素(hypericin)
  酪氨酸激酶抑制剂   imatinib(Novartis)来氟米特(leflunomide)(Sugen/Pharmacia)ZD 1839(AstraZeneca)erlotinib(Oncogene Science)canertinib(Pfizer)角鲨胺(squalamine)(Genaera)SU5416(Phanmacia)SU6668(Pharmacia)ZD41 90(AstraZeneca)ZD6474(AstraZeneca)vatalanib(Novartis)PK1166(Novartis)GW2016(GlaxoSmithKline)EKB-509(Wyeth)EKB-569(Wyeth)   kahalide F(PharmaMar)CEP-701(Cephalon)CEP-751(Cephalon)MLN518(Millenium)PKC412(Novartis)phenoxodiol()曲妥单抗(trastuzumab)(Genentech)C225(ImClone)rhu-Mab(Genentech)MDX-H210(Medarex)2C4(Genentech)MDX-447(Medarex)ABX-EGF(Abgenix)IMC-lCll(ImClone)
  混杂因子(miseellaneous agents)
  SR-27897(CCK A抑制剂，Sanofi-Synthelabo)托拉地新(tocladesine)(环磷腺苷激动剂，Ribapharm)alvocidib(CDK抑制剂，Aventis)CV-247(COX-2抑制剂，Ivy Medical)P54(COX-2抑制剂，Phytopharm)CapCellTM(CYP450兴奋剂，BavarianNordic)GCS-100(gal3拮抗剂，GlycoGenesys)G17DT免疫源(胃泌素抑制剂，Aphton)efaproxiral(oxygenator，Allos   BCX-1777(PNP抑制剂，BioCryst)豹蛙酶(ranpimase)(核糖核酸酶兴奋剂，Alfacell)加柔比星(galarubicin)(RNA合成抑制剂，Dong-A)替拉扎明(tirapazamine)(还原剂，SRI国际的)N-乙酰半胱氨酸(还原剂，Zambon)R-氟布洛芬(R-flurbiprofen)(NF-κB抑制剂，Encore)3CPA(NF-κB抑制剂，Active Biotech)西奥骨化醇(seocalcitol)(维生素D受体激动剂，Leo)
  Therapeutics)PI-88(类肝素酶抑制剂，Progen)替米利芬(tesmilifene)(组胺拮抗剂，YM BioSciences)组胺(组胺H2受体激动剂，Maxim)噻唑呋林(tiazofurin)(IMPDH抑制剂，Ribapharm)西仑吉肽(cilengitide)(整联蛋白拮抗剂，MerckKGaA)SR-31747(IL-1拮抗剂，Sanofi-Synthelabo)CCI-779(mTOR激酶抑制剂，Wyeth)依昔舒林(exisulind)(PDE V抑制剂，Cell Pathways)CP-461(PDE V抑制剂，CellPathways)AG-2037(GART抑制剂，Pfizer)WX-UK1(纤维蛋白溶酶原激活抑制剂，Wilex)PBI-1402(PMN兴奋剂，ProMeticLifeSciences)bortezomib(蛋白酶体抑制剂，Millennium)SRL-172(T细胞兴奋剂，SR Pharma)TLK-286(谷光苷肽S转移酶抑制剂，Telik)PT-100(生长因子激动剂，PointTherapeutics)米哚妥林(midostaurin)(PKC抑制剂，Novartis)苔藓抑素-1(bryostatin-1)(PKC兴奋   131-I-TM-601(DNA拮抗剂，TransMolecular)依洛尼塞(eflomithine)(ODC抑制剂，ILEX Oncology)米诺膦酸(minodronic acid)(破骨细胞抑制剂，Yamanouchi)indisulam(p53兴奋剂，Eisai)aplidine(PPT抑制剂，PharmaMar)利妥昔单抗(rituximab)(CD20抗体，Genentech)吉姆单抗(gemtuzumab)(CD33抗体，Wyeth Ayerst)PG2(造血增强剂，Pharmagenesis)ImmunolTM(三氯森口服灌洗剂，Endo)三乙酰尿核甙(Triacetyluridine)(尿核甙前药，Wellstat)SN-4071(sarcoma agent，SignatureBioScience)TransMID-107TM(immunotoxin，KSBiomedix)PCK-3145(凋亡启动子，Procyon)doranidazole(凋亡启动子，Pola)CHS-828(细胞毒素剂t，Leo)反式视黄酸(differentiator，NIH)MX6(凋亡启动子，MAXIA)apomine(凋亡启动子，ILEX Oncology)urocidin(凋亡启动子，Bioniche)Ro-31-7453(凋亡启动子，La Roche)brostallicin(凋亡启动子，Pharmacia)
 剂，GPC Biotech)CDA-II(凋亡启动子，Everlife)SDX-101(凋亡启动子，Salmedix)ceflatonin(凋亡启动子，ChemGenex)
下列实施例用于举例说明本发明。无论如何，无意用它们限制本发明。
实施例1：核碱基寡聚物的选择
根据下列的选择标准，我们选择了大部分不相重叠的分别针对人XIAP和HIAP1的长度为19个碱基的96个和98个序列。对于XIAP，我们从cDNA序列上起始密码子上游大约1kb处至终止密码子下游大约1kb处之间的区域选择了96个序列(每一个长度为19个碱基)(SEQ ID NOs：1-96，表2)。这覆盖了编码区的大约50％，而且也接近5′和3′UTR序列(即96个19碱基(19-mers)长的序列跨越了1.8kb的序列，而目标区的长度是大约3.5kb，它包括1.5kb的编码区，及编码区两侧1kb的UTR序列)。
                                                    表2
  SEQ ID NO：   代码   碱基序列   XIAP下调T24RNA   XIAP下调T24蛋白 XIAP下调H460 RNA
  1   A1   AAAATTCTAAGTACCTGCA   -   -   48％
  2   B1   TCTAGAGGGTGGCTCAGGA   -   -   66％
  3   C1   CAGATATATATGTAACACT   -   -   66％
  4   D1   TGAGAGCCCTTTTTTTGTT   -   -   75％
  5   E1   AGTATGAAATATTTCTGAT   -   -   69％
  6   F1   ATTGGTTCCAATGTGTTCT   -   -   81％
  7   G1   TTAGCAAAATATGTTTAA   -   -   33％
  8   H1   TGAATTAATTTTTAATATC   -   -   13％
  9   A2   ATTCAAGGCATCAAAGTTG   -   -   58％
  10   B2   GTCAAATCATTAATTAGGA   -   -   55％
  11   C2   AATATGTAAACTGTGATGC   36％   45％   70％
  12   D2   GCAGAATAAAACTAATAAT   -   -   39％
  13   E2   GAAAGTAATATTTAAGCAG   54％   51％   60％
  14   F2   TTACCACATCATTCAAGTC   -   -   34％
  15   G2   CTAAATACTAGAGTTCGAC   -   -   55％
  16   H2   ACACGACCGCTAAGAAACA   -   -   46％
  17   A3   TATCCACTTATGACATAAA   -   -   27％
  18   B3   GTTATAGGAGCTAACAAAT   -   -   34％
  19   C3   AATGTGAAACACAAGCAAC   -   -   43％
  SEQ ID NO：   代码   碱基序列   XIAP下调T24RNA   XIAP下调T24蛋白 XIAP下调H460 RNA
  20   D3   ACATTATATTAGGAAATCC   -   -   30％
  21   E3   CTTGTCCACCTTTTCTAAA   53％   64％   55％
  22   F3   ATCTTCTCTTGAAAATAGG   44％   53％   -
  23   G3   CCTTCAAAACTGTTAAAAG   -   -   -
  24   H3   ATGTCTGCAGGTACACAAG   -   -   -
  25   A4   ATCTATTAAACTCTTCTAC   -   -   -
  26   B4   ACAGGACTACCACTTGGAA   -   -   76％
  27   C4   TGCCAGTGTTGATGCTGAA   28％   56％   77％
  28   D4   GTATAAAGAAACCCTGCTC   12％   43％   51％
  29   E4   CGCACGGTATCTCCTTCAC   47％   34％   51％
  30   F4   CTACAGCTGCATGACAACT   33％   43％   -
  31   G4   GCTGAGTCTCCATATTGCC   34％   48％   51％
  32   H4   ATACTTTCCTGTGTCTTCC   -   -   -
  33   A5   GATAAATCTGCAATTTGGG   -   -   -
  34   B5   TTGTAGACTGCGTGGCACT   -   -   61％
  35   C5   ACCATTCTGGATACCAGAA   71％   54％   -
  36   D5   AGTTTTCAACTTTGTACTG   39％   33％   -
  37   E5   ATGATCTCTGCTTCCCAGA   -   -   46％
  38   F5   AGATGGCCTGTCTAAGGCA   -   -   -
  39   G5   AGTTCTCAAAAGATAGTCT   -   -   30％
SEQ ID NO：  代码   碱基序列  XIAP下调T24 RNA   XIAP下调T24蛋白 XIAP下调H460 RNA
  40   H5   GTGTCTGATATATCTACAA   -   -   39％
  41   A6   TCGGGTATATGGTGTCTGA   -   -   72％
  42   B6   CAGGGTTCCTCGGGTATAT   51％   47％   -
  43   C6   GCTTCTTCACAATACATGG   -   -   -
  44   D6   GGCCAGTTCTGAAAGGACT   -   -   60％
  45   E6   GCTAACTCTCTTGGGGTTA   -   -   -
  46   F6   GTGTAGTAGAGTCCAGCAC   34％   39％   -
  47   G6   AAGCACTGCACTTGGTCAC   -   -   69％
  48   H6   TTCAGTTTTCCACCACAAC   -   -   68％
  49   A7   ACGATCACAAGGTTCCCAA   -   -   -
  50   B7   TCGCCTGTGTTCTGACCAG   -   -   -
  51   C7   CCGGCCCAAAACAAAGAAG   -   -   72％
  52   D7   GATTCACTTCGAATATTAA   56％   88％   46％
  53   E7   TATCAGAACTCACAGCATC   -   -   -
  54   F7   GGAAGATTTGTTGAATTTG   -   -   69％
  55   G7   TCTGCCATGGATGGATTTC   -   -   41％
  56   H7   AAGTAAAGATCCGTGCTTC   -   -   63％
  57   A8   CTGAGTATATCCATGTCCC   -   -   -
  58   B8   GCAAGCTGCTCCTTGTTAA   -   -   -
  59   C8   AAAGCATAAAATCCAGCTC   -   -   16％
 SEQ ID NO：   代码   碱基序列  XIAP下调T24 RNA   XIAP下调T24蛋白   XIAP下调H460 RNA
  60   D8   GAAAGCACTTTACTTTATC   38％   26％   49％
  61   H8   ACTGGGCTTCCAATCAGTT   -   -   -
  62   E8   GTTGTTCCCAAGGGTCTTC   72％   56％   44％
  63   F8   ACCCTGGATACCATTTAGC   -   -   47％
  64   G8   TGTTCTAACAGATATTTGC   -   -   49％
  65   A9   TATATATTCTTGTCCCTTC   -   -   62％
  66   B9   AGTTAAATGAATATTGTTT   -   -   38％
  67   C9   GACACTCCTCAAGTGAATG   -   -   -
  68   D9   TTTCTCAGTAGTTCTTACC   -   -   39％
  69   E9   GTTAGTGATGGTGTTTTCT   -   -   43％
  70   F9   AGATGGTATCATCAATTCT   -   -   19％
  71   G9   TGTACCATAGGATTTTGGA   -   -   -
  72   H9   CCCCATTCGTATAGCTTCT   -   -   -
  73   A10   ATTATTTTCTTAATGTCCT   -   -   29％
  74   B10   CAAGTGATTTATAGTTGCT   -   -   -
  75   C10   TAGATCTGCAACCAGAACC   -   -   53％
  76   D10   CATCTTGCATACTGTCTTT   -   -   55％
  77   E10   CCTTAGCTGCTCTTCAGTA   -   -   -
  78   F10   AAGCTTCTCCTCTTGCAGG   -   -   51％
  79   G10   ATATTTCTATCCATACAGA   -   -   56％
 SEQ ID NO：   代码   碱基序列  XIAP下调T24 RNA  XIAP下调T24蛋白   XIAP下调H460 RNA
  80   H10   CTAGATGTCCACAAGGAAC   -   -   -
  81   A11   AGCACATTGTTTACAAGTG   -   -   68％
  82   B11   AGCACATGGGACACTTGTC   -   -   63％
  83   C11   CTTGAAAGTAATGACTGTG   -   -   52％
  84   D11   CCTACTATAGAGTTAGATT   -   -   -
  85   E11   ATTCAATCAGGGTAATAAG   -   -   48％
  86   F11   AAGTCAGTTCACATCACAC   -   -   64％
  87   G11   CAGTAAAAAAAATGGATAA   -   -   33％
  88   H11   TTCAGTTATAGTATGATGC   -   -   -
  89   A12   TACACTTAGAAATTAAATC   -   -   46％
  90   B12   TCTCTATCTTTCCACCAGC   -   -   -
  91   C12   AGAATCCTAAAACACAACA   -   -   -
  92   D12   ATTCGCACAAGTACGTGTT   -   -   77％
  93   E12   TGTCAGTACATGTTGGCTC   -   -   74％
  94   F12   ACATAGTGTTTTGCCACTT   -   -   74％
  95   G12   CTTTGATCTGGCTCAGACT   -   -   76％
  96   H12   GAAACCACATTTAACAGTT   -   -   52％
应注意在上述的任何核碱基寡聚物，或任何此处描述的其它核碱基寡聚物中，每个碱基可以独立地是DNA残基或RNA残基，例如2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA残基。例如，SEQ ID NO：3的碱基序列可以是5′-CAGATATATATGTAACACT-3′，5′-CAGATATATATGTAACACU-3′或5′-mCmAGATATATATGTAACAmCmU-3′(其中mX代表2′-氧-甲基X残基)。其它附加的修饰碱基本领域已经公知。连接可以是磷酸二酯(PO)、硫代磷酸酯(PS)或膦酸甲酯(MP)键，或者具有混合骨架(MB)。骨架可以是允许核碱基寡聚物与靶IAP多核苷酸杂交的任何适当的骨架。在这里描述了一些示例性的骨架。在其它的实施例中，核碱基寡聚物包含吖啶保护键、胆甾醇基或补骨脂素组分、C5-propynyl嘧啶或C5-甲基嘧啶。对本发明的核碱基寡聚物的适当的修饰包含那些如上所述的修饰，以及在此引入作为参考的公开号为US2002/0128216 A1的美国专利申请中的那些修饰。
在下面的表3中列出了核碱基寡聚物的实例(其中mX代表2′-氧-甲基X RNA残基)。
                         表3
 2x2 MB PO   SEQ ID NO：
 DE4 as   MGmGTATCTCCTTCACCAGmUmA   97
 DE4 rev   MAmUGACCACTTCCTCTATmGmG   98
 δBC5 as   MGmATACCAGAATTTmGmU   99
 δBC5 rev   MUmGTTTAAGACCATmAmG   100
 mG4 as   MGmCTGAGTCTCCATACTGmCmC   101
 mG4 sm   MGmGCTCTCTGCCCACTGAmAmU   102
 3x3 MB PO
 F3 as   MAmUmCTTCTCTTGAAAATmAmGmG   103
 F3 scr   MCmAmGAGATTTCATTTAAmCmGmU   104
 F3 mm   MAmUmCTTGACTTGATTATmAmGmG   105
 F3 rev   MGmGmATAAAAGTTCTCTTmCmUmA   106
 E4 as   MCmGmCACGGTATCTCCTTmCmAmC   107
 E4 scr   MCmUmACGCTCGCCATCGTmUmCmA   108
                           表3
 E4 rev   MCmAmCTTCCTCTATGGCAmCmGmC   109
 E4 mm   MCmGmCACCCTATCTGGTTmCmAmC   110
 G4 as   MGmCmUGAGTCTCCATATTmGmCmC   111
 G4 scr   MGmGmCTCTTTCGCCACTGmAmAmU   112
 G4 rev   MCmCmGTTATACCTCTGAGmUmCmG   113
 G4 mm   MGmCmUGACACTCCAATTTmGmCmC   114
 C5 as   MAmCmCATTCTGGTAACCAmGmAmA   115
 C5 scr   mUmGmCCCAAGAATACTAGmUmCmA   116
 C5 mm   MAmCmCATAGTGGATTGCAmGmAmA   117
 C5 rev   MAmAmGACCATAGGTCTTAmCmCmA   118
 D7 as   mGmAmUTCACTTCTTCGAATATmUmAmA   119
 D7 scr   MUmGmAAATGTAAATCATCmUmUmC   120
 D7 mm   MGmAmUTCTGTTCGATAATmUmAmA   121
 D7 rev   MAmAmUTATAAGCTTCACTmUmAmG   122
 硫代磷酸酯
 PS-G4 as   GCTGAGTCTCCATATTGCC   123
 PS-G4 sm   GGCTCTTTGCCCACTGAAT   124
 PS-C5 as   ACCATTCTGGATACCAGAA   125
 PS-C5 rev   AAGACCATAGGTCTTACCA   126
 PS-F3 as   ATCTTCTCTTGAAAATAGG   127
 PS-F3 rev   GGATAAAAGTTCTCTTCTA   128
 PS-DE4 as   GGTATCTCCTTCACCAGTA   129
 PS-DE4 rev   ATGACCACTTCCTCTATGG   130
 PS-BC5 as   TCTGGATACCAGAATTTGT   131
 PS-BC5 rev   TGTTTAAGACCATAGGTCT   132
 PS-AB6 as   GGGTTCCTCGGGTATATGG   133
 PS-AB6 rs   GGTATATGGCGTCCTTGGG   134
 PS-D7 as   GATTCACTTCGAATATTAA   135
 PS-D7 rs   AATTATAACGTTCACTTAG   136
 Penetratin
 F3 as   ATCTTCTCTTGAAAATAGG   137
 G4 as   GCTGAGTCTCCATATTGCC   138
 D7 as   GATTCACTTCGAATATTAA   139
 C5 cs   TGCCCAAGAATACTAGTCA   140
 4X4 MBO PS(各处都是硫代磷酸酯键)
 G4 as   mGmCmUmGAGTCTCCATATmUmGmCmC   141
 G4 sm   mGmGmCmUCTTTGCCCACTmGmAmAmU   142
 DE4 as   mGmGmUmATCTCCTTCACCmAmGmUmA   143
 DE4 rev   mAm UmGmACCACTTCCTCTmAm UmGmG   144
 E2 as   mGmAmAmAGTAATATTTAAmGmCmAmG   145
 E2 rm   mGmAmGmCAATTTATAATGmAmAmAmG   146
 H2G as   mAmCmCmGCTAAGAAACATmUmCmUmA   147
 H2G rm   mAmUmCmUTACAAAGAATCmCmGmCmA   148
                       表3
  A3 as   mUmAmUmCCACTTATGACAmUmAmAmA   149
  A3 rev   mAmAmAmUACAGTATTCACmCmUmAmU   150
  FG8 as   mUmGmCmACCCTGGATACCmAmUmUmU   151
  FG8 rm   mUmUmUmACCATAGGTCCCmAmGmCmU   152
  mG4 as   mGmCmUmGAGTCTCCATACmUmGmCmC   153
  mG4 sm   mGmGmCmUCTCTGCCCACTmGmAmAmU   154
  F1 as   mAmUmUmGGTTCCAATGTGmUmUmCmU   155
  F1 rev   mUmCmUmUGTGTAACCTTGmGmUmUmA   156
  B4 as   mAmCmAmGGACTACCACTTmGmGmAmA   157
  B4 rev   mAmAmGmGTTCACCATCAGmGmAmCmA   158
  G6 as   mAmAmGmCACTGCACTTGGmUmCmAmC   159
  G6 sm   mCmAmCmTGGTTGACCTCAmCmAmAmG   160
  E12 as   mUmGmUmCAGTACATGTTGmGmCmUmC   161
  E12 sm   mCmUmAmGGTTGTCCATGAmCmUmGmU   162
在PCT专利申请FR91/00444中描述了介导核碱基寡聚物进入细胞的Penetratin和其用途。
采用类似的鉴定方法来设计针对HIAP1的核碱基寡聚物。最初，选择了98个长度为19个碱基(19-mer)的核碱基寡聚物(SEQ ID NOs：163-260，表4)。从这98个靶向HIAP1序列的核碱基寡聚物中选出十五个序列(SEQID NOs：163-170，173，179，202，222，223，247和259)作更进一步的评价。这十五个候选的核碱基寡聚物包括四个靶向编码区的核碱基寡聚物(SEQ ID NOs：202，222，223和247)、一个靶向3′UTR的核碱基寡聚物(SEQ ID NO：259)、七个靶向5′UTR的核碱基寡聚物(SEQ ID NOs：166-170，173和179；这七个核碱基寡聚物中的一个与起始密码子交叠)，以及三个经设计靶向5′UTR的内含子部分的其它寡核苷酸(SEQ ID NOs：163-165)。
                       表4
  SEQ ID NO：   代码   碱基寡聚物序列
  163   APO 1   TCATTTGAGCCTGGGAGGT
  164   APO 2   CGGAGGCTGAGGCAGGAGA
  165   APO 3   GGTGTGGTGGTACGCGCCT
  166   APO 4   ACCCATGCACAAAACTACC
  167   APO 5   AGAATGTGCCAGTAGGAGA
  168   APO 6   TCTCACAGACGTTGGGCTT
  169   APO 7   CCAGTGGTTTGCAAGCATG
  170   APO 8   GAAATTTAGTGGCCAGGAA
  171   AGAAATACACAATTGCACC
  172   TACTGATACATTTTAAGGA
  173   APO 9   TTCAACATGGAGATTCTAA
  174   ATTTCTATGCATTTAGAGT
  175   AATACTAGGCTGAAAAGCC
  176   GGCTTTGCTTTTATCAGTT
  177   TCTAGGGAGGTAGTTTTGT
  178   GGGAAGAAAAGGGACTAGC
  179   APO 10   GTTCATAATGAAATGAATG
  180   ATAAGAATATGCTGTTTTC
  181   TTCAAACGTGTTGGCGCTT
  182   ATGACAAGTCGTATTTCAG
  183   AAGTGGAATACGTAGACAT
  184   AGACAGGAACCCCAGCAGG
  185   CGAGCAAGACTCCTTTCTG
  186   AGTGTAATAGAAACCAGCA
  187   TGACCTTGTCATTCACACC
  188   TTATCCAGCATCAGGCCAC
  189   ACTGTCTCCTCTTTTCCAG
  190   TTTTATGCTTTTCAGTAGG
  191   ACGAATCTGCAGCTAGGAT
  192   CAAGTTGTTAACGGAATTT
  193   TAGGCTGAGAGGTAGCTTC
  194   GTTACTGAAGAAGGAAAAG
  195   GAATGAGTGTGTGGAATGT
  196   TGTTTTCTGTACCCGGAAG
  197   GAGCCACGGAAATATCCAC
  198   TGATGGAGAGTTTGAATAA
  199   GATTTGCTCTGGAGTTTAC
  200   GGCAGAAAATTCTTGATTT
  201   GGACAGGGGTAGGAACTTC
  202   APO 11   GCATTTTCGTTATTCATTG
  203   CTGAAAAGTAAGTAATCTG
  204   GGCGACAGAAAAGTCAATG
  205   CCACTCTGTCTCCAGGTCC
  206   CCACCACAGGCAAAGCAAG
  SEQ ID NO：   代码   碱基寡聚物序列
  207   TTCGGTTCCCAATTGCTCA
  208   TTCTGACATAGCATTATCC
  209   TGGGAAAATGTCTCAGGTG
  210   TATAAATGGGCATTTGGGA
  211   TGTCTTGAAGCTGATTTTC
  212   GAAACTGTGTATCTTGAAG
  213   TGTCTGCATGCTCAGATTA
  214   GAATGTTTTAAAGCGGGCT
  215   CACTAGAGGGCCAGTTAAA
  216   CCGCACTTGCAAGCTGCTC
  217   CATCATCACTGTTACCCAC
  218   CCACCATCACAGCAAAAGC
  219   TCCAGATTCCCAACACCTG
  220   CCCATGGATCATCTCCAGA
  221   AACCACTTGGCATGTTGAA
  222   APO 12   CAAGTACTCACACCTTGGA
  223   APO 13   CCTGTCCTTTAATTCTTAT
  224   TGAACTTGACGGATGAACT
  225   TAGATGAGGGTAACTGGCT
  226   TGGATAGCAGCTGTTCAAG
  227   CATTTTCATCTCCTGGGCT
  228   TGGATAATTGATGACTCTG
  229   GTCTTCTCCAGGTTCAAAA
  230   TATTCATCATGATTGCATC
  231   CATTTCCACGGCAGCATTA
  232   CCAGGCTTCTACTAAAGCC
  233   GCTAGGATTTTTCTCTGAA
  234   TCTATAATTCTCTCCAGTT
  235   ACACAAGATCATTGACTAG
  236   TCTGCATTGAGTAAGTCTA
  237   CTCTTCCCTTATTTCATCT
  238   TCCTCAGTTGCTCTTTCTC
  239   GCCATTCTATTCTTCCGGA
  240   AGTCAAATGTTGAAAAAGT
  241   CCAGGATTGGAATTACACA
  242   ATTCCGGCAGTTAGTAGAC
  243   TAACATCATGTTCTTGTTC
  244   GTCTGTGTCTTCTGTTTAA
  245   TTCTCTTGCTTGTAAAGAC
  246   CTAAAATCGTATCAATCAG
  247   APO 14   GGCTGCAATATTTCCTTTT
  248   GAGAGTTTCTGAATACAGT
  249   ACAGCTTCAGCTTCTTGCA
  250   AAATAAATGCTCATATAAC
  251   GAAACATCTTCTGTGGGAA
  SEQ ID NO：   代码   碱基寡聚物序列
  252   GTTCTTCCACTGGTAGATC
  253   CTTCTTGTAGTCTCCGCAA
  254   TTGTCCATACACACTTTAC
  255   AACCAAATTAGGATAAAAG
  256   ATGTTCATATGGTTTAGAT
  257   TAAGTTTTACTTCACTTAC
  258   ATGTTCCCGGTATTAGTAC
  259   APO 15   GGGCTCAAGTAATTCTCTT
  260   GCCCAGGATGGATTCAAAC
核碱基寡聚物选择标准
利用计算机程序OLIGO(以前由National Biosciences Inc分配的)，基于下列标准来选择候选的核碱基寡聚物：
1)GC含量不超过75％；AT含量不超过75％；
2)优选不具有四个或四个以上连续的G残基的核碱基寡聚物(虽然挑选了一个作为毒性对照，但因为已报告有毒性影响)；
3)不选择能形成稳定的二聚物或发夹结构的核碱基寡聚物；以及
4)围绕翻译起始位点的序列是优选区。
另外，借助于RNA二级结构折叠程序MFOLD(M.Zuker，D.H.Mathews& D.H.Turner，Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary StructurePrediction：A Practical Guide.In：RNA Biochemistry and Biotechnology，J.Barciszewski & B.F.C.Clark，Ed.，NATO ASI Series，Kluwer AcademicPublishers，(1999))预测靶mRNA的可进入的区域。利用200个碱基的窗口已经预测出自由能数值在预计的最稳定的mRNA折叠5％以内的亚最佳折叠，其中200个碱基中的残基能找到互补的碱基形成碱基对连接。和每个亚最佳折叠一起总计不形成碱基对的开放区，认为那些始终被预言为开放的区域更容易与核碱基寡聚物结合。如果只能部分满足上述一些选择标准的附加核碱基寡聚物能识别预测的靶mRNA开放区，也可以选择它们作为可能的候选物。
实施例2：寡核苷酸合成
利用寡核苷酸作为示范的核碱基寡聚物对核碱基寡聚物抑制IAP表达的能力进行了测试。利用IDT(Integrated DNA Technologies，USA)合成的寡核苷酸是嵌合的第二代寡核苷酸，它们由在一侧侧接了两个2′-氧-甲基RNA残基的磷酸二酯DNA残基核心组成，其中侧接的RNA残基之间有硫代磷酸酯键。提供的最少量的寡核苷酸在96孔板和相配的管中，当检测方法是灵敏的方法，例如是TaqMan定量PCR或ELISA时，最少量为12ODs的核碱基寡聚物提供了丰富的转染材料(大于96孔板测定模式的一百次测定)。一旦鉴定呈阳性(见下文)，再合成寡核苷酸时用三个侧接的RNA残基替换两个侧接的RNA残基以进一步增强其稳定性/核酶抗性。另外，为了证实结果有效，针对一些产生最高活性的靶合成了适当的对照物(例如：混杂的，4-碱基错配和反极性寡核苷酸)。
实施例3：核碱基寡聚物的筛选和优化
我们鉴定能抑制IAP表达的核碱基寡聚物的方法是为了筛选上述的寡核苷酸库，以选择能特异性降低(降低(knock-down))被靶向的特异IAP基因的RNA和/或蛋白质的寡聚物。可以使用任意数量的标准方法来检测细胞的RNA和蛋白水平。例如：可以利用标准northern印迹分析或RT-PCR技术来测量RNA水平。例如：可以利用标准的western印迹分析或免测沉淀法技术测量蛋白水平。换句话说，可以参照这里引入的作为参考的美国专利5,919,912，6,156,535和6,133,437中描述的方法来检查施用了反义IAP核酸的细胞的成活力。
我们利用TaqMan定量PCR(如下所述)来测定寡核苷酸处理后mRNA水平的变化。我们利用ELISA来确定XIAP蛋白水平，利用western印迹来确定HIAP1蛋白水平。利用来自XIAP的跨越起始密码子的荧光素标记的正义寡核苷酸(5′-mGmAGAAGATGACTGGTAAmCmA-3′；SEQ ID NO：261)作为对照，用Lipofectamine plus或Lipofectamine 2000(Life Technologies，Canada)来优化T24膀胱癌细胞或H460非小细胞肺癌的转染条件，用lipofectin来优化SF-295恶性胶质瘤细胞的转染条件。通过表面-荧光显微术对结果进行目测检验和精确计量。基于已公开的寡核苷酸下调存活蛋白表达的能力，对T24细胞的转染条件进行更进一步的优化(Li et al.，Nat.CellBiol.1：461-466，1999)(5′-U/TGTGCTATTCTGTGAAU/TU/T-3′；SEQ ID NO：262)。我们基于用下文详细描术的PCR引物和荧光探针检测出的存活蛋白RNA降低的TaqMan结果，对转染条件进行优化。发现细胞摄取寡核苷酸的最优条件是940nM寡核苷酸，4uL PLUS试剂以及0.8uL Lipofectamine，共70uL，作用三小时。然后我们施加这些条件来筛选寡核苷酸库中使T24细胞XIAP蛋白质降低的寡核苷酸。
在SF-295细胞中研究HIAP1降低，因为这些细胞具有容易检测和辨别的70kDa的HIAP1蛋-白质，而许多细胞系并不表达高水平的这种蛋白质，或者表达的蛋白质不能与大量的类似大小的68kDa的HIAP2蛋白质相区别。
实时PCR
从溶解在RLT缓冲液(QIAGEN，Valencia，CA)中的细胞抽提RNA，用QIAGEN Rneasy柱/试剂盒进行纯化。在Perkin-Elmer ABI 7700 Prism PCR仪上运行实时定量PCR。利用设计的能特异地识别XIAP，HIAP1，存活蛋白或GAPDH的引物和探针，参照PE生物系统的TaqMan通用PCR标准混合规程(TaqMan Universal PCR Master Mix protocol of PE Biosystems)逆转录和扩增RNA。人存活蛋白的正向引物为5′-TCTGCTTCAAGGAGCTGGAA-3′(SEQ ID NO：263)，反向引物为5′-GAAAGGAAAGCGCAACCG-3′(SEQ ID NO：264)，探针为5′-(FAM)AGCCAGATGACGACCCCATAGAGGAACATA(TAMRA)-3′(SEQ ID NO：265)。人HIAP1的正向引物为5′-TGGAGATGATCCATGGGTTCA-3′(SEQ IDNO：266)，反向引物为5′-GAACTCCTGTCCTTTAATTCTTATCAAGT-3′(SEQID NO：267)，探针为5′-(FAM)CTCACACCTTGGAAACCACTTGGCATG(TAMRA)-3′(SEQ ID NO：268)。人XIAP的正向引物为5′-GGTGATAAAGTA AAGTGCTTTCACTGT-3′(SEQ IDNO：269)，反向引物为5′-TCAGTAGTTCTTACCAGACACTCCTCAA-3′(SEQID NO：270)，探针为5′-(FAM)CAACATGCTAAATGGTATCCAGGGTGCAAATATC(TAMRA)-3′(SEQ IDNO：271)。人GAPDH的正向引物为5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′(SEQID NO：272)，反向引物为5′-GAAGATGGTGATGGGATTC-3′(SEQ ID NO：273)，探针为5′-(JOE)CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC(TAMRA)-3′(SEQ IDNO：274)。FAM是6-羧基荧光素，JOE是6-羧基-4，5-二氯-2，7-二甲氧基荧光素，TAMRA是6-羧基-N，N，N′，N′-四甲基罗丹明。FAM和JOE是5′报告染料，而TAMRA是3′淬灭染料。
利用GAPDH作为内标准，按照PE生物系统手册(PE Biosystems manual)中的描述对基因表达进行相对定量。利用比较Ct(循环阈值)的方法将IAP mRNA水平与GAPDH mRNA水平相比较，对IAP mRNA水平进行相对定量。简而言之就是在每个PCR循环都进行实时荧光测量，通过确定荧光超过基线标准偏差30倍的阈极限点，计算出每个样品的阈循环(Ct)值。利用开始于第三个循环的基线值和中止于信号开始按指数规律上升之前的三个循环的基线值计算平均基线值和基线SD。为了减少扩增和检出基因组DNA污染物的可能性，设计的IAPs的特异的PCR引物和/或探针跨越至少一个被1kb或更长基因组DNA分开的外显子-内含子边界。通过在实行反转录和PCR反应步骤前用DNase或RNase处理一些RNA样品来验证信号的特异性和由DNA引起的可能污染。
XIAP ELISA和HIAP1蛋白质免疫印迹
利用亲合纯化的抗鼠XIAP的兔多克隆抗体作为第一抗体实行标准的比色XIAP ELISA测定，利用XIAP单克隆抗体(MBL，Japan)，生物素化的抗-鼠Ig抗体，辣根过氧化酶结合的抗生物素蛋白链菌素，以及TMB底物进行检测。另外，也可以分别利用多克隆XIAP或HIAP1抗体来测量XIAP或HIAP1蛋白水平。
在蛋白免疫印迹时利用亲合纯化的抗鼠HIAP1兔多克隆抗体作为第一抗体来检测HIAP1，在X线胶片上时，利用二抗——结合辣根过氧化物酶的抗兔Ig抗体和化学荧光底物通过ECL来检测HIAP1。收集针对鼠HIAP1的GST融合物的抗HIAP1多克隆抗体。这种抗体会与人和鼠两者的HIAP1，HIAP2发生交叉反应。
实施例4：反义XIAP寡核苷酸减少XIAP RNA和多肽表达
首先筛选XIAP合成库的96个反义寡核苷酸，以选出能降低XIAP蛋白水平的寡核苷酸。具体地，在第1天将T24细胞(1.5×104细胞/孔)接种在96孔培养板的孔中，在不含抗菌素的McCoy′s培养基培养24小时。第2天，用如上所述的XIAP反义寡核苷酸转染细胞(依照寡核苷酸在培养板中的位置对它们进行标记，即A1到H12，包括含有冻干的粘到密封膜上的DNA小丸的两个重复——A13和B13)。简而言之就是将核碱基寡聚物稀释在10ul/孔的无血清及抗菌素的McCoy′s培养基中，然后添加PLUS试剂。Lipofectamine被稀释在10ul/孔的无血清及抗菌素的McCoy′s培养基中，在室温下孵育这两种混合物15分钟。然后联合混合物，在室温下孵育15分钟。
同时，除去培养细胞的完全培养基，以50ul/孔给细胞添加无血清及抗菌素的培养基。向孔中加入转染混合物，孵育细胞三小时。然后向每孔中加入30ul/孔的无血清及抗菌素的培养基和100ul/孔的包含20％胎牛血清的无抗菌素的完全培养基。
在第3天，利用如上所述的实时定量PCR技术测量XIAP RNA水平。在第4天，用ELISA测量XIAP蛋白水平(图1A，1C，1E，1G，1I和1K)，用生物化学技术测量总细胞蛋白质(图1B，1D，1F，1H，1J和1L，用来使XIAP蛋白水平标准化)。将结果与模拟转染样品(用转染试剂处理，但没有添加寡核苷酸DNA，接下来按照处理其它样品的方法进行处理)的结果进行比较。时间过程实验确定蛋白质降低的最佳时机大约为12-24小时。
也在适当的最佳时间利用如上所述的引物和探针，用TaqMan特异的PCR引物和荧光探针对寡核苷酸库进行了筛选，以选择能降低RNA水平的寡核苷酸。时间过程实验确定mRNA在6-9小时出现最佳减少。这些结果与蛋白质的结果一致。
第一个筛选(虽然在可能由于非转染细胞的生长使XIAP水平恢复正常的亚最佳时间点进行)从测试的96个核碱基寡聚物中鉴定出16个反义寡核苷酸(表1：C2，E2，E3，F3，C4，D4，E4，F4，G4，C5，D5，B6，F6，D7，D8，F8)，与模拟(没有核碱基寡聚物)转染水平(图1A，1C，1E，1G，1I和1K)相比，这16个反义寡核苷酸使相对于总蛋白的XIAP蛋白水平显示出一些下降。这16个核碱基寡聚物中的每一个都导致总蛋白降低，这表明这些核碱基寡聚物具有毒性或抑制细胞效应(图1B，1D，1F，1H，1J，1L)。核碱基寡聚物B9和C9显示出清楚的总蛋白降低，但没有出现XIAP蛋白水平的相对下降。
基于上述的时间过程研究(图2B)，在更合适的时间点(12小时)对这16个使相对XIAP蛋白水平与模拟转染相比显示出一些下降的反义核碱基寡聚物的降低XIAP蛋白质的能力进行了单独的或联合的再测试，其中测试包括一个对照核碱基寡聚物(D2)。也检测了这些核碱基寡聚物在12小时降低XIAP mRNA水平的能力，其中用GAPDH水平将XIAP mRNA水平标准化，并与模拟转染的结果相比较。也确定了12小时时的总蛋白浓度(图2C)。
核碱基寡聚物降低XIAP蛋白水平的能力(图2B)和它降低XIAP mRNA水平的能力(图2A)之间有很好的相关性。另外，在这个早期时间点，也没有出现较多的总蛋白损失，在晚些的时间点可以看到XIAP mRNA和蛋白质的下降出现在总蛋白的下降之前。确定单独或两个以1∶1联合形式添加的能显示出大于50％的XIAP蛋白质或mRNA水平损失的核碱基寡聚物为最好的核碱基寡聚物，并进行更进一步地证实。依据使用的转染条件，或以联合形式使用时(如C5和G4)，在这16个寡核苷酸中的十个(E2，E3，F3，E4，F4，G4，C5，B6，D7，F8)显示出一致的降低XIAP蛋白质或RNA水平超过50％的能力。而且，这些显示出反义活性的16个寡核苷酸簇生在XIAP mRNA的四个不同的目标区，其中目标区相邻的核碱基寡聚物显示出一些降低的活性。用靶向这些区域之间的序列的核碱基寡聚物或敏感性的岛状物几乎没有观察到反义活性。推测这些区域代表细胞内部核碱基寡聚物能到达的mRNA上的开放区。两个核碱基寡聚物E3和F3靶向正好位于起始密码子上游，在IRES和翻译起始位点之间的过渡区内的XIAP区，与IRES元件的末端重叠。C2，D2和E2靶向最小IRES元件上游的XIAP区域，为最小IRES区域是活体内核碱基寡聚物不易到达的RNA的高度组织区域提供了更进一步的证据。所有其它的核碱基寡聚物与编码区域的一部分互补，包括一串在XIAP序列的856-916位置(E4，F4和G4)和较小的分开区域的寡聚物，例如，如核碱基寡聚物C5和D5所示。
转染后9小时，在NCI-H460细胞中，再次筛选了表2中描述的96个核碱基寡聚物中的一部分寡聚物降低XIAP mRNA的能力。数据概括在下表5中。
                                表5
  2x2 MBO   XIAP RNA   Std.Dev.   2x2 MBO   XIAP RNA   Std.Dev.
  Untrf.Co.   1.04   0.055   A6 as   0.27   0
  Mock Co.   1.01   0.006   D6 as   0.39   0.03
  G4 sm   0.97   0.071   G6 as   0.3   0.01
  DE4 rev   1.06   0.121   H6 as   0.31   0.01
  A1 as   0.46   0.01   C7 as   0.27   0.02
  B1 as   0.34   0.03   D7 as   0.52   0.04
  C1 as   0.3   0.04   F7 as   0.3   0.04
  D1 as   0.25   0.03   G7 as   0.66   0.04
  E1 as   0.31   0.01   H7 as   0.49   0.01
  F1 as   0.19   0.01   C8 as   1.01   0.08
  G1 as   0.67   0.03   D8 as   0.55   0.04
  H1 as   0.87   0.03   F8 as   0.62   0
  A2 as   0.42   0.02   G8 as   0.64   0.06
  B2 as   0.45   0.03   H8 as   0.61   0.06
  C2 as   0.33   0.02   A9 as   0.46   0.02
  D2 as   0.66   0.01   B9 as   0.74   0.07
  E2 as   0.44   0.01   D9 as   0.73   0.04
  F2 as   0.64   0.02   E9 as   0.69   0.06
  G2 as   0.44   0.01   F9 as   0.97   0.15
  H2 as   0.56   0.04   A10 as   0.85   0.04
  A3 as   0.71   0.03   C10 as   0.56   0.01
  B3 as   0.64   0.08   D10 as   0.54   0.01
  C3 as   0.55   0.04   F10 as   0.64   0
  D3 as   0.68   0.02   G10 as   0.49   0
  E3 as   0.48   0.02   A11 as   0.36   0.03
  B4 as   0.23   0.01   B11 as   0.39   0.02
  C4 as   0.22   0.04   C11 as   0.44   0.03
  D4 as   0.48   0.04   E11 as   0.52   0.04
  E4 as   0.44   0.01   F11 as   0.36   0.05
  G4 as   0.48   0.02   G11 as   0.67   0.02
  B5 as   0.38   0.03   A12 as   0.54   0.03
  E5 as   0.52   0.05   D12 as   0.23   0.05
  G5 as   0.68   0.05   E12 as   0.26   0.01
  H5 as   0.59   0.09   F12 as   0.26   0.03
  G12 as   0.24   0.05
  H12 as   0.48   0.06
我们也确定了4X4 MBOs(全部PS，DNA残基两例都侧接了四个2′-氧-甲基RNA残基)是否能够降低H460细胞内XIAP蛋白质。如图3和4所示，在量低到31nM时，E12和另一个寡核苷酸FG8的4X4 MBs仍有效。
实施例5：XIAP反义核碱基寡聚物增加细胞毒性和化学致敏性
我们对XIAP反义核碱基寡聚物是否可以使高度耐药的T24细胞对传统的化疗剂，例如阿霉素或顺铂敏感进行了研究。选择能代表一些不同XIAP目标区的反义寡核苷酸，对它们单独的或与其它的寡核苷酸或药物联合的细胞毒性影响进行测试。测试了五个XIAP反义寡核苷酸杀死或化学致敏T24膀胱癌细胞的能力，并与三个对应的混杂对照寡核苷酸的效果进行了比较。
用XIAP反义寡核苷酸，混杂的寡核苷酸，无寡核苷酸(模拟转染)转染T24细胞，或不处理T24细胞。在转染20小时之后(除未处理对照外)，利用WST-1四唑染料测定方法测试细胞成活力，其中在测试中WST-1四唑染料在代谢活性细胞中被还原成着色甲月替产物(图5A)。
通过察看未处理的，模拟转染的，用E4，用E4混杂对照，E4反极性或E4错配寡核苷酸转染的T24细胞，研究了寡核苷酸E4引起的细胞毒性事件。在转染二十小时之后，检查细胞形态(图5D)。只有用反义E4寡核苷酸转染的细胞显示出毒性征象。
为了研究核碱基寡聚物化学致敏T24细胞，使其对顺铂或阿霉素敏感的效果，在固定剂量的阿霉素(0.5ug/ml)存在时，对寡核苷酸更进一步地杀死T24细胞的能力进行了测试。首先用寡核苷酸转染细胞，然后在另外的20小时添加阿霉素。在20小时的药物治疗结束时，用WST-1测量成活力(图5B)。用与单独核碱基寡聚物治疗相比较的百分比成活力将结果显示在图5C中。
与模拟(没有寡核苷酸)转染的细胞，或用三个对应于F3(5′-mCmAmGAGATTTCATTTAAmCmGmU-3′；SEQ ID NO：275)，E4(5′-mCmUmACGCTCGCCATCGTmUmCmA-3′；SEQ ID NO：276)和C5(5′-mUmGmCCCAAGAATACTAGmUmCmA-3′；SEQ ID NO：277)的混杂对照相比，所有测试的五个核碱基寡聚物(F3，E4，G4，C5，D7)，E4+C5和G4+C5组合在24小时之后都能杀死T24细胞，只留下10-15％的存活细胞(图5A和5C)。因此，毒性对那些降低XIAP水平的核碱基寡聚物来说是序列特异的，没有因为核碱基寡聚物的一般化学作用而出现非序列特异的毒性。这些细胞毒性可能是由XIAP蛋白质的降低(和通过XIAP提供的抗凋亡预期损耗)和转染本身的毒性的综合效应引起的。
在三个小时转染周期结束时，添加固定剂量的阿霉素或顺铂会导致一些测试的寡核苷酸引起更进一步的存活率下降，在20小时之后，核碱基寡聚物F3，D7和G4+C5组合(图5B)引起的存活率与它们对应的寡核苷酸治疗值相比，更进一步地下降了40％(图5C)。将图5B中的数值(寡核苷酸加药物)与图5C中单独用寡核苷酸的数值相比较，在图5C中每一个ODN被设置为100％。只显示了对阿霉素化学致敏的结果；当用顺铂化学致敏细胞时可获得类似的结果。在使用固定剂量时，当用阿霉素处理时，模拟和混杂对照转染不显示任何增加的存活率损失(图5B)。只有当XIAP水平被特异的反义寡核苷酸降低时才能见到化学致敏。
实施例6：反义寡核苷酸对H460细胞的XIAP mRNA的下调效果
通过利用实时PCR研究了反义寡核苷酸(2x2MBO，由在任意一侧以硫代磷酸酯键侧接的两个2′-氧-甲基RNA残基和15个磷酸二酯DNA残基中心核组成)对H460细胞XIAP mRNA的影响。在这种构型中，与未处理的对照相比，核碱基寡聚物F3，G4，C5，AB6和DE4降低mRNA水平达50-70％，而D7 AS核碱基寡聚物降低mRNA水平30％(图6)。相反，对照核碱基寡聚物和单独的转染试剂(LFA)只能降低少于未处理对照20％的mRNA水平(图6)。选择核碱基寡聚物F3，G4和C5进行进一步的体外和体内研究。图7和8中描述了通过TaqMan分析观察到的另外的XIAPmRNA降低。
实施例7：反义寡核苷酸对XIAP蛋白质的下调效果
我们通过蛋白印迹分析描绘了寡核苷酸构型中的核碱基寡聚物F3，G4和C5影响XIAP蛋白质表达效能的特征(图9，10A和10B)。G4 AS寡核苷酸对XIAP蛋白质显示出最强的下调作用，1.2uM的浓度在转染结束后24小时能降低XIAP蛋白水平62％(图10A和10B)。F3AS寡核苷酸在1.2uM能降低XIAP蛋白水平50％，而与对照相比，C5 AS寡核苷酸不显示序列特异效应(图10B)。在另外的研究中，E12和FG8 AS寡核苷酸能显著降低XIAP蛋白水平(图9)。
实施例8：XIAP AS寡核苷酸诱导凋亡
在已经显示XIAP AS核碱基寡聚物能够降低H460细胞和T24膀胱癌细胞的成活力之后，我们对是否因为诱导凋亡引起观察到的细胞死亡进行了测定。如图11A所示，用1.2uM的F3或G4 AS寡核苷酸处理H460细胞能活化和降低前胱冬酶-3蛋白质，降低量与未处理的对照细胞相比，分别为蛋白水平的40％或60％。PARP也是预计的胱冬酶-3产生的片断(图11A)。相反，1.2uM的F3和G4 SC寡核苷酸对照对胱冬酶-3或PARP蛋白质表达不产生任何影响(图11A)。用1.2uM的F3和G4 AS寡核苷酸，以及它们各自的对照处理的H460细胞中的Bcl-2∶Bax比例未改变。利用流式细胞计数法来检测用G4 AS寡核苷酸处理，用PI染色的H460细胞中的亚二倍体DNA含量(图12A)。与未处理对照细胞的16.6％相比，当用1.2uM的G4 AS寡核苷酸或混杂对照寡核苷酸处理H460细胞时，细胞的亚(hypo)二倍体DNA含量分别是40.8和22.1％。用DAPI染色来检测用1.2uM的G4 AS寡核苷酸或混杂对照寡核苷酸处理的H460细胞的核形态变化。如图12B所示，用G4 AS寡核苷酸处理的细胞经受了凋亡特有的形态变化，包括染色质凝缩和核DNA断裂。在G4 SC处理的对照细胞中，几乎没有细胞显示出这些形态变化。
实施例9：通过AS寡核苷酸抑制细胞生长，使H460细胞对抗癌剂致敏
为了分析与下调XIAP表达和凋亡有关的核碱基寡聚物的生物效应，通过MTT测定对G4 AS寡核苷酸处理的H460细胞的生长进行了研究。在转染后四十八小时，G4 AS寡核苷酸已经以剂量依赖方式降低了H460细胞的生长，在1.2uM时，相对于未处理的对照水平显示出55％的降低(图13A)。相反，G4 SC寡核苷酸或单独的转染试剂的生长抑制效果相当低，不及它们的未处理对照的10％。
为了研究XIAP表达的下调是否具有使H460细胞对化疗敏感的潜能，利用G4 AS寡核苷酸和下列抗癌药中的一种实施了组合治疗：阿霉素(DOX)、紫杉酚、长春瑞滨(VNB)和依托扑沙(Etop)。图13B显示与单独用G4 AS寡核苷酸或抗癌药相比，每一个组合对细胞死亡都产生至少一种附加的细胞毒素影响。
实施例10：G4 AS寡核苷酸对H460和LCC6肿瘤异种移植物的抗肿瘤效力
我们首先确定瘤内注射XIAP反义2x2-MBOs到携带皮下H460人肺癌异种移植物的SCID-RAG2小鼠体内是否会降低肿瘤生长量。在肿瘤细胞接种(s.c.，肩注射106细胞)14天后，通过注射MBOs(50ug2′-氧-甲基RNA寡核苷酸/克肿瘤)到可触知的肿瘤块内开始治疗，每周注射三次，持续两周。在第17和24天，注射长春瑞滨(VNB，也被称为诺维本(NVB)，(15mg/kg，腹膜内注射)。每周用测径器测量肿瘤大小三次。在治疗周期结束时(第24天)，与用混杂对照MBOs和VNB处理的那些小鼠相比，用C5+G4 AS MBOs和VNB联合处理的小鼠的平均相对肿瘤生长降低了～70％。与混杂对照相比，用C5AS MBO和VNB治疗导致肿瘤大小减少了～60％(图14)。
设计的初始系统性PS寡核苷酸研究没有任何化疗剂。给SCID-RAG2小鼠接种H460人肺癌细胞(s.c.，肩注射106细胞)，在肿瘤接种后三天开始用G4和F3 AS PS寡核苷酸，以及混杂对照进行治疗。以12.5mg/kg的剂量腹膜内注射施用核碱基寡聚物注射剂，一周注射三次，持续三周。在治疗周期结束时，G4或F3 AS寡核苷酸处理组的平均肿瘤大小比混杂对照寡核苷酸处理组的平均肿瘤大小小～50％(图15)。对正位接种了MDA-MB-435/LCC6人乳腺癌细胞的雌性SCID-RAG2小鼠进行了相同治疗规程的测试。最后一次治疗两周后(第35天)，用F3，C5或G4 AS寡核苷酸处理的小鼠的肿瘤体积分别小于载体对照组的肿瘤体积70％，60％和45％(图16)。
我们在接受皮下植入H460人非小细胞肺肿瘤异种移植物的SCID-RAG2小鼠体内对G4 AS寡核苷酸的抗肿瘤效果进行了附加研究。盐水治疗的对照肿瘤在大约24天内可繁殖生长到0.75cm3大小(图17)。在肿瘤细胞接种之后三天开始寡核苷酸治疗。依据在第3-7，10-14和17-21天每天一次腹膜内注射的治疗时间表施用G4 AS寡核苷酸(5-15mg/kg)。用5或15mg/kg G4 AS寡核苷酸治疗能大大延迟肿瘤生长：在第24天，对照组，5和15mg/kg治疗组的平均肿瘤大小分别是0.75，0.45和0.29cm3(图18A)。肿瘤生长抑制呈剂量依赖性。用15mg/kg G4 AS寡核苷酸治疗的小鼠体内的肿瘤大小显著地小于对照组，是对照组平均肿瘤大小的39％。相反，施用15mg/kg的G4 SC寡核苷酸没有产生治疗活性(图17)。寡核苷酸处理的小鼠都没有表现出任何毒性迹象，能很好地耐受两个剂量的寡核苷酸。选择15mg/kg的剂量用于将来与抗癌药进行组合治疗。
实施例11：用G4 AS寡核苷酸处理的H460肿瘤中XIAP表达降低
为了将G4 AS寡核苷酸的肿瘤生长抑制效果与XIAP蛋白质表达相关联，在15mg/kg的G4 AS和SC寡核苷酸体内治疗结束时，我们研究了XIAP表达的变化。在肿瘤接种后21天或24天，当肿瘤达到1cm3大小(图17)时，收获肿瘤，用取自肿瘤匀浆的溶胞产物进行蛋白印迹分析。使用了针对人蛋白质的XIAP和β-肌动蛋白抗体，要考虑到确定从肿瘤细胞样品中获得人XIAP水平没有受来源于小鼠细胞的XIAP的污染。用G4 AS寡核苷酸处理的肿瘤内的XIAP蛋白水平被显著地降低为对照组的大约85％(P＜0.005)(图18A和18B)。用G4 SC寡核苷酸处理的肿瘤的大小降低量为对照肿瘤的24％。这些结果表明G4 AS寡核苷酸抑制H460肿瘤生长与XIAP蛋白质的表达下调相关联。
实施例12：肿瘤样品的病理组织学
为了评估XIAP AS寡核苷酸给药是否能导致直接杀死肿瘤细胞，我们在治疗后研究了肿瘤的组织结构，以了解其形态和泛素免疫染色情形(图19A和19B)。在肿瘤接种后21天或24天，切除用15mg/kg的G4AS寡核苷酸，SC寡核苷酸或盐水对照处理的肿瘤，并制成切片，用苏木精和伊红染色。结果表明施用给定XIAP AS寡核苷酸进行治疗的动物体内的肿瘤包含数量增加的，通过无定形形状和凝缩的核质从形态学上被鉴定的死细胞(图19A)。
蛋白质降解主要是泛素蛋白酶体依赖性的；在凋亡期间已经观察到泛素表达增加。因此，我们研究了用于苏木素伊红染色的肿瘤切片的泛素表达。如图19B所示，相对于对照或SC ODN治疗小鼠体内的肿瘤，施用了XIAP AS寡核苷酸的小鼠体内的肿瘤表现出更强烈的免疫组织化学的染色。这些数据表明XIAP AS碱基寡核苷酸治疗的肿瘤细胞中有比对照肿瘤更多的游离泛素和/或泛素化蛋白质。
实施例13：G4 AS寡核苷酸和长春瑞滨的联合治疗
为了评估G4 AS寡核苷酸和一种用于治疗肺癌的化疗剂-长春瑞滨(VNB)的联合治疗是否可以产生任何协同效应，我们比较了存在和不存在G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸时VNB的治疗效能。在肿瘤接种之后第3天开始治疗。图20A显示了给负载了H460肿瘤的小鼠施用5mg/kg和10mg/kg剂量的VNB时产生的体内效力，并与盐水对照组进行了比较。两种给药方法都以剂量依赖方式导致显著的肿瘤生长抑制，没有显示出明显的不良毒性征兆(即，体重减轻)。当联合施用G4 AS寡核苷酸(15mg/kg)和VNB(5mg/kg)治疗H460肿瘤时，能观察到与单独施用任何一种物质相比更显著的H460肿瘤生长迟滞(图20B)。而且，小鼠不显示出任何明显的毒性征兆(即，体重减轻)。在第29天，将存在或不存在G4 AS或SC寡核苷酸时，用5mg/kg VNB治疗的小鼠体内的平均肿瘤大小进行了比较(图20A和20B)。VNB和G4 AS寡核苷酸治疗组的平均肿瘤大小是0.22±0.03cm3，这显著小于5mg/kg VNB单独治疗或5mg/kg VNB与G4 SC寡核苷酸联合治疗的动物体内的平均肿瘤大小(分别是0.59±0.04和0.48±0.05cm3)。
方法
利用下列方法获得实施例5-13中得到的结果。
寡核苷酸合成
合成96个以上不相重叠的嵌合的或骨架混合的(MBO)的长度为19个碱基的反义寡核苷酸作为2x2 MBO，其中2x2 MBO由在任意一侧以硫代磷酸酯键侧接的两个2′-氧-甲基RNA残基和15个磷酸二酯DNA残基中心核组成。用SephadexG-25色谱仪(IDT Inc.，Coralville，IA)除去每一个最终产物的盐分。这种嵌合的wingmer构型，以及硫代磷酸酯和磷酸二酯键(称为2x2PS/PO)的混合提供了足够的稳定性，同时也降低了与硫代磷酸酯残基有关的非特异毒性。用Trilink Biotech合成供体内和体外试验的完全硫代磷酸酯化的非嵌合(DNA)反义寡核苷酸，用RP-HPLC进行纯化。
反义寡核苷酸的筛选
为了确定每个寡核苷酸下调XIAP蛋白质的能力，对1-1.2uM寡核苷酸-lipofectin复合物转染24-48小时的T24膀胱癌细胞进行了评价。在T24膀胱癌细胞和H460肺癌细胞中，(i)通过western分析再次证实阳性寡核苷酸在转染12-18小时降低XIAP蛋白水平的能力，和(ii)通过定量RT-PCR(见下文)再次证实阳性寡核苷酸在转染6-9小时降低XIAP mRNA水平的能力。更进一步地鉴定和测试候选的寡核苷酸。在6-9小时，鉴定的2x2PS/PO嵌合寡核苷酸在400-1200nM的浓度范围内显示出剂量依赖性的降低XIAP mRNA水平的能力。示例的寡核苷酸显示在表6中。
                            表6
  寡核苷酸   序列*   SEQ IDNO：
  F3 AS   ATCTTCTCTTGAAAATAGG   (PS)   278
  F3 AS   AUCTTCTCTTGAAAATA GG   (2x2 PS/PO)   279
  F3 RP   GGATAAAAGTTCTCTTCTA   (PS)   280
  G4 AS   GCTGAGTCTCCATATTGCC   (PS)   281
  G4 AS   GCTGAGTCTCCATATTG CC   (2x2 PS/PO)   282
  G4 SC   GGCTCTTTGCCCACTGAAT   (PS)   283
  C5 AS   ACCATTCTGGATACCAGAA   (PS)   284
  C5 AS   ACCATTCTGGATACCAG AA   (2x2 PS/PO)   285
  C5 RP   AAGACCATAGGTCTTACCA   (PS)   286
  AB6 AS   GGGTTCCTCGGGTATATGG   (PS)   287
  AB6 RP   GGTATATGGCGTCCTTGGG   (PS)   288
  DE4 AS   GGTATCTCCTTCACCAGTA   (PS)   289
  DE4 RP   ATGACCACTTCCTCTATGG   (PS)   290
  D7 AS   GATTCACTTCGAATATTAA   (PS)   291
  D7 RP   AATTATAACGTTCACTTAG   (PS)   292
粗体残基＝具有硫代磷酸酯键的DNA残基，带下划线的残基＝2′-氧-甲基RNA碱基，普通类型＝磷酸二酯DNA残基。
肿瘤细胞系和异种移植动物模型
从ATCC获得人非小细胞肺癌细胞系(大细胞类型)NCI-H460(H460)，37℃在包含5％CO2的湿润空气中将细胞维持在补充了10％FCS的RPMI1640中。使用指数生长期的细胞，体外传代最大可达25代。从英国哥仑比亚省癌症机构联合的动物实验室繁殖地(British Columbia British ColumbiaCancer Agency Joint Animal Facility breeding colony)获得雄性SCID-RAG2小鼠(7-9周大，23-26g)，饲养在无菌环境中。通过在小鼠背部皮下植入1×106的NCI-H460细胞在SCID-RAG2小鼠中建立NCI-H460细胞的肿瘤模型。
用反义核酸和抗癌药处理细胞
转染前一天，将H460细胞平铺在6孔或96孔组织培养皿中。用Lipofectamine 2000(Life Technologies)以脂质体-寡核苷酸复合物的形式将硫代磷酸酯反义寡核苷酸递送到细胞中。在转染4.5或6小时后，用包含10％FBS的RPMI培养基替换转染培养基，再孵育细胞24或48小时。
实时定量RT-PCR
利用RNeasy微型离心法柱和DNase处理(QIAGEN Valencia，CA)立即从脂质体-寡核苷酸复合物处理6小时的H460细胞中分离总RNA。用实时定量RT-PCR方法测量特异的XIAP mRNA。设计的XIAP正反向引物(600nM)和探针(200nM)(5′-GGTGATAAAGTAAAGTGCTTTCACTGT-3′(SEQ ID NO 293)，6FAM-CAACATGCTAAATGGTTCCAGGGTGCAAATATC-TAMRA(SEQ ID NO：294)和5′-TCAGTAGTTCTTACCAGACACTCCTCAA-3′(SEQ ID NO：295)跨越了外显子3-4和4-5的结合点。为阻止检测出任何可能的基因组DNA污染物，其中的一个引物和探针被设计成重叠内含子-外显子边界的形式。利用TaqMan EZ RT-PCR试剂盒(PE/ABI，Foster City，CA)在ABI棱镜7700序列检测系统(ABI prism 7700 Sequence Detection System)(PE/ABI)中反转录和PCR扩增RNA。RT步骤的热循环条件是50℃2分钟，60℃30分钟，95℃5分钟，然后进行45个PCR循环(每个循环94℃20秒，60℃1分钟)。相对于未处理的对照细胞计算每个样品的XIAP mRNA水平。利用基线SD30X的阈值，用PE/ABI提供的引物和探针通过循环阈方法(Ct)确定XIAPmRNA水平，参照GAPDH含量将XIAP水平标准化。
蛋白印迹分析
用冰冷的包含蛋白酶抑制剂(完全的微型蛋白酶抑制片剂；BoehringerMannheim GmBH，曼海姆，德国)的溶解缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，2.5mM EDTA，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸钠，1％NP-40，0.02％叠氮化钠)溶解细胞或肿瘤组织样品。在冰上孵育30分钟后，以10,000rpm将样品离心15分钟，保存在-20℃。利用去污剂-相容的Bio-Rad测定(Bio-Rad Labs，Hercules，CA)确定溶解的提取物中的蛋白含量。在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶或4-15％的梯度SDS-聚丙烯酰胺预制凝胶(Bio-Rad)上分离等量的蛋白质(40ug/泳道)，并将蛋白转移到硝酸纤维薄膜上。使用了针对XIAP，Bcl-2(DAKO，Glostrup，丹麦)，Bax(Sigma，St.Louis，MO)，β-肌动蛋白(Sigma)，胱冬酶-3(BD PharMingen San Diego，CA)和PARP(BD PharMingen)的第一抗体。第二抗体是适当的结合辣根的抗小鼠或抗兔IgG(Promega，Madison，WI)。利用增强的化学发光(ECL；Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，英国)来检测蛋白质，曝光到Kodak放射自显影薄膜后进行目测检验。实施光密度扫描(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)，通过体积/面积积分来量化条带的强度。在剥离和再探查时，用各自泳道的β-肌动蛋白水平将细胞内的XIAP，胱冬酶-3，Bcl-2和Bax标准化。
细胞生长以及成活或死亡测量
通过比色MTT细胞成活力/增殖测定来确定H640细胞的生长抑制。简而言之就是用脂质体-寡核苷酸复合物处理细胞4.5小时，然后在存在或不存在抗癌药的条件下，37℃在没有转染试剂或寡核苷酸的培养基中再孵育48小时。向每孔中加入MTT(25ug/孔)，在37℃孵育平皿3小时。孵育步骤后，加入200ul DMSO溶解着色甲月替产物。利用微量滴定板读数器(Dynex Technologies Inc.，Chantilly，VA)在570nm波长处读出平皿读数。参照未处理的对照，将寡核苷酸处理孔中的成活细胞的百分比标准化。所有测定都以一式三份方式实施。
凋亡的流式细胞计数测定
用脂质体-寡核苷酸复合物处理细胞4.5小时，37℃在没有转染试剂或寡核苷酸的培养基中再孵育48小时细胞。孵育后，收获细胞，用样品缓冲液(存在于不含Ca++和Mg++的PBS中的0.5％的葡萄糖)洗涤细胞两次，4℃在70％冷乙醇中固定至少18小时。以3000rpm离心样品10分钟，然后再将样品悬浮在含有50ug/ml碘化丙啶(PI)和400U/ml RNase的样品缓冲液中。室温下和冰上各孵育样品30分钟，接下来进行流细胞计数分析。用EXPO软件(Applied Cytometry Systems，Sacramento，CA)形成直方图，直方图被用来确定排除碎片之后的细胞周期相分布。认为亚Gl/GO细胞分数代表凋亡细胞。
核形态
用脂质体-寡核苷酸复合物处理细胞4.5小时，37℃在没有转染试剂或寡核苷酸的培养基中再孵育细胞48小时。收获细胞，用0.10ug/ml DAPI(4′，6二脒基-2-2-苯吲哚)(4′，6-diamidino-2-2-phenylindole)在室温下染色30分钟。将细胞放置在玻片，细胞离心涂片(cytospun)上，用Leica显微镜和40X物镜在UV荧光照明下进行观察。利用Imagedatabase V4.01软件(Leica，德国)捕获数字图像。
体内抗肿瘤活性
在负载NCI-H460肿瘤的雄性RAG2免疫缺陷小鼠或负载LCC6肿瘤的雌性RAG2小鼠体内进行效力实验。在肿瘤接种之后第3天开始治疗。每天腹膜内注射施用盐水(对照)、G4AS寡核苷酸(5或15mg/kg)或G4 SC寡核苷酸(5或15mg/kg)，每周注射5剂，持续三周。在肿瘤接种之后第3，7，11和17天，由尾静脉通过静脉内施用长春瑞滨(VNB，5或10mg/kg)，可单独施用或与寡核苷酸联合一起施用。当与VNB结合施用寡核苷酸时，在ODN处理之后四小时实施药物治疗。
每天观察小鼠。用体重测量和应激征象(例如昏睡、波纹表皮、共济失调)来检测可能的毒性。肿瘤形成溃疡或肿瘤体积达1cm3或更大时动物被杀死。利用公式：1/2[长(cm)]×[宽(cm)]2将肿瘤的数字测径器测量值转变为平均肿瘤大小(cm3)。利用从每组的至少两个独立实验获得的每只小鼠的平均肿瘤大小来计算组平均肿瘤大小±SE(n＝6只小鼠)。
肿瘤和组织处理
在肿瘤接种和处理后第21或第24天收集小鼠肿瘤。一部分肿瘤组织固定在福尔马林中。将石蜡包埋组织切片，利用苏木素伊红染色进行大体病理组织学实验，进行免疫组织化学研究泛素表达。在溶解缓冲液中将肿瘤的另一部分匀浆用于蛋白印迹分析(参见上面)。
统计分析
利用学生t检验来测定两个处理组间的统计显著性。利用单向ANOVA(方差分析)，以及通过Shelle检验标准(Statistica release 4.5，StatSoft Inc.Tulsa，OK)比较不同处理组的post-hoc测试来进行多重比较。P＜0.05时，认为数据有意义。
实施例14：反义HIAP1寡核苷酸减少HIAP1 RNA和多肽表达
在两个不同的条件下，利用上述实施例3中描述的引物和探针，通过蛋白印迹分析从作为寡核苷酸的15个HIAP1反义核碱基寡聚物组成的库中筛选能下调蛋白质的寡聚物，通过TaqMan从库中筛选能下调RNA的寡聚物。可以利用标准northern印迹分析或RT-PCR技术来检测HIAP1 RNA水平。在基础条件下或在放线菌酮诱导(用亚中毒剂量处理24小时)条件下给细胞施用反义寡核苷酸。放线菌酮(CHX)可以导致诱导出10-200倍的HIAP1 mRNA，具体值取决于处理的细胞系。这将依次导致HIAP蛋白质增加，在蛋白印迹中能看到这一点(70kda的条带)。CHX的这些效果是由两个不同的作用机理引起的。首先，CHX通过阻断NFkB的抑制剂——一种不稳定的蛋白质IkB的从头合成而活化NFkB，NFkB是一种已知的HIAP1翻译诱导物。另一种蛋白质合成抑制剂嘌呤霉素，以及诱导信号级联反应的TNF-α可模拟该效果，其中信号级联反应导致产生磷酸化，ubiquination和IkB降解。只有CHX导致更进一步地稳定HIAP1 mRNA，从阻挡从头转录的放线菌素D和CHX存在时，HIAP1信使的消失速率降低能看出这一点，当放线菌素D和嘌呤霉素或TNF-α联合时结果则相反。
用lipofectin和寡核苷酸(混杂的存活蛋白，无寡核苷酸，反义APO 1到APO 15)转染SF295恶性胶质瘤细胞或不处理细胞。在转染之后六小时从细胞中分离RNA，利用定量PCR(TaqMan分析)测定HIAP1 mRNA的水平，参照GAPDH mRNA将结果标准化，其中混杂的存活蛋白寡核苷酸转染后的值设置为1.0。该实验的结果，即编纂的三个单独实验的结果显示在图21中。混杂的存活蛋白寡核苷酸，模拟转染和未处理的(未转染)细胞都显示出类似的HIAP1 mRNA水平。与模拟转染或存活蛋白混杂对照寡核苷酸转染(5′-mUmAmAGCTGTTCTATGTGmUmUmC-3′；SEQ ID NO：296)相比，这15个反义寡核苷酸中的七个(APO 1，2，7，8，9，12，15)显示出几乎50％的降低(图21)。一些寡核苷酸导致诱导HIAP1 mRNA，这可能是对非特异中毒寡核苷酸的应激反应。如果寡核苷酸能干扰翻译过程，那么即使信使RNA增加，反义寡核苷酸可能仍能有效降低HIAP1蛋白水平。
在诱导表达HIAP1的细胞中，也研究了HIAP1反义核碱基寡聚物对HIAP1蛋白质和mRNA表达的影响。用寡核苷酸转染或模拟转染SF295细胞。然后用10ug/ml的放线菌酮处理转染细胞24小时以诱导70kDa HIAP1mRNA和蛋白质。用抗-HIAPI多克隆抗体，通过蛋白印迹分析测定蛋白水平，在相同印迹的探察中，参照肌动蛋白将蛋白水平进行标准化。蛋白印迹结果的扫描显示在图22A中。在图22B中画出了相对于模拟结果(设置为100％)的光密度扫描结果图。在50％处画线很容易鉴定出最有效的反义寡核苷酸。与未处理样品相比，转染过程本身(例如，模拟或混杂的存活蛋白)会诱导HIAP 1蛋白质，western免疫印迹中已经显示这一点。
这15个测试核碱基寡聚物中的六个(APO 1，2，7，8，12，15)显示出高活性，或在蛋白质和mRNA测定中都具有显著活性，而且不导致应激反应诱导的HIAP1 mRNA增加，但APO 4，6，11，13，14和APO 2的对照寡核苷酸(错配或反极性，见下文和图23，24)都导致HIAP1 mRNA增加(图21)。注意，APO 6也显示出毒性迹象，从总蛋白的广泛下降能看出这一点(图23)。
为了更进一步地研究在放线菌酮诱导条件下HIAP 1反义寡核苷酸的效力，在APO 2转染之后6小时用TaqMan实时PCR测定HIAP1 mRNA的变化，其中APO 2靶向HIAP1内含子内的Alu重复，能最大程度地阻断CHX诱导的HIAP1 mRNA和蛋白质上调。这实验的对照是针对APO 2的三个寡核苷酸：一个混杂序列(除了顺序随机外，碱基组成相同，5′-AAGGGCGGCGGAGTGAGAC-3′；SEQ ID NO：297)，一个反极性序列(除了方向相反外，碱基组成相同，序列顺序相同5′-AGAGGACGGAGTCGGAGGC-3′；SEQ ID NO：298)，和一个错配序列(在19个碱基中包含四个错配，5′-CGGAGCGTGAGGATGAGA-3′；SEQ IDNO：299)。
与混杂的存活蛋白对照相比，APO 2反义转染到细胞内导致mRNA降低50％，与蛋白质结果完全相配，而APO 2的混杂对照(图24中的H1 sc apo2)根本不改变HIAP1 mRNA水平(这里重复两次，在两个不同的实验中进行)。然而，结果却显示错配对照ODN(H1 mm apo 2)和反极性对照寡核苷酸(H1 RV apo 2)6小时时诱导6-7倍的HIAP1 mRNA。正如所料，这些寡核苷酸不再靶向HIAP1，但仍可以因为简并性和这些序列的重复性靶向Alu重复。因此，这两个对照对细胞有毒性，会产生导致HIAP1被诱导的应激反应是可能的。反义APO 2寡核苷酸也可能产生该影响，但在这种情况下，APO 2也会使诱导的HIAP1 mRNA降解，与混杂的存活蛋白对照相比，最终导致HIAP1 mRNA的相对降低，而且与混杂的存活蛋白对照相比，在转染和CHX处理之后会降低HIAP1蛋白质的相对诱导倍数。
这六个反义HIAP1核碱基寡聚物包括两个非常有效的针对内含子序列的寡核苷酸(APO 1和APO 2，APO 2显示出更好的活性)。在治疗上这些寡核苷酸能用于癌症或自身免疫紊乱的治疗。针对内含子序列的寡核苷酸可能只靶向前mRNA(存在时间非常短的靶标)，不靶向加工成熟形式的HIAP1。除非想通过靶向内含子-外显子界线或分支点改变拼接，否则典型地，反义核酸不靶向内含子。这通常导致遗漏外显子，而不是导致RNase介导的信使RNA的降解。两种机理可能都有利于增强凋亡，因为遗漏将导致编码HIAP1的头两个重要BIR域的外显子缺失。APO 2反义ODN也通过靶向19个碱基中的18个连续的碱基而靶向存活蛋白的内含子，但我们没有看到存活蛋白蛋白质的任何损失；在寡核苷酸治疗之后只有HIAP1被降低了，这表明了HIAP1反义寡核苷酸的特异性。这些反义寡核苷酸击中HIAP1内含子中的Alu序列以及许多其它基因中可能的Alu序列，诱导癌细胞死亡(见下文)，这可能是HIAP1和一些其它重要基因下调的结果，因此，如果对正常细胞没有太大毒性就具有治疗价值。
据报道癌细胞具有更多含有Alu的转录产物，因此可能对用靶向Alu的核碱基寡聚物诱导凋亡更敏感。此外，核碱基寡聚物APO 1和APO 2的杀死效果可能是由于靶向Alu的序列和HIAP1同时作用的综合效应引起的。当细胞暴露于某些毒性剂中时，这一双重效应将成为能有效防止由NFkB途径诱导的HIAP1正常应激反应的方法。应激反应很可能癌细胞抗凋亡程序的一部分。通过阻断HIAP1表达，我们计算了这种抗凋亡应激反应，因此预计了癌细胞的死亡。
实施例15：HIAP1反义寡核苷酸增加细胞毒性和化学致敏性
也对HIAP1反义核碱基寡聚物化学致敏SF295细胞的效果进行了评价。用三个不同的反义寡核苷酸(APO 7，APO 15和SCAPO 2(对照))中的一个转染细胞。寡核苷酸转染后二十四小时，将细胞与阿霉素一起再孵育24小时，其中孵育在通过测定WST-1确定细胞存活率之前进行。
图25显示了用上述HIAP1寡核苷酸转染，然后用浓度增加的阿霉素处理的SF295细胞的WST-1存活曲线。用阿霉素处理时，与用不能降低HIAP1mRNA水平的寡核苷酸处理的细胞相比，导致HIAP1 mRNA降低的两个寡核苷酸也显示存活率下降。因此，通过反义或其它方式降低HIAP1可以化学致敏对许多化学疗药的细胞毒素作用具有高度抵抗力的恶性胶质瘤细胞系。
表7中显示了能够用于本发明的方法中的另外89个HIAP1反义序列。黑体是在人HIAP1和人HIAP2之间100％相同或具有一个或两个错配的序列。
                                                             表7
  碱基寡聚物序列  SEQ ID NO：   碱基寡聚物序列   SEQ ID NO：   碱基寡聚物序列  SEQ ID NO：
  AGCAAGGACAAGCCCAGTC   300   TTAAGCCATCAGGATGCCA   332   GATTTTTCTCTGAACTGTC   364
  TGTAAACCTGCTGCCCAGA   301   GCTACAGAGTAAGCTGTGT   333   CTATAATTCTCTCCAGTTG   365
  AGAAGTCGTTTTCCTCCTT   302   CTCTAGGGAGGTAGTTTTG   334   ACACAAGATCATTGACTAG   366
  CCGAGATTAGACTAAGTCC   303   AAGAAAAGGGACTAGCCTT   335   TCTGCATTGAGTAAGTCTA   367
  ACTTTTCCTTTATTTCCAC   304   CAGTTCACATGACAAGTCG   336   TCTTTTTCCTCAGTTGCTC   368
  TCCCAAACACAGGTACTAT   305   GACTCCTTTCTGAGACAGG   337   GTGCCATTCTATTCTTCCG   369
  CATTCTCAGCGGTAACAGC   306   ATTCACACCAGTGTAATAG   338   GTAGACTATCCAGGATTGG   370
  ACCATCATTCTCATCCTCA   307   CAGAAGCATTTGACCTTGT   339   AGTTCTCTTGCTTGTAAAG   371
  AATGTAACCTTCAACCATC   308   CCAGCATCAGGCCACAACA   340   TCGTATCAATCAGTTCTCT   372
  TTTGTATTCATCACTGTC   309   TTTCAGTAGGACTGTCTCC   341   GCAGAGAGTTTCTGAATAC   373
  TCACATCTCATTACCAAC   310   TGCAGCTAGGATACAACTT   342   ATGTCCTGTTGCACAAATA   374
  CCAGGTGGCAGGAGAAACA   311   AGAGGTAGCTTCCAAGTTG   343   CTGAAACATCTTCTGTGGG   375
  TGCAGACTTCAATGCTTTG   312   GAAGTAATGAGTGTGTGGA   344   TTTCTTCTTGTAGTCTCCG   376
  TAAGCAAGTCACTGTGGCT   313   GGATTTGATGGAGAGTTTG   345   CTTCTTTGTCCATACACAC   377
  CTGAGTCGATAATACTAGC   314   GAACTTCTCATCAAGGCAG   346   GGAATAAACACTATGGACA   378
  ACTAGCCATTAGTAAAGAG   315   AGGTCCTATGTAGTAAAAG   347   CATACTACTAGATGACCAC   379
  CAACAGCAGAGACCTTGTC   316   CAATTTTCCACCACAGGCA   348   TGTACCCTTGATTGTACTC   380
  ATAGCATACCTTGAACCAG   317   CATTATCCTTCGGTTCCCA   349   GAAATGTACGAACTGTACC   381
  CATCTGTAGGCTAAGATGG   318   CTCAGGTGTTCTGACATAG   350   GATGTTTTGGTTCTTCTTC   382
  AGTTACCAGATGCCATCTG   319   GCTCAGATTAGAAACTGTG   351   CTATCATTCTCTTAGTTTC   383
  AATCTACTCTGATAGTGGA   320   CTGCATGTGTCTGCATGCT   352   ACACCTGGCTTCATGTTCC   384
  GTTTCTGAAGCCAACATCA   321   TTAACTAGAACACTAGAGG   353   GACTACAGGCACATACCAC   385
  TCAACTTATCACCTCCTGA   322   CATAATAAAAACCCGCACT   354   TGCCTCAGCCTGGGACTAC   386
  AAGAACTAACATTGTAGAG   323   CACCATCACAGCAAAAGCA   355   AGGATGGATTCAAACTCCT   387
  GTAGACAACAGGTGCTGCA   324   CTCCAGATTCCCAACACCT   356   GAGAAATGTGTCCCTGGTG   388
  ATGTCCTCTGTAATTATGG   325   GGAAACCACTTGGCATGTT   357   GCCACAACAGAAGCATTTG   389
  TACTTGGCTAGAACATGGA   326   GTTCAAGTAGATGAGGGTA   358
  GAAGCAACTCAATGTTAAG   327   GATAATTGATGACTCTGCA   359
  TTTGGTCTTTTGGACTCAG   328   ATGGTCTTCTCCAGGTTCA   360
  CCATAGATCATCAGGAATA   329   GCATTAATCACAGGGGTAT   361
  CAGGACTGGCTAACACATC   330   TAAAGCCCATTTCCACGGC   362
  TTTAATGGCAGGCATCTCC   331   TGTTTTACCAGGCTTCTAC   363
为了寻找合适的可用作反义核碱基寡聚物的序列，我们也分析人HIAP2。鉴定的序列显示在表8中。
                                表8
  碱基寡聚物序列 SEQ ID NO：   碱基寡聚物序列 SEQ ID NO：
  TTCTGAAAACTCTTCAATG   390   CTCAGAGTTTCTAGAGAAT   426
  CTTAGCATAAAGTATCAGT   391   ATGTTCTCATTCGAGCTGC   427
  CAAAAAAGTACTGCTTAGC   392   TGAACTGGAACACTAGATG   428
  CAAGATAAAACTTGTCCTT   393   GCTCAGGCTGAACTGGAAC   429
  TATCAGTCATGTTGTAAAC   394   TTGACATCATCATTGCGAC   430
  CTAAATAACCTGTTCATCA   395   ACCATCACAACAAAAGCAT   431
  AGCACACTTTTTACACTGC   396   CCACTTGGCATGTTCTACC   432
  ACCACTATTATTCTTGATC   397   TCGTATCAAGAACTCACAC   433
  TGTATTTGTTTCCATTTCC   398   GGTATCTGAAGTTGACAAC   434
  ACTGTAAACTCTATCTTTG   399   TTTCTTCTCCAGTGGTATC   435
  CTTAAGTGGGCTAAATTAC   400   TTCTCCAGGTCCAAAATGA   436
  CCTTCATATGGTCACACTA   401   ACAGCATCTTCTGAAGAAC   437
  GGTTACAAGCTATGAAGCC   402   CACAGGTGTATTCATCATG   438
  CTAAGCAACTATAGAATAC   403   CCAGGTCTCTATTAAAGCC   439
  TCCTTGATTTTTCACAGAG   404   TTCTCTCCAGTTGTCAGGA   440
  ATACTAACTTAAAGCCCTG   405   GAAGTGCTGACACAATATC   441
  GGGTTGTAGTAACTCTTTC   406   TTTTCCTTCTCCTCCTCTC   442
  TAGAACACAACTCTTTGGG   407   CATCTGATGCCATTTCTTC   443
  CTCTGAATTTCCAAGATAC   408   AGCCATTCTGTTCTTCCGA   444
  TTTACTGGATTTATCTCAG   409   CCAGGATAGGAAGCACACA   445
  TGAGTAGGTGACAGTGCTG   410   ATGGTATCAATCAGTTCTC   446
  GGAGGCAGTTTTGTGCATG   411   CCGCAGCATTTCCTTTAAC   447
  CTATCTTCCATTATACTCT   412   CAGTTTTTGAAGATGTTGG   448
  TTGTTTGTTGCTGTTTGTC   413   GTGACAGACCTGAAACATC   449
  TCCTTTCTGAGACAGGCAC   414   GGGCATTTTCTTAGAGAAG   450
  ACCAGCACGAGCAAGACTC   415   AGTACCCTTGATTATACCC   451
  ACCTTGTCATTCACACCAG   416   GAAATGTACGAACAGTACC   452
  TCCAGTTATCCAGCATCAG   417   TGAAAAACTCATAATTCCC   453
  GCTTTTGAATAGGACTGTC   418   CCATCTTTTCAGAAACAAG   454
  GAGATGTCTTCAACTGCTC   419   CTATAATTCTCTCCAGTTG   455
  GGGGTTAGTCCTCGATGAA   420   CTCCCTTAGGTACACATAC   456
  TCATTGCATAACTGTAGGG   421   ACAAGCAGTGACACTACTC   457
  GCTCTTGCCAATTCTGATG   422   GTAACTCCTGAAATGATGC   458
  ACCCTATCTCCAGGTCCTA   423   CAACAAATCCAGTAACTCC   459
  ACAGGCAAAGCAGGCTACC   424   CACCATAACTCTGATGAAC   460
  GTTCTGACATAGCATCATC   425
下文的表9也提供了其它的反义IAP核碱基寡聚物，包括在美国专利No.6,087,173的表2中描述的那些寡聚物。
                表9
  碱基寡聚物序列   SEQ ID NO：
  TAGGACTTGTCCACCTTTTC   461
  TTGAAAATAGGACTTGTCCA   462
  TCTTCTCTTGAAAATAGGAC   463
  CATCTTCTCTTGAAAATAGG   464
  GTCATCTTCTCTTGAAAATA   465
  AAGTCATCTTCTCTTGAAAA   466
  AAAAGTCATCTTCTCTTGAA   467
  TTAAAAGTCATCTTCTCTTG   468
  TGTTAAAAGTCATCTTCTCT   469
  ACTGTTAAAAGTCATCTTCT   470
  AAACTGTTAAAAGTCATCTT   471
  CAAAACTGTTAAAAGTCATC   472
  TTCAAAACTGTTAAAAGTCA   473
  GATGTCTGCAGGTACACAAG   474
  TAGCAAAAGTTTTTAATCTA   475
  GCATGACAACTAAAGCACCG   476
  AATCTGCAATTTGGGGATAC   477
  TTGTACTGACCATTCTGGAT   478
  TCTGCATGTGTCTCAGATGG   479
  ACAATACATGGCAGGGTTCC   480
  TGCCTACTATAGAGTTAGAT   481
  TAATGGAATTCAATCCTGAT   482
  CAACTAAAACACTGCCATGT   483
  TATGATGCTTCTTATTCTTA   484
  ATTTGTTAAGCCTATCTGAA   485
  TCCACCAGCATGGAACAATT   486
  AGAAAATGGACAGAATCCTA   487
  CTATCATTAAATACGCTTTC   488
  TATTAACAACATACATACTT   489
  GGTTAGGTTACTGATGTTAG   490
在美国专利6,355,194；6,165,788；6,077,709；5,958,772；5,958,771，公开号为2003/0125287 A1和2002/0137708美国专利申请，以及Carter et al.，″Regulation and targeting of antiapoptotic XIAP in acute myeloid leukemia″(Leukemia advance online publication 11 September 2003；doi：10.1038/sj.leu.2403113)和Bilim et al.，Int.J.Cancer 103：29-37(2003)中描述了在本发明的方法中有用的反义IAP核碱基寡聚物的其它序列。
其它实施方案
象具体和个别指出的合并作为参考的每份独立的出版物或专利申请的一样，在说明书中提到的所有出版物和专利申请在这里被合并作为参考。
已经采用与具体实施方案有关的方式描述了本发明，应理解它能作更进一步的修改，该申请含盖遵循本发明的原则，以及包含与本发明公开内容相偏离的内容的发明的任何变化，应用或修改，其中偏离的属于本发明所属领域的已知或常规操作的范围，可作为在上文中列出的必要特征亦在本发明范围之内。
                        序列表
<110>艾吉拉医疗股份有限公司(AEGERA Therapeutics，Inc.et al)
<120>利用反义IAP寡聚物和化疗剂治疗增生性疾病
<130>07891/039WO2
<150>60/516,263
<151>2003-10-30
<160>490
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>5，6，8，12，16
<223>n＝T或U
<400>1
aaaanncnaa gnaccngca                                                19
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，3，10，14
<223>n＝T或U
<400>2
ncnagagggn ggcncagga                                                19
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>5，7，9，11，13，19
<223>n＝T或U
<400>3
cagananana ngnaacacn                                            19
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
    每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，10，11，12，13，14，15，16，18，19
<223>n＝T或U
<400>4
ngagagcccn nnnnnngnn                                            19
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，5，10，12，13，14，16，19
<223>n＝T或U
<400>5
agnangaaan annncngan                                            19
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，3，6，7，12，14，16，17，19
<223>n＝T或U
<400>6
annggnncca angngnncn                                            19
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，2，10，12，14，15，16，17
<223>n＝T或U
<400>7
nnagcaaaan angnnnnaa                                            19
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，5，6，9，10，11，12，13，16，18
<223>n＝T或U
<400>8
ngaannaann nnnaananc                                            19
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，3，11，17，18
<223>n＝T或U
<400>9
anncaaggca ncaaagnng                                            19
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，7，10，11，14，15
<223>n＝T或U
<400>10
gncaaancan naannagga                                            19
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，5，7，12，14，17
<223>n＝T或U
<400>11
aanangnaaa cngngangc                                            19
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>7，13，16，19
<223>n＝T或U
<400>12
gcagaanaaa acnaanaan                                            19
<210>13
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>6，9，11，12，13
<223>n＝T或U
<400>13
gaaagnaana nnnaagcag                                            19
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，2，9，12，13，18
<223>n＝T或U
<400>14
nnaccacanc anncaagnc                                            19
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，6，9，14，15
<223>n＝T或U
<400>15
cnaaanacna gagnncgac                                            19
<210>16
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>11
<223>n＝T或U
<400>16
acacgaccgc naagaaaca                                            19
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，3，8，9，11，16
<223>n＝T或U
<400>17
nanccacnna ngacanaaa                                            19
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，3，5，12，19
<223>n＝T或U
<400>18
gnnanaggag cnaacaaan                                            19
<210>19
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，5
<223>n＝T或U
<400>19
aangngaaac acaagcaac                                            19
<210>20
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>4，5，7，9，10，17
<223>n＝T或U
<400>20
acannanann aggaaancc                                            19
<210>21
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，3，5，11，12，13，14，16
<223>n＝T或U
<400>21
cnngnccacc nnnncnaaa                                            19
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，4，5，7，9，10，16
<223>n＝T或U
<400>22
ancnncncnn gaaaanagg                                            19
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，4，11，13，14
<223>n＝T或U
<400>23
ccnncaaaac ngnnaa aag                                           19
<210>24
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，4，6，12
<223>n＝T或U
<400>24
angncngcag gnacacaag                                            19
<210>25
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，4，6，7，12，14，15，17
<223>n＝T或U
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>8，14，15
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<400>26
acaggacnac cacnnggaa                                            19
<210>27
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，7，9，10，13，16
<223>n＝T或U
<400>27
ngccagngnn gangcngaa                                            19
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，4，15，18
<223>n＝T或U
<400>28
gnanaaagaa acccngcnc                                            19
<210>29
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>8，10，12，15，16
<223>n＝T或U
<400>29
cgcacggnan cnccnncac                                        19
<210>30
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，8，12，19
<223>n＝T或U
<400>30
cnacagcngc angacaacn                                            19
<210>31
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，7，9，13，15，16
<223>n＝T或U
<400>31
gcngagncnc cananngcc                                            19
<210>32
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，5，6，7，10，12，14，16，17
<223>n＝T或U
<400>32
anacnnnccn gngncnncc                                            19
<210>33
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<221>misc_feature
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     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<220>
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<221>misc_feature
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<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<220>
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     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<222>3，5，6，10，13，15，17，18，19
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<222>5，6，8，11，13，14
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<223>基于人(Homo sapiens)
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<222>7，8，10，11，12，18
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<223>基于人(Homo sapiens)
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<221>misc_feature
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<221>misc_feature
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     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<222>3，4，6，11，12，16，17
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gcngagncnc cananngcc                                                19
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<222>8，12，14，15
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<222>2，4，5，7，9，10，16
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ancnncncnn gaaaanagg                                                19
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<222>4，10，11，13，15，16，18
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<223>基于人(Homo sapiens)
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<222>3，5，7，10，11，18
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<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>16
<223>n＝T或U
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，3，6，9，14，18
<223>n＝T或U
<400>179
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，9，12，14，15，16
<223>n＝T或U
<400>182
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>4，9，13，19
<223>n＝T或U
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<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<400>184
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>11，14，15，16，18
<223>n＝T或U
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，6，7，9，12，13
<223>n＝T或U
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<220>
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     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<222>5，6，8，9，17，18，19
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>4，8，10，12，17，19
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，4，11，12，13，17
<223>n＝T或U
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nganggagag nnngaanaa                                                19
<210>199
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<222>4，5，6，7，10，11，13，14，17，18
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，9，13，16，18
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<223>基于人(Homo sapiens)
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<400>206
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<223>n＝T或U
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<222>1，9，11，13，18
<223>n＝T或U
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<223>n＝T或U
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<210>211
<211>19
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，3，5，6，12，15，16，17，18
<223>n＝T或U
<400>211
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<210>212
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>6，8，10，12，14，15
<223>n＝T或U
<400>212
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<210>213
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，3，5，9，12，17，18
<223>n＝T或U
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>4，6，7，8，9，19
<223>n＝T或U
<400>214
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<210>215
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>4，15，16
<223>n＝T或U
<400>215
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<210>216
<211>19
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>7，8，15，18
<223>n＝T或U
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ccgcacnngc aagcngcnc                                                19
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<211>19
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，6，10，12，13
<223>n＝T或U
<400>217
cancancacn gnnacccac                                                19
<210>218
<211>19
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>7
<223>n＝T或U
<400>218
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<210>219
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，7，8，18
<223>n＝T或U
<400>219
nccaganncc caacaccng                                                19
<210>220
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<222>5，9，12，14
<223>n＝T或U
<400>220
cccangganc ancnccaga                                                19
<210>221
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>7，8，13，15，16
<223>n＝T或U
<400>221
aaccacnngg cangnngaa                                                19
<210>222
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>5，8，15，16
<223>n＝T或U
<400>222
caagnacnca caccnngga                                                19
<210>223
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，5，8，9，10，13，14，16，17，19
<223>n＝T或U
<400>223
ccngnccnnn aanncnnan                                                19
<210>224
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，6，7，14，19
<223>n＝T或U
<400>224
ngaacnngac ggangaacn                                                19
<210>225
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，5，11，15，19
<223>n＝T或U
<400>225
nagangaggg naacnggcn                                                19
<210>226
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，5，12，14，15
<223>n＝T或U
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<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<223>基于人(Homo sapiens)
     DNA/RNA杂交
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<223>基于人(Homo sapiens)
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<213>人工序列
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<223>基于人(Homo sapiens)
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<211>21
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<213>人工序列
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<223>基于人(Homo sapiens)
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<223>基于人(Homo sapiens)
<400>267
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<210>268
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<400>268
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<210>269
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<400>269
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<210>270
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<400>270
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<210>271
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<400>271
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<210>272
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<400>272
gaaggtgaag gtcggagtc                                             19
<210>273
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<400>273
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<210>274
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<400>274
caagcttccc gttctcagcc                                            20
<210>275
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基是部分的脱氧核糖核苷酸，或核糖核苷酸
<400>275
cagagatttc atttaacgu                                            19
<210>276
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的脱氧核糖核苷酸，或核糖核苷酸
<400>276
cuacgctcgc catcgtuca                                            19
<210>277
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基是部分的脱氧核糖核苷酸，或核糖核苷酸
<400>277
ugcccaagaa tactaguca                                            19
<210>278
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，4，5，7，9，10，16
<223>n＝T或U
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<210>279
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，4，5，7，9，10，16
<223>n＝T或U
<400>279
ancnncncnn gaaaanagg                                            19
<210>280
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>4，10，11，13，15，16，18
<223>n＝T或U
<400>280
gganaaaagn ncncnncna                                                19
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，7，9，13，15，16
<223>n＝T或U
<400>281
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，7，9，13，15，16
<223>n＝T或U
<400>282
gcngagncnc cananngcc                                                19
<210>283
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>4，6，7，8，15，19
<223>n＝T或U
<400>283
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>5，6，8，12
<223>n＝T或U
<400>284
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<210>285
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>5，6，8，12
<223>n＝T或U
<400>285
accanncngg anaccagaa                                                19
<210>286
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
    每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>8，12，14，15
<223>n＝T或U
<400>286
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<210>287
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>4，5，8，13，15，17
<223>n＝T或U
<400>287
gggnnccncg ggnanangg                                                19
<210>288
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，5，7，12，15，16
<223>n＝T或U
<400>288
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，5，7，10，11，18
<223>n＝T或U
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，9，10，13，15，17
<223>n＝T或U
<400>290
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，4，8，9，14，16，17
<223>n＝T或U
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，4，6，11，12，16，17
<223>n＝T或U
<400>292
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<213>人工序列
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<223>基于人(Homo sapiens)
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
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<213>人工序列
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<223>基于人(Homo sapiens)
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     DNA/RNA杂交
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<213>人工序列
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<223>基于人(Homo sapiens)
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<213>人工序列
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<223>基于人(Homo sapiens)
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<400>299
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<210>300
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>18
<223>n＝T或U
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，3，9，12
<223>n＝T或U
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ngnaaaccng cngcccaga                                                19
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>6，9，10，11，12，15，18，19
<223>n＝T或U
<400>302
agaagncgnn nnccnccnn                                                19
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>7，8，13，17
<223>n＝T或U
<400>303
ccgagannag acnaagncc                                                19
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，4，5，6，9，10，11，13，14，15
<223>n＝T或U
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，14，17，19
<223>n＝T或U
<400>305
ncccaaacac aggnacnan                                                19
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，4，6，13
<223>n＝T或U
<400>306
canncncagc ggnaacagc                                                19
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>5，8，9，11，14，17
<223>n＝T或U
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，5，10，11，18
<223>n＝T或U
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aangnaaccn ncaaccanc                                                19
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，2，3，5，7，8，11，15，17
<223>n＝T或U
<400>309
nnngnannca ncacngnc                                                18
<210>310
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，6，8，11，12
<223>n＝T或U
<400>310
ncacancnca nnaccaac                                                 18
<210>311
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>6
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，8，9，13，16，17，18
<223>n＝T或U
<400>312
ngcagacnnc aangcnnng                                                19
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，9，13，15，19
<223>n＝T或U
<400>313
naagcaagnc acngnggcn                                                19
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，6，10，13，16
<223>n＝T或U
<400>314
cngagncgan aanacnagc                                                19
<210>315
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，9，10，13
<223>n＝T或U
<400>315
acnagccann agnaaagag                                                19
<210>316
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>15，16，18
<223>n＝T或U
<400>316
caacagcaga gaccnngnc                                                19
<210>317
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，7，11，12
<223>n＝T或U
<400>317
anagcanacc nngaaccag                                                19
<210>318
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，5，7，12，17
<223>n＝T或U
<400>318
cancngnagg cnaagangg                                                19
<210>319
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，4，11，16，18
<223>n＝T或U
<400>319
agnnaccaga ngccancng                                                19
<210>320
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，5，8，10，13，16
<223>n＝T或U
<400>320
aancnacncn ganagngga                                                19
<210>321
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，3，4，6，17
<223>n＝T或U
<400>321
gnnncngaag ccaacanca                                                19
<210>322
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，6，7，9，14，17
<223>n＝T或U
<400>322
ncaacnnanc accnccnga                                                19
<210>323
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>7，12，13，15
<223>n＝T或U
<400>323
aagaacnaac anngnagag                                                19
<210>324
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，13，16
<223>n＝T或U
<400>324
gnagacaaca ggngcngca                                                19
<210>325
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>2，4，7，9，11，14，15，17
<223>n＝T或U
<400>325
angnccncng naannangg                                                19
<210>326
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，4，5，9，16
<223>n＝T或U
<400>326
nacnnggcna gaacangga                                                19
<210>327
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>9，13，15，16
<223>n＝T或U
<400>327
gaagcaacnc aangnnaag                                                19
<210>328
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<222>1，2，3，6，8，9，10，11，16
<223>n＝T或U
<400>328
nnnggncnnn nggacncag                                                19
<210>329
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
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<221>misc_feature
<222>4，8，11，18
<223>n＝T或U
<400>329
ccanaganca ncaggaana                                                19
<210>330
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>7，11，18
<223>n＝T或U
<400>330
caggacnggc naacacanc                                                19
<210>331
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>1，2，3，6，15，17
<223>n＝T或U
<400>331
nnnaanggca ggcancncc                                                19
<210>332
<211>19
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<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
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     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<223>基于人(Homo sapiens)
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<221>misc_feature
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<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>5，6，11，13，14，16
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     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
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<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
<221>misc_feature
<222>3，5，7，12，13
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<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<223>基于人(Homo sapiens)
     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<221>misc_feature
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     每个核碱基可以是部分的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或核苷酸类似物
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<223>基于人(Homo sapiens)
<221>misc_feature
<222>1，3，7，9，11，13，18
<223>n＝A，T，C或G
<400>479
ncngcangng ncncagangg                                                20
<210>480
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<221>misc_feature
<222>5，9，17，18
<223>n＝A，T，C或G
<400>480
acaanacang gcagggnncc                                                20
<210>481
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<221>misc_feature
<222>1，5，8，10，15，16，20
<223>n＝A，T，C或G
<400>481
ngccnacnan agagnnagan                                                20
<210>482
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<221>misc_feature
<222>1，4，9，10，14，17，20
<223>n＝A，T，C或G
<400>482
naanggaann caanccngan                                                20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<221>misc_feature
<222>5，13，18，20
<223>n＝A，T，C或G
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caacnaaaac acngccangn                                                20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<221>misc_feature
<222>1，3，6，9，10，12，13，15，16，18，19
<223>n＝A，T，C或G
<400>484
nangangcnn cnnanncnna                                                20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<221>misc_feature
<222>2，3，4，6，7，13，15，17
<223>n＝A，T，C或G
<400>485
annngnnaag ccnancngaa                                                20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<221>misc_feature
<222>1，11，19，20
<223>n＝A，T，C或G
<400>486
nccaccagca nggaacaann                                                20
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<221>misc_feature
<222>7，16，19
<223>n＝A，T，C或G
<400>487
agaaaangga cagaanccna                                                20
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
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<222>2，4，7，8，12，17，18，19
<223>n＝A，T，C或G
<400>488
cnancannaa anacgcnnnc                                                20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<221>misc_feature
<222>1，3，4，12，16，19，20
<223>n＝A，T，C或G
<400>489
nannaacaac anacanacnn                                                20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人(Homo sapiens)
<221>misc_feature
<222>3，4，8，9，12，15，17，18
<223>n＝A，T，C或G
<400>490
ggnnaggnna cngangnnag                                                20

Claims (85)

1.一种治疗患有增生性疾病的患者的方法，所述方法包括给所述患者施用：
(i)长度为八到三十个核碱基之间的反义IAP核碱基寡聚物；和
(ii)化疗剂，
两者总量加在一起足以治疗患者。
2.权利要求1所述的方法，其中在彼此相距28天内施用所述的反义IAP核碱基寡聚物和所述的化疗剂。
3.权利要求2所述的方法，其中在彼此相距24小时内施用所述的反义IAP核碱基寡聚物和所述的化疗剂。
4.权利要求3所述的方法，其中在彼此相距1小时内施用所述的反义IAP核碱基寡聚物和所述的化疗剂。
5.权利要求4所述的方法，其中同时施用所述的反义IAP核碱基寡聚物和所述的化疗剂。
6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述的核碱基寡聚物包含从SEQID NOs：1-99，143，147，151，163-260，287，289和300-460组成的群组中选择出来的序列的至少八个连续核碱基。
7.权利要求6所述的方法，其中所述的核碱基寡聚物包含从SEQ IDNOs：97，98，99，143，147，151，287，289和300-460组成的群组中选择出来的序列的至少八个连续核碱基。
8.权利要求7所述的方法，其中所述的核碱基寡聚物基本上由从SEQ IDNOs：97，98，99，143，147，151，287，289和300-460组成的群组中选择出来的序列组成。
9.权利要求8所述的方法，其中所述的核碱基寡聚物由从SEQ ID NOs：97，98，99，143，147，151，287，289和300-460组成的群组中选择出来的序列组成。
10.权利要求1-9任何一项所述的方法，其中所述核碱基寡聚物是寡核苷酸。
11.权利要求10所述的方法，其中所述的寡核苷酸包含至少一个修饰键。
12.权利要求11所述的方法，其中所述的修饰键选自由硫代磷酸酯，磷酸甲酯，磷酸三酯，二硫代磷酸酯和phosphoselenate键组成的组。
13.权利要求1-9任何一项所述的方法，其中所述核碱基寡聚物包含至少一个修饰的糖部分。
14.权利要求13所述的方法，其中修饰的糖部分是2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基。
15.权利要求1-9任何一项所述的方法，其中所述核碱基寡聚物包含至少一个修饰的碱基。
16.权利要求15所述的方法，其中所述的修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
17.权利要求1-9任何一项所述的方法，其中所述核碱基寡聚物是嵌合的核碱基寡聚物。
18.权利要求17所述的方法，其中所述的核碱基寡聚物包含通过硫代磷酸酯键连接在一起的DNA残基，其中所述的DNA残基的每侧侧接了至少一个2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA残基。
19.权利要求18所述的方法，其中所述的DNA残基的两侧都侧接了至少三个2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA残基。
20.权利要求19所述的方法，其中所述的DNA残基的两侧都侧接了四个2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA残基。
21.权利要求18所述的方法，其中所述的RNA残基通过硫代磷酸酯键连接在一起，而且所述的RNA残基通过硫代磷酸酯键连接到所述DNA残基上。
22.权利要求18所述的方法，其中所述的核碱基寡聚物包含通过磷酸二酯键连接在一起的DNA残基，其中所述的DNA残基的两侧分别侧接了至少两个通过硫代磷酸酯键连接在一起的2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA残基。
23.权利要求22所述的方法，其中所述的DNA残基的两侧都侧接了至少三个2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA残基。
24.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述的核碱基寡聚物包含十一个DNA残基，DNA残基两侧都侧接了四个2′-氧-甲基RNA残基，所述核碱基寡聚物由下列序列中的一个组成：
5′-AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3′(SEQ ID NO：155)；
5′-ACACGACCGCTAAGAAACA-3′(SEQ ID NO：16)；
5′-ACAGGACTACCACTTGGAA-3′(SEQ ID NO：157)；
5′-UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3′(SEQ ID NO：27)；
5′-GCUGAGTCTCCATATUGCC-3′(SEQ ID NO：141)；
5′-UCGGGTATATGGTGTCUGA-3′(SEQ ID NO：41)；
5′-AAGCACTGCACTTGGUCAC-3′(SEQ ID NO：47)；
5′-CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3′(SEQ ID NO：51)；
5′-ACCCTGGATACCATTUAGC-3′(SEQ ID NO：63)；
5′-UGUCAGTACATGTTGGCUC-3′(SEQ ID NO：161)；和
5′-UGCACCCTGGATACCAUUU-3′(SEQ ID NO：151)，所述残基通过硫代磷酸酯键连接在一起。
25.权利要求1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂破坏微管。
26.权利要求1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂稳定微管。
27.权利要求1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂是紫杉烷。
28.权利要求27所述的方法，其中所述的紫杉烷是紫杉醇、多西它赛(doxetaxel)、RPR109881A、SB-T-1213、SB-T-1250、SB-T-101187、BMS-275183、BRT 216、DJ-927、MAC-321、IDN5109或IDN5390。
29.权利要求1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂是长春花生物碱。
30.权利要求29所述的方法，其中所述的长春花生物碱是长春新碱、长春花碱、脱乙酰长春花碱、长春氟宁、长春瑞滨和脱水长春花碱。
31.权利要求1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂是多拉司它汀(dolastatain)。
32.权利要求31所述的方法，其中所述的多拉司它汀是多拉司它汀-10、多拉司它汀-15、ILX651、TZT-1027、symplostatin 1、symplostatin 3或西马多丁(cemadotin)。
33.权利要求1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂是隐藻素(cryptophycin)。
34.权利要求33所述的方法，其中所述隐藻素是隐藻素1或隐藻素52。
35.权利要求1-25任何一项所述的方法，其中所述化疗剂是埃博霉素(epothilone)。
36.权利要求35所述的方法，其中所述埃博霉素是埃博霉素A、埃博霉素B、脱氧埃博霉素B或埃博霉素B内酰胺。
37.权利要求1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂是艾榴素(eleutherobin)、discodermolide、2-epi-discodermolide、2-des-methyldiscodermolide、5-hydroxymethyldiscodermolide、19-des-aminocarbonyldiscodermolide、9(13)-cyclodiscodermolide或laulimalide。
38.权利要求1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂是一种选自表1的药物。
39.权利要求1-38任何一项所述的方法，其中所述增生性疾病是癌症。
40.权利要求39所述的方法，其中所述癌症是急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、骨髓发育不良综合征、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、何杰金氏病、Waldenstrom氏巨球蛋白血症、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、Wilm氏瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑(脊)膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤或成视网膜细胞瘤。
41.权利要求1-40任何一项所述的方法，更进一步地包含给所述患者施用化学致敏剂。
42.权利要求1-41任何一项所述的方法，更进一步地包含给所述患者施用生物效应调节剂。
43.权利1-42任何一项所述的方法，更进一步地包含给所述患者施用第二化疗剂。
44.一种组合物，包含：
(i)长度为八到三十个碱基之间的反义IAP核碱基寡聚物；和
(ii)化疗剂，
两者总量加在一起足以治疗患有增生性疾病的患者。
45.权利要求44所述的组合物，其中所述的核碱基寡聚物包含从SEQ IDNOs：1-99，143，147，151，163-260，287，289，和300-460组成的群组中选择出来的序列的至少八个连续碱基。
46.权利要求45所述的组合物，其中所述的核碱基寡聚物包含从SEQ IDNOs：97，98，99，143，147，151，287，289和300-460组成的群组中选择出来的序列的至少八个连续碱基。
47.权利要求46所述的组合物，其中所述的核碱基寡聚物基本上由从SEQ IDNOs：97，98，99，143，147，151，287，289和300-460组成的群组中选择出来的序列组成。
48.权利要求47所述的组合物，其中所述的核碱基寡聚物由从SEQ IDNOs：97，98，99，143，147，151，287，289和300-460组成的群组中选择出来的序列组成。
49.权利要求44-48任何一项所述的组合物，其中所述核碱基寡聚物是寡核苷酸。
50.权利要求49所述的组合物，其中所述的寡核苷酸包含至少一个修饰键。
51.权利要求50所述的组合物，其中所述的修饰键选自硫代磷酸酯，膦酸甲酯，磷酸三酯，二硫代磷酸酯和phosphoselenate键组成的组。
52.权利要求44-48任何一项所述的组合物，其中所述核碱基寡聚物包含至少一个修饰的糖部分。
53.权利要求52所述的组合物，其中修饰的糖部分是2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基。
54.权利要求44-48任何一项所述的组合物，其中所述核碱基寡聚物包含至少一个修饰的碱基。
55.权利要求54所述的组合物，其中所述的修饰的碱基是5-甲基胞嘧啶。
56.权利要求44-48任何一项所述的组合物，其中所述核碱基寡聚物是嵌合的核碱基寡聚物。
57.权利要求56所述的组合物，其中所述的核碱基寡聚物包含通过1硫代磷酸酯键连接在一起的DNA残基，所述的DNA残基的两侧分别侧接了至少一个2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA残基。
58.权利要求57所述的组合物，其中所述的DNA残基的两侧都侧接了至少三个2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA残基。
59.权利要求58所述的组合物，其中所述的DNA残基的两侧都侧接了四个2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA残基。
60.权利要求57所述的组合物，其中所述的RNA残基通过硫代磷酸酯键连接在一起，而且所述的RNA残基通过硫磷酰键连接到所述DNA残基上。
61.权利要求57所述的组合物，其中所述的核碱基寡聚物包含通过磷酸二酯键连接在一起的DNA残基，其中所述的DNA残基的两侧分别侧接了至少两个通过硫代磷酸酯键连接在一起的2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA残基。
62.权利要求61所述的组合物，其中所述的DNA残基的两侧都侧接了至少三个2′-氧-甲基或2′-氧-甲氧乙基RNA残基。
63.权利要求44所述的组合物，其中所述的核碱基寡聚物包含十一个DNA残基，DNA残基两侧都侧接了四个2′-氧-甲基RNA残基，所述核碱基寡聚物由下列序列中的一个组成：
5′-AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3′(SEQ ID NO：155)；
5′-ACACGACCGCTAAGAAACA-3′(SEQ ID NO：16)；
5′-ACAGGACTACCACTTGGAA-3′(SEQ ID NO：157)；
5′-UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3′(SEQ ID NO：27)；
5′-GCUGAGTCTCCATATUGCC-3′(SEQ ID NO：141)；
5′-UCGGGTATATGGTGTCUGA-3′(SEQ ID NO：41)；
5′-AAGCACTGCACTTGGUCAC-3′(SEQ ID NO：47)；
5′-CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3′(SEQ ID NO：51)；
5′-ACCCTGGATACCATTUAGC-3′(SEQ ID NO：63)；
5′-UGUCAGTACATGTTGGCUC-3′(SEQ ID NO：161)；和
5′-UGCACCCTGGATACCAUUU-3′(SEQ ID NO：151)，所述残基通过硫代磷酸酯键连接在一起。
64.权利要求44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂破坏微管。
65.权利要求44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂稳定微管。
66.权利要求44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂是紫杉烷。
67.权利要求66所述的组合物，其中所述的紫杉烷是紫杉醇、多西它赛(doxetaxel)、RPR109881A、SB-T-1213、SB-T-1250、SB-T-101187、BMS-275183、BRT216、DJ-927、MAC-321、IDN5109或IDN5390。
68.权利要求44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂是长春花生物碱。
69.权利要求68所述的组合物，其中所述的长春花生物碱是长春新碱、长春花碱、脱乙酰长春花碱、长春氟宁、长春瑞滨和脱水长春花碱。
70.权利要求44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂是多拉司它汀(dolastatin)。
71.权利要求70所述的组合物，其中所述的多拉司它汀是多拉司它汀-10、多拉司它汀-15、ILX651、TZT-1027、symplostatin 1、symplostatin 3或西马多丁(cemadotin)。
72.权利要求44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂是隐藻素(cryptophycin)。
73.权利要求72所述的组合物，其中所述隐藻素是隐藻素1或隐藻素52。
74.权利要求44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂是埃博霉素(epothilone)。
75.权利要求74所述的组合物，其中所述埃博霉素是埃博霉素A、埃博霉素B、脱氧埃博霉素B或埃博霉素B内酰胺。
76.权利要求44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂是艾榴素(eleutherobin)、discodermolide、2-epi-discodermolide、2-des-methyldiscodermolide、5-hydroxymethyldiscodermolide、19-des-aminocarbonyldiscodermolide、9(13)-cyclodiscodermolide或laulimalide。
77.权利要求44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂是一种选自表1的药物。
78.一种增强细胞凋亡的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求44-77任何一项所述的组合物接触。
79.权利要求78所述的方法，其中所述细胞在活体内。
80.权利要求78所述的方法，其中所述细胞是在活体外。
81.权利要求78-80所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
82.权利要求81所述的方法，其中所述癌细胞是人癌细胞。
83.一种试剂盒，包括：
(i)长度为八到三十个碱基之间的反义IAP核碱基寡聚物；
(ii)化疗剂，和
(iii)给患有增生性疾病的患者施用所述反义IAP核碱基寡聚物和所述化疗剂的说明，施用剂量足以治疗所述的增生性疾病。
84.一种试剂盒，包括：
(i)长度为八到三十个碱基之间的反义IAP核碱基寡聚物；和
(ii)给患有增生性疾病的患者施用所述反义IAP核碱基寡聚物和所述化疗剂的说明，施用剂量足以治疗所述的增生性疾病。
85.一种试剂盒，包括：
(i)权利要求44-77任何一项所述的组合物；和
(ii)给患有增生性疾病的患者施用所述组合物的说明，施用剂量足以治疗所述的增生性疾病。
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PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
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