JP3944654B2 - 神経細胞アポトーシスの抑制タンパクとその遺伝子配列、並びに脊髄性筋萎縮症の原因となる当該遺伝子の突然変異 - Google Patents

Description

発明の分野
神経細胞アポトーシスの抑制タンパク（ＮＡＩＰ）の遺伝子が、第５染色体のｑ１３領域に同定された。この遺伝子の突然変異がＩ型、II型およびIII型の脊髄性筋萎縮症患者に認められた。この発明は、この神経細胞アポトーシス抑制タンパクのアミノ酸配列を提供し、ウイルス性アポトーシスタンパクとの相同性を証明する。
発明の背景
この発明に係る様々な態様を説明する際に、種々の刊行誌の論文を容易に参照できるように、明細書の最後に参考文献一覧表を付した。また、これらの参考文献はその最初の著者名および出版年を明細書中に明記した。
小児期の脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡｓ）は、常染色体性劣性神経変性疾患のグループに含まれ、発症および臨床的進行に基づいて３タイプに分類される（Ｄｕｂｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９７８；Ｄｕｂｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。これら３タイプはすべて、近位随意筋の弱化および摩滅として顕在化する脊髄α運動ニューロンの変性によって特徴づけられる。Ｉ型ＳＭＡは最も重篤なタイプであり、胎児期（ｉｎ ｕｔｅｒｏ）または生後数カ月で発症する。発症児は座位保持が不可能で、呼吸が不十分なために胸部感染症を再発し易いため、生後数年間を生き延びることは滅多にない（Ｄｕｂｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９７８；Ｄｕｂｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。保因頻度が１／６０から１／８０のこの急性疾患は、最も頻度が高い致命的常染色体性変性疾患の１つである。II型ＳＭＡ発症児は歩行には介助を必要とし、予後はさまざまであるが、青年期に死亡する場合がある。III型発症児は自力歩行を続けられるが、３才から１７才までの時期に弱化し始め、症状が緩やかに進行していく（Ｄｕｂｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９７８；Ｄｕｂｏｗｉｔｚ．，１９９１）。
１９９０年には、ＳＭＡのこれら３つの小児期形態がすべて第５染色体長腕の５ｑ１１．２−１３．３に遺伝学的にマッピングされた（Ｂｒｕｓｔｏｗｉｔｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｇｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｍｅｌｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。その後、多点連鎖分析と組換え現象の同定を行ったところ、その遺伝子欠損はＤ５Ｓ４３５／Ｄ５Ｓ６２９によってセントロメア側に位置する領域に局在化され（Ｓｏａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｗｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｌｅｒｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、ＭＡＰ１Ｂ／Ｄ５Ｓ１１２によってテロメア側に位置する領域に局在化された（Ｗｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４；ＭａｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。この区間は、さらに最近の組換え現象の同定によって明確になり、ＳＭＡ遺伝子がＣＭＳ−１の遠位に存在し（Ｙａｒａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓに投稿； ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｅｅｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓに投稿）、Ｄ５Ｓ５５７の近位に存在する（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３）ことが明らかにされた。我々やその他の研究者等は、クローンおよび単純縦列反復の単離ならびに順序付けを阻害するＤ５Ｓ６２９／ＣＭＳ−Ｄ５Ｓ５５７領域に特に豊富な第５染色体の特異反復配列を検出した（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。この区間内では、２００ｋｂのＣＭＳ−１領域（Ｋｌｅｙｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）／ＣＡＴＴ−１領域（Ｂｕｒｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，印刷中）／Ｄ５Ｆ１５０領域／Ｄ５Ｆ１４９領域／Ｄ５Ｆ１５３領域（Ｍｅｌｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４）に及ぶコスミドクローン系列が構成されている。
我々は、５ｑ１３．１のＳＭＡ含有Ｄ５Ｓ４３５−Ｄ５Ｓ１１２区間を含むＹＡＣクローンの連続系列を構築した。その後、我々は、５ｑ１３．１のこの区間に存在し、神経細胞アポトーシス抑制タンパク（ＮＡＩＰ）をコードする遺伝子を発見した。さらに研究を行った結果、この遺伝子の欠失がＩ型、II型およびIII型の脊髄性筋萎縮症に認められることが確認された。
発明の要約
神経細胞アポトーシス抑制タンパク（ＮＡＩＰ）をコードする遺伝子がヒト染色体の５ｑ１３領域で見出された。この発明の一つの態様によれば、神経細胞アポトーシス抑制タンパクのｃＤＮＡ配列表４に開示されたとおりに提供さる。この発明の別の態様によれば、このｃＤＮＡ配列から予測される神経細胞アポトーシス抑制タンパクのアミノ酸配列が提供される。
この発明の別の態様によれば、神経細胞アポトーシス抑制タンパク遺伝子の欠失がＩ型、II型およびIII型の脊髄性筋萎縮症患者に認められた。この神経細胞アポトーシス抑制タンパク遺伝子欠失の発見によって、脊髄性筋萎縮症の診断に使用する診断指示薬が提供される。
以下、図面を参照してこの発明の様々な態様をさらに詳細に説明する。また、図面の簡単な説明はこの発明の要約の次に記載する。
この発明のさらに別の態様によれば、染色体５ｑ１３のＳＭＡ含有領域に位置するヒト遺伝子が提供される。このヒト遺伝子は約５．５ｋｂのエクソン１から１７までを含み、エクソン２から１１までの制限地図は図８に示したとおりである。
この発明のさらに他の態様によれば、エクソン１から１７までは、図９Ｄに示すように、エクソン２から１６までの制限地図を有している。
この発明の別の態様によれば、上記態様のヒト遺伝子の場合、エクソン５から１６は配列番号２のアミノ酸配列と生物学的、機能的に同等のアミノ酸配列を有するＮＡＩＰタンパクをコードする。
この発明の別の態様によれば、上記態様のヒト遺伝子は配列番号１のｃＤＮＡ配列に生物学的、機能的に同等のｃＤＮＡ配列を含むエクソン５から１６を有する遺伝子である。
この発明の別の態様によれば、精製ヌクレオチド配列は配列番号１のｃＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡまたは相同ＤＮＡを含むヌクレオチド配列である。
この発明の別の態様によれば、ＤＮＡ分子の配列は配列番号２を有するＮＡＩＰタンパクをコードする配列である。
この発明の別の態様によれば、精製ＤＮＡ配列は実質的に配列番号１のＤＮＡ配列からなる配列である。
この発明の別の態様によれば、精製ＤＮＡ配列は実質的に配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列からなる配列である。
この発明の別の態様によれば、精製ＤＮＡ配列は配列番号１の少なくとも連続１８塩基を含む配列である。ＤＮＡプローブ、ＰＣＲプライマー、ＤＮＡハイブリダイゼーション分子などが、少なくとも１８連続塩基からなる精製ＤＮＡ配列を用いて提供することができる。
この発明の別の態様によれば、上記態様のＤＮＡ配列はクローニングベクターまたは発現ベクターの構築に使用される。
この発明の別の態様によれば、ＮＡＩＰタンパクは上記のＤＮＡ配列によってコードされるタンパクである。
この発明の別の態様によれば、ＮＡＩＰタンパクは配列番号２のアミノ酸配列と生物学的に同等なアミノ酸配列を含むタンパクである。
この発明の別の態様によれば、ＮＡＩＰタンパクは実質的に配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパクである。
この発明の別の態様によれば、ＮＡＩＰタンパクのフラグメントは配列番号２の少なくとも１５連続アミノ酸を含むフラグメントである。
この発明の別の態様によれば、上記アミノ酸配列はハイブリドーマの製造に使用される。
この発明の別の態様によれば、生物標本を分析してＮＡＩＰタンパクをコードする遺伝子の有無を診断する方法が提供される。
この方法は、
ｉ）第５染色体のＳＭＡ含有領域ｑ１３由来の生物標本を単離し、
ii）生物学的アッセイを行い、
ａ）配列番号１のＮＡＩＰコードＤＮＡ；および
Ｂ）配列番号２のＮＡＩＰタンパク
からなる群から選択された少なくとも一方が生物標本に存在するか否かを判定する方法である。
図面の説明
ＮＡＩＰ遺伝子のエクソンの番号は０から１６まで順次付けられている。これは、配列番号方式＃１として図面に記載した。ただし、従来のエクソン番号についてはエクソン１からエクソン１７までが好ましい。そこで、配列番号方式＃２として区別した。
図１はＳＭＡ遺伝子領域のＹＡＣ連続アッセイである。ＹＡＣは実線で示されている。白三角は多形性ＳＴＲＳを示し、黒三角はＳＴＳＳを示し、白四角は単一コピープローブを示す。遺伝学的に定義されたＳＭＡ区間であるＣＭＳ−１−ＣＭＡ−Ｄ５Ｓ５５７および従来のＤ５Ｓ６２９−ＳＭＡ−Ｄ５Ｓ５５７区間をＹＡＣ上方に示した。
図２はＳＭＡ領域の長距離制限地図である。低頻度切断（Ｒａｒｅ Ｃｕｔｔｅｒ）部位は実線上方に示した。マーカーの最小セットをｐＹＭＣ４トリプトファンに対応する実線ｔ下方または左端に示した。ｕはｐＹＭＣ４ウラシルまたは右端に対応する。遺伝的に定義されたＣＭＳ−１−ＳＭＡ−Ｄ５Ｓ５５７区間およびＤ５Ｓ６２９−ＳＭＡ−Ｄ５Ｓ５５７区間は、それぞれ５５０ｋｂと１．１Ｍｂであると推定される。
図３はＣＡＴＴ−Ｉ部位の増幅を示す。対立遺伝子サイズは各レーンの下方に示した。（Ａ）はＹＡＣの増幅であり、ＧはゲノムＤＮＡを示す。（Ｂ）は第５染色体移動選別ライブラリ由来のコスミドの増幅である。４つの異なる対立遺伝子をコスミド４０Ｇ１（対立遺伝子１５）、５８Ｇ１２（対立遺伝子１２）、１９２Ｆ７（対立遺伝子１０）および２５０Ｂ６（対立遺伝子７）によって示した。
図４は我々の連続系列からマッピングされたコスミドの代表例を示す。実線上方の垂直線はＥｃｏＲＩ部位である。白三角は多形性ＳＴＲＳを示し、黒三角はＳＴＳＳを示し、黒四角は単一コピープローブを示し、白四角は転写配列を示す。Ｉ型ＳＭＡと強い連鎖不平衡を示すＳＴＲｓは星印で示した。コスミドＩＧ３とＩＧ９はＹＡＣ ７６Ｃｌコスミドライブラリから得られる。
図５はｐ１５１．２によって同定されるＳＭＡ領域の配列重複である。ＹＡＣのハイブリダイゼーションは、（Ａ）では７００ｂｐのフラグメント、（Ｃ）では５００ｂｐのフラグメントを用いた。ＹＡＣは、左から右に、セントロメアからテロメアまでが配列されている。コスミドのハイブリダイゼーションは、（Ｂ）では７００ｂｐのフラグメント、（Ｄ）では５００ｂｐのフラグメントを用いた。（Ｂ）では、１２ｋｂのフラグメントがコスミドに検出されたが、２０ｋｂのフラグメントは存在しない。２．５ｋｂのフラグメントおよび６００ｋｂのフラグメントは、それぞれ３Ｂ３と、ＩＥＩに検出されたが、これらは末端フラグメントである。（Ｄ）では、３ｋｂのフラグメントしかコスミドに検出されなかった。２４Ｄ６の２０ｋｂバンドは（Ａ）では検出されていないが、（Ｃ）では存在することに留意されたい。７００ｂｐフラグメントは２４Ｄ６に検出される場合もある。
図６はＩ型ＳＭＡと各種多形性５ｑ１３．１標識との間に観察される連鎖不平衡度が、４０Ｇ１で不平衡ピークを示す図である。
図７は９クローンから構成されるＣＡＴＴ領域を含み、約４００ｋｂに及ぶＰＡＣ連続系列を示す。
図８はＳＭＡ遺伝子の構造を示す。エクソンを黒枠で示し、上方に番号を付けた。制限部位が図示されているが、ＢはＢａｍＨＩ、ＥはＥｃｏＲＩ、ＮはＮｏｔＩである。エクソン４およびエクソン５（方式＃１）または方式＃２のエクソン５および６は全てのタイプのＳＭＡでしばしば欠失している。
図９は図６、１、７、および８のそれぞれに開示された内容を単ページに配置した図である。図９（Ａ）は、病状表現型および物理地図を伴った６つの５ｑ１３．１標識について、Ｉ型ＳＭＡ家族に観察される連鎖不平衡度の相関を示す。本明細書記載の主要な組換えによって定義されるＳＭＡ含有区間が示されている。不均衡のピークが、組換え体によって規定されたＳＭＡ区間のセントロメア末端に隣接していることに留意されたい。
図９（Ｂ）は、５ｑ１３．１のＳＭＡ領域をカバーするＹＡＣ連続系列である。ＹＡＣおよびＰＡＣの連続系列については、ＳＴＳｓを黒三角で示し、多形性縦列反復の多形性を白三角で示し、単コピークローンを黒四角で示した。特に、以下の点を留意されたい。すなわち、我々の物理地図は、星印を付けた対立遺伝子９を含むＣＭＳ下位部位を他のＣＭＡ下位部位のテロメア側に配置しており、遺伝的組換えデータによれば逆転が観察されることから、我々は、５ｑ１３．１のこの領域に変異型が存在することを確信している。
図９（Ｃ）は、５ｑ１３．１のＳＭＡ領域をカバーするＰＡＣ連続系列である。
図９（Ｄ）は、図８に詳細に記載されたＮＡＩＰの遺伝子構造である。
図１０は、ＰＡＣ、非ＳＭＡ個体由来の胎児脳ｃＤＮＡクローンおよびＳＭＡ患者由来のＲＴ−ＰＣＲクローンのエクソン内容である。Ｅ１５８はグルタミン酸残基の欠失を示している。ＲＴ−ＰＣＲは方式＃２のエクソン１３とエクソン４の間で行われたが、この領域の外側では未検出の欠失がさらに存在することが考えられる。
図１１は、ＰＡＣに認められるＮＡＩＰ遺伝子の正常構造および内部欠失／切断変異の構造である。図１１Ａでは、方式＃２に基づくエクソンを番号付けした黒枠として記した。ＮはＮｏｔＩ部位、ＢはＢａｍＨＩ部位、ＥはＥｃｏＲＩ部位を示す。図１１Ｂでは、明細書中で言及されている３ｋｂおよび９．４ｋｂのＥｃｏＲＩバンドを検出するＥｃｏＲＶクローンをＥＶと記した。図１４では欠失した４．８ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩバンドも記した。エクソン５およびエクソン６を含む６ｋｂの領域とこの欠失から生じる２３ｋｂのＢａｍＨＩを、図１１Ｃおよび１１Ｄに示した。エクソン５およびエクソン６の欠失を同定するために使用するプライマーと欠失ＮＡＩＰ遺伝子の切断フラグメントを同定するために使用するプライマーとの位置は、上記のＮＡＩＰ構造に示されている。
図１２は、ＮＡＩＰ遺伝子のイントロン／エクソンスのスプライス配列である。
図１３は、ＮＡＩＰ部位のエクソン１３（方式＃２）をプローブとした成人組織のノーザンブロットである。組織は標識化され、フィルターは５０℃、０．２×ＳＳＣで洗浄され、４日間露呈させた。バンドは、肝臓および胎盤に６−７ｋｂの範囲で観察することかができる。
図１４は、近親婚のフランス系カナダ人のIII型ＳＭＡ家族の家系分析結果およびサザンブロット結果である。上のパネルは、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断したゲノムＤＮＡを、ＮＡＩＰのエクソン２から９（方式＃２）までを含むｃＤＮＡプローブで探索した結果、エクソン５および６（方式＃２）を含む４．８ｋｂのフラグメントが全患者で損失し、フレーム内欠失が生じていることを示している。その他全員は、ホモの正常な姉弟を除き、このバンドの用量は半分であった。下のパネルは、同じ家族のＢａｍＨＩ断片を示す。患者では、２つの重なった１４．５ｋｂの連続フラグメントがＢａｍＨＩ部位を含む６ｋｂ配列を欠失しており、その結果２３ｋｂのバンドが生成されている（図１１参照）。家系のすべての個体の２３ｋｂのＢａｍＨＩバンドの存在は、母集団全体のばらつきと一致することに留意されたい。同様に、ＰＡＣ２３８Ｄ１２に含まれ、かつ図１１に示される方式＃２のエクソン１から６までの欠失を示す９．６ｋｂのＢａｍＨＩバンドが、非ＳＭＡキャリアーを含む個体すべてに確認することができる。
図１５は、エクソン５（方式＃２）を増幅するプライマー１８６４および１８６３を用いてIII型家系２１４７０および２４５６１をＰＣＲ増幅した結果である。この反応は、エクソン１３（方式＃２）のプライマー１２５８および１３４３を用いて多数回行い、結果を暖昧にするＰＣＲの不良を除外した。増幅不良は、エクソン５（方式＃２）のホモ接合の不在に一致し、病状表現型と共分離することがわかる。
図１６は、ＳＭＡ組織および非ＳＭＡ組織から得られたＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果である。文字ｎは、非ＳＭＡ組織由来のＲＮＡを指し、ａはＳＭＡ疾患組織由来のＲＮＡを指す。組織源は、各パネルの上に示した。ｌｙｍはリンパ芽球を指し、ｆｉｂは繊維芽細胞を指す。ａ５を除くすべての試料はＩ型ＳＭＡ患者から得られ、ａ５は図１５に示す近親婚のIII型ＳＭＡ家系２４５６１から得られた。
ＲＮＡは、エクソン１３（方式＃２）から逆転写された。パネルＡおよびパネルＢに示される一次ＰＣＲ産物には、エクソン１のプライマー１８８４とエクソン１３のプライマー１２８５または１９７４を使用し、パネルＣに示される一次ＰＣＲ産物にはエクソン６のプライマー１９１９とエクソン１３のプライマーとを使用した。パネルＡの二次ＰＣＲには、エクソン４のプライマー１８８６とエクソン１３のプライマー１９７４とを使用し、パネルＢの二次ＰＣＲには、エクソン５のプライマー１８６４とエクソン１１のプライマー１９７９とを使用し、パネルＣの二次ＰＣＲには、エクソン９のプライマー１８６４とエクソン１３のプライマー１９７４とを使用した。
生成産物の不良または増幅は、パネルＡの脊髄組織およびリンパ芽球組織の試料ａ２、ａ３、ａ４、ａ５、ａ６およびａ７から確認することができる。パネルＢは、ａ２およびａ３においてサイズが減少したバンドが増幅されたことを示し、ａ７においては挿入断片と一致して大型産物が増幅されたことを示している。パネルＣは、ａ２、ａ３、ａ９およびａ１１においてエクソン１１および１２（方式＃２）の欠失と一致してバンドサイズが低減することを示している。
好ましい態様の詳細な説明
以下、別段の指示がない限り、本発明の詳細な説明においてはエクソン番号方式＃２に基づてエクソンを参照する。
明細書を通して、種々の略語を使用して様々な構成要素および技術を特定する。以下は、このような構成要素および技術の参照として付する語彙リストである。
ＣＴＲ − 複合縦列反復
ＤＮＡ − デオキシリボ核酸
ＰＣＲ − ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＦＧＥ − パルスフィールドゲル電気泳動
ＰＡＣ − Ｐ１人工染色体
ＲＮＡ − リボ核酸
ＲＴ−ＰＣＲ − 逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＴＲ − 単純縦列反復
ＳＴＳ − 配列標識部位
ＹＡＣ − 酵母人工染色体
本発明は、神経細胞アポトーシス抑制タンパク（ＮＡＩＰ）をコードする遺伝子の同定、位置決定および配列特性に関するものである。我々は、この遺伝子の突然変異が上記Ｉ型、II型およびIII型脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を引き起こすことを見出した。この遺伝子の突然変異は正常なＮＡＩＰタンパクの生成欠損を生じさせるが、このＮＡＩＰタンパクはヒト正常過程に生理学的に関与し、神経細胞を維持し、愚者に共通する早期の神経細胞死を阻止していると考えられる。対象遺伝子は染色体５ｑ１３．１のＳＭＡ含有領域に特定される。別段の指示がない限り、本発明の詳細な説明においてはエクソン番号方式＃２に基づてエクソンを参照する。この遺伝子は、約５．８ｋｂのエクソン１から１７までを含み、図８に示すようなエクソン２から１１までの制限地図を有する。エクソン２から１６までの最新の制限地図を図９Ｄと図１１Ａに示した。図から解るように、この遺伝子はエクソン１から１７までの配列よりも相当長い。未だに配列が決定されていないエクソン間には、相当のイントロン情報が存在している。ＳＭＡを診断する観点からすると、エクソン１から１７までの配列が極めて貴重である。正常な配列は、表４に示す他、配列番号１として記載した。いかなる遺伝的突然変異、すなわちそのＤＮＡ配列の変化は、それが遺伝子の全体的な欠失、置換または多形化などに関わらず、疾患の原因であるか、または原因となり得る。最も共通的な突然変異は以下のとおりであると考えられる。
ｉ）遺伝子のエクソン５、６の欠失、または
ii）残りの遺伝子に欠陥がある場合には、第５染色体のこの遺伝子のコピー不在もしくはコピー数の著しい減少が原因となり得る。
正常配列、または正常配列の突然変異の有無を判定することによってヒトのＳＭＡ感受性を診断するにはどのような生物学的アッセイを採用することもできる。このよう生物学的アッセイは、ＤＮＡプローブを使用するＤＮＡハイブリダイゼーション、制限酵素分析、ヒトの生体試料の第５染色体から単離されるような配列該当部のＰＣＲ増幅、配列当該部のメッセンジャーＲＮＡ検出およびＤＮＡ配列決定などである。これらの一般的な生物学的アッセイは様々な手続きで行うことができるが、その場合の好ましい方法は以下の通りである。
ＳＭＡの診断を２つの方法で実施する。第１は、危険性のあるヒトのゲノムについて、ＮＡＩＰのエクソン５および６が不在であるかを検定する。これらのエクソンは、母集団では０．０５％の頻度で、Ｉ型ＳＭＡ集団では５０％の頻度で不在であることが分かっている。第２の方法は、被検者のＮＡＩＰ遺伝子のコピー数を調べるものである。我々は、ＳＭＡ患者ではＮＡＩＰ遺伝子の欠失形態と正常形態とが共に概ね減少していることを見出している。濃度計を使用して遺伝子のコピー数を測定することによって、ＳＭＡの発症リスクを正確に評価する方法を確立することができる。最も高い相関は、エクソン２から４までとエクソン１３に観察される。
実際には、以上に概説した２つのステップは以下の方法で実施することができる。
（ｉ）被検者から得た等量のＤＮＡ（０．１マイクログラム）に対して２つの同時ＰＣＲを実施する。一方のプライマー対はエクソン５および６に対応するものとし（例えば、配列番号７のプライマー１８６３と配列番号８のプライマー１８６４）、他方のプライマー対はエクソン５および６以外の領域に相同なもの（例えば、配列番号５のプライマー１３４３と配列番号４のプライマー１２５８）とする。後者の反応を実施することで、ＰＣＲが作用していることを確認することができる。さらに２つのコントロールとして、（ｉ）適切なプライマーを使用して、エクソン５およびエクソン６を含むことが知られるゲノムＤＮＡにＰＣＲを行い、この特定反応が作用していることを確認するものと、（ii）鋳型として水を使用し、混入物質の不在を確認する負のコントロールとがある。すべてのＰＣＲ産物はアガロースゲル内に移され、電気泳動によって分離され、視覚的に分析される。
（ii）ＳＭＡリスクの濃度計による判定は、蛍光色素で標識したＰＣＲプライマーを用いて行う。エクソン２から４、エクソン１３、エクソン５、６およびエクソン１１、１２に対するプライマーを使用して、被験者由来のゲノムＤＮＡに対するＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物はゲル上で電気泳動によって分離され、個々のバンドの輝度は蛍光光度法によって判定される。このような値を標準値と対比させ、ＳＭＡリスクを確認する。
ＮＡＩＰの一つの側面は、筋萎縮性側索硬化症やアルツハイマー病等のその他の神経変性疾患に対するリスクと明らかに相関することである。従って、上記に説明した試験は、これらの疾患に対するリスクの予知としても役立つ。以下のＢａｃｕｌｏｖｉｒａｌ ｌＡＰｓの節で詳細に述べるように、ＮＡＩＰタンパクは細胞アポトーシス抑制タンパクと高い相同性を有している。このため、神経細胞のアポトーシスを起因する神経変性疾患であれば、ＮＡＩＰ遺伝子のＤＮＡ配列情報を用いて予知することもできる。このような神経細胞アポトーシスはＮＡＩＰ遺伝子の突然変異と最も結び付き易く、この変異は、ＳＭＡに関連した突然変異や神経アポトーシスを抑制するＮＡＩＰタンパクの生物活性に影響する他の遺伝子の突然変異と類似している。
ｍＲＮＡの検出については、我々は以下を提案する。
ＲＴ−ＰＣＲは複数の分子生物学的用途に必須であるＲＮＡ転写物を分析するめの迅速な方法である。この方法は従来のノーザンブロット法、ＲＮＡドット／スロットブロット法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼイション法よりもはるかに感受性が高く、効率が良い。このような高い感受性によって、少量のＲＮＡ転写物や少量の細胞から単離したＲＮＡについて試験することができる。さらに、転写物のパネル全体を同時に分析することもできる。
プロトコルの概要： 最初に、ＲＮＡを組織または細胞から単離し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）への逆転写のための鋳型として使用する。逆転写（ＲＮＡ依存性のＤＮＡ合成）を逆転写酵素によって触媒する。次に、ｃＤＮＡを鋳型として、選択されたｃＤＮＡ領域を増幅するよう設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲ後、生成物をアガロースゲル電気泳動によって分析する。そのｃＤＮＡのヌクレオチド配列情報から推定されるＰＣＲ産物のサイズによって増幅されたｃＤＮＡを同定する。ＰＣＲ産物は、さらに制限切断、ハイブリダイゼーション、またはヌクレオチド配列決定によって確認することができる。
ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によるＲＮＡの酵素的増幅
この方法は、ＰＣＲを用いてＲＮＡを酵素的に増幅するために用いる。
プロトコルの詳細： 最初に、プライマーをＲＮＡにアニーリングする。ＲＮＡおよびｃＤＮＡプライマーは、ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび水を一緒に添加することによって共沈させる。酢酸ナトリウムとエタノールとを添加する。これを−２０℃以上で一晩かけて沈降させる。ペレットをエタノールで洗浄する。次に、水、Ｔｉｓ−ＨＣｌおよびＫＣｌを添加し、その混合物を９０℃に加熱した後、徐々に６７℃まで冷却する。微少遠心分離し、３時間５２℃でインキュベートする。この最終アニーリング温度は、プライマーの塩基組成に従って調整することができる。あるいは、プライマーをｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび水に混合することによってＲＮＡにアニーリングすることもできる。この混合物を６５℃で３分から１５分間加熱する。冷却した混合物に逆転写酵素緩衝液を添加する。
次にｃＤＮＡを合成する。逆転写酵素緩衝液とＡＭＶ逆転写酵素とを添加する。これを混合して１時間４２℃でインキュベートする（プライマーとＲＮＡの塩基組成による）。Ｔｒｉｓ−Ｃｌ／ＥＤＴＡを添加した後、緩衝フェノールを混合し、撹拌する。微少遠心し、クロロホルムを水相に添加し、撹拌し、微少遠心する。酢酸ナトリウムとエタノールを水相に添加する。混合し、−２０℃で一晩沈殿させ、微少遠心し、ペレットを乾燥させ、水に入れて再懸濁する。
次いでｃＤＮＡをＰＣＲ増幅する。混合物は調製ｃＤＮＡ、増幅因子、ｄＮＴＰ混合物、増幅緩衝剤および水を含む。通常、増幅プライマーの一つはｃＤＮＡプライマーと同一のものである。異なるプライマーを使用する場合、ｃＤＮＡプライマーはｃＤＮＡ反応から除外されることが望ましい。反応混合物を２分間９４℃に加熱し、微少遠心して凝縮物を回収する。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを添加し、混合し、遠心分離し、ミネラルオイルで皮膜して増幅サイクルを開始する。サイクル数は、ＲＮＡの量によって様々である。通常は４０サイクルで十分である。次に、反応産物をアガロースまたは非変性ポリアクリルアミドゲル内でゲル電気泳動によって分析する。ｃＤＮＡを増幅ステップに直接導入することもできる。
当然のことながら、遺伝子、そのｃＤＮＡ配列、その他のＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列について言及する際に、何らかに特定化した配列は生物学的に同等の機能を有するもののいずれかまたは全てを包含するものである。同様に、記載したタンパク質配列についても、目的が関連している限りは、それらの呼び名は生物学的に同等の機能を有するもののいずれかまたは全てを包含する。上記の生物学的アッセイでは、当然のことながら、ＤＮＡ配列またはタンパク配列の全長または一部を使用することができる。一般に、そのＤＮＡの少なくとも連続１８個塩基がハイブリダイゼーション用プローブやＰＣＲプライマー等として有用である。同様に、タンパク質配列の場合にも、少なくとも１５個の連続アミノ酸配列がモノクローナル抗体などのタンパク質受容体を開発する際に有用である。このようなモノクロナール抗体は、タンパク質構造の特定の抗原決定因子に特異的なモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマを作成するような標準的な方法で製造することができる。
表４について言えば、エクソン５、６、７、８、９、１０、１１および１２がＩＡＰ領域と高い相同性を示すという観点からすれば、このような相同性は、これらのエクソンの欠失またはその他の突然変異が疾患に感受性があるキャリアに生じ得ることは当然である。例えば、このことは、ヒトにおける減少したコピー数においてエクソン５および６の欠失がこの疾患の原因となることによって証明される。このため、遺伝子のこの領域のいかなる配列情報も診断的観点からは重要であり、この領域に存在するいかなるＤＮＡの１８連続塩基または１５連続アミノ酸残基もＳＭＡの疑いがあるヒトの診断の根拠とすることができる。当然、この遺伝子のその他の領域における他の種類の欠失、突然変異、多形性なども疾患の原因であることが考えられ、疾患分析、予後、あるいは治療に関連するその他の目的に使用することもできる。
制限地図は被検者の遺伝子の特性を同定する際に有用であるが、エクソン１からエクソン１７までの特異的ｃＤＮＡ配列を配列番号１に記載した。コード配列は、エクソン５の３９６位塩基のＡＴＧコドンから始まり、エクソン１６の４０９２位塩基の停止コドンＴＡＡで終了する。エクソン１から４までは５’未翻訳領域に位置し、エクソン１７は３，未翻訳領域に位置する。いくつかの遺伝性疾患と同様に、未翻訳領域の突然変異または多形化がこの疾患の原因として当然と考えられるので、ＩＡＰが相当に類似した領域以外におけるプローブなどの配列部分もＳＭＡ診断に有効であると考えられる。配列番号１の配列情報は、適切なクローニングベクターを構築してその遺伝子のコピーを複製するために使用するこができ、あるいは組み換え技術によって発現ベクターを構築し、これを宿主にトランスフェクトしてＮＡＩＰを多量に製造するために使用することができる。クローニングベクターまたは発現ベクターの使用目的によって、配列情報のセクション、フラグメントまたは全長をそのようなベクターの構築に使用することができる。この理解を前提に、ＳＭＡ疾患遺伝子の同定、その特性、対応するタンパク質配列および診断時のそれらの使用法の詳細を説明する。
染色体５ｑ．１３に沿った脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）遺伝子領域のＹＡＣ連続系列を構築したが、これはＤ５Ｓ４３５−Ｄ５Ｓ１１２区間を含み、全体で４Ｍｂであった。コスミド系列のＣＡＴＴ−４０Ｇ１下位部位は、脊髄性筋萎縮症との有意な連鎖不平衡を示し、その遺伝子に隣接していることを示した。ただし、ＳＡＭ遺伝子を含む正確な領域の描写は、この情報だけでは不可能である。９個のクローンからなるＣＡＴＴ領域を含み約４００ｋｂに及ぶＰＡＣ連続系列が構築された。物理的マッピングデータと併用した遺伝学的分析の結果、ＣＭＳ対立遺伝子９と４０Ｇ１ＣＡＴＴ下位部位を含む１５４ｋｂのＰＡＣクローン１２５Ｄ９（図７）が高い確率でＳＭＡを含んでいた。以下のようにさらに分析した結果、ＰＡＣ１２５Ｄ９は、神経アポトーシス抑制タンパクをコードする遺伝子を含むことが判明した。
ｐＹＡＣ（酵母人工染色体プラスミド）によって、４００ｋｂ以下のＤＮＡ連続鎖を酵母に直接クローニングすることができる。環状ρＹＡＣ（インサートなし）はＥ．ｃｏｌｉ．で複製させることができる。ｐＹＡＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ開列、外来性ＤＮＡとの連結、直鎖状分子（各末端にテロメアを含む）の酵母への直接形質転換によってライブラリが構築され、これは標準的な方法によってスクリーニングすることができる。
大型のＹＡＣ構築物は自然の染色体と同様に安定している。これらは、ヒトゲノムなどの複合ゲノムからライブラリを構成するための格好のベクターである。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ．コスミドおよびラムダベクターではクローニング不可能な配列も、ＹＡＣベクターでは十分にクローニング可能である。
ＹＡＣベクターは、通常は環状プラスミドとして細菌中で増殖する。制限酵素標的部位は、切断時に２つの腕を生じさせるように配置されており、その各々が異なる選別マーカーを含み、一方がテロメアで、他方が平滑末端で終結する。さらに、一方の腕はＡＲＳ要素を含む。この２つの腕は、連結フラグメントから分離精製され、平滑末端を分離するように断片化された供与ＤＮＡに連結される。連結反応混合溶液によって酵母細胞が形質転換されるが、この時の選別条件は、両腕の存在を確認することや、非組み換え体に認められる第３の選別マーカーがインサートによって妨害されることを確認すること等である。
ＹＡＣ連続系列の構築
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｏｆ Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ（ＮＣＥ，Ｔｏｒｏｎｔｏ）、Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ（ＩＣＲＦ，Ｌｏｎｄｏｎ）（Ｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）およびＣｅｎｔｒｅｄ’Ｅｔｕｄｅ ｄｕ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｈｕｍａｉｎｅ（ＣＥＰＨ，Ｐａｒｉｓ）（Ａｌｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）で構築させた３つのライブラリからＹＡＣクローンを単離したが、これらは全てＹＡＣベクターｐＹＡＣ４に連結したＤＮＡ全体の一部のＥｃｏＲＩ断片から調製されたものである。ＩＣＲＦ ＹＡＣクローンは、ライブラリフィルターを５ｑ１３．１プローブを用いて探査するこによって同定した。ＮＣＥライブラリから得られたＹＡＣ ＤＮＡをＰＣＲ増幅によってスクリーニングし、電気泳動し、サザンブロットに固定し、放射標識したＳＴＳ産物にハイブリダイズし、ポジティブであることを確認した。多数のポジティブがプールしたプレートの第１回目ＰＣＲおよび目的のクローンを含むと考えられたプレートでの第２回目のＰＣＲ双方から繰り返し得られたが、その多くは偽のポジティブであった。偽ポジティブクローンはプライマー依存性と思われるが、その数はＰＣＲ産物を放射標識し、６％ポリアクリルアミドゲル上で分解させることによって減少した。その後、真のポジティブクローンのサイズを偽生成物からの干渉を受けずに正確に測定することができた。
５ｑ１３．１ＳＴＳに対してポジティブなＹＡＣを有する酵母菌株を選別プレート上で培養し、以下の方法で安定性を試験した。すなわち、４コロニーの各々をアガロースブロックで培養し調製し、酵母染色体ＤＮＡをパルスフィールドゲル電気泳動によって分離し、フィルターに転移し、放射標識した全ヒトゲノムＤＮＡとハイブリダイズさせることによって各酵母コロニー内に含まれるＹＡＣクローンのサイズと数を決定した。ポジティブクローンは、オリジナルプローブとのハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ増幅のいずれかによって確認した。ＹＡＣ２４Ｄ６−２だけが１つ以上のＹＡＣを有する複数のコロニーを含んでいた。
ＹＡＣ末端クローンおよびインター−Ａｌｕは、それぞれベクター−Ａｌｕ ＰＣＲおよびインター−Ａｌｕ ＰＣＲによって単離した。５ｑ１１−１３におけるこれらの産物の位置は、第５染色体の全てを含む体細胞ハイブリッドＨＨＷ１０５（Ｄｏｎａ ｅｔ ａｌ．，１９８２）と、５ｑ１１．２−１３．３が欠失した第５染色体を含む誘導体ＨＨＷ１０６４（Ｇｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８９）のサザンフィルターにハイブリダイズさせて確認した。これらのプローブの多くは、５ｑ１１−１３領域と第５染色体のどこかとに位置することを示すハイブリダイゼーションプロフィルを示した。ある場合には、各ＹＡＣ末端に特異的なプライマーは、ベクター−Ａｌｕ ＰＣＲによって単離されたＹＡＣ末端クローンの配列から生成された。各々の新規ＳＴＳの５ｑ１１−１３への配置は、体細胞ハイブリッドＨＨＷ１０５およびＨＨＷ１０６４由来のＤＮＡのＰＣＲ増幅によって決定された。若干の場合には、ＨＨＷ１０５およびＨＨＥ１０６４から得られたＰＣＲ増幅産物がポジティブの場合は、プライマー対が第５染色体反復配列を含んでいた。新規のＳＴＳプライマーの形成によって、５ｑ１１−１３領域に特異的な産物が増幅した。末端クローンハイブリダイゼーションおよびＳＴＳ分析をすべてのＹＡＣに実施し、各ＹＡＣの向きと位置を確認した。
ＳＭＡ区間を含むＹＡＣ連続系列の集合は、２つのマーカー、すなわち、ＳＭＡに隣接し、Ｄ５Ｓ４３５のセントロメア側に存在するマーカーＤ５Ｓ１２５（Ｍａｎｋｏｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）と、よりテロメア側に位置するマーカーＤ５Ｓ１１２（Ｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）（図１参照）とから開始する。６つのＹＡＣは、セントロメアマーカーｐＪＫ５３（Ｄ５Ｓ１１２）によってＩＣＲＦライブラリに同定された。これらのＹＡＣの１つはＤ０６１００であるが、末端クローンＳＴＳ分析に基づきさらにセントロメア方向に延在することが示された。このＹＡＣのセントロメア末端によって、ＮＣＥライブラリから２つのＹＡＣすなわち１２８１と１２８４を同定した。Ｄ５Ｓ１２５またはＤ５Ｓ４３５マーカーにポジティブなＹＡＣは、ＩＣＲＦライブラリとＮＣＥライブラリには認められなかったため、ＣＥＰＨライブラリをスクリーニングすることによって、Ｄ５Ｓ４３５を含むクローンを単離した。ギャップの中心に位置するミクロサテライト多形性であるＣＡＴＴ−１を使用して、３つのＹＡＣすなわち２４Ｄ６−２、２７Ｈ５、３３Ｈ１０を検出した。これらのＹＡＣは、ＳＴＳ分析によって、セントロメア方向のＹＡＣおよびテロメア側のＹＡＣ（１２８１、１２８４）に連結することが示された。Ａｌｕ ＰＣＲによる中間ＹＡＣ産物を使用して全てのＹＡＣを探査し、オーバーラップの程度を確立した。ＪＫ３４８とＤ５Ｓ１１２との間に位置するＳＴＳ配列（Ｋｌｅｙｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）を使用し、オーバーラップの程度と連続系列におけるＹＡＣの配向を確認した。同時に５ｑ１３に沿って各ＳＴＳの順番も確認した。結果的に全部で１４ＹＡＣを同定し、遺伝マーカーＤ５ｓ４３５、Ｄ５Ｓ６２９、ＣＭＳ−１、Ｄ５Ｆ１５３、Ｄ５Ｆ１４９、Ｄ５Ｆ１５０、Ｄ５Ｆ１５１、Ｄ５Ｓ５５７およびＤ５Ｓ１１２によって固定した。
長距離制限地図および物理的距離の見積
重要なＳＭＡ領域の制限地図をＤ５Ｓ６２９に約１００ｋｂ近位のＳＴＳ Ｙ１１６Ｕ（Ｋｌｅｙｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）からＤ５Ｓ５５７に約５００ｋｂ遠位のＳＴＳ Ｙ１０７Ｕまで作成した（図２参照）。我々のＹＡＣの欠失または転位についてあらゆる可能性を見い出すために、ＣＥＰＨライブラリ（Ｋｌｅｅｙｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）からさらにＹＡＣを単離し、この領域内にマッピングすることを分析に含めた。ＹＡＣの２４Ｄ６、２２７Ｈ５、３３Ｈ１０、１５５ＳＨ１１、７６Ｃ１、２３５Ｂ７、１８４Ｍ２、４２８Ｃ５、８１Ｂ１１（ＫＩｅｙｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）を低頻度切断エンドヌクレアーゼＮｏｔＩ、ＢｓｓＨｌｌ、Ｓｆｉｌ、Ｒｓｒｌを用いて部分的に切断した。パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）で分離した制限産物をサザンブロッティングし、ＹＡＣの左腕特異プローブおよび右腕特異プローブにハイブリダイズさせたところ、各ＹＡＣの両端からの開列部位の位置が明らかにされた。ＹＡＣの配向およびオーバーラップは、ＳＴＳ分析に基づいてすでに求められているので、オーバーラップしたＹＡＣ中の低頻度切断部位の位置を比較した。それらの共通する低頻度切断部位にオーバーラップしたＹＡＣを並べることによって、オーバーラップの程度をさらに正確に決定することかできた。異なる起源由来のオーバーラップＹＡＣの長距離制限地図は３３Ｈ１０および４２８Ｃ５を例外としてほとんど一致する。４２８Ｃ５は欠失を含むことが以前に立証さており（Ｋｌｅｙｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、そのＳＴＳ含有物の比較と、わずか３００ｋｂのサイズしかないことから、図２の配置よりもさらにセントロメア側に存在することが示唆される。ＳＴＳ分析に基づくＹＡＣ ３３Ｈ１０は、内部欠失を含み、ＹＡＣ １５５Ｈ１１はテロメア側がキメラであるので、地図のテロメア側の低頻度切断部位は確認することができず、含まれていなかった。この結果は、セントロメア境界であるＤ５Ｓ４３５からテロメア境界であるＤ５Ｓ５５７までの距離は１．４Ｍｂであり、これは先に報告された４００ｋｂ（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３）とは著しく異なるが、別の見積結果（Ｗｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３）とは一致した。さらに、Ｄ５Ｓ６２９−Ｄ５ｓ５５７区間は１．１Ｍｂであり、遺伝的に定義されたＣＭＳ１−ＳＭＡ−Ｄ５Ｓ５５７区間の距離は約５５０ｋｂであると見積もられた。
第５染色体ライブラリからのコスミド連続アセンブリ
ＹＡＣ全体をプローブとして使用するコスミドの単離は、コスミド連続系列を構築する迅速な方法であると考えられたが、この場合、第５染色体に特異的な反復配列の存在によって、第５染色体の別の場所に位置するコスミドを単離し易いと思われた。目的のコスミドのウォーキング法は、こうして採用された。ＣＡＴＴ−１ ＳＴＲは、放射線ハイブリッド分析によって２つの接合標識Ｄ５Ｓ４３５とＤ５Ｓ３５１のほぼ中間に位置することがわかっているが、これを開始点として使用し、コスミドクローン系列を構築した。ゲノムＤＮＡに見られる複合増幅パターンは、１個体あたり２から８の対立遺伝子を含んでいるが（図３参照）、この領域のＣＡＴＴ−１配列のコピー数または部位が可変的であることを示すものであつた。３０個のＣＡＴＴ−１にポジティブなコスミドを同定したところ、それらはＰＣＲ分析時に４個の異なる対立遺伝子の１つを含むことがわかった。コスミドライブラリはモノ染色体ソース由来であったので、これによってＣＡＴＴ ＳＴＲは少なくとも４つの位置に存在することが確認された。我々はこれらの４つの部位を下位部位（ｓｕｂｌｏｃｉ）と命名した。これらの下位部位は、各々１２、１９、１５、２０のシトシンアデノシン（ＣＡ）ジヌクレオチドの対立遺伝子を含有することが確認された第１コスミド番地に基づいてＣＡＴＴ−４０Ｇ１、ＣＡＴＴ−１９２Ｆ７、ＣＡＴＴ−５８Ｇ１２、ＣＡＴＴ２５ＯＢ６０と命名された。両方向ウォーキングを４つのコスミド下位部位から開始した。ポジティブなハイブリダイゼーションは、５８Ｇ１２を一端に有する２５０Ｂ６と他端に有する１９２Ｆ７に観察され、ｃｅｎ−１９２Ｆ７−５８Ｇ１２−２５０Ｂ６−ｔｅｌの順序であった（図４）。ＣＡＴＴ−１９２Ｆ７対立遺伝子を含む全てのコスミドは、それらのＣＡＴＴ−１対立遺伝子のサイズおよびそれらの制限酵素プロフィルに基づいて、この位置に配置された。図４に示すように、ＣＡＴＴ−１９２Ｆ７下位部位は、ＳＴＲ ＣＭＳ−１に対してテロメア側であり、それ自体がＣＡＴＴ−４０Ｇ１下位部位のテロメア側である。
第５染色体特異反復配列の存在によって第５染色体の別の領域からコスミドを同定し、連続系列の一貫性を次の各ステップによって確認した。ベクター−Ａｌｕ−ＰＣＲによって生成されたコスミド末端クローンを上記体細胞ハイブリッドパネルにハイブリダイズした。第５染色体領域に単独で位置する反復配列がハイブリッド細胞系ＨＨＷ１０６４では欠失しいてることが確認され、最終産物によって同定されるコスミドはＨＨＷ１０６４とハイブリダイズしないので、さらに分析した。オーバーラップは、末端クローンのハイブリダイゼーション、単コピープローブのハイブリダイゼーション、ＳＴＳ含量、制限酵素プロフィルの比較によって証明された。ＨＨＷ１０６４にハイブリダイズする末端クローンによって同定されたコスミドを除外し、同じ方法で確認した別のクローンからの異なるインター−Ａｌｕ産物を用いてウォーキングを継続した。コスミドのサイズは、ＥｃｏＲＩ制限フラグメントの添加によって算出され、オーバーラップの存在はＥｃｏＲＩ制限フラグメントによって同様に求められた。
ＹＡＣ ７６Ｃ１コスミドのコスミド連続系列
コスミド連続系列の伸長は第５染色体に特異的な反復配列の存在によって妨げられるので、５ＸコスミドライブラリをＹＡＣ ７６Ｃ１から作成した。ＹＡＣに沿って分布するＳＴＳのＣＡＴＴ−１、ＣＭＳ−１、Ｙ１２２Ｔ（Ｋｌｅｙｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、Ｙ９７Ｔ（Ｋｌｅｙｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）およびＹ９８Ｔ（Ｋｌｅｙｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）を用いてコスミドを同定し、連続系列を構築した。同様に、以前に開発されたマーカーｐＺＹ８、ｐＬ７、ｐＧＡ−１、ｐ１５．１、ｐ４０２．１、ｐ２２８１．８および構築されたコスミド連続系列由来のβ−グルクロニダーゼ（Ｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，１９８７）（表２、図２）がこのライブラリにハイブリダイズしたが、これはコスミドの順序付けに効果的な方法であった。不規則なハイブリダイゼーションパターンを示し、欠失および／または転位を含むと考えられるコスミドを除去した。
ＳＴＳ Ｙ９８Ｔは、ＳＴＳ Ｙ９８Ｔを含む第５染色体ライブラリクローン由来のプローブ２２８１．８によって以前に同定されたコスミドを含む３つのコスミドを識別した。このコスミドの最終産物は、１０個のコスミドにハイブリダイズした。同時に、ＣＡＴＴ４０Ｇ１下位部位の末端フラグメントは、これら１０コスミドの４つにハイブリダイズし、ＣＡＴＴ−４０Ｇ１およびＣＭＳ−１をよりセントロメア寄りのＳＴＳ Ｙ９８Ｔに連結した（図４）。我々は、ＹＡＣおよびＳＴＳ Ｙ９７Ｔを含むいかなるクローンをも同定することができなかった。フィルターハイブリダイゼーションおよびＳＴＳマッピング実験の結果、別のＣＡＴＴ４０Ｇ１下位部位がさらにセントロメア寄りであることを示した。この下位部位の重複は、我々のＳＭＡ血族遺伝子型データに一致した（ＭｃＬＥａｎ ｅｔ ａｌ．，印刷中）。
この領域を測るのに必要な最小のコスミドセットを用いてＥｃｏｒＩ制限地図を作製した。連続系列の信頼性を確認するため、我々はそれを第５染色体特異的ライブラリからの連続構築物に組み込むことを試みた。連続系列の一致は、制限地図の比較、地図上のプローブおよびＳＴＳｓの位置、およびＡｌｕ−ＰＣＲフィンガプリンティングによって明白であった。この方法の場合、連続系列のサイズは２１０ｋｂであると見積もられた。このため、直接的なウォーキング法によって、既知のセントロメア／テロメア配置を有する下位部位のＣＡＴＴ−１クラスターを含む１組のコスミド集合を作成した。
重複／欠失
幾つかの証拠は、我々のコスミド系列中にゲノム配列重複が存在することを示唆した。我々は、ＣＡＴＴ−４０Ｇ１サブクローンの複製が単一の第５染色体由来のコスミドに存在することの証拠を提供する。ＣＡＴＴ−４０Ｇ１下位部位として確立されたこの下位部位に対するセントロメアの位置は、複数のコスミドにおいてＳＴＳｓのＹ１２２Ｔ、Ｙ８８ＴおよびＣＭＳ−１に隣接していることが見出され、セントロメアのＹＡＣ４２８Ｓは、ＣＡＴＴ−４０Ｇ１含有コスミドから単離されたプローブに対してポジティブであった。ＹＡＣ ４２８Ｃ５は、ＰＣＲ増幅の際にはＣＡＴＴ−４０Ｇ１下位部位を含まなかったが、これはＹＡＣが由来する染色体の無効対立遺伝子またはＹＡＣの欠失によって説明することができる。我々は、既に、離れたＣＡＴＴ−１下位部位で個々の無効対立遺伝子を観察している。ＣＡＴＴ４０Ｇ１の別のよりテロメア寄りの位置を、いずれもテロメア側のＹＡＣ３３Ｈ１０である２４Ｄ６２に結合するプローブｐＧＡ−１、ｐＬ−７およびｐＺＹ８のＣＡＴＴ４０Ｇ−１へのハイブリダイゼーションによって決定した。コスミド４０Ｇ１由来のｐ４０２．１をコスミドの両方の位置にハイブリダイズしたところ、重複はＣＡＴＴ４０−１下位部位に限定されず、より広い領域を含む傾向にあることが分かった。サザンブロットによって、２つの位置に対するコスミドの異なるプロフィルが明かになったが、Ａｌｕ−ＰＣＲフィンガプリントによって共通のバンドが検出され、重複を裏付けた。
我々のＹＡＣ系列とコスミド系列との相関関係から、ＹＡＣの７６Ｃ１、８１Ｂ１１、２７Ｈ５は、５ｑ１３の１５０ｋｂのＣＡＴＴ領域に及ぶことがわかった。それにも関わらず、これらのＹＡＣのＣＡＴＴ−１遺伝子型からは１つの対立遺伝子サイズが判明しただけで、これらのＹＡＣ（４つすべて）が由来する染色体が、それらの残りのＣＡＴＴ−１下位部位の無効対立遺伝子を含む確率が高くなった。ただし、我々の実験は、ＳＭＡ家系のＣＡＴＴ連鎖分析によって、遺伝子型を決定した約３００人のうち誰も２つ以下の対立遺伝子を持っていないというようなシナリオはほとんど有り得ないことを示した。従って我々は、これらのＣＡＴＴ下位部位は不安定であり、ＹＡＣの構築および／または増殖中に欠失する傾向が強いと考える。
ＣＡＴＴ−１とＤ５Ｆ１５３プライマーの配列比較は、一方のプライマーが一致し、他方のプライマー配列が８ヌクレオチド重複しているので、これらの２つのＳＴＲは類似しており恐らくは同一であることを示した。ただし、セントロメア側のＹＡＣである４２８Ｃ５、２３２Ｆ１２、２３５Ｂ７、１８４Ｈ２と、テロメア側ののＹＡＣである１２Ｈ１、１５５Ｈ１１、２６９Ａ６は、ＣＡＴＴ−１ネガティブであり、Ｄ５Ｆ１５３増幅産物を生成したことから、ＣＡＴＴ−１はＤ５Ｆ１５３の誘導体の可能性がでてきた。これらのデータは、３つのＤ５Ｆ１５３部位（図４）を含むコスミド系列のＤ５Ｆ１５３分析との比較によって、少なくとも５つのＤ５Ｆ１５３下位部位の存在を示した。
ＣＡＴＴ−１ ＳＴＲとＤ５Ｆ１５３ ＳＴＲの他に、ＣＭＳ−１ ＳＴＲとＤ５Ｆ１５０ ＳＴＲが第５染色体当たりの種々のコピー数で存在した。ＳＴＳ分析によって、ＣＭＳ−１はＹＡＣの４２３Ｃ５、７６Ｃｌ、８１Ｂ１１、２７Ｈ５に位置決定されたが、それぞれの対立遺伝子サイズは、５、４、４、３および４であった。ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅は、１個体あたり４対立遺伝子までであることがわかり、染色体当たり２コピー多かった。Ｄ５Ｆ１５０はコスミド系列内の２つの位置に存在したが、１つの位置しかＹＡＣ系列には検出されなかった。Ｄ５Ｆ１５１は我々のコスミド系列には検出されなかったにもかかわらず、ＹＡＣ ４２８Ｃ５のポジティブな増幅に基づきそのコスミド系列に含まれたＹＡＣ ３３Ｈ１０のセントロメア末端に配置された。Ｄ５Ｆ１４９の位置の一つは、我々のコスミドとＹＡＣクローンの両方で検出された。我々のデータは、ＣＡＴＴ−１については、無効対立遺伝子の存在および／またはＹＡＣのＣＭＳ−１、Ｄ５Ｆ１５０、Ｄ５Ｆ１５１、Ｄ５Ｆ１４９配列の不安定性を示唆した。
欠失現象は、第５染色体の特異的コスミドライブラリから得られたコスミド２３４Ａ１を含むＣＡＴＴ−４０Ｇ１から単一コピープローブとして単離された８００ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントとのハイブリダイゼーションにおいて観察された。ＹＡＣＤＮＡの探査では、我々のＹＡＣのいずれにおいてもこのフラグメントを検出することができなかった。数人のゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションでは、欠失現象は一切同定されなかったので、この配列はＹＡＣの不安定性に起因するものと考えられた。このフラグメントの配列決定では、エクソンもコード領域も一切明かにならなかった。
ＳＭＡ領域の配列重複の別の証拠は、コスミド１５Ｆ８（図４）から得られた１．２ｋｂの内部Ａｌｕ−ＰＣＲ産物（ｐ１５１．２）を用いて確認された。プローブによって、ＹＡＣクローンの７６Ｃ１、８１Ｂ１１、２７Ｈ５（２０ｋｂ、１２ｋ、３ｋｂ）の３つのＥｃｏＲＩフラグメントが同定されたが、３３Ｈ１０および２４Ｄ６（２０ｋｂ）と４２８Ｃ５では１つずつしか確認されなかった。内部ＥｃｏＲＩ部位は、このマーカーを５００ｂｐと７００ｂｐのプローブに分割した。大きい方のプローブによって、１２ｋｂおよび２０ｋｂのフラグメントを識別する一方で、小さい方のプローブによって３ｋｂおよび２０ｋｂのフラグメントを識別した（図５）。我々は、ＹＡＣのこの配列の不安定性は、ライブラリが異なるために除外し、ハイブリダイゼーションパターンをそれらの物理的位置に反映させた。１２ｋｂおよび３ｋｂのフラグメントはＥｃｏＲＩ制限地図上に配置されたが、我々は２０ｋｂのフラグメントを位置づけすることはできなかった。我々のコスミド連続系列の遠位にある２０ｋｂフラグメントはデータから推測することができる。複製はゲノムＤＮＡ断片へのハイブリダイゼーションによって確認され、３つ全てのフラグメントサイズが明らかになった。
ＹＡＣ系列とコスミド系列の特徴
我々は、Ｄ５Ｓ４３５−Ｄ５Ｓ１１２領域を組み込み４Ｍｂを含むＳＭＡ疾患遺伝子領域のＹＡＣ系列を確立した。５ｑ１３に沿った系列の向きはＰＦＧＥ分析と組み合わせて７つの遺伝マーカーおよびＳＴＳｓを分析することによって確認した。長距離制限地図では、我々の系列に含まれるＹＡＣの主な欠失および転位は明かにならなかったので、この地図を用いて系列のサイズを詳細に見積もった。我々のＹＡＣ地図は、少数コピー反復配列と複数部位ＳＴＳｓによって特徴づけられる１．１Ｍｂ領域に、マーカーＤ５Ｓ６２９、Ｄ５Ｆ１５３、Ｄ５Ｆ１５１、Ｄ５Ｆ１５０、Ｄ５Ｆ１４９、ＣＭＳ−１、ＣＡＴＴ−１およびＤ５Ｓ５５７を物理的に連結させた。さらに、我々は、新しく遺伝的に規定されたＣＭＳ１−ＳＭＡ−Ｄ５Ｓ５５７が５００ｋｂであると見積もった。Ｄ５Ｓ４３５−Ｄ５Ｓ５５７領域の物理的距離の評価値は４００ｋｂ（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３）から１．４Ｍｂ（Ｗｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３）までであることが報告されている。このような研究とは対照的に、我々はＤ５Ｓ４３５−ＳＭＡ−Ｄ５Ｓ５５７領域を１，４Ｍｂ、ＣＭＳ１１−ＳＭＡ−Ｄ５Ｓ５５７領域を５５０ｋｂとする見積では、６個の染色体からなる３つの起源に由来するクローンを採用する。さらに、クローンサイズと低頻度切断部位の位置とを決定することによって、さらに詳細にＹＡＣのオーバーラップの程度と系列のサイズを決定することができるようになり、評価が信頼できるものになった。
我々は、第５染色体特異的ライブラリおよびＹＡＣ（７６Ｃ１）特異的ライブラリ由来のコスミドクローンの単一連続系列を、２１０ｋｂを含むＣＭＳ−１／ＣＡＴＴ−１／Ｄ５Ｆ１５３／Ｄ５Ｆ１５０／Ｄ５Ｆ１４９領域の制限地図に関連して構築した。第５染色体特異的ライブラリを使用した場合に、反復配列がコスミド配列の伸長を阻害したので、重要な領域についてコスミドライブラリＹＡＣ ７６Ｃ１を構築しなければならなかった。連続コスミド系列は、制限酵素フラグメントのオーバーラップによって確立されたコスミドのオーバーラップやＡｌｕフィンガプリンティング、あるいはＳＴＳ、コスミド末端クローンおよび単コピープローブの分析を実証しながら直接的なウォーキング法によって構築された。
物理的マッピング分析および遺伝的マッピング分折は、重複と反復配列を含むゲノムＤＮＡの複合領域を明らかにした。この領域から得られた複合ＳＴＲを用いてゲノムＤＮＡの遺伝子型を決定することで、１個体当たり８個までの多形性バンドが存在することがわかった。これは、ＳＴＲのＣＡＴＴ−１、ＣＭＳ−１、Ｄ５Ｆ１５３、Ｄ５Ｆ１５０には複数のコピーまたは下位部位が存在することを示している。我々の物理的マッピングデータは、これらの複数の下位部位の存在を確認したが、Ｄ５Ｆ１５１およびＤ５Ｆ１４９の場合は例外であり、１つの位置しか明かにならなかった。４つのＣＡＴＴ−１下位部位は我々のコスミド系列の１４０ｋｂ領域に位置し、少なくともその一つである下位部位ＣＡＴＴ−４０Ｇ１は重複化されている。Ｄ５Ｆ１５３とＣＱＴＴ−１は共通の祖先から分岐したと考えられるＳＲＳに関連していた。我々は、１つのＣＭＳ−１下位部位を我々のコスミド系列に位置づけたが、ＹＡＣ／コスミドライブラリが由来する染色体は無効対立遺伝子を残りの下位部位に含むか、または欠失が確認される場合が考えられるので、、我々のデータからはこの２００ｋｂ領域内の別の染色体上に他の下位部位が存在するか否かについて判定することができなかった。
ＣＡＴＴ−１、ＤＦ１５３、Ｄ５Ｆ１５０およびＤ５Ｆ１４９ ＳＴＲは、母集団の染色体上に複数コピーが存在していたが、各々に対して単一の対立遺伝子ＰＣＲ産物によって明かなように、すべてのＹＡＣＳ上に下位部位マーカーとして確認され、これらの配列の不安定性と欠失とを示した。これは、第５染色体コスミドライブラリをベースとした連続系列由来の我々のＹＡＣにおいて８００ｂｐのフラグメントが不在であることによって裏付けられる。複数の下位部位間に配置される別のユニークな配列プローブがＹＡＣに保持されているので、これらの配列の不安定性が大きな欠失を生じさせるとは思われない。
要するに、我々は、決定的なＳＭＡ領域に対する最初の高解像度物理地図を作成したのである。ただし、ＳＭＡ遺伝子を含んだ正確な領域の説明は、この情報だけでは不可能である。
我々は、遺伝的分析と同時に、ＹＡＣ連続系列を３つの異なるＹＡＣライブラリから得たクローン（Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４）を用いて構築した。この系列からの最小表示は図９Ｂに示したとおりであり、これは拡張パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）分析と相関した。一般的なＣＡＴＴ−１マーカーおよびＳＭＡの連鎖不平衡に関する初期の提案（Ｂｕｒｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ，．１９９４）に従い、伸長したＣＡＴＴ領域を組み込むコスミド連続系列の構築に着手した。５ｑ１３か第５染色体のどこかに位置する広範で多形性のゲノム反復要素の存在が、連続系列を直線的に構築することを妨害した。ただし、系列の一貫性は、制限酵素分析、Ａｌｕ−ＰＣＲフィンガプリンティング、ＳＴＳ含量決定およびコスミド末端クローンやその他の単コピープローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって確保された。この結果、単一染色体に由来するフローソート第５染色体ゲノムライブラリ（Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４）に含まれる５つのＣＡＴＴ下位部位を含んだ２００ｋｂを組み込んだ系列が作成された。さらに最近では、このＣＡＴＴ領域を含み、１０クローンから構成され、約５５０ｋｂの長さを有するＰ１人工染色体（ＰＡＣ．Ｉｏａｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４）連続系列が構築された（図９Ｃ）。
連鎖不平衡分析
ＳＭＡ領域に位置する５つの複合縦列反復および単純縦列反復を用いる連鎖不平衡分析を行った。この分析に使用された２つの多形性は、我々のコスミド系列にマッピングしたＣＡＴＴ−４０Ｇ１下位部位およびＣＡＴＴ−１９２Ｆ７下位部位であった。２つの独立した下位部位の特異的増幅はＣＡ反復に隣接する領域の配列多形性で終了するプライマーを構築することによってなされた。ＣＡＴＴ−４０Ｇ１下位部位では図６に示されるように、明確なピークが観察された。
ＰＡＣ連続系列
４０Ｇ１ ＣＡＴＴ下位部位は連鎖不平衡を示したので、ＣＡＴＴ領域を含むＰＡＣ連続系列を構築した。このＰＡＣ連続系列は９個のクローンからなり、全長約４００ｋｂであった（図７）。物理的マッピングデータに組み合わせた我々の遺伝的分析は、ＳＭＡと最大の不平衡を示した４０Ｇ１ ＣＡＴＴ下位部位マーカーが重複しており、重要なＳＭＡ領域の極めてセントロメア寄りに局在していることを明らかにした。結果的に、１０ｋｂのセントロメア末端内にＣＭＳ対立遺伝子９を限定するＳＭＡ領域を含み、テロメア方向に延在して４０Ｇｌ ＣＡＴＴ下位部位を組み込んだ１５４ｋｂのＰＡＣクローン１２５Ｄ９をさらに別の試験用に選択した。
２つのゲノムライブラリは、ＰＡＣ１２５Ｄ９の全長およびＳｓｕ３Ａｌで切断した部分的断片（平均インサートサイズ５ｋｂ）を用い、制限酵素産物をＢａｍＨ１で開列したＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドにクローン化することによって構築された。ゲノム配列決定は、連続的でオーバーラップしたゲノムクローンがＰＡＣの大部分をカバーするように（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、５ｋｂの部分的インサートＳａｕ３Ａｌライブラリから得られた２００クローンの両端について行った。これは、神経アポトーシス抑制タンパク遺伝子の構造を説明するための手段を提供する。
ＰＡＣ１２５Ｄ９を３０ｋｂのセントロメア側フラグメントと１２５ｋｂテロメア側フラグメントにＮｏｔＩ部位で切除する（これは、アポトーシス抑制領域の開始部位であるＰＡＣ１２５Ｄ９のエクソン７を二分することが後に示された）。ＮｏｔＩ ＰＡＣフラグメントはＰＦＧＥによって単離され、胎児脳ｃＤＮＡライブラリのプローブとして別々に使用された。ＮｏｔＩ部位領域の物理的マッピングおよび配列決定も行い、迅速にコード配列を検出するためにＣｐＧｉｌａｎｄの存在を検定した。ＰＡＣ１２５Ｄ９はまたエクソン トラッピング システムにおける鋳型として使用し、神経アポトーシスよ抑制タンパク遺伝子に含まれるエクソンを同定した。
ＧＡ１やＬ７などのコスミド系列から得られたクローンを用いたハイブリダイゼーションによって既に同定された転写の存在に加え、多面的な方法を行って、神経アポトーシス抑制タンパク遺伝子に含まれる６つのｃＤＮＡクローンを迅速に同定した。これらのクローンを可能な場合はオーバーラップ系列に配置した。キメラ現象は、ＰＡＣ１２５Ｄ９の部分的なＳａｕ３Ａｌゲノムライブラリ由来のクローンから得られた配列を有するｃＤＮＡクローンの共直線検出によって何度も除去した。
神経アポトーシス抑制タンパクのクローニング
５つのＣＡＴＴ下位部位の１つを含むコスミド２５０Ｂ６の完全なゲノムｃＤＮＡインサートを用いてヒト胎児脊髄ｃＤＮＡライブラリをプロービングしたした。この結果、２．２ｋｂの転写ＧＡ１が検出されたが、この位置は図７に示した。胎児脳ライブラリを連続コスミド インサート（コスミド４０Ｇ１）の他、このようなコスミドから単離された単コピーサブクローンを用いてさらにプロービングした。複数の転写が確認され、中にはＬ７と呼ばれるものも含まれていた。コード領域はＬ７につては検出されなかったが、これは恐らくクローン実質部が未処理の異核ＲＮＡを含んでいた事実によると思われる。ただし、我々は、後にＬ７が神経アポトーシス抑制タンパク遺伝子の一部と考えられる領域を含むことを発見した。同様に、ＧＡ１転写は、神経アポトーシス抑制タンパクのエクソン１３であることが最終的に証明された。ＧＡ１は、発現遺伝子であることを示すエクソンを含むことがわかったので特に注目した。ＰＡＣクローン１２５Ｄ９内に含まれるＧＡ１転写は後にｃＤＮＡライブラリを詳しくプロービングすることによって伸長された。
伸長ＧＡ１転写をその他の既知の配列と比較し、そのアミノ酸配列がＯｒｇｙｉａ ＰｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａウイルスおよびＣｙｄｉａ Ｐｏｍｏｎｅｌｌａウイルスのアポトーシス抑制ポリペプチドと高い相同性を有することが明らかにされた（表３）。この配列分析によって、エクソン５および６のアポトーシス抑制タンパクに相同性があることがわかった。
ｃＤＮＡの残りのギャップを補完して、２つの捕捉エクソンを用いて胎児脳ライブラリをプロービングすることによって最終的な３’の伸長を行った。オーバーラップクローンを有するｃＤＮＡの物理的地図を作成した。完全ｃＤＮＡ配列を表４に示したが、これには１６個のエクソンが含まれている。アミノ酸配列は、ヌクレオチドトリプレットＡＴＧに対応するメチオニンから開始する。図８は、ＳＭＡ遺伝子の構造を示す。
表４に示されるＮＡＩＰのｃＤＮＡ配列は、当業者らによってこの遺伝子プライマー、プローブおよびタンパク産物に対する抗体から発展させることができる。表４のｃＤＮＡ配列を組換ＤＮＡ技術に利用して適当な宿主で発現させ、神経アポトーシス抑制タンパクを製造することができる。これによって、神経アポトーシス抑制タンパク材料を提供することができる。ＮＡＩＰの配列およびそれに含まれるプローブとプライマーを供給すると、たとえば、脊髄性筋萎縮症などの疾患を検出することもできる。
ＮＡＩＰ構造
ＮＡＩＰ遺伝子は、少なくとも５．５ｋｂからなる１７個のエクソンを含み、ゲノムＤＮＡの約８０ｋｂに及んでいる。ＮＡＩＰコード領域は３６９８ヌクレオチドで、１２３３アミノ酸からなる遺伝子産物が推定される。ＮＡＩＰは２つの潜在的膜貫通領域と、ＧＴＰ結合部位に直接隣接する細胞内のアポトーシス抑制ドメインとを含んでいる。タンパク質ドメインプログラムの調査によって以下の結果が出た。
（i）残基９−９１：認識可能なモチーフが存在しないＮ−末端ドメイン
（ii）残基９４−１１８：疎水性膜ｓｐａｎｎｉｎｇドメイン
（iii）残基：１６９−４３５：アポトーシス抑制タンパクと相同性を示し、次の疎水性ドメインであるＧＴＰ／ＡＴＰ結合部位の直前に位置するドメイン
（iv）残基４８６−５０４：疎水性膜ｓｐａｎｎｉｎｇドメイン
（v）残基５０５−１００５：４つのＮ−末端結合グリコシル化部位と１つのリポタンパク質結合ドメインを含む受容体ドメイン
神経アポトーシス抑制タンパク
タンパク遺伝子突然変異の分析
ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするプローブとして完全ＰＡＣ１２５Ｄ９を用いてｃＤＮＡ２０．３プローブを得た。ｃＤＮＡプローブ２０．３を用いたゲノムサザンのプロービングによって、III型の近親婚家族では９ｋｂのＥｃｏＲＩバンドが欠損していることを明らかにした。この情報によって、ＮＡＩＰ遺伝子の欠失をエクソン５およびエクソン６に位置づけた。このため、欠失は低頻度ＮｏｔＩ制限部位とその直接下流を含むエクソンをカバーする。これらのエクソン内または周囲のプライマーを構築し、Ｉ型ＳＭＡ患者３人とIII型ＳＭＡ患者３人にこの領域の増幅がないことを明かにした。上記の欠失が原因で生成される接合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）フラグメントを増幅するプライマーを調製する目的で、ＰＡＣとエクソン４および５内および周囲のコスミドサブクローンからゲノムＤＮＡを単離し、配列を決定した。１つの接合フラグメントがIII型の患者に検出された。同様の産物が、近親婚の履歴がない別のフランス系カナダ人２例に観察された。３例のＩ型ＳＭＡおよび３例のIII型ＳＭＡ患者の染色体は、同一のＣＡＴＴ／ＣＭＳハプロタイプを有し、これが共通の軽度のＳＭＡ突然変異であり、フランス系カナダ人の母集団には比較的多いことを強く示唆した。このパターンの共分離が証明された。我々は、ＳＭＡ患者の１１０人の両親の分析を行ったが、同様の産物を発見することができなかった。この領域のゲノムＤＮＡの配列を決定したところ、約１０ｋｂの欠失があり、これがフレーム欠失を生じさせていることが確認された。この欠失は、イントロン領域とエクソン５および６に及んでいた。２世代のＳＭＡ家族にサザンブロット分析を行った。最初の８エクソンを含むｃＤＮＡプローブを用いて、末梢血白血球由来ＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片をプロービングした。ＳＭＡ患者は、エクソン５および６を含む１０ｋｂのＥｃｏＲＩバンドへのハイブリダイゼーションが存在しなかった。（図９）。
ＮＡＩＰ転写物は、最初に、コスミドライブラリに存在する５つのＣＡＴＴ下位部位の一つを含むコスミド２５０Ｂ６の完全な２８ｋｂのゲノムＤＮＡインサートを用いてヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリをプロービングすることによって単離した。これによって２．２ｋｂの転写物を検出し、最終的にＮＡＩＰ遺伝子のエクソン１４であることを証明した。さらに、胎児脳ライブラリを連続隣接コスミド系列のインサート（コスミド４０Ｇ１）と、このようなコスミドから単離された単コピーサブクローンを用いてプロービングすることによて、Ｌ７転写物を含む複数の転写物を同定し、最終的にＮＡＩＰ部位のエクソン１３を含むことを証明した。Ｌ７に対するコード領域は検出されなかったが、これは、クローン含有の未処理異核ＲＮＡがかなりの割合でその真の性質を妨害したことによると考えられる。
この段階では、完全な遺伝的分析および連鎖的不平衡分析とＰＡＣ連続系列の構築によって、ＰＡＣ１２５Ｄ９をＳＭＡ部位を含む可能性が高いものとして同定した。４つのＰＡＣ１２５Ｄ９ゲノムライブラリは、ＰＡＣインサートの全長およびＳａｕ３Ａｌ、ＢａｍＨＩおよびＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩで切断した部分的断片（平均インサートサイズ５ｋｂ）をプラスミドベクターにクローニングすることによって作成した。Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｕｔゲノム配列決定は、連続的でオーバーラップしたゲノムクローンがＰＡＣ１２５Ｄ９の大部分をカバーするように（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、５ｋｂの部分的インサートＳａｕ３Ａｌ切断ライブラリから得られた２００クローンの両端について行った。これは、神経アポトーシス抑制タンパク遺伝子の構造を説明するための手段を提供する。
ＰＡＣ１２５Ｄ９は、２４ｋｂのセントロメア側フラグメントと１３０ｋｂのテロメア側フラグメントにＮｏｔＩ部位で分割され、アポトーシス抑制相同ドメインの上流に位置する最初の膜貫通ドメインの開始位置でＮＡＩＰのエクソン６を二分する（図１１および表４）。ＮｏｔＩ ＰＡＣフラグメントはＰＦＧＥによって単離され、胎児脳ｃＤＮＡライブラリのプローブとして別々に使用された。ＮｏｔＩ部位領域の物理的マッピングおよび配列決定も行い、迅速にコード配列を検出するためにＣｐＧｉｌａｎｄの存在を検定した。ＰＡＣ１２５Ｄ９はまたエクソントラッピング システムにおける鋳型として使用し（Ｃｈｕｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、ＮＡＩＰ遺伝子のエクソン５、１２、１６、１７を同定した。
これらの多面的な方法によって、ＮＡＩＰ遺伝子（図１０）を網羅するｃＤＮＡクローンを同定した。オーバーラップクローンを同定し、ＰＡＣ１２５Ｄ９の部分的Ｓａｕ３ｌ断片ゲノムライブラリのクローンから得られた配列を有するｃＤＮＡ末端の共直線化を検出することによって、複数回ｃＤＮＡクローンのキメラ現象を除去した。この時点で、配列分祈結果から、ＮＡＩＰ遺伝子のエクソン７から１３にコードされたタンパク配列は、バキュロウイルスの２つのアポトーシス抑制タンパク（ＩＡＰｓ）と類似することが明らかにされた。その後まもなく、ｃＤＮＡプローブを用いて近親婚のＳＭＡ家族から得たＤＮＡを含むサザンブロットをプロービングしたところ、欠失したバンドが明かになった。
どちらのＩＡＰもそのアミノ酸末端に８０アミノ酸ＢＩＲ（バクロウイルスＩＡＰ反復）モチーフを含んでおり、約３０残基の介在配列の後ろで、３３％の一致率で重複していた（Ｃｌｅｍ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，１９９３）。同じ現象はＮＡＩＰにも観察される。エクソン６、７、８にコードされたアミノ酸１８５−２５０は、エクソン１０、１１、１２にコードされたアミノ酸３００−３７０と３５％相同であった。最も長い相同性は、５３アミノ酸配列領域全体に観察され、２９のアミノ酸が一致していた。
さらに、ＩＡＰドメインのＮＨ２末端では、システインとヒスチジンが豊富な亜鉛フィンガー様モチーフがＣｐＩＡＰとＯｐＩＡＰの両方のカルボキシ末端に存在する。これらのモチーフはＤＮＡと相互作用することが知られている（Ｂｉｒｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４）が、ＮＡＩＰ（表４）では認められない。ＮＡＩＰはアポトーシス抑制ドメインと連続性ＧＴＰ結合部位を挟む２つの膜貫通領域を含んでいる。別のタンパク ドメイン プログラムの研究からは、以下のように、上記のタンパク ドメイン評価よりも特異的な結果が得られた。
１．残基１−９１：認識可能なモチーフがないＮ−末端ドメイン
２．残基９２−１１０：ＭＥＭＳＡＴプログラム（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）によって膜ｓｐａｎｎｉｎｇドメインであることが予知された疎水性ドメイン
３．残基１６３−４７７：バキュウロウイルスのアポトーシス抑制タンパクと相同性を示し、次の疎水性ドメインＧＴＰ／ＡＴＰ結合部位の直接上流に続くドメイン。
４．残基４７９−４９６：ＭＥＭＳＡＴによって膜ｓｐａｎｎｉｎｇドメインであると予知される疎水性ドメイン。
５．残基４９３−１２３２：４つのＮ−末端連結グリコシル化部位および１つの原核脂質付着部位を含む受容体部位。
我々は、少なくとも３つのエクソンは４００ｂｐの５’未翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含んでおり、これ以外にも存在するであろうことを理解している。この領域の顕著な特徴は、エクソン２の前の５’ＵＴＲの９０ｂｐ領域と、エクソン２とエクソン３を架橋する領域に完全重複領域が存在することである。さらに、エクソン１７を含む３’未翻訳領域は５５０ｂｐ区間を含み、そこにはニワトリ内在性膜タンパク質であるｏｃｃｌｕｄｉｎ（Ｆｕｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３）との相同性が高く、ＧＲＡＩＬプログラムによって検出される潜在性コード領域が存在する。これがキメラ転写物を表わしている可能性がある。ｏｃｃｕｌｄｉｎ相同配列は４つの異なるｃＤＮＡクローンと遺伝子の２つのアイソフオームに検出されている。推定上の３’ＵＴＲを有するＮＡＩＰ遺伝子のコード化エクソンを表すｏｃｃｕｌｄｉｎ配列が、実際には異核ＲＮＡであるという可能性は、３’ＵＴＲが観察されｏｃｃｌｕｄｉｎ相同領域の上流に位置するフレーム内翻訳停止コドンが存在することからすると、ありえないことである。予備的なＲＴ−ＰＣＲ分析結果は、ｏｃｃｌｕｄｉｎ系が転写されていることを示した。
組織発現
成人組織ｍＲＮＡを含有するノーザンブロットとエクソン１４プローブとのハイブリダイゼーションの結果、成人肝臓（約６ｋｂと約７ｋｂのバンド）と胎盤（７ｋｂのバンド、図６）にのみバンドが検出された。成人ＣＮＳでの発現レベルは、ノーザン分析法では可視バンドを生成するためには不十分であったが、脊髄、繊維芽細胞、リンパ芽球ＲＮＡを用いてたＮＡＩＰ転写物の逆転転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅は、このような組織の転写活性を示唆した。
ＮＡＩＰ遺伝子の切断型および内的欠失型の検出
ＰＡＣ連続系の解析において、クローン２３８Ｄ１２および３０Ｂ２が、ＮＡＩＰのエクソン６に位置するＰＡＣ１２５Ｄ９と高い配列相同性を示したが、これらのクローンはＰＡＣ１２５Ｄ９のＮｏｔＩ部位を含んでいなかった。このことは、ＮＡＩＰ遺伝子の重複コピーの可能性を示しており、そのため、さらに解析を進め、ＰＡＣＤＮＡを含むサザンプロットとＮＡＩＰエクソンプローブとのハイブリダイゼーションを行い、またＰＣＲ ＳＴＳに何が含まれているか評価を行った結果、ＮＡＩＰ遺伝子座の異常型２種が検出された。すなわち、一つは、エクソン２〜７が欠失したもの（ＰＡＣ ２３８Ｄ１２）で、他の一種は、エクソン６、７および１２〜１７が欠失したもの（ＰＡＣ ３０Ｂ２および２５０１７）である。サザン解析によってゲノムＤＮＡおよびＰＡＣＤＮＡに同じ大きさのバンドが存在することと、ＰＣＲの結果から、この欠失は、ｉｎ ｖｉｖｏの状態よりもむしろｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＡＣアーチファクトを反映するものであるという可能性は排除された。従って、ゲノムＤＮＡサザンプロットをＮＡＩＰエクソンプローブとハイブリダズすると、現れたバンドの数は、ＮＡＩＰ遺伝子の単一コピーをプローブとした場合に予想されるより多かった。例えば、ＢａｍＨＩ制限切断ゲノムＤＮＡ含有ブロットをＮＡＩＰエクソン３−１１でプロービングすると、同一サイズの連続する１４．５ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントを含むバンドが正常なＮＡＩＰ部位に得られるはずである。（図１１）。ところが、さらに２つのバンドが９．４と２３ｋｂ（図１１）に現れた。これは、それぞれＰＡＣ２３８Ｄ１２と３０Ｂ２／２５０１７で見られる断片である。９．４ｋｂ ＢａｍＨＩ断片はコスミドからサブクローン化されたもので、欠失のあるエクソン８−１１を含んでいるが、この欠失は８番目のエクソンの直前にあるエクソン２から７を組み込んでいる（図１１）。２３ｋｂのバンドはＢａｍＨｉ部位から６ｋｂが欠失して、２つの連続する１４．５ｋｂのＢａｍＨＩ断片がエクソン２〜５、および８〜１１を含む２３ｋｂ ＢａｍＨＩ断片に置換し、その結果図１１に示したようにエクソン５および６が欠失する。この欠失の左側は、プライマー１９３３および１９２６での増幅では遺伝子産物ができるのに対し、１９３３および１９２３でのＰＣＲでは遺伝子産物が生成されない（データ示さず）という事実によってマッピングされた。プライマー１９２７および１９３３を用いてＰＣＲを行い、６ｋｂの欠失に及ぶ４．２ｋｂの接合断片を増幅すると（図１１）、サイズおよび配列がゲノムＤＮＡおよびＰＡＣｓ３０Ｂ２／２５０１７において見られるような増幅産物が得られた。様々なヒトゲノムＤＮＡに見られる９．４および２３ｋｂバンドの用量が異なることから、ＮＡＩＰ遺伝子の２つの部分的欠失型は、一般母集団に複数かつ多形性で存在することを示している。
非ＳＭＡヒト胎児脳のｃＤＮＡライブラリから、エクソン１１および１２（方式＃１）を欠失したクローンを同定し、そのうちの幾つかはさらにエクソン１５および１６（方式＃２）も欠失していたことから、複雑さがさらに高まった。こうしたエクソンの欠失はフレームシフトと非成熟タンパクの切断を生じさせるという事実は、それらが正常なスプライシングの変形であるよりはむしろ、一般母集団に存在する切断または欠失型ＮＡＩＰ遺伝子の転写結果である可能性の方が高いことがわかる（図１１）。以上を総合すると、ＮＡＩＰ遺伝子部位の内部欠失型および切断型は、幾つかは転写されるものであるが、これらの変異遺伝子の様々なコピー数を含む領域のプロフィールが我々の分析から明らかになった。
ＮＡＩＰのエクソン プローブを用いて、体細胞変異ハイブリッドＨＨＷ１０６４（Ｇｉｌｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）のＤＮＡ含有試料をプロービングすると、ＮＡＩＰ遺伝子の全ての形態が、この細胞系の第５桑色体に含まれた５ｑ１１−１３．３の３０Ｍｂ欠失領域に限定されることがわかる。以上の知見は、ＮＡＩＰエクソン１３をプローブに用いておこなったＦＩＳＨ検出によっても確認されている（未発表データ）。
ＮＡＩＰ遺伝子の突然変異分析
ＰＣＲで増幅したＮＡＩＰエクソン３〜１０でゲノムサザンブロットをプローブすると、III型ＳＭＡ患者近親家系２４５６１の発症者４例には、エクソン５および６を含む４．８ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ１断片が欠けていることが判明した（図１１および１４）。この家系についてＢａｍＨｉで消化したＤＮＡを同様に検出すると、１４．５ｋｂバンドの欠失が認められ、前記のようにエクソン５および６の欠失に対応した（図１１および１４）。やはり近親関係にあると考えられる他のフランス系カナダ人家族２組にも、これと類似した結果が認められている。
このエクソン５および６の欠失を確認するため、このエクソンと相同のプライマーを作成した（図１１の矢印で示すプライマー１８９３、１８６４、１８６３、１９１０、１８７７）。家族２４５６１と別のIII型ＳＭＡ近親家族のＤＮＡをエクソン５特異プライマー（プライマー１８６４および１８６３）を用いて、ＰＣＲで典型的な増幅を行うと同時に、エクソン１３配列を同時に反応させてＰＣＲが万が一エラーした場合にも対応できるようにした例を図１５に示す。エクソン５の増幅が存在しないことが、ＳＭＡの表現型と共分離していることが見いだせる。
ＮＡＩＰ遺伝子におけるエクソン５および６の欠失がＳＭＡの突然変異に起因するものかどうかを解析するため、サザン・ブロット解析をおこなった。エクソン５および６の６ｋｂ欠失の３’末端直近にマップされる８００ｂｐのＥｃｏＲＶ単一コピーローブを使用した（図１１）。このマーカーをＥｃｏＲＩサザン・ブロットとハイブリダイズすると、完全なＮＡＩＰ遺伝子部位のエクソン５および６を含む９．４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片とエクソン５および６が欠失した３ｋｂのＥｃｏＲＩバンドが検出された。ここで、われわれのＤＮＡ診断ライブラリで得られた筋緊張性ジストロフィー、ＡＤＰＫＯおよび嚢胞性繊維症の家族の９００種以上に及ぶ縁せき関係にない者のＤＮＡを含むＥｃｏＲＩのサザン解析試料について分析した。９．４ｋｂのバンドは、全ての被検個体に認められたが、これは、約９００の被検者それぞれにエクソン５および６が少なくとも一以上存在する事実と一致する。さらに、被検者全てにこの３ｋｂのバンドが認められたが、これは、一般母集団にエクソン５〜６が欠失したＮＡＩＰ遺伝子が何らかの形でほぼ全面的に遍在していることを示している。さらに、３ｋｂのバンドの容量にバラツキがあることから、エクソン５−６の欠失したＮＡＩＰ遺伝子のコピーの数は多型性であり、おそらく、ゲノム当たり４〜５コピーであろうと思われる。
次に、ＰＣＲ分析の範囲を拡大してエクソン５および６プライマーを用いて１１０のＳＭＡ家族に適用した。Ｉ型ＳＭＡ患者３８例中１７例名（４５％）、およびII型およびIII型ＳＭＡ患者７２例中１３例（１８％）に、このエクソンのホモ接合欠失が認められた。染色体がランダムに並んでいると仮定し、エクソン５〜６の欠失したホモ接合個体の実測頻度の平方をとると、Ｉ型ＳＭＡの６７％とII型／III型ＳＭＡの４２％について、エクソン５〜６の欠失した染色体が発現すると予想される頻度予測値が得られる。次に、増幅がうまくいかなかったＳＭＡ発症児の親１６８名についてＰＣＲ分析をおこなった結果、被検者３例においてエクソン５および６のホモ接合欠失が示唆された。この知見は、今回のアッセイには十分なＤＮＡによるサザン解析により、２例において確認された。この２名は、年齢２８歳と３５歳でともにＳＭＡ発症児の親で、電話でのインタビューで、体は健康で、ＳＭＡの発症はないと答えた。以上から結論として、単離されたＮＡＩＰのエクソン５〜６の欠失は、下記のようにＳＭＡ発症個体におけるより重度の欠失を表わしているものとも思われるが、臨床学的には無害であることから、極めて軽微なＳＭＡか正常な表現型に関係しているものと思われる。以上の個体について臨床学的評価が現在おこなわれている。
胎児脳のライブラリーとＰＴ−ＰＣＲ ＮＡＩＰ遺伝子産物から検出されたｃＤＮＡのクローン（図２）から判断すると、ＮＡＩＰ遺伝子の多くの、そしておそらくは全ての切断されコピーは転写されているように思われる。ＳＭＡ患者でそのゲノムにエクソン４および５のコピーを持っていない者の親３名については、表面上ＳＭＡの影響を受けていないと思われる状態を考えると、ＮＡＩＰのエクソン５〜６の欠失型も翻訳されていると考えられる。このモデルによると、エクソン５および６が欠けると、フレーム内で欠失が生じ、上流の最も長いＮＡＩＰの読み取り枠が上流に伸びてヌクレオチド２１１位のエクソン３開始メチオニンにまで達する。
さらに、欠失したエクソン５および６のＩＡＰモチーフがコードするタンパク配列は、エクソン１０および１１でコードされたＩＡＰモチーフに約３５％相同である。このことは、エクソン５〜６が欠失した上記３例の個体において、識別可能な表現型が存在しないことの理由となるかもしれない。モデルとして一つ考えられるのは、各染色体上にエクソン５〜６が欠失したＮＡＩＰのコピーが一つだけあると、ＳＭＡの弱い表現型が生じ、一方、エクソン４−５が欠失したＮＡＩＰ遺伝子座のコピーを３ないし４以上もつ個体の場合は、臨床学的に影響を受けないということである。ＳＭＡ遺伝子が重複することがこの疾患の基本条件であるのではないか、という可能性が、ＤｉＤｏｎａｄｏらによってこのほど提唱されている（１９９４年）。
ＳＡＭ組織および非ＳＭＡ組織由来のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる増幅
ＳＭＡ患者と非ＳＭＡ患者のＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を図１６に示す。
ここで得た知見では、内部に欠失がみられ、かつ切断されたＮＡＩＰ遺伝子型は、少なくともその一部は転写されていた。機能的タンパクを産生する正常なＮＡＩＰ遺伝子の転写と、生成しないものの転写とを区別するため、できるだけ大きな転写体をＲＴ−ＰＣＲ増幅することを試みた。エクソン１４の大きさが２．２ｋｂだとすると、これはエクソン２とエクソン１３の５’末端を含んだものであることがわかった。第１回目のＰＣＲ後の臭化エチジウム染色段階では遺伝子産物は検出されなかった。従って、先の図１６の説明のように二次の分枝増幅を行った。
ＲＴ−ＰＣＲ増幅実験の代表的な例を図１６に示す。すなわち、非ＳＭＡ組織のＲＮＡを鋳型に使い、エクソン１０または１３からの逆転写産物をＰＣＲ増幅すと、予想されたサイズの産物が一貫して増幅された。これとは対照的に、ＳＭＡ組織のＲＮＡを用いた同種のＲＴ−ＰＣＲ実験の結果、５例ではまったく増幅が認められなかったが、これは、この５例においては正常な転写が著しく制限されたか、あるいは転写が行われなかったことを示す（図１６Ａ９）。ＳＭＡ組織のＲＮＡは、死後わずか１２時間後に得られた。死後２４時間の正常な組織から完全なＮＡＩＰ転写を増幅するのは困難でないから、今回の増幅に伴う困難の原因はＲＮＡの劣化によるものだとは考えられない。また、増幅の困難性はＳＭＡ組織すべてについても見られるが、これは、ＮＡＰが運動ニューロンでのみ転写され、この運動ニューロンはＳＭＡではその細胞型を消失して居るために、脊髄組織でのＲＴ−ＰＣＲが成功しなかたったという可能性を否定するものである。
増幅が観察された事例では、ＲＴ−ＰＣＲ遺伝子産物の配列決定の結果、図１６Ａ，１６Ｂ，１６Ｃに示すように次の知見が得られた。
（ｉ）試料ａ９のエクソン５の３’末端からのコドン１５３および１９０の欠失。
（ii）資料ａ２のエクソン５プライマー１８６４およびエクソン１３プライマー１９７４により増幅した産物において、７３番目ヌクレオチドにある終止コドンのエクソン７へのフレームシフトを生じさせるエクソン６の欠失。
（iii）試料ａ７のエクソン４のプライマー１８８６とエクソン１３のプライマー１９７４により増幅された遺伝子産物への約５０ヌクレオチドの挿入。（iv）試料ａ３のエクソン５のプライマー１８６４とエクソン１３のプライマー１９７４による増幅産物のエクソン１１および１２の欠失と合わせて、エクソン５のグルタミン酸コドン番号１５８の欠失。
（ｖ）試料ａ２、ａ３、ａ９、ａ１１においてエクソン９プライマー１８４４およびエクソン１３プライマー１９７４による増幅産物において、終止コドン１４ヌクレオチドのエクソン１３へのフレームシフトを生じさせるエクソン１１および１２の欠失。
以上を要約すると、エクソン１３からの逆転写産物に対するＰＣＲを行った結果、１２例の非ＳＭＡ組織からは目的遺伝子産物がうまく増幅されたのに対し、１２例のＳＭＡ組織では増幅が成功したのは１例に過ぎなかった。後者の場合、すなわち、試料ａ１２においては、増幅が行われたのはエクソン１３から１４に限られ、その転写には、エクソン２〜３あるいはエクソン１４〜１７が含まれているどうかは不明である。以上のデータは、ＮＡＩＰがＳＭＡの原因遺伝子であるという強力な証拠であると考えられる。
ＮＡＩＰ蛋白質の役割
神経アポトーシス抑制タンパク遺伝子が第５染色体のＳＭＡ領域で発見されたことは、ＳＭＡの状態がアポトーシス抑制タンパクドメインにおける欠失の結果によるものであることを示している。運動ニューロンが長時間生き残るかどうかは、神経アポトーシス抑制タンパクアが生成されるかどうかにかかっている。このアポトーシス抑制タンパクドメインの欠失は、このタンパク活性を阻害する。我々は、ＳＭＡ患者全体の１７パーセント近くに、第５染色体のエクソン５および６の欠失が認められたことを実証した。
５ｑ１３．１の同定領域にはＮＡＩＰ遺伝子の完全なコピーと一部欠失したものが不定数含まれている。５ｑ１３．１には別に遺伝子座があってその突然変異がＳＭＡ表現型の発現の原因となることは否定できないが、ＮＡＩＰ遺伝子の突然変異はＳＭＡの発症には必要かつ十分であると考えられる。ほとんどの常染色体性劣性遺伝病では、その原因となる突然変異が所与の遺伝子の単一コピーに認められるのが通常であるが、これとは対照的に、ＳＭＡ染色体は、重度のＳＭＡ突然変異の場合には、正常なＮＡＩＰ遺伝子のみならずエクソン３および４が欠失した変異型も不足しているか、あるいは全く存在していないことによって特徴づけられるということである。こうした染色体の出現に際しては、不均衡なクロスオーバーが関与し、上記遺伝子座に欠失が生じ、その結果、ＮＡＩＰ遺伝子産物が欠け、ＳＭＡが発症するように考えられる。
ＳＭＡの診断
所与の個体におけるＳＭＡの遺伝子型を説明することは、５ｑ１３．１領域におけるＮＡＩＰ遺伝子の異常増幅によって複雑となる。ＮＡＩＰエクソン・プローブでゲノムＤＮＡ含有サザンブロットをプロービングすると、ＮＡＩＰ遺伝子の内部欠失型および切断型コピーから生じたバンドが見られる。従って、一般母集団においては、多様な形態のＮＡＩＰ遺伝子座が不定数存在するのが正常であり、それだけではＳＭＡ突然変異の判定要素とはならず、それ故に、ＮＡＩＰ遺伝子の突然変異分析は複雑となる。ＮＡＩＰ遺伝子座の変異体を含有したゲノムＤＮＡが検出されても、ＳＭＡ染色体の証拠とはならず、正常な遺伝子が欠損しているかどうかを探求しなければならない。しかし、ゲノム中にエクソン３−４のコピーがないにもかかわらず、臨床上は疾患の形跡がないという珍しい患者を我々は検出した。これは、我々がＮＡＩＰ遺伝子構造について理解していることと一致する知見である。従って、ＳＭＡ染色体の同定は、完全なＮＡＩＰと、エクソン３−４だけが欠失したＮＡＩＰ型の両方が不在であることに依存する。それが欠けているかどうかを検定する作業は複雑なものとなる。それは、ＮＡＩＰ遺伝子座でもう一つ、欠失のさらに進んだ形のものそれぞれに正常なＮＡＩＰ断片が存在するためにである。例えば、ＳＭＡ患者がそのゲノムにＰＡＣ２３８Ｄ１２と３０Ｂ２、すなわち各々エクソン１−６およびエクソン５、６と１１−１４が欠失したＮＡＩＰの欠失型（図１０、１１）だけを持っている場合、ＰＣＲとサザン・ブロット解析ではＮＡＩＰのエクソン５−６だけが欠失した型を持っていることになり、従って、ＳＭＡ染色体は含んでいないように見られる。我々は、観察した多数のエクソン５−６の欠失したＳＭＡ患者の多く、おそらくはその大部分が、実際にこうした構造の染色体を持ち、欠失のないＮＡＩＰ遺伝子座もエクソン５−６だけが欠失したＮＡＩＰ型も含んでおらず、何か別の遺伝子座に重度な切断／欠失の認められる型を組み合わせたものを含有していて、その結果、欠失のないＮＡＩＰの翻訳ができないのだと考えている。こうした解釈の裏付けとなるのは、我々が、Ｉ型ＳＭＡ組織のＲＮＡにＲＴ−ＰＣＲを用いて、正常なＮＡＩＰ転写体を増幅させることができないという事実による。
以上を総合して、ＮＡＩＰ遺伝子の突然変異またはその欠失がＳＭＡの原因となるという見解を支持する証拠をあげると次のようになる。
（i）ＮＡＩＰは、バキュロウイルスのＩＡＰと相同性があることを考えると、アポトーシスの抑制因子として作用する可能性が高いこと。この特性はＳＭＡの病理と完全に呼応するものである。ここで注目に値するのは、従来より、アポトーシスの調節遺伝子の変異がＳＭＡの原因ではないかと推測されていたことである（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ １９９１，Ｓａｒｎｍａｔ，１９９２）。
（ii）組換えの範囲内でのＮＰＩＡ遺伝子座のマッピングは重大なＳＭＡ区間を規定すること、Ｉ型ＳＭＡと強い連鎖不平衡状態にあることが判明している３種の多型マーカー、すなわち、ＣＡＴＴ−４０Ｇ１（Ｍｃｌｅａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、Ｃ２７２（Ｍｅｌｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４）およびＡＧ−１（ＤｉＤｏｎａｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４）は全てＰＡＣ１２５Ｄ９に位置し、ＮＡＩＰイントロン上に存在する（図９Ｃ）という事実。
（iii）Ｉ型ＳＭＡの表現型と５ｑ１３．１マーカーの間に見られる連鎖不均衡の性質。我々は、非ＳＭＡ染色体でしばしば重複しているＣＴＴ−４０Ｇ１ ＣＴＲ下位部位（Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４）の欠失が、非ＳＭＡ染色体では４５％（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）であるのに対して、Ｉ型ＳＭＡでは８０％であることを見出している。この知見は、ＳＭＡ染色体におけるＮＡＩＰ遺伝子数の欠失とよく一致する。同様に、Ｍｅｌｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４は、Ｉ型ＳＭＡにおけるＣ２７２ＣＴＲのバンド数の減少を伴う“ヘテロ接合体不全”を観察し、彼らはこれを、染色体欠失を反映するものであると提案している。ＤｉＤｏｎａｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）もまた、非ＳＭＡ患者に比べて、Ｉ型ＳＭＡ患者ではＡＧ１ＣＴＲ下位部位の数の著しい減少を見出している。Ｉ型ＳＭＡ染色体でのこれらＮＡＩＰ内マーカーの欠失に関する３つの研究グループの観察結果は、ＮＡＩＰ遺伝子の正常型とエクソン５−６欠失型双方の欠如または不在が疾患の原因となるというモデルと良く一致する。
（iv）ＮＡＩＰエクソン５−６の欠失割合は、非ＳＭＡ染色体での検出（２−３％）に比べて、ＳＭＡ染色体で検出される割合が著しく高い（Ｉ型ＳＭＡ染色体で約６７％、II／III型ＳＭＡ染色体で４２％）。既に概観したように、この現象は、ＳＭＡ染色体において正常なＮＡＩＰ遺伝子とともにエクソン５から６のみが欠失したＮＡＩＰ変異型の双方が現象または不在であることを反映するものであり、ＮＡＩＰ遺伝子のより重度な内的欠失型および切断型が表出されていると思われる。
（ｖ）１２名の非ＳＭＡ患者からのＲＮＡは全てＲＴ−ＰＣＲで増幅できたにも関わらず、１２名中１１名のＳＭＡ患者からのＲＮＡの転写物は一貫してＲＴ−ＰＣＲ増幅することはできなかった。さらに、Ｉ型ＳＭＡ材料から得ることのできたＰＣＲ産物の配列を決定したところ、様々な突然変異と欠失が明らかになった。
（vi）ＮＡＩＰ遺伝子の切断型および内的欠失型のコピーが不定数存在することは、常染色体優性多発性嚢胞腎臓病（ＡＤＰＫＤ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，１９９４）で報告されている状況と類似している。このケースの場合には、原因遺伝子に対応するプロセスされていない偽遺伝子の位置が第１６染色体以外の場所にマッピングされることが見出されている。主な相違点は、ＮＡＩＰの遺伝子座では、その遺伝子の突然変異型が増幅されるという点である。
この点に関して、５ｑ１３．１のＮＡＩＰ領域は、ステロイド２１−ハイドロキシラーゼをコードする遺伝子ＣＹＰ２１を含有する第６染色体の領域との類似性が高い（Ｗｅｄｅｌｌ ａｎｄ Ｌｕｔｈｍａｎ，１９９３）。ＣＹＰ２１は突然変異すると常染色体性劣性２１ハイドロキシラーゼ不全を引き起こすが、これは個体中のコピーが０−３個の時に観察されている。また、この領域にはＣＹＰ２１の不活性の偽遺伝子コピー（合わせて、ＣＹＰ２１Ｐという）が不定数存在する。ＣＹＰ２１の突然変異体の大多数は２１ハイドロキシラーゼ不全で観察されているだけでなく、ＣＹＰ２１Ｐの幾つかの形態でも検出できることから、この偽遺伝子はＣＹＰ２１で見られる突然変異の発生源として作用すると考えられる。切断および内的欠失を有するＮＡＩＰ遺伝子が類似しているのはＣＹＰ２１Ｐのみであり、ＣＹＰ２１／ＣＹＰ２１Ｐについて想定される遺伝子変換の代わりに、機能性タンパクをコードするＮＡＩＰ遺伝子形態を欠失させるような不均衡なクロスオーバーが染色体に生じる可能性がある。５ｑ１３．１上における変異ＮＡＩＰ遺伝子の多型性の存在は、上記のようにしてＳＭＡ染色体が発生する機序だと考えられる。
バキュロウイルスＩＡＰ
ＮＡＩＰは、ＣｐＩＡＰおよびＯｐＩＡＰという昆虫細胞のアポトーシス抑制能をもつ二種のバキュロウイルスＩＡＰと高い相同性を示す（表４）。昆虫の細胞アポトーシスはバキュクロウイルス感染によって生じるが、これについては十分に実証されており、防衛メカニズムの一種と考えられている。感染した昆虫の細胞が早期に死亡する結果、ウイルスの複製が弱められる（Ｃｌｅｍ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，１９９４ａ）。ＣｐＩＡＰおよびＯｐＩＡＰは、こうしたアポトーシスメカニズムに対するバギュロウイルス反応を表すものであると考えられる。両タンパクとも互いに関係なく作用し、宿主昆虫細胞アポトーシスを抑制することによってウイルスの増殖を増加させる（Ｃｌｅｍ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，１９９４ａ，１９９４ｂ）。これらのタンパクは相互にのみ強い類似性を有することが知られているが、最近までｃｒｏｓｓｐｈｙｌａタンパクとの配列上の類似性は報告されていなかった。その作用形態は知られてはいないが、ＤＮＡとある程度相互作用することものと想定されている。
ＮＡＩＰの働きおよび細胞局在性についてはまだ明らかにされていない。しかし、系統発生的にかなりかけ離れたＮＡＰ配列とバキュロウイルスＩＡＰ配列との強い類似性と、先に想定したようなＳＭＡの発生病理における異常なアポトーシスの役割とを考えあわせると、ＮＡＩＰは運動ニューロンにおいてアポトーシス抑制因子として作用する可能性が高い。ＮＡＩＰを用いて昆虫および哺乳類の神経細胞にトランスフェクション・アッセイをおこなえばこの点が明らかになるであろう。
一つの可能性は、ＮＡＩＰのカルボキシル末端が特異なリガンドに結合してＧＴＰの結合部位を活性化させ、それがＩＡＰドメインを活性化させるということである。従って、運動ニューロンが生存できるかどうかは、リガンドが存在するかどうかで決まることになる。濃度が閾値以下に低下すると、ＩＡＰ領域は機能が停止し、その結果、細胞が死ぬ。これは胚形成過程で観察される運動ニューロンが自然選別されるメカニズムと考えられる。リガンドは筋肉細胞あるいはシュワン細胞のいずれかから発生すると考えられる。以上から、運動ニューロンの胚形成は細胞間における一種の競争と見ることができ、ＮＡＩＰの占有率を維持できるだけの接触をおこなう細胞だけが生き残ることができるのである。
想定した通りにＮＡＩＰがアポトーシスを抑制するとしても、ＮＡＩＰがこれまでに特性化されていない哺乳動物のアポトーシス経路の成分であるのか、ヒトのアポトーシス抑制因子であるＢｃｌ−２（Ｖａｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｒｙ ｅｔ ｌａ．，１９９０；Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，９９２）に関わる経路の上流成分（と考えられるもの）であるのかは不明である。アポトーシス抑制因子の欠落したバキュロウイルス株を用いて検査した結果、Ｂｃｌ−２はそのような欠落を補完はしないことが明らかとなった（Ｃｌｅｍ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，１９９４ｂ）。ＮＡＩＰがバキュロウイルスの機能的相似体であるとすれば、この観察からわかることは、従来特性化されていない真核細胞アポトーシスの経路においての何らかの役割が示唆される。可能性として一つ考えられるのは、ＮＡＩＰは、神経栄養性サイトカイン、繊毛の神経栄養性因子（ＣＮＴＦ，Ｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｍｅａｋｉｎ ａｎｄ Ｓｈｏｏｔｅｒ，１９９３）またはこの経路の下流成分の一種（Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４）を伴った新規なアポトーシスメカニズムとの交差を表わすということである。ＣＮＴＦナルマウスはＳＭＡと類似した病理学的態様を示し、ニューロンの正常な発達に続いて最初は徐々にアポトーシス的欠失状態が続く（Ｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。さらに、正常な状態での神経栄養因子の剥奪は培養ニューロンにアポトーシスを生じさせるが、ＣＮＴＦだけではＢｃｌ−１で救済されるようなアポトーシスを抑制することはできないということは注目すべきである。こうした知見に基づいて、その研究者等は第２の真核細胞アポトーシス経路の存在を示唆している（Ａｌｌｓｔｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。このような別々の経路の存在は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およびＣＮＴＦ（Ｍｉｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４）で処理後に、Ｗｏｂｂｌｅｒマウスの突然変異体における運動ニューロンの欠損が顕著に遅延することに見られる相乗効果を裏付けるものかもしれない。
ＮＡＩＰの脂質付着部位の役割は知られていない。同種の部位は、通常はタンパクのアミノ末端にある原核タンパクのリーダー配列としての役割を果たすことが知られている。我々は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｒｅｌｅａｓｅ−２８）の２１８のヒト配列に共通パターンを検出した。これらの配列は多様な機能的背景に存在する。例えば、トランスメンブラン領域、シグナル配列、細胞外領域および細胞質領域などである。一つ考えられるのは、リポタンパク質付着部位は細胞外にあり、インテグリンと細胞外マトリックスとのアポトーシス抑制性相互作用について想定されているような方法でシュワン細胞のプロテオリピッドの成分を結合するということである（Ｍｅｄｅｄｉｔｈ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ｆｒｉｓｈ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ，１９９４）。さらに、この付着部位は我々がノーザンブロット解析で観察した肝細胞のＮＡＩＰにおいてはより積極的な役割を果たしているとも考えられる。また、ＳＭＡ発症児には血清脂肪酸異常が検出されたことは注目に値する（Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｓｌａｄｋｙ，１９８６）。
５ｑ１３．１の同定領域は、ＮＡＩＰ遺伝子の他に、ＮＡＩＰ遺伝子の内部欠失／切断型のコピーも不定数含んでいる。完全なＮＡＩＰ遺伝子と、特定個人のゲノムからエクソン５および６が欠失したＮＡＩＰ遺伝子座の両方が欠損または不在であることがＳＭＡの原因でると我々は考えている。この点について、我々はＮＡＩＰを同定したことにより、ＳＭＡの正確な分子的診断法を整備することができるだけでなく、このような疾病状態に対する伝統的な治療法と遺伝的治療法とを公式化することがが可能となったのである。さらに、ＮＡＩＰ遺伝子座とＮＡＩＰと相互作用するタンパクとの相同性を示す遺伝子の同定により、哺乳類細胞におけるアポトーシスのメカニズムをさらに明らかとするための助けとなるかもしれない。
実施例
Ｆａｍｉｌｙ Ｍａｔｅｒｉａｌ
ＭａｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ，（１９９３）に記載の方法で、所定の診断基準を満足する患者を対象に臨床的診断をおこなった。記載に従ってＤＮＡを抹消白血球から単離した（ＭａｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。
遺伝的分析および連鎖不平衡分析
ミクロサテライト マーカーによる遺伝子型の決定は、ＭａｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）およびＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）に従って行った。既に述べたように、次の５ｑ１３．１部位を用いた。Ｄ５Ｓ１１２（Ｂｒｚｕｓｏｗｉｔｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、Ｄ５Ｓ３５１（Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、Ｄ５Ｓ４３５（Ｓｏａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、Ｄ５Ｓ５５７（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、Ｄ５Ｓ６２９およびＤ５Ｓ６３７（Ｃｌｅｒｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、Ｄ５Ｓ６８４（Ｂｒａｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、Ｙ９８Ｔ、Ｙ９７Ｔ、Ｙ１１６Ｔ、Ｙ１２２ＴおよびＣＭＳ（Ｋｌｅｙｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、ＣＡＴ（Ｂｕｒｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）およびＭＡＰＩＢ（Ｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。
ミクロサテライトの繰返しで見られる複数対立遺伝子に対応できるパラメタを用いて連鎖不平衡分析をおこなった。不平衡分析は元来複雑なことを考え、複数の対立遺伝子に対応可能な計４種のパラメタを用いた。このパラメタとは、Ｈｄｅｒｉｃｋ（１９８７）に規定されているＤｉｊ、Ｄｉｊ’およびＤ’ならびにχ²検定である。うち２種、Ｄｉｊ、Ｄｉｊ’は筋緊張性ジストロフィーに関する以前の研究（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４）において後見的位置情報として最適であるとされている。患者とコントロール母集団はＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ，（１９９４）のとおりである。
コスミド、ＹＡＣ、ＰＡＣの系列化
コスミドとＹＡＣ連続系列についてはＲｏｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）に概要が述べられている。ＰＡＣはＩｏａｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）の記載に従って作製した。以上の方法を用いて合計１７５，０００個のクローンからなるＰＡＣライブラリを３つ作製し、マイコロタイター皿に個別クローンとして増殖させた（Ｉａｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ．，結果未公表）。３つのライブラリ（ＬＬＮＬ ＰＡＣ １、ＲＰＣｌ１、ＲＰＣｌ２と命名）を５ｑ１３．１ＳＴＳ’ｓでスクリーニングした。ポジティブなＰＡＣを配列して、互いに連続的にオーバーラップするように配置し、さらにＳＴＳを加えて解析するとともに、単一コピーのゲノムＤＮＡとｃＤＮＡプローブを用いてＰＡＣ ＤＮＡを含有するサザンブロットをプロービングした。
ＤＮＡ操作および分析
ＰＡＣゲノムＤＮＡインサートをＢａｍＨＩ、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ、全および部分的Ｓａｕ３ａｌ（５ｋｂのインサートサイズに合わせて選択）で消化することにより、ＰＡＣ１２５Ｄ９インサートを含む４種のゲノム・ライブラリーを作製し、これをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにサブクローニングした。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）の方法により、部分Ｓａｕ３Ａｌ消化ライブラリーから得た５ｋｂのクローン２００個について両末端の約４００ｂｐの配列を決定した。
ＰＡＣのコード配列をＣｈｕｒｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）に記載されたエクソン増幅法で単離した。ＰＡＣをＢａｍＨＩまたはＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIIで消化させ、サブクローニングしてｐＳＰＬ３を得た。各ＰＡＣのプールしたクローンをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。２４時間のトランスフェクション後、ＲＮＡ全体を抽出した。エクソンはｐＡＭＰ１０（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）にクローニングし、プライマーＳＤ２（ＡＴＧ ＡＡＣ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＴＧ ＡＣＡ ＡＧＣ ＴＧＣ）を用いて合成した。
ＡＢＩ ３７３Ａ 自動ＤＮＡシーケンサーによりＤＮＡの配列決定を行った。λｇｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびλＺＡＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の市販ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを用いて転写物の候補を単離した。ノーザンブロットは市販品を入手し（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、標準的な方法で検出を行った。
一般に、文献でＰＣＲ用に使用されるプライマーは６０℃のＴ_mＳに選択されたもので、９４℃、６０秒；６０℃、６０秒；７２℃、９０秒を３０サイクルという条件で使用される。ＰＣＲプライマーのマッピングは図面および本文に記載の通りである。プライマーの配列は下記の通りである。

ＲＴ−ＰＣＲ
７μｇの完全なＲＮＡを用い、２０μｌの反応溶液でｃＤＮＡを合成した。このＲＮＡを５分間９５℃で変性し、３７℃で冷却した。５μｌ５×の逆転写緩衝液、２μｌ ０．１Ｍ ＤＴＴ、４ｌ２．５ ｍＭ ｄＮＴＰ、８単位ＲＮＡｓｉｎ、２５ ｎｇ ｃＤＮＡプライマー（１２８５）および４００単位ＨＭＬＶ（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）を添加後、４２℃で１時間逆転写反応を行った。その後、５０μｌＰＣＲの反応では鋳型として１μｌのＤＮＡを用いた。この一次ＰＣＲ１ μｌを鋳型に用いて二次ＰＣＲ増幅を行った。
配列分析
一次ＤＮＡ配列データをＴＥＤプログラムで編集した（Ｇｌｅｅｓｏｎ ａｎｄ Ｈｉｌｌｉｅｒ，１９９１）。部分Ｓａｕ３Ａｌ消化ライブラリーの部分的にアミノ酸配列が決定されている５ｋｂクローン２００のうちなるべく多数を、ＸＢＡＰ Ｓｔａｄｅｎパッケージにより配列し、オーバーラップする列にした（Ｄｅａｒ ａｎｄ Ｓｔａｄｅｎ，１９９１）。また、ＧＣＧ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，１９９１）により配列データを組立て、分析した。Ｐｒｏｃｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎデータベース（Ｂａｉｒｏｃｈ ａｎｄ Ｂｕｔｃｈｅｒ，１９９３）を検索して蛋白質領域の相同性を検出した。ＭＥＭＳＴＡＴプログラムも使ってトランスメンブランドメイン領域の検索もおこなった（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。

配列表
配列番号１
（Ａ）配列の長さ： ５０５２塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ： ＮＯ
アンチセンス： ＮＯ
ゲノム位置
単位： ｂｐ
配列

配列番号２
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： １２３３アミノ酸
（Ｂ）配列の型： アミノ酸
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： タンパク
配列

配列番号３
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２１塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号４
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２０塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号５
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２２塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号６
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２１塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号７
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２１塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号８
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２１塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号９
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２１塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号１０
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２１塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号１１
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２２塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号１２
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２７塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号１３
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２１塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号１４
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２１塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号１５
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２４塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号１６
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２３塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号１７
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２２塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号１８
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２１塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号１９
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２２塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

配列番号２０
配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ： ２１塩基対
（Ｂ）配列の型： 核酸
（Ｃ）配列の数： １本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ｃＤＮＡ
配列

Claims (3)

1. 配列番号１の３９６位塩基から４０９２位塩基までのヌクレオチド配列にコードされる神経細胞アポトーシス抑制タンパク。
2. 請求項１の神経細胞アポトーシス抑制タンパクを認識するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体。
3. 脊髄性筋萎縮症の原因となる神経細胞アポトーシス抑制タンパクを認識する、請求項２記載のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体。

Images