CN1822845A - 阻止和治疗细胞死亡的手段以及它们的生物学应用 - Google Patents

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Abstract

阻止、遮掩/沉默细胞死亡中半胱天冬酶－2活性的抑制剂。

Description

阻止和治疗细胞死亡的手段 以及它们的生物学应用
本发明涉及阻断、阻止或治疗细胞死亡尤其是神经细胞死亡的手段、方法和产品。
为了去除多余的神经元，在胚胎发生过程中发生神经元细胞死亡以确保合适的突出前或突出后连接，并允许功能性成人大脑的形成。
除了与正常衰老相关的有丝分裂后死亡外，急性损伤(例如，缺氧-缺血、中风、脊髓损伤、创伤)或慢性神经退行性疾病过程中，环境或基因突变因子可以诱导成人的神经元死亡。
与这些紊乱相关联的细胞死亡可以通过三个截然不同的机制发生，展现了坏死、自噬或凋亡的形态学和生物化学特性。生理和病理的神经元死亡通常都与有缺陷的凋亡调节相关联，哺乳动物细胞内导致这个有活性的细胞自杀机制的信号传导途径可以分为半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(半胱天冬酶(caspase))依赖性和半胱天冬酶非依赖性途径。
神经元凋亡是有活性的细胞自杀机制，可分为顺序的阶段，包括启动、判断、执行和降解。特异性机器的激活，包括半胱氨酸依赖性天冬氨酸特异性蛋白酶(半胱天冬酶)和可以起决定性(或扩大)调节性细胞器作用的线粒体，都驱使了这个级联事件。的确，线粒体的改变包括线粒体内膜电化学梯度(Δψm)的丢失和例如细胞色素C、Smac/Diablo和凋亡诱导因子的促凋亡因子的释放。一旦从线粒体释放，这些效应子触发半胱天冬酶依赖性和/或半胱天冬酶非依赖性细胞浆和细胞核的分解。因此，线粒体因子联合半胱天冬酶造成了凋亡的降解相，导致细胞皱缩、核凝聚(condensation)、凋亡小体的发射和例如磷脂酰丝氨酸转位到浆膜外叶的“吃我”信号的出现。在没有噬菌细胞存在下，进行凋亡的细胞最后发生非特异性浆膜破裂，称为继发坏死。
神经元凋亡过程中线粒体、半胱天冬酶和其它事件各自的作用仍然没有阐明，特别是关于给定的死亡诱导剂/细胞类型偶联。
直到最近，主要通过两个类型的手段研究了神经元细胞的凋亡和坏死：第一组(生化)技术一般用线粒体琥珀酸脱氢酶活性(MTT试验)或乳酸脱氢酶活性细胞外释放(LDH试验)的比色法评价神经元死亡的晚期事件。这些常规的单参数定量技术没有给予关于细胞死亡机制的信息，并且不能与其它生化过程的检测联合。
近来，对于通过免疫印迹生化评估细胞色素C转位并使用产荧光的底物评估半胱天冬酶的激活发表了一些适合神经元细胞分级分离方案。这些最近的方法给予了神经元群的半定量信息，但是排除了多参数和实时分析。第二组技术使用荧光显微镜(FM)读出装置检测了细胞器的修饰或凋亡相关蛋白质。这些FM研究大部分集中于后期细胞核的改变，包括染色体形态的显现(Hoechst染色)和/或DNA片段化的生化检测(TUNEL试验)。在一些最近的神经元FM研究中，报告了(固定细胞中)细胞色素C的免疫定位，但是与细胞生物学其它领域相反，有限数量的神经元研究使用了线粒体改变和半胱天冬酶激活的原位检测。当应用于培养的原代神经元时，基于FM的分析很耗时、费工，并且细胞体聚集物和重叠的轴突网络阻碍了定量分析。另外，敏感荧光探针的光学淬灭能够导致显著的错误解释，并且排除了早期死亡相关事件的实时追踪。因而，在原代神经元中关键凋亡事件的细胞生物学特点还没有完全证明和排序。
本发明者开发了分析凋亡现象动力学的互补和定量的途径，特别是对于原代皮层神经元或神经元细胞系或非神经元细胞系有用。
这样的途径使得本发明者开发了组织和分析与凋亡相联系的分子事件的新方法。为了用这个方法评价神经元细胞中凋亡相关事件的时间表和分级(hierarchy)，本发明者详尽说明了实验性急性死亡模型以测定干扰凋亡过程的更加邻近的可逆检查点并将所述方法应用于这个模型。有利地，能够在神经元细胞、神经元细胞系以及非神经元细胞和非神经元细胞系上进行这个评价。
本发明的目的是提供多参数分析和成像平台方法，以鉴别阻止细胞死亡的细胞检查点，及其阻断和阻止细胞死亡的用途。
本发明的另一个目的是发明者提供了实时跟踪神经元或细胞系中一个或多个凋亡印记的方法。
本发明的另一个目的是提供诱导半胱天冬酶-2(也称为Nedd-2；Ich-1)的基因沉默或抑制前凋亡半胱天冬酶-2的活性(或干扰下游半胱天冬酶-2依赖性过程)的新型化合物。
本发明的另一个目的是提供治疗涉及半胱天冬酶-2的疾病和损伤的药物组合物和方法。
根据一个方面，本发明涉及阻止细胞死亡的方法，包含在给定的细胞类型中依赖于给定的诱导途径对凋亡相关事件的分级(hierarchy)的测定和更加邻近的可逆检查点的阻断以干扰凋亡过程。
在神经元中通过联合快速定量流式细胞仪和定量/定性荧光显微镜分析很便利地进行这个方法。所述方法也能用在神经元细胞系上。
这两个技术的使用实现了凋亡的判断、效应、早期和晚期降解阶段的共检测。
如实施例所说明地，本发明提供了开发可靠地实时流式细胞仪的方法以监测应答于包括MPTP处理的神经毒性损伤的Δψm和浆膜、核和细胞形态颗粒度和细胞大小变化。
使用特异性非重叠荧光探针和/或特异性抗体和/或药理试剂，本发明提供了实现研究凋亡的细胞生物学并特征分析新的保护性分子的有用的手段(mean)。
本发明者使用了神经元培养中血清的剥夺作为实验模型以研究神经元死亡的途径以及鉴别上游检查点。神经元发育和病理过程中，不能找到合适靶点或代谢物(氧气、葡萄糖、钾、神经营养或生长因子、养分)和靶点衍生神经营养因子来源的神经元发生凋亡性细胞死亡(Deckwerth等人，1996；Deshmuck等人，1996和1998；Lipton，1999；Plenisla等人，2001；Chang等人，2002)。
在急性血清剥夺(SD)诱导的神经元细胞死亡的上下文中，通过使用所述多参数和成像分析平台并且通过研究半胱天冬酶的选择性作用(药理抑制；小干扰RNA基因压制(knock-down))，本发明者发现半胱天冬酶-2是Bax依赖性MMP的上游调节子。
相应地，本发明特别涉及检查点是半胱天冬酶-2的方法。如说明书和权利要求中使用的术语“半胱天冬酶”包含了替代剪切得到的各种形式。
如本发明者所显示地，早期半胱天冬酶-2的激活是线粒体Bax转位、线粒体膜电位(Δψm)破坏、半胱天冬酶-9/半胱天冬酶-3细胞色素C释放依赖性的激活、核改变、磷脂酰丝氨酸暴露和浆膜的最终通透(PMP)所必需的。
根据本发明的另一个实施方案，所述检查点是半胱天冬酶。
根据另一个实施方案，所述检查点是不相关的半胱天冬酶的激活。
本发明因而也涉及能够阻止或阻断半胱天冬酶-2活性(和/或半胱天冬酶-2/bax相互作用)以沉默半胱天冬酶-2表达的分子，以及用于治疗有半胱天冬酶-2参与的疾病和损伤，特别是治疗(缺氧-)缺血损伤的药物组合物。
根据另一个方面，本发明涉及半胱天冬酶-2抑制剂和抑制/沉默神经元细胞死亡中半胱天冬酶-2的方法。
本发明优选的实施方案中，半胱天冬酶-2抑制剂是分离的双链RNA分子，能够特异性靶向半胱天冬酶-2mRNA以降低或抑制半胱天冬酶-2的表达。
本发明特别涉及尤其是小鼠和人来源的原代神经元或神经元细胞系中半胱天冬酶-2活性的降低或抑制。
它也涉及对所述抑制剂对包括肿瘤细胞的非神经元细胞中半胱天冬酶-2的活性的降低或抑制。
用于沉默半胱天冬酶-2的双链RNA分子是由15-25个核苷酸，优选地19-25个核苷酸的互补链组成的双体。优选地，稳定小干扰链的末端以抗降解。
对于半胱天冬酶-2的沉默有利的siRNA包含互补的SEQ ID No 1和SEQ ID No 2的双体。其它有利的siRNA包含互补的SEQ ID No 6和SEQ ID No 7的双体。
另一个优选的实施方案中，半胱天冬酶-2的抑制剂是shRNA。本发明因而涉及基于如上面定义的siRNA序列导致细胞对细胞内(incellula)特别是神经元和细胞系中半胱天冬酶-2沉默的任何shRNA构建体。
优选的shRNA构建体包含SEQ ID No 1和SEQ ID No 2，或者SEQID No 6和SEQ ID No 7，或者SEQ ID No 8和SEQ ID No 9，或者SEQID No 10和SEQ ID No 11的插入。
通过合成得到或在细胞中生产双链的所述siRNA或shRNA。
如实施例说明地，基于siRNA或shRNA的基因压制完全阻止了血清剥夺诱导的皮质神经元死亡。
本发明也涉及每个RNA链的合成和所述链的联合，以形成能够特异性靶向细胞内mRNA半胱天冬酶-2的双链分子。
在抑制性半胱天冬酶-2表达的条件下将合成的RNA分子引入人或动物或人来源。引入步骤包含合适载体的使用或通过注射进行。
或者，使用含有表达所述RNA的遗传信息的载体。这样的载体也在本发明的范围内。
本发明的抑制剂阻断凋亡或坏死或自噬类型的细胞死亡。
本发明者也开发了药理(通过特定肽优选地但不排外地，五肽对半胱天冬酶-2活性的直接抑制)工具以体外减弱半胱天冬酶-2介导的细胞死亡。所述工具在临时美国未决定的申请中有公开。
因为Bax的切割和半胱天冬酶-2活性在血清剥夺诱导的皮质神经元死亡中发生在线粒体的上游，并且半胱天冬酶-2活性的抑制通过对Bax切割的抑制导致了神经元的存活，为了开发能够保护细胞对抗死亡的新的分子，本发明者使用了这个调节步骤。
如上面提到地，本发明者证明了半胱天冬酶-2依赖性途径是体外神经死亡的急性模型和体内中风中必需的。本发明者也显示了与广谱半胱天冬酶抑制相比，半胱天冬酶-2的特异性抑制在体内更加有效地保护神经元。如实施例中显示地，半胱天冬酶-2是包括缺氧-缺血(H-I)损伤在内的体内病理情形下神经元细胞死亡(尤其是凋亡)抑制的上游主要检查点。
本发明因而涉及用具有SEQ ID No 5的分子体外抑制半胱天冬酶-2的活性。它也涉及用具有SEQ ID No 5的分子体内抑制半胱天冬酶-2的活性。
特别是，本发明涉及能够破坏Bax和半胱天冬酶-2之间的相互作用或者阻止半胱天冬酶-2依赖性Bax切割的分子。
优选的肽来源于有3至40个氨基酸长的Bax序列，包括序列IQD(例如：SEQ ID 12-23)。特别优选的序列包括：
SEQ ID No 12：KTGAFLLQFIQDRAGRMAGETP
SEQ ID No 13：GAFLLQGFIQDRAGRMAGETP
SEQ ID No 14：FLLQGFIQDRAGRMAGETP
SEQ ID No 15：LQGFIQDRAGRMAGETP
SEQ ID No 16：GFIQDRAGRMAGETP
SEQ ID No 17：FIQDRAGRMAGETP
SEQ ID No 18：IQDRAGRMAGETP
SEQ ID No 19：IQDRAGRMAGE
SEQ ID No 20：IQDRAGRMA
SEQ ID No 21：IQDRAGR
SEQ ID No 22：I QDRA
SEQ ID No 23：I QDR
本发明也包含能够破坏Bax和半胱天冬酶-2之间相互作用或阻止半胱天冬酶-2依赖性Bax切割的任何分子，它在氨基末端或羧基末端与肽或非肽分子联合，产生(不管是否在特异性识别之后)能够进入细胞以破坏半胱天冬酶-2和Bax之间相互作用的嵌合分子。
它也包含在氨基末端或羧基末端与肽或非肽分子联合的分子，产生(不管是否在特异性识别之后)能够进入细胞以阻止或治疗凋亡或提供线粒体保护性细胞保护作用的嵌合分子。
其它源自能够破坏Bax和半胱天冬酶-2之间相互作用或阻止半胱天冬酶-2依赖性Bax切割的分子的肽分子具有长度为3至10个的氨基酸，包括在氨基末端或羧基末端与标记物(例如：产荧光的(AMC、AFC、PE…)、显色的(pNA…)或生物发光底物、放射性同位素…)联合的序列IQD。
提供含有特定半胱天冬酶-2抑制剂的药物组合物是本发明的另一个目的。
本发明的药物组合物包含与药学可接受的载体相连的如上面定义的至少一种治疗有效量的半胱天冬酶-2抑制剂。
本发明特别涉及包含例如上面定义的siRNA或shRNA分子的药物组合物。
它也涉及包含有效量SEQ ID No 5的药物组合物。
包含能够破坏Bax和半胱天冬酶-2之间相互作用或阻止半胱天冬酶-2依赖性Bax切割的有效量的至少一种分子的药物组合物，特别是源自如上面定义的Bax序列的肽，特别是具有序列SEQ ID No 12至SEQ ID No 23的那些以及源自它们的分子。
根据本发明的药物组合物有利地旨在通过口服、局部(例如，浸透化合物或药物组合物的Gelfoam的脑室内或脑内植入、用于机械给药的设备的大脑内植入)或全身(例如：腹腔内、静脉内…)给药以降低细胞死亡。
包含RNA双体的抑制剂的给药有利地按照将核酸引入靶细胞的经典方法进行。
半胱天冬酶-2特异性抑制剂的腹腔内给药很强地降低经受短暂缺氧-缺血大脑损伤的大鼠崽的梗死面积。
所述药物组合物对于包括缺氧-缺血(H-I)H-I(有或没有缺氧/低血糖症的缺血)损伤在内的病理情形和中风样情形(例如大脑、肾、心脏衰竭)的治疗特别有用。
它们对于包括大脑缺氧-缺血(H-I)(有或无缺氧/低血糖症的缺血)损伤在内的病理情形和中风样情形(例如，大脑、肾、心脏衰竭)的治疗也引起了很大的兴趣。
本发明的药物组合物对于神经元死亡特别是总体或病灶H-I(有或无缺氧/低血糖症的缺血)损伤和中风样情形(例如，大脑、肾、心脏衰竭)的治疗也是有用的。
它们对于神经元的死亡特别是成人或新生儿H-I(有或无缺氧/低血糖症的缺血)损伤和中风样情形(例如大脑、肾、心脏衰竭)的治疗也是特别便利的。
它们对于神经元死亡特别是成人或新生儿H-I(有或无缺氧/低血糖症的缺血)损伤和中风样情形(例如大脑、肾、心脏衰竭)的治疗也是有用的。
它们也能用于特别是暂时或永久H-I(有或无缺氧/低血糖症的缺血)损伤和中风样情形(例如大脑、肾、心脏衰竭)中神经元死亡的治疗。
所述药物组合物对于神经元死亡特别是H-I(有或无缺氧/低血糖症的缺血)损伤和有或无再灌注情形的中风样情形脑损伤(例如大脑、肾、心脏衰竭)的治疗也是有用的。
它们能用于特别是中脑动脉阻塞(MCAO)中的神经元死亡的治疗。
上面定义的药物组合物对于神经元死亡的治疗，特别是至少一个或多个下面的病理事件联合的时候引起了很大的兴趣：总体或病灶，暂时或永久，(有或无缺氧/低血糖症的缺血)(在大脑水平或在全身水平)有或无再灌注的成人或新生儿H-I。
本发明的药物组合物的其它的应用包含它们的用途：
-阻止和/或治疗慢性退行性疾病过程中的凋亡，例如神经退行性疾病，包括阿尔兹海默氏疾病、享延顿氏疾病、帕金森氏疾病、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化、脊髓延髓萎缩、朊病毒病，或者
-阻止和/或治疗脊髓损伤过程中的凋亡，或者阻止和/或治疗外伤脑损伤造成的凋亡，或者
-提供神经保护作用，或者
-提供脑保护作用，或者
-阻止和/或治疗与自身免疫疾病和移植排斥相连的细胞毒性T细胞和天然杀伤细胞介导的凋亡，或者
-阻止心脏细胞的细胞死亡，包括心脏衰竭、心肌病、心脏病毒性感染或细菌性感染、心肌缺血、心肌梗塞和心肌缺血、冠状动脉旁路嫁接，或者
-阻止和/或治疗例如作为化学治疗或HIV治疗结果的线粒体药物毒性，
-阻止病毒性感染或细菌性感染过程中的细胞死亡，或者
-阻止和/或治疗炎症或炎性疾病、炎性肠道疾病、脓毒症和脓毒性休克，或者
-阻止从滤泡到卵母细胞期、从卵母细胞到成熟卵期和精子的细胞死亡(例如，冷冻和移植卵巢组织的方法、人工授精)，或者
-保存化疗后女性和男性的生育能力，或者
-保存雌性和雄性动物的生育能力，或者阻止和/或治疗斑点变性和青光眼，或者阻止和/或治疗急性肝炎、慢性活动型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎，或者
-阻止脱发和所述的由于男性模式秃头、放射、化学治疗或情绪应激的脱发，或者
-治疗或缓解皮肤损害(由于暴露于高水平的放射、热、烧伤、化学物质、太阳和自身免疫疾病)，或者
-阻止髓性发育不良综合症(MDS)中骨髓细胞的细胞死亡，或者
-治疗胰腺炎，或者
-治疗呼吸综合症，或者
-治疗骨关节炎、风湿性关节炎、牛皮癣、肾小球肾炎、动脉粥样硬化和移植物抗宿主疾病，或者
-治疗视网膜周边细胞(pericyte)凋亡、视网膜神经元凋亡青光眼、缺血造成的视网膜损伤、糖尿病性视网膜病变，或者
-治疗与凋亡增加相连的疾病状态，或者
-阻止植物中的细胞死亡(例如：植物、花朵、藻菌植物(蘑菇、海藻)…)。
根据另一方面，本发明涉及阻断或阻止体外细胞死亡的方法，包括筛选与细胞死亡特别是凋亡相关的治疗性分子。
参考图示在下面的数据中给出了本发明其它的特点和优点，代表了：
图1.荧光显微境和流式细胞仪对血清剥夺的原代神经元的凋亡过程中对浆膜通透(PMP)的联合检测。
(A)进行或没进行(Co)24小时血清剥夺(SD)的培养的皮质神经元的相差和荧光显微照片。细胞用细胞通透的荧光DNA配体Hoeschst 33342(Ho.342，蓝色荧光)和细胞非通透的荧光DNA交联7-氨基-放线菌素D(7-AAD；红色荧光)染色。显示了代表显性表型的原代皮质神经元(＞60％的细胞经受了SD)。在SD-神经元中，紫色荧光(红和蓝的混合)指出了7-AAD和Hoechst 33342在凝聚细胞核中的共存在(合并中的紫色荧光)，如此使PMP与核凋亡相关。(B)Triton对培养的神经元PMP和染色体状态的作用。培养的神经元用7-AAD、Hoechst 33342和非毒性CellTrackerTM绿荧光染料染色。神经元的代表性显微图片显示在没有0.02％Triton(Co.)或用其处理5分钟后的相差与单独Hoechst 333342和7-AAD(上图)或CellTrackerTM绿(下图)的合并。(C)神经元的胰蛋白酶消化后PMP的缺乏。用7-AAD、Hoechst 33342和CellTrackerTM绿染色的培养的神经元经受了基于胰蛋白酶试验方案的小心脱离(如“材料和方法”中描述地)。显示了如(B)中分析的胰蛋白酶消化的神经元代表性显微照片，以及在胰蛋白酶消化后0、1、3和4小时神经元相关的CellTrackerTM绿荧光的FC定量分析。(D)SD后对神经元PMP和核凝聚的FM分析。经受了24小时SD的培养神经元的代表性显微照片显示了相差与Hoechst33342和7-AAD的合并。指出了PMP阳性神经元(具有紫色细胞核)的百分比。(E)PMP的FC分析。如(D)中分析的神经元样品随后进行胰蛋白酶消化并且立即进行PMP的FC定量分析。显示了代表性点状图(FSC/FL3)。指出了FC计算的PMP阳性神经元的百分比。插图显示了胰蛋白酶消化的皮质神经元的代表性相差显微照片。(F)使用FM(胰蛋白酶消化前光学计数)和FC(胰蛋白酶消化后自动计数)对PMP的比较性定量分析(n＝30)。(G)基于FM和FC的PMP定量分析之间线性相关性。
图2：神经元凋亡过程中PMP、PS暴露和核修饰的联合检测。(A)经受了24小时SD的培养皮质神经元的荧光显微照片。细胞用7-AAD(红色荧光)和FITC结合的膜联蛋白(annexin)V(绿色荧光)染色。原代皮质神经元分成三个主要的凋亡亚群：早期凋亡(膜联蛋白V+，7-AAD-，亚群1)、晚期凋亡(膜联蛋白V+，7-AAD+，亚群2)和末期凋亡(膜联蛋白V-，7-AAD+，亚群3)。(B)PMP和PS暴露的FC检测。神经元亚群1、2和3的代表性点状图分析。活的神经元未展现PS转位(MFI膜联蛋白V＝81.4+/-17.9)并且对7-AAD不通透(双阴性神经元，亚群L)。(C)整个SD过程中出现的凋亡亚群的FC动力学(n＝4；+/-标准误差)。(D)凋亡亚群中基于FM的核周长的测定联合基于FC的神经元大小(FSC)的分析。经受了24小时SD的培养皮质神经元用Hoechst 33342、7-AAD和FITC结合的膜联蛋白V染色。FM观察过程中获取多个视野，然后使用前部散射(FSC)参数对样品进行细胞大小的FC分析。在每个亚群的基础上呈现了核周长(n＝15；+/-标准误差)和FSC(n＝7；+/-标准误差)的共评价。(E)活的(L亚群)和死亡的(1、2、3亚群)神经元的FSC、SSC和核特色的详细分析。星号表示与前面的亚群相比非常显著的的作用(p＜0.0001)，§表示显著的作用(p＜0.05)。
图3：激活的半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-3、PS暴露和PMP的检测和分子排序
(A)经受了24小时SD的培养皮质神经元的荧光显微照片。细胞用FAM-DEVD-fmk(FLICA；绿色荧光)、7-AAD(红色荧光)和Hoechst(蓝色荧光)染色。检测了四个截然不同的表型：活的(半胱天冬酶-3-，7-AAD-，L亚群)、早期凋亡(半胱天冬酶-3+、7-AAD-，1亚群)、晚期凋亡(半胱天冬酶-3+、7-AAD+，2亚群)和末期凋亡神经元(半胱天冬酶-3-、7-AAD+，3亚群)。(B)PMP和半胱天冬酶-3样活性的FC共检测。神经元L(蓝色)、1(绿色)、2(黄色)和3(红色)亚群的代表性FC点状图分析。(C)全半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPH存在下的神经保护。制备培养皮质神经元的荧光显微照片并标记为“A”。(D)凋亡调节性化合物对半胱天冬酶-3激活和PMP的作用。神经元用丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc、ANT阻断剂BA或所示半胱天冬酶抑制剂(z-DEVD-fmk、z-VAD-fmk、Q-VD-OPH)处理，并进行24小时的血清剥夺。细胞用7-AAD(红色荧光)染色并进行激活的半胱天冬酶-3的免疫染色，然后进行FC分析。结果是三个独立实验的平均值(±标准误差)。(E和F)血清剥夺整个过程中半胱天冬酶-3活性和PS暴露的FM和FC的动力学分析。细胞用罗丹明结合的FLICA(红色荧光)、FITC结合的膜联蛋白V(绿色荧光)和Hoechst(蓝色荧光)染色。(E)中呈现的荧光显微照片相应于点状图(F)中指出的“a”至“d”亚群。(G)在无(SD)或有(+LEHD)半胱天冬酶-9抑制剂z-LEHD-fmk存在下经受了24小时血清撤除的培养皮质神经元的荧光显微照片。细胞用Hoechst(蓝色荧光)染色和在图1中用FAM-LEHD-fmk(FLICA；绿色荧光)共染色或在图2中用FITC结合的膜联蛋白V(绿色荧光)共染色。(H)ANT样检查点、半胱天冬酶-9样活性和PMP之间的分级。神经元用ANT样阻断剂BA或z-LEHD-fmk处理并经受24小时的SD。细胞用7-AAD(红色荧光)染色，用FAM-LEHD-fmk共染色，然后进行FM分析。结果是三次独立实验的平均值(±标准误差)。
图4：神经元中Δψm和PMP的联合检测。
(A)在无或有(24小时对照；Co)血清存在下培养了所指时期的原代神经元的荧光显微照片。细胞用Hoechst 33342(蓝色荧光)和Δψm敏感染料JC-1(高Δψm的线粒体橙色荧光，低Δψm的线粒体绿色荧光)染色。显示了代表主要表型的神经元(＞50％)。Dec，判断相；Eff，效应相；Deg，降解相。(B)Δψm和PMP的FC点状图分析。SD神经元用7-AAD和JC-1染色，胰蛋白酶消化并立即进行FC分析。FL2(JC-1)/FL3(7-AAD)点状图揭示了两个低Δψm神经元亚群：II′亚群对7-AAD不通透，II″，7-AAD阳性。(C)经由Δψm(JC-1)和浆膜通透性(7-AAD)共检测的I、II′、II″亚群的FM显现。(D)血清剥夺神经元中II′和II″亚群的FC实时监测。(E)通过FC评价的BA而不是z-DEVD-fmk的神经保护。
直方图指出在无或有BA或z-DEVD-fmk的存在下24小时SD后低Δψm神经元的百分比(II′+II″亚群，蓝色直方图)，或者7-AAD阳性神经元的百分比(II″亚群，黑色直方图)。结果是3个独立实验的平均值(平均值+/-标准误差)。
图5：原代皮质神经元中Δψm变异的实时检测。
(A)FM重复照射诱导的JC-1的光学淬灭。1、3、5、10和15次照射(1.2秒；5瓦)后JC-1染色的神经元的荧光显微照片。两次照射之间的间隔是1分钟。注意橙色荧光渐进性的消失。(B)照射区域上评估的JC-1橙色荧光强度的对数回归。(C)使用JC-1和7-AAD探针对Δψm和PMP实时FC监测的试验方案。插入的荧光显微照片显示胰蛋白酶消化后用hoechst、JC-1和7-AAD共染色的原代神经元的代表性呈现。注意在这些实验条件中没有检测到PMP，没有检测到Δψm的丢失(轴突和细胞体)，或核凝聚。(D)应用到原代神经元。(D1)不用(Co.)或用mCICCP(100μM；30分钟)处理的神经元的荧光显微照片。(D2)JC-1橙色和JC-1绿色荧光的实时FC监测。白线相应于神经元的平均荧光。(D3)相同样品(对照，点状线，以及CICCP处理的，平线)中得到的线粒体去极化(JC-1橙色)、PMP(7-AAD)和大小(FSC)/颗粒度(SSC)变异的时程。
图6：不同神经毒性分子对Δψm改变和PMP诱导的实时FC分析。
(A-1)Δψm和浆膜状态的定时FM。神经元用0.6mM SNP或1mM MPTP或20mM乙醇(etOH)(或不用；Co.)处理45分钟。细胞用JC-1(高Δψm的线粒体橙色荧光，低Δψm的线粒体绿色荧光)、Hoechst(蓝色荧光)和7-AAD(红色荧光)染色。(A-2)用培养基单独(Co.)、0.6mMSNP、1mM MPTP或20mM etOH处理15分钟的整个过程中Δψm(JC-1橙色荧光)的实时FC分析。橙色事件相应于高Δψm神经元，绿色事件相应于低Δψm神经元。(A-3)PMP(7-AAD荧光)的实时FC分析。(B)实时FC的定量分析。(B-1)MPTP处理的神经元FSC/SSC比例的分析。红线相应于高Δψm神经元上FSC/SSC比例的平均值，点状绿线相应于低Δψm神经元上FSC/SSC比例的平均值(如A-2中定义)。平黑线相应于整个神经元群的FSC/SSC比例的平均值。(B-2)MPTP处理的神经元中JC-1橙色平均荧光强度(MFI)的分析。平红线和点状绿线分别相应于高和低Δψm神经元之中JC-1橙色MFI。平黑线相应于整个神经元群的JC-1橙色MFI。(B-3)etOH处理的神经元中7-AAD平均荧光强度(MFI)的分析。
图7：SD诱导的神经元死亡过程中凋亡相关事件的分级。
指出了凋亡的主要相和它们相应的亚细胞事件。呈现了细胞死亡过程中神经元行为的艺术图。用蓝色的核(Hoechst标记)和红色的线粒体(JC-1标记；高Δψm)画出活的神经元。判断相中也出现了绿色线粒体(JC-1标记；低Δψm)。效应相与核皱缩和弥漫的半胱天冬酶-3激活(弥漫的粉色的细胞质)相连。降解相与轴突断裂、PS暴露(绿色浆膜)和不连续的细胞质激活的半胱天冬酶-3相连。降解的末期与导致核7-AAD掺入(红色皱缩核)的终末浆膜通透(PMP)相连。Bax的切割和转位似乎是线粒体的上游但是是半胱天冬酶-2活性的下游。指出了特异性抑制剂影响的重要性。
图8：泛半胱天冬酶抑制促进了血清剥夺诱导发生死亡的原代皮质神经元的存活
(A)整个48小时皮质神经元培养物(DIV6)血清剥夺(SD)过程中凋亡特性的时间反应。通过对(如前面Lecoeur等，2004中描述地)分别用JC-1、Heochst 33342、7-放线菌素D(7-AAD)或FITC结合的膜联蛋白V标记的神经元的荧光显微镜和细胞仪分析测定有低Δψm(n＝30)、核凋亡(NA)(n＝30)、浆膜通透(PMP)(n＝30)或者磷脂酰丝氨酸残基(PS)的外叶暴露(n＝30)的神经元出现的动力学。注意24小时后PS阳性神经元渐进性减少，因此指出低ΔψXm/NA+/7-AAD+/FITC-膜联蛋白V+亚群向末端低Δψm/NA+/7-AAD+/FITC-膜联蛋白V-亚群的转移(Lecoeur等，2004)。(B)不同的泛半胱天冬酶抑制剂神经保护的比较分析。神经元经受了SD同时也用广谱半胱天冬酶、Q-VD-OPH、Z-VAD-FMK(ZVAD)或BOC-D-FMK(BOC-D)(都在100μM)处理。直方图指出了保留在对照(Co.)水平附近的有低Δψm(n＝12)、NA(n＝12)、PS暴露(n-7)和PMP(n＝12)的神经元百分比。(C)24小时SD后Q-VD-OPH高度保存了核形态和轴突完整性。对照(Co.)、SD和Q-VD-OPH处理(100μM)的神经元的代表性视野：上图，相差显微照片；下图，相差和蓝色细胞核Hoechst荧光合并。注意在全半胱天冬酶抑制剂的存在下都没有显著的轴突分裂和核凝聚/片段化。(D)在24小时SD过程中至少激活四个半胱天冬酶。分别使用FLICA、FAM-VDVAD-FMK、FAM-LETD-FMK和FAM-LEHD-FMK检测半胱天冬酶-2(n＝14)、半胱天冬酶-8(n＝3)、半胱天冬酶-9(n＝8)的激活。用藻红蛋白结合的抗切割的半胱天冬酶-3多克隆抗体(n＝5)或FAM-DEVD-FMK(n＝12)检测半胱天冬酶-3的激活，这两个方法相关性很好。注意SD过程中低水平的半胱天冬酶-8激活。用100μMQ-VD-OPH使所有这些半胱天冬酶完全失活。(E)广谱半胱天冬酶抑制剂不能显著地阻止皮质神经元免受β-淀粉蛋白(25-35)(βA)、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)、3-硝基丙酸(3-NPA)、硝普纳(SNP)或离子霉素(Iono.)诱导的NA和PMP。在无或有100μMZ-VAD-FMK(ZVAD)或Q-VD-OPH(QVDOPH)存在下用离子霉素(6μM)或βA25-35(60μM)处理皮质神经元24小时；用MPTP(2mM)、3-NPA(100μM)或SNP(500μM)处理48小时。计数展现如(A)中NA和PMP的神经元。进行非配对Student t检验。
图9：线粒体前半胱天冬酶-2样活性是血清剥夺诱导皮质神经元凋亡性细胞死亡必需的
(A)半胱天冬酶-2样活性是SD诱导的细胞死亡过程中最早检测到的事件。半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-2的特异性抑制剂在SD的起始时加入，分别是在100μM的Z-DEVD-FMK(DEVD)(n＝8)、Z-LEHD-FMK(LEHD)(n＝6)、Z-LETD-FMK(LETD)(n-4)、Z-VDVAD-FMK(VDVAD)(n＝10)。Δψm的降低、NA、PS的暴露和PMP分别在24小时JC-1、Hoechst 33342、7-AAD和FITC结合的膜联蛋白V染色后测定。与DEVD和LETD相反VDVAD取消了这些凋亡标志。虽然阻止PS暴露、NA和PMP，LEHD不阻碍Δψm的降低。星号指的是如图2B中描述的LEHD处理的神经元中特定的细胞核表型。结果表示为抑制作用的％。(B)用特异性半胱天冬酶抑制剂处理的神经元核的代表性荧光显微照片。与DEVD和LETD相反，Hoechst 33342染色VDVAD处理的核展现了与对照相似的形态。LEHD处理的神经元核体积减小，相应于I期的凝聚(根据Susin的分类；Susin等，1999)。(C)SD神经元中半胱天冬酶-2样激活发生在Δψm降低之前。在用FAM-VDVAD-FMK(绿色)和Δψm敏感的染料CMXRos(红色)共染色后用荧光显微镜评价半胱天冬酶-2激活和Δψm改变的动力学。在进行性Δψm降低(8.5个小时)之前检测到半胱天冬酶-2样活性(2个小时)。mC1CCP(100μM，45分钟)用作完全线粒体膜去极化的阳性对照。(D)半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-9之间分级的评价。在SD开始时加入每个指出的半胱天冬酶抑制剂(100μM)和丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc(100μM)，使用特异性FLICAs24小时后检测半胱天冬酶样活性。直方图代表了半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-9抑制的％(n＝4)。
图10：QVDOPH或VDVAD诱导的神经保护最佳模式的测定。
神经元细胞死亡相应于在报告没有抑制剂的SD培养物中，有半胱天冬酶抑制剂的存在下24小时SD后，同时显示了低Δψm(JC-1绿)、NA表型(Hoechast 33342)和PMP(7-AAD红色荧光的掺入)的神经元。左图显示了在SD起始时加入的每个抑制剂的剂量-反应，证明100μM是最佳存活必需的。另外，当SD开始后2、4或6小时加入时(右图)，100μM VDVAD或QVDOPH的保护作用(在t＝24小时)进行性地降低。通过荧光显微镜对神经元进行计数(n＝3)。
图11：血清剥夺诱导的半胱天冬酶-2介导的凋亡的基因学证据：RNA干扰方法对半胱天冬酶-2的压制
(A)小干扰RNA对鼠半胱天冬酶-2的基因沉默。在N5培养基中进一步孵育之前如实验部分描述地用siRNA转染DIV6的神经元6小时。上图：RT-PCR分析测定转染后24小时内源性半胱天冬酶-2基因的表达。注意siRNA C2wt降低半胱天冬酶-2的表达而对其它基因没有任何副作用(半胱天冬酶-9，GADPH)；下图：western blotting评估siRNA C2wt对对照神经元中前半胱天冬酶-2的压制。siRNA C2m是基因沉默的阴性对照。GADPH用作相等上样的对照。(B)通过免疫染色对半胱天冬酶-2压制的细胞内监测。用siRNA C2wt转染后24小时荧光强度降低70％。使用Leica Q荧光软件的Probemeter选择在FM下(5个视野相应于每个条件每个试验(experience)150个随机选择的细胞)追踪荧光消退。注意压制发生在所有的神经元。(C)SD-神经元中RNA干扰之后取消了半胱天冬酶-2活性和细胞死亡的参数。在DIV6转染了siRNA 6个小时的神经元在进一步24小时无血清培养基中适应之前在富含血清培养基中重新培养。代表性荧光显微照片：核凝聚/片段化(Hoechst；蓝色)、半胱天冬酶-2活性(FAM-VDVAD-FMK，绿色；1亚群)和PMP(7-AAD；红色，3亚群)；2亚群指的是半胱天冬酶-2和7-AAD阳性神经元。不像siRNA C 2m，siRNA C2 wt阻止了半胱天冬酶-2的激活(n＝5)。(D)半胱天冬酶-2活性对于SD诱导的但不是离子霉素诱导的神经元细胞死亡是关键的。RNA干扰阻止SD细胞死亡的其它标记。在无或有指出的抑制剂(100μM)或siRNAs(n＝5)存在下细胞死亡参数的定量分析。如(C)中RNA干扰处理神经元。通过JC-1、Hoechst 33342、7-AAD和FITC结合的膜联蛋白V染色分别测定Δψm的降低、NA、PS暴露和PMP。用6μM Ca2+离子载体处理24小时诱导的细胞死亡途径是不依赖于半胱天冬酶-2的：注意VDVAD或siRNA C2wt(n＝3)没有保护。(E)立体照片描述了与离子霉素处理(6μM，24小时)相反，siRNA C2wt对SD后PMP(7-AAD掺入)、核(Hoechst 33342；蓝色)和轴突形态；粉红荧光来源于Hoechst和7-AAD的合并。荧光与相差图像合并。
图12.半胱天冬酶-2是24小时血清剥夺神经元中线粒体后细胞色素C释放和线粒体前Bax转位必需的。
(A)VDVAD和siRNA C2 wt降低了线粒体后细胞色素C的释放。左图：相应于选择性半胱天冬酶抑制剂(100μM)作用的荧光显微照片。在24小时血清撤除过程中用或不用抑制剂处理的神经元用Hoechst33342(蓝色)和识别细胞色素C的单克隆抗体(6H2.B4)(红色)染色。SD引发了从线粒体(点状染色)释放的细胞浆细胞色素C(弥散染色)。右图：通过FM对细胞色素C释放相应的定量分析(n＝4)。对于siRNAs试验，DIV6的神经元用siRNAs转染了6个小时，然后在进一步24小时SD之前培养在N5培养基中。注意Pefabloc(100μM)、半胱天冬酶-9抑制剂LEHD和半胱天冬酶-3抑制剂DEVD没有阻碍细胞色素C的释放。
(B)RNA干扰取消了半胱天冬酶-2的激活并阻止了下游半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3之细胞色素C释放依赖性激活。如A中或用100μMQVDOPH或VDVAD处理神经元，并用FAM-VDVAD-FMK、FAM-DEVD-FMK和FAM-LEHD-FMK染色(n＝4)。注意皮质神经元中离子霉素(6μM)24小时诱导的细胞死亡途径不依赖于半胱天冬酶-2的激活(没有测试其它半胱天冬酶的活性)。(C)siRNA C2 wt对细胞内半胱天冬酶-3失活的代表性显微照片：上图，合并了蓝色核Hoechst荧光和半胱天冬酶-3(胞浆)绿色荧光；下图：得自PMP的红色7-AAD核荧光和胞浆半胱天冬酶-3绿色荧光合并。SiRNA C2 wt完全取消了半胱天冬酶-3的激活、NA和PMP。(D)VDVAD和siRNA C2 wt降低了线粒体前Bax的转位。选择性半胱天冬酶抑制剂(100μM)和siRNAs的作用的荧光显微照片(左图)和相应的定量分析(右图)。在FM下评分(10个视野相应于每个条件每个实验150-300个随机选择的细胞)之前在24小时血清撤除时未处理的神经元和如A中抑制剂或siRNAs处理的神经元用Hoechst 33342(蓝色)和识别Bax的多克隆Δ21抗体(绿色)(n＝4)。VDVAD、QVDOPH和siRNA C2wt阻止了Bax从胞浆(弥散染色)转位到线粒体(点状染色)。注意Pefabloc、LEHD和DEVD不能阻碍Bax的转位。
图13.与速尿灵(furosemide)比VDVAD对Bax转位和半胱天冬酶-2活性的保护作用的定位
(A)半胱天冬酶-2活性是Bax转位的上游。在24小时SD起始时神经元与2mM速尿灵(Furo.)或100μM VDVAD孵育。神经元用Hoechst33342(蓝色)标记并用Δ21抗体免疫染色Bax(上图；绿色)或者用FAM-VDVAD-FMK标记(下图；绿色)。代表性荧光显微照片显示速尿灵部分阻止了SD时线粒体Bax的转位而没有阻碍半胱天冬酶-2活性。相反，VDVAD阻断了半胱天冬酶-2的激活和Bax的转位。(B)FM对如(A)中处理之后展现了Bax转位或半胱天冬酶-2活性的神经元的定量分析。Pefabolic是阴性对照。(C)速尿灵对Bax转位的抑制导致了Δψm降低、NA、PMP和细胞色素C释放的阻碍。在24小时SD起始时用2mM速尿灵或100μM VDVAD处理的神经元用JC-1、Hoechst 33342、7-AAD和识别细胞色素C的单克隆抗体(6H2.B4)标记。细胞用FM评分(n＝3-8)。
图14.SD过程中Bax α切割依赖于胞浆半胱天冬酶-2和不依赖钙蛋白酶
(A)RT-PCR分析24小时SD神经元中半胱天冬酶-2mRNA，揭示了没有RNA水平改变。GADPH的表达用作上样对照。(B)半胱天冬酶-2介导的Bax切割的特征分析。神经元经受SD 2、5、8、15和24小时，使用抗缺失了羧基末端21个氨基酸的小鼠Bax α兔多克隆抗体(Δ21)通过Western印迹分析Bax切割的时程。天然p22 Bax是早期的，进行性地切割为p18 Bax。(C)SD过程中Bax切割成18kDa形式发生在N-末端。右图：使用抗缺失了羧基末端21个氨基酸的小鼠Baxα的兔多克隆抗体(Δ21)和抗定位(mapping)在Baxα的氨基末端的肽的兔多克隆抗体(N20)对相同样品(对照和SD神经元)Western印迹分析的比较。两个抗体识别天然Bax而Δ21只检测切割的Bax。(D)在100μM VDVAD或siRNA C2 wt(3.8μg)存在下对24小时SD Bax切割的蛋白酶抑制剂谱的特征分析。VDVAD和siRNA C2 wt阻止了Bax的切割。Bax切割依赖于半胱天冬酶-2的存在和半胱天冬酶-2的活性。使用Δ21抗体进行Western印迹。(E)血清剥夺诱导了切割的p18 Bax的Bax转位到线粒体，提示p18 Bax是促进进一步线粒体改变的活性形式。分离SD神经元的线粒体部分和细胞质，使用Δ21抗Bax抗体通过Western印迹检测Bax的转位。小鼠抗HSP60抗体用于检查线粒体部分。p22 Bax存在于24小时SD神经元的细胞质中。然而，在24小时SD时Bax被部分切割成p18形式，该形式从胞浆离位到线粒体膜。(F)皮质神经元中半胱天冬酶-2介导的Bax切割是刺激物特异性的。使用Δ21抗体的免疫印记分析之前在有或无VDVAD(100μM)存在下用十字孢碱(STS，10μM)或离子霉素处理神经元8、15或24小时。STS和离子霉素在皮质神经元中诱导半胱天冬酶-2非依赖性的Bax切割。(G)Bax的切割不是由钙蛋白酶介导的。如B检查了特异性(对于钙蛋白酶I 25μM ALLN；对于钙蛋白酶II 25μMALLM)和广谱(25-50μM E64d)钙蛋白酶抑制剂阻断24小时SD诱导Bax切割的能力。与100μM QVDOPH相反，这些抑制剂不能阻止Bax切割。使用Δ21抗体进行Western印迹。(H)蛋白酶活性的抑制对p18Bax的稳定化。在无或有蛋白酶抑制剂：Lactacystin 1-10μM(Lact.)和Epoxomycin 10μM(Epox.)存在下将神经元培养在无血清培养基中24小时。使用Δ21抗体进行Western印迹。(I-J)24小时SD神经元中半胱天冬酶-2的状态：通过RT-PCR(I)和使用大鼠单克隆抗小鼠半胱天冬酶-2抗体(11B4)的Western印迹(J)的分析。在SD起始时加入VDVAD(100μM)。SD过程中前半胱天冬酶-2蛋白质的含量降低而没有改变半胱天冬酶-2mRNA水平。GADPH用作等量上样的对照。前半胱天冬酶-2蛋白质没有上或下调，但是前半胱天冬酶-2以VDVADase依赖性的方式切割为p14形式。(K)SD过程中不典型的半胱天冬酶-2定位：SD过程中半胱天冬酶-2弥散于小鼠原代皮质神经元的胞浆内。在DIV6的神经元在用大鼠单克隆抗小鼠半胱天冬酶-2抗体(10C6；红色)染色之前在无血清培养基中培养8、16和24小时。细胞核用1μM Hoechst 33342(蓝色)反染色。(L)损伤过程中半胱天冬酶-2的胞浆分布是刺激剂依赖性的。如(J)中染色之前用细胞毒性浓度的Ca2+离子载体离子霉素(6μM)、激酶抑制剂十字孢碱(STS，10μM)、拓扑异构酶I抑制剂喜树碱(CPT，10μM)处理神经元或神经元培养在无血清培养基中24小时。不像SD，在用离子霉素和STS处理过程中发生了半胱天冬酶-2的完全核转位。对于CPT核转位是部分的。
图15.Q-VDVAD-OPH对半胱天冬酶-2特异性的抑制比Q-VD-OPH的全半胱天冬酶抑制提供了抗新生儿缺血脑损伤更好的神经保护。(A)体外重组半胱天冬酶-2对VDVAD-AMC的切割。与选择性或泛半胱天冬酶抑制剂(2μM)孵育之前在37℃30分钟后测定重组人半胱天冬酶-2(125U)对50μM VDVAD-AMC的切割(n≥2)。原型化合物Q-VDVAD-OPH象特异性半胱天冬酶-2抑制剂(Ac-VDVAD-Cho，Z-VDVAD-FMK)的Q-VD-OPH一样有效地阻断了半胱天冬酶-2的切割活性。虽然Z-VAD-FAMK的切割抑制不太重要，BOC-D-FMK完全没有抗半胱天冬酶-2的活性。半胱天冬酶-3样抑制剂(Z-DEVD-FMK)并不高度干扰半胱天冬酶-2活性。钙蛋白酶抑制剂E64d用作阴性对照。(B)Q-VDVAD-OPH促进了SD皮质神经元培养物的存活。SD起始时给予DIV6的神经元Q-VDVAD-OPH 24小时。用FLICA、JC-1、Hoechst 33342和7-AAD染色分别测定半胱天冬酶-2活性、Δψm丢失、NA和PMP(n＝2)。(C-E)半胱天冬酶-2抑制提供了抗新生鼠体内缺血脑损伤的脑保护：缺血48小时后测定的Q-VD-OPH和Q-VDVAD-OPH对梗死体积的作用。缺血开始前5分钟给予药物，药物由抑制剂的单次腹腔内注射(10％DMSO中100μg/10g，分别是n＝16和12)组成。也研究了对照缺血大鼠(n＝15)。(C)从缺血对照和Q-VDVAD-OPH处理的动物获得背侧海马(21盘)和前连合(12盘)水平的代表性冠状缝切片并用结晶紫染色。注意治疗大鼠(有2％梗死体积的动物)有显著降低的梗死。箭头指出了分别在相同的缺血或Q-VDVAD治疗的动物中梗死的存在和缺失。横条代表了130μm。(D)不同组的平均梗死体积。数据是平均值±SEM。Q-VD-OPH和Q-VD-VAD-OPH分别诱导了44和74％的降低(***＝p＜0.001，Kruskall-Wallis检验)。(E)Q-VDVAD-OPH和Q-VD-OPH治疗提供了展现高/总或低保护水平的两个动物组。对单个梗死体积的数据作图。粗和细水平条分别代表了组的中位数和平均数。注意4和8个动物分别在Q-VD-OPH和Q-VDVAD-OPH治疗后没有展现梗死。
图16.体外人重组半胱天冬酶-2对VDVAD-AMC的切割。
与选择性或泛半胱天冬酶抑制剂(2μM)孵育之前在37℃30分钟后测定重组人半胱天冬酶-2(125U)对50μM VDVAD-AMC的切割(n≥2)。原型化合物Q-VDVAD-OPH象特异性半胱天冬酶-2抑制剂(Ac-VDVAD-Cho、Z-VDVAD-FMK)和泛半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPH一样有效地阻断了半胱天冬酶-2的切割活性。虽然Z-VAD-FAMK的切割抑制不太重要，BOC-D-FMK完全没有抗半胱天冬酶-2的活性。其它半胱天冬酶-3(Z-DEVD-FMK)、半胱天冬酶-9(Z-LEHD-FMK)和半胱天冬酶-8(Z-LETD-FMK)的特异性抑制剂并不高度干扰半胱天冬酶-2活性。抑制钙蛋白酶的E64d、ALLN、ALLM用作阴性对照。
图17.线粒体前半胱天冬酶-2依赖性途径的假设模型。
我们描述了一个新的内源性途径，其中半胱天冬酶-2的线粒体前激活是促进皮质神经元凋亡必需的。血清撤除能够引发凋亡途径，其中半胱天冬酶-2的激活可以介导Bcl-2家族的前凋亡成员Bax的上游对照。Bax转位并整合进外线粒体膜以诱导Δψm降低和以半胱天冬酶-2依赖性方式促进细胞色素C释放。所以半胱天冬酶-2的失活也取消了下游事件，比如半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3的细胞色素C释放依赖性的激活、核形态改变、磷脂酰丝氨酸暴露和浆膜的终末通透。整个长期血清剥夺过程中活性半胱天冬酶-2专一的胞浆定位指出了特别激活机制的证据。
图18.DNA损伤诱导的细胞死亡过程中有半胱天冬酶-2参与并且在Δψm丢失和PMP之前。
在无或有半胱天冬酶抑制剂存在下VP16的剂量-反应：A和B显示了特异性半胱天冬酶-2抑制剂对半胱天冬酶-2样抑制的保护作用(VDVAD＝Z-VDVAD-FMK)。也调查了泛半胱天冬酶抑制剂(OPH＝Q-VD-OPH)的作用。(A)n＝3，JC-1/7AAD染色；(B)n＝1，DiOC6/PI。
图19.半胱天冬酶-2激活在Δψm丢失和其后半胱天冬酶的激活之前。
(A)左图显示了VP16处理的Jurkat细胞(10μM，7小时)中Δψm丢失(JC-1)和核改变(Hoechst)的特征性凋亡特性。右图显示了全半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPH或特异性半胱天冬酶-2样(VDVAD＝Z-VDVAD-FMK)、半胱天冬酶-3样(DEVD＝Z-DEVD-FMK)、半胱天冬酶-9样(LEHD＝Z-LEHD-FMK)、半胱天冬酶-8样(LETD＝Z-LETD-FMK)抑制剂分别对Δψm丢失(JC-1)、半胱天冬酶-2和半胱天冬酶-3激活(FLICAs)、PMP和核改变的作用。所有抑制剂在50μM进行测试。(B)流式细胞仪对这些抑制剂对Δψm丢失(JC-1)和PMP(7AAD)的作用(8小时)的定量分析。环己酰亚胺；BA＝米酵菌酸；DIDS＝4，4′-二异硫氰酸二苯乙烯-2，2′-二磺酸二钠盐；ActD＝放线菌素D。(n＝2-4)。
图20.特定siRNA对半胱天冬酶-2基因的压制。
(A)左和右图分别显示了hsiRNA C2wt能够降低HeLa和Jurkat细胞中前半胱天冬酶-2蛋白池(Western Blot分析；11B4克隆用于半胱天冬酶-2的检测)。(B)用siRNA-FITC的荧光检测(流式细胞仪，FL-1)检查细胞内转染的产量：几乎100％掺入siRNA(24小时)。
图21.特定siRNA对半胱天冬酶-2基因的压制导致了VP16处理的Jurket细胞的存活。
(A)(人)siRNA对VP16处理的Jurkat细胞(7-8个小时，10μM)的保护作用(n＝3)。流式细胞仪谱显示Z-VDVAD-FMK和siRNA C2wt拯救的细胞保存了形态(前散射)，这些细胞是活的(7-AAD排除)。Lipo＝lipectamine 2000单独。
图22.源于鼠C2 siRNA序列的sh插入体的序列和结构。(A)设计正和反寡核苷酸使它们之间互相退火。小写的序列代表了指向鼠C2 mRNA的siRNA有义和反义序列。BamH I和Xba I悬突分别加到5′和3′末端以提高pGE-1载体中的克隆。(B)退火shRNA的结构说明了shRNA插入体的不同功能区域。
图23.shRNA-6和shRNA-9构建体的转染后3T3细胞中半胱天冬酶-2的表达水平。空pGE-1作为对照(泳道pGE-1)或者含有shRNA插入体(克隆shRNA-6和shRNA-9，泳道shRNA6和shRNA9)的pGE-1载体转染后24或48个小时的3T3总提取物(每个泳道15μg)的Western印迹分析。也作了有lipofectamine单独的对照(泳道lipo)。NT泳道代表了未处理的细胞。
图24.源于人C2 siRNA序列的sh-插入体的序列和结构。(A)设计正向和反向寡核苷酸使它们之间互相退火。小写的序列代表了指向人C2 mRNA的siRNA的有义和反义序列。BamH I和Xba I悬突分别加到5′和3′末端以提高pGE-1载体中的克隆。(B)退火的shRNA的结构说明了shRNA插入体的不同功能区域。
缩写：7-AAD，7-氨基放线菌素D；4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟，AEBSF，Pefabloc；ANT，腺嘌呤核苷酸转位子；BA，米酵菌酸；mCICCP，羰基氰化物间氯苯腙；Δψm，线粒体跨膜电位；FACS，荧光激活的细胞分拣；FLICA，荧光标记的半胱天冬酶的抑制剂；FSC，前散射；FC，流式细胞仪；FM，荧光显微镜；JC-1，5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′-四乙基苯咪唑基碳花青碘；MFI，平均荧光强度；PMT，光子倍增管；SD，血清剥夺；SSC，侧散射；MPTP，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶；PS，磷脂酰丝氨酸；PTP，通透转换孔；喹啉-Val-Asp(OMe)-CH2-O-Ph，Q-VD-OPH；SNP，硝普钠；z-DEVD-fmk，N-苄氧羰基-Asp-Glu(Ome)-His-Asp(Ome)-氟甲基酮；z-VAD-fmk，N-苄氧羰基-Val-Ala-Asp(Ome)-氟甲基酮。
实施例1：鉴定检查点的方法；定时和实时细胞荧光测定法对神经元凋亡的多参数和动力分析
直到最近，主要通过两个类型的方法研究神经元细胞的凋亡和坏死：第一组(生化)技术一般通过线粒体琥珀酸脱氢酶活性(MTT试验)或乳酸脱氢酶活性的细胞外释放(LDH试验)的比色法评价评价了神经元死亡的后期事件(Johnson，1995)。这些常规单参数定量技术不给出关于细胞死亡机制的信息，不能与其它生化方法的检测联合。就在最近，发表了使用产荧光底物的免疫印记和半胱天冬酶激活对细胞色素C转位进行生化评价的一些适应神经元的细胞分级分离试验方案(Ethell和Green，2002)。这样最近的方法给出了神经元群半定量的信息但是排除了多参数和实时分析。第二组技术使用荧光显微镜(FM)读出以检测细胞器改变或凋亡相关蛋白质。大部分这些FM研究集中在后期核改变，包括染色体形态学的显现(Hoechst染色)和/或DNA片段化的生化检测(TUNEL试验)。一些最近神经元的FM研究中，报告了(固定细胞中)细胞色素C的免疫定位，但是和细胞生物学的其它领域相反，有限数量的神经元研究使用了线粒体改变和半胱天冬酶激活的原位检测。当应用于培养的原代神经元时，基于FM的分析是费时、费人工的，并且细胞体聚集体和重叠的轴突网络阻碍了定量分析。另外，敏感荧光探针的光子淬灭能够导致显著误导的解释，排除了早期死亡相关事件的实时追踪。因此，就我们所知，关键凋亡事件的细胞生物学特性在原代神经元中还未全部证明和排序。
流式细胞仪(FC)提供了很广范围的应用，已经成为细胞生物学和凋亡的主要工具。虽然大量应用于原代血细胞和癌症细胞系，这个技术在神经科学中仍然惊人地使用不足，一般限于固定细胞中DNA含量后期丢失的证明(Yan等，1999；Fall和Bennet，1999)。合适的流式细胞仪应用的缺乏可能得自下面的假设：神经元从它们的底物必需的脱离能够改变浆膜的完整性，破坏轴突和/或引发失巢凋亡，因而阻止对凋亡可靠的分析。为了克服这些(神经元)特异性的限制，我们使用了原代神经元非侵入性脱离的一个简单的胰蛋白酶消化方法，它保持了神经元的完整性并保留了很高比例的它们的轴突。然后，我们开发了将定量FC联合于详细的FM分析的一种方法，它实现了凋亡的判断、效应、早和晚期降解相的共检测。使用选择性荧光(重要的)探针，这个双读出允许在胰蛋白酶消化之前(通过FM)和之后(通过FC)检测线粒体跨膜电位(Δψm)状态、原位半胱天冬酶的激活、磷脂酰丝氨酸残基的表面暴露和浆膜完整性的丢失。
使用血清剥夺诱导小鼠原代皮质神经元死亡作为系统模型，证明了FC不仅与FM相协调，而且也是建立神经元凋亡事件时间顺序的快速、敏感和定量分析的技术。另外，FC分析的领域扩展到在线粒体活性化合物加入的数分钟内对早期神经元Δψm改变和浆膜通透(PMP)改革性的实时监测。定时和实时FC都允许克服FM的限制，将帮助证明和发展神经元凋亡的细胞生物学。
-活的和濒临死亡的原代神经元的细胞荧光检测分析
从胚胎14天小鼠分离的原代皮质神经元当培养在聚乙烯亚胺包被孔上，在含有葡萄糖、马血清和胎牛血清的专门培养基中时，能够维持存活超过10天(Kawamoto和Barrett，1986)。
这些实验条件中，染色体凝聚(Hoechst 33342；蓝色荧光)和使用细胞非通透性荧光DNA嵌入性7-氨基-放线菌素D(7-AAD；红色荧光)对浆膜完整性的荧光显微镜(FM)的评价指出：血清剥夺导致了培养的神经元进行性浆膜通透(PMP)(图1A)。这个PMP是后凋亡事件，因为它只发生在有凝聚的染色体和去掉轴突的皱缩神经元中(图1A)。相反，当低浓度Triton诱导原发性PMP(即坏死)时，没有检测到细胞皱缩或染色体凝聚(相差和Hoechst荧光)，但是7-AAD快速进入神经元并标记核(图1B)。为了清楚地定量分析在细胞死亡过程中在任何选择的时间神经元皱缩和PMP，建立了胰蛋白酶消化的条件，如7-AAD染色的缺乏和非毒性CellTrackerTM绿荧光染料稳定的神经元贮留客观反映地允许了神经元完整性的维持(图1B，C)。因此，神经元能够首先标记上它们的底物，并通过FM观察，第二安全地进行胰蛋白酶消化，第三立即进行流式细胞仪(FC)分析(图1D-G)。除了对照样品中完整的7-AAD阴性(胰蛋白酶消化的)神经元(88.4+/-7.6)外，47.1％(+/-18.1)的24小时血清剥夺的神经元呈现了PMP(7-AAD+)，与胰蛋白酶消化之前的显微镜观察和计数相关(图1E-G)。
-凋亡的原代皮质神经元中降解相和效应相的检测
PMP(7-AAD染色)和凋亡相关的磷脂酰丝氨酸(PS)暴露(FITC结合的膜联蛋白V；绿色荧光)基于FM的共检测指出了在血清剥夺的神经元中出现了三个细胞群：有7-AAD和FITC膜联蛋白V染色的亚群(亚群2；图2A)和有7-AAD染色(亚群3)或FITC膜联蛋白V染色(亚群1)的两个亚群。胰蛋白酶消化后通过FC也检测到相同的亚群，动力学跟踪显示了亚群1在亚群2之前，亚群2在亚群3之前(图2B，C)，因而得出结论PS的暴露发生在PMP之前。第一个可检测的核事件是显著地进行性核减少(周长)，这似乎是在神经元大小改变之前(图2D，E)。
神经元的这个FC定时分析能够延伸到半胱天冬酶的激活(图3)。确实，使用绿色荧光标记的半胱天冬酶抑制剂(FLICA，FAM-DEVD-FMK)和PMP(7-AAD染色)的半胱天冬酶-3样活性的原位共检测给出了与FM(胰蛋白酶消化前)和FC(胰蛋白酶消化后)相似的结果，显示PMP之前可检测到半胱天冬酶-3样活性(图3A，B)。当激活的半胱天冬酶-3基于抗体的原位检测取代了半胱天冬酶-3活性基于FLICA的检测时，获得了相似的结果(未显示)。当在血清剥夺开始时加入到神经元时，新广谱半胱天冬酶抑制剂喹啉-Val-Asp-(Ome)-CH2-O-Ph(Q-VD-OPH)(Melnilov等，2002)和线粒体腺嘌呤核苷酸转位子(ANT)抑制剂米酵菌酸(BA)都很强地阻止了半胱天冬酶的激活、PMP和核凋亡(图3C，D)。FC定量分析指出与泛丝氨酸蛋白酶抑制剂4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟(AEBSF，Pefabloc)相反，Q-VD-OPH抑制了95.3+/-5.6％的血清剥夺诱导的半胱天冬酶-3样活性和93.9+/-3.8％的PMP(7-AAD)(图3D)。非琐碎的问题是在给定的细胞死亡模型中测定半胱天冬酶激活和PS暴露之间的分级。使用磺基罗丹明结合的FLICA(红色荧光)对半胱天冬酶-3样活性以及使用FITC-膜联蛋白V(绿色荧光)对PS暴露的原位FM(胰蛋白酶消化前)和FC(胰蛋白酶消化后)共检测一致地证明，在原发神经元中血清剥夺后半胱天冬酶-3活性发生在PS暴露之前(图3E，F)。应当注意FM对染色体状态(Hoechst；蓝色荧光)的同时分析指出，早期半胱天冬酶-3活性与核凝聚的第一步短暂地相关(根据Susin分类I期；Susin等，1999)，虽然(图3E，4E)终末核片段化为不连续的凋亡小体(II期形态学，Susin等，1999)发生在PS暴露开始之后。有趣地，基准泛半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk和更加局限的半胱天冬酶-3样抑制剂z-DEVD-fmk很强地抑制了半胱天冬酶-3的激活，但不是神经元凋亡的降解相(即PS暴露、核凝聚和PMP)(图3D)，因而指出半胱天冬酶-3相关活性对于这些实验条件中神经元的死亡不是必要的。相反，在有或无半胱天冬酶-9抑制剂z-LEHD-fmk的存在下对染色体状态(Hoechst)和使用绿色荧光标记的半胱天冬酶抑制剂(FLICA，FAM-LEHD-FMK)对半胱天冬酶-9样活性的原位共检测揭示了半胱天冬酶-9样活性的取消导致了核凋亡的中间表型，其中多数核在核凝聚的第一步被捕获(I期；图3G)。另外，FM和FC分析都一致地显示半胱天冬酶-9的抑制取消了PS暴露和PMP(图3G，H)。因而，既然BA阻止了半胱天冬酶-9样激活(图3H)，双读出方法强烈地提示了这个实验模型中半胱天冬酶-9的执行点是下游线粒体和上游PS暴露和II期核凋亡。
-神经元凋亡线粒体/判断相的检测
用Δψm敏感染料JC-1的染色之后FM分析揭示了进行性Δψm丢失。因而，在血清剥夺前，神经元的线粒体拥有高Δψm(橙色JC-1荧光；图4A)，而来自8-24个小时血清剥夺神经元的线粒体具有低Δψm(绿色JC-1荧光；图4A)。Δψm丢失异质性地(heteregeneously)进行而没有任何明显的位置(geographic)分级，引起瞬时中间表型，其中在相同的神经元中可检测到异质性。这个提示了至少在这个实验系统中没有同时协调的Δψm丢失，而有断裂信号从线粒体到线粒体的进行性传送。在通过Hoechst染色直观反应出任何迹象的核凋亡之前观察到了完全的Δψm破坏(图4A；蓝色荧光)。如期望地，基于FM和FC的Δψm丢失(JC-1)和PMP(7-AAD染色)的共定量分析一致地证明了BA抑制了血清剥夺神经元中Δψm的丢失并且发生在PMP之前(图4B-E)。基于Δψm(使用Δψm敏感染料CMX-Ros)和半胱天冬酶-3样活性(FLICA，FAM-DEVD-FMK)共检测的动力学实验提示Δψm丢失发生在半胱天冬酶-3的激活之前(未显示)。相应地，z-DEVD-fmk对半胱天冬酶-3激活的抑制对SD诱导的Δψm丢失没有作用(图4E)。
-Δψm的实时检测
神经元凋亡中线粒体的早期参与要求监测对药物暴露的快速Δψm反应。FM对Δψm的实时检测能够倾斜分析因为重复数据采集会引起探针显著的光学淬灭(检测为JC-1橙色荧光的降低)，这能够错误地造成凋亡相关的Δψm丢失(图5A，B)。为了克服这个仪器的不足，开发了实时FC方法，其中与定时FC试验方案相反，神经元第一胰蛋白酶消化，第二标记以随着时间检测ATM(JC-1)和PMP(7-AAD)(图5C)。在这些条件下，FM观察揭示了胰蛋白酶消化的神经元不呈现PMP并维持了共3个小时的高Δψm(图5C)。应当注意在胰蛋白酶消化后最初5小时中没有检测到失巢凋亡(anoikis)的迹象。FC纪录20分钟证实了胰蛋白酶消化的神经元仍然具有稳定升高的Δψm并且对7-AAD不通透，即保持了完整的浆膜(图5D2-3)。呼吸链解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(mCICCP)加入到非胰蛋白酶消化的神经元中诱导了Δψm的破坏(图5D-1)。实时FC监测揭示了神经元群的Δψm丢失在用mC1CCP治疗的2分钟后最大(图5D-2，3)。用线粒体毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)处理的非胰蛋白酶消化神经元培养物PMP(7-AAD)和Δψm(JC-1)的FM共检测提示在45分钟后多数神经元Δψm很低而没有任何迹象的PMP(图6A-1)。相反，用或不用一氧化氮诱导剂SNP处理的皮质神经元维持了升高的Δψm。如期待地，乙醇诱导了如大量7-AAD掺入培养的神经元而客观反映的快速PMP(图6A-1)。当实时FC应用于PMP、Δψm、细胞大小和皮质神经元颗粒度的同时评价，这个技术指出在15分钟后，49.6％(+/-8.2；n＝4)MPTP处理的神经元是低Δψm，而16.2％(+/-1.2)未处理神经元和15.0％(+/-6.2)SNP处理的神经元是低Δψm。实时FC揭示与MPTP和SNP相反，乙醇处理诱导了原发坏死。确实，乙醇引发了非常快速的PMP(5分钟后98％)，这发生在Δψm丢失之前(5分钟后75％)(图6)。有趣地，MPTP诱导的Δψm丢失是异质性的因为发生快速Δψm降低的神经元呈现了显著的颗粒度的增加，而发生很小Δψm降低的神经元没有呈现形态学改变(图6)。
综合起来，这些结果显示实时FC分析是在每个神经元基础上定量追踪短期PMP事件和Δψm改变的简单的方法。
使用血清剥夺的小鼠原代皮质神经元作为系统模型，显示1)神经元样品能用凋亡相关探针多重标记并用FM连续地进行分析，安全地从它们的支持物上脱离并用FC定量研究而没有固定，2)用这个双读出方法学获得的动力学和药理学信息允许描述并清楚地排序神经元凋亡的主要相(判断、执行和降解)，3)神经元也能够首先从它们的支持物上脱离，然后用重要的探针标记并进行实时FC分析3个小时，因而提供评估神经元死亡的短期事件，包括原发坏死(即PMP在Δψm丢失之前时)和对给定刺激物的凋亡相关细胞反应之间的辨别。
FC提供了一些特异性优点(表1)。首先，不管培养神经元聚集体是什么起始水平，FC允许快速地获得对高数量神经元(这个研究中每个样品40,000个)凋亡和相关事件的代表性定量分析。第二，FC能够检测几乎用FM不能证明的有低水平荧光的细胞内探针。这个优点能够归因于细胞仪光子培增管(FC)与电荷偶联设备(CCD)照相机(FM)相比更好的辨别弱荧光细胞的能力。第三，FC也克服了FM观察中经典地诱发的问题，包括探针的光学淬灭(用JC-1的Δψm检测就是这个情况)、长时间表荧光照明诱导的细胞损伤和/或光热作用。例如，由于与FM(5瓦，多色波长)相比弱的神经元照射(15毫瓦，单色波长)以及极度短(和唯一的)细胞通过激光柱，JC-1光学淬灭在FC最小。第四，实时FC允许在任何神经活性药物的加入之后数分钟内非常短期的浆膜和线粒体内膜改变的定量分析。第五，多重参数分析可以通过能够调查共14个单独参数的更加强大的细胞仪的使用而扩大。
也证明了SD神经元发生了遵守下面规则的凋亡程序(图7)。第一，SD神经元证明了ANT相关依赖过程中Δψm驱散的迹象。第二，Δψm驱散发生在半胱天冬酶-3和9激活的上游。第三，PS暴露和全核凝聚(II期)在半胱天冬酶-9样活性的下级但是不依赖于半胱天冬酶-3样活性。自相矛盾地，Z-VAD-fmk处理的24小时SD神经元不呈现半胱天冬酶-3样活性但是发生PS暴露、II期核凋亡和终末PMP，而所有这些事件被第三代全半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPH完全阻断。因而，上面的结果揭示了不常见的线粒体依赖性半胱天冬酶途径，这在原代皮质神经元中血清撤除诱导的凋亡过程中被激活。
这个细胞荧光测定技术也用于研究神经元对其它刺激物反应的凋亡动力学，包括神经酰胺、α-淀粉样肽、3-硝基丙酸、谷氨酸盐和病毒蛋白质。分析也延伸到检测参与神经元凋亡的其它半胱天冬酶的激活。这些细胞荧光检测分析也能够实现对仍然不充分了解的死亡类型更好的特征分析，例如物质P处理的皮质、纹状体和海马原代神经元非凋亡形式的程序性死亡，并使得区分有坏死样死亡和凋亡共同存在的例如缺血损伤的模型中这两个成为可能。
所以，根据本发明开发的技术对于研究神经元凋亡的细胞生物学并给神经元毒性和神经元保护性化合物的筛选和特征分析提供多参数的定量分析工具是强大的。
实验步骤
皮质神经元的分离和培养
从胚胎第14天Swiss小鼠的新皮质分离原代皮质神经元(Janvier，Le Genest-St-Isle，法国)。神经元以每cm2 7×105个活细胞在500μl补充了5％马血清(HS，Eurobio，Les Ulis，法国)和2.5％胎牛血清(FCS，Eurobio)的Eagle氏基础培养基(EBM，Eurobio)中接种于包被了聚乙烯亚胺(PEI，1mg/mL，Sigma，St Quentin Fallavier，美国)的24孔平板(Sarstedt，Orsay，法国)或Lab-Tek有小室(chambered)的盖玻片上(Nalge Nunc International，Naperville，IL，美国)。2天后，培养集替换为含有180mg/L葡萄糖、5％HS和1％FCS的N5培养基(Kawamoto和Barrett，1986)以及3μM胞嘧啶β-D-阿拉伯糖苷(阿糖胞苷，Sigma)和1μM 5-甲基-10，11-二氢-5H-二苯环庚烯-5，10-亚胺马来酸酯(MK-801，国际研究生化物)(Knusel等，1990)并且每天更换。在5天的培养物中用血清撤除诱导凋亡(Macleod等，2001)。用抗微管相关蛋白2的单克隆抗体(MAP-2，Sigma)和抗神经胶质纤丝酸性蛋白质多克隆抗体(GFAP，Dako)评估培养物的纯度(＞95％)。
皮质神经元胰蛋白酶消化
用无血清N5培养基仔细清洗一次后然后在250μl 37℃胰蛋白酶-EDTA(Gibco BRL，UK)在37℃孵育15分钟进行神经元的酶性脱离。使用1000μl枪头(Gilson)5次温和冲洗进行细胞的脱离。在500μl N5培养基中通过200μl枪头10次仔细的冲洗脱离剩余的神经元聚集物。为了胰蛋白酶消化步骤的确认，用10μM CellTracker绿TM(分子探针，Eugene，OR)在37℃染色粘附的神经元15分钟，N5培养基清洗，进行胰蛋白酶消化。通过流式细胞仪(FL-1通道)和显微镜(激发BP 480/40和发射BP527/30)进行神经元的分析。TritonX-100(Sigma)处理(0.02％)用作浆膜破坏的阳性对照。
仪器使用
使用装备了15毫瓦空气冷却的488nm氩激光的3色FACSCalibur细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行荧光激活的细胞分拣。对于每个样品，登记了来自40,000个神经元的数据，并用CellQuest ProTM软件(Becton Dickinson)分析。对于实时分析样品流速定为12μl+/-3μl/分钟，对于定时实验，定为60μl+/-3μl/分钟。用配置了100瓦水银短弧光灯和x 40 N PLAN L物镜或水浸x100N PLAN物镜(Leica，Welzlar，德国)的DM IRB倒置荧光显微镜(Leica，Rueil-Malmaison，法国)进行荧光显微镜检测(FM)。用CCD彩色照相机(Leica DC 300F，Leica，法国)获取1300×1030像素的分辨率的图像，并且用Leica QFluoro软件(Leica Microsystem AG，瑞士)调控。为了用IM1000软件(Leica Microsystem AG)进行离线分析使用Leica QFluoro软件储存数据。
通过7-氨基放线菌素D的掺入对凋亡降解相的检测
通过对7-氨基放线菌素D(7-AAD，Sigma)增加的通透性检测浆膜完整性的丢失(Schmid等，1992；Carpenter等，1997；Lecoeur等，2002)。在37℃将20μg/m l 7-AAD加入到培养的神经元15分钟。使用BP 515-560滤片通过100ms激发进行FM分析，通过LP 590长通道滤片检测7-AAD荧光(FI-3通道，λ＞650nm，PMT＝333)。如对悬浮生长的细胞所描述地从分析中抛弃凋亡体/碎片(Lecoeur等，1997)。
使用FITC-膜联蛋白V和7-AAD对早期和晚期降解相的检测
通过FITC结合的膜联蛋白V的固定(凋亡检测试剂盒，R&D系统)检测磷脂酰丝氨酸暴露(PS)于浆膜外层。室温下将20μg/ml 7-AAD和1x膜联蛋白V加入到200μl富含Ca2+的缓冲液(凋亡检测试剂盒)20分钟。对于FM实验，通过BP 480/40滤片激发膜联蛋白V-FITC，使用BP 527/30滤片收集发射光。在F1-1通道(530+/-15nm)进行FITC-膜联蛋白V荧光的FC检测，以线性扩增模式进行分析(PMT电压＝867，扩增获得＝9.00)。通过如下调节代偿网络避免光谱的重叠：FL2-22.9％FL1和FL2-41.7％FL3。
使用FLICA、膜联蛋白V和7-AAD对效应和降解相的联合检测
使用FAM-DEVD-FMK和FAM-LEHD-FMK这两个荧光团标记的半胱天冬酶抑制剂(FLICA)(CaspaTaqTM荧光素半胱天冬酶活性试剂盒，Intergen，NY)检测激活的半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-9(Lecoeur等，2002；Smolewski等，2002)。神经元与1/150FLICA的DMSO储备液在37℃孵育1小时。在最后15分钟中加入7-AAD和Hoechst。然后在清洗缓冲液(CaspaTagTM试剂盒)中清洗神经元三次。对于FM成像，通过BP 480/40滤片激活FLICA，通过BP 527/30滤片收集发射光。对于FC分析，通过FL-1通道收集FLICA荧光(PMT电压＝501，补偿网络：FL1-7.8％FL2，FL2-40.8％FL1和FL2-45.4％FL3)。使用藻红蛋白(PE)结合的多克隆抗体(Beckton Dickinson)通过免疫检测证明了细胞内切割的半胱天冬酶-3。神经元用7-AAD染色，胰蛋白酶消化，在含有1％PFA和20μg/ml放线菌素D(AD)的PBS中固定20分钟。然后，室温下将神经元重新悬浮在100μM PBS，1％BSA，20μg/ml AD，0.05％皂甙Quillaja bark(Sigma)和20μl抗半胱天冬酶-3抗体中30分钟(Lecoeur等，2001)。PBS清洗后，在细胞仪上(FL-2通道)分析PE相关的荧光。在血清剥夺起始时加入100μM都购自ICN(Orsay，法国)的Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK(Z-VAD-FMK)、喹啉-Val-Asp(OMe)-CH2-O-Ph(Q-VD-OPH)、Z-DEVD-FMK(Z-Leu-Glu(OMe)-His-Asp(OMe)-His-Asp(OMe)-fmk，ICN)和Z-LEHD-FMK(Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)FMK和4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟(AEBSF，Pefabloc SC，Roche，Meylan，法国)。磺基罗丹明-DEVD-FMK(CaspaTagTM红活性试剂盒)允许检测激活的半胱天冬酶-3和FITC-膜联蛋白V。神经元与1/900FLICA的DMSO储存液和1XFITC-膜联蛋白V在200μl膜联蛋白缓冲液中37℃孵育30分钟。然后神经元在50％清洗缓冲液和50％膜联蛋白缓冲液组成的缓冲液中清洗三次。FL-2通道(585+/-21nm)检测半胱天冬酶-3活性。对于FM，通过BP 515-560滤片激发FLICA，通过LP590长途径发射滤片收集它的荧光。
使用JC-1和7-AAD对凋亡判断相的定时检测。
通过5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′-四乙基苯并咪唑基羰花青碘(JC-1，分子探针，Eugene，OR)掺入评估线粒体跨膜电位(Δψm)。在37℃用1μM JC-1和7-AAD共染色神经元15分钟。通过FC在FI-1通道(PMT电压＝644)检测JC-1单体。通过FI-2通道(PMT电压＝451)检测J聚集体(Reers等，1991)。7-AAD检测的PMT电压是326。补偿网络：FL1-0.0％FL2，FL2-22.9％FL1，FL2-41.7％FL3和FL3-0.7％FL2。对于FM分析，在1.2s激发(BP 450-490激发/LP 515长途径发射滤片)后同时记录绿色和橙色荧光。通过N20中性滤色片将照射减弱到最初入射光的5％来避免光学淬灭。测试了25μM的米酵菌酸(BIOMOL)。
线粒体跨膜电位Δψm和神经元形态学的实时检测
就在胰蛋白酶消化后在5天培养的神经元上进行实时试验。神经元重新悬浮在N5培养基中，调到0.7×106个细胞/ml并在37℃用800nM JC-1上样15分钟。然后，样品在N5培养基中稀释到1/8，加入20μg/ml 7-AAD。登记基本形态和Δψm和膜通透性共5分钟，并加入药物；100μM羰基氰化物-间-氯苯腙(mCICCP，Sigma)、1μM 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP，Sigma)和0.6μM硝普钠(SNP，Sigma)。MPTP是线粒体复合物-I毒素和凋亡诱导剂，体内用于在小鼠和猿类产生帕金森氏症(Speciale，2002)。接下来的15分钟记录每个参数的变化。使用微软Excel软件画曲线图。
Hoechst 33342的核染色和核周长测量
神经元与1μM Hoechst 33342(Ho 342，Sigma)孵育15分钟，并用FM进行分析(5毫秒曝光(BP 340-380激发滤片/LP 425长途径滤片)。使用Leica Q Fluoro软件通过产生目的处理掩饰的各个区域测量核周长，表示为绝对单位。
统计分析
使用微软Excel软件进行统计分析。用线性回归分析计算相关性。对于每个分析，指出了R2。进行未配对Student测试以比较在不同凋亡期的细胞百分率。p值＜0.05认为是显著的。
实施例2：体外和体内神经元细胞死亡中的半胱天冬酶-2的抑制/沉默
泛半胱天冬酶抑制促进了血清剥夺诱导死亡的原代皮质神经元培养物的存活
神经元发育和病理过程中，没有找到合适营养支持和源于靶点营养因子的来源的神经元发生凋亡性细胞死亡。急性神经元损伤的体外模型原代皮质神经元的血清剥夺(SD)导致了凋亡性细胞死亡。研究SD过程中凋亡标志的分级和时间顺序，描述了似内源性途径，其中线粒体膜电位(Δψm)破环发生在核凋亡(NA)(凝聚/片段化为凋亡体)、磷脂酰丝氨酸(PS)暴露于外浆膜叶和浆膜终末通透(PMP)的上游。所述的研究证明了整个50小时SD中这样凋亡标志的时间-反应(图8A)。为了清楚性，有低Δψm、NA、PS向外暴露或PMP的神经元出现的动力学反映了有进行性改变的所有中间亚单位。在这些实验条件下，多数神经元同时参与每个过程。
由于半胱天冬酶在凋亡一些范例中的关键性作用，评价了SD过程中皮质神经元中半胱天冬酶的需求。当在血清撤除起始加入时，用新一代广谱半胱天冬酶抑制剂喹啉-Val-Asp(OMe)-CH2-O-Ph(Q-VD-OPH)的连续处理拯救了大部分SD神经元，导致Δψm和核形态、完整浆膜的高度保存以及PS暴露的缺乏(图8B)。
相反，Z-VAD-FMK或BOC-D-FMK(BOC-D)不能延迟或者取消SD相关的细胞死亡(图1B)。应当注意在Q-VD-OPH 24小时拯救的神经元中，核形态以及轴突完整性和轴突网络似乎充足地保存(图8C)。然而，它们的细胞体稍微小些。使用特异性荧光底物，在24小时SD检测了细胞内半胱天冬酶-2样、半胱天冬酶-3样、半胱天冬酶-8样和半胱天冬酶-9样活性(图8D)。SD过程中低水平的半胱天冬酶-8样激活提示这个模型中外源性途径不占优势。用Q-VD-OPH共处理使所有这些半胱天冬酶活性完全失活(图8D)。进行研究以测定用如下其它非相关半胱天冬酶依赖性的神经退行性刺激剂攻击过程中Q-VD-OPH是否可以促进存活：Ca2+离子载体离子霉素(兴奋性毒性)、NO供体硝普钠(SNP)、β-淀粉样(25-35)肽(βA)和线粒体毒素例如1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)或3-硝基丙酸(3-NPA)。这些药物诱导凋亡(监测了NA和PMP)，但是除了β-淀粉样肽外，同时用Z-VAD-FMK或Q-VD-OPH治疗不提供保护，这与以前的报告一致(图8E)。这些发现加强了皮质神经元SD过程中特异性半胱天冬酶的参与。
为了确保原发性半胱天冬酶激活在测试系统模型中的重要性，使用下面的化合物家族进行了不同信号和代谢途径的药理学抑制(表I)：靶向线粒体和通透性转移孔(PTP)的试剂、线粒体钙摄入的调节剂、细胞浆钙螯合剂、蛋白酶的抑制剂(钙蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、蛋白酶体或溶酶体的组织蛋白酶(cathepsin))、细胞周期抑制剂、涉及信号转导途径的激酶和磷酸酶的抑制剂、干扰内吞和自噬过程的抑制剂、抗氧化剂、蛋白质核运出的抑制剂。几乎所有受试化合物没有阻止SD诱发的细胞死亡。抑制转导和翻译的多效(pleiotropic)试剂环己酰亚胺(cycloheximide)和放线菌素D促进经受了SD的皮质神经元的存活(表I)。
线粒体前半胱天冬酶-2活性对于血清剥夺诱导的皮质神经元凋亡性细胞死亡是必需的
Q-VD-OPH阻止例如Δψm丢失的早期事件的事实提出了(线粒体前)半胱天冬酶在本模型中的重要性和Q-VD-OPH的特异性这两个问题。为了鉴定SD模型中负责细胞死亡的更加接近的半胱天冬酶活性，使用了一组更加有选择性的半胱天冬酶抑制剂并且分析了它们对对一些死亡参数的影响(图9A)：分别抑制半胱天冬酶-3、-9、-2和-8样活性的Z-DEVD-FMK、Z-LEHD-FMK、Z-VDVAD-FMK和Z-LETD-FMK。似乎只有有效的半胱天冬酶-2样活性的抑制剂Z-VDVAD-FMK(图9D)能够取消Δψm的丢失以及其它凋亡的标志(NA、PMP、PS暴露)并保护神经元抵抗死亡(图9A和9B)。为了更好地特征分析Q-VD-OPH和Z-VDVAD-FMK的抑制谱，测定了神经保护的最好模式。Q-VD-OPH和Z-VDVAD-FMK以浓度依赖方式抑制凋亡，加强了皮质神经元SD过程中半胱天冬酶极联的激活(图10)。考虑到培养物的高密度(每cm2 7×105个)，100μM的每个抑制剂提供了更高的保护作用，这是本研究中使用的浓度。这些抑制剂(100μM)在SD起始时加入对于Q-VD-OPH或Z-VDVAD-FMK诱导的神经保护是最好的模式，因为血清撤除后延迟了2-6小时抑制剂的处理效率较低(补充材料；图10)。另外，从2小时SD检测到了半胱天冬酶-2样的激活，并且在最先Δψm降低的迹象(8小时)和其后核改变之前(图9C)。总而言之，这些发现显示线粒体前半胱天冬酶-2样活性是皮质神经元中SD诱导凋亡必需的最近的半胱天冬酶活性。Z-VDVAD-FMK而不是Z-DEVD-FMK、Z-LEHD-FMK或Z-LETD-FMK取消了半胱天冬酶-2样活性(图9D)。相反，Z-VDVAD-FMK抑制了半胱天冬酶-3样和半胱天冬酶-9样活性，因而证明了半胱天冬酶-2样激活在半胱天冬酶-3样和半胱天冬酶-9样活性的上游(图9D)。虽然分别取消了半胱天冬酶-3样和半胱天冬酶-8样活性(图9D)，Z-DEVD-FMK和Z-LETD-FMK没能保护神经元免受SD(图9A和9B)，因而指出了半胱天冬酶-3相关活性以及半胱天冬酶-8的募集对于神经元退变不是必需的。另外，半胱天冬酶-8抑制剂也没有阻断半胱天冬酶-2、-3或-9的激活(图9D)。半胱天冬酶-9抑制剂Z-LEHD-FMK没有阻碍Δψm的降低，然而它延迟和阻止了凋亡小体形成，而不是I期-凝聚(NA)、PS暴露和PMP(图9A和9B)。
这些数据显示半胱天冬酶-2在MMP的上游起作用，并且SD过程中半胱天冬酶-9在MMP下游起作用。
为了证实这个评估，研究了SD诱导半胱天冬酶-2活性介导凋亡的基因证据。小鼠半胱天冬酶-2的序列分析导致了指向小鼠半胱天冬酶-2的特异性小干扰RNA(siRNA C2wt)的设计，如RT-PCR和Western印迹评估地所述RNA诱导了半胱天冬酶-2表达的特异性压制(图11A)。作为对照，设计了有4个突变的无关siRNA(siRNA C2m)。
siRNA C2 wt双体是：
SEQ ID No 1 5′-caccuccuagagaaggacadTdT-3′
SEQ ID No 2 5′-uguccuucucuaggaggugdTdT-3′
siRNA C2 m双体是：
SEQ ID No 3 5′-caucuacucgagacggacadTdT-3′
SEQ ID No 4 5′-uguccgucucgaguagaugdTdT-3′
原位基于抗体的检测证实了小鼠半胱天冬酶-2的高度基因沉默，因为siRNA C2 wt降低了所有神经元中半胱天冬酶-2的表达(图11B)。消除在转染后24小时时最大，在72小时有半胱天冬酶-2表达的进行性恢复(图11B)。惊人地，如细胞内半胱天冬酶-2失活(图11C和11D)以及Δψm的保存、NA、PS对称性、浆膜完整性和轴突网络(图11C-E)所评估地siRNA C2wt对半胱天冬酶-2的压制导致了皮质神经元在SD后的存活。截然相反，对照siRNA C2m既没有阻止了基因/蛋白质的表达(图11A)也没有阻止这些凋亡标志的出现(图3C和3D)。另外，半胱天冬酶-2的抑制或取消对细胞存活的影响是SD特异性的，因为离子霉素处理的神经元未受保护而免受细胞死亡(图11D和11E)。因而，用这个Ca2+离子载体的处理是有用的半胱天冬酶-2非依赖性对照以探查siRNA C2wt的特异性，因为半胱天冬酶-2未被激活(见下)，并且Z-VDVAD-FMK或siRNA C2wt没有提供了保护作用(图11D和11E)。
这些结果证明半胱天冬酶-2激活是这个模型中关键的线粒体前检查点。
半胱天冬酶-2控制细胞色素C的释放和Bax转位到线粒体
进行研究以测定半胱天冬酶-2的抑制或压制是否阻止MMP依赖性事件例如细胞色素C释放。SD引发细胞浆细胞色素C从线粒体的释放，这个有效地被Q-VD-OPH、Z-VDVAD-FMK和siRNA C2 wt阻断(图12A)。相似地，Q-VD-OPH、Z-VDVAD-FMK和siRNA C2 wt取消了半胱天冬酶-2的激活并阻止了下游半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3细胞色素C释放依赖性的激活(图12B和12C)。皮质神经元中离子霉素诱导的细胞死亡不依赖于半胱天冬酶-2的激活(图12B)，这与Z-VDVAD-FMK和siRNA C2 wt对凋亡的其它标志没有保护性作用一致。(图12D和12E)。应当注意更加远端的半胱天冬酶例如半胱天冬酶-9(通过Z-LEHD-FMK)和半胱天冬酶-3(通过Z-DEVD-FMK)的抑制不能阻止细胞色素C的释放(图12A)，而Z-LEHD-FMK可以延迟如核凝聚初期阶段(I期)中更高频率阻断所观察地(图12A)更加后期的凋亡特性。与Z-LEHD-FMK没有阻碍Δψm的降低但它阻止半胱天冬酶-9的激活和凋亡的终末特性，即PS暴露、NA和PMP(图9A、9B和9D)的事实一起，这些结果支持经典凋亡体的形成，暗示了细胞色素C、半胱天冬酶-9和其后半胱天冬酶-3的激活。
然后研究了Bax相对于半胱天冬酶-2的作用，因为Bcl-2家族的这个前凋亡蛋白质在神经元发育过程中是必需的，对于促进神经元中在营养因子之后线粒体细胞色素C释放和细胞死亡也是关键的。在SD神经元中进行了Bax基于抗体的原位检测，显示了Bax从细胞质(弥散模式)转位到线粒体样腔室(点状)(图12D)，证明了Bax也参与了细胞死亡的起始。重要地，定位半胱天冬酶-2激活对Bax转位对于理解(i)Bax转位是否依赖于半胱天冬酶-2；(ii)如果半胱天冬酶-2活性是否依赖于Bax；(iii)这两个是否相互独立地参与对SD诱导细胞死亡的线粒体前控制是关键的。
观察到Bax弥漫于Z-LEHD-FMK处理的SD神经元细胞质中，因而提示半胱天冬酶-2控制Bax的转位以促进细胞死亡(图13A)。相反，对线粒体下游激活的更加接近的半胱天冬酶半胱天冬酶-9起作用的Z-LEHD-FMK并不阻止线粒体Bax转位。一致地，用Z-VDVAD-FMK、Q-VD-OPH的处理或siRNA C2 wt对半胱天冬酶-2的压制阻碍了Bax转位到线粒体(图12D)，证实半胱天冬酶-2对Bax实行上游控制以促进细胞死亡。为了更好地特征分析Bax和半胱天冬酶-2之间推测的关系，用氯通道抑制剂速尿灵处理SD诱导发生死亡的原代皮质神经元。确实，Bax转位似乎需要pH和离子强度敏感的构象改变，显示速尿灵降低了十字孢碱、肿瘤坏死因子-α或足叶乙甙处理的细胞内Bax的转位。通过干扰Bax转位(图13A和13B)，速尿灵(在Bax的水平或上游起作用)降低了SD神经元中凋亡的标志(即Δψm丢失、细胞色素C释放、NA、PMP)(图13C)。另外，细微动力学观察揭示了部分Bax转位到线粒体发生在5小时SD(几乎伴随着半胱天冬酶-2的激活，图9C)，在8小时时Δψm丢失和在15小时时细胞色素C从线粒体释放之前(数据未显示)，提示在SD范例中Bax介导了MMP。重要地，虽然速尿灵阻断了Bax转位，它部分阻止了SD时线粒体Bax转位但是不阻碍半胱天冬酶-2活性(图13B)。应当评论与Z-VDVAD-FMK或siRNAC2 wt相比速尿灵只提供了部分保护，这归因于剂量限制(高于3mM对于皮质神经元是有毒性的)，事实上速尿灵不是直接的Bax干扰剂。
半胱天冬酶-2活性是非核的，弥散于SD神经元以及用速尿灵处理的SD神经元的细胞体和轴突中，提示没有细胞器特异性的半胱天冬酶-2活性。这个观察是关键的因为Z-VDVAD-FMK或siRNA C2 wt阻碍了Bax转位和半胱天冬酶-2活性(图13B)。总而言之，这些数据提示Bax上游半胱天冬酶-2依赖性地从细胞质到线粒体的转位，这依次启动了线性顺序的事件，其中发生了Δψm丢失、半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3下游细胞色素C释放依赖性的激活、NA、PS暴露和终末PMP。然而，如无细胞的系统中提示地，不能排除半胱天冬酶-2对神经元中线粒体膜推测的直接或间接Bax非依赖性作用。
SD诱导的Bax切割依赖于胞浆半胱天冬酶-2但不依赖于钙蛋白酶
为了准确建立Bax和半胱天冬酶-2之间的联系，检查了SD神经元中半胱天冬酶-2和Bax在mRNA和蛋白质水平的表达，搜索集中于整个SD中活性半胱天冬酶-2的准确细胞内定位。
关于Bax，在24小时SD之后没有检测到mRNA上/下调(图14A)或p22 Bax蛋白质含量的增加(图14B)。惊人地，当使用靶向缺失了羧基末端21个氨基酸的全小鼠Baxα多克隆抗体(Δ21)通过Western印迹检测时，整个24小时SD中除了天然全长p22 Bax，观察到了相应于18kDa的第二个条带的进行性出现(见图14B中的时程)。用Δ21抗体和抗基因定位(mapping)在Baxα氨基末端的肽的多克隆抗体N20，进行p22和p18Bax相关条带的比较性免疫印记(图14B和14C)。N20不允许p18条带的检测(图14C)，提示将p22 Bax在其N-末端基团切割为18kDa形式。应当注意这个早期切割(图14B)以与半胱天冬酶-2活性(图9C)相似的动力学发生。惊人地，半胱天冬酶-2的抑制或其基于siRNA基因消除完全取消了Bax切割而siRNAC2m没有作用(图14D)，证明了半胱天冬酶-2激活对于SD之后Bax的切割是必需的。
然后进行细胞分级分离以鉴定SD过程中Bax诱导的细胞死亡是否主要与半胱天冬酶-2激活相关联并检查Bax是否整合进线粒体膜以促进皮质神经元中Δψm的降低和细胞色素C的释放。用Western印迹分析得自经受了有或没有Z-VDVAD-FMK或siRNA C2 wt 24小时SD的皮质神经元可溶性细胞质和富含线粒体的重膜组分中Bax的含量。在24小时SD时的可溶性和富含线粒体组分中发现了天然p22 Bax，而p18Bax唯独在富含线粒体的组分中检测到(图14E)。天然Bax也以较低的程度插入线粒体(外)膜(图14E)。所述数据显示Bax的两个形式参加了SD激发的细胞死亡。然后进行研究以测定半胱天冬酶-2依赖性Bax切割在皮质神经元中是否响应于其它刺激剂而发生。有效地，Bax切割也发生在用十字孢碱或离子霉素的处理过程中，但是在这些情形下以半胱天冬酶-2非依赖性的方式产生p18 Bax(图14F)，证实了其它蛋白酶在这些模型中负责Bax的切割(Wood等，1998；Choi等，2001)。相应地，Q-VD-OPH或Z-VDVAD-FMK没有阻止十字孢碱或离子霉素诱导的细胞死亡。
对Bax切割的蛋白酶抑制谱进行更加精确地询问，因为其它半胱氨酸蛋白酶、钙蛋白酶或通过半胱天冬酶依赖性钙蛋白酶激活可以直接切割Bax(Choi等，2001)。为了检查钙蛋白酶是否对神经元SD过程中Bax的切割负责，用Western blot研究钙蛋白酶抑制剂(ALLN、ALLM和E64D)对Bax切割的作用。与Q-VD-OPH相反，钙蛋白酶活性的抑制没有阻止Bax切割，证明SD过程中Bax切割直接或间接由钙蛋白酶介导(图14G)。有趣地，乳胞素和epoxomycin对蛋白酶体活性的抑制似乎稳定了p18 Bax(图14H)，加强了以前报道的p18 Bax的凋亡作用。
所有这些数据与半胱天冬酶-2激活导致Bax切割成活性形式的模型相符。
所述结果显示Bax需要半胱天冬酶-2被处理。因而进行研究以测定整个SD过程中半胱天冬酶-2的生化状态和细胞分布。似乎SD后没有半胱天冬酶-2mRNA的上调(图14I)。相反，与未处理的神经元相比前半胱天冬酶-2蛋白质含量在SD神经元中降低，这个降低似乎是半胱天冬酶-2自我切割的结果因为Z-VDVAD-FMK处理阻止了它(图14J)。确实SD神经元中免疫检测到处理的p14形式的半胱天冬酶-2，而在Z-VDVAD-FAMK处理的SD神经元不是(图14J)。在33kDa也检测到了切割的中间产物。SD过程中半胱天冬酶-2位置的动力学分析显示半胱天冬酶-2是严格胞浆的，甚至在后期，因而排除了半胱天冬酶-2在SD细胞死亡中的细胞核功能(图14K)。相反，一些凋亡诱导药物例如Ca2+离子载体离子霉素、激酶抑制剂十字孢碱、拓扑异构酶I抑制剂喜树碱引发了半胱天冬酶-2部分或完全的核转位(图14L)。
因而，神经元中半胱天冬酶-2胞浆分布是刺激剂依赖性的，证明了半胱天冬酶-2在SD神经元胞浆中的特别功能。
特异性半胱天冬酶-2抑制在新生鼠缺血脑损伤过程中提供了很强的神经保护
上面的结果证明了上游和早期的半胱天冬酶-2激活是所述体外模型中关键的检查点。进行实验以体内测定急性神经元应急过程中是否有效地靶向这样的途径。为了开始，在五肽VDVAD联合氨基末端喹啉基团和羧基末端O-苯氧基团的基础上进行了新的细胞通透性半胱天冬酶-2抑制剂原型的惯例合成，称作Q-VDVAD-OPH，这可以增强细胞通透性和抑制强度。
SEQ ID No 5，Q-VDVAD-OPH：喹啉基carnonyl-L-缬氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)-L-缬氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)2，6-二氟苯酯
测试了Q-VDVAD-OPH对重组半胱天冬酶-2的特异性(图15A)。Q-VDVAD-OPH阻断了体外半胱天冬酶-2对VDVAD-AMC的切割，象Q-VD-OPH和特异性半胱天冬酶-2可逆(Ac-VDVAD-Cho)或不可逆(Z-VDVAD-FMK)抑制剂一样有效。虽然Z-VAD-FMK的切割抑制不那么重要，BOC-D-FMK对于抗半胱天冬酶-2是完全无活性的，因而证明了平常的全半胱天冬酶抑制剂抗半胱天冬酶-2的较低效力。半胱天冬酶-3样抑制剂Z-DEVD-FMK或分别半胱天冬酶-3/9/8样抑制剂Z-LEHD-FMK、Z-LETD-FMK并不是很强地使半胱天冬酶-2失活(图15A)。其它的半胱氨酸蛋白酶E64d、ALLN、ALLM抑制剂、钙蛋白酶不能阻碍切割活性(图16)。当在SD范例中受试(但不是离子霉素诱导的死亡)时，象Q-VD-OPH、Z-VDVAD-FMK或siRNA C2 wt(图8B、9A和11D和11B)一样Q-VDVAD-OPH促进了皮质神经元的存活(图15B)，因而提供了体内实验的特异性半胱天冬酶-2抑制剂。相反，BOC-D-FMK和Z-VAD-FMK对抵抗SD诱导的神经元细胞死亡是无效的(图8A)。然后在发育大脑缺氧缺血损伤的急性模型中测试了Q-VDVAD-OPH，其中细胞死亡是通过凋亡发生的。在这个瞬时单侧局部缺血模型，大鼠崽发生了永久性左中大脑动脉阻塞以及与之相关的有再灌注左颈总动脉的瞬时阻塞。然后当在这个产期缺血模型中给予时检查了全半胱天冬酶(Q-VD-OPH)和半胱天冬酶-2特异性(Q-VDVAD-OPH)抑制剂的神经保护作用。缺血开始前i.p.给予一个剂量的Q-VD-OPH或Q-VD-VAD-OPH(100μg/动物)或载体溶剂。48小时后分析大脑，在这个时间点梗死稳定，没有显著的水肿(不超过1.5％)。缺血诱导了55.0±3.4mm3的梗死体积，这代表损害的同侧半球有22.1±1.4％的损伤。梗死体积似乎呈正态分布(15和26％之间)(图15C和15D)。缺血前给予单个剂量的Q-VD-OPH显著降低44％的梗死体积(12.4±2.6％，Newman-Keul检验与对照组相比p＜0.05)，体积分布在0和31之间(图15D和15E)。相同剂量的Q-VDVAD-OPH诱导了非常显著的74％梗死体积的降低(5.7±2.3％，Newman-Keul检验与对照和Q-VD-OPH组相比p＜0.01)(图15C和15D)。12个研究的动物上，与缺血对照动物相比8个动物展现了MCA闭塞水平(相应于平板12和13的水平)可见的非常显著的更小的梗死体积(0.5％的中位数)但不是在背面和海马水平(平板21)(图15C和15E)。另外四个动物展现了有16.5±1.32％平均值的梗死，这个值低于缺血对照动物中得到的值。结论，我们的数据证明了启动子半胱天冬酶-2的特异性阻断提供了很强的神经保护，这比抗缺血脑损伤的全半胱天冬酶的抑制更有效。
讨论
线粒体前半胱天冬酶-2活性对于神经元凋亡是必需的
本发明因而描述一个新的内源性途径亚型，其中SD诱导的原代皮质神经元的凋亡依赖于启动子半胱天冬酶-2的上游激活，这个通过对Bax诱导的线粒体功能障碍和其后半胱天冬酶依赖性神经元破坏的控制而进行(图17)。
下面几条证据支持这个模型：
(i)凋亡的分级和时间顺序显示了内源性样途径，其中细胞质Bax转位并整合进外线粒体膜以诱导Δψm的降低、促进细胞色素C的释放以及下游事件，象半胱天冬酶-9/半胱天冬酶-3细胞色素C释放依赖性激活、核凝聚/片段化、PS暴露和终末PMP。
根据本发明得到的结果支持有细胞色素C和半胱天冬酶-9的经典凋亡体的形成。然而，半胱天冬酶-9也参与有待鉴定的另一个下游执行半胱天冬酶的激活，因为半胱天冬酶-3的抑制没有阻止凋亡的终末标志。
(ii)Z-VDVAD-FMK比半胱天冬酶-3、-8、-9的选择性抑制剂促进了更高的SD诱导死亡的神经元的存活。
(iii)MMP之前检测到了早期半胱天冬酶-2激活并且不依赖于其它的半胱天冬酶。线粒体前半胱天冬酶-2的激活对于SD诱导的细胞死亡必需的，因为特定siRNA对半胱天冬酶-2的压制或半胱天冬酶-2活性的药理抑制(Z-VDVAD-FMK、Q-VD-OPH)取消了所有的凋亡标志。
(iv)半胱天冬酶-2活性的抑制应当在SD的起始时进行，以提供细胞保护，加强了半胱天冬酶-2更早和关键的作用。
(v)因为SD诱导的凋亡也是Bax依赖性的，半胱天冬酶-2的激活可以通过允许天然Bax切割为p18片段来介导Bax的上游控制，并不依赖于钙蛋白酶。然而天然和切割的Bax转位并整合进外线粒体膜以半胱天冬酶-2依赖性的方式诱导了Δψm的降低并促进细胞色素C释放以及下游事件。
(vi)半胱天冬酶-2被处理成p14的形式是SD过程中自我切割的结果并且严格地弥散于胞浆中，因而排除了半胱天冬酶-2细胞器特异性或细胞核功能。整个长时间SD过程中半胱天冬酶-2独有的胞浆定位指出了SD过程中激活的特别机制的证据。
半胱天冬酶依赖性与半胱天冬酶非依赖性神经元细胞死亡的比较
受试的三个光谱半胱天冬酶抑制剂中，只有Q-VD-OPH在皮质SD神经元中提供了显著的半胱天冬酶抑制和存活。这个第三代泛半胱天冬酶抑制剂展现了增强的抗凋亡特性，并不限于神经元，可能因为最好的细胞通透性(氨基末端喹啉基团)、特异性和羧基末端O-苯氧基团的有效性(与经典的氟甲基/氯甲基酮比)。因而，对于神经生物学Q-VD-OPH似乎比旧一代抑制剂Z-VAD-FMK和BOC-D-FMK有更大的用途。神经元培养模型中多个半胱天冬酶的抑制一般提供瞬时或部分保护而没有所有凋亡标志的保存。为了这个的原因很可能是因为部分线粒体半胱天冬酶非依赖性途径或(上游半胱天冬酶非依赖性)线粒体途径的激活，其中涉及半胱天冬酶抑制的线粒体检查点下游没有阻止细胞色素C的释放，但是将任务(commitment)延伸到死亡。例如，DOC-D-FMK拯救的剥夺神经生长因子(NGF)的交感神经元显示了形态的保存，没有蛋白质合成和电生理浆膜特性的恢复。相反地，似乎是如果特异性半胱天冬酶-2失活或压制发生在线粒体前水平并因而阻止细胞色素C的释放和下游依赖性事件，那么SD神经元几乎展现了保存的形态(细胞体和轴突网络)。
与半胱天冬酶激活相反，已经报告了MMP在急性和慢性神经退行性紊乱中细胞死亡调节的作用。然而，从表I可见，线粒体或PTP直接干扰没有提供SD神经元显著的存活。这样的化合物显著保护性的缺乏指出线粒体不太可能是SD范例中更加上游的检查点。根据本发明得到的数据支持了半胱天冬酶-2在一些急性神经元死亡模型中在线粒体上游起作用，执行半胱天冬酶-3和-9在线粒体下游起作用。
另外，其它信号和代谢主要途径的药理性抑制没有阻止SD激发的细胞死亡(见表I)。不能排除全部化合物的作用被忽略并且精心的联合可以提供细胞保护。最后，如期望地，只有放线菌素D和环己酰亚胺促进经受了SD的皮质神经元的存活，提示转录/翻译后事件可以参与这个死亡模型。确实，大分子的原位转录和翻译对于一些神经元凋亡模型中的细胞死亡是不可缺的：环己酰亚胺阻止剥夺NGF的交感神经元Δψm丢失和细胞色素C释放，放线菌素D阻断剥夺了NGF/血清的幼稚和分化的PC12细胞的细胞死亡。
SD皮质神经元中线粒体前半胱天冬酶-2的激活
本发明支持一开始就需要促进失活(Z-VDVAD-FMK)或沉默(siRNAC2 wt)时很高神经元存活的线粒体前半胱天冬酶-2的模型(图8)。
惊人地，半胱天冬酶-2-/-小鼠能存活并且除了(由新生期加速的凋亡而不是神经元形成的降低造成的)面部运动神经元数量减少外没有展现异常的神经元表型。令人惊讶地，虽然交感神经元在NGF撤除时发生凋亡并且受到反义半胱天冬酶-2的保护，半胱天冬酶-2缺失的交感神经元比野生型神经元更加有效地发生凋亡。另外，来自这些小鼠的海马神经元是抗μ-淀粉样肽的。
RNA干扰对皮质神经元中瞬时半胱天冬酶-2压制的诱导阻止了补偿机制，这允许清楚地证明半胱天冬酶-2在神经元死亡中的参与。
虽然半胱天冬酶-2的亚细胞定位可以了解其激活的机制，它的精确亚细胞分布仍然有争议(Golgi复合体、线粒体、细胞核和胞浆)，可能是因为细胞类型、死亡刺激剂、GFP融合蛋白质的过度表达和用于检测半胱天冬酶-2的抗血清的不同。令人惊讶地，甚至在长时间SD过程中在皮质神经元中检测到了弥散的和胞浆池分布的组成性半胱天冬酶-2，因而排除了半胱天冬酶-2在皮质神经元SD细胞死亡中细胞核或细胞器特异性功能。SD过程中半胱天冬酶-2细胞核的重新分布的缺失和皮质神经元中半胱天冬酶-2胞浆分布是刺激剂依赖性的事实都提示了SD神经元胞浆中半胱天冬酶-2激活的特殊机制。有趣地，Z-VDVAD-FMK也降低了癫痫发作诱导的神经元死亡，该模型中检测了海马神经元胞浆和细胞核中的半胱天冬酶-2。半胱天冬酶-2染色也主要在PC12细胞的胞浆，许多核中有一至两个焦点，在剥夺NGF的细胞中这个模式基本上未变。和SD范例一起，这些数据赞成半胱天冬酶-2从细胞质诱导凋亡，这挑战了半胱天冬酶-2介导的细胞死亡在细胞核水平激活的实际共识。
使用敏感的Δψm染料，显示SD神经元中细胞内半胱天冬酶-2活性发生在Δψm破坏和细胞色素C的释放之前，这与促凋亡Bcl-2成员起的作用是相容的。所述数据与Bax在神经元发育过程中是必需的并且对于促进营养因子剥夺后神经元中线粒体细胞色素C释放和细胞死亡是关键的这个前面的结果相符合。
体内缺血过程中半胱天冬酶-2作为靶点
考虑到将siRNA递送到脑内的困难性，为了证明在半胱天冬酶-2水平体内治疗干预的概念，设计了第一个能够抑制特异性半胱天冬酶-2的基于O-苯氧基和喹啉的肽。
最近介绍地(Melnikov等人，2002；Caserta等人，2003；Lecoeur等人，2004)，Q-VD-OPH是可以获得的唯一基于O-苯氧基和喹啉的抑制剂，但不是选择性的。SD范例中Z-VAD-FMK神经保护性的缺乏联合它阻断体外半胱天冬酶-2切割活性的事实，强调了氨基末端喹啉基团提供的细胞通透性的获得。本发明者使用的模板Q-VDVAD-OPH很好地阻断了体外和细胞内半胱天冬酶-2的活性，因而促进了SD神经元的存活。
SD、缺氧或葡萄糖的剥夺是体内脑或心肌缺血的组分。有证据证明缺氧-缺血(H-I)新生鼠模型中核心和周围大面积的凋亡而不是坏死。新生鼠脑缺血导致了有DNA损伤和细胞死亡的凋亡机制的细胞死亡的延迟。P7大鼠崽中有再灌注的瞬时局部缺血导致了DNA片段化、凋亡的形态学特征和线粒体途径的激活。
本发明者证明了5mg/Kg i.p.给予高度有效并细胞可通透的半胱天冬酶-2抑制剂Q-VDVAD-OPH，大大地降低经受了这样的实验性新生瞬时H-I损伤的大鼠崽的梗死大小(74％)。Q-VDVAD-OPH的极端效能与以前这个模型中得到的结果极度相反，显示全半胱天冬酶抑制剂BOC-D-FMK没有诱导这样显著的梗死体积的降低。因为这个H-I模型似乎是半胱天冬酶-2依赖性的，这些发现与我们对SD神经元中BOC-D-FMK相对无效性的观察相符合，与重组半胱天冬酶-2体外VDVAD酶活性相反。另外，这个化合物没有神经保护性，尽管以前的工作证明在Rice-Vannucci模型中缺氧-缺血之后有显著的保护性。实际上，BOC-D-FMK提供了Renolleau模型中60％动物的恶化。证据提示生理和非致死性半胱天冬酶的激活造成了轴突导向和突触重塑，因为(i)突触可塑性中涉及的一些蛋白质(GluR1-4 AMPA受体亚基、Cam激酶、PKC相互作用蛋白质、MAP和酪氨酸激酶)也是半胱天冬酶的底物，(ii)Z-VAD-FMKC治疗的小鼠展现了损伤的记忆。活生物体中全半胱天冬酶的抑制能够从凋亡切换到坏死、肿瘤发生或者细胞稳态的破坏，这能够导致损伤恶化、癌症或自身免疫疾病。因而，由于全半胱天冬酶抑制剂给予的延长造成的生理半胱天冬酶激活、毒性和副作用的改变也能限制它们在慢性神经退性病变的治疗中的用途，因而加强了对急性和慢性疾病半胱天冬酶的优先选择性抑制的需要。如果全半胱天冬酶的抑制能够提供H-I损伤的部分降低，它是否因为促凋亡或者促炎症半胱天冬酶或者两个都有就不太清楚。有趣地，因为这个有再灌注的新生鼠中风模型在临床上尤其与新生儿出生时缺氧-缺血脑病相关，小肽抑制剂对半胱天冬酶-2的抑制可以提供一些替代治疗以保存新生儿中风中的神经元而没有全半胱天冬酶抑制过程中会发生的副作用。另外，因为促炎症性半胱天冬酶-1介导的对IL-1β和聚(ADP-核糖)合酶(PARS)的处理的特异性抑制也适度地降低了缺血损伤后的细胞死亡，这个提供了半胱天冬酶-1或PARS抑制剂与半胱天冬酶-2抑制联合的合理性。
鉴于本发明者得到的结果，选择性干扰线粒体前半胱天冬酶-2似乎是减弱神经元细胞死亡的相关工具。这些结果允许至少在神经元细胞死亡范例中内源性途径与孤儿半胱天冬酶-2激活的和解，并描绘了起始半胱天冬酶和内源性线粒体途径之间新的连接。急性神经元凋亡可以依赖起始半胱天冬酶-2的上游激活，它通过对Bax诱导的线粒体功能障碍和其后半胱天冬酶依赖性神经元破坏的控制而进行。证明了半胱天冬酶-2也是新生儿中风中与好的神经保护性预后有关的靶点，因为体内半胱天冬酶-2的失活导致了瞬时局部缺血过程中梗死体积大大的降低。
实验步骤
原代皮质神经元的分离和培养
从E14 SWISS小鼠胚胎(Janvier)培养原代皮质神经元。颈椎脱位处死小鼠，剖腹取出胚胎。提取大脑皮层，使用1000μl枪头(Eppendorf)在L15培养基(Gibco BRL)中机械粉碎组织15分钟，然后去除碎屑，细胞悬浮液在850rpm离心10分钟。神经元以高密度(每cm2 7×105个活细胞)在补充了1％谷氨酰胺、5％马血清(HS，Eurobio)和2.5％胎牛血清(FCS，Eurobio)的Eagle氏基础培养基(Eurobio)中接种于之前用1mg/ml聚乙烯亚胺(Sigma)包被6或24孔平板(Sarstedt)或4孔Lab-Tek有小室的盖玻片(Nalge NuncInternational)。在DIV3，每天更换培养基，神经元在含有180mg/l葡萄糖、5％HS和1％FCS的N5完全培养基和3μM胞嘧啶-β-D-阿拉伯糖苷(Sigma)以及1μM 5-甲基-10，11-二氢-5H-二苯环庚烯-5，10-亚胺马来酸酯(MK-801，Sigma)。用抗微管相关蛋白质2的单克隆抗体(MAP-2，Sigma)和抗神经胶质原纤维酸性蛋白质多克隆抗体(GFAP，Dako)控制培养物的纯度(＞95％)。使用DIV6-DIV9之间的神经元。
药理试剂对凋亡的诱导和神经保护试验
在DIV6用血清剥夺(SD)诱导细胞死亡。简而言之，如下进行血清撤除：N5完全培养基中培养的神经元快速在无HS和FCS的N5中清洗3次，在无或有药理试剂的存在下在没有血清的N5培养基中培养24个小时。或者，用离子霉素、十字孢碱、喜树碱、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)、3-硝基丙酸(3NPA)、硝普钠(SNP)(全部够自Sigma)或者β-淀粉样肽(25-35)(Bachem)处理24小时也诱导细胞死亡。在SD或(N5完全培养基中)药物处理起始时加入神经保护试验的试剂。它们在它们本身不诱导毒性作用的浓度使用。环孢菌素A、4，4′-二异硫氰酸二苯乙烯-2，2′-二磺酸二钠盐(DIDS)、钉红(ruthenium red)、癸泛醌(decylubiquinone)、1，2-二(2-氨苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸乙酰氧甲酯(BAPTA-AM)、3-甲基腺嘌呤、bafilomycin A1、雷怕霉素、来普霉素B、N-苄氧羰基-Phe-Phe-氟甲基酮(Z-FF-FMK)、胃酶抑素、冈田酸、微囊藻素LR、H-7、阿司匹林、渥曼青霉素、染料木黄酮、乳胞素、epoxomycin、Trolox；N-乙酰-半胱氨酸、谷胱甘肽、放线菌素D、亚胺环己酮购自Sigma；N-苄氧羰基-Val-Ala-Asp(Ome)-氟甲基酮(Z-VAD-FMK)、BOC-Asp(OMe)-氟甲基酮(BOC-D-FMK)、喹啉-Val-Asp-(OMe)-CH2-O-Ph(Q-VD-OPH)、N-苄氧羰基-Phe-Ala-氟甲基酮(Z-FA-FMK)、N-苄氧羰基-Asp-Glu(Ome)-His-Asp(Ome)-氟甲基酮(Z-DEVD-FMK)、N-苄氧羰基-Leu-Glu(Ome)-His-Asp(Ome)-氟甲基酮(Z-LEHD-FMK)、N-苄氧羰基-Leu-Glu(Ome)-Thr-Asp(Ome)-氟甲基酮(Z-LETD-FMK)、N-苄氧羰基-Val-Asp(Ome)-Val-Ala-Asp(Ome)-氟甲基酮(Z-VDVAD-FMK)购自ICN；ICN进行了喹啉-Val-Asp(Ome)-Val-Ala-Asp(Ome)-CH2-O-Ph(Q-VDVAD-OPH)的定制合成；4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟(AEBSF或Pefabloc SC)来自Roche；N-乙酰-Leu-Leu-NorLeu-al(钙蛋白酶抑制剂I或ALLN)，N-乙酰-Leu-Leu-Met-al(钙蛋白酶抑制剂II或ALLM)、反环氧琥珀酰-L-亮氨酰氨基-(4-胍)丁烷(E64d)、MDL-28170、SB 202190、PD 98059、SP 600125来自Merck/VWR。
原代皮质神经元中凋亡动力学分析的仪器使用
使用配备了100瓦水银短弧光灯和x 40 N PLAN L目镜或水浸x 100N PLAN目镜的DM IRB倒置荧光显微镜(Leica)在以前染色的神经元上进行多探针荧光显微测定(FM)。通常，通过在大约200-600细胞/视野上对每个实验5-10个随机选择的视野评分的FM和更高样品通量的流式细胞仪(FC)进行定量研究。为了这个后者，如前面描述地(Lecoeur等，2004)在对染色的神经元胰蛋白酶消化后进行凋亡和相关事件的多参数分析。使用配备了15mW空气冷却的488nm氩激光的3色FACSCalibur细胞仪(Becton Dickinson)进行FC。
Δψm、半胱天冬酶激活、PS暴露、PMP和NA的多重探针分析
如前面描述地用FC和FM进行测量(Lecoeur等，2004)。用Δψm敏感的染料5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′-四乙基苯并咪唑基碳花青碘(JC-1，分子探针)掺入(Smiley等，1991)。神经元在37℃装载1μM JC-130分钟。对于FM，同时获取绿(单体，低Δψm)和橙色(J-聚集物，高Δψm)荧光(BP 450-490激发/LP 515长途径发射滤片)。用FC在F1-1通道检测JC-1单体。通过F2-2通道检测J-聚集物(Lecoeur等，2004)。或者，也用60nM MitoTracker红(CMXRos；分子探针)来评价Δψm并通过FM检测(BP 515-560激发滤片/LP 590发射滤片)。用羰基氰化物间氯苯腙(mClCCP，100μM，45分钟)来进行Δψm破坏的阳性对照。使用特异性FAM结合肽(称为荧光团标记的半胱天冬酶的抑制剂，FLICA，CaspaTaqTM荧光素半胱天冬酶活性试剂盒，Q-Biogen，Illkirch，法国；ApoFluoTM半胱天冬酶检测试剂盒，ICN，Orsay，法国)：FAM-VDVAD-FMK、FAM-DEVD-FMK、FAM-LETD-FMK和FAM-LEHD-FMK分别检测激活的半胱天冬酶-2、-3、-8和-9。神经元与FLICAs(1∶150，CaspaTaqTM或1∶500，ApoFluorTM)在37℃孵育1小时，然后在清洗缓冲液中清洗三次。对于FM，通过BP 480/40滤片激发FAM结合肽，通过BP 527/30滤片收集发射的光。FL-1通道进行FC分析(Lecoeur等，2004)。通过FITC结合的膜联蛋白V(Immunotech)的固定来检测磷脂酰丝氨酸(PS)暴露于浆膜的外叶。通过7-氨基放线菌素D(7-AAD，Sigma)与核DNA结合的增加来检测浆膜通透性(PMP)，并通过FM进行分析，如前进行FC(Lecoeur等，2004)。核用1μM Hoechst 33342染色(30分钟)，用FM(BP 340-380激发滤片/LP 425长途径滤片)进行分析。如前面神经元中定义地评价核的凋亡(NA)(Lecoeur等，2004)。
细胞色素C、Bax、半胱天冬酶-2和半胱天冬酶-3的免疫检测
生长在Lab-Tek小室切片的神经元用4％多聚甲醛/0.19％苦味酸固定20分钟，用PBS中0.01％Triton-X 100通透5分钟，然后用PBS中10％FCS封闭30-45分钟。室温下进行所有的免疫染色。抗体用PBS中1％牛血清白蛋白(Sigma)稀释。然后，使用小鼠单克隆IgG1抗细胞色素C(1小时；1∶200；克隆6H2.B4，BD Pharmingen)和AlexaFluor594羊抗小鼠IgG的F(ab′)2片段(1小时，1∶200；分子探针)作为第二抗体染色神经元。相似地，使用抗小鼠缺失了羧基末端21个氨基酸的Bax α的兔多克隆抗体(1小时，1∶100；Δ21，Santa Cruz生物技术)研究Bax的转位，并用FITC-羊抗兔IgG抗体(1小时，1∶100；分子探针)进行检测。在FM下计数相应于每个实验每个条件下150-300个随机选择细胞的大约10个视野上显示了弥散胞浆细胞色素C或Bax点状标记的细胞。使用大鼠单克隆抗小鼠半胱天冬酶-2抗体(10C6，Alexis Biochemicals，San Diego，CA，美国；1∶100，1小时)和AlexaFluor594羊抗大鼠IgG的F(ab′)2片段(1小时，1∶100，分子探针)作为第二抗体检测细胞内半胱天冬酶-2。FC细胞内证明了激活的半胱天冬酶-3(Lecoeur等人，2004)。为了进行，神经元胰蛋白酶消化，在含有1％PFA和20μg/ml放线菌素D(Sigma)的PBS中固定20分钟。然后，神经元重新悬浮在100μl含有20μg/ml 7-AAD和20μl藻红蛋白结合的多克隆兔抗半胱天冬酶-3抗体(BD Pharmingen)的PBS/1％BSA/0.05％皂甙Quilaja树皮(Sigma)30分钟。
RNA干扰
双链siRNA相应于小鼠半胱天冬酶-2基因的序列(AACACCTCCTAGAGAAGGACA；核苷酸185-203；siRNA C2 wt)。设计相同序列中有四个突变的无活性siRNA(AACATCTACTCG AGACGGACA；siRNA C2m)。siRNA C2 wt序列递交到BLAST确保其特异性。从Proligo购买(RP-HPLC纯化的)退火的siRNA双体。24孔平板(7×106个/孔)或Lab-Tek有4个小室的盖玻片(1.33×106个/孔)中在DIV6的神经元培养物使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染siRNA(3.8μg)6个小时。然后在经受或没有经受24小时SD或离子霉素处理之前清洗神经元并且放回完全N5培养基再16个小时。
RT-PCR分析
在24孔(1.33×106个神经元)或6孔(7×106个神经元)平板中用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)根据生产厂商的推荐直接进行RNA提取。使用SupercriptTM II RNase H-逆转录酶(Invitrogen)进行逆转录。从Proligo购买PCR引物：Bax正向引物
5′-AGAGGCAGCGGCAGTGAT-3′，Bax反向引物
5′-AGACACAGTCCAAGGCAGTGG-3′；半胱天冬酶-2正向引物
5′-GAGCAATGTGCACTTCACTGG-3′，半胱天冬酶-2反向
5′-CCACACCATGTGAGAGGAGTG-3′；半胱天冬酶-2正向引物
5′-AGCTGGAGCCGTCACAGCC-3′，半胱天冬酶-9反向引物
5′-CTCCGCCAGAACCAATGTCC-3′；GAPDH正向引物5′-
GGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3′，GAPDH反正引物5′-
CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC-3′。扩增条件是94℃1分钟，之后对于Bax是94℃30秒、58℃30秒、72℃1分钟30个循环，然后72℃15分钟；对于半胱天冬酶-2和半胱天冬酶-9是94℃30秒、54℃30秒、72℃1分钟的35个循环或者对于GADPH是25个循环，然后72℃15分钟。在PCR之后，20μl在1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，拍照前条带用溴化乙锭通过UV投射照明显现条带。GADPH用作扩增的内部对照。
细胞质制备和亚细胞分离
在4℃50μl的补充了完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)的CSF缓冲液(220mM甘露醇，68mM葡萄糖，5mM丙酮酸盐，0.5mMEGTA，MgCl2 2mM，NaCl 2mM，KH2PO4 2.5mM，二硫苏糖醇1mM，细胞松弛素B 20μM和10mM Hepes，pH7.5)收集神经元(6孔平板中7×106个)，然后在液氮中五个冻融循环裂解。样品在4℃900g离心以去除核和未破裂细胞，之后是10,000g离心30分钟以获得富含线粒体的重膜组分。然后样品在4℃100,000g离心10分钟以获得微粒体粒。用Bradford试验方法对蛋白质浓度测定之前材料重新悬浮于25mM Tris-HCl pH7.4，25mM NaCl，5mM EDTA，1％Triton X-100。10μg每个组分用于Western印迹分析。
蛋白质提取和Western印迹分析
室温下在补充了完全蛋白质抑制剂鸡尾酒(Roche)的25mMTris-HCl pH7.4，25mM NaCl，5mM EDTA，1％Triton X-100种裂解神经元。使用Bio-Rad蛋白质试验试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白质(半胱天冬酶-2 30μg；Bax 10μg)在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到PVDF膜(Amersham)。使用ECL(Amersham Pharmacia Biotech)揭示免疫染色。在1∶1000稀释度使用单克隆抗小鼠半胱天冬酶-2抗体(11B4，Alexis Biochemicals)；在1∶200稀释度使用抗小鼠缺失了羧基末端21个氨基酸的Bax α的多克隆抗体(Δ21，Santa Cruz生物技术)；在1∶1000稀释度使用抗Bax α氨基末端(识别残基11至30)的多克隆抗体(N20，Santa Cruz生物技术)。肌动蛋白(42kDa；Sigma；1∶5000)用作相等上样的对照。用小鼠单克隆抗热休克蛋白质(Sigma；1∶400)对热休克蛋白质60(HSP60)的免疫印记用于检查富含线粒体的重膜组分的纯度。
体外重组半胱天冬酶-2对VDVAD-AMC切割
在100μl试验缓冲液(50mM HEPES，pH7.4，100Mm NaCl，0.1％CHAPS，10mM DTT，1mM EDTA，10％甘油)中评估人重组半胱天冬酶-2的活性(BIOMOL QuantiZymeTM试验系统)。30分钟后在37℃在荧光微量平板阅读仪上通过监测在405nm激发之上的510nm荧光发射测量重组半胱天冬酶-2(125U)对50μM VDVAD-AMC的切割。为了VDVAD酶活性的抑制，在其后与50μM VDVAD-AMC孵育(30分钟，37℃)之前在半胱天冬酶-2存在下抑制剂在37℃预孵育30分钟。VDVAD-AMC单独没有观察到显著的荧光背景。
围产期缺血
当小崽在3-4天大时新生Wistar大鼠(围栏(dam)+每窝9个小崽)得自Janvier(Le Genest-St-Isle，法国)。小崽与它们的围栏一起安置，12:12h光亮-黑暗循环，食物和水可自由获得。根据法国和欧共体饲养和使用实验动物指导方针进行动物实验。如前面描述地(Renolleau等，1998)对7天大的大鼠进行缺血。腹腔内注射水合氯醛(350mg/kg)麻醉大鼠崽。麻醉大鼠腹部朝上平躺，在颈部制造中位切口以暴露左颈总动脉。然后大鼠置于右侧卧，在耳朵和眼睛之间制造一个斜的皮肤切口。颞肌切除之后，从额缝去除颅骨至低于颧弓水平。然后，就在嗅裂之上出现的暴露的左中脑动脉在脑静脉下方水平凝结。这个步骤后，放置一个夹子以堵塞左总动脉。然后大鼠放在孵育箱中以避免体温过低。50分钟后，取出夹子。在显微镜的帮助下证实颈动脉血流的恢复。然后关闭颈部和头盖皮肤切口。手术过程中，体温维持在37-38℃。小崽转移到孵育箱(32℃)直到恢复，然后放回它们的围栏内。
缺血开始前5分钟腹腔内给予50μg/10g重量(在100μl中)剂量的半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPH n＝15，Q-VDVAD-OPH n＝14)。对照动物(n＝15)接受了等体积的含有10％DMSO的0.9％生理盐水，需要载体来溶解半胱天冬酶的抑制剂(载体处理的组)。缺血过程中或处死前的死亡率在Q-VD-OPH、Q-VDVAD-OPH和载体处理组之间没有不同(＜4％)。再灌注后48小时处死大鼠，取出大脑。由不知道动物治疗的观察者对梗死损伤(苍白区)进行视觉评分。在放大镜下观察没有明显缺血苍白区的大脑。摒弃没有展现明显MCA堵塞的那些大鼠(Q-VD-VAD处理组中2只动物)。大脑然后在4％缓冲甲醛固定2天。恒冷切片机上切五十微米的冠状大脑切片，收集在明胶包被的切片。选择从前纹状体至后海马的十六个切片(相应于Paxinos大鼠大脑图谱中平板9至27)，取等距离的0.5mm间隔。使用成像分析仪(NIH成像软件)在甲酚紫染色的切片上测量损伤区域，各个冠状切片之间的距离用于计算梗死体积。
如下进行统计分析。假设β危险度0.2，α危险度0.05，估计需要每组15-16个动物以检测两组之间50％梗死体积的降低。从以前的研究中抽取数据(Ducroq等人，2000)。因为实验中比较了三组动物，这些数值只是提供信息的。有六个动物的方块(block)的预先确定列表用于在三个组之间随机分配动物。对于治疗条件完全不知的研究者进行所有的测量。通过Kruskall-Wallis的非参数多重比较检验评估平均值之间的差异，之后对于非参数的数值用的是Newman-Keul检验。我们认为在5％水平的差异是有显著性的(P＜0.05)。
实施例IV：用于人半胱天冬酶-2沉默的特异性siRNA的设计
为了进一步应用于人类(缺血和其它)损伤和疾病设计用于人半胱天冬酶-2基因压制的特异性siRNA(hsiRNA C2 wt)。这个siRNA双体由下面互补的序列组成：
SEQ ID No 6 5′-caucuucuggagaaggacadTdT-3′
SEQ ID No 7 5′-uguccuucuccagaagaugdTdT-3′
基于Robertson模型(Robertson等人，2002)开发了一个实验方法以检测所述siRNA，它显示Z-VDVAD-FMK对半胱天冬酶-2的抑制部分降低了Jurkat T细胞中细胞色素C释放和磷脂酰丝氨酸残基的暴露。
然后VP-16处理的Jurkat细胞中进行药理性半胱天冬酶-2的抑制(Z-VDVAD-FMK，Q-VD-OPH；所有都来自ICN)或半胱天冬酶-2基因的压制(siRNA)。
人细胞中siRNA的确认
用泛半胱天冬酶Q-VD-OPH(25-100μM)或选择性半胱天冬酶-2抑制剂Z-VDVAD-FMK(25-100μM)预处理阻止了DNA损伤和拓扑异构酶II抑制剂VP-16诱导的细胞死亡(图18)。对于很大范围浓度的VP-16获得了在7-8小时的存活(图18)。Z-VDVAD-FMK阻断Δψm丢失的事实提示在这个范例中半胱天冬酶-2激活发生在线粒体的上游。相应地在图19中，数据显示
(i)Z-DEVD-FMK、Z-LEHD-FMK、Z-LETD-FMK不会取消进行性Δψm丢失，但是只有Z-VDVAD-FMK或Q-VD-OPH会；
(ii)Z-DEVD-FMK、Z-LEHD-FMK、Z-LETD-FMK不会阻碍半胱天冬酶-2的激活，提示了半胱天冬酶-2是所研究的更加上游的半胱天冬酶-2；
(iii)半胱天冬酶-9抑制阻止了半胱天冬酶-3的激活但是半胱天冬酶-2抑制不会阻止半胱天冬酶-9的激活，显示半胱天冬酶-3通过半胱天冬酶-9被激活；
(iV)Z-VDVAD-FMK、Q-VD-OPH阻止了绝大部分终末核改变和PMP，Z-LEHD-FMK阻止程度较小；
(v)ANT阻断剂BA减弱了Δψm丢失和PMP，证实线粒体介导激活的半胱天冬酶-2的促调亡作用的作用；
(vi)VP16-半胱天冬酶-2依赖性细胞死亡不依赖于翻译和转录，因为CHX和ActD既没有阻止Δψm丢失也没有阻止PMP；
(vii)半胱天冬酶-8依赖性途径在这个模型中不重要，因为Z-LETD-FMK不能阻止Δψm丢失、半胱天冬酶-2和-3的激活、核改变和PMP。最后，全部的数据指出了模型的证据，其中线粒体前半胱天冬酶-2的激活诱导Δψm降低并促进下游事件，象半胱天冬酶-9/半胱天冬酶-3激活的激活、核凝聚/片段化和终末PMP。
这个范例允许指向半胱天冬酶-2的人siRNA的测试和确认。首先，hsiRNA C2 wt能够分别降低HeLa和Jurkat细胞中前半胱天冬酶-2蛋白质的表达(如图20A中Western印迹分析中显示地)。如用流式细胞仪通过siRNA-FITC的荧光检测细胞内评估地，转染所有的细胞，。一旦这些细胞被转染，它们也受到保护免受其后VP16的7小时的处理(图21A-B)，证明了hsiRNA C2 wt的有效性。
实验部分
细胞培养：
Jurkat细胞购自ATCC(克隆E6-1)并且以100000-120000细胞/孔(24孔板)的密度培养于补充了10％胎牛血清的RPMI 1640(富含Glutamax)中。Jurkat E6-1细胞(ATCC号TIB-152)是Jurkat细胞系的衍生系Jurkat-FHCRC(Schneider等(1977)以前从14岁男孩的外周血建立地并且原先由JM设计地)的一个克隆。实验使用7-14代的细胞。
凋亡诱导和细胞保护试验
在其后VP16(VP16或足叶乙甙；Sigma)处理(10-20μM)7-8个小时之前细胞用各种药理试剂预处理30分钟至1小时。对于siRNA实验，在VP16处理之前，细胞用3.8μg siRNA(Proligo)/2μLlipofectamine 2000(在500μl中)处理24小时。鼠半胱天冬酶-2(ID No 1-2或ID No 3-4)用作阴性对照。通过siRNA-FITC(ID No1-2、ID No 3-4或ID No 6-7)的荧光检测(流式细胞仪，FL-1)细胞内检查转染产量。
流式细胞仪和荧光显微镜对凋亡参数的研究
流式细胞仪
双JC-1/7-AAD染色：DYm敏感染料5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′四乙基苯并咪唑基羰花青碘(JC-1，分子探针，1μM)的掺入评估线粒体跨膜电位(Δψm)。在FL-1和FL-2通道分别获得绿(低Δψm)和橙色(高Δψm)荧光。用7-放线菌素D(7-AAD；0.02mg；Sigma)掺入(FL-3通道)检测PMP。或者，进行双DioC6(0.1μM)/PI(5×10-3mg)染色并在FL-1和FL-2通道分别检测。每个条件至少获取7000个事件。
荧光显微镜
使用特异性FAM结合肽(称作荧光团标记的半胱天冬酶的抑制剂，FLICA：CaspaTagTM荧光素半胱天冬酶活性试剂盒，Q-Biogen，IIIkirch，法国；ApoFluorTM半胱天冬酶检测试剂盒，ICN，Orsay，法国)：FAM-VDVAD-FMK、FAM-DEVD-FMK、FAMLETD-FMK和FAM-LEHD-FMK分别检测激活的半胱天冬酶-2、-3和-9。细胞与FLICA(1∶150，CaspaTag TM或者1∶500，ApoFluorTM)37℃孵育1小时，然后在清洗缓冲液中清洗三次。对于FM，通过BP 480/40滤片激发FAM结合肽，通过BP527/30滤片收集发射光。通过7-氨基放线菌素D(0.02mg7-AAD，Sigma)对核DNA结合的增加(通过BP 515-560滤片激发并通过LP590长途径发射滤片收集荧光)检测浆膜通透性(PMP)。用1μMHoechst 33342染色细胞核(30分钟)并进行分析(BP 340-380激发滤片/LP 425长途径滤片)。通过JC-1(1μM，30分钟)评估线粒体跨膜电位：1.2s激发(BP 450-490激发/LP 515长途径发射滤片)后同时记录绿色和橙色荧光。
实施例V：shRNA
shRNA的构建和确认
实时siRNA能够跨越血脑屏障，它们在生物液体中不稳定，因而要克服的困难障碍将是体内细胞内递送。最近，一些突破强调了病毒是siRNA递送很好的载体。例如，许多实验基因治疗研究选择的转基因递送载体逆转录病毒或腺病毒，已经被工程构建以在体外和体内细胞中递送和稳定表达治疗siRNA。确实，siRNA的重组版本：生产小发夹(sh)RNA(在小RNA启动子的控制下组成性siRNA表达为发夹环版本)以阻止这个问题。例如通过局部脑给予(例如脑室内注射)能将shRNA的表达引入慢病毒骨架，这能用于体内稳定转染神经元，应当导致靶基因的永久沉默。
为了细胞内产生稳定的siRNA结构，开发了小发夹结构的概念，包括由短序列联结并且接了pol III聚合酶的终末信号(TTTTT)的siRNA的正义和反义序列的表达。这个序列从H1 RnaseP或U6小核RNA基因开始在pol III启动子的控制下并导致转染细胞内大量小发夹siRNA(shRNA)的表达。当然DICER对环部分的快速处理导致了功能性siRNA的形成。最近，开发了一个质粒(pGE-1)(Stratagene)并且我们使用了这个shRNA哺乳动物表达载体以提供有效率的靶基因的长期抑制。从(U6启动子控制的)由环序列分开的正义和反义链组成的RNA转录物中产生shRNA。RNA转录物向着自己折叠回去形成发夹。为了抑制哺乳动物细胞中靶基因的表达对pGE-1表达载体进行优化。为了获得含有特异于鼠半胱天冬酶-2的shRNA的表达载体，设计了两个寡核苷酸(图22A)，由被环序列分开的两个反转重复序列组成，并接了作为RNA聚合酶III的转录终止子的6个核苷酸多(T)串。
SEQ ID No 8 5′-GATCCCgcacctcctagagaaggacaGAAGCTTGtgtccttctctaggaggtgTTTTTT-3′
SEQ ID No 9 5′-CTAGAAAAAAcacctcctagagaaggacaCAAGCTTCtgtccttctctaggaggtgCGG-3′
两个寡核苷酸退火之后，我们获得了sh-插入体(图22B)，它被克隆进pGE-1载体的BamH I和Xba I位点。PCR筛选阳性克隆后，我们选择了2个克隆(shRNA6和shRNA9)。对这些克隆进行测序，显示了sh-序列在U6启动子控制下的正确的插入。
为了确认这些shRNA构建体作为半胱天冬酶-2下调的工具，3T3细胞(鼠细胞)用载体shRNA6和shRNA9转染，通过半胱天冬酶-2的Western印迹检查转染后24和48小时3T3细胞总提取物中的表达水平(图23)。
似乎shRNA6和shRNA9构建体能够下调转染后48小时3T3细胞中半胱天冬酶-2的表达。这个结果显示shRNA策略作为体内沉默半胱天冬酶-2表达的工具是有用的。确实，靶向半胱天冬酶-2mRNA的sh-插入体能被引入一些病毒骨架(慢病毒、腺病毒、Semliki病毒或有治疗领域应用的任何病毒骨架)，因而允许有效的体内递送和半胱天冬酶-2表达有效和长期的沉默。
另外，获得了应用于人类的特异性shRNA构建体：
SEQ ID No 10 5′-GATCCCGcatcttctggagaaggacaGAAGCTTGtgtccttctccagaagatgTTTTTT-3′
SEQ ID No 11 5′-CTAGAAAAAAcatcttctggagaaggacaCAAGCTTCtgtccttctccagaagatgCGG-3′
实验部分
合成有5′Bam H I和3′Xba I悬突的两个互补寡核苷酸(Proligo)。退火步骤后，这些寡核苷酸克隆进预消化的(BamH I/Xba I)pGE-1载体(Stratagene)。PCR选择含有插入体的阳性克隆之后，扩增两个克隆，证实了它们的序列(shRNA6和shRNA9)。
一天前接种于6孔平皿的3T3细胞在6个小时中用lipofectamine2000试剂和0.8μg shRNA6或shRNA9质粒进行转染。使用GFP载体监测转染的水平。转染24和48小时后，细胞收集在裂解缓冲液(25mMTris-HCl pH7.4，25Mm NaCl，5mMEDTA，1％Triton X-100)并且使用Bradford试剂(BioRad)测定蛋白质浓度。在12.5％聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上分离蛋白质并转移到PVDF膜(Amersham)上。用特异于半胱天冬酶-2的抗小鼠单克隆抗体(11B4，AlexisBiochemicals，在1∶1000稀释度使用)检测后，用化学发光试剂盒(ECL，Amersham)检测免疫反应性。
表1.半胱天冬酶在原代皮质神经元SD相关凋亡的调节中起关键作用。
  受试化合物   []，μM   特异性靶点/活性   存活
  放线菌素D   0.016   RNA合成   是
  环己酰亚胺   1   重新蛋白质合成   是
  Q-VD-OPH   100   广谱半胱天冬酶   是
  z-VAD-fmk   100   广谱半胱天冬酶   否
  BOC-D-fmk   100   广谱半胱天冬酶   否
  癸基-辅酶Q   10   复合物III呼吸链；PTP   否
  DIDS   50   阴离子通道；VDAC(PTP)   否
  环孢菌素A   1   Cyclophylin D(PTP)   否
  钉红   50   线粒体钙摄入；VDAC(PTP)   否
  雷怕霉素   1   雷怕霉素的哺乳动物靶点(mTOR)或FKBP12-雷怕霉素相关蛋白质(FRAP)   否
  3-甲基腺嘌呤   1000   溶酶体pH(碱化诱导)   否
  Bafilomycin A1   1   溶酶体空泡型H+-ATP酶   否
  z-FA-fmk   100   组织蛋白酶B样活性   否
  z-FA-fmk   150   组织蛋白酶L样活性   否
  胃酶抑素   50   组织蛋白酶D样活性  否
  E64d   100   钙蛋白酶+组织蛋白酶B、H、L样活性  否
  ALLN   25/150   钙蛋白酶I/20S蛋白酶体  否/否
  ALLM   25/150   钙蛋白酶II/20S蛋白酶体  否/否
  MDL-28170   1-100   钙蛋白酶I+II  否
  Pefabloc AEBSF   100   丝氨酸蛋白酶活性  否
  乳胞素   0.1-10   20S蛋白酶体  否
  Epoxomicin   0.1-10   20S蛋白酶体  否
  BAPTA-AM   50   细胞质钙库的选择性螯合  否
  aminopurva lanol   500   细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)1，2，5  否
  roscovitine   250   CDK1，2，5  否
  SB 202190   50   p38分裂素激活的蛋白激酶(MAPK)  否
  PD 98059   50   分裂素激活的蛋白激酶激酶(MEKI)  否
  SP 600125   50   Jun N-末端激酶(JNK)  否
  染料木黄酮   100   酪氨酸激酶  否
  渥曼青霉素   100   磷酸肌醇3′(PI2)激酶  否
  阿斯匹林   100   IKK  否
  H-7   100   PKC(＞＞PKA/PKG)  否
  冈田酸   0.01   磷脂酶：PP2A  否
  微囊藻素LR   1-100   磷脂酶：PP1+PP2A  否
  Trolox   100-1000   抗氧化剂  否
  N-乙酰半胱氨酸   100-1000   抗氧化剂  否
  谷胱甘肽   100-1000   抗氧化剂  否
  Leptomycin B   0.05   含有核运出信号的蛋白质的核胞浆转位  否
表格显示SD模型中测试的广泛类型的药理试剂能够或不能促进存活，即组织Δψm破坏、NA、PS暴露、PMP、半胱天冬酶激活和轴突改变。所有这些化合物在SD开始时加入。VDAC：电压依赖性阴离子通道；PTP：通透性转移孔。
                   参考文献
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                              序列表
<110>THERAPTOSIS SA
<120>防止和处理细胞死亡的方法及其生物学应用
<130>CP/60995-PCT
<150>FR 03 06 190
<151>2003-05-22
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<170>PatentIn version 3.1
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Claims (47)

1.阻止、遮掩/沉默细胞死亡中半胱天冬酶-2活性的抑制剂。
2.根据权利要求1的半胱天冬酶-2抑制剂，其中所述细胞是神经元。
3.根据权利要求1的半胱天冬酶-2抑制剂，其中所述细胞是神经元细胞系。
4.根据权利要求1的半胱天冬酶-2抑制剂，其中所述细胞是非神经元细胞系。
5.根据权利要求1至4中任何一个的半胱天冬酶-2抑制剂，其中半胱天冬酶-2抑制剂是能够特异性靶向半胱天冬酶-2mRNA以降低或抑制半胱天冬酶-2表达的分离的双链RNA分子。
6.根据权利要求5的半胱天冬酶-2抑制剂，沉默神经元中半胱天冬酶-2的表达。
7.根据权利要求5的半胱天冬酶-2抑制剂，沉默神经元细胞系中半胱天冬酶-2的表达。
8.根据权利要求5的半胱天冬酶-2抑制剂，沉默非神经元细胞系中半胱天冬酶-2的表达。
9.根据权利要求5至8中任何一个的RNA分子，包含由15-25个核苷酸优选地19-25个核苷酸的互补链组成的双链双体。
10.根据权利要求5至9中任何一个的RNA分子，包含互补的SEQID N°1和SEQ ID N°2的双体或互补的SEQ ID N°6和SEQ ID N°7的双体。
11.根据权利要求5的RNA分子，包含基于根据权利要求5至10中任何一个的siRNA序列之shRNA构建体，所述构建体导致细胞内半胱天冬酶-2的沉默。
12.根据权利要求11的RNA分子，包含SEQ ID N°1和SEQ ID N°2，或SEQ ID N°6和SEQ ID N°7，或SEQ ID N°8和SEQ ID N°9，或SEQ ID N°10和SEQ ID N°11的插入。
13.根据权利要求11或12的RAN分子，它导致了神经元或神经元细胞系中细胞内半胱天冬酶-2的沉默。
14.根据权利要求11或12的RNA分子，它导致非神经元细胞中细胞内半胱天冬酶-2的沉默。
15.具有SEQ ID N°5的分子对半胱天冬酶-2活性的体外抑制。
16.具有SEQ ID N°5的分子对半胱天冬酶-2活性的体内抑制。
17.能够破坏Bax和半胱天冬酶-2之间相互作用或阻止半胱天冬酶-2依赖性Bax切割的分子。
18.源自3至40个氨基酸长的包括序列IQD(例如：SEQ ID 12-23)的Bax序列并且能够与Bax中半胱天冬酶-2切割的推测位点竞争的肽
SEQ ID N°12：KTGAFLLQFIQDRAGRMAGETP
SEQ ID N°13：GAFLLQGFIQDRAGRMAGETP
SEQ ID N°14：FLLQGFIQDRAGRMAGETP
SEQ ID N°15：LQGFIQDRAGRMAGETP
SEQ ID N°16：GFIQDRAGRMAGETP
SEQ ID N°17：FIQDRAGRMAGETP
SEQ ID N°18：IQDRAGRMAGETP
SEQ ID N°19：IQDRAGRMAGE
SEQ ID N°20：IQDRAGRMA
SEQ ID N°21：IQDRAGR
SEQ ID N°22：IQDRA
SEQ ID N°23：IQDR
19.根据权利要求16的分子，为了破坏半胱天冬酶-2和Bax之间的相互作用，在氨基末端或羧基末端与肽或非肽分子结合，产生(在或不在特异性识别之后)能够进入细胞的嵌合分子。
20.根据权利要求16的分子，为了阻止或处理凋亡或提供线粒体保护性细胞保护作用，在氨基末端或羧基末端与肽或非肽分子结合，产生(在或不在特异性识别之后)能够进入细胞的嵌合分子。
21.根据权利要求16的3至10个氨基酸长的分子，包括在氨基末端或羧基末端与标记物(例如：产荧光的(AMC、AFC、PE...)、显色的(pNA...)或生物发光底物、放射同位素...)结合的序列IQD。
22.药物组合物，包含治疗有效量的、与药物可接受载体联合的根据权利要求1至21中任何一个的至少一种半胱天冬酶-2抑制剂。
23.根据权利要求22的药物组合物，包含有效量的根据权利要求5至10中任何一个的至少一种化合物。
24.根据权利要求22的药物组合物，包含有效量的根据权利要求11至14中任何一个的至少一种化合物。
25.根据权利要求22的药物组合物，包含有效量的SEQ ID N°5。
26.根据权利要求22的药物组合物，包含有效量的根据权利要求17至20中任何一个的至少一种分子。
27.根据权利要求22至26任何一个的药物组合物，用于口服、局部(例如，浸透了化合物或药物组合物的Gelfoam的脑室内、脑内植入、用于机械递送的设备的脑内植入)或全身(例如：腹腔内、静脉内...)给药以降低细胞死亡。
28.根据权利要求22至26中任何一个的药物组合物，用于包括缺氧-缺血(H-I)H-I(有或没有缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情形(例如，脑衰、肾衰、心衰)的病理情形的治疗。
29.根据权利要求22至26中任何一个的药物组合物，用于包括脑缺氧-缺血(H-I)(有或没有缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情形(例如，脑衰、肾衰、心衰)的病理情形的治疗。
30.根据权利要求22至26中任何一个的药物组合物，用于特别是总体或病灶H-I(有或没有缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情形(例如，脑衰、肾衰、心衰)中神经元死亡的治疗。
31.根据权利要求22至26中任何一个的药物组合物，用于特别是成人或新生儿H-I(有或没有缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情形(例如，脑衰、肾衰、心衰)中神经元死亡的治疗。
32.根据权利要求22至26中任何一个的药物组合物，用于特别是成人或新生儿H-I(有或没有缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情形(例如，脑衰、肾衰、心衰)中神经元死亡的治疗。
33.根据权利要求22至26中任何一个的药物组合物，用于特别是暂时或永久H-I(有或没有缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情形(例如，脑衰、肾衰、心衰)中神经元死亡的治疗。
34.根据权利要求22至26中任何一个的药物组合物，用于特别是H-I(有或没有缺氧/低血糖的缺血)损伤和有或无再灌注情形的中风样情形(例如，脑衰、肾衰、心衰)脑损伤的神经元死亡的治疗。
35.根据权利要求22至26中任何一个的药物组合物，用于特别是中脑动脉阻塞(MCAO)中神经元死亡的治疗。
36.根据权利要求22至26中任何一个的药物组合物，用于特别是当至少一个或多个如下病理事件联合时神经元死亡的治疗：有或没有再灌注的在大脑水平或全身水平的总体或病灶、暂时或永久、成人或新生儿H-I(有或没有缺氧/低血糖的缺血)。
37.根据权利要求任何一个的药物组合物：
-为了预防和/或治疗慢性退行性疾病过程中的凋亡，例如神经退行性疾病，包括阿尔兹海默病、享廷顿病、帕金森氏病、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化、脊髓延髓萎缩、朊病毒病，或者
-为了预防和/或治疗脊髓损伤过程中的凋亡，或者为了预防和/或治疗创伤性脑损伤造成的凋亡，或者
-为了提供神经保护作用，或者
-为了提供脑保护作用，或者
-为了预防和/或治疗与自身免疫疾病和移植排斥相关联的细胞毒性T细胞和天然杀伤细胞介导的凋亡，或者
-为了预防心脏细胞的细胞死亡，包括心衰、心肌病、心脏病毒感染或细菌感染、心肌缺血、心肌梗死和心肌缺血、冠状动脉旁路移植，或者
-为了预防和/或治疗，例如化学治疗或HIV治疗造成的结果之线粒体药物毒性，
-为了预防病毒感染或细菌感染过程中的细胞死亡，或者
-为了预防和/或治疗炎症或炎性疾病、炎性肠病、脓毒症和脓毒性性休克，或者
-为了预防从滤泡至卵母细胞期、从卵母细胞至成熟卵期和精子(例如，冷冻和移植卵巢组织、人工授精方法)的细胞死亡，或者
-为了在化学治疗后保存女人和男人的生育能力，或者
-为了保存雌性和雄性动物的生育能力，或者预防和/或治疗斑点变性和青光眼，或者预防和/或治疗急性肝炎、慢性活动型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎，或者
-为了预防头发脱落和由于雄性模式秃头、放射、化学治疗或情绪应激的所述头发脱落，或者
-为了治疗或改善皮肤损伤(由于暴露于高水平的放射、热、烧伤、化学试剂、太阳和自身免疫疾病)，或者
-为了预防骨髓增生综合征(MDS)中骨髓细胞的细胞死亡，或者
-为了治疗胰腺炎，或者
-为了治疗呼吸综合征，或者
-为了治疗骨关节炎、风湿性关节炎、牛皮癣、肾小球肾炎、动脉粥样硬化和移植物抗宿主疾病，或者
-为了治疗视网膜周边细胞凋亡、视网膜神经元凋亡、青光眼、缺血造成的视网膜损害、糖尿病视网膜病，或者
-为了治疗与凋亡增加相关联的疾病状态，或者
-为了预防植物(例如：植物、花朵、藻菌植物(蘑菇、海藻)...)中的细胞死亡。
38.阻断或阻止细胞死亡体外的方法，包括筛选与细胞死亡特别是凋亡有关的治疗性分子。
39.阻止细胞死亡的方法，包括根据给定的诱导方法，在给定的细胞类型中，对凋亡相关事件的分级之测定以及干扰凋亡过程更近端的可逆转检查点的阻断。
40.根据权利要求39的方法，包括联合神经元中快速定量流式细胞仪和定量/定性荧光显微镜分析。
41.根据权利要求39的方法，包括联合非神经元细胞中快速定量流式细胞仪和定量/定性荧光显微镜分析。
42.根据权利要求39的方法，包括联合神经元细胞系中快速定量流式细胞仪和定量/定性荧光显微镜分析。
43.根据权利要求39或42的方法，其中所述检查点是半胱天冬酶-2。
44.根据权利要求39或42的方法，其中所述检查点是半胱天冬酶。
45.根据权利要求39或42的方法，其中所述检查点是非相关的半胱天冬酶激活。
46.根据权利要求39至42中任何一个的方法的用途，用于开发可靠的实时流式细胞仪，以监测应答包括MPTP处理的毒性损伤或保护性治疗的Δψm和质膜完整性。
47.根据权利要求39至42中任何一个的方法的用途，用于开发可靠的实时流式细胞仪，以监测应答包括MPTP处理的毒性损伤或神经保护性治疗的Δψm和质膜完整性。
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