KR100397275B1 - 단방향성 안티센스 ｃＤＮＡ 라이브러리 구축을 통한 신규대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템 - Google Patents

단방향성 안티센스 ｃＤＮＡ 라이브러리 구축을 통한 신규대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 (unidirectional antisense cDNA library)의 구축을 통한 신규 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템 (Novel high-throughput system for functional genomics)에 관한 것으로, 구체적으로 1) 제 4세대 안티센스 기술을 이용하여 안티센스 cDNA 라이브러리를 구축하는 단계; 2) 안티센스 cDNA 라이브러리의 구축으로 얻은 단일 클론 중 일정크기 이상의 cDNA 단편을 가진 것을 선별하는 단계; 3) 상기에서 선별된 단일 클론을 배양하여 단일가닥의 폐쇄형 안티센스 분자를 얻는 단계; 4) 상기 안티센스 분자를 이용하여 안티센스 분자-전달체 복합체를 형성하는 단계; 5) 마이크로플레이트에서 상기 안티센스 분자-전달체 복합체를 세포주에 형질감염(transfection)한 후 1차적인 유전자 기능검색을 수행하는 단계; 및 6) 1차적인 유전자 기능검색 결과를 토대로 선정된 클론의 DNA 염기서열을 분석한 후 DNA 데이터 베이스를 이용하여 동정 (identification) 하고, 아직 기능이 밝혀져 있지 않은 미지의 유전자 기능을 2차적으로 분석하는 단계로 구성된 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템은 기능이 밝혀져 있지 않은 미지의 유전자를 검색하고 기능을 분석할 수 있을 뿐 아니라 난치성 질환에 대한 안티센스 치료제의 후보자를 선별하는데 있어서도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

단방향성 안티센스 ｃＤＮＡ 라이브러리 구축을 통한 신규 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템{Novel high-throughput system for functional genomics using unidirectional antisense cDNA library}
본 발명은 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 (unidirectional antisense cDNA library) 및 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리 (unidirectional subtracted antisense cDNA library) 의 구축을 통한 신규 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템 (Novel high-throughput system for functional genomics)에 관한 것으로, 구체적으로 1) 제 4세대 안티센스 기술을 이용하여 안티센스 cDNA 라이브러리를 구축하는 단계; 2) 안티센스 cDNA 라이브러리의 구축으로 얻은 단일 클론 중 일정크기 이상의 cDNA 단편을 가진 것을 선별하는 단계; 3) 상기에서 선별된 단일 클론을 배양하여 단일가닥의 폐쇄형 안티센스 분자를 얻는 단계; 4) 상기 안티센스 분자를 이용하여 안티센스 분자-전달체 복합체를 형성하는 단계; 5) 마이크로플레이트에서 상기 안티센스 분자-전달체 복합체를 세포주에 형질감염(transfection)한 후 1차적인 유전자 기능검색을 수행하는 단계; 및 6) 1차적인 유전자 기능검색 결과를 토대로 선정된 클론의 DNA 염기서열을 분석한 후 DNA 데이터 베이스를 이용하여 동정 (identification) 하고, 아직 기능이 밝혀져 있지 않은 미지의 유전자 기능을 2차적으로 분석하는 단계로 구성된 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템에 관한 것이다.
인간 게놈의 유전정보가 대부분 해독되면서 선진 발명 기관을 중심으로 새로운 유전자의 검색과 기능 분석을 위해 활발한 발명이 진행되고 있다. 새로운 유전자의 검색과 기능 분석은 세포의 생존뿐만 아니라 질병과 관련된 복잡한 생화학적, 생리적 물질대사를 이해하는데 많은 정보를 제공하고 있다. 이들은 궁극적으로 난치성 질병의 발병 기전을 밝히고, 세포내 혹은 세포간의 관계를 효율적으로 조절할 수 있게 함으로써 질병에 대한 효과적인 치료를 가능하게 한다.
안티센스 (Antisense ; AS) 기술은 목적 유전자의 발현을 차단함으로써 발생되는 현상에 기초하여 유전자의 기능을 분석하도록 고안되어 사용되었다. 안티센스 분자 (Antisense molecules)란 목적 유전자의 염기서열과 상보적이며 역순인 염기서열을 갖는 인위적인 합성 DNA 물질 혹은 RNA 전사체를 말한다. 안티센스 분자는 이론적으로 상보적인 목적 유전자의 염기서열 인식과 전사체 제거를 통하여 유전자의 발현을 특이적으로 감소시킬 수 있다. 따라서 유전자 산물의 상호 유연관계 및 기능 분석 발명에 대단히 유용할 수 있다. 근년에는 안티센스의 유전자 발현 억제 능력을 활용하여 유전자의 과발현으로 의해 발생하는 질병을 치료할 목적으로 분자 치료제의 개발 발명이 주로 진행되고 있다.
안티센스 작용 기전은 주로RNaseH의 활성으로 이루어진다.RNaseH는 DNA-RNA 혼성체를 특이적으로 인식한 후 RNA를 선택적으로 분해하는 효소이다. 즉, 외부에서 공급된 안티센스 분자가 목적 mRNA와 상보적으로 결합하면 전사체가RNaseH의 활성에 의해 분해됨으로써 단백질 합성이 저해되는 것이다. 또 다른 안티센스 작용 기전은 안티센스 DNA가 결합된 mRNA가 단백질 합성의 주형으로서의 기능을 상실토록 하는 것이다. 즉, DNA-RNA 결합에 따라 라이보좀의 결합 및 진행을 방해함으로써 불완전한 단백질이 만들어지거나 단백질 합성이 되지 않도록 하는 기전을 통해 안티센스 작용을 한다. 그 외 안티센스 DNA가 게놈 DNA 선상의 프러모터에 결합한 후 트리플 헬릭스 (triple helix)를 형성하고 그 결과 mRNA 합성 과정인 전사를 억제하기도 한다. 이렇듯이 안티센스 작용기전은 이론적으로 목적 유전자에만 특이적으로 결합하여 작용하기 때문에 유전자의 기능을 분석하는데 매우 우수한 장점을 가질 수 있다.
이러한 연구의 일환으로서 개발된 제 1세대 안티센스 약물은 포스포다이에스테 (phosphodiester : PO) 구조로 구성된 자연형의 합성 올리고뉴클레오타이드인데 제 1세대는 핵산분해효소 (nuclease)에 대단히 취약한 단점을 가지고 있었다. 따라서 핵산분해효소에 대한 안정성을 개선하기 위해 올리고뉴클레오타이드의 포스페이트 (phosphate) 연결구조를 화학적으로 변조 (modification)한 것이 제2세대 안티센스이며, 이러한 것에는 포스포로치오에이트 (phosphorothioate), 메틸포스페이트 (methylphosphate) 등이 알려져 있다. 포스포로치오에이트는 포스페이트의 산소 한 개가 황으로 치환된 올리고머로서, mRNA에 대한 결합력은 자연형 DNA 보다 떨어지나 뉴클레아제에 대하여 강한 내성을 보이며, 생체외 (in vitro) 또는 생체내 (in vivo) 실험에서 약리활성을 가짐이 확인되었다. 그러나 화학적으로 변조된 안티센스 올리고는 상보적 염기서열에 대한 결합 특이성의 저하 혹은RNaseH 활성의 저하 및 혈액응고 지연 등의 다양한 문제점들을 노출시켰다.
상기 제 2세대 안티센스 약물 중, 현재 그 일부는 항바이러스제, 항암제로서 임상시험 중에 있으며, 항바이러스제로서 시판중인 것도 있다 (Bennett et al., "Antisense Oligonucleotides: is the glass half full or half empty"Biochem. Pharmacol., 55, 9-19, 1998). 그러나 이들은 독성, 면역반응 유발 등의 문제점을 가지고 있어서 (Stein et al.,Current Opinion in Oncology, 6, 587-594, 1994 ; Krieg et al,Nature, 374, 549, 1995 ; O'Brien et al.,Leukemia, 8, 2156, 1994) 이러한 단점을 보완할 수 있는 안티센스 약물의 개발을 위한 새로운 전략들이 대두되었는데, 올리고뉴클레오타이드의 포스페이트 골격을 아마이드나 에테르 등으로 바꾸는 방법, 뉴클레오타이드의 염기 구조를 변화시키는 방법 및 리보오스 당의 구조를 변화시키는 방법에 관한 연구 등이 이에 해당된다 (De Mesmaeker et al., "Antisense Oligonucleotides"Acc. Chem. Res., 28, 366-374, 1995).
또 다른 일련의 제 2세대 안티센스로는 올리고뉴클레오타이드의 당의 구조에 변화를 준 올리고머가 있다. 이러한 당의 구조에 변화를 준 올리고머에는 2' 위치에 메톡시, 메톡시에톡시 (Martin et al.,Helv. Chim. Acta., 186, 584, 1995) 또는 아미노알콕시기 (Griffey et al.,J. Med. Chem., 39, 5100-5109, 1996)가 도입된 올리고머, 헥소오스 (hexose) 함유 올리고머 (Herdewijn et al., In Carbohydrate Modifications in Antisense Research; ACS Symposium Series 580; Sanghvi, Y. S., Cook, P. D., Eds.; American Chemical Society: Washington, DC, 1994; pp 80-99), 펜토오스 (pentose) 함유 올리고머 (Moser et al., Strategies and Chemical Approaches toward Oligonucleotide Therapeutics. In Perspectives in Medicinal Chemistry; Testa, B. et al., Eds.; Verlag Helvetica Chimica Acta: Basel, 1993, pp 275-97), 4'-아미노리보오스 (4'-aminoribose) 함유 올리고머 (Scharer et al.,J. Am. Chem. Soc., 117, 6623-6624, 1995), 4'-치오리보오스 (4'-thioribose) 함유 올리고머 (Bellonet al., 4-Thio RNA: a novel class of sugar-modified B-RNA. In Carbohydrate Modifications in Antisense Research; ACS Symposium Series 580; Sanghvi, Y. S., Cook, P. D., Eds.; American Chemical Society: Washington, DC, 1994; pp 68-79) 및 이들의 유도체 등이 있다.
제 2세대에서는 안정성을 부여하기 위해 분자 자체에 화학적 치환을 도입하였으나 여전히 유전자 기능 분석에 있어서 몇 가지 중대한 단점을 가지고 있다. 첫째, 화학적 변형에 따른 비특이성 유발 및 세포독성 등의 부작용으로 유전자 기능을 분석하는데 있어 왜곡된 결과를 초래할 수 있다. 둘째, 합성 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 대부분 15∼28 mer로 목적 유전자에 작용할 효율적 안티센스 작용 부위를 찾는 필수적 과정을 거쳐야만 한다. 셋째, 염기 합성 오류에 의한 안티센스 작용부위에 대한 결합 특이성이 떨어져 안티센스의 활성 효율이 떨어질 가능성이 높다. 넷째, 고가의 합성 기기 및 시약으로 인한 생산비용이 높다. 다섯째, 목적 전사체에 대한 불완전한 안티센스 활성으로 인한 유전자 기능 누출 가능성이 있다. 제 1세대 및 제 2세대 안티센스의 이러한 문제점을 해소하기 위해 본 발명자들은 폐쇄형 안티센스로서 CMAS (closed multiple antisense)와 RiAS (ribbon type antisense)등의 제 3세대 안티센스 분자를 개발하였고, 이러한 분자가 혈장과 세포질에서 실제 우수한 안정성을 나타낼 뿐만 아니라 높은 안티센스 활성을 나타낸다는 사실을 보고하였다 (Moon et al.,J. Biol. Chem., 275, 4647-4653, 2000). 제 3세대 안티센스 분자는 기존의 여러 문제점들을 상당히 개선하였으나, 역시 합성에 따른 고비용과 상대적으로 긴 길이에 따른 합성의 효율성 (elongation coefficiency)에 문제점을 갖고 있다.
제 1세대 내지 제 3세대 안티센스 분자가 가지는 상기 문제점들을 근본적으로 해결하기 위해 본 발명자들이 개발한 제 4세대 안티센스는 단일가닥의 길이가 대단히 긴 폐쇄형 안티센스 DNA 분자이며 세균 세포를 감염하는 단일가닥의 DNA 게놈을 가진 재조합 박테리오페이지로부터 제조된다. 제 4세대 안티센스는 기존의 안티센스 분자에 비해 소량의 사용으로도 월등한 안티센스 효과를 나타낼 수 있으며, 전사체의 전체 염기서열을 대상으로 안티센스의 길이를 자유롭게 제작할 수 있다. 더불어 목표 설정 과정도 필요치 않을 뿐만 아니라 매우 안정하며, 단방향성안티센스 cDNA 라이브러리를 제작함으로써 수천 또는 수만의 다양한 종류의 안티센스를 쉽게 생산할 수 있고, 미생물을 통한 대량 생산이 용이하며 생산 비용 또한 저렴하다는 큰 장점들을 가진다. 이러한 제 4세대 안티센스의 장점을 활용하여 유전자 기능 분석에 적용하면 비용 절감과 더불어 신속성, 정확성을 기할 수 있으며 무엇보다 대량으로 분석할 수 있을 것으로 기대된다.
이에 본 발명자들은 기존의 유전자 검색 시스템은 단순히 유전자 검색의 역할만을 수행할 수 밖에 없으며, 검색된 유전자의 기능을 분석하기 위해서는 별도의 시스템을 부수적으로 구축해야 하는 문제점을 해결하기 위하여, 제 4세대 안티센스 기술을 이용하여 특정 또는 질환관련 세포주가 발현하는 전체 전사체의 cDNA로부터 단방향성인 동시에 선택적인 (unidirectional and subtracted) 안티센스 cDNA 라이브러리를 구축하였고, 이를 이용하여 기능이 밝혀져 있지 않은 미지의 유전자를 검색하고 기능을 분석할 수 있을 뿐 아니라 난치성 질환에 대한 안티센스 치료제의 후보자를 선별하는데 있어서도 효과적인 결과를 기대할 수 있는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템 (Novel high-throughput system for functional genomics using unidirectional antisense cDNA library)을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 미지의 유전자와 각종 질병에 관련된 유전자의 기능을 신속·정확하게 대량으로 분석할 수 있는 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 및 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리를 이용하는 신규 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템 (novel high-throughput system for functional genomics using unidirectional antisense cDNA library)을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 랫트 TNFα-M13 안티센스 (rTNFα-M13AS)를 제작하는 모식도를 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 rTNFα-M13AS의 염기서열을 분석한 결과이고,
도 3a는 본 발명의 rTNFα-M13AS에 다양한 효소를 처리하여 rTNFα-M13AS가 단일 가닥임을 확인한 결과이고,
레인 1 ; rTNF-αcDNA를 포함하는 플라스미드 DNA(TNFα-plasmid),
레인 2 ; rTNF-αM13AS,
레인 3 ; 제한효소XhoI을 처리한 TNFα-플라스미드,
레인 4 ; 제한효소XhoI을 처리한 rTNF-αM13AS,
레인 5 ; S1 뉴클리아제를 처리한 TNFα-플라스미드,
레인 6 ; S1 뉴클리아제를 처리한 rTNF-αM13AS,
레인 7 ; 제한효소XhoI을 처리한 후 엑소뉴클리아제 III를 처리한 TNFα-플라스미드,
레인 8 ; 제한효소XhoI을 처리한 후 엑소뉴클리아제 III를 처리한 rTNF-αM13AS
도 3b는 본 발명의 rTNFα-M13AS가 뉴클리아제에 대하여 안정함을 확인한 결과이고,
레인 1 ; TNFα-플라스미드
레인 2 : rTNFα-M13AS
레인 3 ; TNFα-플라스미드 + 소 태아 혈청
레인 4 ; 제한효소XhoI을 처리한 TNFα-플라스미드 + 소 태아 혈청
레인 5 ; rTNFα-M13AS + 소 태아 혈청
레인 6 ; rTNFα-M13AS와 리포좀 복합체 + 소 태아 혈청
레인 7 ; TNFα-플라스미드 + 송아지 혈청
레인 8 : 제한효소XhoI을 처리한 TNFα-플라스미드 + 송아지 혈청
레인 9 ; rTNFα-M13AS + 송아지 혈청
레인 10 ; rTNFα-M13AS와 리포좀 복합체 + 송아지 혈청
도 4a는 본 발명의 rTNF-αM13AS에 의해 rTNF-α의 발현이 특이적으로 억제되는 것을 rTNF-α특이적 프라이머 쌍 및 β-액틴 특이적 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR로 확인한 결과이고,
레인 1 ; 리포좀, 레인 2 ; rTNFα-M13AS,
레인 3 ; rTNFα-M13 센스,
레인 4 ; rTNF-αcDNA를 포함하지 않는 단일가닥의 페이지미드
도4b는 본 발명의 rTNF-αM13AS는 rTNF-α의 발현만 특이적으로 억제하는 대신 다른 유전자의 발현에는 영향을 미치지 않는 것을 IL-1β및 GAPDH를 예로서 증폭하는 RT-PCR로 확인한 결과이고,
레인 1 ; 리포좀, 레인 2 ; rTNFα-M13AS,
레인 3 ; rTNFα-M13 센스,
레인 4 ; rTNF-αcDNA를 포함하지 않는 단일가닥의 페이지미드
도 4c는 본 발명의 rTNF-αM13AS에 의해 rTNF-α의 발현이 특이적으로 억제되는 것을 rTNF-α특이적 혼성화 탐침을 이용한 서던 블럿 분석으로 확인한 결과이고,
레인 1 ; 리포좀, 레인 2 ; rTNFα-M13AS,
레인 3 ; rTNFα-M13 센스,
레인 4 ; rTNF-αcDNA를 포함하지 않는 단일가닥의 페이지미드
도 5는 세포로부터 분비된 rTNF-α단백질을 ELISA로 정량하여 본 발명의 rTNFα-M13AS 분자에 의해 rTNF-α의 발현이 감소함을 확인한 결과이고,
레인 1 ; rTNFα-M13AS, 레인 2 ; rTNFα-M13 센스,
레인 3 ; M13SS, 레인 4 ; 리포좀
도 6a는 본 발명의 인간 NF-κB-M13AS에 의해 인간 NF-κB의 발현이 농도 의존성 양상으로 감소하는 것을 확인한 RT-PCR 결과이고,
도 6b는 본 발명의 인간 NF-κB-M13AS에 의해 인간 NF-κB의 발현이 억제되는 것을 NF-κB 특이적 혼성화 탐침을 이용한 서던 블럿 분석으로 확인한 결과이고,
도 7은 본 발명의 제 4세대 안티센스 기술을 이용한 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 (unidirectional antisense cDNA library)의 제작과정을 나타낸 것이고,
도 8은 본 발명의 제 4세대 안티센스 기술을 이용한 단방향성인 동시에 선택적인 (subtracted) 안티센스 cDNA 라이브러리의 제작과정을 나타낸 것이고,
도 9는 본 발명의 cDNA 라이브러리 구축을 통해 확보된 재조합 페이지미드 (phagemid) 중 일정크기 이상의 목적유전자를 가진 것을 선별하고올바르게 클로닝되었음을 크랙킹(cracking) 방법을 이용하여 확인한 결과이고,
C ; 대조군으로서 300 bp 삽입부 (insert)를 가진 단일 클론
도 10은 본 발명의 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 구축을 통한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템의 개요를 설명한 것이고,
도 11은 본 발명의 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템을 이용하여 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리를 제작한 후 크랙킹 방법으로 선별된 클론 중 일부를 DNA 염기서열 결정을 통해 동정한 예를 나타낸 것이고,
A ; 인간 RBP 56/hTAF Ⅱ (human RBP 56/hTAF Ⅱ),
B ; α-페토프로틴 (α-fetoprotein),
C ; 호모 사피엔스 염색체 17, 클론 hC (Homo sapienschromosome 17, clone hC)
도 12는 본 발명의 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템에 의한 유전자기능 분석 방법을 나타낸 것이고,
도 13은 본 발명의 대규모 유전자 검색 및 기능분석 시스템에 의한 유전자 기능분석의 일례로서, 정제한 단일가닥의 폐쇄형 안티센스 분자를 전달체와 복합체를 형성한 후 96 웰 마이크로플레이트 단위로 기능분석법 중 하나인 MTT 분석을 수행하여 암세포주의 성장을 저해하는 제4세대 안티센스 분자를 선별한 예를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단일가닥으로서 길이가 대단히 긴 제 4세대 폐쇄형 안티센스 분자 및 그의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 제 4세대 안티센스 제조기술을 이용하여 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 및 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 안티센스 cDNA 라이브러리를 이용한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.본원에서 사용하는 "표적(target) 유전자 또는 표적(target) mRNA"라는 용어는 제조된 안티센스-분자가 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열(센스서열)을 포함하는 유전자 또는 mRNA을 의미한다.본 발명은 핵산 분해효소에 대한 안정성 및 표적 mRNA 또는 표적 유전자에 대한 안티센스 반응 특이성이 우수하면서 길이가 긴 안티센스-분자를 제조하기 위하여, 폐쇄형의 단일가닥 게놈을 갖는 박테리오페이지로부터 유래하여 상기 페이지의 복제원점을 포함하는 페이지미드 벡터 및 헬퍼페이지 시스템을 이용하는 안티센스-분자의 제조방법을 제공한다.본 발명의 안티센스-분자 제조방법은,1) 하나 이상의 표적(target) 유전자 또는 표적 mRNA의 염기서열로부터 cDNA 단편을 제조하는 단계;2) 폐쇄형 단일가닥 (closed single strand) 게놈을 가지는 페이지로부터 유래하여 상기 페이지의 복제원점을 포함하는 페이지미드 벡터에 상기 단계 1)의 cDNA 단편을 안티센스 서열이 복제되는 방향으로 삽입한 재조합 페이지미드를 제조하는 단계; 및3) 상기 단계 2)의 재조합 페이지미드를 형질전환체에 도입한 후 헬퍼 페이지 (helper phage)를 감염시킴으로써, 표적 유전자 또는 표적 mRNA에 대한 안티센스 서열을 포함하고 폐쇄형 단일가닥 형태의 안티센스-분자를 대량으로 생산하는 단계를 포함한다.상기 제조방법을 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.우선, 상기 단계 1)의 cDNA 단편, 즉 삽입체(insert)를 제조하는 방법은, 하나 이상의 표적 유전자 또는 표적 mRNA의 염기서열로 부터 당업계에서 통상적으로 사용되는 여하한 방법을 포함한다. 일례로, 표적으로 하는 유전자를 발현하는 세포주로부터 전체 mRNA를 분리한 후, 표적 mRNA만을 분리하여 상기 표적 mRNA의 전체 또는 일부 염기서열을 RT-PCR로 클로닝하는 방법도 가능하다. 이를 위하여 올리고 뉴클레오타이드(프라이머)를 제작하는데, 상기 올리고 뉴클레오타이드에는 용이한 클로닝을 위하여 제한효소 인식부위를 포함할 수 있다.RT-PCR를 통해 제조되어, 겔로부터 분리한 cDNA 단편을 폐쇄형 단일가닥 게놈을 가지는 페이지에서 유래하여 상기 페이지의 복제원점을 포함하는 페이지미드 벡터에 삽입하여 재조합 페이지미드 벡터를 제조한다. 상기 재조합 페이지미드벡터를 대장균 등에 형질전환(transformation)시킨 후 이 형질전환체를 분리하여 -20℃에 보관하며, 염기서열 분석을 통하여 목적하는 유전자의 cDNA가 삽입되었는지 여부를 확인한다.상기 단계 1)에서 표적 유전자 (또는 표적 mRNA)는 암을 유발하는 원발암성 유전자(proto-oncogene)를 비롯하여 유전자의 이상 발현으로 유발되는 면역질환, 감염 질환, 대사 질환 및 유전성 질환 등의 발생과 진행에 관련된 유전자가 될 수 있다. 또한, 본원의 제조방법에 의하여 제조되는 안티센스-분자는 수백 내지 수천베이스(base)의 안티센스서열을 목적에 따라 여러개 포함할 수 있으므로, 하나 이상의 표적 유전자(또는 표적 mRNA)에 대한 안티센스서열을 포함하는 것이 가능하다. 본 발명자들은 바람직한 실시예에서 종양괴사 인자인 TNF-α및 NF-κB를 각각 표적 유전자로 하는 안티센스 분자를 제조하였다.또한, 상기 단계 2)에서 페이지미드 벡터는 폐쇄형 단일가닥 게놈을 가지는 페이지로부터 유래하여 상기 페이지의 복제원점을 포함하는 페이지미드 벡터인 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 선형 페이지(filamentous phage) f1 Ori(f1 복제 시작점)를 포함하는 벡터, 예를 들면 pBluescript(Stratagene, USA), pGEM-f(Promega, USA) 등의 페이지미드 벡터가 바람직하며, 본 발명자들은 바람직한 실시예로서 M13 박테이오페이지의 페이지미드 벡터인 pBluescript SK(-)를 사용하였다. 여기서 선형 박테리오페이지(filmentous bacteriophages)인 M13을 기반으로 하는 재조합 바이러스 벡터가 다양한 크기의 안티센스 염기서열을 받아들일 수 있으므로 유리하다. 그럼에도 불구하고, 다면체 구형(icosaheral shape)이며 단일가닥 폐쇄형 게놈을 갖고있는 여러종류의 박테리오페이지(예를 들면, φχ174 phages 등)를 사용할 경우 정해진 크기의 범위내에서는 안티센스의 클로닝 벡터로 사용이 가능하다.아울러, 단계 3)에서 생산된 안티센스-분자는 대장균 등 형질전환체에서 염기서열 교정(proof reading) 기능이 있는 DNA 중합효소(DNA polymerase)에 의해 복제되기 때문에, 화학합성된 안티센스-올리고와는 달리 안티센스 염기서열의 충실도가 대단히 우수하며, 세균세포의 대량 배양으로 다량의 안티센스-분자를 획득할 수 있으므로 화학합성에 따른 고비용의 문제가 발생하지 않는 추가적인 장점을 갖는다.또한, 본 발명은 상기의 제조방법에 따라 제조되어 핵산 분해효소에 대한 안정성이 뛰어나고 표적 mRNA (또는 표적 유전자)에 대한 안티센스 반응 특이성이 우수한 안티센스-분자를 제공한다.상기의 제조방법에 의해 생산된 본 발명의 폐쇄형 단일가닥 안티센스-분자는 표적 유전자 또는 표적 mRNA 염기서열의 일부분 또는 전체를 포함할 수 있다. 또한, M13 박테리오페이지는 구조상 여러개의 안티센스 염기서열을 단일가닥 분자 내에 위치시키는 것이 용이하며, 더불어 재조합 페이지미드에 의해 생산된 안티센스-분자는 표적 mRNA에 대하여 매우 충실한 염기서열을 갖는다. 본 발명자들은 길이가 708 bp인 TNF-αmRNA에 대한 안티센스 염기서열을 포함하는 M13 안티센스-분자를 제조하였는데, 이와 같이 표적 mRNA에 대한 안티센스 염기서열이 대단히 긴 경우에는 상보적으로 결합하고자 하는 안티센스 염기서열의 충실도가 크게 문제되지 않는다. 따라서, 본 발명의 안티센스-분자 제조방법은, 기존의 화학합성에 의해 생산되는 안티센스-올리고의 반응 특이성을 증진시키기 위하여 꼭 필요한 표적 mRNA의 2차 구조분석 후 특정한 인식부위(안티센스서열)를 선별하는 단계 등을 요하지 않으므로, 안티센스서열 선별에 필요한 시간과 노력을 절감하는 장점이 있다.이러한 장점은 단일 뉴클레오타이드(single nucleotide)에서의 빈번한 동질이상(polymorphism)의 발생이 발견되는 면역질환 및 유전질환 또는 HIV와 같은 저항성 균주의 발생이 문제되는 감염성질환에 대하여 포괄적으로 안티센스 활성을 가지는 분자치료제의 개발을 가능하게 한다.M13 박테리오페이지는 폐쇄형 단일가닥 DNA 바이러스(closed single strand DNA virus)로서, 현재까지는 Sanger의 방법을 통한 DNA 염기서열 분석(sequencing)이나 돌연변이 유발(mutagenesis)에 보편적으로 이용되어 왔으나, 본원에서와 같이 안티센스-분자를 제조하기 위하여 사용된 바가 전혀 없었으며, 대량생산과 분리가 쉽게 이루어 질 수 있는 장점 또한 가지고 있다. 따라서, 폐쇄형 안티센스-분자의 안정성과 M13 박테리오페이지의 생물학적인 배양을 활용하여 길이가 길고 대량생산이 용이한 단일가닥 M13 DNA에 기반을 둔 안티센스-분자를 제조하기 위해서 재조합 박테리오페이지 시스템이 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명자들은 상기의 안티센스 제조방법에 따라 재조합 M13 박테리오페이지 시스템을 이용하여 면역 유발성 싸이토카인인 TNF-αmRNA 및 전사인자(transcription factor)인 NF-κB mRNA에 대한 안티센스-분자를 단일가닥 M13 페이지 게놈의 일부로 제조하였다.종양 괴사 인자 알파(Tumor Necrosis Factor alpha, TNF-α)는 정상적인 면역반응 과정에 필요한 싸이토카인(cytokine)이지만, 이들이 과다생성되면 류마티스 관절염 등의 자가면역 질환, 알러지(allergy), 염증성 질환 및 패혈증 등의 면역학적 질환(immunopathology)의 발생 및 진행을 유도한다고 알려져 있다(Waszczykowska E, Robak E, Wozniacka A, Narbutt J, Torzecka JD, and Sysa-Jedrzejowska A.,Mediators Inflamm.,1999, 8(2), 93-100 ; Pulsatelli L, Dolzani P, Piacentini A, Silvestri T, Ruggeri R, Gualtieri G, Meliconi R, and Facchini A.,J. Rheumatol.,1999, 26(9), 1992-2001). 또한, 대표적 전사인자(transcription factor)인 NF-κB는 세포성장에 관여하는 여러 유전자의 전사를 활성화 하는것으로 알려져있다. 따라서, 재조합 M13 박테리오페이지 시스템을 이용하여 제조한 TNF-α 및 NF-κB에 대한 안티센스-분자는 상기 유전자의 이상 발현으로 인해 유발되는 질병의 발생 및 진행을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.상기의 제조방법에 따라 생산된 TNF-α 및 NF-κB에 대한 단일가닥 안티센스-분자들은 각각 3.7 Kb 크기로 708 bp의 TNF-α안티센스 염기서열 및 700 bp 크기의 NF-κB 안티센스 염기서열을 포함하고 있으며(도 2참조), 핵산 분해효소에 대한 안정성 및 표적으로 하는 mRNA에 대한 안티센스 반응 특이성이 우수하여 rTNF-α 및 NF-κB의 발현을 효과적으로 억제하며 안티센스 활성이 월등하게 향상되었음을 확인하였다(도 3, 도 6a및6b참조).실제로 TNF-α의 안티센스 염기서열만을 계산하면 기존에 본 발명자들이 보고한 RiAS-올리고에 비하여 10배 이상 안티센스 활성이 증가됨을 보였다. RiAS-올리고는 기존의 어떠한 선형(linear) 올리고 보다도 핵산 분해효소에 대한 안정성 및 안티센스 활성이 우수한 것으로 보고되었는데, 이러한 RiAS-올리고 보다 본 발명의 M13 안티센스-분자가 월등한 안티센스 활성을 나타내는 것은 M13 안티센스-분자가 기존의 안티센스-올리고 보다 매우 긴 안티센스 염기서열을 포함하고 있어, M13 안티센스-분자와 표적 mRNA (또는 표적 유전자)간의 상보적 결합이 향상된 때문인 것으로 사료된다.또한, 본 발명의 안티센스-분자는 길이가 길어서 리포좀 전달 효율(liposome delivery efficiency)이 좀더 플라스미드에 가까울 것으로 예상되며, 실제로 리포좀과 결합된 M13 안티센스-분자 복합체는 세포 내로의 흡수율이 증가하여 결과적으로 안티센스의 활성을 향상시킨다.한편, 본 발명의 M13 안티센스-분자는 cDNA의 클로닝 방향성에 따라, 표적 mRNA에 대한 안티센스 염기서열 이외에 암피실린(ampicillin) 내성유전자 및 β-갈락토시데아제 유전자(β-galactosidease, lacZ) 등의 페이지미드 벡터유래의 다른 유전자에 대한 안티센스 염기서열이 함께 포함될 수 있지만, M13 안티센스-분자에 의한 비선택적 저해 활성(non specific inhibition)은 관찰되지 않는다. 실제로, 안티센스-분자에 의한 비선택적 저해는 화학적으로 변조된 합성 올리고에 의해서 주로 관찰되며, 원핵세포 유전자(prokaryotic genes)와 진핵세포 유전자(eukaryotic genes)의 염기서열에 있어서의 상동성(homology)이 대부분의 경우 현저한 차이를 보인다는 사실과 플라스미드상에 존재하는 유전자가 원핵세포에서 유래한다는 사실 등을 고려할 때, 본 발명의 M13 안티센스-분자에 포함된 벡터유래의 유전자 염기서열과 표적 mRNA에 대한 안티센스 염기서열은 비선택적 저해를 유발하지 않을 것으로 보인다.기존의 합성 안티센스-올리고가 핵산 분해효소에 의해 쉽게 분해되는 단점을 보완하기 위하여 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 제조하기도 하는데, 이렇게 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드는 게놈에 재편입시 돌연변이를 유발할 수 있을 뿐만 아니라 혈액응고지연 또는 보체활성작용(complement activation) 등의 문제점을 유발하기도 한다. 하지만, 본 발명에서 제공하는 안티센스-분자는 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드가 아니기 때문에 인체 내에서 분해된 후 DNA 복제 혹은 수복 때 재 사용되더라도 돌연변이를 유발하지 않는 장점을 갖는다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 폐쇄형 단일가닥 게놈을 갖는 박테리오페이지를 이용한 제조 방법에 의해 생산된 제 4세대 안티센스 분자의 특징을 정리하면 하기와 같다.
첫째, 현저히 개선된 안티센스 활성을 나타낸다. 약 십만개의 세포에 0.1 ㎍의 제 4세대 안티센스 분자를 처리하여서 제거 대상 전사체의 완전한 제거가 통상적으로 이루어진다. 사용한 단일가닥의 핵산에서 실제 안티센스 일련염기가 차지하는 비율은 대개 전체 분자의 1/5 이하가 된다. 따라서, 실제 사용된 안티센스의 양에 대비한 안티센스 활성은 대단히 우수함을 알 수 있다. 제 4세대가 높은 안티센스 활성을 가지는 이유는 기존의 합성 안티센스 올리고에 비해 길이가 매우 길기 때문일 것으로 생각되는데, 실제로 안티센스 벡터내에서 차지하는 안티센스 염기의 길이가 짧아질수록 안티센스 활성은 현저히 감소한다.
둘째, 신속하고 정확한 안티센스 분자의 제작이 가능하다. 제 4세대 안티센스는 안티센스 벡터의 일부로서 제작되므로 플라스미드 벡터를 가지고 있는 재조합 대장균 세포에서 배양 후 단일가닥 폐쇄형 분자로서 분리될 수 있다. 박테리오페이지 게놈의 일부로서 대장균에서 복제되어 분리되므로 안티센스 일련의 염기서열은 기존의 합성 올리고와 비교할 때 월등히 정확하다.
셋째, 리포좀과 복합체를 형성할 경우 원활한 세포내 흡수가 일어난다. 짧은 길이의 합성 올리고는 리포좀과의 결합시에 DOTAP 등과 같은 특정의 양이온 리포좀과 결합하는 경우에 세포내에 전달된 후 효율적인 안티센스 활성을 나타낸다. 합성 올리고와는 달리 제 4세대 안티센스 분자는 전체 길이가 3,000 bp 이상일 수 있으며 여러 곳에서 부분적으로 2차 구조를 형성하므로 양이온 리포좀에 결합한 후의 세포내 전달은 플라스미드의 세포내 흡수와 유사한 양상을 나타낸다. 상기의 이유로 플라스미드의 세포내 전달에 사용될 수 있는 양이온 리포좀이 제 4세대 안티센스 분자의 세포내 전달에도 효율적으로 이용될 수 있다.
넷째, 안정성 개선으로 소량 사용이 가능하다. 폐쇄형 안티센스 합성 올리고는 기존의 핵산 올리고 분자보다 뛰어난 안정성을 나타낸다. 폐쇄형 합성 안티센스 올리고의 향상된 안정성은 엑소뉴클레아제의 활성 작용점의 소멸에 의한 것이므로, 제 4세대 안티센스 분자 역시 폐쇄형 분자로서 혈장의 존재 하에서 높은 안정성을 나타내며 양이온 리포좀과의 결합 시에는 더욱 안정화된다. 안티센스 분자의 안정성은 안티센스 기술의 성패여부를 결정짓는 가장 핵심적인 부분이므로 본 발명의 새로운 안티센스 분자가 우수한 안정성을 나타내는 것은 매우 고무적이다.
다섯째, 생산된 안티센스 분자의 염기서열이 자연상태의 핵산과 조성이 동일하며 대량생산이 용이하다. 제 4세대 안티센스는 박테리오페이지 게놈의 파생체인 페이지미드로서 수용 대장균에 도입된 후 대장균 자체의 DNA 복제 기전을 이용하여 생산되므로 화학적으로 변조되지 않은 자연상태의 핵산 조성을 가진다. 더불어 형질전환된 (transformed) 세균의 대량배양과 분리정제를 통하여 다량의 안티센스 분자 생산이 저렴한 비용으로 가능하다. 실제 안티센스 분자로 사용하는 고순도의 합성 올리고 제작은 고비용을 수반하므로 전임상 동물실험 혹은 임상실험의 장애요인으로 지적되어 왔다.
여섯째, 상이한 종류인 다중의 전사체 제거가 용이하다. 제 4세대 안티센스 분자는 단일가닥 벡터내에 크기의 제약을 받지 않고 안티센스 일련의 염기 (sequence)를 포함시킬 수 있다. 안티센스 일련의 염기서열은 길이가 3,000 bp 이상으로도 용이하게 제작될 수 있으므로 여러개의 상이한 안티센스 일련의 염기를 직렬로 위치시킬 수 있고, 따라서 여러개의 상이한 유전자 전사체의 동시 다발적인 제거를 목표로 하는 것이 가능하다. 이러한 특성은 암 등의 난치성 질환에서 여러 발암관련 유전자의 발현을 동시에 억제해야 할 경우 대단히 유용할 수 있는 특성이다.
일곱번째, 자연성 핵산 조성으로 독성이 낮다. 화학적으로 변조된 기존 제 2세대 안티센스와는 달리 대장균의 배양을 통하여 얻어진 자연성 핵산을 기본조성으로 하므로, 화학적 변조 핵산체에서 빈번히 관찰되던 비특이성, 독성 등의 문제가 현저하게 줄어들 것으로 예상된다.
여덟번째, 방향성을 갖는 (directional) cDNA 라이브러리에서 다수 (수천 혹은 수만 종류)의 안티센스 염기서열을 포함하는 단일가닥의 분자를 제작할 수 있다. 페이지미드 벡터 혹은 M13 박테리오페이지에 기반을 둔 다양한 벡터들을 이용하여 제 4세대의 안티센스 분자를 제작할 수 있으므로 cDNA의 방향성을 선택적으로 할 경우 많은 수의 안티센스 분자를 단기간에 제작할 수 있다. 이렇게 제작된 수천 혹은 수만 종의 안티센스 분자들은 특정 세포주에서 일시적인 유전자의 발현 억제를 통한 유전자의 기능 분석에 효율적으로 이용될 수 있다. 합성 안티센스 올리고를 사용할 경우 제작상 장기간에 걸치는 시간적 소요와 전사체 상의 타겟 염기서열 (target sequence) 설정 등의 문제점으로 인하여 용이하게 대규모 안티센스 라이브러리를 확립할 수 없는 특성을 갖는다.
또한, 본 발명은 상기의 제 4세대 안티센스 제조기술을 이용하여 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 및 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리 및 그의 제조 방법을 제공한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 제 4세대 안티센스 분자는 목적하는 염기서열에 대해서만 특이적으로 반응하고 소량으로도 우수한 안티센스 활성을 나타낼 뿐 아니라 길이가 긴 목적 염기서열의 대부분을 포함할 수 있어 목적 염기서열과의 개선된 반응성을 가지고 세균세포 배양기술을 이용하여 대량으로 생산될 수 있기 때문에 유전자의 이상 발현으로 유발되는 암, 면역 질환, 감염 질환, 대사 질환 및 유전성 질환 등의 유전자 발현 억제를 위한 안티센스 분자치료제의 개발에 유용하게 사용될 수 있다. 이에 본 발명자들은 상기 제 4세대 안티센스 분자의 제조기술을 이용하여 미지의 유전자와 각종 질병에 관련된 유전자의 기능을 신속·정확하게 대량으로 분석할 수 있는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템을 위한 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA (unidirectional and subtracted antisense cDNA) 라이브러리를 개발하였다.
본 발명의 유전자 검색 및 기능 분석 시스템에서는 안티센스 활성의 우수성, 목적 부위 (target site) 설정의 불필요성, 대량 제작의 우수성 등의 장점을 갖고 있는 제 4세대 안티센스 기술을 사용한다. 안티센스 라이브러리의 제작에는 2종류의 방법이 사용되는데, 첫째는 염기서열이 일부라도 밝혀진 기존의 발굴된 cDNA 단편들을 제 4세대 안티센스 제작 벡터에 클로닝하여 안티센스 cDNA 라이브러리를 제작하는 방법이고, 둘째는도 7및도 8에 각각 나타난 바와 같이 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 (unidirectional antisense cDNA library) 및 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리 (unidirectional subtracted antisense cDNA library)의 제작 방법들을 사용하여 제 4세대 안티센스 벡터에 염기서열이 알려지지 않은 상태의 cDNA 단편들을 무작위 (random)로 단방향 클로닝하여 안티센스 라이브러리를 제작하는 방법이다.
우선, 본 발명은 제 4세대 안티센스 기술을 이용하여 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 및 그의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리의 제조 방법은,
1) 특정 또는 질환관련 세포주 또는 조직으로부터 전체 RNA를 분리하는 단계;
2) 상기 RNA를 주형으로 역전사반응 (reverse transcription)을 수행하여 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하고 이로부터 두 번째 가닥 cDNA를 합성하는 단계;3) 상기와 같이 합성된 cDNA 말단에 제한효소 어뎁터 (adaptor)를 결합시키는 단계;
4) 동일한 제한효소가 처리된 페이지미드 벡터에 상기 cDNA 단편을 클로닝하여 재조합 페이지미드를 제조하는 단계;
5) 상기 재조합 페이지미드를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
6) 형질전환체와 헬퍼 페이지 (helper phage)의 동시감염 (coinfection)에 의해 단일가닥 안티센스 DNA를 생산하여 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리를 구축하는 단계로 구성된다 (도 7참조).
구체적으로 단계 1)은 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 제조를 위해 주형으로 사용될 전체 RNA를 분리하는 단계로, 본 발명에서는 대상 세포주 및 조직으로 랫트 호염기성 백혈병 (rat basophilic leukemia) 세포주인 WRT7/P2 (Dr. Yagita로부터 분양받음, Juntendo University) 및 인간 자궁 경부암 세포주인 HeLa 세포주 (KTCC에서 분양 받음), 1차적 (primary) 간 세포 조직, 폐 세포 조직, 간암 세포조직 그리고 폐암 세포 조직을 주로 사용하여 이들 세포부로부터 전체 RNA를 분리한다. 분리된 전체 RNA 중 폴리(A)+mRNA (poly(A)+mRNA)만을 정제하여 이를 역전사반응 (reverse transcription)의 주형으로 사용한다.
단계 2)는 상기에서 분리·정제된 폴리(A)+mRNA를 주형으로 하고 제한효소 (XhoI) 인식부위를 함유하는 올리고 dT-프라이머 (oligo-dT primer)를 사용하여 역전사효소 (reverse transcriptase)로 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하고 이어서 두 번째 가닥 cDNA를 합성하는 단계이다.
단계 3) 및 단계 4)는 상기와 같이 합성된 cDNA 말단에 제한효소 (EcoR I) 인식부위를 형성하기 위하여EcoR I 어댑터 (adaptor)를 결합시킨 후 제한효소XhoI으로 분해하여EcoR I/XhoI cDNA 단편을 제조하는 단계이다. 상기 cDNA 단편을 T4 DNA 접합효소 (ligase)를 이용하여 주로 제한효소EcoR I/XhoI으로 미리 절단한 뒤 탈인산화한 페이지미드 벡터 pBlueScriptII SK(-) 내로 삽입하여 재조합 페이지미드 (recombinant phagemid)를 제조한다. 페이지미드 벡터로는 폐쇄형 단일가닥 게놈을 갖는 것을 특징으로 하며 선형 페이지 (filamentous phage)의 f1 Ori (f1 복제 시작점)를 포함하는 벡터, 예를 들면 pUC 계열, M13mp 계열, pBluescript II 계열, pCR2.1, pGEM-f, pGL2, pβgal 등의 M13 박테리오페이지 벡터 및 페이지미드를 목적에 따라 폭 넓게 사용할 수 있다.
단계 5)는 상기에서 클로닝된 재조합 페이지미드를 칼슘 클로라이드 방법으로 수용 대장균 (competent cell ;Escherichia coli; XL-10 GOLD, Stratagene)에 형질전환하여 대장균 형질전환체를 얻는 단계이다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서 사용한 페이지미드 벡터로는 F1(+)또는 F1(-) ori 영역을 가져 단방향 클로닝으로 폐쇄형의 단일가닥 게놈을 생성할수 있는 모든 것을 사용할 수 있으며, 주로 사용하는 pBlueScript II SK(-) 벡터는 F1(-) ori (origin) 영역을 가지므로 제한효소EcoR I/XhoI 인식부위에 cDNA들을 단방향 (unidirection)으로 클로닝함으로써, 단일 클론들로부터 단일가닥의 안티센스 DNA를 생산할 수 있다.
또한, 본 발명은 제 4세대 안티센스 기술을 이용하여 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리 및 그의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리의 제조 방법은 다음과 같다.
1) 질환관련 세포주 또는 조직으로부터 전체 RNA를 분리한 후 이를 주형으로 역전사반응 (reverse transcription)을 수행하여 검체 cDNA (tester cDNA)를 합성하는 단계;
2) 정상 세포주 또는 조직으로부터 전체 RNA를 분리하고 정제한 후 이를 주형으로 역전사반응을 수행하여 조종 cDNA (driver cDNA)를 합성하는 단계;3) 단계 1의 검체 cDNA를 서로 다른 튜브에 분주한 후 서로 다른 제한효소 인식부위를 가지는 어댑터를 각각 결합시켜 두 종의 검체 cDNA를 제조하는 단계;4) 상기 두 종의 검체 cDNA를 함유하는 튜브를 단계 2의 조종 cDNA를 함유하는 튜브와 각각 혼합하여 1차 혼성화 (first hybridization)시키는 단계;5) 단계 4에서 1차 혼성화시킨 각각의 튜브들을 서로 혼합하여 2차 혼성화 (second hybridization)시킨 후 PCR을 수행하여 cDNA 단편을 증폭하는 단계;
6) 상기와 같이 증폭된 cDNA 단편을 페이지미드 벡터에 클로닝하여 재조합 페이지미드를 제조하는 단계;
7) 상기 재조합 페이지미드를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
8) 형질전환체와 헬퍼 페이지 (helper phage)의 동시감염 (coinfection)에 의해 단일가닥 안티센스 DNA를 생산하여 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리를 구축하는 단계로 구성된다 (도 8참조).
상기 방법은 사람 정상세포에 비하여 암세포에서 특이적으로 과발현되는 유전자의 cDNA를 차별적으로 또는 대량으로 클로닝하기 위하여 Diatchenko 등 (1996)이 개발한 선택적 혼성화 방법 (subtractive hybridization, Diachenkoet al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 93:6025-6030, 1996)을 근간으로 한다.
구체적으로, 단계 1) 및 2)는 인간의 정상세포 및 암세포로부터 분리한 전체 mRNA를 주형으로 제한효소XhoI 부위를 포함하는 프라이머를 이용하여 정상세포 유래의 조종 cDNA와 암세포 유래의 검체 cDNA를 합성하는 단계이다.
단계 3) 및 4)는 상기 암세포 유래 검체 cDNA 및 정상세포 유래 조종 cDNA의 각 말단을 평활화하여 검체 cDNA에만 서로 다른 제한효소 부위를 포함하는 어댑터를 결합시켜 두 종의 검체 cDNA를 제조한 후 조종 cDNA와 1차 혼성화하는 단계로, 본 발명에서는NotⅠ 제한효소 인식부위를 포함하는서열번호 13의 35번에서 44번까지의 뉴클레오타이드에서열번호 14로 기재되는 올리고뉴클레오타이드를 상보적으로 결합시킨 어댑터 1과EagⅠ 제한효소 인식부위를 포함하는서열번호 15의 33번에서 42번까지의 뉴클레오타이드에서열번호 16으로 기재되는 올리고뉴클레오타이드를 상보적으로 결합시킨 어댑터 2를 각각 사용하였다.
다음으로, 단계 5)는 2차 혼성화 및 PCR로 cDNA를 증폭하는 단계로 1차 혼성화한 두 종류의 혼합액을 다시 2차 혼성화한 후 서로 다른 제한효소 부위의 염기서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 억제 PCR (suppression PCR)과 지수 PCR (exponential PCR)을 수행함으로써 암세포주에 특이적으로 과발현하는 유전자의 cDNA를 선택적으로 증폭한다. 본 발명에서는 검체 cDNA를 증폭하기 위하여 제한효소NotⅠ 인식부위를 포함하는 프라이머를 이용하였다.
단계 6)은 상기와 같이 증폭된 cDNA 단편을 제한효소NotⅠ과XhoI으로 분해하여NotⅠ/XhoI cDNA 단편을 제조한 후 상기 cDNA 단편을 T4 DNA 접합효소를 이용하여 주로 제한효소NotⅠ/XhoI으로 미리 절단한 뒤 탈인산화한 페이지미드벡터 pBlueScript II SK(-) 내로 삽입하여 재조합 페이지미드 (recombinant phagemid)를 제조하였다. 페이지미드 벡터로는 폐쇄형 단일가닥 게놈을 갖는 것을 특징으로 하며 선형 페이지 (filamentous phage)의 f1 Ori (f1 복제 시작점)를 포함하는 벡터, 예를 들면 pUC 계열, M13mp 계열, pBluescript II 계열, pCR2.1, pGEM-f, pGL2, pβgal 등의 M13 박테리오페이지 벡터 및 페이지미드를 목적에 따라 폭 넓게 사용할 수 있다.
단계 7)은 상기에서 클로닝된 재조합 페이지미드를 칼슘 클로라이드 방법으로 수용 대장균 (competent cell ;Escherichia coli; XL-10 GOLD, Stratagene)에 형질전환하여 대장균 형질전환체를 얻는 단계이다. 상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서 사용한 페이지미드 벡터는 F1(-) ori 영역을 포함하여 단방향 클로닝이 가능한 폐쇄형 단일가닥 게놈을 가지는 모든 벡터를 사용할 수 있으며, 대표적으로 사용한 pBlueScript II SK(-) 벡터는 F1(-) ori (origin) 영역을 가지고 있어 제한효소NotⅠ/XhoI 인식부위에 cDNA들을 단방향 (unidirection)으로 클로닝함으로써 이와 같이 구축된 재조합 페이지미드를 포함하는 단일 클론들로부터 단일가닥의 안티센스 DNA를 생산하여 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리를 구축하였다.
본 발명의 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리의 제조 방법에 의하여 하우스키핑 (housekeeping) 유전자를 포함한 정상세포 내 발현유전자들은 소거되고 상대적으로 발현빈도가 낮았던 암세포주 특이 유전자들만을 대량으로 확보할 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 및 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리를 이용하는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법과 그의 장치를 제공한다.
일반적으로 유전자 검색 시스템을 구축함에 있어 안티센스를 이용한 다양한 방법들이 적용되어 왔다. 기존의 유전자 검색 시스템은 단지 유전자 검색 기능만을 수행할 수 있기 때문에 부수적으로 복잡하고 장기간을 요하며 고비용이 수반되는 기능 분석 시스템을 별도로 구축하여야 하는 번거로움이 지적되고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 고안된 본 발명에서는 새로이 개발된 제 4세대 안티센스 분자로 구성되는 방대한 규모의 안티센스 라이브러리를 이용하므로 기존의 방법보다 대규모로 미지의 유전자를 신속하게 검색할 수 있는 유전자 검색 및 기능 분석 방법을 개발할 수 있었다. 또한, 본 발명의 유전자 검색 및 기능 분석 방법은 유전자의 기능을 포괄적으로 검색할 수 있을 뿐 아니라 유전자 각각의 기능을 명확히 확인 또는 유추할 수 있게 하며, 더불어 유전자간의 상호관계를 밝히는데도 유용하게 사용될 것이다.
전술한 바와 같이, 제 4세대 안티센스 분자는 현저히 개선된 안티센스 활성; 신속하고 정확한 안티센스 분자의 제작; 리포좀과 복합체를 형성할 경우 원활한 세포내 흡수; 안정성 개선으로 소량 사용; 생산된 안티센스 분자의 염기서열과 자연상태 핵산의 동일한 조성 및 대량생산 용이; 상이한 종류인 다중의 전사체 제거 용이; 자연성 핵산 조성으로 낮은 독성; 및 방향성을 갖는 (directional) cDNA 라이브러리에서 다수 (수천 혹은 수만 종류)의 안티센스 염기서열을 포함하는 단일가닥의 분자를 제작 가능의 다양한 장점을 갖는다. 이러한 장점은 유전자 기능의 대규모 분석에 직·간접적으로 도움이 된다. 본 발명자들이 개발한 수천 혹은 수만개의 안티센스 라이브러리를 사용하는 유전자 기능 분석 시스템은 진핵세포의 유전자 기능 분석을 위해 지금까지 개발된 것 중 유일한 대규모 분석시스템이다. 본 발명에서 개발된 제 4세대 안티센스 라이브러리에서는 단일가닥의 모든 박테리오페이지 게놈이 안티센스 염기배열을 갖도록 하였으며, 특정 질병조직에서만 발현되는 유전자들이 PCR 선택 (subtraction)을 통해 우선적으로 선별되도록 하였다. 이렇듯 단방향성을 갖는 동시에 선택적인 (unidirectional and subtracted) 안티센스 cDNA 라이브러리의 제작은 본 발명을 통해 유일하게 보고되는 것이다.
본 발명의 유전자 검색 및 기능 분석 방법의 최대 장점은 다수의 상이한 전사체에 대한 안티센스 라이브러리를 신속하게 확보할 수 있으며, 한 종류의 세포주를 대상으로 수 천에서 수 만종 이상에 달하는 특정 유전자의 기능을 단시일 내에 검색할 수 있다는 것이다. 또한, 제 4세대 안티센스만이 가질 수 있는 장점을 이용하여 개발한 것이므로, 특정 또는 질환 세포주가 발현하는 전체 전사체를 대상으로 안티센스를 제작하여 미지의 유전자를 검색하고 기능을 분석할 수 있다는 장점을 가진다 (도 10참조). 즉, 1차 검색 및 불필요한 안티센스 DNA를 사용하지 않고 세포주 자체가 발현하는 전사체만으로 안티센스를 제작하기 때문에 좀 더 효율적인 멀티 매크로어래이 (multi-macroarray) 시스템으로 간소화할 수 있다.
본 발명의 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법은,
1) 제 4세대 안티센스 기술을 이용하여 안티센스 cDNA 라이브러리를 구축하는 단계;
2) 안티센스 cDNA 라이브러리의 구축으로 얻은 단일 클론 중 100 bp 이상의 cDNA 단편을 선별하는 단계;
3) 상기에서 선별된 단일 클론을 배양하여 단일가닥 안티센스 분자를 얻는 단계;
4) 상기 안티센스 분자를 이용하여 안티센스 분자-전달체 복합체를 형성하는 단계;
5) 마이크로플레이트에서 상기 안티센스 분자-전달체 복합체를 세포주에 적용한 후 1차적인 유전자 기능검색을 수행하는 단계; 및
6) DNA 염기서열 분석 및 DNA 데이터 베이스를 이용하여 기능이 밝혀져 있지 않은 미지의 유전자를 검색하고 2차적인 유전자의 기능을 분석하는 단계로 구성된다 (도 10참조).
단계 1)의 cDNA 라이브러리는 전술한 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 또는 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리의 제조와 동일한 방법으로 구축한다. 단계 1)에서 유전자 기능을 분석하기 위해 사용하는 안티센스 라이브러리의 단일가닥 안티센스 일련염기는 5 프라임 말단에 poly(T) 염기배열을 갖는데, 이러한 poly(T) 염기배열은 cDNA 센스 가닥의 poly(A) 꼬리 (tail)의 상보적인염기배열에 해당한다. 상기 Poly(T) 염기배열은 다양한 길이를 가지고 목적하는 전사체가 아닌 다른 여타 전사체의 poly(A) 꼬리에 비특이적으로 결합할 가능성도 있으며, 이 경우에는poly(A) 배열을 가진 매스킹 (masking) 올리고를 사전 처리하여 목적하는 전사체에 대한 비특이적 결합을 억제할 수 있다. 이 경우 사용되는 매스킹 올리고는 안티센스 분자의 poly(T) 부분에 결합한 후 안정성과 결합성을 동시에 가져야 하므로 최소한 10 mer 이상의 올리고를 사용하는 것이 바람직하며 올리고의 양 말단을 포스포로치오에이트 (phophorothioate)로 변조하거나 캡핑 (capping) 혹은 또 다른 화학적 변조를 통하여 결합력을 높이는 동시에 안정성을 증가시킬 필요성이 있다. 또 다른 방법으로 제작된 cDNA의 염기배열 분석을 통하여 poly(A) 꼬리가 제외된 cDNA 단편을 클로닝 (subcloning)한 후 순수한 안티센스 염기배열을 제작하여 사용할 수 있다. 이 경우에는 시간과 비용이 많이 소요된다는 문제점을 가지며, poly(T) 염기배열의 길이가 지나치게 길게되면 안티센스 분자중에서 벡터 염기배열을 제외한 안티센스 고유의 염기배열 길이가 짧아져서 효과적인 안티센스 활성을 기대하기가 어려울 수 있다. 본 발명에서 제작한 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리의 cDNA 단편은 평균적으로 약 300 bp의 크기를 가지나, 여기에는 poly(A) 꼬리가 부분적으로 포함되어 있으므로 이들이 제 4세대 안티센스 분자로서 효과적으로 작용하기 위해서는 cDNA 단편의 길이가 500 bp 이상인 것들이 도움이 될 수 있다.
단계 2)에서는 일정크기 이상의 cDNA 단편을 가진 재조합 페이지미드를 단시간에 효율적으로 선별하기 위하여 크랙킹 혹은 여타의 자동화 소규모 플라스미드DNA 분리방법을 사용한다 (도 9참조).
본 발명에서 이용한 플라스미드 DNA 분리방법의 과정은 다음과 같다.
1) 안티센스 cDNA 라이브러리의 구축으로 얻은 단일 클론들을 배양하여 세포 침전물을 회수하는 단계;
2) 상기 세포 침전물로부터 재조합 페이지미드 DNA를 분리하는 단계;
3) 상기 재조합 페이지미드 DNA에 제한효소를 처리하여 절단하는 단계; 및
4) 상기 재조합 페이지미드 DNA를 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 삽입된 cDNA와 벡터의 크기를 확인하는 단계로 구성된다.
이때, 선별된 클론들이 실제로 일정크기 이상의 cDNA 단편을 가지는지 확인하기 위하여 상기 클론들로부터 분리한 재조합 페이지미드 DNA는AccI,BamH I,BglII,EcoR I,EcoR V,KpnI,NotI,SacI,PstI,XhoI 등의 다양한 제한효소로 처리한 후 아가로즈 겔에 전기영동하여 삽입된 cDNA와 벡터의 크기를 확인한다. 상기에서 일정크기 이상의 유전자를 가짐이 확인된 재조합 페이지미드는 글리세롤 보관액 (glycerol stock)으로 만들어 -70℃에서 보존하면서 필요에 따라 사용한다. 이와 같이 선별된 단일 클론들은 세포주가 발현하는 전체 전사체 중 전사체 각각에 대한 cDNA가 포함된 페이지미드를 갖는 형질전환체들이다.
단계 3)은 상기에서 선별된 재조합 페이지미드에 M13 헬퍼 박테리오페이지 (helper bacteriophage)를 감염시킴으로써 형질전환체의 배양 상층액으로부터 단일가닥 안티센스 DNA 분자를 얻는 단계이다.
단계 4)는 안티센스 분자를 효율적으로 세포 내로 전달하여 안티센스의 활성을 극대화하기 위하여 안티센스 분자-전달체 복합체를 형성하는 단계로, 안티센스 분자의 전달체로는 양이온 리포좀, 양이온 폴리머, HVJ-리포좀 복합체 등을 사용할 수 있으며 다른 인체 감염 바이러스의 표면에 부착하여 전달하는 등의 방법을 사용할 수 있다. 사용될 전달체는 안티센스 및 세포주에 따라 결정되며, 대표적인 전달체로서 양이온 리포좀인 리포펙타민 (LIPOFECTAMINE, Gibco BRL, USA)을 이용할 경우 안티센스 cDNA 라이브러리로부터 확보한 안티센스 분자와 복합체를 형성한 후 이들 복합체를 OPTI-MEM (Gibco BRL, USA)으로 희석하고 제조사의 지침에 따라 배양세포에 처리한다.
단계 5)는 마이크로플레이트에서 상기 안티센스 분자-전달체 복합체를 세포주에 적용하는 단계이다. 96-웰 또는 384-웰 플레이트 상에 mRNA를 분리했던 세포주나 특정 질환 세포주를 안티센스 분자-전달체 복합체 처리 전날 분주하여 이산화탄소 배양기에서 배양한 후 복합체를 처리한다. 96-웰 플레이트를 사용할 경우, 세포 및 리포좀의 종류에 따라 안티센스 DNA와 양이온 리포좀을 1 : 3 내지 1 : 4 등의 비율로 혼합할 수 있으며 일반적으로는 1 : 3 (w/w)의 비율로 혼합하여 세포를 형질감염 (transfection)한다. 안티센스 분자의 활성을 확인하기 위하여 세포 상등액은 일례로 ELISA 분석 등에 사용하고 세포들은 RNA 분리에 사용할 수 있다. 추가적으로 현미경을 사용하여 시간대별 또는 일일별 세포의 형태학적 관찰, 세포사멸 및 세포 성장 상태를 관찰하고 특정 기질에 대한 반응을 통해 1차적인 유전자 기능검색을 할 수 있다.
단계 6)은 DNA 염기서열 분석 및 DNA 데이터 베이스를 이용하여 기능이 밝혀져 있지 않은 유전자의 검색 및 기능 분석을 하는 단계로 단계 5)의 1차적인 유전자 검색 결과를 토대로 선정된 안티센스 분자를 자동 DNA 염기서열 분석기를 이용하여 염기서열을 결정한다. DNA 데이터 베이스를 활용하여 상기 결정된 염기서열에 의한 유전자 동정과정을 통해 새로운 유전자의 존재 여부 및 정보를 얻을 수 있다. 본 발명자들은 방향성 안티센스 라이브러리의 진위 확인을 위하여 무작위로 선별한 100개의 클론에 대한 염기서열분석을 하였고, 염기서열이 결정된 모든 클론 중 이미 알려진 것과 일치하는 것은 mRNA의 센스 가닥과 동일한 염기조성을 나타내었다 (도 11참조). 더불어 폴리(A) 꼬리 (poly(A) tail)는 변함없이 3 프라임 말단 (3 prime end)에서 발견되었는데, 이러한 사실은 모든 단일가닥 재조합 박테리오페이지 게놈이 안티센스 일련 염기를 가지고 있음을 나타내며 단방향성 클로닝이 성공적으로 수행되었음을 나타낸다.
유전자 동정에 따른 결과를 바탕으로 추가적인 분자생물학, 세포생물학, 면역학, 생화학적 분석을 통하여 유전자 기능검정을 보강함으로써 유전자 기능 및 상호관계에 대한 정확한 정보를 얻을 수 있다.
유전자의 기능 분석은 그 목적에 따라 다양한 방법이 적용될 수 있다. 유전자의 기능 분석은 기존에 확립된 방법을 이용하여 수행될 수 있는데 (도 12참조), 1차적인 유전자의 기능 분석 방법의 일례로서는 현미경으로의 세포의 형태적 변화, 성장 변화 (성장억제 및 촉진) 및 세포사멸을 관찰하는 것을 들 수 있다.
특정 유전자의 기능 분석을 위해서는 많은 방법들을 활용할 수 있지만 주로 다음과 같은 방법을 이용한다.
1) 안티센스 활성에 의한 유전자 발현 억제 분석은 주로 RT-PCR과 웨스턴 블럿 분석 (Western blot analysis)에 의한 mRNA 발현, 단백질 발현 및 단백질 활성의 측정 (예; 면역분석 방법 [immunoassay])을 통해 이루어진다 (도 4및도 5참조).
2) 세포 성장과 분화 분석은 MTT 분석, 사이미딘 편입 (thymidine incorporation) 양 측정, 콜로니 형성 등의 실험으로 측정할 수 있고 세부적으로는 사이토카인 수용체에 관한 인자의 탐색, DNA 복제관련 유전자의 탐색, 크로마틴 활성화 인자 (histon acetylase)의 탐색 등 여러 방법으로 유전자의 기능을 분석한다.
3) 세포사멸 (apoptossis) 분석은 세포의 형태학적 변화, 핵의 응축 및 단편화, DNA 단편화, 세포사멸의 정량 분석, 세포사멸의 신호전달 기구 분석 등의 방법으로 유전자 기능을 분석한다.
4) 세포주기 조절의 분석은 플로우 사이토메트리 (flow cytometry)를 이용한 세포주기 측정, 세포주기 억제 인자의 활성, 세포주기 촉진 인자의 활성, 세포주기 조절 인자간의 복합체 형성 확인 등의 분석으로 유전자의 기능을 분석한다.
이외에도 다양한 방법을 이용하여 특정 유전자의 발현억제에 의한 세포의 생리적, 생화학적, 형태학적 및 분자생물학적 변화를 검색할 수 있다.
본 발명의 제 4세대 안티센스 분자 기술을 이용한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법과 그의 장치는 미지의 유전자를 검색하여 그 기능을 대규모로 분석할 수 있을 뿐 아니라 이러한 실험에서 얻어진 결과를 안티센스 분자 치료제의 개발에직접적으로 이용할 수 있는 매우 유용한 발명이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험예 1> M13 박테이오페이지를 이용한 안티센스 분자의 제조
본 발명자들은 제 4세대 안티센스 제조기술을 본 발명의 유전자 검색 및 기능 분석 시스템에 적용하기 위하여, 우선 폐쇄형 단일가닥의 DNA를 게놈으로 갖는 M13 박테리오페이지 (M13 bacteriophages)를 이용하여 길이가 길면서 안티센스 활성이 우수한 안티센스 분자를 제조하고자 목적 염기서열을 TNF-α로 하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<1-1> rTNF mRNA의 발현과 유전자 재조합
랫트의 TNF-αmRNA를 발현시키기 위하여, 쥐의 단핵구 세포주인 WRT7/P2 세포 (Dr. Yagita로부터 분양받음, Juntendo University)를 48-웰 플레이트 (48-well plate)에 웰당 1 ×106cells/200 ㎕ 농도로 분주한 후, 지질 다당류 (lipopolysaccharide, LPS, Sigma)를 30 ㎍/㎖ 첨가하여 4시간 내지 24시간 동안 반응시켰다. 이와 같이 반응된 세포를 시간대별로 회수하여 rTNF-α의 mRNA 발현 양상을 RT-PCR로 조사한 결과, rTNF-α mRNA가 가장 많이 발현되는 시간대는 LPS를첨가하고 6시간 경과 후임을 확인하였다.
재조합 벡터에 삽입될 rTNF-α의 cDNA를 제조하기 위하여, 상기에서 확인한 바와 같이 WRT7/P2 세포를 6시간 동안 LPS와 반응시킨 후 RNA를 추출하였다. 상기 RNA를 주형으로 하고서열번호 1및서열번호 2로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 rTNF-α의 단백질 암호화 (coding) 부분 전체 (708 bp)가 포함되도록 RT-PCR을 수행하여 삽입 유전자를 제조하였다. rTNF-αmRNA의 암호화 염기서열 전체에 대한 안티센스를 재조합하기 위하여, pBluescript 페이지미드가 f1 오리진 (f1 origin)의 방향에 따라서 센스 (sense) 혹은 안티센스 (antisense)로 발현된다는 점을 이용하여 상기로부터 얻은 rTNF-α삽입 유전자를 pBluescript (pBS-KS(±), Stratagene, USA) 클로닝 벡터 내 다중 클로닝 부위 (multiple cloning sites)의 제한효소SalI과EcoRI 부위에 lacZ와 동일한 방향으로 클로닝하여 rTNF-αcDNA가 삽입된 pBS-KS(-) 페이지미드 (rTNF-αin pBS-KS[-])를 제조하였다 (도 1).
<1-2> M13K07 헬퍼 페이지를 이용한 폐쇄형 안티센스 분자의 제조
폐쇄형 안티센스 분자를 Sambrook 등 (Molecular Cloning, 1989)의 방법을 이용하여 제조하였다. rTNF-αcDNA가 삽입된 pBS-KS(-) 페이지미드가 형질전환된 균주에 M13K07 헬퍼 페이지 (M13K07 helper phage, NEB Nucleic Acids, USA)를 형질감염시켰다. 이와 같이 헬퍼 페이지에 의하여 rTNF-α안티센스를 포함하는 재조합 M13 페이지 게놈 (phage genome)이 복제될 경우, 페이지미드 상에 존재하는 f1 오리진에 의해 TNF-α안티센스를 포함하여 전체가 단일가닥으로 제작되어 TNF-α뿐아니라 페이지미드 상에 존재하는 암피실린 내성 유전자 (ampicillin resistance gene) 및 lacZ와 같은 다른 유전자도 안티센스 방향으로 복제된다.
구체적으로, M13KO7 헬퍼 페이지를 포함하는 2×YT 배지 (10 g NaCl, 10 g yeast extract 및 16 g bactotrypton/L)에서 상기 형질전환 균주를 배양한 후 배양액에 20% 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG 8000)를 첨가하여 박테리오페이지를 침전시켰다. 원심분리하여 상등액을 제거한 후 침전물을 TE 완충용액 (pH 8.0)에 용해시키고 페놀 추출법 및 에탄올 침전법을 이용하여 DNA를 분리하였다.
헬퍼 페이지 DNA로부터 분리된 폐쇄형 단일가닥 rTNF-α안티센스 DNA를 확인하기 위하여, 1% 아가로즈 겔을 사용하여 폐쇄형 단일가닥 rTNF-α안티센스 DNA를 전기영동하였다. 이때, 대조군으로 rTNF-αcDNA를 pBS-KS(-)에 lacZ와 반대방향 (센스 방향)으로 삽입시킨 이중가닥 rTNF-α안티센스 cDNA가 삽입된 원래의 pBS-KS(-) 플라스미드를 사용하였다. 상기와 같이 제조된 폐쇄형 단일가닥 rTNF-α안티센스 분자가 실제로 rTNF-α에 대한 안티센스 염기서열을 포함하고 있는지의 진위를 자동 염기 서열 분석기 (automated fluorescence sequencing)를 이용하여 확인하였다.
염기서열 분석 결과,도 2에 나타낸 바와 같이, 5' 말단 방향은 페이지미드 벡터의 염기서열을 나타내고 3' 말단 방향은 rTNF-αcDNA의 염기서열을 나타내었다. 상기 염기서열은 주형으로 사용된 DNA 분자에 대해서 상보적이며 역순이기 때문에 페이지미드 게놈에 TNF-α의 안티센스가 생성된 것을 알 수 있다. 상기와 같이 제조된 폐쇄형 단일가닥 rTNF-α안티센스 분자를 rTNFα-M13AS로 명명하였다.
<실험예 2> 폐쇄형 rTNFα안티센스 분자의 구조 확인 및 안정성 시험
<2-1> 폐쇄형 단일가닥 형태의 rTNFα안티센스 분자
M13K07 헬퍼 페이지의 형질감염 후 생산된 폐쇄형의 안티센스 분자가 폐쇄형의 단일가닥 DNA를 가지는지를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
rTNFα-M13AS 1 ㎍에 제한효소XhoⅠ(10 units/㎍ DNA), 엑소뉴클리아제 Ⅲ (Exonuclease Ⅲ, 160 units/g DNA), S1 뉴클리아제 (S1 nuclease, 10 units/㎍ DNA)를 처리하고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 후 상기 안티센스 분자를 페놀 추출법 및 에탄올 침전법을 이용하여 분리한 후 1% 아가로오즈 겔 상에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.
rTNFα-M13AS 분자는 재조합 페이지미드가 형질전환된 균주를 M13K07 헬퍼 페이지로 감염시킨 후 이로부터 획득된 재조합 M13 페이지로부터 분리되었다. 따라서, 상기와 같이 제조된 rTNFα-M13AS 분자는 폐쇄형 단일가닥 분자이므로 엑소뉴클리아제에 대해 높은 저항성을 나타낼 것으로 기대되었다. 실제적으로,도 3a에 나타낸 바와 같이, rTNFα-M13AS 분자에 이중가닥 DNA를 인식하여 절단하는 제한효소XhoI과 엑소뉴클리아제 Ⅲ를 처리한 결과, rTNFα-M13AS 분자는 3시간의 처리 후에도 분해되지 않고 안정하였다 (레인 4 및 레인 8). 반면, 이중나선의 복제형 (replicative form)인 M13 페이지 DNA는 제한효소XhoI에 의해 효과적으로 절단되었다. 또한, rTNFα-M13AS는 단일가닥 DNA를 인식하여 절단하는 S1 뉴클리아제에 의해서 완벽하게 분해되었는데, 상기 결과들은 본 발명의 안티센스 분자가 페쇄형 단일가닥 DNA (closed single strand DNA) 구조를 가짐을 뒷받침 해준다.
<2-2> rTNFα안티센스 분자의 안정성 시험
안티센스 분자가 세포 내로 효과적으로 흡수되기 위하여 리포좀 (liposomes)과 결합하여 복합체를 형성할 때, 본 발명의 rTNFα-M13AS 분자가 세포 내 또는 혈장 내 존재하는 뉴클리아제에 대하여 안정한지를 조사하였다.
구체적으로, 1 g의 폐쇄형 단일가닥 DNA를 그대로 사용하거나 또는 리포좀과 1 : 3 (w/w)의 비율로 혼합하여 복합체를 형성시킨 후 30% 비가열 불활성화 소 태아 혈청 (non-heat inactivated fetal bovine serum, FBS) 또는 송아지 혈청 (calf serum)과 혼합하여 37℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 후 DNA를 페놀과 클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켜 분리한 후 1% 아가로오즈 겔 상에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.
그 결과, rTNFα-M13AS는 전혀 분해되지 않았는데, 이러한 결과는 rTNFα-M13AS가 양이온 리포좀 (cationic liposomes)과의 복합체 형태로 인체 내에 주입될 경우 혈장이나 세포 내로 전달되는 과정에서 안정할 수 있음을 나타낸다 (도 3b).
<실험예 3> rTNFα-M13AS에 의한 rTNF-α 발현 억제
본 발명의 rTNFα-M13AS가 기존의 안티센스 올리고에 비하여 뉴클리아제에 대한 안정성이 매우 우수하며 담체 (carrier)인 양이온 리포좀과 결합된 복합체 역시 세포 내에서의 안정성이 월등히 개선되었음을 확인한 본 발명자들은 세포 내로 전달된 rTNFα-M13AS가 과연 우수한 안티센스 활성을 나타내는지 조사하기 위하여, rTNFα-M13AS-리포좀 복합체를 세포 내로 전달시킨 후 rTNFα-M13AS의 rTNF-αmRNA에 대한 안티센스 효과를 RT-PCR과 서던 블럿 분석을 통하여 조사하였다.
<3-1> 세포 배양
쥐의 단핵구 세포주인 WRT7/P2를 야기타 박사 (Dr. Yagita, Juntendo University)의 실험실로부터 분양받아 실험에 사용하였다. 10% 가열-비활성 FBS (heat-inactivated FBS, Hyclone, USA), 100 units/㎖ 페니실린 (penicillin) 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (streptomycin)이 첨가된 RPMI 1640 (Gibco BRL, USA) 배지에 상기 세포를 접종하여 37℃, 5% CO2항온기에서 배양하고, 배양 과정에서 세포 농도를 적정하게 유지시켰다. 형질감염 (transfection) 실험에 사용되는 세포는 모두 실험 전날 (16시간 전) 신선한 배양액으로 교체하여 0.4% 트립판 블루로 생존율 (viability)을 확인하였다.
<3-2> rTNFα-M13AS와 리포좀의 복합체를 이용한 세포 내 형질감염
rTNFα-M13AS를 양이온 리포좀 복합체를 이용하여 세포 내로 형질감염 시키기 위하여, 리포펙틴 (Lipofectin, Gibco BRL, USA) 또는 리포펙타민 (Lipofectamine, Gibco BRL, USA)의 양이온 리포좀을 사용하였다. 우선, rTNFα-M13AS 또는 대조군인 M13 페이지 게놈 DNA를 FBS와 항생제를 첨가하지 않은 OPTI-MEM (Gibco BRL, USA) 배지로 희석한 후 상기 양이온 리포좀과 혼합하여 상온에서 40분 동안 반응시켜 각각의 양이온 리포좀 복합체를 준비하였다. 실험 전날 신선한 RPMI-1640 배양액으로 교환해 준 WRT7/P2 세포를 OPTI-MEM 배지로 두 번 세척하고 웰당 1 ×106cells/㎖의 세포 농도로 48-웰 플레이트에 분주하였다. 이때, DNA와 양이온 리포좀을 1 : 3 (w/w)의 비율로 형질감염 시켰으며, FBS가 없는 상태로 37℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 그 후 2×FBS (Gibco BRL, USA) 및 항생제가 첨가된 OPTI-MEM 배지를 첨가하여 다시 37℃에서 18시간 추가적으로 배양하였다. 상기와 같이 형질감염된 세포로부터 RNA를 추출하기 전에 6시간 동안 지질 다당류 (lipopolysaccharide, LPS) 30 ㎍/㎖을 첨가하여 rTNF-α의 발현을 유도 (induction)하였다. 상기 배양액을 원심분리하여 상등액과 세포 침전물로 분리한 후 상등액은 단백질 발현 양상 측정을 위한 ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) 분석에 사용하였고 세포 침전물은 RNA 분리에 사용하였다.
<3-3> RNA 분리 및 RT-PCR
양이온 리포좀을 사용하여 세포 내로 전달된 rTNFα-M13AS의 rTNFα염기서열에 대한 특이적인 안티센스 효과를 조사하기 위하여, 상기 세포로부터 RNA를 분리하여 역전사효소-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 수행하였다.
구체적으로, 트리 시약 (Tri ReagentRMRC, USA)을 사용하여 제조회사에서 권장하는 방법에 따라 RNA를 분리하였는데, 상기 <3-2>에서 형질감염시킨 각각의 웰로부터 회수한 세포에 1 ㎖ 트리 시약과 200 ㎕ 클로로포름을 첨가하여 전체 RNA 를 분리하였다. 이와 같이 분리한 RNA를 주형으로 사용하고서열번호 3및서열번호 4로 기재되는 프라이머 쌍을 사용하여 RT-PCR 키트 (AccessRRT-PCR kit, Promega, USA)로 제조사의 지침에 따라 RT-PCR을 수행하였다. 0.5 ㎖ PCR 튜브에 총 반응용량을 50 ㎕로 하여 AMV 역전사효소 (AMV reverse transcriptase, 5 U/㎕), Tfl DNA 중합효소 (Tfl DNA polymerase, 5 U/㎕), dNTP (10 mM, 1 ㎕) 및 MgSO4(25 mM, 2.5 ㎕)를 첨가한 후, DNA 써멀 싸이클러 (DNA thermal cycler, Hybaid, UK)를 이용하여 역전사반응 (reverse transcription) 및 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction)을 순차적으로 수행하였다. 1번째 가닥의 cDNA 합성반응은 48℃에서 45분 동안 실시하였으며, 2번째 가닥의 cDNA 합성반응 및 PCR 증폭반응은 94℃에서 30초, 59℃에서 1분, 68℃에서 2분 동안의 반응을 30회 반복하여 수행하였다. 이로부터 얻은 PCR 생성물을 1% 아가로오즈 겔 상에서 전기영동을 수행하여 확인하였으며, 겔 독 프로그램 (gel documentation program, Gel Doc. 1000, Bio-Rad, USA)을 이용하여 증폭된 cDNA를 정량적으로 비교, 분석하였다.
<3-4> 서던 블럿 분석
서던 블럿 분석 (Southern blot analysis)은 ECL 3' 말단 올리고-표지 및 검출 시스템 (ECL 3 prime end oligo-labeling and detection system, Amersham Life Science, UK)을 사용하여 제조회사에서 권장하는 방법에 따라 하기와 같이 수행하였다.
구체적으로, 상기 <3-3>으로부터 얻은 RT-PCR 생성물을 1% 아가로오즈 겔에 전기영동한 후 0.4 M NaOH 용액상에서 나일론 막 (nylon membrane)에 이전시켰다. 탐침으로서열번호 5로 기재되는 22 mer의 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 DNA 100 pmol에 플루오르세인-11-dUTP (fluorescein-11-dUTP), 카코딜레이트 완충용액 (cacodylate buffer), 말단 전이효소 (terminal transferase)를 잘 혼합한 후 37℃에서 70분 동안 반응시켜 표지-탐침 (labeled probe)을 제조하였다. 혼성화 반응은 나일론 막을 혼성화 완충용액 (5 ×SSC, 0.02% SDS, liquid block) 6 ㎖로 42℃에서 40분 동안 처리한 후 상기와 같이 표지된 올리고뉴클레오타이드 탐침을 6.25 ng/㎖ 첨가하여 42℃에서 14시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 막을 0.1% SDS가 포함된 5 ×SSC로 두번 세척하고, 다시 1 ×SSC (0.1% SDS)로 45℃에서 15분 동안 두번 세척하였다. 막 블러킹 (Membrane blocking) 과정을 거친 후 HRP-항 플루오르세인 접합 항체 (HRP anti-fluorescein conjugated antibody)를 처리하여 30분 동안 반응시킨 후 ECL 검출시약을 처리하여 검출하고 상기 막을 X-ray 필름에 노출시켜 현상하였다.
상기와 같이 양이온 리포좀을 사용하여 세포 내로 전달한 rTNFα-M13AS의 rTNFα염기서열에 특이적인 안티센스 효과를 RT-PCR 및 서던 블럿 분석을 통하여 조사한 결과, rTNFα-M13AS-리포좀 복합체가 형질감염된 세포주에서의 rTNF-α의 발현은 현저하게 감소한 반면, 대조구인 rTNFα-M13S (TNF-α센스 가닥)가 도입된세포주 또는 안티센스 염기서열을 포함하지 않는 M13SS (M13 단일가닥)가 도입된 세포주에서는 TNF-αmRNA의 감소가 관찰되지 않았다 (도 4a및4c).
본 발명의 rTNFα-M13AS는 TNF-α안티센스 염기서열과 함께 LacZ 및 암피실린 내성 유전자 등의 벡터 유래 염기서열을 포함하여 전체적으로 3.7 Kb 크기의 폐쇄형 단일가닥 안티센스 분자이다. 따라서, 상기에서 확인한 안티센스 활성이 TNF-α안티센스 이외의 염기서열에 의한 비특이적 활성에 의한 것인지 또는 TNF-α안티센스 자체에 의한 비특이적 활성에 의한 것인지를 조사하기 위하여, 동일한 세포 내에서 TNF-α가 아닌 3종류의 다른 유전자 발현을 조사하였다.
도 4a및4b에 나타낸 바와 같이 β-액틴 (β-actin), GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 및 IL-1β의 발현을 조사한 결과, 본 발명의 rTNFα-M13AS 분자가 상기 유전자들의 발현에는 아무런 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 rTNFα-M13AS의 안티센스 활성효율을 조사하기 위하여, 안티센스 분자의 사용량을 순차적으로 감소시킨 후 목적하는 mRNA의 제거정도를 측정하였다. 1 ×106cells/㎖ 세포농도의 세포에 대하여 rTNFα-M13AS를 0.1 ㎍ 처리한 경우에는 rTNF-α의 발현이 완전히 억제되었고, 0.05 ㎍ 처리한 경우에는 rTNF-α의 발현이 부분적으로 억제됨을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 rTNFα-M13AS가 기존의 안티센스 올리고 보다 현저히 적은 양에서도 효과적으로 유전자 발현을 억제할 수 있음을 나타낸다.
<실험예 4> rTNFα의 단백질 발현 양상
rTNFα-M13AS에 의해 TNF-αmRNA가 감소함을 확인한 본 발명자들은 rTNFα-M13AS가 세포외부로 유리되는 rTNFα단백질의 양에도 영향을 미치는지를 조사하기 위하여, 세포외부로 유리되는 랫트의 rTNFα단백질의 발현양상을 ELISA 키트 (Biosource, USA)를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 상기 <3-2>에서 얻은 세포 상등액을 50배로 희석하여 rTNF-α항체로 코팅된 플레이트에 먼저 첨가한 후 바이오틴화 항 TNF-α항체 (biotinylated anti TNF-αantibody)를 2차 항체로써 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트를 90분 동안 상온에서 반응시킨 후 세척 완충용액 (wash buffer in 'Cytoscreen TM' kit from BioSource, USA)으로 네번 세척하여 결합하지 않은 항체를 제거하고 스트렙타비딘-퍼옥시다제 (streptavidin-peroxidase)를 첨가하여 45분 동안 더 반응시켰다. 비결합 스트렙타비딘-퍼옥시다제를 제거하기 위하여 상기 세척완충용액으로 네번 세척한 후 상기 플레이트의 웰상에 크로모젠 (chromogen)을 첨가하여 20분 동안 발색시키고 450 nm에서 흡광정도를 측정하였다.
그 결과, rTNFα-M13AS를 처리한 경우에는 배양 세포액 내로 유리되는 rTNF-α단백질의 양이 현저하게 감소된 반면, rTNFα-M13S (센스 가닥)와 M13SS (단일가닥 벡터)를 처리한 대조구에서는 TNF-α단백질의 양이 전혀 감소하지 않았다 (도 5). 한편, 세포에 폐쇄형 단일가닥 핵산물질을 제외하고 리포좀만을 처리한 다른 대조구 실험에서는 부분적으로 TNF-α단백질의 양이 감소되었는데, 이러한 결과는 양이온 리포좀만을 사용할 경우에는 라이소좀 (lysosomes) 내에 양 (+) 전하가 축적되어 이로 인한 세포 독성에 기인한 것으로 판단된다.
<실험예 5> NF-κB-M13AS에 의한 인간 NF-κB의 발현 양상
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 인간 NF-κB를 목적하는 염기서열로 하는 안티센스 분자를 제조하여 이를 NF-κB-M13AS라 명명한 후 상기 안티센스 분자가 양이온 리포좀과의 복합체로서 세포 내로 전달되어 우수한 안티센스 활성을 나타내는지를 조사하기 위하여, NF-κB-M13AS-리포좀 복합체를 세포 내로 전달한 후 NF-κB-M13AS의 NF-κB에 대한 안티센스 활성을 RT-PCR 및 서던 블럿 분석을 통하여 확인하였다.
구체적으로, 상기 <3-2>와 같이 배양한 백혈구 단핵세포중의 대식세포 계열에서 유래한 THP1 세포를 1 ×106cells/㎖ 세포농도로 웰 플레이트에 분주한 후 NF-κB-M13AS, NF-κB-M13S 또는 M13SS로 형질감염시켰다. 이때, 양이온 리포좀인 리포펙타민을 DNA에 대하여 1 : 4 (w/w)의 비율로 혼합하여 형질감염시켰으며, 이를 하루동안 배양하였다. 형질감염시키고 하루 경과한 세포로부터 RNA를 추출하기 전에 6시간 동안 PMA (160 nM)를 첨가하여 NF-κB의 발현을 유도하였다. 상기 세포로부터 실험예 <3-3>과 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출한 후 이를 주형으로 하고서열번호 6및서열번호 7로 기재되는 프라이머 쌍을 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 또한, RT-PCR로부터 얻은 PCR 산물을 실험예 <3-4>와 동일한 방법으로서열번호 8로 기재되는 22 mer의 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용하여 서던 블럿 분석을 수행하였다.
상기와 같이 양이온 리포좀을 사용하여 세포 내로 전달한 NF-κB-M13AS의 NF-κB 염기서열에 특이적인 안티센스 효과를 RT-PCR 및 서던 블럿 분석을 통하여 조사한 결과, NF-κB-M13AS-리포좀 복합체가 형질감염된 세포주에서의 NF-κB의 발현은 현저하게 감소한 반면, 대조구인 NF-κB-M13S (NF-κB센스 가닥)가 도입된 세포주 또는 안티센스 염기서열을 포함하지 않는 M13SS (M13 단일가닥)가 도입된 세포주에서는 NF-κB mRNA의 감소가 관찰되지 않았으며 (도 6a), NF-κB-M13AS 분자가 β-액틴의 발현에 아무런 영향을 미치지 않았다. 따라서, 본 발명의 NF-κB-M13AS 분자는 NF-κB 염기서열에 대해서만 반응 특이적으로 안티센스 활성을 나타냄을 확인하였다.
또한, 본 발명의 NF-κB-M13AS의 안티센스 활성효율을 조사하기 위하여, 안티센스 분자의 사용량을 순차적으로 감소시킨 후 목적하는 mRNA의 제거정도를 측정하였다. 1 ×106cells/㎖ 세포농도의 세포에 대하여 NF-κB-M13AS를 0.1 ㎍ 처리한 경우에는 NF-κB의 발현이 완전히 억제되었고, 0.05 ㎍ 처리한 경우에는 NF-κB의 발현이 부분적으로 억제됨을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 NF-κB-M13AS가 기존의 안티센스 올리고 보다 현저히 적은 양에서도 효과적으로 유전자 발현을 억제할 수 있음을 나타낸다.
<실시예 1> 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 구축을 통한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법
상기 실험예 1 내지 6에서 생산된 제 4세대 안티센스 분자가 목적하는 염기서열에 대해서만 특이적으로 반응하고 소량에서도 우수한 안티센스 활성을 나타낼 뿐 아니라 길이가 긴 목적 염기서열의 대부분을 포함할 수 있어 목적 염기서열과의 개선된 반응성을 가짐을 확인하였다. 더불어 세균세포 배양기술을 이용하여 대량으로 생산될 수 있으므로 유전자의 이상 발현으로 유발되는 암, 면역질환, 감염질환, 대사질환 및 유전성질환 등의 유전자 발현 억제를 위한 안티센스 분자치료제의 개발에 유용하게 사용될 수 있음을 확인한 본 발명자들은 상기 제 4세대 안티센스 분자의 제조기술을 이용하여 미지의 유전자와 각종 질병에 관련된 유전자의 기능을 신속·정확하게 대량으로 분석할 수 있는 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리 (unidirectional subtracted antisense cDNA library)를 이용하는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법을 개발하였다.
<1-1> 세포배양 및 RNA 분리
우선, 단방향성 cDNA 라이브러리 구축을 위한 주형으로 사용할 RNA를 분리하기 위해서, 랫트 호염기성 백혈병 (rat basophilic leukemia) 세포주인 WRT7/P2 (Dr. Yagita로부터 분양받음, Juntendo University) 및 인간 자궁 경부암 세포주인 HeLa 세포주 (KTCC), 1차적 (primary) 간 세포 조직, 폐 세포 조직, 간암 세포조직 그리고 폐암 세포 조직을 사용하였다. 이들 중 부착 성장형인 세포 (HeLa, MCF-7, HepG2, HT-29 등)와 부유 성장형인 세포 (HL-60, K562, Ragi, Jurkat, WRT7/P2 등)를 10% 가열-비활성 FBS (heat-inactivated FBS, Hyclone, USA)와 100 units/㎖ 페니실린 (penicillin), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (streptomycin)을 첨가하여 37℃,5% CO2세포 배양기에서 배양하였다. 실험에 사용된 모든 세포는 배양 과정에서 적정한 세포 농도를 유지하도록 하였고, 실험에 사용한 세포는 전날 신선한 배양액으로 교체한 후 0.4% 트립판 블루 (trypan blue)로 생존을 확인하고 RNA 분리 및 안티센스 분자의 처리에 사용하였다. 한편, 암 조직 및 관련 정상 조직은 인산염-완충 생리식염수 (Phosphate-Buffered Saline) 용액으로 세척한 후 절개하고 적정량의 트리졸 시약 (TRIzol Reagent, GibcoBRL, USA)에 넣어 균질화 (homogenization)하였다. 균질화한 조직으로부터 제조사의 지침에 따라 전체 (total) RNA를 분리한 후 이로부터 mRNA를 정제하여 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 제작을 위한 주형으로 사용하였다.
<1-2> 단방향성 유전자 클로닝 (unidirectional gene cloning)
본 발명의 유전자 검색 및 기능 분석 방법에서는 안티센스 활성의 우수성, 목적 부위 (target site) 설정의 불필요성, 대량 제작의 우수성 등의 장점을 갖고 있는 제 4세대 안티센스 기술을 사용한다. 이를 이용하여 본 발명에서는도 7및도 8에 나타난 바와 같이 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 (unidirectional cDNA library) 제작 방법을 사용하여 제 4세대 안티센스 벡터에 염기서열이 알려지지 않은 상태의 cDNA 단편들을 무작위 (random) 로 단방향 클로닝하여 안티센스 라이브러리를 제작하였다. 상기 실시예 <1-1>에서 분리·정제된 mRNA를 주형으로 cDNA 단편을 합성하고 유전자를 단방향성 클로닝하는 과정은 하기와 같다.
<1-2-1> 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리 구축
단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리를 구축하기 위하여 제 4세대 안티센스 기술을 이용하여 페이지미드 벡터에 특정 암세포주의 cDNA를 단방향으로 클로닝하여 재조합 페이지미드를 제작하였다 (도 7). 우선, 상기 실시예 <1-1>과 같이 배양한 인간의 특정 세포주 및 조직에서 전체 RNA를 분리하고 이로부터 다시 폴리(A)+mRNA (poly[A]+mRNA)를 정제하였다. 이것을 주형으로 제한효소 (XhoI) 인식부위를 포함하는서열번호 9로 기재되는 올리고-dT 프라이머 (oligo-dT primer)를 사용하여 역전사효소 (reverse transcriptase)로 1차 가닥 cDNA (first strand cDNA)를 합성하였다. 이어서 2차 가닥 cDNA를 합성한 후 여기에 제한효소EcoR I 인식부위를 포함하는,서열번호 10의 5번에서 10번까지의 뉴클레오타이드에서열번호 11로 기재되는 올리고뉴클레오타이드를 상보적으로 결합시킨 어댑터 (adaptor)를 결합시켰다.
이와 같이 합성된 cDNA를 제한효소XhoI으로 분해한 후 T4 DNA 접합효소 (ligase)를 이용하여 pBlueScriptII SK(-) 벡터 내로 클로닝하여 재조합 페이지미드를 제조하였다. 이때, 상기 벡터는 클로닝을 용이하게 하기 위하여 미리 동일한 제한효소 (EcoR I,XhoI)로 자른 후 탈인산화 과정을 거친 것이다. 재조합 페이지미드는 칼슘 클로라이드 방법으로 수용 대장균 (competent cell ;Escherichia coli; XL-10 GOLD, Stratagene)에 형질전환하여 단일가닥 안티센스를 생산하는 대장균 형질전환체를 확보하였다. 본 발명에서 사용한 pBlueScript II SK(-) 벡터는F1(-) ori (origin) 영역을 가지고 있어 제한효소EcoR I/XhoI 인식부위에 cDNA들을 단방향 (unidirection)으로 클로닝함으로써 상기 재조합 페이지미드 단일 클론들은 헬퍼 페이지의 감염에 의해 단일가닥 안티센스 DNA를 생산할 수 있으므로 이로부터 암세포주로부터 염기서열이 규명되지 않은 다수의 안티센스 DNA 라이브러리를 구축할 수 있었다.
상기에서 사용된 안티센스 라이브러리의 단일가닥 안티센스 일련염기는 5 프라임 말단에 poly(T) 염기서열을 갖는데, 이러한 poly(T) 염기배열은 cDNA 센스 가닥의 poly(A) 꼬리 (tail)의 상보적인 염기서열에 해당한다. 상기 Poly(T) 염기서열은 다양한 길이를 가져 목적 전사체가 아닌 다른 여타 전사체의 poly(A) 꼬리에 비특이적으로 결합할 수 있으므로 poly(A) 배열을 가진 매스킹 (masking) 올리고를 사전 처리하여 목적하는 전사체에 대한 비특이적 결합을 억제할 수 있다. 상기 매스킹 올리고는 안티센스 분자의 poly(T) 부분에 결합한 후 안정성과 결합성을 동시에 가져야 하므로 최소한 10 mer 이상의 올리고를 사용해야 하며 올리고의 양 말단을 포스포로치오에이트 (phophorothioate)로 변조하거나 캡핑 (capping) 혹은 또 다른 화학적 변조를 통하여 결합력을 높이는 동시에 안정성을 증가시킬 수 있다.
<1-2-2> 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리 구축
사람의 정상세포에 비하여 암세포에서 특이적으로 과발현하는 유전자의 cDNA를 차별적으로 대량 클로닝하기 위하여 Diatchenko 등 (1996)이 개발한 선택적 혼성화 방법 (Subtractive Hybridization method, Diachenkoet al.,Proc. Natl.Acad. Sci., 93: 6025-6030, 1996)을 근간으로 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리 (unidirectional subtracted antisense cDNA library) 를 제작하였다 (도 8).
우선 사람의 정상세포 및 암세포주로부터 상기 실시예 <1-1>과 같이 전체 RNA를 분리하고 이로부터 폴리(A)+mRNA를 정제하였다. 상기 mRNA를 주형으로 하고 제한효소XhoⅠ 인식부위를 포함하는서열번호 12로 기재되는 cDNA 합성 프라이머를 이용하여 1차 가닥 cDNA를 합성한 후 2차 가닥 cDNA를 합성하였다. 이 과정을 통해 정상세포의 mRNA로부터 조종 cDNA (driver cDNA)를, 암세포주의 mRNA로부터 검체 cDNA (tester cDNA)를 합성한 후 각 cDNA의 말단을 평활화하였다. 상기 검체 cDNA를 서로 다른 2개의 튜브에 각각 분주한 후, 각기 다른 2종류의 제한효소 (NotI,EagI)를 포함하는서열번호 13의 35번에서 44번까지의 뉴클레오타이드에서열번호 14로 기재되는 올리고뉴클레오타이드를 상보적으로 결합시킨 어댑터 1을 한 튜브에 존재하는 검체 cDNA에 붙이고 서열번호 15의 33번에서 42번까지의 뉴클레오타이드에서열번호 16으로 기재되는 올리고뉴클레오타이드를 상보적으로 결합시킨 어댑터 2를 다른 튜브에 존재하는 검체 cDNA에 붙인 후 조종 cDNA와 각각 1차 혼성화 (first hybridization)하여 접합물을 형성하였다. 이어서 상기 두 가지 검체 cDNA와 조종 cDNA의 접합물을 서로 2차 혼성화 (second hybridization)하여 억제 PCR (suppression PCR)을 수행하고, 제한효소NotI 인식부위를 가지는서열번호 17및서열번호 18로 기재되는 프라이머 (nested primer)로 다시 한번 증폭 (exponential PCR)하였다. 이로부터 얻은 cDNA 단편들에 제한효소NotI,XhoI을 처리한 후 T4 DNA 접합효소 (ligase)로 동일한 제한효소 처리와 탈인산화 과정을 거친 pBlueScript II SK(-) 벡터 내로 단방향으로 삽입하였다. 접합된 재조합 페이지미드 (phagemid)는 칼슘 클로라이드 방법으로 수용 대장균 (competent cell ;Escherichia coli; XL-10 GOLD, Stratagene)에 형질전환하여 대장균 형질전환체를 확보하였다. 이러한 과정을 통하여 하우스키핑 (housekeeping) 유전자를 포함하여 정상세포에서 발현되는 유전자들은 소거되고 상대적으로 발현빈도가 낮았던 암세포주 특이 유전자들을 대량으로 확보할 수 있다. 본 발명의 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리의 구축에 사용하는 pBlueScript II SK(-) 벡터는 F1(-) ori (origin) 영역을 가지고 있어 제한효소NotI/XhoI 인식부위에 cDNA들을 단방향 (unidirection)으로 클로닝할 수 있다. 이와 같이 구축된 단일 클론들의 배양상청액으로 단일가닥의 안티센스를 쉽게 생산할 수 있다.
상기에서 사용된 안티센스 라이브러리의 단일가닥 안티센스 일련염기는 5 프라임 말단에 poly(T) 염기배열을 갖는데, 이러한 poly(T) 염기배열은 cDNA 센스 가닥의 poly(A) 꼬리 (tail)의 상보적인 염기배열에 해당한다. 상기 Poly(T) 염기배열은 다양한 길이를 가지고 목적하는 전사체가 아닌 다른 여타 전사체의 poly(A) 꼬리에 비특이적으로 결합할 가능성이 있으며, 이 경우에는 poly(A) 배열을 가진 매스킹 (masking) 올리고를 사전 처리하여 목적하는 전사체에 대한 비특이적 결합을 억제할 수 있다. 상기 매스킹 올리고는 안티센스 분자의 poly(T) 부분에 결합한 후 안정성과 결합성을 동시에 가져야 하므로 최소한 10 mer 이상의 올리고를 사용하는 것이 바람직하며 올리고의 양 말단을 포스포로치오에이트 (phophorothioate)로 변조하거나 캡핑 (capping) 혹은 또 다른 화학적 변조를 통하여 결합력을 높이는 동시에 안정성을 증가시킬 필요성이 있다.
<1-3> 재조합 페이지미드의 분리와 확인
상기 실시예 <1-2>에서 안티센스 cDNA 라이브러리의 구축으로 얻은 단일 클론들 중 일정 크기 이상의 cDNA 단편을 가진 것을 일차적으로 선별하기 위해 우선은 재조합 페이지미드를 단시간에 효율적으로 정제할 수 있는 크랙킹 방법 (Cracking method,Biotechniques,24, 748, 1998)을 사용하였다.
구체적으로, LB 고형배지에서 14 ∼ 16시간 동안 배양한 콜로니를 암피실린 (50 ㎎/㎖)이 첨가된 1 ㎖ LB 액체배지에 접종한 후 14 ∼ 16시간 동안 진탕배양 (37℃에서 250 rpm)하였다. 배양액 1 ㎖ 중 300 ㎕를 1.5 ㎖ 튜브로 옮긴 후 원심분리 (6,000 rpm, 상온, 5분)하여 세포침전물을 얻고 여기에 40 ㎕의 겔 로딩 완충용액 (gel loading buffer, 0.25% bromophenol blue, 30% glycerol)과 14 ㎕의 페놀-클로로포름 (phenol-chloroform, 비율 25 : 24) 혼합액을 첨가하고 30초 동안 강하게 진탕 (vortex)하였다. 이후 다시 원심분리 (12,000 rpm, 상온, 10분)를 한 후 상등액 8 ㎕를 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 일정크기 이상의 유전자를 가진 단일 클론들만 선별하였다 (도 9).
상기에서 선별된 단일 클론들이 실제로 일정크기 이상의 cDNA 단편을 가지는지 확인하기 위하여, LB 고형배지에 14 ∼ 16시간 배양된 콜로니 (colony)를 암피실린 (50 ㎎/㎖)이 첨가된 3 ㎖ LB 액체배지에 접종한 후 14 ∼ 16시간 동안 진탕배양 (37℃에서 250 rpm)하여 얻은 배양액으로부터 알카리 변성법을 사용하여 재조합 페이지미드를 분리하였다. 구체적으로, 배양액 1.5 ㎖을 원심분리 (14,000 rpm에서 30초간)하여 상층액은 버리고 회수한 침전물 (pellet)에 4℃의 용액 Ⅰ (50 mM glucose, 25 mM Tris-base, 10 mM EDTA, pH 8.0)을 100 ㎕씩 분주하고 진탕 (vortex)하여 완전히 재부유시켰다. 상기에 용액 Ⅱ (2 % SDS, 0.4 N NaOH)를 각각 100 ㎕씩 분주하여 혼합한 후 얼음에 10분간 정치시켰다. 정치 후 용액 Ⅲ (5 M potassium acetate 60 ㎖, glacial acetic acid 11.5 ㎖, H2O 28.5 ㎖)를 150 ㎕씩 넣고 얼음에 15분간 정치한 후 원심분리 (12,000 rpm, 4℃, 10분)하였다. 이로부터 얻은 상층액을 1.5 ㎖ 튜브로 옮기고 에탄올로 침전시킨 후 원심분리 (14,000 rpm, 4 ℃, 15분)하여 페이지미드 DNA를 분리하였다.
재조합 페이지미드 내에 존재하는 cDNA 단편의 크기를 확인하기 위하여 다양한 제한효소 (AccI,BamH I,BglII,EcoR I,EcoR V,KpnI,NotI,SacI,PstI,XhoI 등)로 처리한 후 0.7 ∼ 1.2%의 아가로즈 겔 (agarose gel)에 전기영동을 수행하였다. 이로부터 삽입된 cDNA와 벡터의 크기가 확인된 재조합 페이지미드는 15% 글리세롤 보관액 (glycerol stock)으로 만들어 -70℃에서 보존하면서 필요에 따라 사용하였다.
본 발명자들은 본 과정을 통해 간 정상조직 및 간암조직으로부터 제작한 단방향성 선택 안티센스 cDNA 라이브러리 (unidirectional subtracted antisense liver cDNA library)에서 무작위로 선택한 9,600개의 클론들 중 500 bp 이상의 cDNA를 가진 1,200여개의 클론을 선별하였고, 이 중 일부 클론들을 유전자 염기서열 분석을 통해 동정하였다 (도 11).
<1-4> 단일가닥 안티센스 DNA의 분리 및 정제
상기 실시예 <1-3>에서 일정크기 이상의 cDNA 단편을 가지고 있음이 확인된 단일 클론들로부터 단일가닥 안티센스 DNA를 분리·정제하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 암피실린 (최종농도 50 ㎍/㎖)과 테트라사이클린 (최종농도 50 ㎍/㎖)첨가된 LB 고형배지에서 생육한 콜로니를 암피실린 (최종농도 50 ㎍/㎖)이 첨가된 2×YT 액체배지 (tryptone 16 g, yeast extract 10 g, NaCl 10 g / 1000 ㎖) 2 ㎖에 접종한 후 6 ∼ 8시간 동안 진탕배양 (37℃, 250 rpm)한다. 이어 암피실린이 첨가되지 않은 신선한 2 ×YT 액체배지 3 ㎖에 상기 배양액 30 ㎕와 M13 헬퍼 박테리오페지 (M13 helper bacteriophage) 9 ㎕를 접종한 후 계속 진탕배양 (37℃, 250 rpm, 1시간)하였다. 배양 후 카나마이신 (kanamycin : 25 ㎎/㎖ ) 4.2 ㎕를 넣고 5 ~ 6시간 동안 추가적으로 진탕배양하였다.여기서 얻은 배양액으로부터 단일가닥 안티센스 DNA를 대규모로 분리정제하기 위하여 정제 킷트 (QIAprep 96 M13 Kit, QIAGEN, GERMAN) 및 정제장치 (QIAVAC Vacumn Manifold, QIAGEN, GERMAN)를 사용하였고, 일련의 정제는 제조사의 지침에 따라 하였다. 단일가닥 안티센스 DNA의 확인은 0.7 ∼ 1.2%의 아가로스 겔 상에서의 전기영동으로 수행하였다.
<1-5> 안티센스 분자의 세포내 전달체와의 복합체 형성 및 형질감염
안티센스의 활성을 극대화하기 위해서는 안티센스 분자를 효율적으로 세포내로 전달하여야 한다. 본 발명의 유전자 검색 및 기능 분석 방법에서는 이를 위해 양이온 리포좀, 양이온 폴리머, HVJ-리포좀 복합체 혹은 다른 인체 감염 바이러스의 표면에 부착하여 전달하는 등의 방법을 사용할 수 있으며, 대표적으로 양이온 리포좀을 사용한 경우의 계략적인 방법은 하기와 같다.
우선, 형질감염 하루 전날 간암세포주인 HepG2 세포를 96 웰 플레이트에 웰당 1 ×104개씩 분주하고 37℃, 5% CO2조건에서 24시간 배양하였고, 양이온 리포좀인 리포펙타민 2000 시약 (LIPOFECTAMINE 2000 reagent, Gibco BRL, USA)을 상기 실시예 <1-4>에서 확보한 제4세대 안티센스 분자와 복합체를 형성한 후 이들 복합체를 OPTI-MEM (Gibco BRL, USA)으로 희석하고 제조사의 지침에 따라 배양세포에 형질감염하였다. 안티센스 DNA와 양이온 리포좀의 혼합비율은 1 : 3 (w/w)으로 하였다. 형질감염 후 배양을 위한 배지로는 소태아 혈청(Fetal Bovine Serum)은 함유하나 항생제는 포함하지 않는 DMEM (Gibco BRL, USA) 을 사용하였고, 배양조건은 37℃, 5% CO2로 하였다.
<1-6> 대규모 유전자 검색 및 기능 분석
상기 <1-5>에서 수행한 형질감염 5일 후 대규모로 세포의 성장에 영향을 미치는 유전자를 검색하고 그 기능을 분석하기 위한 일례로서 MTT 분석법 (MTT Assay)을 하기와 같이 수행하였다. 구체적으로 이미 제4세대 안티센스-전달체 복합체를 형질감염 해 놓은 96 웰 플레이트의 각 웰의 배양배지를 제거하는 대신 50㎕의 신선한 DMEM 배지 (소 태아 혈청 함유, 항생제 미함유) 및 25 ㎕ (5 mg/ml)의 MTT 시약 (3-(4,5-dimethylthazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, SIGMA, USA)을 첨가하고 37℃에서 4시간 반응시켰다. 이후 각 웰마다 0.1 N HCl을 함유하는 이소프로파놀(isopropanol)을 150 ㎕씩 첨가하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 형질감염을 하지 않은 대조군과 형질감염을 한 실험군의 흡광도를 570 nm에서 측정하고 성장저해율을 계산하였다. 그 예로서, 본 발명자들은 192개를 선별하였을 때 50~90%에 이르는 다양한 저해율을 나타내는 12개의 안티센스 분자를 선별할 수 있었다 (그림 13).
상기의 실험예에서와 같이 선별된 안티센스 분자들은 해당 유전자의 동정을 위해 염기서열을 분석하고, 미지 유전자의 기능을 확인하기 위해 다양한 실험 방법들을 통해 추가적인 기능분석을 수행할 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템은 기존의 안티센스 분자에 비해 소량으로도 월등한 효과를 나타낼 수 있고 전사체의 전체 염기서열을 대상으로 안티센스 길이를 자유롭게 제작할 수 있다. 더불어 미생물을 형질전환체로 사용하여 안티센스를 용이하게 대량 생산할 수 있으며, 제 4세대 안티센스 기술을 이용하여 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리를 구축함으로써 기능이 밝혀져 있지 않은 미지의 유전자를 대규모로 검색하고 기능을 분석할 수 있을 뿐 아니라 난치성 질환에 대한 안티센스 치료제의 후보자를 선별하는데 있어서도 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 신규 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템은 다양한 세포주 및 조직에 대한 일반적인 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리를 구축할 수 있을 뿐 아니라 정상조직에 비해서 질병조직에 특이적으로 과발현하는 유전자를 우선적으로 클로닝할 수 있는 단방향성인 동시에 선택적인 (subtracted) 안티센스 cDNA 라이브러리를 구축함으로써 기능이 밝혀지지 않은 유전자의 기능을 대량으로 밝히는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (19)

1) 특정 또는 질환관련 세포주 및 조직으로부터 전체(total) RNA를 분리하는 단계;
2) 상기 RNA를 주형으로 역전사반응 (reverse transcription)을 수행하여 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하고 이로부터 두 번째 가닥 cDNA를 합성하는 단계;
3) 상기와 같이 합성된 cDNA 말단에 제한효소 어댑터 (adaptor)를 결합시키는 단계;
4) 동일한 제한효소가 처리된 페이지미드 벡터에 상기 cDNA 단편을 클로닝하여 재조합 페이지미드를 제조하는 단계;
5) 상기 재조합 페이지미드를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
6) 형질전환체와 헬퍼 페이지 (helper phage)의 동시감염 (coinfection)에 의해 단일가닥 안티센스 DNA를 생산하여 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리를 구축하는 단계로 구성되는 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 단계 1)의 RNA는 폴리(A)+mRNA인 것을 특징으로 하는 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 단계 3)의 어댑터는EcoRⅠ 제한효소 인식부위를 포함하는것을 특징으로 하는 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 단계 4)의 페이지미드 벡터는 F1(-) ori 영역을 포함하여 단방향의 폐쇄형 단일가닥 안티센스 분자를 제조할 수 있는모든벡터를 특징으로 하는 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리의 제조 방법.
제 1항의 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리의 제조 방법에 의하여 구축된 단방향성 안티센스 cDNA 라이브러리.
1) 질환관련 세포주 또는 조직으로부터 전체 RNA를 분리한 후 이를 주형으로 역전사반응 (reverse transcription)을 수행하여 검체 cDNA (tester cDNA)를 합성하는 단계;
2) 정상 세포주 또는 조직으로부터 전체 RNA를 분리하고 정제한 후 이를 주형으로 역전사반응을 수행하여 조종 cDNA (driver cDNA)를 합성하는 단계;
3) 단계 1의 검체 cDNA를 서로 다른 튜브에 분주한 후 서로 다른 제한효소 인식부위를 가지는 어댑터를 각각 결합시켜 두 종의 검체 cDNA를 제조하는 단계;
4) 상기 두 종의 검체 cDNA를 함유하는 튜브를 단계 2의 조종 cDNA를 함유하는 튜브와 각각 혼합하여 1차 혼성화 (first hybridization)시키는 단계;
5) 단계 4에서 1차 혼성화시킨 각각의 튜브들을 서로 혼합하여 2차 혼성화 (second hybridization)시킨 후 PCR을 수행하여 cDNA 단편을 증폭하는 단계;
6) 상기와 같이 증폭된 cDNA 단편을 페이지미드 벡터에 클로닝하여 재조합 페이지미드를 제조하는 단계;
7) 상기 재조합 페이지미드를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
8) 형질전환체와 헬퍼 페이지 (helper phage)의 동시감염 (coinfection)에 의해 단일가닥 안티센스 DNA를 생산하여 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리를 구축하는 단계로 구성되는 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리의 제조 방법.
제 6항에 있어서, 단계 2)의 정제는 폴리(A)+ RNA를 사용하여 정제하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 6항에 있어서, 단계 3)의 어댑터는 제한효소NotⅠ 또는EagⅠ 인식부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리의 제조 방법.
제 6항에 있어서, 단계 6)의 페이지미드 벡터는 F1(-) ori 영역을 포함하여 단방향의 폐쇄형 단일가닥 안티센스 분자를 제조할 수 있는 모든 벡터인 것을 특징으로 하는 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리의 제조 방법.
제 6항의 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리의 제조 방법에 의하여 구축된 단방향성인 동시에 선택적인 안티센스 cDNA 라이브러리.
1) 제 1항 또는 제 6항의 방법에 의하여 안티센스 cDNA 라이브러리를 구축하는 단계;
2) 안티센스 cDNA 라이브러리의 구축으로 얻은 단일 클론 중 100 bp 이상의 cDNA 단편을 선별하는 단계;
3) 상기에서 선별된 단일 클론을 배양하여 단일가닥 안티센스 분자를 얻는 단계;
4) 상기 안티센스 분자를 이용하여 안티센스 분자-전달체 복합체를 형성하는 단계;
5) 마이크로플레이트에서 상기 안티센스 분자-전달체 복합체를 세포주에 적용한 후 1차적인 유전자 기능검색을 수행하는 단계; 및
6) DNA 염기서열 분석 및 DNA 데이터 베이스를 이용하여 기능이 밝혀져 있지 않은 미지의 유전자를 검색하고 2차적인 유전자의 기능을 분석하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
제 11항에 있어서, 단계 1)의 안티센스 cDNA 라이브러리는 제 5항의 단방향성 (unidirectional) 안티센스 cDNA 라이브러리 또는 제 10항의 단방향성인 동시에 선택적인 (unidirectional and substracted) 안티센스 cDNA 라이브러리인 것을 특징으로 하는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
제 11항에 있어서, 단계 2)의 선별 방법은
1) 안티센스 cDNA 라이브러리의 구축으로 얻은 단일 클론들을 배양하여 세포 침전물을 회수하는 단계;
2) 상기 세포 침전물로부터 재조합 페이지미드 DNA를 분리하는 단계;
3) 상기 재조합 페이지미드 DNA에 제한효소를 처리하여 절단하는 단계; 및
4) 상기 재조합 페이지미드 DNA를 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 삽입된 cDNA와 벡터의 크기를 확인하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
삭제
제 11항에 있어서, 단계 4)의 안티센스 분자-전달체 복합체에서 안티센스 분자의 전달체는 양이온 리포좀, 양이온 폴리머, HVJ-리포좀 복합체 및 다른 인체 감염 바이러스의 표면접착으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
삭제
제 11항에 있어서, 단계 5)의 1차적인 유전자 기능검색은 현미경을 이용한 세포의 형태학적 관찰, 세포사멸 및 세포 성장 상태 관찰, 특정 기질에 대한 반응 관찰을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
제 11항에 있어서, 단계 6)의 2차적인 유전자 기능 분석은 RT-PCR과 웨스턴 블럿 분석 (Western blot analysis)에 의한 mRNA 발현, 단백질 발현 및 단백질 활성의 측정 (면역분석 방법, immunoassay)을 통한 안티센스 활성에 의한 유전자 발현 억제 분석; MTT 분석, 사이미딘 편입 (thymidine incorporation) 양 측정, 콜로니 형성 실험, 사이토카인 수용체에 관한 인자의 탐색, DNA 복제관련 유전자의 탐색 및 크로마틴 활성화 인자 (histon acetylase)의 탐색을 통한 세포 성장과 분화 분석; 세포의 형태학적 변화, 핵의 응축 및 단편화, DNA 단편화, 세포사멸의 정량 분석, 세포사멸의 신호전달 기구 분석을 통한 세포사멸 (apoptossis) 분석; 및 세포주기 측정, 세포주기 억제 인자의 활성, 세포주기 촉진 인자의 활성, 세포주기 조절 인자간 복합체 형성 확인 분석을 통한 세포주기 조절의 분석으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
삭제
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