CN1656222A - 反义iap核碱基寡聚物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与IAP多核苷酸杂交的核碱基寡聚物以及应用它们来增强程序性细胞死亡和治疗增殖性疾病的方法。

Description

反义IAP核碱基寡聚物及其应用
发明背景
本发明涉及反义IAP核碱基寡聚物和运用它们诱导程序性细胞死亡的方法。
细胞死亡的一个途径被称作程序性细胞死亡，或程序性细胞死亡。程序性细胞死亡通常作为健康组织发育及维持的一个正常部分。该过程发生地如此之快以至于很难检测得到。
现在已经知道程序性细胞死亡的途径在胚胎的发育、病毒的发病机理、癌症、自身免疫性疾病、神经变性疾病以及其它的一些情况中起到关键作用。细胞凋亡反应的衰竭已经牵涉到癌症，自身免疫性疾病如红斑狼疮和多发性硬化症，以及包括与疱疹病毒、痘病毒和腺病毒相关的病毒性感染的发展。
近几年程序性细胞死亡在癌症中的重要性已经清楚。二十世纪七十年代末生长促进癌基因的识别使几乎全世界聚焦于统治癌症生物学研究多年的细胞增生。长期存在的教条认为相对于“正常”细胞来说抗癌治疗优选地靶向于快速分化癌细胞。这种解释不完全令人满意，因为一些慢生长肿瘤容易治疗，而许多快速分化肿瘤类型对抗癌治疗极其抵抗。目前癌症领域的进展导致了一种新的癌症生物学模式，其中瘤形成被视为是没有完成程序性细胞死亡的正常途径。正常的细胞通过各种生长因子接收从它们的邻细胞传来的连续的反馈，如果从其所处的环境中移开就会“自杀”。癌细胞以某种方式绕开这些命令，持续的不适当的增殖。许多癌症治疗，包括放射疗法和许多化学疗法，以前被认为通过引起细胞损伤起作用，现在认为事实上是通过引发程序性细胞死亡起作用的。
虽然这种抵抗的决定因素现在仅在研究之中，然而正常细胞类型和癌症细胞类型均显示出对细胞凋亡触发剂的宽量程的敏感性。许多正常的细胞类型对亚致死剂量的放射或细胞毒类化学药物产生响应，经历暂时的生长抑制，而邻近的癌症细胞产生程序性细胞死亡。这种在给定剂量下的不同效果提供了可以成功治疗癌症的决定性的治疗窗。因此，肿瘤细胞对程序性细胞死亡的抵抗作为癌症治疗失败的主要原因也就不足为奇了。
已经鉴定了几种抑制程序性细胞死亡的有效的内源性蛋白质，包括哺乳动物细胞中的Bcl-2，IAP(程序性细胞死亡抑制剂)家族。后一家族中的某些成员直接抑制终端效应器半胱天冬酶，即参与完成细胞死亡的casp-3和casp-7，还抑制对于癌症化学疗法诱导的细胞死亡的调解十分重要的主要线粒体起始因子半胱天冬酶，casp-9。IAP是唯一的已知的内源性半胱天冬酶抑制剂，因此在程序性细胞死亡的调节中起着重要的作用。
IAP曾被假定为促成一些癌症的发生，MALT淋巴瘤中鉴定出一种假定因果的涉及一种特定IAP(cIAP2/HIAP1)的染色体易位。最近患急性骨髓性白血病的患者的情况说明了升高的XIAP，预后不良与短的存活率之间的相互关联。XIAP在许多NCI型的肿瘤细胞系中大大的过表达。
应用改良的癌症疗法成为一种需要，特别是能够诱导癌症细胞发生程序性细胞死亡和在此类细胞中避免提供抗细胞凋亡信号的疗法。
发明概述
总的来说，本发明涉及用于诱导细胞中程序性细胞死亡的方法和试剂。本发明的方法和试剂对治疗癌症和其它增殖性疾病有效。
本发明涉及核碱基寡聚物，特别是寡核苷酸，用于调解编码IAP的多核苷酸的功能。这些寡聚物减少产生的IAP的数量，此数量允许通常表达IAP的细胞产生程序性细胞死亡。这一点通过提供核碱基寡聚物来实现，所述核碱基寡聚物特异性的与编码IAP的一种或多种多核苷酸杂交。核碱基寡聚物与IAP多核苷酸(如RNA，DNA)的特异性杂交作用干扰IAP多核苷酸的正常功能，减少IAP蛋白质的产生数量。这种通过特异性杂交到靶位的化合物对靶核酸的功能的调解通常被称为“反义”。
一方面，本发明涉及长度多达30个核碱基的核碱基寡聚物，寡聚物包括选自SEQ ID NO：1-99，143，147，151，163-260，287，289和300-460序列的至少八个连续的核碱基。所要达到的是将寡聚物给予细胞时能够抑制IAP的表达。
在某些实施方案中，核碱基寡聚物包括选自SEQ ID NO：1-99，143，147，151，163-260，287，289和300-460的序列。令人期望的是核碱基寡聚物由(或基本上由)一种或多种上述的SEQ ID NOs组成。例如，核碱基寡聚物可以是包括选自SEQ ID NOs：97，98，99，143，147，151，287和289序列的XIAP反义核酸，包括选自SEQ ID NOs：300-389序列的HIAP1反义核酸，或者包括选自SEQ ID NOs：390-460序列的HIAP2反义核酸。在一个特别理想的实施方案中，本发明涉及具有11个DNA残基的核碱基寡聚物，所述DNA残基的每一侧连接有4个2’-O-甲基RNA残基并由下列序列中的一种组成：
                                                  5’-AUUGGTTC
CAATGTGUUCU-3’(SEQ ID NO：155)；5’-ACACGACCGCTAAGAAACA-3’(SEQ
ID NO：16)；5’-ACAGGACTACCACTTGGAA-3’(SEQ ID NO：157)；5’-UGCCAGTG
TTGATGCUGAA-3’(SEQ ID NO：27)；5’-GCUGAGTCTCCATATUGCC-3’(SEQ ID
NO：141)；5’-UCGGGTATATGGTGTCUGA-3’(SEQ ID NO：41)；5’-AAGCACTGCA
CTTGGUCAC-3’(SEQ IDNO：47)；5’-CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3’(SEQ ID
NO：51)；5’-ACCCTGGATACCATTUAGC-3’(SEQ ID NO：63)；5’-UGUCAGTACA
TGTTGGCUC-3’(SEQ ID NO：161)；和5’-UGCACCCTGGATACCAUUU-3’(SEQ
ID NO：151)。
本发明的核碱基寡聚物可以包括至少一个经修饰的键(如硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，磷酸三酯，二硫代磷酸酯，或者磷酸硒酸酯键)，经修饰的核碱基(如，5-甲基胞嘧啶)，和/或经修饰的糖部分(如，2’-O-甲氧乙基基团或2’-O-甲基基团)。在一个实施方案中，寡聚物是嵌合的寡聚物(如，一种寡核苷酸包括由硫代磷酸酯或磷酸二酯键连接的DNA残基，每一侧带有至少一、二、三或四个由硫代磷酸酯键连接的2’-O-甲基RNA残基)。
另一方面，本发明涉及一种增强细胞中程序性细胞死亡的方法。该方法包括给予细胞本发明的核碱基寡聚物以便IAP(如，XIAP，HIAP1，或HIAP2)的表达被抑制的步骤。核碱基寡聚物可以是，例如，反义化合物、双链RNA或核酶的组成部分。这一给药步骤可以单独进行或者与第二步(如给予化疗剂，生物反应调节剂，和/或化学致敏剂)结合。细胞可以是体外或体内的。在一个实施方案中，细胞是癌细胞(如人类癌细胞)或源于淋巴或骨髓的细胞。
在一个相关方面，本发明涉及通过给予动物有效量的本发明的核碱基寡聚物来治疗动物具有增生性疾病(如，癌症，淋巴增生性障碍或骨髓增生异常综合征)或预防这样疾病发生的方法。
癌症可以是例如急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性原粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性骨髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、何杰金氏病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤或视网膜母细胞瘤。治疗癌症时，优选还给予一种或多种化疗剂、生物反应调节剂、和/或化学致敏剂。优选的，给予一种或多种这些药剂是在给予核碱基寡聚物五天之内。典型的化疗剂是阿霉素(多柔比星)、长春烯碱、依托泊苷、紫杉醇和顺铂。可以应用任意一种能够在靶位形成有效量的给药方式，特别优选的给药方式是通过静脉内和瘤内给药。
另一方面，本发明涉及包括本发明的核碱基寡聚物和药学上可接受的载体的药物组合物。如果需要，药物组合物中还可以包括其他组分(如胶体分散体系或化疗剂)。
本发明还涉及一种能够切割XIAP，HIAP1或HIAP2mRNA的催化性RNA分子。在优选的实施方案中，催化性RNA分子的结合臂上包括相应于本发明的核碱基寡聚物的至少8个连续的核碱基(如表1、2、6和7中任意一个的核碱基序列)。RNA分子优选锤头状基序，但也可以是发夹结构，丁型肝炎病毒，组1内含子，VS RNA或RNA酶P RNA基序。
本发明还涉及表达载体，其包括编码一种或多种催化性RNA分子并且位置适当的核酸，用于在哺乳动物细胞中表达。
本发明还涉及一种通过给予动物有效量的上述催化性RNA分子或编码催化性RNA分子的表达载体来治疗患有癌症或淋巴组织增生性疾病的动物的方法。
在另外一方面，本发明涉及具有21至29个核碱基的双链RNA分子，其中至少八个连续的核碱基相应于表1、2、6和7中的任意序列。
一个相关的方面，本发明还涉及具有50至70个核碱基的双链RNA分子，所述的RNA分子包含21至29个核碱基的第一结构域，这些核碱基包括对应于表1，2，6和7中任一序列的至少8个连续的核碱基；与所述的第一结构域互补的第二结构域，以及位于所述第一和第二结构域之间的环形结构域，以便所述第一结构域和所述第二结构域能够复合形成双链发夹式RNA分子。本发明还以一种编码这种双链RNA的表达载体(如：腺病毒载体或逆转录病毒载体)为特征。
本发明还以一种通过给予动物有效量的上述双链RNA分子治疗患有癌症或淋巴增生性障碍的动物的方法为特征。
这里的“核碱基寡聚物”是指一种包括至少八个通过连接基团连接在一起的核碱基化合物。经过修饰和未经修饰的天然和非天然的寡核苷酸，以及寡核苷酸模拟物如蛋白质核酸(Protein Nucleic Acids)，锁核苷酸和阿拉伯糖核酸包括在该定义中。很多核碱基或连接基团用于本发明的核碱基寡聚物之中，包括那些下文在标题为“寡核苷酸和其它核碱基寡聚物”部分中详细描述的核碱基寡聚物。
“蛋白质”或“多肽”或“多肽片段”是指构成一种天然存在的多肽或肽的全部或部分，或者构成一种非天然存在的多肽或肽的两个氨基酸以上的任意链，不管翻译后修饰(如糖基化或磷酸化)。
“程序性细胞死亡”是指细胞死亡的程序，其中死亡细胞显示一系列具有明显特征的生化标志包括细胞膜起泡，细胞体皱缩，染色体凝聚和DNA梯形。通过编程性死亡的细胞包括神经元(如在神经变性疾病例如中风，帕金森氏病和阿尔默海茨病的过程中)，心肌症(在心肌梗塞后或充血性心力衰竭过程中)，和癌症细胞(如暴露于放射性或化疗剂后)。未减轻环境压力(如缺氧负荷)可以引起细胞进入程序性细胞死亡程序的早期，这一程序是可逆的(即在程序性细胞死亡程序早期的细胞可能被救活)。在细胞编程性死亡的晚期(定型期)，细胞不能被救活，结果将导致死亡。
已知的刺激和抑制不同种细胞程序性细胞死亡的蛋白质和化合物均是本领域公知的。例如，半胱天冬酶(ICE)家族的细胞内表达和激活诱导或活化程序性细胞死亡，然而IAP的表达或一些Bcl-2家族的成员抑制程序性细胞死亡。另外，在一些特别的细胞类型中有抑制细胞死亡的存活因子。例如，神经营养因子，如NGF抑制神经元的程序性细胞死亡。
这里的“IAP基因”是指编码具有至少一种BIR域的多肽，并且当以其它细胞内或细胞外递送方式提供时能够调节(抑制或增强)细胞或组织内程序性细胞死亡(如见US专利No.5,919,912)的基因。在优选的实施方案中，IAP基因是一种与至少一种人或小鼠XIAP、HIAP1或HIAP2(任何一种在US专利No.6,156,535中描述)具有大约50％或更多(如至少85％、90％或95％)同一性的基因。优选的测定同一性的序列的区域是编码至少一种BIR域和环锌指结构域的区域。哺乳动物IAP基因包括从任意的哺乳动物中分离的核苷酸序列。优选的哺乳动物是人类。
这里“IAP蛋白质”或“IAP多肽”是指一种由IAP基因编码的多肽或其片段。
这里的“IAP生物活性”是指已知在体内或体外通过IAP多肽引起的任何活性。
这里的“增强的程序性细胞死亡”是指增加那些在给定细胞群中(如癌症细胞、淋巴细胞、成纤维细胞或任何其它细胞)的程序性细胞死亡的细胞的数量。可以理解在特定试验中由一种提高程序性细胞死亡的化合物所引起的程序性细胞死亡提高的程度是不同的，但是本领域技术人员能够确定程序性细胞死亡的水平的统计学显著差异由此鉴定提高程序性细胞死亡的核碱基寡聚物，其中程序性细胞死亡受IAP抑制。优选的“提高程序性细胞死亡”是指与没有给予本发明的核碱基寡聚物但是接受了基本上类似的治疗的细胞相比，进行程序性细胞死亡的细胞的增加量至少是10％，优选25％甚至是50％；最优选的是增加至少一倍。优选的检测样本是正常的进行非充分的程序性细胞死亡的细胞(即，癌细胞)的样本。这里将描述在程序性细胞死亡的水平上检测变化的方法。
所述的“抑制目标基因的表达”的核碱基寡聚物是指相对于未经处理的对照组而言，能够减少至少5％，更优选至少大约10％，25％，甚至50％目标mRNA的数量，或者由这种mRNA编码的蛋白质的数量的核碱基寡聚物。测定mRNA和蛋白质水平的方法是本领域公知的；这里描述一些示例方法。
“杂交”是指互补核碱基之间的氢连接，可以是沃森-克里克，Hoogsteen或反式Hoogsteen氢连接。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢连接形成的互补核碱基对。
所述的“增生性疾病”是指由于不适当的高水平的细胞分化，不适当的低水平的程序性细胞死亡，或二者兼备所引起的疾病，或者能够导致这种不适当的高水平的细胞分化，不适当的低水平的程序性细胞死亡，或二者兼备的疾病。例如，癌症是增生性疾病的一个例子。癌症的例子包括，但不限于，白血球过多症(如，急性白血病，急性淋巴细胞性白血病，急性髓细胞性白血病，急性原粒细胞性白血病，急性早幼粒细胞性白血病，急性骨髓单核细胞性白血病，急性单核细胞性白血病，急性红白血病，慢性白血病，慢性髓细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病)红细胞增多症，淋巴瘤(何杰金氏病，非何杰金氏病)，特发性巨球蛋白血症，重链病，和实体瘤，如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤，粘液肉瘤脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤；间皮瘤，尤因氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头腺癌，囊腺癌，骨髓癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，尼罗导管癌，绒毛膜癌，精原细胞癌，胚胎性癌，维尔姆斯瘤(Wilims)，宫颈癌，子宫癌，睾丸癌，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，神经鞘瘤，脑脊膜瘤，黑素瘤，神经母细胞瘤，和视网膜母细胞瘤)。淋巴组织增生性疾病也被认为是增生性疾病。
优选的，本发明的核碱基寡聚物在不能正常的进行充分的程序性细胞死亡的细胞中能够增强程序性细胞死亡和/或减少IAP mRNA或蛋白质水平。相对于对照组而言，优选的增加至少10％，更优选增加25％，最优选增加1倍或更多。优选的本发明的核碱基寡聚物包括大约8至30个核碱基，其中至少八个连续核碱基是选自SEQ ID NO：1-99，143，147，151，163-260，287，289和300-460的序列。本发明的核碱基寡聚物还可以包括，例如，附加的20，40，60，85，120或更多的与IAP多核苷酸互补的连续的核碱基。核碱基寡聚物(或其中一部分)可以包括一个经修饰的骨架。硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯和其它经修饰的骨架是本领域公知的。核碱基寡聚物可以包括一或多个非天然连接。
所述的“化疗剂”是指用来杀死癌症细胞或减缓其生长的药剂。相应的，认为细胞毒性剂和细胞生长抑制剂都是化学治疗剂。
所述的“生物反应调节剂”是指刺激或恢复免疫系统抵抗疾病能力的药剂。一些，但不是全部，生物反应调节剂可以减缓癌症细胞生长，因此也被认为是化学治疗剂。生物反应调节剂的例子是干扰素(α，β，γ)，白细胞介素-2，美罗华(rituximab)和曲妥单抗(transtuzumab)。
所述的“化学致敏剂“是指能够使肿瘤细胞对化学治疗作用更加敏感的药剂。
所述的“治疗有效量“是指与未经治疗的患者相比能够改善疾病症状，抑制靶细胞生长，减小肿瘤的大小和数量，抑制IAP表达或增强靶细胞的程序性细胞死亡的化合物(例如，一种核碱基寡聚物)的量。本发明用来治疗异常增生(即，癌症)的活性化合物的有效量依赖给药方式，年龄，体重和受试者整体健康状况的不同而不同。最终，主治医师或兽医决定适当的量和剂量方案。这个量被认为是一个“有效的”量。
所述的“淋巴组织增生性疾病”是指淋巴系统的细胞(例如，T-细胞和B-细胞)异常增生的疾病，包括多发性硬化症，克罗恩病，红斑狼疮，类风湿性关节炎和骨关节炎。
所述的“核酶”是指具有酶活性，对于靶RNA分子具有特异性位点和分裂能力的RNA。核酶可以用于减少多肽的表达。应用核酶减少多肽表达的方法在如Turner等(Adv.Exp.Med.Biol.465：303-318，2000)和Norris等(Adv.Exp.Med.Biol.465：293-301，2000)中有所描述。
所述的“报告基因”是指编码一种其表达可被测定的多肽的基因；这样的多肽包括，但不局限于，葡萄糖醛酸酶(GUS)，荧光素酶，氯霉素转乙酰基酶(CAT)和β-半乳糖苷酶。
所述的“启动子”是指足以引导转录的多核苷酸。
所述的“可操作性连接”是指第一多核苷酸位于第二多核苷酸的邻近位置，该第二多核苷酸在有适当的分子(如，转录激活因子蛋白质)与其结合时能够引导第一多核苷酸的转录。
本发明的其它特征和优点将以下面的优选实施方案的说明和权利要求进一步加以明确。
附图简述
图1A-1L表示相对于总蛋白质而言，反义XIAP寡核苷酸对XIAP蛋白质表达的效果图。
图1B，1D，1F，1H，1J和1L是与模拟试验的转染结果相比，每一个寡核苷酸转染的总蛋白质浓度，模拟转染用来使上述的XIAP蛋白质结果标准化。
图2A-2C表示多种反义XIAP寡核苷酸，单独或结合起来，作用于XIAP RNA(图2A)和蛋白质(图2B)的效果图。图2C是与模拟转染结果相比较每一个寡核苷酸转染的总蛋白质浓度值，模拟转染用来使图2B中表示的XIAP蛋白质结果标准化。
图3和图4表示31nM(图3)或63nM(图4)的4×4混合骨架(MBO)FG8或E12寡核苷酸的效果图。H460肺癌细胞用125nM MBO和Lipofectamine 2000在一天两天或连续三天中转染18小时。在指示时间采集用于蛋白质印迹法(western)分析的样本。进行光密度扫描法，XIAP蛋白质水平以GAPDH为标准，与定位至100％的模拟对照试验相比较。标明的百分数表示XIAP蛋白质对特异的无序(Scrambled)对照组的百分数。
图5A-5D表示反义XIAP寡核苷酸对细胞活力的效果图(图5A，5C和5D)，以及阿霉素存在时的化学致敏作用(图5B)。
图6表示在体外H460细胞中寡核苷酸介导的特异的XIAP mRNA的下降。描述在H460细胞内用单独的Lipofectamine 2000(LFA)处理，或用1.2□M的寡核苷酸F3、G4、C5、AB6、DE4或D7和Lipofectamine 2000处理，或用分别的反极性(RP)或无序(SC)寡核苷酸对照品处理的XIAP mRNA图。进行转染6个小时的XIAP mRNA相对量的实时RT-PCR定量。所有的数据都以代表性试验中的三个数据的平均值±标准偏差(SD)表示。同等实验条件下未处理细胞(对照组)中的XIAP mRNA的水平指定为1。
图7表示用不同的PS-XIAP寡核苷酸转染后H460细胞的XIAP RNA的水平。H460人类肺癌细胞用1uM PS-寡核苷酸和Lipofectamine 2000转染6个小时。然后采集细胞做Taqman分析。
图8表示用4×4 MBO转染9小时后H460细胞中的XIAP RNA的水平图。H460细胞用62.5nM至1uM的4×4 MBO和Lipofectamine 2000转染9个小时。然后采集细胞做Taqman分析。
图9表示用4×4MBO转染24小时后H460细胞中的XIAP蛋白质降低(knockdown)。H460细胞用1uM的4×4 MBO和Lipofectamine 2000转染24个小时。然后采集细胞做蛋白质印迹分析。进行光密度扫描法测定，XIAP蛋白质水平用肌动蛋白校正，与被设置为100％的特定无序(sm，rm)的对照组相比较。
图10A和10B是表示体外H460细胞中的XIAP蛋白质的反义介导的特异性下调的示意图。描述单独用Lipodectamine 2000(LFA)处理，或用LFA加上1.2uM XIAP寡核苷酸F3、G4或C5处理，或用它们各自的寡核苷酸对照(RP，SC)处理的H460细胞中的XIAP蛋白质水平。XIAP蛋白质水平用蛋白质印迹法分析(图10A)，蛋白质的量用光密度法来定量(图10B)。XIAP水平用细胞肌动蛋白水平校正，与未经处理的对照组(CNT)水平相比。
图11A和11B是表示XIAP寡核苷酸介导的对半胱天冬酶的作用的示意图。表示与对照组相比在转染的H460细胞中，1.2uM的XIAP寡核苷酸F3、G4或C5或它们各自的RP和SC ODN对照对前-半胱天冬酶-3，PARP(全长(116kDa)和经处理的(85kDa))(图10A)和Bcl-2和Bax蛋白水平(图10B)表达的影响。用蛋白质印迹法分析蛋白质的表达。Bcl-2和Bax蛋白质水平以细胞肌动蛋白水平为标准，用光密度法定量。Bcl-2和Bax的比率以两个或三个独立的实验的平均值表示，对照组(CNT)的比率设为1。
图12A和12B是表示XIAP特异寡核苷酸诱导程序性细胞死亡的图解。在用1.2uM XIAP G4 AS寡核苷酸，G4 SC寡核苷酸处理的或未经处理的对照组(CNT)的H460细胞中测定程序性细胞死亡的诱导。
图12A表示具有亚-G0/G1 DNA含量(细胞凋亡的)的细胞的百分数，用碘化丙锭(PI)染色和流式细胞仪测量。图12B表示用DAPI染色的寡核苷酸处理的H460细胞的核形态学。箭头表示具有核DNA皱缩或剪切的特征性细胞凋亡形态学的细胞。
图13A是XIAP G4 AS寡核苷酸治疗对H460细胞活力影响的效果图。细胞用浓度递增的单独的LFA或LFA与G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸复合的LFA-寡核苷酸复合物处理，处理24小时后通过MTT分析测定细胞活力。数据以三个独立实验的平均值±SD表示。
图13B表示在有或没有阿霉素(DOX)、紫杉醇、长春烯碱(VNB)或依托泊苷(Etop)存在时，在0.4uM剂量下，用单独的LFA或LFA与G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸复合的LFA-寡核苷酸复合物处理后死亡H460细胞的百分数，以MTT分析测定。数据以三个独立的实验的平均值±SD表示。
图14表示用XIAP AS 2×2 MBOs和长春烯碱处理的小鼠的相对H460肿瘤生长。寡核苷酸以50ug/g瘤质量瘤内注射于皮下移植H460细胞异种移植物的SCID-RAG2小鼠。这种治疗与给予长春烯碱相结合。
图15是表示用XIAP AS PS-寡核苷酸系统治疗的小鼠的平均H460细胞肿瘤大小的图。将XIAP AS PS-寡核苷酸系统给药(腹膜内注射)于皮下植入H460细胞异种移植物的SCID-RAG2小鼠，与对照组相比减小了肿瘤的体积。
图16是表示用XIAP AS PS-寡核苷酸系统治疗的小鼠中MDA-MB-435/LCC6人乳腺癌细胞肿瘤大小的图。将XIAP AS PS-寡核苷酸系统给药于在乳房脂肪垫中植入LCC6细胞异种移植物的雌性SCID-RAG2小鼠，与对照组相比减小了肿瘤的体积。
图17是表明在体内G4寡核苷酸对肿瘤生长和肿瘤XIAP蛋白质水平的效果的示意图。全身给予裸XIAP G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸对雄性SCID-RAG2小鼠皮下H460细胞异种移植物生长的抗肿瘤效力。所有的数据以平均值±SEM表示(n＝6只小鼠/组)。
图18A和18B是描述单独用G4 AS寡核苷酸、G4 SC寡核苷酸或赋形剂(对照)治疗21天后SCID-RAG2小鼠中植入的H460肿瘤异种移植物中的XIAP的蛋白质表达水平，用蛋白质印迹法分析，用光密度法定量。XIAP的水平用细胞的肌动蛋白校正。所有的数据以平均值±SD表示(n＝3)。
图19A和19B表示用15mg/kg系统给药XIAP G4 AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸超过21天后，G4寡核苷酸对植入SCID-RAG2小鼠的H460肿瘤的组织病理学体内影响的显微照片。图19A描述用苏木精和伊红染色的肿瘤切片。图19B表示肿瘤切片中泛素表达的免疫组织化学。展示了典型的肿瘤显微照片。内部的刻度标记等于100μm。
图20A和20B表示长春烯碱(VNB)与XIAP寡核苷酸联合使用体内效力增加的图。测定SCID-RAG2小鼠中VNB联合或不联合XIAP G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸的抗H460肿瘤异种移植物的效力。图20A描述单个药剂的抗肿瘤活性，而图20B描述VNB和G4寡核苷酸联合使用的抗肿瘤活性。所有的数据以平均值±SEM表示(n＝6只小鼠/组)。
图21是表示HIAP1寡核苷酸对HIAP1 RNA水平影响的图。
图22A和22B是表示蛋白质印迹的光密度扫描的示意图，该蛋白质印迹法显示HIAP1寡核苷酸对细胞阻断放线菌酮诱导的HIAP1蛋白质上调的能力的作用。
图23是表示通过总蛋白质测量HIAP1表明寡核苷酸对细胞毒性的影响图。
图24是表示对HIAP1寡核苷酸APO 2序列特异性的验证的图。
图25表示HIAP1寡核苷酸对抗药SF295成胶质细胞瘤化学致敏作用的影响。
发明详述
本发明提供抑制IAP表达的核碱基寡聚物和将其用于细胞中诱导程序性细胞死亡的方法。本发明的核碱基寡聚物也可以用于形成药物组合物。本发明还涉及提高细胞内程序性细胞死亡的方法，该方法是将本发明的寡核苷酸与化疗剂，如细胞毒性剂、细胞生长抑制剂或生物反应调节剂(如，阿霉素、长春烯碱、依托泊苷、紫杉醇、顺铂、干扰素、白细胞介素2、单克隆抗体)联合给药。化学治疗剂可以是，例如，如果需要，也可以给予化学致敏剂(即一种使增殖的细胞对化学治疗更加敏感的药剂)。上述药剂的任意结合可以构成药物组合物。这些药物组合物用来治疗增生性疾病，如，癌症或淋巴增生性障碍，或增生性疾病的症状。本发明的核碱基寡聚物也可以与放射疗法结合用来治疗癌症或其它增生性疾病。
癌症细胞中程序性细胞死亡的激活作用提供了新的强效改善患者对常规的化学治疗或放射治疗的响应的方法。就直接抑制半胱天冬酶和抑制程序性细胞死亡的能力而言，XIAP是IAP基因家族中最有效的成员。我们研究过在体内和体外XIAP通过反义(AS)寡核苷酸的下调对人类非小细胞肺癌(NIH-H460)生长的作用。经实时RT-PCT和蛋白质印迹法测定，在培养的H460人类肺癌细胞中，寡核苷酸G4 AS被鉴定为最有效的化合物，分别有效地下调XIAP mRNA55％，下调蛋白质水平高达60％，在1.2uM浓度时诱导60％的细胞死亡。相反的，无序对照组G4寡核苷酸仅引起很少的XIAP损失和小于10％的细胞死亡。由前-半胱天冬酶-3和PARP蛋白质的降解显示，用G4 AS的治疗诱导程序性细胞死亡，在1.2uM浓度时伴随显著的核DNA浓缩和剪切。而且，XIAP AS寡核苷酸使H460细胞对阿霉素，紫杉醇，长春烯碱和依托泊苷的细胞毒性效应敏感。在动物模型中，我们证明在系统的腹膜内给药的SCID/RAG2-免疫缺陷小鼠的异种移植物模型中15mg/kg的G4 AS对人类H460肿瘤具有显著的序列特异性的生长抑制作用。系统的AS ODN给药与肿瘤异种移植XIAP蛋白质下调85％有关。15mg/kg的G4 AS和5mg/kg的长春烯碱联合应用明显的抑制肿瘤的生长，比它们分别单独使用效果明显。这些研究表明XIAP的下调是肺癌细胞死亡的一个明显信号，并且能够在体外诱导程序性细胞死亡，在体内抑制肿瘤生长。这些研究支持IAP是人类非小细胞肺癌和其它实体瘤的癌症治疗的适当靶位的论点。
治疗
治疗可以用在癌症治疗之处：家中，医师诊室，诊所，医院的门诊部，或住院部进行。治疗通常由住院开始，以便于医生可以近距离的观察治疗效果和做出所需的调整。治疗的持续时间取决于被治疗的癌症的种类，患者的年龄和状况，所患疾病的阶段和类型，患者机体对治疗的响应情况。给药应有不同的间隔(如，每天一次，每周一次，或每月一次)。治疗应按照启动和停止循环进行，这种循环包括修整期以便于患者的机体有机会构造新的健康的细胞并且恢复机体的抵抗力。
根据癌症的种类和其所处的阶段，治疗可以用来减缓癌症的扩散，减慢癌症的生长，杀死或捕获可能从原始的肿瘤扩散到身体其它部位的癌症细胞，减轻由癌症引起的症状，避免癌症的首次发生。
这里所用的术语“癌症”或“新生物”或肿瘤细胞“是指以异常方式增长的细胞的集合。癌症生长是不受控制的和递增的，在不激发情况下发生，或者将使正常细胞的增生停止。
本发明的核碱基寡聚物或其它IAP抗细胞凋亡的路径的负调节物可以在药学可接受的稀释剂，载体或赋形剂中以单位药剂的形式给药。采用常规的药学方法制备合适的药剂或组合物，通过这些药剂或组合物将化合物给予患有由过度细胞增生引起的疾病的患者。给药可以在患者具有症状之前。任何适当的给药途径都可以采用，例如，肠胃道外给药，静脉内，动脉内，皮下，瘤内，肌内，颅内，眶内，眼睛，心室内，肝内，囊内，鞘膜内，脑池内，腹膜内，鼻内，气雾剂，栓剂，或口服给药。例如，治疗药剂可以是液体溶液或混悬液的形式；对于口服给药，制剂可以是片剂或胶囊；鼻内给药制剂是粉末剂，滴鼻剂或气雾剂。
本领域技术人员公知的制备药剂的方法在，例如″Remington：TheScience and Practice of Pharmacy″Ed.A.R.Gennaro，LippincourtWilliams & Wilkins，Philadelphia，PA，2000中公开。例如肠胃道外给药的制剂可以包括赋形剂，无菌水，或盐，聚二醇，如聚乙二醇，植物油，或氢化萘。生物相容的，生物可降解的丙交酯聚合物，丙交酯/乙交酯共聚物，或聚氧乙烯-聚丙乙烯共聚物可以用来控制化合物的释放。其它的可用作IAP调节化合物的有用的肠胃道外递药系统包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗粒，渗透泵，可植入的灌注系统和脂质体。可吸入的药剂可以包括赋形剂，例如，乳糖，或者可以是水溶液包括，例如，聚氧乙烯-9-月桂基醚，甘氨胆酸盐，和脱氧胆酸盐，或以滴鼻剂或凝胶形式给药的油溶液。
药剂以治疗有效量(如，预防、消除或减轻病理状态的量)给予患者，提供对疾病或病症的治疗。本发明的核碱基寡聚物的优选的剂量可能依赖于疾病的类型和程度，特定患者的整体健康状况，复方赋形剂的组成和给药途径的变化。
如上所述，如果需要，本发明的核碱基寡聚物的治疗可以与治疗增生性疾病的其它疗法(如放射性疗法，外科手术或化学疗法)联合使用。
对于上述的任何一种方法，本发明的核碱基寡聚物优选以静脉内给药或施用于需要发生程序性细胞死亡的位点(例如，注射)。
寡核苷酸和其它核碱基寡聚物
至少两种寡核苷酸通过RNA酶H诱导RNA的剪切：具有磷酸二酯(PO)或硫代磷酸酯(PS)连接的多聚脱氧核苷酸。虽然2′-OMe-RNA序列表现出对RNA靶位的高亲合力，但是这些序列不是RNA酶H的作用底物。一种理想的寡核苷酸是基于2’-修饰的寡核苷酸，该寡核苷酸包含寡聚脱氧核苷酸缺口其中一些或所有核酸间连接键修饰成硫代磷酸酯以抵抗核酸酶。甲基膦酸酯修饰的存在提高了寡核苷酸与它的靶位RNA的亲和力，由此降低了IC50。这种修饰也增加了修饰的寡核苷酸对核酸酶的抵抗。可以理解本发明的方法和制剂可以与任何其它先进的方法结合使用，包括共价闭合的多重反义(CMAS)寡核苷酸(Moon等，Biochem J.346：295-303，2000；PCT公开号No.WO 00/61595)，带状反义(RiAS)寡核苷酸(Moon等，J.Biol.Chem.275：4647-4653，2000；PCT公开号WO 00/61595)和大环反义寡核苷酸(美国专利申请公开号US 2002/0168631 A1)。
如本领域公知的，核苷是核碱基-糖的结合体。核苷的碱基部分通常是一个杂环的碱基。这种杂环的碱基中最常见的两类是嘌呤和嘧啶。核苷酸是糖部分与磷酸基共价连接的核苷。对于那些包括戊呋喃糖的核苷来说，磷酸基可以与糖的2’，3’或5’位的任意羟基部分连接。在形成寡核苷酸中磷酸基共价链接邻近的核苷形成线性的多聚体化合物。依次的，这个线性的多聚体结构的尾端进一步链接形成环状结构；开放的直线形结构通常是优选的。在寡核苷酸结构中，磷酸基通常被认为形成寡核苷酸的骨架。RNA和DNA的通常的连接或骨架是3’和5’磷酸二酯连接。
用于本发明的优选的核碱基寡聚物的特例包括含有经修饰的骨架或非天然的核苷间链接的寡核苷酸。如说明书中定义的，具有经修饰的骨架的核碱基寡聚物包括在骨架中保留磷原子的及骨架中没有磷原子的。根据本说明书的目的，那些核苷间的骨架没有磷原子的经修饰的寡核苷酸也被视为核碱基寡聚物。
具有经修饰的寡核苷酸骨架的核碱基寡聚物包括，例如，硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基-磷酸三酯，甲基或其它烷基磷酸酯包括3’-烯基磷酸酯和手性磷酸酯，次膦酸盐，氨基磷酸酯包括3’-氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯，硫代氨基磷酸酯，硫代烷基磷酸酯，硫代烷基磷酸三酯，具有正常的3′-5′连接的硼烷磷酸酯，这些化合物2′-5′连接的类似物，和那些具有反向极性的化合物，其中核碱基单元的邻近配对是3′-5′连接至5′-3′或2′-5′链接至5′-2′。也包括各种盐，混合盐和游离酸的形式。教导上述含磷链接的制备方法的典型美国专利包括，但不限于，美国专利号No.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361和5,625,050，全部引入这里作为参考。
具有不含磷原子的经修饰的寡核苷酸骨架的核碱基寡聚物具有由短链烷基或环烷基核苷间连接，混合杂原子和烷基或环烷基核苷间链接，或一种或多种短链杂原子或杂环的核苷间连接构成的骨架。包括那些具有吗啉代连接(部分的由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物，亚砜和砜的骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；包含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和氨苯磺胺骨架；酰胺骨架；和其它具有混合的N，O，S和CH2构成部分。教导上述寡核苷酸制备的典型的美国专利包括，但不限于，美国专利No.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,4 39，这些都全文引入作为参考。
在其它核碱基寡聚物中，糖和核苷间连接，即骨架，被一些新的基团取代。核碱基单元保留与IAP杂交。这样的核碱基寡聚物被认为是肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含有酰胺的骨架取代，特别是氨基乙基甘氨酸骨架。核碱基被直接或间接的固定或束缚到骨架的酰胺部分的氮杂氮原子上。制备或应用这些核碱基寡聚物的方法记述在如″Peptide Nucleic Acids：Protocols andApplications″Ed.P.E.Nielsen，Horizon Press，Norfolk，UnitedKingdom，1999中。教导制备PNA的典型的美国专利包括，但不局限于，美国专利号No.5,539,082；5,714,331；和5,719,262，每一篇都引入这里作为参考。关于PNA的进一步教导见Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500。
在本发明的特别的实施例中，核碱基寡聚物具有硫代磷酸酯骨架和带有杂原子骨架的核苷，特别是-CH2-NH-O-CH2-，-CH2-N(CH3)-O-CH2-(已知的亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架)，-CH2-O-N(CH3)-CH2-，-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-，和-O-N(CH3)-CH2-CH2-。在其它的实施例中，寡核苷酸具有美国专利No.5,034,506描述的吗啉代骨架结构。
核碱基寡聚物还可以包含一或多个取代的糖部分。核碱基寡聚物在2’位含有下列基团：OH；F；O-，S-，或N-烷基；O-，S-，或N-烯基；O-，S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基、炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。特别优选的是O[(CH2)nO]mCH3，O(CH2)nOCH3，O(CH2)nNH2，O(CH2)nCH3，O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是从1至大约10。其它优选的核碱基寡聚物包括在2’位是下列基团之一：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、改善核碱基寡聚物药物代谢动力学性质的基团、或改善核碱基寡聚物药效学性质的基团、和具有相似性质的其它取代基。优选的修饰是2′-O-甲基和2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，还公知为2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)。其它理想的修饰是2’-二甲基氨基氧乙氧基(即O(CH2)2ON(CH3)2，还公知为2’-DMAOE。其它的修饰包括，2’-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2′-F)。相似的修饰还可以是在寡核苷酸或其它核碱基寡聚物的其它位置，特别是在3’端核苷酸或2′-5′连接的寡核苷酸上的糖的3’位和5’端核苷酸的5’位。核碱基寡聚物还可以有糖的模拟物如环丁基部分来取代戊呋喃糖。教导这种经修饰的糖结构的制备的典型美国专利包括，但不局限于，美国专利No.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，每一篇都全文引入作为参考。
核碱基寡聚物还可以包括核碱基修饰或取代。这里所使用的“未修饰”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其它合成和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基和其它腺嘌呤和鸟嘌呤的烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基或其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基、和其它8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代(如，5-溴代)、5-三氟甲基和其它5-取代尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-去氮杂鸟嘌呤和7-去氮杂腺嘌呤；3-去氮杂鸟嘌呤和3-去氮杂腺嘌呤。更多的核碱基包括那些公开于美国专利No.3,687,808，The Concise Encyclopedia OfPolymer Science And Engineering，858-859页，Kroschwitz，J.I.，ed.John Wiley & Sons，1990，Englisch等，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613，Sanghvi，Y.S.，Chapter 15，Antisense Research and Applications，289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，ed.，CRC Press，1993中的核碱基。这些核碱基中的某些对于增强本发明的反义寡核苷酸的结合亲和力特别有用。包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶，N-2、N-6、和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代物显示出增强核苷酸双链稳定性0.6-1.2度。C.(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，eds.，Antisense Research andApplications，CRC Press，Boca Raton，1993，pp.276-278)，是理想的碱基取代，当与2’-O-甲氧基乙基或2’-甲基糖基修饰结合时更是如此。教导上述经修饰的核碱基的某种及其它经修饰的核碱基的制备的典型的美国专利包括No.4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；和5,750,692，每一篇都结合在此作为参考。
本发明的其它核碱基寡聚物的修饰包括向核碱基寡聚物上化学连接一个或多个能够增强寡核苷酸活性、细胞分配或细胞摄取的部分或共轭物。这样的部分包括但不局限于，脂质部分如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：6553-6556，1989)，胆酸(Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let，4：1053-1060，1994)，硫醚，如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660：306-309，1992；Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let.，3：2765-2770，1993)，巯基胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.，20：533-538：1992)，脂肪族链，如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J.，10：1111-1118，1991；Kabanov等，FEBS Lett.，259：327-330，1990；Svinarchuk等，Biochimie，75：49-54，1993)，磷脂，如二-十六烷基-rac-甘油或三乙铵1，2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-磷酸酯(Manoharan等，TetrahedronLett.，36：3651-3654，1995；Shea等，Nucl.Acids Res.，18：3777-3783，1990)，聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides & Nucleotides，14：969-973，1995)，或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，36：3651-3654，1995)，十六烷基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1264：229-237，1995)，或十八氨基或己氨基-羰基-羟胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，277：923-937，1996)。教导这些核碱基寡聚物共轭物制备的典型的美国专利包括No.4,587,263；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,818,979；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,948,882；4,958,013；5,082,830；5,109,124；5,112,963；5,118,802；5,138,045；5,214,136；5,218,105；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,414,077；5,416,203；5,151,463；5,486,603；5,510,475；5,512,439；5,512,667；5,514,785；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,578,718；5,580,731；5,585,481；5,587,371；5,591,584；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；5,608,046；和5,688,941，每一篇都全文引入作为参考。
本发明还包括嵌合化合物的核碱基寡聚物。“嵌合”核碱基寡聚物是包含两个或多个化学独立区域的核碱基寡聚物特别是寡核苷酸，每一个化学独立的区域都由至少一个单体单位组成，即，寡核苷酸中的核苷酸。这些核碱基寡聚物典型的具有至少一个区域，在该区域中核苷酸寡聚物被修饰，与核碱基寡聚物相比，经修饰的核苷酸寡聚物增强了对核酸酶降解作用的抵抗力，增加了细胞摄取，和/或增强了对靶核苷酸的结合亲和力。核碱基寡聚物的另外的区域用作能够裂解RNA：DNA或RNA：RNA杂交体的酶作用底物。例如，RNA酶H是细胞核酸内切酶，能够裂解RNA：DNA双链的RNA链。因此，激活RNA酶H导致靶RNA的剪切，由此大大的增强了核碱基寡聚物抑制基因表达的作用。因而，与杂交到相同靶区域的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸相比，使用嵌合核碱基寡聚物时产生相同结果的核碱基寡聚物更短。
本发明的嵌合核碱基寡聚物可以形成上述两种或多种核碱基寡聚物的复合结构。如果是寡核苷酸，这样的核碱基寡聚物在本领域称作杂交体或gapmer。教导这种杂交体结构的制备方法的典型的美国专利包括No.5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，每一篇都全文引入此处作为参考。
按照本发明应用的核碱基寡聚物可以通过公知的固相合成技术便利的常规的制备。这种合成所用的设备由如Applied Biosystems(Foster City，Calif.)等销售。其它的本领域公知的合成方法也可以使用。使用相似的技术制备寡核苷酸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物是众所周知的。
本发明的核碱基寡聚物也可以与其它分子，分子结构或化合物的混合物混合，被包裹，共轭或与其他分子、分子结构或化合物的混合物联合，例如脂质体，受体靶向分子，口服，直肠，局部或其它制剂，以辅助摄取，分布和/或吸收。教导制备这种摄取、分布和/或吸收辅助药剂的方法的典型的美国专利包括No.5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756，每一篇都全文引入作为参考。
本发明的核碱基寡聚物包括任何药学可接受的盐、酯、或这种酯的盐，或其它任何给予动物后能够提供(直接的或间接的)生物学活性的代谢物或其残余部分的化合物。相应的，例如，本发明的公开也涉及本发明化合物的前药和药学上可接受的盐，该前药的药学可接受的盐和其它生物等效物。
术语“前药”指以非活性形式制备，在内源性酶或其它化学试剂和/或条件的作用下在体内或其细胞中转化成活性形式(即，药物)的治疗剂。特别的，按照PCT公开号WO93/24510或WO94/26764公开的方法制备本发明的寡核苷酸前药模型SATE[(S-乙酰基-2-巯基乙基)磷酸盐]衍生物。
术语“药学可接受的盐”是指保留母体化合物的需要得到的生物学活性并且不传递不期望的毒物学作用的盐。药学可接受的碱加成盐是与金属或胺，如碱金属和碱土金属或有机胺类形成的。作为金属阳离子使用的例子是钠、钾、镁、钙等等。适当的胺类的例子是N，N′-二苄乙烯二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二聚环戊二烯、二乙胺茶碱、N-甲基葡萄糖胺和普鲁卡因(例如，见Berge等，J.PharmaSci.，66：1-19，1977)。酸性化合物的碱加成盐以常规方式的通过游离酸与足够量的期望的碱接触生成盐而制备。以常规的方式使盐的形式接触酸并且分离游离酸可以使游离酸的形式再生。游离酸的形式与其盐的形式在一些物理性质如极性溶液中的溶解度上存在一定的差别，但是在其它方面，出于本发明的目的，盐等同于它们的游离酸。这里所使用的“药学上的加成盐”包括本发明的组合物的一种组分的酸形式的药学可接受的盐。包括胺类的有机或无机酸盐。优选的酸盐是盐酸盐、醋酸盐、水杨酸盐、硝酸盐和磷酸盐。其它的适当的药学可接受的盐是本领域技术人员公知的，包括多种无机和有机酸的碱性盐，无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸或磷酸；有机羧酸、磺酸、磺基或磷酸基的酸或N-取代的氨基磺酸，例如，醋酸、丙酸、羟乙酸、琥珀酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、反丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、草酸、葡萄糖酸、葡萄糖二酸、葡糖醛酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、苯乙醇酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、2-苯氧苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、双羟萘酸、烟酸或异烟腙；及氨基酸例如自然界中参与蛋白质合成的20种α氨基酸，如谷氨酸或天门冬氨酸，还有苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯磺酸、4-甲苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1，5-二磺酸、2-或3-磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸盐、N-环己基氨基磺酸(形成环己氨基磺酸盐)，或其它酸有机化合物，如抗坏血酸。化合物的药学可接受的盐可以用药学可接受的阳离子制备。适当的药学可接受的阳离子是本领域技术人员公知的，包括碱金属、碱土金属、铵和季铵的阳离子。碳酸盐和碳酸氢盐也可以。
对于寡核苷酸和其它核碱基寡聚物而言，适当的药学可接受的盐包括(i)与阳离子如钠、钾、铵、镁、钙、多胺如精胺和精脒等形成的盐；(ii)与无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐；(iii)与有机酸如醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸等等形成的盐；和(iv)由元素阴离子如氯、溴和碘得到的盐。
本发明还包括包含本发明的核碱基寡聚物的药物组合物和药剂。本发明的药物组合物可以以很多途径给药，取决于期望局部治疗还是全身疗法以及被治疗的面积。可以局部给药(包括眼部的和粘膜的包括阴道和直肠给药)，肺的，如，通过吸入或吹入粉末剂或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内，鼻内，表皮和透皮)，口服或肠胃道外给药。肠胃道外给药包括静脉内，动脉内，皮下，腹膜内，或肌肉内注射或输注；或颅内，如，鞘膜内或心室内给药。
锁核苷酸(Locked nucleic acids)
锁核苷酸(LNAs)是可以用在本发明的核碱基寡聚物。LNAs包括一个能够限制核苷酸类似物的呋喃核糖环的灵活性并将其锁定在刚性的双环N-型构象的2’O，4’-C亚甲基桥。LNAs表现出对特定核酸外切酶和核酸内切酶的增强的耐受性并激活RNA酶H，几乎能够整合到任何核碱基寡聚物。而且，包含LNA的核碱基寡聚物可以用标准的亚磷酰胺合成实验设计制备。其它关于LNAs的详细内容见PCT申请WO99/14226和美国专利申请公开US2002/0094555A1，每一篇都合并在此作为参考。
阿拉伯糖核酸
阿拉伯糖核酸(ANAs)也可以用作本发明的方法和制剂中。ANAs是基于用D-阿拉伯糖代替天然的D-2’-去氧核糖的核碱基寡聚物。非衍生的ANA类似物与RNA的结合亲和力与硫代磷酸酯与RNA的结合亲和力相似。阿拉伯糖用氟衍生(2’F-ANA)，将导致结合亲和力增强，并有效的选择性的水解所得到的ANA/RNA和F-ANA/RNA双链中的结合RNA。这些类似物的末端用简单的L糖衍生而使其在细胞介质中稳定。ANAs在治疗中的用途在如Damha等，Nucleosides Nucleotides &Nucleic Acids 20：429-440，2001中讨论。
核碱基寡聚物的传递
我们在此证明裸寡核苷酸能够进入肿瘤细胞并且抑制IAP表达。但是，也许期望使用一种制剂以辅助寡核苷酸或其它核碱基寡聚物传递入细胞(如，见美国专利No.5,656,611,5,753,613,5,785,992，6,120,798，6,221,959，6,346,613，和6,353,055，每一篇都结合在此作为参考。)。
核酶
包括本发明的反义IAP序列的催化性RNA分子或核酶在体内可以用于抑制IAP聚核苷酸的表达。反义RNAs中包含核酶序列赋予RNA裂解活性，因此增强了构建体的活性。这种目标RNA特异性核酶的设计和应用在Haseloff等，Nature 334：585-591。1988，and美国专利No.2003/0003469 A1中有所描述，每一篇都结合在此作为参考。
相应的，本申请涉及一种催化性RNA分子，其结合臂上包括一个具有8-19个连续核碱基的反义RNA，这些核碱基对应于表1，2，6和7中任意一个序列。在本发明的优选的实施例中，催化的核苷酸分子构成锤头型或发夹结构，也可以形成肝炎δ病毒的基序，组I内含子或RNA酶P RNA(与RNA引导序列联合)或链孢霉属VS RNA。这种锤头基序的例子在Rossi等，Aids Research and Human Retroviruses，8：183，1992中有所描述。发夹结构基序的例子在Hampel等，″RNACatalyst for Cleaving Specific RNA Sequences，″filed Sep.20，1989中有所描述，该文献是U.S.Ser.No.07/247,100 filed Sept.20，1988，Hampel和Tritz，Biochemistry，28：4929，1989及Hampel等，Nucleic Acids Research，18：299，1990的连续。肝炎δ病毒基序的例子在Perrotta和Been，Biochemistry，31：16，1992中有所描述。链孢霉属VS核酶基序在Collins等的(Saville和Collins，Cell 61：685-696，1990；Saville and Collins，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8826-8830，1991；Collins和Olive，Biochemistry 32：2795-2799，1993)中有所描述。这些特殊的基序不是对本发明的限制，本领域技术人员公知重要的是本发明中的酶核酸分子具有与一或多个靶基因RNA区域互被的特异的底物结合位点，并且具有赋予分子RNA裂解活性的位于底物结合位点中或环绕底物结合位点的核苷酸序列。
RNA干扰
本发明的核碱基寡聚物可以用于双链RNA中用于RNA干扰(RNAi)-介导的IAP表达的减少(knockdown)。RNAi是一种降低感兴趣的特定蛋白质细胞表达的方法(综述Tuschl，Chembiochem 2：239-245，2001；Sharp，Genes & Devel.15：485-490，2000；Hutvagner和Zamore，Curr.Opin.Genet.Devel.12：225-232 2002；Hannon，Nature 418：244-251，2002)。在RNAi中，基因沉默通常由于细胞中双链RNA(dsRNA)的存在而在转录后激发。这些双链RNA被细胞内处理为被称作小干扰RNA(siRNA)的短链片段。通过dsRNA转染或通过使用基于质粒表达系统的siRNA表达而使siRNA进入细胞逐渐的用来在哺乳动物细胞中产生功能丧失表型。
本发明的一个实施方案中，制成包括八个至十九个连续的核碱基的本发明的核碱基寡聚物的双链RNA(dsRNA)分子。dsRNA可以是形成双链的两个不同RNA链或自身形成双链的单RNA链(小发夹结构(sh)RNA)。典型的，dsRNA是大约21或22个碱基对，如果需要可以更短或更长(直到大约29个碱基对)。dsRNA可由标准的技术制备(如，化学合成或体外转录)。例如可从Ambion(Austin，TX)和Epicentre(Madison，WI)得到试剂盒。哺乳动物细胞中的dsRNA表达的方法在Brummelkamp等Science 296：550-553，2002；Paddison等Genes & Devel.16：948-958，2002.Paul等Nature Biotechnol.20：505-508，2002；Sui等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：5515-5520，2002；Yu等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6047-6052，2002；Miyagishi等Nature Biotechnol.20：497-500，2002；Lee等Nature Biotechnol.20：500-505 2002中有所描述，这些都合并在此作为参考。
小发夹结构的RNA由一个具有可选的3’UU-突出的茎环结构组成。虽然存在差异，茎的范围是21至31bp(优选25至29bp)，环的范围是4至30bp(优选4至23bp)。对于细胞内shRNA的表达，可使用包含多聚酶IIIH1-RNA或U6启动子、茎环结构插入的克隆位点，和4-5-脱氧胸腺嘧啶苷转录终止信号的质粒载体。多聚酶III启动因子通常具有界限清楚的起始和终止位点，它们的转录物缺少聚(A)尾部。这些启动子的终止信号被定义为聚脱氧胸腺嘧啶苷束，转录物典型的在第二尿嘧啶核苷后裂开。在这个位置的剪切产生一个在表达的shRNA中的3’UU突出，与合成的siRNA的3’突出相似。其它的在哺乳动物细胞中表达shRNA的方法在上面引用的参考文献中有所描述。
下面的例子用来解释本发明。但这不意味本发明仅限于此。
实施例1：核碱基寡聚物的选择
按照下面列出的选择标准，我们分别选择大部分不重叠的人XIAP和HIAP1的96和98个19-姆核碱基序列。例如XIAP，我们从互补脱氧核糖核酸序列的起始密码子上游大约1kb至终止密码子下游大约1kb的区域中选择96个序列(每个序列含有19个核碱基)(SEQ ID NOs：1至96；表1)。这包括了大约50％的编码区和附近的5’和3’端非翻译区序列(例如，96个19-姆序列跨越1.8kb，尽管目标区域大约长3.5kb，包括1.5kb的编码区和两边各1kb的非翻译区的序列)。
                                    表1
    SEQ IDNO： 代码 核碱基序列     XIAP下调T24 RNA     XIAP下调T24蛋白质     XIAP下调H460 RNA
    1   A1   AAAATTCTAAGTACCTGCA     -     -     48％
    2   B1   TCTAGAGGGTGGCTCAGGA     -     -     66％
    3   C1   CAGATATATATGTAACACT     -     -     66％
    4   D1   TGAGAGCCCTTTTTTTGTT     -     -     75％
    5   E1   AGTATGAAATATTTCTGAT     -     -     69％
    6   F1   ATTGGTTCCAATGTGTTCT     -     -     81％
    7   G1   TTAGCAAAATATGTTTTAA     -     -     33％
    8   H1   TGAATTAATTTTTAATATC     -     -     13％
    9   A2   ATTCAAGGCATCAAAGTTG     -     -     58％
    10   B2   GTCAAATCATTAATTAGGA     -     -     55％
    11   C2   AATATGTAAACTGTGATGC     36％     45％     70％
    12   D2   GCAGAATAAAACTAATAAT     -     -     39％
    13   E2   GAAAGTAATATTTAAGCAG     54％     51％     60％
    14   F2   TTACCACATCATTCAAGTC     -     -     34％
    15   G2   CTAAATACTAGAGTTCGAC     -     -     55％
    16   H2   ACACGACCGCTAAGAAACA     -     -     46％
    17   A3   TATCCACTTATGACATAAA     -     -     27％
    18   B3   GTTATAGGAGCTAACAAAT     -     -     34％
    SEQ IDNO： 代码 核碱基序列     XIAP下调T24 RNA     XIAP下调T24蛋白质     XIAP下调H460 RNA
    19   C3   AATGTGAAACACAAGCAAC     -     -     43％
    20   D3   ACATTATATTAGGAAATCC     -     -     30％
    21   E3   CTTGTCCACCTTTTCTAAA     53％     64％     55％
    22   F3   ATCTTCTCTTGAAAATAGG     44％     53％     -
    23   G3   CCTTCAAAACTGTTAAAAG     -     -     -
    24   H3   ATGTCTGCAGGTACACAAG     -     -     -
    25   A4   ATCTATTAAACTCTTCTAC     -     -     -
    26   B4   ACAGGACTACCACTTGGAA     -     -     76％
    27   C4   TGCCAGTGTTGATGCTGAA     28％     56％     77％
    28   D4   GTATAAAGAAACCCTGCTC     12％     43％     51％
    29   E4   CGCACGGTATCTCCTTCAC     47％     34％     51％
    30   F4   CTACAGCTGCATGACAACT     33％     43％     -
    31   G4   GCTGAGTCTCCATATTGCC     34％     48％     51％
    32   H4   ATACTTTCCTGTGTCTTCC     -     -     -
33 A5 GATAAATCTGCAATTTGGG - - -
    34   B5   TTGTAGACTGCGTGGCACT     -     -     61％
    35   C5   ACCATTCTGGATACCAGAA     71％     54％     -
    36   D5   AGTTTTCAACTTTGTACTG     39％     33％     -
    37   E5   ATGATCTCTGCTTCCCAGA     -     -     46％
    38   F5   AGATGGCCTGTCTAAGGCA     -     -     -
    SEQ IDNO： 代码 核碱基序列     XIAP下调T24 RNA     XIAP下调T24蛋白质     XIAP下调H460 RNA
    39   G5   AGTTCTCAAAAGATAGTCT     -     -     30％
    40   H5   GTGTCTGATATATCTACAA     -     -     39％
    41   A6   TCGGGTATATGGTGTCTGA     -     -     72％
    42   B6   CAGGGTTCCTCGGGTATAT     51％     47％     -
    43   C6   GCTTCTTCACAATACATGG     -     -     -
    44   D6   GGCCAGTTCTGAAAGGACT     -     -     60％
    45   E6   GCTAACTCTCTTGGGGTTA     -     -     -
    46   F6   GTGTAGTAGAGTCCAGCAC     34％     39％     -
    47   G6   AAGCACTGCACTTGGTCAC     -     -     69％
    48   H6   TTCAGTTTTCCACCACAAC     -     -     68％
    49   A7   ACGATCACAAGGTTCCCAA     -     -     -
    50   B7   TCGCCTGTGTTCTGACCAG     -     -     -
    51   C7   CCGGCCCAAAACAAAGAAG     -     -     72％
    52   D7   GATTCACTTCGAATATTAA     56％     88％     46％
    53   E7   TATCAGAACTCACAGCATC     -     -     -
    54   F7   GGAAGATTTGTTGAATTTG     -     -     69％
    55   G7   TCTGCCATGGATGGATTTC     -     -     41％
    56   H7   AAGTAAAGATCCGTGCTTC     -     -     63％
    57   A8   CTGAGTATATCCATGTCCC     -     -     -
    58   B8   GCAAGCTGCTCCTTGTTAA     -     -     -
    SEQ IDNO： 代码 核碱基序列     XIAP下调T24 RNA     XIAP下调T24蛋白质     XIAP下调H460 RNA
    59   C8   AAAGCATAAAATCCAGCTC     -     -     16％
    60   D8   GAAAGCACTTTACTTTATC     38％     26％     49％
    61   H8   ACTGGGCTTCCAATCAGTT     -     -     -
    62   E8   GTTGTTCCCAAGGGTCTTC     72％     56％     44％
    63   F8   ACCCTGGATACCATTTAGC     -     -     47％
    64   G8   TGTTCTAACAGATATTTGC     -     -     49％
    65   A9   TATATATTCTTGTCCCTTC     -     -     62％
    66   B9   AGTTAAATGAATATTGTTT     -     -     38％
    67   C9   GACACTCCTCAAGTGAATG     -     -     -
    68   D9   TTTCTCAGIAGTTCTTACC     -     -     39％
    69   E9   GTTAGTGATGGTGTTTTCT     -     -     43％
    70   F9   AGATGGTATCATCAATTCT     -     -     19％
    71   G9   TGTACCATAGGATTTTGGA     -     -     -
    72   H9   CCCCATTCGTATAGCTTCT     -     -     -
    73   A10   ATTATTTTCTTAATGTCCT     -     -     29％
    74   B10   CAAGTGATTTATAGTTGCT     -     -     -
    75   C10   TAGATCTGCAACCAGAACC     -     -     53％
    76   D10   CATCTTGCATACTGTCTTT     -     -     55％
    77   E10   CCTTAGCTGCTCTTCAGTA     -     -     -
    78   F10   AAGCTTCTCCTCTTGCAGG     -     -     51％
    SEQ IDNO： 代码 核碱基序列     XIAP下调T24 RNA     XIAP下调T24蛋白质     XIAP下调H460 RNA
    79   G10   ATATTTCTATCCATACAGA     -     -     56％
    80   H10   CTAGATGTCCACAAGGAAC     -     -     -
    81   A11   AGCACATTGTTTACAAGTG     -     -     68％
    82   B11   AGCACATGGGACACTTGTC     -     -     63％
    83   C11   CTTGAAAGTAATGACTGTG     -     -     52％
    84   D11   CCTACTATAGAGTTAGATT     -     -     -
    85   E11   ATTCAATCAGGGTAATAAG     -     -     48％
    86   F11   AAGTCAGTTCACATCACAC     -     -     64％
    87   G11   CAGTAAAAAAAATGGATAA     -     -     33％
    88   H11   TTCAGTTATAGTATGATGC     -     -     -
    89   A12   TACACTTAGAAATTAAATC     -     -     46％
    90   B12   TCTCTATCTTTCCACCAGC     -     -     -
    91   C12   AGAATCCTAAAACACAACA     -     -     -
    92   D12   ATTCGCACAAGTACGTGTT     -     -     77％
    93   E12   TGTCAGTACATGTTGGCTC     -     -     74％
    94   F12   ACATAGTGTTTTGCCACTT     -     -     74％
    95   G12   CTTTGATCTGGCTCAGACT     -     -     76％
    96   H12   GAAACCACATTTAACAGTT     -     -     52％
上面提到的任何核碱基寡聚物或此处描述的任何其它核碱基寡聚体，每种核碱基可以独立地是DNA残基或RNA残基，例如2’-O-甲基或2’-O-甲氧乙基RNA残基。例如，SEQ ID NO：3的核碱基序列可以是5’-CAGATATATATGTAACACT-3’，5’-CAGATATATATGTAACACU-3’或5’-mCmAGATATATATGTAACAmCmU-3’(其中mX代表2’-O-甲基X残基)。其他修饰的核碱基在本领域中已知。连接键可以是磷酸二酯(PO)，硫代磷酸酯(PS)，或甲基膦酸酯(MP)键，或者混合骨架(MB)。骨架可以是能使核碱基寡聚物靶IAP多聚核苷酸杂交的任何合适的骨架。特别是此处描述的骨架。其它实施方案中，核碱基寡聚物包括丫啶保护键，胆固醇或补骨酯内酯成分，C5-丙炔基嘧啶，或C5-甲基嘧啶。本发明中对核碱基寡聚体的合适的修饰除了U.S.Patent ApplicationPublication No.US 2002/0128216 A1中的例子，还包括上面描述的例子。
下面的表2提供了具体的核碱基寡聚物(其中X代表2’-O-甲基XRNA残基)。
                         表2
2×2 MB PO  SEQ ID NO：
DE4 as mGmGTATCTCCTTCACCAGmUmA     97
DE4 rev mAmUGACCACTTCCTCTATmGmG     98
δBC5 as mGmATACCAGAATTTmGmU     99
δBC5 rev mUmGTTTAAGACCATmAmG     100
mG4 as mGmCTGAGTCTCCATACTGmCmC     101
mG4 sm mGmGCTCTCTGCCCACTGAmAmU     102
3×3 MB PO
F3 as mAmUmCTTCTCTTGAAAATmAmGmG     103
F3 scr mCmAmGAGATTTCATTTAAmCmGmU     104
F3 mm mAmUmCTTGACTTGATTATmAmGmG     105
                            表2
F3 rev mGmGmATAAAAGTTCTCTTmCmUmA     106
E4 as mCmGmCACGGTATCTCCTTmCmAmC     107
E4 scr mCmUmACGCTCGCCATCGTmUmCmA     108
E4 rev mCmAmCTTCCTCTATGGCAmCmGmC     109
E4 mm mCmGmCACCCTATCTGGTTmCmAmC     110
G4 as mGmCmUGAGTCTCCATATTmGmCmC     111
G4 scr mGmGmCTCTTTCGCCACTGmAmAmU     112
G4 rev mCmCmGTTATACCTCTGAGmUmCmG     113
G4 mm mGmCmUGACACTCCAATTTmGmCmC     114
C5 as mAmCmCATTCTGGTAACCAmGmAmA     115
C5 scr mUmGmCCCAAGAATACTAGmUmCmA     116
C5 mm mAmCmCATAGTGGATTGCAmGmAmA     117
C5 rev mAmAmGACCATAGGTCTTAmCmCmA     118
D7 as mGmAmUTCACTTCTTCGAATATmUmAmA     119
D7 scr mUmGmAAATGTAAATCATCmUmUmC     120
D7 mm mGmAmUTCTGTTCGATAATmUmAmA     121
D7 rev mAmAmUTATAAGCTTCACTmUmAmG     122
硫代磷酸酯
PS-G4 as GCTGAGTCTCCATATTGCC     123
PS-G4 sm GGCTCTTTGCCCACTGAAT     124
PS-C5 as ACCATTCTGGATACCAGAA     125
PS-C5 rev AAGACCATAGGTCTTACCA     126
PS-F3 as ATCTTCTCTTGAAAATAGG     127
PS-F3 rev GGATAAAAGTTCTCTTCTA     128
PS-DE4 as GGTATCTCCTTCACCAGTA     129
PS-DE4 rev ATGACCACTTCCTCTATGG     130
PS-BC5 as TCTGGATACCAGAATTTGT     131
PS-BC5 rev TGTTTAAGACCATAGGTCT     132
PS-AB6 as GGGTTCCTCGGGTATATGG     133
PS-AB6 rs GGTATATGGCGTCCTTGGG     134
PS-D7 as GATTCACTTCGAATATTAA     135
PS-D7 rs AATTATAACGTTCACTTAG     136
Penetratin
F3 as ATCTTCTCTTGAAAATAGG     137
G4 as GCTGAGTCTCCATATTGCC     138
D7 as GATTCACTTCGAATATTAA     139
C5 cs TGCCCAAGAATACTAGTCA     140
                          表2
4×4 MBO PS(硫代磷酸酯连接)
G4 as mGmCmUmGAGTCTCCATATmUmGmCmC     141
G4 sm mGmGmCmUCTTTGCCCACTmGmAmAmU     142
DE4 as mGmGmUmATCTCCTTCACCmAmGmUmA     143
DE4 rev mAmUmGmACCACTTCCTCTmAmUmGmG     144
E2 as mGmAmAmAGTAATATTTAAmGmCmAmG     145
E2 rm mGmAmGmCAATTTATAATGmAmAmAmG     146
H2G as mAmCmCmGCTAAGAAACATmUmCmUmA     147
H2G rm mAmUmCmUTACAAAGAATCmCmGmCmA     148
A3 as mUmAmUmCCACTTATGACAmUmAmAmA     149
A3 rev mAmAmAmUACAGTATTCACmCmUmAmU     150
FG8 as mUmGmCmACCCTGGATACCmAmUmUmU     151
FG8 rm mUmUmUmACCATAGGTCCCmAmGmCmU     152
mG4 as mGmCmUmGAGTCTCCATACmUmGmCmC     153
mG4 sm mGmGmCmUCTCTGCCCACTmGmAmAmU     154
F1 as mAmUmUmGGTTCCAATGTGmUmUmCmU     155
F1 rev mUmCmUmUGTGTAACCTTGmGmUmUmA     156
B4 as mAmCmAmGGACTACCACTTmGmGmAmA     157
B4 rev mAmAmGmGTTCACCATCAGmGmAmCmA     158
G6 as mAmAmGmCACTGCACTTGGmUmCmAmC     159
G6 sm mCmAmCmTGGTTGACCTCAmCmAmAmG     160
E12 as mUmGmUmCAGTACATGTTGmGmCmUmC     161
E12 sm mCmUmAmGGTTGTCCATGAmCmUmGmU     162
PCT专利申请No.FR91/00444描述了Penetratin以及其在介导寡核苷酸进入细胞过程中的应用。
采用类似的鉴定方法设计抗HIAP1的核碱基寡聚物。首先，选择98个19-姆核碱基寡聚体(SEQ ID NOs：163-260；表3)。在靶向HIAP1序列的98个核碱基寡聚体中选择15个进一步评价(SEQ ID NOs：163-170，173，179，202，222，223，247和259)。这15个候选核碱基寡聚体包括4个编码区靶向(SEQ ID NOs：202，222，223和247)的核碱基寡聚体，1个3’-UTR靶向的核碱基寡聚体(SEQ ID NO：259)，7个5’-UTR靶向的核碱基寡聚体(SEQ ID NOs：166-170，173和179；7个中有1个核碱基寡聚体与起始密码子是重叠的)，其余3个寡核苷酸(SEQ ID NOs：163-165)设计成以5’-UTR内含子片段为作用靶。
                       表3
  SEQ ID NO：     代码     核碱基寡聚物序列
    163     APO 1     TCATTTGAGCCTGGGAGGT
    164     APO 2     CGGAGGCTGAGGCAGGAGA
    165     APO 3     GGTGTGGTGGTACGCGCCT
    166     APO 4     ACCCATGCACAAAACTACC
    167     APO 5     AGAATGTGCCAGTAGGAGA
    168     APO 6     TCTCACAGACGTTGGGCTT
    169     APO 7     CCAGTGGTTTGCAAGCATG
    170     APO 8     GAAATTTAGTGGCCAGGAA
    171     AGAAATACACAATTGCACC
    172     TACTGATACATTTTAAGGA
    173     APO 9     TTCAACATGGAGATTCTAA
    174     ATTTCTATGCATTTAGAGT
    175     AATACTAGGCTGAAAAGCC
    176     GGCTTTGCTTTTATCAGTT
    177     TCTAGGGAGGTAGTTTTGT
    178     GGGAAGAAAAGGGACTAGC
    179     APO 10     GTTCATAATGAAATGAATG
    180     ATAAGAATATGCTGTTTTC
    181     TTCAAACGTGTTGGCGCTT
    182     ATGACAAGTCGTATTTCAG
    183     AAGTGGAATACGTAGACAT
    184     AGACAGGAACCCCAGCAGG
    185     CGAGCAAGACTCCTTTCTG
    186     AGTGTAATAGAAACCAGCA
    187     TGACCTTGTCATTCACACC
    188     TTATCCAGCATCAGGCCAC
    189     ACTGTCTCCTCTTTTCCAG
    190     TTTTATGCTTTTCAGTAGG
    191     ACGAATCTGCAGCTAGGAT
    192     CAAGTTGTTAACGGAATTT
    193     TAGGCTGAGAGGTAGCTTC
    194     GTTACTGAAGAAGGAAAAG
    195     GAATGAGTGTGTGGAATGT
  SEQ ID NO：     代码     核碱基寡聚物序列
    196     TGTTTTCTGTACCCGGAAG
    197     GAGCCACGGAAATATCCAC
    198     TGATGGAGAGTTTGAATAA
    199     GATTTGCTCTGGAGTTTAC
    200     GGCAGAAAATTCTTGATTT
    201     GGACAGGGGTAGGAACTTC
    202   APO 11     GCATTTTCGTTATTCATTG
    203     CTGAAAAGTAAGTAATCTG
    204     GGCGACAGAAAAGTCAATG
    205     CCACTCTGTCTCCAGGTCC
    206     CCACCACAGGCAAAGCAAG
    207     TTCGGTTCCCAATTGCTCA
    208     TTCTGACATAGCATTATCC
    209     TGGGAAAATGTCTCAGGTG
    210     TATAAATGGGCATTTGGGA
    211     TGTCTTGAAGCTGATTTTC
    212     GAAACTGTGTATCTTGAAG
    213     TGTCTGCATGCTCAGATTA
    214     GAATGTTTTAAAGCGGGCT
    215     CACTAGAGGGCCAGTTAAA
    216     CCGCACTTGCAAGCTGCTC
    217     CATCATCACTGTTACCCAC
    218     CCACCATCACAGCAAAAGC
    219     TCCAGATTCCCAACACCTG
    220     CCCATGGATCATCTCCAGA
    221     AACCACTTGGCATGTTGAA
    222   APO 12     CAAGTACTCACACCTTGGA
    223   APO 13     CCTGTCCTTTAATTCTTAT
    224     TGAACTTGACGGATGAACT
    225     TAGATGAGGGTAACTGGCT
    226     TGGATAGCAGCTGTTCAAG
    227     CATTTTCATCTCCTGGGCT
    228     TGGATAATTGATGACTCTG
    229     GTCTTCTCCAGGTTCAAAA
    230     TATTCATCATGATTGCATC
    231     CATTTCCACGGCAGCATTA
    232     CCAGGCTTCTACTAAAGCC
    233     GCTAGGATTTTTCTCTGAA
    234     TCTATAATTCTCTCCAGTT
  SEQ ID NO：     代码     核碱基寡聚物序列
    235     ACACAAGATCATTGACTAG
    236     TCTGCATTGAGTAAGTCTA
    237     CTCTTCCCTTATTTCATCT
    238     TCCTCAGTTGCTCTTTCTC
    239     GCCATTCTATTCTTCCGGA
    240     AGTCAAATGTTGAAAAAGT
    241     CCAGGATTGGAATTACACA
    242     ATTCCGGCAGTTAGTAGAC
    243     TAACATCATGTTCTTGTTC
    244     GTCTGTGTCTTCTGTTTAA
    245     TTCTCTTGCTTGTAAAGAC
    246     CTAAAATCGTATCAATCAG
    247   APO 14     GGCTGCAATATTTCCTTTT
    248     GAGAGTTTCTGAATACAGT
    249     ACAGCTTCAGCTTCTTGCA
    250     AAATAAATGCTCATATAAC
    251     GAAACATCTTCTGTGGGAA
    252     GTTCTTCCACTGGTAGATC
    253     CTTCTTGTAGTCTCCGCAA
    254     TTGTCCATACACACTTTAC
    255     AACCAAATTAGGATAAAAG
    256     ATGTTCATATGGTTTAGAT
    257     TAAGTTTTACTTCACTTAC
    258     ATGTTCCCGGTATTAGTAC
    259   APO 15     GGGCTCAAGTAATTCTCTT
    260     GCCCAGGATGGATTCAAAC
核碱基寡聚物的选择标准
使用计算机程序OLIGO(先前由National Biosciences Inc发行)筛选候选核碱基寡聚体基于下列标准：
1)GC含量少于75％或者AT含量少于75％；
2)核碱基寡聚体最好不包含4个或4个以上连续的G残基(虽然可以选择1个作为毒性对照，但鉴于已报道的毒性作用不选为好)；
3)不选择能够形成稳定二聚体或发夹结构的核碱基寡聚体；
4)优选翻译起始区域附近的序列。
此外，当检测方法很灵敏时(例如TaqMan定量PCR，或ELISA)，利用RNA二级结构折叠程序MFOLD来预测目标mRNA的可进入区域(M.ZukerD.H.Mathews & D.H.Turner，Algorithms andThermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction：APractical Guide.In：RNA Biochemist7)and Biotechnology，J.Barciszewski & B.F.C.Clark，eds.，NATO ASI Series，KluwerAcademic Publishers，(1999)。利用具有200个碱基的窗(其中残基能找到形成碱基对的互补碱基)，来预测亚最佳折叠，其游离能量值在预测的mRNA的最稳定折叠的5％范围内。没有形成碱基对的开放区域和次稳定折叠相加，一直被预期为开放的区域更容易和寡核苷酸结合。其它的只能部分满足上面的选择标准的寡核苷酸如果识别目标mRNA的预测的开放区域，也可能被选择为可能的候选mRNA。
实施例2：寡核苷酸的合成
使用寡核苷酸作为典型的核碱基寡聚体检测核碱基寡聚体抑制IPA表达的能力。使用IDT(integrated DNA technologies，USA)合成寡核苷酸作为嵌合的，第二代的寡核苷酸，其由任一侧连有两个2’-O-甲基RNA残基的磷酸二酯DNA残基核心组成，RNA残基间由硫代磷酸酯键连接。寡核苷酸和至少12ODs的核碱基寡聚体(保证为转染提供充足的原料)放在96孔板中或配对管中，当检测方法很灵敏时，例如TaqMan定量PCR或ELISA(在96孔板模式下超过100次测量)。一旦阳性结果被认定(见下面)，寡核苷酸与3个，而非2个，侧接的RNA残基再合成以便增加稳定性/核酸酶抗性。此外，为了验证目的，为能够产生最高活性的目标核碱基寡聚体合成适当的对照品(例如，无序的，4-碱基不匹配和反极性寡核苷酸)。
实施例3：核碱基寡聚体的筛选测定和优化
我们鉴定能够抑制IAP表达的核碱基寡聚体的方法是筛选上面描述的寡核苷酸库，寻找以特异IAP基因为靶，能够特异的降低其RNA和/或蛋白的寡核苷酸。可以应用许多标准测定法检测细胞中RNA和蛋白的水平。例如，使用标准RNA印迹分析法或RT-PCR技术检测RNA水平。使用标准蛋白质印迹分析法或免疫沉淀技术检测蛋白水平。也结合文献，例如依照U.S.Patent Nos.5,919,912，6,156,535，and6,133,437中描述的方法通过检测给予反义IAP核苷酸的细胞活力。
使用TaqMan定量PCR(下面描述)测定给予寡核苷酸后mRNA水平的变化。采用ELISA确定XIAP蛋白水平，采用蛋白印迹法确定HIAP1蛋白水平。以来源于XIAP的跨越起始密码子的荧光标记的有义寡核苷酸(5′-mGmAGAAGATGACTGGTAAmCmA-3′；SEQ ID NO.：261)作为对照，Lipofectamine或Lipofectamine2000(Life Technologies，Canada)对T24膀胱癌细胞或H460非小细胞肺癌细胞，或者Lipofectamine对SF-295胶质母细胞瘤细胞的转染条件可以得到优化。结果可以通过epi-荧光显微镜观察和计量。至于T24细胞，在已经公布的能够下调sunivin表达的寡核苷酸基础上，转染可以进一步的优化(Li et al.，Nat.Cell Biol.1：461-466，1999)(5′-U/TGTGCTATTCTGTGAA U/TU/T-3′SEQ ID NO.：262)。下面详细描述了在采用PCR引物和荧光探针检测survivin RNA水平降低的TaqMan结果的基础上对转染条件进行优化。对于细胞摄取寡核苷酸的优化条件是940nM寡核苷酸和4uL PLUS试剂和0.8uL Lipofectamine共70uL持续3小时。我们采用这些条件在寡聚物库中筛选能够降低T24细胞中XIAP蛋白的寡核苷酸。
在SF-295细胞中研究HIAP1水平降低是由于这些细胞含有易于检测和辨别的70kDa HIAPI蛋白，而许多细胞系没有高水平的表达这种蛋白，或者表达的该蛋白不能和大量大小相似的68kDa HIAP2蛋白相区别。
实时PCR
RNA从溶解于RLT缓冲液(QIAGEN，Valencia，CA)中的细胞中提取，使用QIAGEN RN简易柱/试剂盒纯化。在Perkin-Elmer ABI7700Prism PCR仪器上执行实时定量PCR分析。依据PE生物系统TaqManUniversal PCR Master Mix协议，使用特异性识别XIAP，HIAPI，survivin或GAPDH的引物和探针来反转录和扩增RNA。对于人类survivin，正向的引物是5′-TCTGCTTCAAGGAGCTGGAA-3′(SEQ ID NO.：263)，反向引物是5′-GAAAGGAA AGCGCAACCG-3′(SEQ ID NO.：264)，探针是5′-(FAM)AGCCAGATGAC GACCCCATAGAGGAACATA(TAMRA)-3′(SEQID NO.：265)。对于人类HIAP1，正向的引物是5′-TGGAGATGATCCATGGGTTCA-3′(SEQ ID NO.：266)，反向引物是5′-GAACTCCTGTCCTTTAATTCTTATCAAGT-3′(SEQ ID NO.：267)，探针是5’-(FAM)CTCACACCTTGGAAACCACTTGGCATG(TAMRA)-3’(SEQ ID NO.：268)。对于人XIAP，正向引物是5’-GGTGATAAAGTAAAGTGCTTTCACTCT-3’(SEQ IDNO：269)，反向引物是5’-TCAGTAGTTCTTACCAGACACTCCTCAA-3’-(SEQ IDNO：270)，探针是5’-(FAM)CAACATGCTAAATGGTATCCAGGGTGCAAATATC(TAMRA)-3’-(SEQ ID  No.：271)。对于人GAPDH，正向引物是5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQ ID NO：272)，反向引物是5’-GAAGATGGTGATGGGATTC-3’(SEQ ID NO：273)，探针是5’-(JOE)CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC(TAMRA)-3’(SEQ ID NO：274)。FAM是6-羧基荧光素，JOE是6-羧基-4，5-二氯-2，7-二甲氧基荧光素和TAMRA是6-羧基-N，N，N’，N’-四甲基罗丹明。FAM和JOE是5’报告染料，而TAMRA是3’猝灭染料。
如PE生物系统手册所述使用GAPDH作为内参照对基因表达进行相对量化。使用相对Ct(循环阈值)的方法对IAP mRNA相对于GAPDHmRNA的水平进行相对量化。简而言之，每个PCR循环进行实时荧光检测，通过测定荧光超过基线标准差30倍阈限值的点计算每个样品的循环阈值(Ct)。从第三个循环基线值开始计算平均基线值和基线SD直至信号开始出现指数上升前的基线值三个周期。设计跨越至少一个由1kb或更多基因组DNA分开的外显子-内含子区域的特异IAPs PCR引物和/或探针，以降低扩增和检测基因组DNA污染的可能性。在进行逆转录和PCR反应之前，用DNA酶或RNA酶处理RNA样品验证信号的特异性和DNA污染的可能性。
XIAP ELISA和HIAP1蛋白免疫印迹
标准比色XIAP ELISA测定法应用亲和纯化的家兔多克隆XIAP抗体作为捕获抗体，用XIAP单克隆抗体(MBL，Japan)和生物素化的抗小鼠免疫球蛋白抗体、辣根过氧化物酶偶联的链亲合素和TMB底物进行检测。或者，可以使用多克隆XIAP或HIAP1抗体分别来检测XIAP或HIAP1的蛋白水平。
HIAP1使用亲和纯化的抗大鼠HIAP1家兔多克隆抗体采用蛋白免疫印记法进行测定，也可使用第二辣根过氧化物酶偶联的抗家兔免疫球蛋白抗体和化学发光底物在X光胶片上用ECL进行测定。产生抗大鼠HIAP1 GST-融合的抗-HIAP1多克隆抗体。这种抗体与人和小鼠的HIAP1和HIAP2能交叉反应。
实施例4：反义XIAP寡核苷酸降低XIAP RNA和多肽表达
首先从含96个反义寡核苷酸的XIAP合成库中筛选使XIAP的蛋白水平降低的寡核苷酸。具体是，第一天将T24细胞(1.5×104个/孔)接种于96孔板的孔内，在没有抗生素的McCoy’s培养基中培育24小时。第二天，用上面描述的XIAP反义寡核苷酸转染细胞(寡核苷酸依据它们的放置位置进行标记，例如，A1至H12，还包括两个重复标记，A13和B13含有吸附于密封膜上的冻干DNA沉淀)。简要地讲，将核碱基寡聚体稀释于10ul/孔的无血清，无抗生素McCoy’s培养基中，然后加入PLUS试剂。Lipofectamine稀释于10ul/孔的无血清，无抗生素MoCoy’s培养基中，两种混合物在室温条件孵育15分钟。然后两种混合物在室温条件下混合，孵育15分钟。
同时，从细胞中去除完全培养基，再向细胞中加入50μl/孔的无血清，无抗生素培养基。然后，将转染混合物加入孔中，将细胞孵育3个小时。然后向每个孔加入30μl/孔的无血清，无抗生素培养基和100ul/孔含有20％胎牛血清的无抗生素完全培养基。
第三天，按照上面描述的方法，使用定量实时PCR技术测定XIAPRNA水平。第四天，用ELISA测定XIAP的蛋白水平(图.1A，1C，IE，1G，1I，和1K)，采用生物化学方法测定整个细胞的蛋白水平(图.1B，1D，IF，1H，1J，和1L；用来标准化XIAP的蛋白水平)。结果与模拟转染样品(经过转染试剂处理并不加寡核苷酸DNA，然后按照其它样品一样处理)相比较。反应进程试验确定了降低蛋白的最佳时间是12至24小时。
在适当的最佳时间使用TaqMan-特异PCR引物和荧光探针，使用上面描述的引物和探针筛选寡核苷酸库以期能够降低RNA水平。反应进程实验确定反应进行到6至9小时，mRNA降低的最显著。这些结果和蛋白的结果完全符合。
首次筛选(虽然是在次佳时间点筛选，可能是由于非转染细胞增生导致XIAP恢复正常水平)从96种核碱基寡聚体中鉴定了16种反义寡核苷酸(表1：C2，E2，E3，F3，C4，D4，E4，F4，G4，C5，D5，B6，F6，D7，D8，F8)，与模拟组的转染水平相比，它们能够使XIAP的蛋白水平相对于整体蛋白水平有所降低(图1A，1C，IE，1G，1I，和1K)。16种核碱基寡聚体均能使整体蛋白水平降低，表明这些核碱基寡聚体具有毒性或细胞生长抑制活性(图1B，1D，IF，1H，1J，1L)。核碱基寡聚体B9和C9D使整体蛋白水平显著降低，却没有相对降低XIAP蛋白水平。
在上面描述的反应进程研究基础上，相对于模拟转染组，能使XIAP蛋白水平相对下降的16个反义核碱基寡聚体，在更佳的时间点(12小时)单独或与一种对照核碱基寡聚体(D2)一起再次检测，观察其降低XIAP蛋白水平的能力(图2B)。12小时，检测这些核碱基寡聚体降低XIAP的mRNA水平的能力，以GAPDH水平为标准，与模拟转染相比较。同时在12小时测定整体蛋白浓度(图2C)。
核碱基寡聚体降低XIAP蛋白水平的能力(图2B)和降低XIAP mRNA水平的能力(图2A)之间存在良好的相关性。此外，实验初期整体蛋白水平没有大的降低，后来XIAP的mRNA和蛋白水平的降低优先于整体蛋白水平的降低。使XIAP蛋白或mRNA水平降低50％以上的核碱基寡聚体或以1∶1比例混合的两种核碱基寡聚体被认为是最好的核碱基寡聚体并得到进一步的确证。调节转染条件或联合用药(例如C5和G4)，16个核碱基寡聚体中的10种(E2，E3，F3，E4，F4，G4，C5，B6，D7，F8)均能将XIAP的蛋白和mRNA水平降低50％以上。此外，这16种反义寡核苷酸集中作用于XIAP mRNA的四个不同的目标区域，其相邻的核碱基寡聚体活性降低。以这些敏感区域或部分之间序列为作用靶的核碱基寡聚体几乎没有反义活性。初步推测这些敏感区域是细胞内能和核碱基寡聚体结合的mRNA的开放区域。核碱基寡聚体E3和F3对XIAP起作用时作用于插入区域中启动子的上游，该区域介于IRES和翻译起始点之间，与IRES的末端部分重叠。C2，D2和E2作用于XIAP的最小IRES元件的上游部分，进一步证明最小IRES区域是RNA的高度结构化的区域，在体内该区域不易和核碱基寡聚体结合。其它核碱基寡聚体与编码区的一部分互补，包括XIAP序列(E4，F4和G4)的活性连续区域856-916和较小的分散区域，这一点被核碱基寡聚体C5和D5所证明。
表1描述的96种核碱基寡聚体的一部分再次筛选，观察它们能否将NCI-H460细胞中的XIAPmRNA水平在转染9小时后降下来。数据总结在下面的表4中。
                                    表4
    2×2 MBO   XIAP RNA     标准差     2×2 MBO XIAP RNA   标准差
    Untrf.Co.     1.04     0.055     A6 as     0.27     0
    Mock Co.     1.01     0.006     D6 as     0.39     0.03
    G4 sm     0.97     0.071     G6 as     0.3     0.01
    DE4 rev     1.06     0.121     H6 as     0.31     0.01
    A1 as     0.46     0.01     C7 as     0.27     0.02
    B1 as     0.34     0.03     D7 as     0.52     0.04
    C1 as     0.3     0.04     F7 as     0.3     0.04
    D1 as     0.25     0.03     G7 as     0.66     0.04
    E1 as     0.31     0.01     H7 as     0.49     0.01
    F1 as     0.19     0.01     C8 as     1.01     0.08
    G1 as     0.67     0.03     D8 as     0.55     0.04
    H1 as     0.87     0.03     F8 as     0.62     0
    A2 as     0.42     0.02     G8 as     0.64     0.06
    B2 as     0.45     0.03     H8 as     0.61     0.06
    C2 as     0.33     0.02     A9 as     0.46     0.02
    D2 as     0.66     0.01     B9 as     0.74     0.07
    E2 as     0.44     0.01     D9 as     0.73     0.04
    F2 as     0.64     0.02     E9 as     0.69     0.06
    G2 as     0.44     0.01     F9 as     0.97     0.15
    H2 as     0.56     0.04     A10 as     0.85     0.04
    A3 as     0.71     0.03     C10 as     0.56     0.01
    B3 as     0.64     0.08     D10 as     0.54     0.01
    C3 as     0.55     0.04     F10 as     0.64     0
    D3 as     0.68     0.02     G10 as     0.49     0
    E3 as     0.48     0.02     A11 as     0.36     0.03
    B4 as     0.23     0.01     B11 as     0.39     0.02
    C4 as     0.22     0.04     C11 as     0.44     0.03
    D4 as     0.48     0.04     E11 as     0.52     0.04
    E4 as     0.44     0.01     F11 as     0.36     0.05
    G4 as     0.48     0.02     G11 as     0.67     0.02
    B5 as     0.38     0.03     A12 as     0.54     0.03
    E5 as     0.52     0.05     D12 as     0.23     0.05
    G5 as     0.68     0.05     E12 as     0.26     0.01
    H5 as     0.59     0.09     F12 as     0.26     0.03
    G12 as     0.24     0.05
    H12 as     0.48     0.06
我们还测定了4×4 MBOs(所有PS，DNA残基两侧都连接有4个2’-O-甲基RNA残基)能否降低H460细胞中XIAP蛋白的水平。如图3和4所示，E12的4×4MBs和另一种寡核苷酸，FG8，仅在31nM就表现出活性。
实施例5：XIAP反义核碱基寡聚体增加细胞毒性和化学致敏作用。
我们研究了XIAP反义核碱基寡聚体能否使对传统的化学治疗剂，例如阿霉素或顺铂，具有很强耐药性的T24细胞化学致敏。选择反义寡核苷酸代表XIAP的不同的目标区域，检测它们本身或和其它寡核苷酸或药物连用时的细胞毒性。检测了5种XIAP反义寡核苷酸杀死或致敏T24膀胱癌细胞的能力，并与3种相应无序的对照寡核苷酸的活性比较。
用XIAP反义寡核苷酸、无序寡核苷酸、非寡核苷酸(模拟转染)转染T24细胞，或者对T24细胞不处理。细胞在用WST-1四唑染料方法转染(未处理对照组除外)后的20小时内检测其活力，在新陈代谢活跃的细胞中WST-1四唑染料被还原为有色物质(图5A)。
观察未处理的、模拟转染的、用E4、E4无序、E4反向极性或E4非匹配的寡核苷酸转染的T24细胞，检测寡核苷酸E4诱导的细胞毒性的发生。转染20小时后，检测细胞的形态学变化(图5D)。只有用反义E4寡核苷酸转染的细胞有中毒迹象。
为了检测核碱基寡聚体影响T24细胞对顺铂或阿霉素化学敏感性的效果，检测寡核苷酸在固定剂量阿霉素(0.5μg/ml)存在时杀死细胞的能力。首先用寡核苷酸转染细胞，再加入阿霉素保持20小时。给药20小时结束时用WST-1检测细胞的活力(图5B)。结果如图5C所示，给出了相对于核碱基寡聚体单独给药的活力百分比。
相对于模拟(非寡核苷酸)转染的细胞、或用三个F3(5′-mCmAmGAGATTTCATTTAAmCmGmU-3′；SEQ ID NO：275)，E4(5′-mCmUmACGCTCGCCATCGTmUmCmA-3′；SEQ ID NO：276)和C5(5′-mUmGmCCCAAGAATACTAGmUmCmA-3′；SEQ ID NO：277)(图SA和5C)对应无序对照品转染的细胞，所有检测的5个核碱基寡聚体(F3，E4，G4，C5，D7)与E4+C5和G4+C5的联合用药一样能够杀死T24细胞，给药24小时后仅有10-15％的细胞存活。因此，总的来说，降低XIAP水平的核碱基寡聚体的毒性具有序列特异性，而不是非序列特异性。这种细胞毒性可能来源于XIAP蛋白水平降低(和预期的由XIAP提供的抗细胞凋亡蛋白的丧失)和转染本身毒性的联合作用。
对于一些检测的寡核苷酸，在三个小时转染周期结束时加入固定剂量的阿霉素或顺铂导致细胞存活数量进一步下降，与相应的寡核苷酸治疗值相比(图5C)，核碱基寡聚体F3，D7和G4+C5给药20小时后存活细胞数量进一步下降40％(图5B)。图5B中的数值(寡核苷酸加药物)是相对于图5C中寡核苷酸单独给药的数值，对每个ODN该值设为100％。只列出了阿霉素的化学致敏结果；当用顺铂化学致敏细胞时可以得到相似的结果，当使用固定剂量的阿霉素(图5B)时，模拟组和无序对照转染组的细胞存活数量并没有减少。当特异性反义寡核苷酸使XIAP水平降低时才会发生化学致敏作用。
实施例6：反义寡核苷酸对H460细胞中XIAP mRNA的下调作用。
使用实时PCR检测反义寡核苷酸对H460细胞中XIAP mRNA的活性(2×2 MBO，由每一侧连接有两个通过硫代磷酸酯键连接的2’-O-甲基RNA组成，核心部分是15个磷酸二酯DNA残基)。这种情况下，相对于未处理，核碱基寡聚体F3，G4，C5，AB6和DE4将mRNA水平降低50-70％，而核碱基寡聚体D7AS将mRNA水平降低30％(图6)。相反，对照核碱基寡聚体和单独转染试剂(LFA)只能将未处理组的mRNA水平降低不到20％(图6)。核碱基寡聚体F3，G4和C5进一步进行体外体内研究。图7和8描述了用Taqman分析法观察到的XIAP mRNA的降低。
实施例7：反义寡核苷酸对XIAP蛋白的下调作用
通过蛋白质印迹分析从寡核苷酸结构上明确了核碱基寡聚体对XIAP蛋白表达影响能力(图9，10A和10B)。G4 AS寡核苷酸对于XIAP蛋白表现出最强的下调作用，在浓度是1.2μM转染24小时后，XIAP蛋白水平下降62％(图10A和10B)。F3 AS寡核苷酸在浓度是1.2μM时可以将XIAP蛋白水平降低50％，而C5 AS寡核苷酸相对于对照组并没有显示出序列特异性活性(图10B)。此外研究表明E12和FG8 AS寡核苷酸能够显著降低XIAP蛋白水平(图9)。
实施例8：XIAP AS寡核苷酸诱导细胞凋亡
证明XIAP AS核碱基寡聚体能够降低H460细胞和T24膀胱癌细胞存活率我们可以确证细胞死亡是否由细胞凋亡引起。如图11A所示，F3或G4 AS核碱基寡聚体以1.2μM给药的H460细胞可以激活和降解前-半胱天冬酶-3蛋白，可以分别使蛋白水平相对于未处理组降低40％或60％。PARP也是预期的由半胱天冬酶-3生成的片段(图11A)。相反，F3和G4 SC寡核苷酸对照组在1.2μM时对半胱天冬酶-3或PARP的蛋白表达并没有影响(图11A)。当F3和G4AS寡核苷酸和各自的对照组给药浓度是1.2μM时，H460细胞中的Bcl-2：Bax比率没有变化。经G4 AS寡核苷酸给药和PI染色处理后，使用流式细胞分析方法检测H460细胞中亚二倍体DNA的含量(图12A)。当H460细胞经G4AS寡核苷酸或无序对照寡核苷酸以1.2uM给药后，细胞中亚二倍体DNA的含量分别为40.8％和22.1％，未处理的含量是16.6％。使用DAPI染色法检测H460细胞经G4 AS寡核苷酸或对照寡核苷酸在1.2uM浓度处理后其细胞核形态的变化。如图12B所示，经G4 AS寡核苷酸处理的细胞形态上发生了类似凋亡的变化：染色质凝聚和细胞核DNA碎裂。而在由G4 SC处理的对照组细胞中少有这些形态上的变化。
实施例9：由AS寡核苷酸引起的细胞生长抑制和使H460细胞对抗肿瘤药物敏感。
为了分析核碱基寡聚体下调XIAP表达和引起细胞凋亡的生物活性，用MTT测定法研究给予G4 AS寡核苷酸的H460细胞的生长。转染48小时后，G4 AS寡核苷酸剂量依赖性的抑制了H460细胞的生长，在1.2μM浓度时相对于未处理组表现出55％的抑制率(图13A)。相反，G4 SC寡核苷酸或单独的转染子试剂的生长抑制活性相对较低，是未处理对照组的低于10％。
为了研究下调XIAP的表达是否能够使H460细胞对化学疗法致敏，将G4 AS寡核苷酸和下列抗肿瘤药物联合给药：阿霉素(DOX)、紫杉醇、长春烯碱(VNB)和依托泊甙(Etop)。图13B表明相对于G4 AS寡核苷酸或抗肿瘤药物单独给药，每种联合给药至少都会给细胞死亡造成附加的细胞毒性作用。
实施例10：G4 AS寡核苷酸对H460和LCC6肿瘤移植物的抗肿瘤活性。
首先要确证将XIAP反义2×2-MBOs肿瘤内注射进皮下接种H460人类肺癌移植物的小鼠体内能否抑制肿瘤的生长。肿瘤细胞接种(s.c.肩部注射106细胞)14天后给肿块注射MBOs(50ug 2′-O-甲基RNA寡核苷酸每克肿瘤块)，每周三次，持续两周。在第17和24天注射长春烯碱(VNB；亦可称为诺维本(NVB))(15mg/kg i.p.)。用测径器测量肿瘤大小，每周三次。治疗周期结束后(24天)，C5+G4 AS MBOs和VNB联合给药使得小鼠肿瘤平均相对生长得到抑制，比MBOs和VNB对照组降低了约70％。C5 AS MBO和VNB给药组相对于无序对照组使得肿瘤大小减少约60％(图14)。
起初对PS-寡核苷酸的系统研究并没有设计任何化疗剂。SCID-RAG2小鼠接种H460人类肺癌细胞(s.c.肩部注射106个细胞)三天后，给予G4和F3 AS PS-寡核苷酸以及无序对照。腹腔注射核碱基寡聚体，12.5mg/kg，每周三次，持续三周。治疗期结束后，G4或F3 AS寡核苷酸给药组的肿瘤平均大小比对照寡核苷酸给药组减小约50％(图15)。接种MDA-MB-435/LCC6人类乳腺癌细胞的雌性SCID-RAG2小鼠采用相同的研究方法检测。末次治疗后两周(35天)，服用F3，C5或G4 AS寡核苷酸的小鼠的肿瘤体积比对照组分别减小了70％，60％和45％(图16)。
我们还用皮下移植了H460人非小细胞肺癌细胞的SCID-RAG2小鼠检测了G4 AS寡核苷酸的抗肿瘤活性。生理盐水对照组的肿瘤在大约24天内繁殖增长到0.75cm3(图17)。肿瘤细胞接种3天之后开始服用寡核苷酸。G4 AS寡核苷酸(5至15mg/kg)采用腹腔注射，每日一次，分别在第3-7天，10-14天和17-21天给药。给予5或15mg/kgG4 AS寡核苷酸极大的延迟了肿瘤的生长：给药24天后，对照组，5和15mg/kg给药组的肿瘤平均大小分别是0.75，0.45和0.29cm3(图18A)。抑制肿瘤生长具有剂量依赖性。15mg/kgG4 AS寡核苷酸给药小鼠的肿瘤比对照组小很多，是对照组平均肿瘤大小的39％。相反，G4 SC寡核苷酸以15mg/kg给药并没有治疗活性(图17)。寡核苷酸给药的小鼠没有显示任何中毒迹象，寡核苷酸的两种剂量都具有很好的耐受性。剂量15mg/kg被用来和抗肿瘤药物联合给药。
实施例11：经G4 AS寡核苷酸处理的H460肿瘤的XIAP蛋白表达减少
体内给予15mg/kg G4 AS和SC寡核苷酸后检测XIAP表达的变化观察G4 AS寡核苷酸的肿瘤生长抑制活性和XIAP蛋白表达之间的相关性。肿瘤接种后的第21或24天肿瘤达到1cm3大小(图17)，收集肿瘤，用蛋白质印迹法分析肿瘤匀浆的裂解物。使用XIAP和人β-肌动蛋白抗体确证肿瘤细胞标本中人XIAP的水平，这些细胞标本没有被小鼠细胞的XIAP所污染。G4 AS寡核苷酸给药的肿瘤的XIAP蛋白水平相对于对照组肿瘤显著降低约85％(P＜0.005)(图18A和18B)。G4 SC寡核苷酸给药的肿瘤比对照组肿瘤减小24％。这些结果表明G4 AS寡核苷酸对H460肿瘤生长抑制作用与XIAP蛋白表达的下调具有相关性。
实施例12：肿瘤标本的组织病理学检测
给药后检测肿瘤组织学形态和泛素免疫染色，评价XIAP AS寡核苷酸是否能够直接杀死肿瘤细胞(图19A和19B)。接种肿瘤后的第21天或24天，对15mg/kg G4 AS寡核苷酸，SC寡核苷酸给药组或生理盐水对照组肿瘤进行切除、切片以及苏木素和伊红染色。结果证明XIAPAS寡核苷酸给药的动物的肿瘤细胞的死亡数量增加了，形态学上可以由它们的无定性形状浓缩核内物质所证明(图19A)。
蛋白的降解主要依赖于泛素-蛋白体；泛素的表达在细胞凋亡过程中增加了。因此，我们检测苏木素和伊红染色的肿瘤部分的泛素表达。如图19B所示，XIAP AS寡核苷酸给药的小鼠的肿瘤相对于对照组SC ODN给药的小鼠的肿瘤表现出更强的免疫组织化学染色。这些数据显示，在XIAP AS核碱基寡聚体给药的肿瘤细胞中有比对照组肿瘤更多的游离泛素和/或泛素蛋白化蛋白。
实施例13：G4 AS寡核苷酸和长春烯碱的联合用药
为了评价G4 AS核碱基寡聚体和长春烯碱(VNB)(一种治疗肺癌的化学药物)联合用药是否具有协同作用，我们比较了VNB在G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸存在和不存在条件下的治疗效果。在肿瘤接种后第3天开始治疗方案。图20A显示了5mg/kg和10mg/kg剂量的长春烯碱在接种H460肿瘤细胞的小鼠体内的活性以及与生理盐水对照组的比较结果。每一个方案都产生了显著的剂量依赖性的肿瘤生长抑制效应，同时没有明显的毒副作用(例如，体重减轻)。当G4 AS寡核苷酸(15mg/kg)和VNB(5mg/kg)联合用药治疗H460肿瘤时，相对于单独给药会产生更为显著的抑制H460肿瘤生长的作用(图20B)。而且小鼠没有显示任何明显的中毒迹象(例如，体重减轻)。以5mg/kg VNB单独给药或和G4 AS或SC寡核苷酸联合给药的小鼠在给药第29天比较其肿瘤的平均大小(图20A和20B)。长春烯碱和G4 AS寡核苷酸给药组的肿瘤平均大小是0.22±0.03cm3，比5mg/kg VNB单独给药或VNB和G4 SC寡核苷酸联合给药组(0.59±0.04和0.48±0.05cm3)小很多。
方法
实施例5-13所得结果使用的是下面的方法。
寡核苷酸的合成
合成含有96种以上非重叠嵌合或混合骨架(MBO)19-姆反义寡核苷酸库，例如2×2MBO寡核苷酸，由侧接于任一侧通过硫代磷酸酯键连接的两个2′-O-甲基RNA残基和15个磷酸二酯DNA残基的核心构成。每一个终产物通过Sephadex G-25色谱柱(IDT Inc.，Coralville，IA)除去盐分。这种嵌合连接构型和硫代磷酸酯键和磷酸二酯键(参照2×2 PS/PO)给分子提供了充足的稳定性，同时减小了硫代磷酸酯残基的非特异性毒性。用于体内和体外研究的完全硫代磷酸酯化的非嵌合(DNA)反义寡核苷酸由Trilink Biotech合成，由RP-HPLC纯化。
反义寡核苷酸筛选
T24膀胱癌细胞经1-1.2μM寡核苷酸-脂质体复合物转染24-48小时后，评价确定每一种寡核苷酸降低XIAP蛋白水平的能力。利用T24膀胱癌细胞和H460肺癌细胞，用蛋白印迹分析法测定转染12-18小时之间寡核苷酸降低XIAP蛋白水平的能力，用定量RT-PCR(见下面)测定转染6-9小时之间寡核苷酸降低XIAP mRNA水平的能力，从而再次确定阳性结果。候选寡核苷酸得到进一步鉴定和检测。鉴定的2×2PS/PO嵌合寡核苷酸在400-1200nM浓度范围内转染6-9小时能够剂量依赖性的降低XIAPmRNA水平。示例性的寡核苷酸列于表5。
                              表5
    寡核苷酸            序列* SEQ ID NO：
    F3 AS   ATCTTCTCTTGAAAATAGG   (PS)     278
    F3 AS   AUCTTCTCTTGAAAATA GG   (2×2 PS/PO)     279
    F3 RP   GGATAAAAGTTCTCTTCTA   (PS)     280
    G4 AS   GCTGAGTCTCCATATTGCC   (PS)     281
    G4 AS   GCTGAGTCTCCATATTG CC   (2×2 PS/PO)     282
    G4 SC   GGCTCTTTGCCCACTGAAT   (PS)     283
    C5 AS   ACCATTCTGGATACCAGAA   (PS)     284
    C5 AS   ACCATTCTGGATACCAG AA   (2×2 PS/PO)     285
    C5 RP   AAGACCATAGGTCTTACCA   (PS)     286
    AB6 AS   GGGTTCCTCGGGTATATGG   (PS)     287
    AB6 RP   GGTATATGGCGTCCTTGGG   (PS)     288
    DE4 AS   GGTATCTCCTTCACCAGTA   (PS)     289
    DE4 RP   ATGACCACTTCCTCTATGG   (PS)     290
    D7 AS   GATTCACTTCGAATATTAA   (PS)     291
    D7 RP   AATTATAACGTTCACTTAG   (PS)     292
*粗体残基＝含有硫代磷酸酯键的DNA残基，下划线残基＝2′-O-甲基RNA碱基，普通型＝磷酸二酯DNA残基。
肿瘤细胞系和动物异种移植物模型
人非小细胞肺癌细胞系(大细胞形)NCI-H460(H460)来源于ATCC，于37度，含有5％CO2的潮湿空气条件下保存在含有10％牛胎血清的RPMI1640中。在指数生长期使用细胞，体外传代达到25。雄性SCID-RAG2小鼠(7-9周，23-26g)来源于British Columbia Cancer AgencyJoint Animal Facility，在无菌环境中群体饲养。通过在小鼠背部皮下移植1×106 NCI-H460细胞建立SCID-RAG2小鼠NCI-H460细胞肿瘤模型。
用反义寡核苷酸和抗肿瘤药物处理细胞
转染前一天，将H460细胞接种于6或96孔组织培养皿中。硫代磷酸酯反义寡核苷酸和Lipofectamine2000以脂质体-寡核苷酸复合物的形式转移至细胞中(生命技术)。转染4.5或6个小时后，由含有10％胎牛血清的RPMI培养基代替转染培养基，细胞继续孵育24或48小时。
实时定量RT-PCR
由脂质体-寡核苷酸复合物转染6小时的H460细胞的总RNA经RNeasy最小旋转柱和DNA酶(QIAGEN，Valencia，CA)处理立刻分离出来。使用实时定量RT-PCR方法检测特异性XIAP mRNA。设计跨越外显子3-4和4-5连接的XIAP正向和反向引物(600nM)和探针(200nM)(5′-GGTGATAAAGTAAAGTGCTTTCACTGT-3′(SEQ ID NO.293)，6FAM-CAACATGCTAAATGGTTCCAGGGTGCAAATATC-TAMRA(SEQ ID NO：294)，5′-TCAGTAGTTCTTACCAGACACTCCTCAA-3′(SEQ ID NO：295)。设计的引物或探针与内含子和外显子的分界点重叠，避免检测到任何可能的基因组DNA污染。逆转录RNA并使用TaqMan EZ RT-PCR试剂盒(PE/ABI，Foster City，CA)在ABI棱镜7700序列检测系统(PE/ABI)中进行扩增。RT步骤中的热循环条件是50℃2分钟，60℃30分钟，和95℃5分钟，然后进行45次PCR(每个循环94℃20秒，60℃1分钟)检测。每个样品的XIAPmRNA水平以未处理细胞为参照进行计算。使用循环阈值(Ct)用30X基线SD的阈值确定XIAPmRNA的水平，XIAPmRNA水平以GAPDH含量校正，使用PE/ABI提供的引物和探针。
蛋白质印迹分析
细胞或肿瘤组织样品用含有蛋白酶抑制剂(Complete-Miniprotease inhibitor tablets；Boehringer Mannheim GmBH，Mannheim，Germany)冰裂解缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，2.5mM EDTA，0.1％SDS，0.5％去氧胆酸钠，1％NP-40，0.02％叠氮化钠)裂解。样品在冰浴条件下孵育30分钟，然后以10000rpm高速冷冻离心15分钟，在-20C保存。使用去污剂兼容的BioRad测定法(Bio-Rad Labs，Hercules，CA)确定溶解提取物的蛋白含量。用12％SDS-聚丙酰胺凝胶或4-15％梯度SDS-聚丙酰胺凝胶(Bio-Rad)分离等量的蛋白(40，ug/道)，将其转移到硝酸纤维膜上。XIAP的一级抗体，Bcl-2(DAKO，Glostrup，Denmark)，Bax(Sigma，St.Louis，MO)，(β-肌动蛋白(Sigma)，半胱天冬酶-3(BD PharMingen，San Diego，CA)，和PARP(BD PharMingen)。次级抗体是合适的辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠或抗兔IgG(Promega，Madison，WI)。蛋白用增强的化学发光(ECL；Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，England)检测并用Kodak放射自显影胶片曝光成像。使用扫描密度测定法(MolecularDynamics，Sunnyvale，CA)通过体积/面积积分定量测定带的强度。细胞中XIAP，caspase-3，Bcl-2和Bax的数量分别用各自道上的p-肌动蛋白水平校正。
细胞生长和存活或死亡的测量
使用比色MTT细胞活力/增殖分析确定H460细胞的生长抑制。简单的讲，细胞经脂质体-寡核苷酸混合物处理4.5小时后，在无转染试剂或寡核苷酸的介质中，在有或无抗肿瘤药物时，37度孵育48小时。将MTT(25ug/孔)加进每一个孔中，培养皿在37C孵育3小时。孵育之后，加入200ulDMSO溶解有色产物。使用微量滴定法培养皿读取器在570nm波长处读取培养皿。给予寡核苷酸的孔中的细胞存活百分比都以未处理为标准。所有测定重复三次。
细胞凋亡流式细胞分析测定法
细胞给予脂质体-寡核苷酸混合物4.5小时后，室温环境在无转染试剂的介质中孵育48小时。孵育之后，收集细胞，用样品缓冲液(含有0.5％葡萄糖的无钙镁的PBS)洗涤两次，在4度70％的冷乙醇中保存至少18小时。样品在3000rpm速度下冷冻离心10分钟，然后混悬于含有50ug/ml碘化丙锭(PI)和400U/ml RNA酶A的样品缓冲液中。样品先在室温条件下孵育30分钟，再在冰浴条件下孵育30分钟，然后进行流式细胞分析。使用EXPO软件(Applied CytometrySystems，Sacramento，CA)绘制直方图确定排除碎屑后细胞循环相分布。亚G1/G0细胞部分被认为是凋亡细胞的典型特征。
细胞核形态学检测
细胞给药脂质体-寡核苷酸混合物4.5小时后，将其接种于没有转染试剂或寡核苷酸的介质中，37度保持48小时。收集细胞并在室温条件下用0.10ug/mlDAPI(4′，6-二脒-2-2-苯基吲哚)染色30分钟。将细胞放置于载玻片上，甩片，使用Leica显微镜，在紫外荧光照射下通过40X物镜观察。使用Imagedatabase V.4.01软件(Leica，Germany)获取数字图像。
体内抗肿瘤活性
用接种NCI-H460肿瘤细胞的雄性RAG2免疫缺陷小鼠或接种LCC6肿瘤细胞的雌性RAG2小鼠进行活性评价实验。肿瘤接种后第三天开始给药治疗。每天皮下注射生理盐水(对照)，G4 AS寡核苷酸(5或15mg/kg)，或G4 SC寡核苷酸(5或15mg/kg)，每周五次，持续3周。肿瘤接种后的第3，7，11和17天尾静脉注射长春烯碱(VNB，5或10mg/kg)或将其与寡核苷酸联合给药。当寡核苷酸和VNB联合给药时，在ODN治疗4小时后再给药。
每日观察小鼠。通过体重测量和应激体征(例如，嗜睡，有褶饰边缘的表皮，共济失调)检测可能的毒性。当肿瘤溃烂或肿瘤体积达到1cm3或更大时杀死小鼠。使用公式：1/2[长度(cm)]×[宽度(cm)]2将数字测径器测量值换算成肿瘤平均大小(cm3)。
肿瘤和组织处理
肿瘤接种和给药后的第21和24天收集小鼠肿瘤。将一部分肿瘤组织浸泡于福尔马林溶液。将石蜡包埋的组织切片，通过苏木素和伊红染色进行整体组织病理学和免疫组织化学检查测定泛素表达。肿瘤的其它部分在溶解缓冲液中经过均匀加工处理进行蛋白质印迹分析(见上面)。
统计学分析
应用Student′s T检验检测两个处理组之间的统计学差异。使用单向ANOVA和用Shelle检验标准(Statistica release 4.5，StatSoftInc.，Tulsa，OK)比较不同组的post-hoc检验进行多重比较。具有P＜0.05的数据具有显著性差异。
实施例14：反义HIAP1寡核苷酸降低HIAP1 RNA和多肽表达
使用上面例3中描述的引物和探针，在两种不同的条件下用蛋白质印迹分析法筛选含15个HIAP反义核碱基寡聚体的寡核苷酸库，鉴定能够降低蛋白的寡核苷酸，用TaqMan方法筛选鉴定能够降低RNA的寡核苷酸。可以使用标准蛋白质印迹分析或RT-PCR技术检测HIAP1RNA水平。在碱性条件或环己酰亚胺(CHX)诱导条件下，向细胞给予反义寡核苷酸(以亚中毒剂量给药24小时)。依据给药细胞系的不同，环己酰亚胺能够诱导10到200倍的HIAP1 mRNA生成。如蛋白质印记(70kDa带)所示，这进而导致HIAP1蛋白的增加。CHX的这种活性是通过两种不同的作用机制起作用的。首先，CHX通过阻碍不稳定蛋白IkB(NFkB抑制剂)的从头合成激活NFkB(已知的HIAP1转录诱导剂)。另一种蛋白合成抑制剂嘌罗霉素和TNF-α也产生类似作用，其中TNF-α通过诱导信号级联导致IkB的磷酸化，泛化和降解。与放线菌素D和嘌罗霉素或和TNF-α联合用药相反，只有CHX能够使HIAPmRNA进一步稳定从而阻碍从头转录，这一点可以由在放线菌素D存在下HIAP1mRNA消失的速度降低看到，CHX的作用与放线菌素D和嘌罗霉素或THF-α组合的作用不同。
SF295胶质母细胞瘤细胞用脂质体和寡核苷酸(无序survivin，非寡核苷酸，反义APO 1至APO 15)转染或不经任何处理。转染6小时后将RNA从细胞中分离出来，用定量PCR(TaqMan分析)检测HIAP1mRNA水平，用GAPDH mRNA校正，将无序survivin寡核苷酸转染结果设为1.0。这个实验包括3个单独实验，结果列于图21。混合寡核苷酸，模拟转染和未处理(未转染)细胞都具有相似的HIAP1mRNA水平。在15个反义寡核苷酸中，和模拟转染组或无序对照寡核苷酸转染组(5′-mUmAmAGCTGTTCTATGTGmUmUmC-3′；SEQ ID NO.：296)(图21)相比，7个(APO 1，2，7，8，9，12，15)显示出使HIAPmRNA降低50％的活性。一些寡核苷酸诱导产生HIAP1mRNA，这可能是对非特异性毒性寡核苷酸的应激反应。如果寡核苷酸能够干扰翻译过程，即使增加HIAPmRNA，反义寡核苷酸可能还具有降低HIAP1蛋白水平的活性。
用诱导表达HIAP1的细胞检测HIAP1反义核碱基寡聚体影响HIAP1蛋白和mRNA表达的活性。用寡核苷酸转染SF295细胞或模拟转染。转染的细胞用10μg/ml CHX处理24小时以便诱导70kDaHIAP1mRNA和蛋白的表达。采用蛋白质印迹分析法用抗HIAP1单克隆抗体检测蛋白水平，通过对同一点的再探察用肌动蛋白校正。蛋白质印迹的扫描结果显示于图22A。密度扫描结果以模拟结果(设置为100％)为标准绘制于图22B。在50％处绘制一条线以便容易识别活性最高的反义寡核苷酸。正如蛋白免疫印迹所示，相对于未处理样品转染过程本身(例如，模拟或无序survivin)诱导HIAP1蛋白表达。
在15个检测的核碱基寡聚体中，6个(APO 1，2，7，8，12，和15)显示高度活性，或在蛋白或RNA测定中都显示出高度活性，没有产生由应激诱发的HIAP1mRNA的增加，而相对与APO2(不匹配或相反极性，见下面的文本和图23和24)，APO4，6，11，13，14(图21)和对照寡核苷酸都导致了HIAPmRNA的增加。整体蛋白水平的普遍降低证实APO6也具有毒性(图23)。
为了进一步研究在环己酰亚胺诱导的条件下HIAP1反义寡核苷酸的活性，用TaqMan实时PCR在转染APO2 6小时后检测HIAP1mRNA的变化，其中APO2以HIAP1的内含子中Alu重复序列为靶，最大限度的阻碍CHX诱导的HIAP1mRNA和蛋白的提高。这个实验的对照是3个针对APO2的寡核苷酸：一个混合序列(碱基组分相同但序列随机，5′-AAGGGCGGCGGAGTGAGAC-3′；SEQ ID NO：297)一个极性相反序列(碱基组分相同，连接顺序相同但方向相反，5′-AGAGG ACGGAGTCGGAGGC-3′；SEQ ID NO：298)，还有一个不匹配序列(19个碱基中有4个碱基不匹配，5′-CGGAGCGTGAGGATGGAGA-3′；SEQ ID NO：299)。
APO2反义寡核苷酸转染进入细胞导致mRNA相对于无序survivin对照组降低50％，这与蛋白结果完全匹配。而APO2的无序对照组(H1sc apo2)根本不会改变HIAP1mRNA的水平(这里在两个不同的实验中重复两次)。然而，不匹配对照ODN(HI mm apo2)和反极性对照寡核苷酸(HI RV apo2)在转染6小时后能够诱导6至7倍的HIAP1mRNA的生成。正如预期的那样，这些寡核苷酸不再以HIAP1为作用靶，但由于Alu重复序列的简并性和重复性，这些寡核苷酸仍然以这些序列为靶。因此，这两个对照品可能对细胞具有毒性，造成应激反应诱导HIAP生成。APO2寡核苷酸也会产生这种作用，但相对于无序survivin对照品，APO2还造成诱导生成的HIAP1mRNA降解，导致HIAP1mRNA的相对降低，相对于无序survivin对照寡核苷酸，APO2还能使经过转染和CHX处理细胞而诱导生成的HIAP1蛋白相对倍数降低。
6个反义HIAP1核碱基寡聚体除了一个内含子序列外(APO1，和APO2，其中APO2具有更好的活性)包括两个非常高效的寡核苷酸。这些寡核苷酸可以用来治疗癌症或自身免疫病。相对于内含子序列寡核苷酸似乎只作用于前信使RNA(存活很短的靶标)而不是HIAP1的成熟的加工的形式。典型的是，反义寡核苷酸不以内含子为靶除非想修改剪接以内含子-外显子分界线或分歧点为作用靶。这通常导致跳过外显子而不是核糖核酸酶介导的mRNA降解。两种机制均有利于增强细胞凋亡，跳过外显子会导致编码HIAP1的头两个重要的BIR区域的外显子的缺失。APO2反义ODN以survivin内含子的19个碱基中的18个连续的碱基为作用靶，但我们并没有观察到survivin蛋白的任何减少；给予寡聚物后只有HIAP1减少了，这证明了HIAP1反义寡核苷酸的特异性。这些反义寡核苷酸命中HIAP1内含子或可能许多其它基因中的Alu序列，导致癌细胞死亡(见下面)，这可能是降低HIAP1或其它决定基因水平的结果，如果对正常细胞没有太大的毒性就具有治疗价值。
据报道癌细胞中有更多的含有Alu的转录，因而在以Alu为靶的核碱基寡聚体存在下对细胞凋亡的诱导更为敏感。此外，核碱基寡聚体APO1和APO2的致死活性可能是由于目标Alu序列和HIAP1同时联合作用的结果。当细胞受到某种毒性药物作用时，这种双重作用为阻止由HIAP1通过NFkB途径诱导的正常应激反应提供了有效途径。这种应激反应很可能是肿瘤细胞抗细胞凋亡过程的一部分。通过阻碍HIAP1的表达，我们计数了这种抗细胞凋亡的应激反应，沉淀癌细胞的死亡。
实施例15：HIAP1反义寡核苷酸增加细胞毒性和化学致敏性。
对于HIAP1反义核碱基寡聚体对SF295细胞的化学致敏效果也进行了评价。用下列三种不同的反义寡核苷酸(APO7，APO15，和SC APO2(对照))之一转染细胞。寡核苷酸转染细胞24小时后，细胞给予阿霉素再孵育24小时，然后应用分析实验WST-1分析存活的细胞。
经上面描述的HIAP1寡核苷酸转染，再给予增加浓度的阿霉素的SF295细胞的WST-1存活曲线见图25。相对于给予没有降低HIAPmRNA水平活性的寡核苷酸的细胞，能够降低HIAPmRNA水平的两种寡核苷酸和阿霉素联用还显示出降低细胞存活数的作用。因此，通过反义或其它方法降低HIAP1水平可以使得对许多化学治疗药物的细胞毒性高度耐受的胶质母细胞瘤细胞系化学致敏。
其它89个可按照本发明的方法应用的HIAP1反义序列列于表6。人HIAP1和HIAP2序列100％相同或有一到两处不匹配用粗体表示                                                             表6
     核碱基寡聚物序列 SEQ ID NO：      核碱基寡聚物序列 SEQ ID NO：      核碱基寡聚物序列 SEQ ID NO：
    AGCAAGGACAAGCCCAGTC     300     TTAAGCCATCAGGATGCCA     332     GATTTTTCTCTGAACTGTC     364
    TGTAAACCTGCTGCCCAGA     301     GCTACAGAGTAAGCTGTGT     333     CTATAATTCTCTCCAGTTG     365
    AGAAGTCGTTTTCCTCCTT     302     CTCTAGGGAGGTAGTTTTG     334     ACACAAGATCATTGACTAG     366
    CCGAGATTAGACTAAGTCC     303     AAGAAAAGGGACTAGCCTT     335     TCTGCATTGAGTAAGTCTA     367
    ACTTTTCCTTTATTTCCAC     304     CAGTTCACATGACAAGTCG     336     TCTTTTTCCTCAGTTGCTC     368
    TCCCAAACACAGGTACTAT     305     GACTCCTTTCTGAGACAGG     337     GTGCCATTCTATTCTTCCG     369
    CATTCTCAGCGGTAACAGC     306     ATTCACACCAGTGTAATAG     338     GTAGACTATCCAGGATTGG     370
    ACCATCATTCTCATCCTCA     307     CAGAAGCATTTGACCTTGT     339     AGTTCTCTTGCTTGTAAAG     371
    AATGTAACCTTCAACCATC     308     CCAGCATCAGGCCACAACA     340     TCGTATCAATCAGTTCTCT     372
    TTTGTATTCATCACTGTC     309     TTTCAGTAGGACTGTCTCC     341     GCAGAGAGTTTCTGAATAC     373
    TCACATCTCATTACCAAC     310     TGCAGCTAGGATACAACTT     342     ATGTCCTGTTGCACAAATA     374
    CCAGGTGGCAGGAGAAACA     311     AGAGGTAGCTTCCAAGTTG     343     CTGAAACATCTTCTGTGGG     375
    TGCAGACTTCAATGCTTTG     312     GAAGTAATGAGTGTGTGGA     344     TTTCTTCTTGTAGTCTCCG     376
    TAAGCAAGTCACTGTGGCT     313     GGATTTGATGGAGAGTTTG     345     CTTCTTTGTCCATACACAC     377
    CTGAGTCGATAATACTAGC     314     GAACTTCTCATCAAGGCAG     346     GGAATAAACACTATGGACA     378
    ACTAGCCATTAGTAAAGAG     315     AGGTCCTATGTAGTAAAAG     347     CATACTACTAGATGACCAC     379
    CAACAGCAGAGACCTTGTC     316     CAATTTTCCACCACAGGCA     348     TGTACCCTTGATTGTACTC     380
    ATAGCATACCTTGAACCAG     317     CATTATCCTTCGGTTCCCA     349     GAAATGTACGAACTGTACC     381
    CATCTGTAGGCTAAGATGG     318     CTCAGGTGTTCTGACATAG     350     GATGTTTTGGTTCTTCTTC     382
    AGTTACCAGATGCCATCTG     319     GCTCAGATTAGAAACTGTG     351     CTATCATTCTCTTAGTTTC     383
    AATCTACTCTGATAGTGGA     320     CTGCATGTGTCTGCATGCT     352     ACACCTGGCTTCATGTTCC     384
    GTTTCTGAAGCCAACATCA     321     TTAACTAGAACACTAGAGG     353     GACTACAGGCACATACCAC     385
    TCAACTTATCACCTCCTGA     322     CATAATAAAAACCCGCACT     354     TGCCTCAGCCTGGGACTAC     386
    AAGAACTAACATTGTAGAG     323     CACCATCACAGCAAAAGCA     355     AGGATGGATTCAAACTCCT     387
    GTAGACAACAGGTGCTGCA     324     CTCCAGATTCCCAACACCT     356     GAGAAATGTGTCCCTGGTG     388
    ATGTCCTCTGTAATTATGG     325     GGAAACCACTTGGCATGTT     357     GCCACAACAGAAGCATTTG     389
    TACTTGGCTAGAACATGGA     326     GTTCAAGTAGATGAGGGTA     358
    GAAGCAACTCAATGTTAAG     327     GATAATTGATGACTCTGCA     359
    TTTGGTCTTTTGGACTCAG     328     ATGGTCTTCTCCAGGTTCA     360
    CCATAGATCATCAGGAATA     329     GCATTAATCACAGGGGTAT     361
    CAGGACTGGCTAACACATC     330     TAAAGCCCATTTCCACGGC     362
    TTTAATGGCAGGCATCTCC     331     TGTTTTACCAGGCTTCTAC     363
我们还分析了人HIAP2以期找到可以作为反义核碱基寡聚体的序列。鉴定的序列列于表7中。
                                   表7
     核碱基寡聚物序列 SEQ ID NO：      核碱基寡聚物序列 SEQ ID NO：
TTCTGAAAACTCTTCAATG     390  CTCAGAGTTTCTAGAGAAT     426
CTTAGCATAAAGTATCAGT     391  ATGTTCTCATTCGAGCTGC     427
CAAAAAAGTACTGCTTAGC     392  TGAACTGGAACACTAGATG     428
CAAGATAAAACTTGTCCTT     393  GCTCAGGCTGAACTGGAAC     429
TATCAGTCATGTTGTAAAC     394  TTGACATCATCATTGCGAC     430
CTAAATAACCTGTTCATCA     395  ACCATCACAACAAAAGCAT     431
AGCACACTTTTTACACTGC     396  CCACTTGGCATGTTCTACC     432
ACCACTATTATTCTTGATC     397  TCGTATCAAGAACTCACAC     433
TGTATTTGTTTCCATTTCC     398  GGTATCTGAAGTTGACAAC     434
ACTGTAAACTCTATCTTTG     399  TTTCTTCTCCAGTGGTATC     435
CTTAAGTGGGCTAAATTAC     400  TTCTCCAGGTCCAAAATGA     436
CCTTCATATGGTCACACTA     401  ACAGCATCTTCTGAAGAAC     437
GGTTACAAGCTATGAAGCC     402  CACAGGTGTATTCATCATG     438
CTAAGCAACTATAGAATAC     403  CCAGGTCTCTATTAAAGCC     439
TCCTTGATTTTTCACAGAG     404  TTCTCTCCAGTTGTCAGGA     440
ATACTAACTTAAAGCCCTG     405  GAAGTGCTGACACAATATC     441
GGGTTGTAGTAACTCTTTC     406  TTTTCCTTCTCCTCCTCTC     442
TAGAACACAACTCTTTGGG     407  CATCTGATGCCATTTCTTC     443
CTCTGAATTTCCAAGATAC     408  AGCCATTCTGTTCTTCCGA     444
TTTACTGGATTTATCTCAG     409  CCAGGATAGGAAGCACACA     445
TGAGTAGGTGACAGTGCTG     410  ATGGTATCAATCAGTTCTC     446
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ACAGGCAAAGCAGGCTACC     424  CACCATAACTCTGATGAAC     460
GTTCTGACATAGCATCATC     425
其它实施方案
本说明中提到的所有出版物和专利申请，包括U.S.Patent Nos.5,919,912，6,156,535，和6,133,437，都以与单独引用同等程度的引入作为参考。
尽管本发明通过其特异的实施方案进行了描述，但是应当理解其可以进一步修饰，本申请覆盖任何遵从本发明的原理而进行的变化、应用或改进，本申请还包括偏离本发明的公开但落在本发明所属领域已知或惯例并可以用于上文提到的基本特征的变化。
序列表
<110>AEGERA Therapeutics，Inc.et al.
<120>反义IAP核碱基寡聚物及其用途
<130>07891/025CN4
<150>PCT/IB2003/001670
<151>2003-03-27
<150>US 60/367,853
<151>2002-03-27
<160>460
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
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<223>基于人类。
每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分。
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每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分。
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每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分。
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每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分。
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每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分。
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每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分。
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<223>基于人类。
每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分。
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<223>基于人类。
每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分。
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每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分。
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<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，4，7，11，12，13，14
<223>n＝T或U
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     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
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<223>基于人类。
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     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
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<223>n＝T或U
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<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
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<223>n＝T或U
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<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，9，11，13，18
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<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>5，8，15，16
<223>n＝T或U
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<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，5，8，9，10，13，14，16，17，19
<223>n＝T或U
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<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
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<223>n＝T或U
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<223>n＝T或U
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<222>1，5，12，14，15
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<223>基于人类。
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<222>1，6，9，11，12，14，15，17，18
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<223>基于人类。
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<223>基于人类。
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gnncnnccac nggnaganc                                                      19
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<223>基于人类。
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<223>n＝T或U
<400>253
cnncnngnag ncnccgcaa                                                      19
<210>254
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，2，4，8，15，16，17
<223>n＝T或U
<400>254
nngnccanac acacnnnac                                                      19
<210>255
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>8，9，14
<223>n＝T或U
<400>255
aaccaaanna gganaaaag                                                      19
<210>256
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>2，4，5，8，10，13，14，15，19
<223>n＝T或U
<400>256
angnncanan ggnnnagan                                                      19
<210>257
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，5，6，7，8，11，12，16，17
<223>n＝T或U
<400>257
naagnnnnac nncacnnac                                                      19
<210>258
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>2，4，5，11，13，14，17
<223>n＝T或U
<400>258
angnncccgg nannagnac                                                      19
<210>259
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>5，10，13，14，16，18，19
<223>n＝T或U
<400>259
gggcncaagn aanncncnn                                                      19
<210>260
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>9，13，14
<223>n＝T或U
<400>260
gcccaggang ganncaaac                                                      19
<210>261
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     DNA/RNA杂交体
<400>261
gagaagatga ctggtaaca                                                      19
<210>262
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     DNA/RNA杂交体
<221>misc_特征
<222>1，17，18
<223>n＝T或U
<400>262
ngtgctattc tgtgaann                                                      18
<210>263
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>263
tctgcttcaa ggagctggaa                                                      20
<210>264
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>264
gaaaggaaag cgcaaccg                                                      18
<210>265
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>265
agccagatga cgaccccata gaggaacata                                                      30
<210>266
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>266
tggagatgat ccatgggttc a                                                      21
<210>267
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>267
gaactcctgt cctttaattc ttatcaagt                                                      29
<210>268
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>268
ctcacacctt ggaaaccact tggcatg                                                      27
<210>269
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>269
ggtgataaag taaagtgctt tcactgt                                                      27
<210>270
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>270
tcagtagttc ttaccagaca ctcctcaa                                                      28
<210>271
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>271
caacatgcta aatggtatcc agggtgcaaa tatc                                                      34
<210>272
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>272
gaaggtgaag gtcggagtc                                                      19
<210>273
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>273
gaagatggtg atgggattc                                                      19
<210>274
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>274
caagcttccc gttctcagcc                                                      20
<210>275
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。Each nucleobase is part of
     a dcoxyribonucleotide或ribonucleotide。
<400>275
cagagatttc atttaacgu                                                      19
<210>276
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     Each nucleobase may be part of a
     deoxyribonucleotide或ribonucleotide
<400>276
cuacgctcgc catcgtuca                                                      19
<210>277
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     Each nucleobase is part of a deoxyribonucleotide
     或ribonucleotide
<400>277
ugcccaagaa tactaguca                                                      19
<210>278
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>2，4，5，7，9，10，16
<223>n＝T或U
<400>278
ancnncncnn gaaaanagg                                                      19
<210>279
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>2，4，5，7，9，10，16
<223>n＝T或U
<400>279
ancnncncnn gaaaanagg                                                      19
<210>280
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>4，10，11，13，15，16，18
<223>n＝T或U
<400>280
gganaaaagn ncncnncna                                                      19
<210>281
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，7，9，13，15，16
<223>n＝T或U
<400>281
gcngagncnc cananngcc                                                      19
<210>282
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，7，9，13，15，16
<223>n＝T或U
<400>282
gcngagncnc cananngcc                                                      19
<210>283
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>4，6，7，8，15，19
<223>n＝T或U
<400>283
ggcncnnngc ccacngaan                                                      19
<210>284
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>5，6，8，12
<223>n＝T或U
<400>284
accanncngg anaccagaa                                                      19
<210>285
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>5，6，8，12
<223>n＝T或U
<400>285
accanncngg anaccagaa                                                      19
<210>286
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>8，12，14，15
<223>n＝T或U
<400>286
aagaccanag gncnnacca                                                      19
<210>287
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>4，5，8，13，15，17
<223>n＝T或U
<400>287
gggnnccncg ggnanangg                                                      19
<210>288
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，5，7，12，15，16
<223>n＝T或U
<400>288
ggnananggc gnccnnggg                                                      19
<210>289
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，5，7，10，11，18
<223>n＝T或U
<400>289
ggnancnccn ncaccagna                                                      19
<210>290
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>2，9，10，13，15，17
<223>n＝T或U
<400>290
angaccacnn ccncnangg                                                      19
<210>291
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，4，8，9，14，16，17
<223>n＝T或U
<400>291
ganncacnnc gaanannaa                                                      19
<210>292
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，4，6，11，12，16，17
<223>n＝T或U
<400>292
aannanaacg nncacnnag                                                      19
<210>293
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>293
ggtgataaag taaagtgctt tcactgt                                                      27
<210>294
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>294
caacatgcta aatggttcca gggtgcaaat atc                                                      33
<210>295
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>295
tcagtagttc ttaccagaca ctcctcaa                                                      28
<210>296
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     DNA/RNA杂交体
<400>296
uaagctgttc tatgtguuc                                                      19
<210>297
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>297
aagggcggcg gagtgagac                                                      19
<210>298
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>298
agaggacgga gtcggaggc                                                      19
<210>299
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
<400>299
cggagcgtga ggatggaga                                                      19
<210>300
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>18
<223>n＝T或U
<400>300
agcaaggaca agcccagnc                                                      19
<210>301
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，3，9，12
<223>n＝T或U
<400>301
ngnaaaccng cngcccaga                                                      19
<210>302
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>6，9，10，11，12，15，18，19
<223>n＝T或U
<400>302
agaagncgnn nnccnccnn                                                      19
<210>303
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>7，8，13，17
<223>n＝T或U
<400>303
ccgagannag acnaagncc                                                      19
<210>304
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，4，5，6，9，10，11，13，14，15
<223>n＝T或U
<400>304
acnnnnccnn nannnccac                                                      19
<210>305
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，14，17，19
<223>n＝T或U
<400>305
ncccaaacac aggnacnan                                                      19
<210>306
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，4，6，13
<223>n＝T或U
<400>306
canncncagc ggnaacagc                                                      19
<210>307
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>5，8，9，11，14，17
<223>n＝T或U
<400>307
accancannc ncanccnca                                                      19
<210>308
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，5，10，11，18
<223>n＝T或U
<400>308
aangnaaccn ncaaccanc                                                      19
<210>309
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，2，3，5，7，8，11，15，17
<223>n＝T或U
<400>309
nnngnannca ncacngnc                                                      18
<210>310
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，6，8，11，12
<223>n＝T或U
<400>310
ncacancnca nnaccaac                                                      18
<210>311
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>6
<223>n＝T或U
<400>311
ccaggnggca ggagaaaca                                                      19
<210>312
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，8，9，13，16，17，18
<223>n＝T或U
<400>312
ngcagacnnc aangcnnng                                                      19
<210>313
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，9，13，15，19
<223>n＝T或U
<400>313
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<213>人工序列
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<223>基于人类。
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<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
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<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
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     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
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     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
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<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>4，5，10，17
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     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
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<223>基于人类。
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accagcacga gcaagacnc                                                      19
<210>416
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>4，5，7，10，11
<223>n＝T或U
<400>416
accnngncan ncacaccag                                                      19
<210>417
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，6，7，9，16
<223>n＝T或U
<400>417
nccagnnanc cagcancag                                                      19
<210>418
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，4，5，6，10，16，18
<223>n＝T或U
<400>418
gcnnnngaan aggacngnc                                                      19
<210>419
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>5，7，9，10，15，18
<223>n＝T或U
<400>419
gagangncnn caacngcnc                                                      19
<210>420
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>5，6，9，12，16
<223>n＝T或U
<400>420
ggggnnagnc cncgangaa                                                      19
<210>421
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，4，5，9，13，15
<223>n＝T或U
<400>421
ncanngcana acngnaggg                                                      19
<210>422
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，5，6，12，13，15，18
<223>n＝T或U
<400>422
gcncnngcca anncngang                                                      19
<210>423
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>5，7，9，15，18
<223>n＝T或U
<400>423
acccnancnc caggnccna                                                      19
<210>424
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>16
<223>n＝T或U
<400>424
acaggcaaag caggcnacc                                                      19
<210>425
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>2，3，5，10，15，18
<223>n＝T或U
<400>425
gnncngacan agcancanc                                                      19
<210>426
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>2，8，9，10，12，19
<223>n＝T或U
<400>426
cncagagnnn cnagagaan                                                      19
<210>427
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>2，4，5，7，10，11，17
<223>n＝T或U
<400>427
angnncncan ncgagcngc                                                      19
<210>428
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，6，14，18
<223>n＝T或U
<400>428
ngaacnggaa cacnagang                                                      19
<210>429
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，9，14
<223>n＝T或U
<400>429
gcncaggcng aacnggaac                                                      19
<210>430
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，2，7，10，13，14
<223>n＝T或U
<400>430
nngacancan canngcgac                                                      19
<210>431
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>5，19
<223>n＝T或U
<400>431
accancacaa caaaagcan                                                      19
<210>432
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>5，6，11，13，14，16
<223>n＝T或U
<400>432
ccacnnggca ngnncnacc                                                      19
<210>433
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，4，6，14
<223>n＝T或U
<400>433
ncgnancaag aacncacac                                                      19
<210>434
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，5，7，12，13
<223>n＝T或U
<400>434
ggnancngaa gnngacaac                                                      19
<210>435
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，2，3，5，6，8，13，16，18
<223>n＝T或U
<400>435
nnncnncncc agnggnanc                                                      19
<210>436
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，2，4，10，17
<223>n＝T或U
<400>436
nncnccaggn ccaaaanga                                                      19
<210>437
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>7，9，10，12
<223>n＝T或U
<400>437
acagcancnn cngaagaac                                                      19
<210>438
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>7，9，11，12，15，18
<223>n＝T或U
<400>438
cacaggngna nncancang                                                      19
<210>439
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>6，8，10，12，13
<223>n＝T或U
<400>439
ccaggncncn annaaagcc                                                      19
<210>440
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，2，4，6，11，12，14
<223>n＝T或U
<400>440
nncncnccag nngncagga                                                      19
<210>441
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>5，8，16，18
<223>n＝T或U
<400>441
gaagngcnga cacaananc                                                      19
<210>442
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，2，3，4，7，8，10，13，16，18
<223>n＝T或U
<400>442
nnnnccnncn ccnccncnc                                                      19
<210>443
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，5，8，13，14，15，17，18
<223>n＝T或U
<400>443
cancngangc cannncnnc                                                      19
<210>444
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>6，7，9，11，12，14，15
<223>n＝T或U
<400>444
agccanncng nncnnccga                                                      19
<210>445
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>7
<223>n＝T或U
<400>445
ccagganagg aagcacaca                                                      19
<210>446
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>2，5，7，11，15，16，18
<223>n＝T或U
<400>446
anggnancaa ncagnncnc                                                      19
<210>447
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>9，10，11，14，15，16
<223>n＝T或U
<400>447
ccgcagcann nccnnnaac                                                      19
<210>448
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>4，5，6，7，8，14，16，17
<223>n＝T或U
<400>448
cagnnnnnga agangnngg                                                      19
<210>449
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>2，11，18
<223>n＝T或U
<400>449
gngacagacc ngaaacanc                                                      19
<210>450
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>6，7，8，9，11，12
<223>n＝T或U
<400>450
gggcannnnc nnagagaag                                                      19
<210>451
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>3，8，9，12，13，15
<223>n＝T或U
<400>451
agnacccnng annanaccc                                                      19
<210>452
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>5，7，16
<223>n＝T或U
<400>452
gaaangnacg aacagnacc                                                      19
<210>453
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>1，9，12，15，16
<223>n＝T或U
<400>453
 ngaaaaacnc anaannccc                                                      19
<210>454
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>4，6，7，8，9
<223>n＝T或U
<400>454
ccancnnnnc agaaacaag                                                      19
<210>455
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>2，4，7，8，10，12，17，18
<223>n＝T或U
<400>455
cnanaanncn cnccagnng                                                      19
<210>456
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>2，6，7，11，17
<223>n＝T或U
<400>456
cncccnnagg nacacanac                                                      19
<210>457
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>9，15，18
<223>n＝T或U
<400>457
acaagcagng acacnacnc                                                      19
<210>458
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>2，6，9，14，17
<223>n＝T或U
<400>458
gnaacnccng aaangangc                                                      19
<210>459
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>8，13，17
<223>n＝T或U
<400>459
caacaaancc agnaacncc                                                      19
<210>460
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基于人类。
     每个核碱基可以是核苷酸、脱氧核苷酸或核苷酸类似物的一部分
<221>misc_特征
<222>6，10，12，15
<223>n＝T或U
<400>460
caccanaacn cngangaac                                                      19

Claims (63)

1.长度达30个核碱基的基本上纯的核碱基寡聚物，所述的核碱基寡聚物包含选自SEQ ID NOs：97，98，99，143，147，151，287，289和300-460中的序列的至少8个连续核碱基。
2.权利要求1的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物基本上由选自SEQ ID NOs：97，98，99，143，147，151，287，289和300-460的序列组成。
3.权利要求2中的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物由选自SEQ ID NOs：97，98，99，143，147，151，287，289和300-460的序列组成。
4.权利要求1-3中任一项的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物是寡核苷酸。
5.权利要求1-4中任一项的核碱基寡聚物，其中所述的寡核苷酸包括至少一个修饰键。
6.权利要求5中的核碱基寡聚物，其中所述的修饰键选自硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、二硫代磷酸酯和磷酸硒酸酯键。
7.权利要求1-6中任一项的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物包含至少一个修饰的糖部分。
8.权利要求7中的核碱基寡聚物，其中所述的修饰的糖部分是2’-O-甲基基团或2’-O-甲氧乙基基团。
9.权利要求1-8中任一项的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物包括至少一个修饰的核碱基。
10.权利要求9中的核碱基寡聚物，其中所述的修饰过的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
11.权利要求1-10中任一项的核碱基寡聚物，其中所述核碱基寡聚物是嵌合的核碱基寡聚物。
12.权利要求11中的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物包括由硫代磷酸酯键连接的DNA残基，所述的DNA残基每一侧连接有至少一个2’-O-甲基或2’-O-甲氧乙基RNA残基。
13.权利要求12中的核碱基寡聚物，其中所述的DNA残基每一侧连接有至少3个2’-O-甲基或2’-O-甲氧乙基RNA残基。
14.权利要求13中的核碱基寡聚物，其中所述DNA残基每一侧连接有4个2’-O-甲基或2’-O-甲氧乙基RNA残基。
15.权利要求12-14中任一项的核碱基寡聚物，其中所述RNA残基之间由硫代磷酸酯键相连接，并且所述RNA残基通过硫代磷酸酯键与所述DNA残基连接。
16.权利要求11中的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物包含由磷酸二酯键连接的DNA残基，所述的DNA残基每一侧连接有至少两个由硫代磷酸酯键连接的2’-O-甲基或2’-O-甲氧乙基RNA残基。
17.权利要求16中的核碱基寡聚物，其中所述的DNA残基每一侧连接有至少3个2’-O-甲基或2’-O-甲氧乙基RNA残基。
18.包含11个每一侧都连接4个2’-O-甲基RNA残基的DNA残基的核碱基寡聚物，所述的核碱基寡聚物由下列序列之一组成：
5’-AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3’(SEQ ID NO：155)；
5’-ACACGACCGCTAAGAAACA-3’(SEQ ID NO：16)；
5’-ACAGGACTACCACTTGGAA-3’(SEQ ID NO：157)；
5’-UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3’(SEQ ID NO：27)；
5’-GCUGAGTCTCCATATUGCC-3’(SEQ ID NO：141)；
5’-UCGGGTATATGGTGTCUGA-3’(SEQ ID NO：41)；
5’-AAGCACTGCACTTGGUCAC-3’(SEQ ID NO：47)；
5’-CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3’(SEQ ID NO：51)；
5’-ACCCTGGATACCATTUAGC-3’(SEQ ID NO：63)；
5’-UGUCAGTACATGTTGGCUC-3’(SEQ ID NO：161)；和
5’-UGCACCCTGGATACCAUUU-3’(SEQ ID NO：151)，
所述的残基由硫代磷酸酯键连接。
19.权利要求18中的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物由SEQ ID NO：155的序列组成。
20.权利要求18中的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物由SEQ ID NO：16的序列组成。
21.权利要求18中的核碱基寡聚物，其中所述核碱基寡聚物由SEQID NO：157的序列组成。
22.权利要求18中的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物由SEQ ID NO：27的序列组成。
23.权利要求18中的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物由SEQ ID NO：141的序列组成。
24.权利要求18中的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物由SEQ ID NO：41的序列组成。
25.权利要求18中的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物由SEQ ID NO：47的序列组成。
26.权利要求18中的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物由SEQ ID NO：51的序列组成。
27.权利要求18中的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物由SEQ ID NO：63的序列组成。
28.权利要求18中的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物由SEQ ID NO：161的序列组成。
29.权利要求18中的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物由SEQ ID NO：151的序列组成。
30.权利要求1-29中任一项的核碱基寡聚物，其中所述的核碱基寡聚物抑制所述细胞中IAP的表达。
31.增强动物细胞中程序性细胞死亡的方法，该方法包括在一定条件下给予所述动物权利要求1-29中任一项的核碱基寡聚物以便所述核碱基寡聚物抑制所述细胞中IAP的表达。
32.权利要求31中的方法，其进一步包括给予所述动物化疗剂。
33.权利要求32中的方法，其中所述化疗剂是细胞生长抑制剂。
34.权利要求32中的方法，其中所述化疗剂是细胞毒性剂。
35.权利要求31-34中任一项的方法，其进一步包括给予所述动物化学致敏剂。
36.权利要求31-35中任一项的方法，其进一步包括给予所述动物生物反应调节剂。
37.权利要求31-36中任一项的方法，其中所述的核碱基寡聚物通过静脉或肿瘤内施用于所述动物。
38.权利要求31-37中任一项的方法，其中所述的动物是人类。
39.治疗患癌症或淋巴组织增生性障碍的动物的方法，该方法包括给予所述动物治疗有效量的权利要求1-30中任一项的核碱基寡聚物。
40.权利要求39中的方法，其中所述的癌症是急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性原粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性骨髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、何杰金氏病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤或视网膜母细胞瘤。
41.权利要求39或40中的方法，其进一步包括给予所述动物化疗剂。
42.权利要求41中的方法，其中所述的核碱基寡聚物和所述的化疗剂各自在5天内给予所述动物。
43.权利要求42中的方法，其中所述的核碱基寡聚物和所述的化疗剂各自在24小时内给予所述动物。
44.权利要求41-43中任一项的方法，其中所述的化疗剂选自由阿霉素、长春烯碱、依托泊甙、紫杉醇和顺铂组成的组。
45.权利要求41中的方法，其中所述化疗剂是细胞生长抑制剂。
46.权利要求41中的方法，其中所述化疗剂是细胞毒性剂。
47.权利要求39-46中任一项的方法，其进一步包括给予所述动物化学致敏剂。
48.权利要求39-47中任一项的方法，其进一步包括给予所述动物生物反应调节剂。
49.权利要求39-48中任一项的方法，其中所述的核碱基寡聚物通过静脉或肿瘤内施用给所述动物。
50.权利要求39-49中任一项的方法，其中所述的动物是人类。
51.药物组合物，其包含权利要求1-30中任一项的核碱基寡聚物和药学可接受的载体。
52.权利要求51中的药物组合物，其进一步包括胶体分散系统。
53.能够剪切XIAP、HIAP1或HIAP2 mRNA的催化性RNA分子。
54.权利要求53中的催化性RNA分子，其结合臂包含对应于表1，2，6和7中任意一个序列的至少8个连续的核碱基。
55.权利要求53或54中的催化性RNA分子，其中所述的RNA分子为锤头状基序。
56.权利要求53或54中的催化性RNA分子，其中所述的RNA分子位于发夹结构、肝炎δ病毒、组1内含子、VS RNA或RNA酶P RNA基序中。
57.一种表达载体，其包括编码权利要求53-56中任一项的一种或多种催化性RNA分子并且位置适当的核酸，用于在哺乳动物细胞中表达。
58.治疗患癌症或淋巴组织增生性障碍的动物的方法，该方法包括给予所述动物有效量的权利要求53-56中任一项的催化性RNA分子。
59.由21至29个核碱基组成的双链RNA分子，所述的RNA分子包括与表1，2，6和7中任一序列相应的至少8个连续的核碱基。
60.由50至70个核碱基组成的双链发夹式RNA分子，所述的RNA分子包含21至29个核碱基的第一结构域，所述核碱基包括对应于表1，2，6和7中任一序列的至少8个连续的核碱基；与所述的第一结构域互补的第二结构域，以及位于所述第一和第二结构域之间的环形结构域，以便所述第一结构域和所述第二结构域能够复合形成所述双链发夹式RNA分子。
61.表达载体，其包括编码权利要求60中的双链RNA分子并且位置适当的核酸分子，用于在哺乳动物细胞中表达。
62.治疗患癌症或淋巴组织增生性障碍的动物的方法，该方法包括给予所述动物有效量的权利要求59或60中的双链RNA分子。
63.由选自SEQ ID NO：97，98，99，143，147，151，287，289和300-460中的序列组成的寡核苷酸。
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