CN1780922A - 治疗严重急性呼吸道综合症(sars)的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了低聚化合物和组合物的设计和合成，给予这种低聚化合物和组合物能降低SARS病毒的体内或体外活性、预防或治疗SARS病毒相关疾病、检测SARS病毒以及诊断SARS病毒相关疾病。

Description

治疗严重急性呼吸道综合症(SARS)的组合物和方法
相关申请的交叉参考
本发明要求下述优先权：1)2003年4月28日提交的美国临时申请序列号60/466,426；2)2003年5月6日提交的美国临时申请序列号60/468,562；3)2003年4月30日提交的美国临时申请序列号60/467,770；4)2003年5月6日提交的美国临时申请序列号60/468,627；5)2003年6月10日提交的美国临时申请序列号60/477,637；6)2003年6月27日提交的美国临时申请序列号60/483,579；和7)2004年4月26日提交的题为“SARS低聚化合物”(SARS Oligomeric Compounds)的代理人案卷编号为ISIS0083-002的美国临时申请，这些申请都已全文纳入本文作为参考。
以光盘提交的序列表
序列表被加载到名为“COPY 1-SEQUENCE LISTING PART”的独立CD-R上，文件名为“ISIS0083-500.SEQ”，创建时间为2004年4月27日，大小为8,530千字节，并被完整纳入本文作为参考。光盘一式4份提交，其中包括副本(3个拷贝)，每个提交的光盘上有一个文件。
发明领域
本发明涉及低聚化合物和组合物的设计和合成，给予这种低聚化合物和组合物能降低SARS病毒的体内或体外活性、预防或治疗SARS病毒相关疾病、检测AARS病毒以及诊断SARS病毒相关疾病。
发明背景
冠状病毒是一种感染人类和动物的病毒家族，包括一种引起普通感冒样呼吸疾病的病毒，称为人冠状病毒229E(Hco-V-229E)。该家族也包括禽感染性支气管炎病毒(IBV)、鼠肝炎病毒(MHV)、猪传染性胃肠炎病毒PRCoV、猪呼吸冠状病毒和牛冠状病毒等(Lai和Holmes，病毒书第35章)。
冠状病毒是有包膜的巨大正链RNA病毒。它们在所有年龄的人群中引起普通感冒，占所有感冒的约15％。冠状病毒已是婴儿胃肠道疾病的病因。它们在动物中也引起有重要经济损失的疾病(如禽感染性支气管炎和猪传染性胃肠炎)。冠状病毒因为在电镜纤维照片中其包膜糖蛋白看起来像在病毒体外围形成了一个晕或冠而得名。冠状病毒也是有趣的，因为它们是唯一具有螺旋核衣壳的正链RNA病毒。
在所有RNA病毒中，冠状病毒的基因组最大，而且通过独特的产生高频率重组的机制复制。病毒粒子通过在胞内膜上出芽而成熟，感染某些冠状病毒会诱导细胞融合(病毒学领域，D.M.Knipe，P.M.Howley编，2001，Lippincott Williams&Wilkins出版，Philadelphia，1163-1179)。
人冠状病毒在培养基中生长缓慢，不能详细分析。大部分研究是用鼠肝炎病毒，一种在培养基中生长良好、涉及人毒株OC43的冠状病毒进行的。当该病毒识别细胞表面受体时开始感染，对于毒株229E，该受体被发现是氨肽酶N，对于OC43该受体是唾液酸。该病毒通过内吞作用和膜融合进入细胞。
与大多数RNA病毒一样，冠状病毒复制完全在胞质中进行。一旦病毒RNA进入胞质，它就翻译产生依赖病毒RNA的RNA聚合酶，然后该酶产生病毒粒子RNA的全长互补(负链)拷贝。该负链作为七被帽和聚腺苷化的mRNA的转录模板。将这些安排为嵌套过程，其中所有RNA都具有相同的3’末端，但每个RNA都比下一个更大的RNA少1个基因。所有RNA具有相同5’末端，即72个核苷酸的前导序列，它仅在基因组RNA的5’末端编码。这提示各mRNA以通过合成前导序列开始转录、然后“跳”至一个基因的开始处而结束于相同的3’末端的机制转录。不管存在多少基因，每个mRNA上只翻译第一个基因(最接近5’末端的那个)。因此，在冠状病毒复制过程中不存在多蛋白加工。
冠状病毒是冬季引起普通感冒的主要原因。在世界范围内都发现了这种病毒。在人们孩提时代就开始出现抗体，在超过90％的成年人中发现存在抗体。冠状病毒呼吸感染的次数每年都会有很大不同。最高的发生率出现在鼻病毒感冒最低的年份。冠状病毒感冒倾向于发生在限定的爆发周期。通过ELISA、补体结合或血凝反应测试进行实验室诊断。人冠状病毒不能通过培养生长而分离。
临床上不能将冠状病毒引起的感冒与鼻病毒感冒区分。潜伏期是2-5天，症状持续5-7天。机体免疫集中在主要病毒表面糖蛋白E2上。尽管再感染因为高水平的病毒遗传重组通常是可能的，然而再感染会持续几年。
冠状病毒通过呼吸分泌物气雾、粪-口途径和机械性传播而传播。大多数病毒生长在上皮细胞中。偶见肝、肾、心或眼，以及其它细胞类型如巨噬细胞的感染。在感冒型呼吸感染中，生长像是定位在上呼吸道上皮中，但是现在对于人呼吸冠状病毒没有足够的动物模型。临床上，大多数感染引起轻微、自限制的疾病(典型“感冒”或胃部不适)，但是可能有极少数神经并发症。
2002年下，中华人民共和国的广东省报道了几百例非典型肺炎。几个月后，在加拿大、越南和香港发现了类似病例。世界卫生组织(WHO)将该突然出现的疾病确定为“严重极性呼吸综合症”或SARS。2003年3月，发现一种全新的冠状病毒(SARS-CoV)与SARS病例有关。至2003年4月下，全球25个国家报道了超过4300例SARS病例，导致约250人死亡。据信，SARS病毒通过咳嗽和打喷嚏产生的飞沫传播，但也可能包括其它传染途径，如手污染的物体。到2003年5月7日为止，WHO估计SARS病例的致死率为14-15％。到2003年6月3日为止，WHO报道的世界范围内SARS病例总数为8398。
现在可能一般性描述该疾病进程。首次感染后的潜伏期约2-7天。一般感染均有发烧的特征，接下来的几天内就是无痰干咳，呼吸短促。该疾病引起3-10％的病例死亡。
已经鉴定了SARS-CoV及其通常变体的全部基因组，SARS-CoV的基因组是29,727个核苷酸的聚腺苷化RNA，具有11个开放阅读框，41％的残基是G或C。它的基因组组织是典型冠状病毒的特征性基因顺序(5’-复制酶(rep)、刺突(S)、包膜(E)、膜(M)、核壳体(N)-3’，两端有短的非翻译区)。预计约占基因组三分之二的SARS-CoVrep基因编码两个进行共翻译蛋白水解加工的多蛋白。预计rep下游有4个开放阅读框(ORF)编码结构蛋白S、E、M和N，这与所有已知冠状病毒相同。没有发现存在于第2类和部分第3类冠状病毒中ORF1b和S之间的血凝-酯酶基因。系统发生分析和序列比较显示SARS-CoV与任何以前表征的冠状病毒都没有紧密的联系。
冠状病毒也编码很多定位于S和E之间、M和N之间或N下游的非结构蛋白。这些非结构蛋白在不同的冠状病毒种中变化很大，其功能未知，而且对于病毒复制来说可有可无。
现在，诊断测试是可行的，但是作为迅速控制疾病爆发的工具，所有的测试都有局限性。ELISA测试可信地检测抗体，但只有在出现临床症状后约20天才能进行。因此它不能用于在病例传播感染其他人之前的早期检测。第二种检测，即免疫荧光测定(IFA)在感染的第10天时可信地检测抗体。它也有ELISA测定的缺陷，因为在基于IFA的诊断前病人已有传染性。而且，IFA测定是苛刻、相当慢的测定，需要病毒在细胞培养中生长。第三种检测是聚合酶链式反应(PCR)分子测定，它可用于感染早期检测SARS病毒遗传物质，但却产生不良的假阴性结果。因此PCR测定即使与临床诊断评价相结合也可能检测不到实际上携带病毒的人，这造成面对已知在亲密的个人接触中容易传播的病毒的潜在流行时，给人们危险的假安全感觉(WHO，严重急性呼吸道综合症(SARS)。Wkly Epidemiol.Rec.，2003，78，121-122)。
由于各种工业、医学、环境、质量和研究的原因，需要迅速和权威的微生物学鉴定。传统上，微生物学实验室通过直接检查和培养传染病病原行使对其鉴定的职责。自1980年代中期以来，研究者已经重复证明了分子生物学技术的实践用途，其中很多技术形成临床诊断测定的基础。这些技术中的一部分包括核酸杂交分析、限制性酶分析、遗传序列分析和核酸的分离和纯化(参见例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，纽约，1989)。这些步骤通常是耗时和冗长的。另外一个选择是聚合酶链式反应(PCR)或其它基于侧面引物扩增特异的靶DNA序列的扩增程序。最终，检测和数据分析将杂交事件转化为分析结果。
其它用于检测生物样品的技术包括高分辨质谱(MS)、低分辨MS、荧光、放射性碘化、DNA芯片和抗体技术。这些技术没有一个是完全令人满意的。
质谱提供了关于所分析分子的详细信息，包括高质量准确度。它也是可容易地自动化的方法。然而，单独高分辨MS不能对未知或生物工程制品，或在生物样品背景水平高(″杂乱的″背景)的环境下进行测定。如果样品的谱线足够弱或足够接近来自样品中其它生物体的谱线，低分辨MS就不能检测这些已知样品。具有特异性探针的DNA芯片只能确定特定的预期生物体的存在与否。因为有几十万种良性细菌，一些细菌与威胁生物体的序列相似，所以甚至排列了10,000探针的阵列也缺乏检测具体生物体的宽度。
抗体比阵列面对更严峻的多样性限制。如果将抗体设计为抗高度保守的目标以增加多样性，会有很多假警告问题，又是因为威胁生物体与良性生物体非常相似。抗体只能在相对不杂乱的环境中检测已知样品。
几个小组已经描述了用高分辨电喷雾电离-傅里叶变换-离子回旋加速器谐振质谱(ESI-FT-ICR MS)检测PCR产物。对确切质量的准确测量与至少一个核苷酸的数量知识相结合，即可计算约100碱基对的PCR双链产物的总碱基构成。(Aaserud等，J.Am.Soc.Mass Spec.，1996，7，1266-1269；Muddiman等，Anal.Chem.，1997，69，1543-1549；Wunschel等，Anal.Chem.，1998，70，1203-1207；和Muddiman等，Rev.Anal.Chem.，1998，17，1-68)。电喷雾电离-傅里叶变换-离子回旋加速器阻抗(ESI-FT-ICR)MS可通过平均分子质量来确定500碱基对的双链PCR产物的质量(Hurst等，Rapid Commun.Mass Spec，1996，10，377-382)。已描述了用基质辅助激光解析电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱表征PCR产物(Muddiman等，RapidCommun.Mass Spec.，1999，13，1201-1204)。然而，用MALDI观察超过约75个核苷酸的DNA降解限制了该方法的使用。
美国专利5,849,492描述了一种回收含系统发生信息的DNA序列的方法，包括搜索被两个高度保守片段包围的基因组DNA的高度趋异片段，设计通用引物来扩增该高度趋异区域，用通用引物通过PCR技术扩增基因组DNA，然后测序该基因以确定生物体身份。
美国专利5,965,363揭示了通过用质谱技术分析扩增的靶核酸来筛选核酸多态性的方法和提高这些方法的质量分辨率和质量准确度的程序。
WO 99/14375描述的方法中，PCR引物和试剂盒被用于通过质谱分析预先选择的DNA串联核苷酸重复等位基因。
WO 98/12355揭示了用质谱确定靶核酸质量的方法，通过切割靶核酸降低其长度，使靶单链化并用MS确定该单链截短靶的质量。也揭示了制备用于MS分析的双链靶核酸的方法，包括扩增靶核酸、将一条链结合到固体支持物上、释放第二条链、然后释放第一条链，然后将用MS分析该链。也提供用于制备靶核酸的试剂盒。
PCT W097/33000揭示了在靶核酸中通过将靶非随机片段化为一组单链非随机长度的片段来检测突变和用MS确定其质量的方法。
美国专利5,547,835、5,605,798、6,043,031、6,197,498、6,221,601、6,221,605、6,277,573、6,235,478、6,258,538、6,300,076、6,428,955和6,500,621描述了快速和高准确度的基于质谱的方法，用来在需要诊断的生物样品中检测具体核苷酸的存在。
WO 98/21066描述了用质谱确定具体靶核酸序列的方法。揭示了在生物样品中用PCR扩增和质谱检测来检测靶核酸存在的方法，即通过用含限制性位点和标记的引物扩增靶、延伸并切割扩增的核酸和检测延伸产物的存在，在样品中检测靶核酸的方法，其中存在与野生型质量不同的DNA片段就说明有突变。也描述了通过质谱方法测序核酸的方法。
WO 97/37041，WO 99/31278和美国专利5,547,835描述了用质谱测序核酸的方法。美国专利5,622,824,5,872,003 and 5,691,141描述了用于核酸外切酶介导的质谱测序的方法、系统和试剂盒。
病毒(包括所有逆转录病毒)、DNA插入序列、细菌和酵母使用程序化的核糖体移码(Farabaugh，Microbiol.Rev.，1996，60，103-134；和Gesteland等，Annu.Rev.Biochem.，1996，65，741-768)，是调节在两个重叠翻译阅读框中编码的相关蛋白表达的重要机制。该移动在通用序列X XXY YYN的七核苷酸位置发生，称为“滑动位点”(Giedroc等，J.Mol.Biol.，2000，298，167-185)。mRNA假结能用其位于滑动位点之上的A-和P-位点tRNA诱导中止核糖体延伸。虽然在滑动位点中止，但是如果核糖体在5’方向上移动1个碱基，那么A-和P-位点tRNA的非摆动碱基就可以与新的-1框密码子结合，以-1框XXX YYY N产生蛋白，此时mRNA假结变性，延伸在新的阅读框中继续进行。
移码的效率依赖于滑动位点的特性，也依赖于下游假结基序的序列和复杂度(Egli等，Proc.Natl.Acad.Sci.，2002，99，4302-4307)。打开假结的热动力学或动力学控制在调节核糖体移码效率中可能是重要的(Giedroc等，J.Mol.Biol.，2000，298，167-185)。
在适应步骤中氨酰基-tRNA反密码子环移动9通常会沿其方向拉出下游mRNA相似的距离。Plan等已经提示下游mRNA假结通过变成楔形卡入核糖体mRNA通道的入口对该移动产生阻力。这两种相反的力导致mRNA中A-位点密码子和mRNA假结之间产生局部区域的拉力。这可通过下述两种机制之一释放：解旋假结，允许下游区域向前移动；或者与mRNA最接近区域向后滑动一个碱基。后一种机制的观察结果是阅读框在5’方向上净移动一个碱基，即核糖体移码-1(Plant等，RNA，2003，9，168-174)。
核糖体移码已经被证明是很多病毒的本质特征。这些病毒包括逆转录病毒载体(如HIV)、冠状病毒科、星形病毒科、全病毒科等其它病毒家族。
冠状病毒中的移码位点在ORF 1a和1b之间。ORF 1a含有很多蛋白，包括蛋白酶，ORF 1b包含RNA依赖性RNA聚合酶。
RNA依赖性RNA聚合酶是必需基因。不像一些其它的RNA基因组病毒，冠状病毒在病毒颗粒中不携带RNA依赖性RNA聚合酶拷贝。因此为了成功复制，必须从基因组RNA中直接翻译RNA依赖性RNA聚合酶。因为RNA依赖性RNA聚合酶位于移码位点下游，所以绝对需要移码信号工作以产生冠状病毒的RNA依赖性RNA聚合酶，它对于上游的ORF 1a来说阅读框移动-1。
如果SARS病毒与以前记载的冠状病毒行为相同，那么也将在基因组的类似位置有移码位点，此移码位点的功能对于病毒生命周期来说是必需的。
因此，希望调节移码过程能提供有用的策略，来破坏SARS-CoV增殖必需的RNA依赖性RNA聚合酶的翻译。
之前调节病毒RNA核糖体移码的尝试限于研究人体免疫缺陷病毒(HIV)。例如，美国专利5,707,866和PCT公告WO 95/27054揭示并要求了用与涉及翻译忠实性控制的哺乳动物细胞小核糖体亚基RNA区互补的反义DNA寡聚物抑制HIV核糖体移码的方法和组合物的权利(Brakier-Gingras，1998)。
Vickers和Ecker报道了靶向HIV gag-pol区的寡核苷酸增强核糖体移码(Vickers等，Nucleic Acids Research，1992，20，3945-3953)。
虽然现在大家相信SARS-CoV是SARS的主要病因物，但仍不知道其它感染物，如病毒是否可能造成较高致病力、发病率和/或死亡率。发病率和死亡率也可能与遗传因素有关，因为已经显示一些病例中亲缘病人似乎具有类似的临床症状。虽然不能排除这些可能性，但是可接受的是，减少病毒在肺中的荷载将与改善的预后相联系。
一个研究得很好的移码位点是感染性支气管炎病毒(IBV)，一种感染小鸡的冠状病毒。IBV病毒的结构是一个滑动位点，后接一个假结。
与移码位点RNA杂交的低聚化合物将提供实用的策略，以调节移码位点的功能，并为发现针对病毒，如有原因地关联于SARS的冠状病毒的抗病毒药物提供基础。另外，希望与具体二级结构的RNA区特异性结合的小分子也将提供调节核糖体移码的手段。
本发明提供调节核糖体移码，包括发生在冠状病毒，如SARS相关冠状病毒的RNA中的移码的方法和组合物。
已经将核苷和它们的衍生物成功用于一些病毒感染的治疗中，然而至今也没有确定有效的抗病毒疗法用于SARS，尤其是在晚期。
反义物质，如反义寡核苷酸、PNA、LNA和吗啉代物已经用于治疗各种病状。FDA批准的第一个反义药物是硫代磷酸寡核苷酸(Vitravene，福米韦生)，可从IsisPharmaceuticals，Inc.，Carlsbad，California购得。福米韦生是一种有效治疗视网膜炎的抗病毒反义化合物。理论证明用反义药物能治疗其它病毒，如丙型肝炎，然而以前并未显示吸入一种或多种抗病毒化合物可治疗冠状病毒，尤其SARS-CoV。
已经有人描述过通过肺部给药输送药物的方法。例如各美国专利6,550,472、6,546,927、6,543,443、6,540,154、6,540,153、6,467,476和6,427,682提供了用于肺部给药的方法和装置的知识，纳入本文作为参考，然而它们没有证明通过吸入疗法能成功治疗SARS。同时，各美国专利6,503,480、6,447,753、6,387,390、5,985,320、5,985,309和5,855,913提供了用于肺部给药的方法和装置的知识，纳入本文作为参考，然而它们没有证明通过吸入疗法能成功治疗SARS。此外，各美国专利6,431,167、6,408,854、6,349,719、6,167,880、6,098,620、5,971,951、5,957,124、5,906,202、5,819,726、5,755,218和5,522,385提供了用于肺部给药的方法和装置的知识，纳入本文作为参考，然而它们没有证明通过吸入疗法能成功治疗SARS。
类似地，各美国专利6,546,929、6,543,448、6,509,006、6,423,344、6,303,582和6,138,668提供了输送药物至肺的方法的知识，纳入本文作为参考，然而它们没有证明通过吸入疗法能成功治疗SARS。
已经有人描述过通过鼻滴输送药物的方法。例如美国专利6,551,578、6,554,497、6,485,707、6,468,507、6,464,959、6,294,153、6,214,805、6,087,343、5,985,320和5,744,166，以上各专利清除地纳入本文作为参考，这些专利揭示了用于鼻滴药物成分的组合物和方法。
已经有人描述生物胶粘剂能够促进药物通过内皮粘膜的运输。例如整体纳入本文作为参考的美国专利6,228,383提供了生物胶粘剂脂肪酸酯用于促进药物通过肺、鼻和其它组织中内皮粘膜的运输的用途。
纳入本文作为参考的1999年5月20日提交的美国专利申请09/315,298已经描述了穿透增强剂。穿透增强剂促进穿透粘膜、包括肺和鼻粘膜。
与移码位点RNA杂交的低聚化合物将提供实用的策略，以调节移码位点的功能，并为发现针对病毒，如有原因地关联于SARS的冠状病毒的抗病毒药物提供基础。另外，希望与具体二级结构的RNA区特异性结合的小分子也将提供调节核糖体移码的手段。
因此，需要一种特异并迅速地检测和鉴定生物样品的方法，其中核酸测序对于获得所需的检测或鉴定并不是非要不可的。这种需要对于全新的感染物，如传播迅速且可能通过相对短时间的突变使传统检测方法混淆的SARS-CoV来说显得尤其迫切。
本发明提供调节核糖体移码，包括发生在冠状病毒，如SARS相关冠状病毒的RNA中的移码的方法和组合物，并着手解决对快速鉴定是主要健康威胁的生物样品、包括SARS病毒的需要。
发明概述
本发明提供靶向编码SARS病毒核酸分子的含有8至约80个核碱基(nucleobase)的低聚化合物，其中该化合物与编码SARS病毒的核酸分子杂交并降低SARS病毒的表达至少50％。在一些实施方式中，该化合物包含12至约50核碱基或15至约30核碱基。造一些实施方式中，该化合物是寡核苷酸、反义寡核苷酸、DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸或嵌合寡核苷酸。在一些实施方式中，至少该化合物的一部分与RNA杂交形成寡核苷酸-RNA双链体。在一些实施方式中，该化合物与编码SARS病毒的核酸分子的互补度至少70％，至少80％，至少90％或至少95％。在一些实施方式中，该化合物至少包含一条修饰的核苷间连接、修饰的糖部分或修饰的核碱基。在一些实施方式中，该化合物包含至少一个2′-O-甲氧基乙基糖部分、至少一个硫代磷酸核苷间连接、或至少一个5-甲基胞嘧啶。
本发明也提供降低SARS病毒在细胞或组织中表达的方法，包括用本文描述的化合物接触细胞或组织，以使SARS病毒表达降低。
本发明也提供筛选SARS病毒调节剂的方法，包括用一种或多种候选的SARS病毒调节剂接触编码SARS病毒的核酸分子中合适的靶区域，并鉴定一种或多种调节SARS病毒表达的SARS病毒表达调节剂。
本发明也提供鉴定病状的诊断方法，包括在样品中用至少一种引物鉴定SARS病毒的存在。
本发明也提供包括本文描述的化合物的试剂盒和测定装置。
本发明也提供治疗患有SARS病毒相关的疾病或症状的动物的方法，包括给予动物治疗或预防有效量的本文描述的化合物，以使SARS病毒的表达降低。在一些实施方式中，该疾病或症状是病毒感染。
本发明也提供长度为8至80个核碱基靶向病毒RNA移码位点的化合物，其中该化合物与移码位点特异性杂交，并调节病毒RNA核糖体移码的过程。
本发明也提供筛选移码位点调节剂的方法，该方法将一种或多种候选的移码位点调节剂与移码位点的合适靶节段接触，测定移码调节程度。
本发明也提供治疗患有冠状病毒相关疾病或症状的个体的方法，该方法是给予个体治疗或预防有效量的靶向冠状病毒移码位点的化合物，以通过调节移码位点抑制冠状病毒的增殖。
本发明还提供表征冠状病毒RNA中以前未表征的移码位点的方法，该方法是获得具有已知移码位点的已知冠状病毒的RNA序列，获得具有未表征移码位点的冠状病毒的RNA序列，对已知冠状病毒的RNA序列和具有未表征的移码位点的冠状病毒RNA序列等的多序列比对进行协方差分析。
附图简述
图1代表传染性胃肠炎病毒(TGEV)、人冠状病毒229E(HcoV 229E)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、禽感染性支气管炎病毒(IBV)、SARS冠状病毒(SARS)、鼠肝炎病毒(MHV)和牛冠状病毒(BcoV)的移码位点的比对序列片段。在比对中也显示了与比对中阴影区代表的滑动序列、茎1和茎2相关的成对掩蔽标识符。以粗体显示冠状病毒中保守的核苷酸残基。
实施方案的描述
本发明将化合物，如低聚化合物，包括例如，寡核苷酸和类似物质用于调节编码SARS病毒的核酸分子的功能和效果。这通过，例如提供与一种或多种编码SARS病毒的核酸分子杂交的寡核苷酸来完成。为方便起见，本文使用术语“靶核酸”和“编码SARS病毒的核酸分子”来包括DMA编码的SARS病毒、转录自所述DNA的RNA(包括mRNA前体和mRNA或其部分)和衍生自所述RNA的cDNA的表述。用本发明化合物的靶核酸与其杂交通常称为“反义”。因此，一种认为是包括在本发明某些实施方式实践中的机制被称为“反义抑制”。所述反义抑制一般基于寡核苷酸链或片段的氢键杂交，该寡核苷酸链或片段中至少一条链或片段被切割、降解或通过其他方式使其不能工作。在这点上，靶向具体核酸分子及其功能对于所述反义抑制来说是合适的。
将被干扰的DNA的功能包括但不限于复制和转录。复制和转录，例如可源自内源性细胞模板、载体、质粒构建物和其他方式。将被干扰的RNA的功能包括但不限于下述功能，如将RNA转运到蛋白翻译的部位、将RNA转运到距离RNA合成部位很远的胞内部位、由RNA翻译蛋白质、剪切RNA产生一种或多种RNA物质和催化或形成由RNA从事或促进的含RNA的复合物。所述干扰靶核酸功能的一个结果是调节了SARS病毒的表达。在本发明的内容中，“调节”和“表达调节”指编码某基因的核酸分子，如DNA或RNA的量或浓度增加(刺激)或降低(抑制或减少)。抑制或减少是经常需要的表达调节形式，mRNA常常是所需的靶核酸。
在本发明的内容中，“杂交”指低聚化合物的互补链配对。一种配对机制包括氢键结合，可以是低聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键结合。例如，腺嘌啉和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补核碱基。在不同的环境下均可发生杂交。
当低聚化合物，如反义化合物与靶核酸结合干扰靶核酸的正常功能，以致引起活性损失，而且在适合特异性结合的条件，如体内试验或治疗性处理的生理条件下和进行体外试验的条件下，足够的互补程度避免了反义化合物与非靶向核酸序列的非特异性结合时，该化合物是“特异性可杂交的”。然而，本发明的低聚化合物不必是特异性可杂交的(即实际上低聚化合物在适合特异性结合的条件下具有非特异性结合到非靶向核酸序列的能力)。
本发明中，短语“严谨杂交条件”或“严谨条件”指在这种条件下，本发明化合物将与其靶序列杂交，但与其它序列的杂交数量最少。严谨条件是依赖于序列的，在不同环境下将是不同的；在本发明内容中，在“严谨条件”下，低聚化合物的特性和组成以及研究它们的实验决定了低聚化合物与靶序列的杂交。
本文使用的“互补”指低聚化合物和与其对应的靶分子的两个核碱基之间的精确配对能力。例如，如果寡核苷酸探针(低聚化合物)上特定位置的核碱基能够与靶核酸分子(靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子)上特定位置的核碱基形成氢键结合，那么认为寡核苷酸和靶核酸分子的氢键结合位置就是互补位置。当可以氢键互相结合的核碱基占据了各分子中足够数量的互补位置时，寡核苷酸与DNA、RNA或寡核苷酸分子互相互补。因此，术语“特异性可杂交”和“互补”用于表示足够数量的核碱基中形成了足够程度的精确配对或互补性，以致寡核苷酸和靶核酸分子之间形成稳定和特异性的结合。
本领域技术人员能够理解，低聚化合物序列不必与靶核酸分子序列100％互补才能是特异性可杂交或可杂交。而且，寡核苷酸可与一个或多个片段杂交，以致插入和邻近片段不会涉及杂交事件(如环结构或发夹结构)。本发明的低聚化合物可含至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列与它们靶向的靶核酸序列内的靶区域互补。例如，反义化合物的20个核碱基中18个与靶区域互补并因此特异性杂交，该反义化合物则代表90％的互补度。在这个例子中，剩下的非互补核碱基可能是成簇或散布于互补核碱基中，不必互相相邻或与互补核碱基相邻。同样地，长度为18个核碱基的反义化合物具有4个非互补核碱基，其两侧是两个与靶核酸完全互补的区域，该反义化合物与靶核酸的总互补度即为77.8％，也落入本发明的范围之内。可用本领域技术人员已知的BLAST程序(局部序列比对基本检索工具)和PowerBLAST程序(Altschul等，J.Mol. Biol.，1990，215,403-410；Zhang和Madden，Genome Res.，1997，7，649-656)或用使用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.，1981，2，482-489)的Gap程序(Wisconsin序列分析包，第8版，用于Unix，遗传学计算机组，大学研究园区，Madison WI)，采用默认设置来例行地确定低聚化合物与靶核酸区域的互补度百分数。
在本发明内容中，术语“低聚化合物”指含有多个单体的聚合物或寡聚物。在本发明内容中，术语“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物，或其模拟物，嵌合体、类似物和同源物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(骨架)连接以及组成的寡核苷酸以及具有非天然存在、而功能类似部分的寡核苷酸。因为其理想特性，如提高的细胞摄取、提高的靶核酸亲和力和在核酸酶存在下增加的稳定性，通常需要所述修饰或取代的寡核苷酸的原始形式。
本发明的化合物
根据本发明，低聚化合物包括但不限于至少可以与靶核酸部分杂交的反义低聚化合物、反义寡核苷酸、核酶、外部向导序列(EGS)寡核苷酸、交替剪接体、引物、探针和其它低聚化合物。同样地，可以将这些化合物以单链、双链、环状或发夹低聚化合物的形式引入，这些化合物可能包含结构部件，如内部或端部的凸起或环。另外，该化合物可能具有单链区域和双链区域。本发明化合物一旦引入系统，就引发一种或多种酶或结构蛋白的反应，以影响靶核酸的修饰。
所述酶的限制性实例是RNA酶H，一种切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。本领域技术人员知道“DNA样”的单链反义化合物引发RNA酶H。因此，激活RNA酶H导致RNA靶的切割，从而大大增加寡核苷酸介导的基因表达抑制的效率。其它核糖核酸酶如RNA酶III和核糖核酸酶L家族也有类似的作用。依赖于2-5A的RNA酶是干扰素调节的在干扰素抗病毒和抗增殖作用中发挥作用的2-5A系统的一个组分。用干扰素处理细胞导致依赖于2-5A的RNA酶和一群从ATP产生5’-三磷酸化、2’、5’-寡腺苷化(2-5A)的合成酶的水平提高。2-5A系统在控制病毒和细胞生长方面的作用提示依赖于2-5A的RNA酶的基因缺陷可导致对病毒感染和癌症的免疫力降低。
虽然低聚化合物的一种形式是单链反义寡核苷酸，但是在很多物质中引入双链结构，如双链RNA(dsRNA)分子却显示能够有效和特异地诱导基因或其相关基因产物的功能反义介导地降低。此现象在植物和动物中均有发生，相信与病毒防御和转座子沉默有进化关联性。
动物中dsRNA可导致基因沉默的第一个证据来自1995年对线虫(秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)进行的工作(Guo和Kempheus，Cell，1995，81，611-620)。Montgomery等显示了dsRNA的主要干扰效果发生在转录后(Montgomery等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，15502-15507)。在秀丽新小杆线虫(Caenorhabditiselegans)中发现的转录后反义机制是由接触双链RNA(dsRNA)产生的，因此该机制被称为RNA干扰(RNAi)。该术语已被推广到意指反义介导的基因沉默，包括引入dsRNA导致内源性靶mRNA水平序列特异性降低(Fire等，Nature，1998，391，806-811)。最近显示，实际上dsRNA的反义极性的单链寡聚物才是有效的RNAi诱导物(Tijsterman等，Science，2002，295，694-697)。
虽然寡核苷酸是本发明化合物的合适形式，但是本发明也包括其它类型的化合物，包括但不限于寡核苷酸类似物和模拟物，如本文描述的那些。
本发明所述的化合物可包含约8至约80个核碱基(即约8至约80个连接的核苷)。本文使用的术语“约”指数值变动5％(如果核碱基是修饰的数目则约等于最接近的整数)。本领域普通技术人员能理解本发明具体可包含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核碱基长度的化合物。
在一个实施方式中，本发明化合物的长度为12至约50个核碱基。本领域普通技术人员能理解本发明具体可包含12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核碱基长度的化合物。
在另一实施方式中，本发明化合物的长度为15至约30个核碱基。本领域普通技术人员能理解本发明具体可包含15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核碱基长度的化合物。
在另一实施方式中，反义化合物的长度为8至约80个核碱基，包含选自示例性反义化合物的至少8个连续核碱基的臂。示例性反义化合物包括但不限于，至少包含来自说明性反义化合物的5′-末端的8个连续核碱基的寡核苷酸序列(剩下的核碱基是从反义化合物的5′-末端上游立即开始，继续到含约8至约80个核碱基的寡核苷酸为止的相同核苷酸连续臂，该反义化合物特异性与靶核酸特异性杂交)。类似地，至少包含来自说明性反义化合物的3′-末端的8个连续核碱基的寡核苷酸序列代表了合适的反义化合物(剩下的核碱基是从反义化合物的3′-末端下游立即开始，继续到含约8至约80个核碱基的寡核苷酸为止的相同核苷酸连续臂，该反义化合物特异性与靶核酸特异性杂交)。具备本文介绍的反义化合物知识的精通此领域的技术人员无需进行过多的试验就能确定更合适的反义化合物。
发明目的
在本发明内容中，将低聚化合物“靶向”具体核酸分子可以是多步的过程。该过程通常以鉴定需要调节其功能的靶核酸为开始。该靶核酸可以是，例如其表达与具体不适或病状相关的细胞基因(或从基因转录的mRNA)或来自感染物的核酸分子。本发明中，靶核酸编码SARS病毒。
靶向过程通常也包括在靶核酸内确定至少一个靶区域、片段或位点，以便发生反义相互作用产生所需的效果，例如调节表达。在本发明的内容内，术语“区”或“区域”定义为靶核酸的一部分，它至少具有一个可鉴定的结构、功能或特征在靶核酸区内就是片段。“片段”定义为靶核酸内区的小部分或亚部分。本发明使用的“位点”定义为靶核酸内的位置。
如本领域技术人员所知，因为翻译密码子一般是5’AUG(在转录的mRNA分子中；在相应的DNA分子中是5’ATG)，翻译起始密码子也称为“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。少数基因的起始密码子为RNA序列5’GUG、5’UUG或5’CUG；5’AUA、5’ACG和5’CUG在体内也起作用。因此，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可以包括很多密码子序列，即使各实例中起始氨基酸一般是甲硫氨酸(真核细胞)或甲酰甲硫氨酸(原核细胞)。本领域技术人员也知道真核细胞和原核细胞基因可能具有两个或更多的交替启动子，在具体细胞类型或组织中，或在具体条件情况下可用任意一个起始翻译。在本发明的内容中，“起始密码子”和“翻译起始密码子”指体内用于起始转录自SARS编码基因的mRNA的翻译的密码子，而不管该密码子的序列是什么。
本领域技术人员也知道基因的翻译终止密码子(或“终止密码子”)可具有下面三个序列之一，即5’UAA、5’UAG和5’UGA(对应的DNA序列分别是5’TAA、5’TAG和5’TGA)。
术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”指mRNA或基因上的一部分，该部分在自翻译起始密码子起的两个方向(即5’或3’)上包含约25至约50个相邻核苷酸。类似地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”指mRNA或基因上的一部分，该部分在自翻译终止密码子起的两个方向(即5’或3’)上包含约25至约50个相邻核苷酸。因此，“起始密码子区”(或“翻译起始密码子区”)和“终止密码子区”(或“翻译终止密码子区”)都是可用本发明低聚化合物有效靶向的区域。
本领域技术人员知道开放阅读框(ORF)或“编码区”指翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域，也是可有效靶向的区域。在本发明内容中，合适的区域是基因内区域，包含基因开放阅读框(ORF)的翻译起始或终止密码子。
其它靶区域包括但不限于5′非翻译区(5′UTR)，本领域技术人员知道它指mRNA在自翻译起始密码子起5′方向上的一部分，因此包括mRNA中5′帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸(或相应基因上的核苷酸)；和3′非翻译区(3′UTR)，本领域技术人员知道它指mRNA在自翻译终止密码子起3′方向上的一部分，因此包括mRNA中翻译终止密码子和3′末端之间的核苷酸(或相应基因上的核苷酸)。mRNA的5′帽位点包括通过5′-5′三磷酸连接到mRNA 5′最末端残基的N7-甲基化鸟苷酸残基。mRNA的5′帽区域被认为包括5′帽结构本身和与帽位点相邻的最初50个核苷酸。靶向5′帽区域也是合适的。
虽然一些真核mRNA转录子直接进行翻译，但很多包含一个或多个称为内含子的区域，这些区域在翻译前从转录子上切除。剩下的(因此是翻译的)区域称为“外显子”，将它们剪接在一起形成连续的mRNA序列。靶向剪接位点，即内含子-外显子连接处或外显子-内含子连接处也可具体用于疾病涉及异常剪接、或疾病涉及一具体剪接产物的产生过度的情况。由于重排或缺失引起的异常融合连接也是合适的靶位点。通过剪接来自不同基因源的两种(或更多种)mRNA的过程产生mRNA转录子称为“融合转录子”。也知道可用靶向如DNA或mRNA前体的低聚化合物有效靶向内含子。
本领域技术人员还知道可由DNA的相同基因组区产生交替RNA转录子。这些交替转录子通常称为“剪接变体”。更具体说，“mRNA前体剪接变体”是有相同基因组DNA产生的转录子，它在其启动或终止位置均不同于相同基因组DNA产生的其它转录子，且同时包含内含的和外显的序列。
在剪接中通过切除一个或多个外显子或内含子区或其部分，mRNA前体剪接变体产生较小的“mRNA剪接变体”。因此，mRNA剪接变体是处理后的mRNA剪接变体，各独特的mRNA前体剪接变体通过剪接产生独特的mRNA剪接变体。这些mRNA剪接变体也称为“交替剪接变体”。如果没有发生mRNA前体剪接变体的剪接，那么mRNA前体剪接变体与mRNA剪接变体则相同。
本领域技术人员也知道可通过用交替信号启动或停止转录来产生剪接变体，mRNA前体和可具有多于一个起始密码子或终止密码子。源自mRNA前体或mRNA、使用交替起始密码子的剪接变体称为该mRNA前体或mRNA的“交替启动剪接变体”。那些使用交替终止密码子的转录子称为该mRNA前体或mRNA的“交替停止剪接变体”。交替停止剪接变体的一个具体类型是“聚腺苷化剪接变体”，其中转录机器交替选择“聚腺苷化终止信号”之一，产生多个转录子，因此产生的转录子终止于独特的聚腺苷化位点。在本发明内容中，本文描述的剪接变体的类型也是合适的靶核酸。
低聚化合物杂交在靶核酸上的位置在下文中称为“合适的靶节段”。本文使用的术语“合适的靶节段”定义为靶向活性低聚化合物的靶区域的至少8个核碱基部分。虽然不希望受限于理论，但现在相信这些靶节段代表了靶核酸的部分，杂交可以达到这些部分。
虽然本文提出了具体合适的靶节段的特异性序列，但是本领域技术人员将认识到，这些是用作说明和描述本发明范围内的具体实施方式的。本领域普通技术人员可以用与本文揭示的方法学类型相同的方法鉴定其它合适的靶节段。
长度为8至约80个核碱基的靶区域或片段也被认为是适合于靶向的，该区域或片段包含选自示例性合适的靶节段或区域的8个连续核碱基的臂。
靶节段或区域可包含DNA或RNA序列，其至少包含来自说明性合适的靶节段或区域之一的5′-末端的8个连续核碱基(剩下的核碱基是从靶节段或区域的5′-末端上游立即开始，继续到含约8至约80个核碱基的DNA或RNA为止的相同DNA或RNA的连续臂)。类似地，至少包含来自说明性合适的靶节段或区域之一的3′-末端的8个连续核碱基的DNA或RNA序列代表了合适的靶节段或区域(剩下的核碱基是从靶节段或区域的3′-末端下游立即开始，继续到含约8至约80个核碱基的DNA或RNA为止的相同DNA或RNA的连续臂)。只要不进行不适当的实验，具备本文介绍的合适的靶节段或区域知识的本领域技术人员就能确定其它合适的靶节段或区域。
一旦鉴定了一个或多个靶区域、片段或位点，就选择与该靶足够互补，即以足够特异性与其足够好地杂交的低聚化合物，给出所需效果。
筛选和靶确认
在另外的实施方式中，本文所称的“合适的靶节段”或“合适的靶区域”可用于筛选其它调节SARS病毒表达的化合物。“调节剂”是那些降低或增加编码SARS病毒的核酸分子表达的化合物，它包含至少8个核碱基的与合适靶节段或区域互补的部分。在一个实施方式中，筛选方法包括将编码SARS病毒的核酸分子的合适靶节段与一种或多种候选调节剂接触，选择一种或多种能降低或升高编码SARS病毒的核酸分子表达的候选调节剂。一旦该候选调节剂或调节剂显示其能够调节(例如降低或升高)编码SARS病毒的核酸分子表达，那么该调节剂即可用于对SARS病毒功能的进一步研究，或依照本发明用作研究、诊断或治疗剂。
本发明中合适的靶节段或区域也可以与本发明中它们各自的互补低聚化合物结合形成稳定的双链寡核苷酸(双链体)。本领域中已知该双链寡核苷酸组分能调节靶表达并调节翻译，也通过反义机制调节RNA处理。而且，可对该双链部分进行化学修饰(Fire等，Nature，1998，391，806-811；Timmons和Fire，Nature，1998，395，854；Timmons等，Gene，2001，263，103-112；Tabara等，Science，1998，282，430-431；Montgomery等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，15502-15507；Tuschl等，GenesDev.，1999，13，3191-3197；Elbashir等，Nature，2001，411，494-498；Elbashir等，Genes Dev.2001，15，188-200)。例如，所述双链部分显示了通过双链体的反义链经典杂交到靶上抑制靶，因此诱发靶的酶降解(Tijsterman等，Science，2002，295，694-697)。
本发明的化合物也可以应用于药物发现和靶确认领域。本发明包含化合物和合适的靶节段或区域的用途，本文确定了在药物发现领域它可用于阐明存在于SARS病毒和病状、表型或状况之间的联系。这些方法包括但不限于，检测或调节SARS病毒，包括将样品、组织、细胞或有机体与本发明化合物接触，测量或检测SARS病毒的核酸或蛋白水平，和/或在治疗后某时间测量或检测相关表型的或化学的终点，并将测定值任选地与未处理样品或用本发明其它化合物处理的样品作比较。这些方法也可与其它实验平行或结合进行，以在靶确认中确定未知基因的功能，或在治疗或预防具体疾病、症状或表型中确定具体基因产物作为靶的有效性。
修饰
如本领域技术人员所知，核苷是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基。两类最通常的杂环碱基是嘌啉和嘧啶。核苷酸是再包含一个磷酸基团的核苷，该磷酸基团与核苷的糖部分共价连接。对于那些包含呋喃戊糖(pentofuranosyl sugar)的核苷来说，磷酸基团可以连接到糖的2′、3′或5′羟基部分上。在形成寡核苷酸的过程中，磷酸基团与相邻的核苷互相连接，形成线性聚合物。轮流地，该线性聚合物的各个末端可进一步连接形成环化物，然而通常，线性化合物是合适的。此外，线性化合物可能有内部核碱基互补，并因此可能以某种方式折叠，产生完全或部分双链的化合物。在寡核苷酸中，通常认为磷酸基团形成核苷酸的核苷间骨架。正常RNA和DNA的连接或骨架是3′-5′磷酸二酯连接。
修饰的核苷间连接(骨架)
用于本发明的合适低聚化合物的具体实例包括但不限于含修饰骨架或非天然核苷间连接的寡核苷酸。如本说明书所定义的，具有修饰骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的寡核苷酸和骨架中不含磷原子的寡核苷酸。为了本说明书的目的，以及有时在本领域中作为参考，核苷间骨架中不含磷原子的修饰寡核苷酸也可被认为是寡核苷。
在秀丽新小杆线虫(C.elegans)系统中，(硫代磷酸)核苷酸间连接不显著干扰RNAi的活性。该观察提示本发明的具体低聚化合物也可以有一个或多个修饰核苷间连接。合适的含磷修饰核苷间连接是硫代磷酸核苷间连接。
合适的包含磷原子的修饰寡核苷酸骨架包括，例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、包括3′-亚烷基膦酸酯、5′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯在内的甲基和其他烷基膦酸酯、亚膦酸酯、包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，它们具有正常3′-5′连接、2′-5′连接类似物以及极性反转的连接形式，即一种或多种核苷酸间连接是3′至3′、5′至5′或2′至2′连接。具有反转极性的合适寡核苷酸在3’-端核苷酸间连接上包含一个单独的3′至3′连接，即一个单独的反转核苷残基，它可能是基础(核碱基丢失或在被羟基替代)。也包括了各种盐(如钾盐和钠盐)、混合盐和游离的酸形式。
提供上述含磷连接的制备知识的代表性美国专利包括但不限于：3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321.131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,194,599、5,565,555、5,527,899、5,721,218、5,672,697和5,625,050，其中一些申请一般为本申请所有，这些申请被全文纳入本文作为参考。
在本发明的一些实施方式中，低聚化合物具有一种或多种硫代磷酸和/或杂原子的核苷间连接，尤其是-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(称为亚甲基(甲基亚氨)或MMI骨架)、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中，天然磷酸二酯核苷间连接用-O-P(＝O)(OH)-O-CH2-代表)。上面引用的美国专利5,489,677揭示了MMI类型的核苷间连接。上面引用的美国专利5,602,240揭示了合适的酰胺核苷间连接。上面引用的美国专利5,034,506揭示的具有吗啉代骨架结构的核苷酸也是合适的。
合适的不含磷原子的修饰的寡核苷酸骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间连接、混合的杂原子骨架和烷基或环烷基核苷间连接、或一种或多种短链杂原子或杂环核苷间连接形成的骨架。这些包括具有吗啉代连接(部分由核苷的糖部分形成)、硅氧烷骨架、氨基磺酸酯骨架、亚甲基氨基和亚甲基肼基骨架、磺酸酯和磺酰胺骨架、酰胺骨架和其它具有混合的N、O、S和CH2组成部分的核苷酸骨架。
提供上述寡核苷的制备知识的代表性美国专利包括但不限于：5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437、5,792,608、5,646,269和5,677,439，其中一些通常为本申请所有，这些申请都被完整纳入本文作为参考。
模拟物
另一群服从本发明的低聚化合物包括寡核苷酸模拟物。当术语“模拟物”应用于寡核苷酸时意思包含了仅有呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间连接都被全新基团取代的低聚化合物，本领域中也将仅呋喃糖环的取代称为糖代用品。为了与合适的靶核酸杂交，保留了杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分。一个所述的低聚化合物，即显示具有出色的杂交性能的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸(PNA)。在PNA低聚化合物中，用酰胺骨架，具体是氨乙基甘氨酸骨架代替了寡核苷酸的糖骨架。核碱基被保留，直接或间接与骨架酰胺部分的杂氮结合。提供PNA低聚化合物的制备知识的代表性美国专利包括但不限于：5,539,082、5,714,331和5,719,262，它们被全文纳入本文作为参考。PNA低聚化合物的其它知识可从Nielsen等，Science，1991,254，1497-1500中发现。
据报道，一个具有出色杂交性能的寡核苷酸模拟物是肽核酸(PNA)。PNA化合物的骨架是两种或更多种连接的氨乙基甘氨酸单位，它们赋予PNA酰胺骨架。杂环碱基部分直接或间接与骨架酰胺部分的杂氮结合。提供PNA化合物的制备知识的代表性美国专利包括但不限于：5,539,082、5,714,331和5,719,262，它们被全文纳入本文作为参考。PNA化合物的其它知识可从Nielsen等，Science，1991,254，1497-1500中发现。
自从首次制备PNA基本结构后，PNA已被修饰，掺入了许多修饰物。基本结构见下：
其中
Bx是杂环碱基部分；
T4是氢、氨基保护基、-C(O)R5、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10链烯基、取代或未取代的C2-C10炔基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、化学官能团、报道基团、共轭基团、通过α-羧基或当氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸或获自通过羧基连接的右旋、左旋或混旋氨基酸的肽时任选地通过ω-羧基连接的右旋或左旋α-氨基酸，其中的取代基选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苯甲基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、链烯基和炔基；
T5是-OH、-N(Z1)Z2、R5、通过α-氨基或当氨基酸是赖氨酸或鸟氨酸或获自通过氨基连接的右旋、左旋或混旋氨基酸的肽时任选地通过ω-氨基连接的右旋或左旋α-氨基酸、化学官能团、报道基团或共轭基团；
Z1是氢、C1-C6烷基或氨基保护基；
Z2是氢、C1-C6烷基、氨基保护基、-C(＝O)-(CH2)n-J-Z3、通过α-羧基或当氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸或获自通过羧基连接的左旋、右旋或混旋氨基酸的肽时任选地通过ω-羧基连接的右旋或左旋α-氨基酸；
Z3是氢、氨基保护基、-C1-C6烷基、-C(＝O)-CH3、苯甲基、苯甲酰基或-(CH2)n-N(H)Z1；
各J是O、S或NH；
R5是羰基保护基；和
n为2至约50。
研究的另一类寡核苷酸模拟物是基于连接的吗啉代单位(吗啉代核酸)，其吗啉环上附着了杂环碱基。已经报道了很多在吗啉代核酸中连接了吗啉代单体单位的连接基团。已经选择了一类连接基团以产生非离子低聚化合物。该非离子基于吗啉的低聚化合物更不可能与细胞蛋白发生不需要的相互作用。基于吗啉代的低聚化合物是非离子寡核苷酸模拟物，它更不可能与细胞蛋白形成不需要的相互作用(Dwaine A.Braasch和David R.Corey，Biochemistry，2002，41(14)，4503-4510)。1991年7月23日提交的美国专利5,034,506公开了基于吗啉代的低聚化合物。制备了吗啉代类的低聚化合物，它带有连接于单体亚单位的各种不同连接基团。
制备了吗啉代类的低聚化合物，它带有连接于单体亚单位的各种不同连接基团(L2)。它的基本式见下：
Figure A20048001141100261
其中
T1是羟基或保护羟基；
T5是氢或磷酸盐或磷酸盐衍生物；
L2是连接基团；和
n为2至约50。
另一类寡核苷酸模拟物是环己烯核酸(CeNA)。用环己烯环代替了通常存在于DNA/RNA分子中的呋喃糖环。已经制备了CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体，并用于经典亚磷酰胺化学之后合成低聚化合物。已经制备并研究了具有用CeNA修饰的特异性位置的完全修饰CeNA低聚化合物和寡核苷酸(参见Wang等，J.Am.Chem.Soc.，2000，122，8595-8602)。通常，CeNA单体掺入DNA链能增加DNA/RNA杂交子的稳定性。CeNA寡腺苷与RNA和DNA补体形成复合物，其稳定性与原始复合物类似。NMR和圆二色谱显示了对CeNA结构掺入天然核酸结构的研究，以进行容易的构象匹配。而且，在血清中将CeNA掺入靶向RNA的序列是稳定的，能够激活大肠杆菌RNA酶，导致靶RNA链被切割。
CeNA的通式见下：
Figure A20048001141100262
其中
各Bx是杂环碱基部分；
T1是羟基或保护羟基；和
T2是羟基或保护羟基。
可从一种或多种脱水己糖醇核苷制备另一类寡核苷酸模拟物(脱水己糖醇核酸)(参见，Wouters和Herdewijn，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1999，9，1563-1566)，通式见下：
其它修饰包括锁定核酸(LNAs)，其中2′-羟基与4′糖环的碳原子连接，因此形成2′-C、4′-C-氧亚甲基连接，因此形成双环糖部分。该连接可以是用亚甲基(-CH2-)n将2′氧原子和4′碳原子桥接，其中n是1或2(Singh等，Chem.Commun.，1998，4，455-456)。LNA和LNA类似物与DNA和RNA互补时显示了高双链体热稳定性(Tm＝+3至+10℃)，也显示了对于3′-核酸外切水解降解的稳定性和良好的溶解性。具有双环系统的LNA基本结构见下：
Figure A20048001141100272
通过2维NMR谱图确定的LNA构象显示了单链LNA形式和双链体形式中的LNA核苷酸的锁定方向，该构象以所述方式限制了磷酸骨架，以引入较高数量的N型构象(Petersen等，J.Mol.Recognit.，2000，13，44-53)。这些构象于改进的核碱基堆积有关(Wengel等，核苷Nucleotides，1999，18，1365-1370)。
已经显示LNA能形成极稳定的LNA:LNA双链体(Koshkin等，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，13252-13253)。LNA:LNA杂交是热稳定性最好的核酸型双链体系统，LNA的RNA-模拟特征在双链体水平得到确定。引入3LNA单体(T或A)显著提高DNA补体的解链点(Tm＝+15/+11)。形成极稳定的LNA:LNA双链体强调了LNA介导的杂交的通用性。单体的N-型构象限制和LNA:RNA双链体的二级结构反应了LNA的RNA-模拟情况。
LNA也与互补DNA、RNA或LNA以高热亲和度形成双链体。圆二色(CD)谱显示包含完全修饰LNA的双链体(尤其是LNA:RNA)结构上与A型RNA:RNA双链体类似。对LNA:DNA双链体的核磁共振(NMR)检查确证了LNA单体的3′-内构象。双链DNA的识别也证明了LNA的链侵入。错配序列的研究显示LNA遵守Watson-Crick碱基配对规则，与相应的非修饰参比链相比，其选择性有所提高。
全新类型的LNA-低聚化合物，以及LNA，广泛用于诊断和治疗应用中。其中有反义应用、PCR应用、链取代寡聚物、核酸聚合酶底物以及通常用于基于核苷酸的药物。
已经描述过含LNA的有效无毒的反义寡核苷酸(Wahlestedt等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，5633-5638)。作者已证明LNA将几种需要的特性赋予反义制剂。LNA/DNA共聚物在血清中和细胞提取物中不容易降解。LNA/DNA共聚物在与活大鼠大脑中G-蛋白偶联受体信号不同的试验系统中显示了有效的反义活性，并在大肠杆菌中检测报道基因。也完成了将LNA有效输送至存活的人乳腺癌细胞，该输送是脂质转染介导的。
已经描述了LNA单体腺嘌啉、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备，连同它们的寡聚化和核酸识别特性(Koshkin等，Tetrahedron，1998，54，3607-3630)。WO 98/39352和WO 99/14226也描述了LNA及其制备。
也制备了LNA的第一类似物，即硫代磷酸LNA和2′-硫代-LNA(Kumar等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998，8，2219-2222)。也描述了含有作为核酸聚合酶底物的寡脱氧核糖核苷酸双链体的锁定核苷类似物的制备(Wengel等，PCT国际申请WO 98-DK393 19980914)。另外，本领域也描述了2′-氨基-LNA，一种带有一个柄的构象受限的全新高亲和寡核苷酸类似物(Singh等，J.Org.Chem.，1998，63，10035-10039)。另外，已经制备了2′-氨基-和2′-甲氨基-LNA，之前也报道了它们与互补RNA和DNA链形成的双链体的热稳定性。
已经制备了其它寡核苷酸类似物，包含具有下式(显示亚酰胺单体)的双环和三环核苷类似物：
Figure A20048001141100281
(参见Steffens等，Helv.Chim.Acta，1997，80，2426-2439；Steffens等，J.Am.Chem.Soc.，1999，121，3249-3255；和Renneberg等，J.Am.Chem.Soc.，2002，124，5993-6002)。用亚磷酰胺方法使这些修饰核苷类似物寡聚化，形成的含有三环核苷类似物的低聚化合物在与DNA、RNA及其自身杂交时显示了提高的热稳定性(Tm′s)。含双环核苷类似物的低聚化合物显示其达到DNA双链体的热稳定性。
另一类寡核苷酸模拟物是将磷基团掺入骨架的磷酸单酯核酸。据报道，这类寡核苷酸模拟物在抑制基因表达领域具有有用的物理和生物和药理学特性(反义寡核苷酸、核酶、正义寡核苷酸和形成三连体的寡核苷酸)，作为探针检测核酸和作为分子生物学中使用的辅助剂
通式(Markush变量的定义参见：美国专利5,874,553和6,127,346，整体纳入本文作为参考)见下：
Figure A20048001141100291
已经报道了另一寡核苷酸模拟物，其中呋喃糖环被环丁基部分取代。
修饰的糖
本发明的低聚化合物也可包含一种或多种取代的糖部分。合适的低聚化合物包含选自：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-链烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基的糖取代基，其中烷基、链烯基和炔基可以是取代或未取代的C1-C10烷基或C2-C10链烯基和炔基。具体说，合适的是O((CH2)nO)mCH3、0(CH2)nOCH3、0(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、0(CH2)nONH2和O(CH2)nON((CH2)nCH3)2，其中n和m为1至约10。其它合适的寡核苷酸包括选自：C2-C10低级烷基、取代的低级烷基、链烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、氧-烷芳基或氧-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ON02、N02、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷基氨基、取代甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于提高寡核苷酸药代动力学性能的基团或用于提高寡核苷酸药效学性能的基团，和其它具有类似性质的取代基的糖取代基。合适的修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH20CH3，也称为′-O-(2-甲氧乙基)或2′-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta，1995、78、486-504)，即烷氧基烷氧基基团。其它合适的修饰包括2′-二甲基氨氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2′-DMAOE，如下面实施例的描述，2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本领域中也称为2′-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2′-DMAEOE)，即2′-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。
其它合适的糖取代基包括甲氧基(-O-CH3)、氨丙基(-OCH2CH2CH2NH2)、烯丙基(-CH2-CH＝CH2)、-O-烯丙基(-O-CH2-CH＝CH2)和氟(F)。2′-糖取代基可以在阿拉伯糖基(上)位置或核糖基(下)位置。合适的2′-阿拉伯糖基修饰是2′-氟。也可在低聚化合物的其它位置进行类似的修饰，具体说，是3′末端核苷上或2′-5′连接寡核苷酸中糖的3′位置或和5′末端核苷酸的5′位置。低聚化合物也可具有糖模拟物，如代替戊呋喃糖的环丁基部分。提供了所述修饰糖结构的知识的代表性美国专利包括但不限于：4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519.134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633、5,792,747和5,700,920，其中一些一般为本申请所有，它们都被全文纳入本文作为参考。其它的代表性糖取代基包括式Ia或IIa的基团：
Figure A20048001141100301
其中：
Rb是0、S或NH；
Rd是单键、O、S或C(＝O)；
Re是C1-C10烷基、N(Rk)(Rm)、N(Rk)(Rn)、N＝C(Rp)(Rq)N＝C(Rp)(Rr)或具有式IIIa；
Figure A20048001141100302
Rp和Rq各自独立为氢或C1-C10烷基；
Rr是-Rx-Ry；
Rs、Rt、Ru和Rv各自独立地是氢、C(O)Rw、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10链烯基、取代或未取代的C2-C10炔基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、化学官能团或共轭基团，其中取代基选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苯甲基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、链烯基和炔基；
或任选地，Ru和Rv与它们所结合氮原子一起形成苯二甲酰亚氨基部分；
各Rw独立地是取代或未取代的C1-C10烷基、三氟甲基、氰乙基氧基、甲氧基、乙氧基、叔丁基、烯丙氧基、9-芴基甲氧基、2-(三甲基甲硅烷基)-乙氧基、2，2，2-三氯乙氧基、苄氧基、丁酰基、异丁酰基、苯基或芳基；
Rk是氢、氮保护基或-Rx-Ry；
Rp是氢、氮保护基或-Rx-Ry；
Rx是键或连接部分；
Ry是化学官能团、共轭基团或固体支持介质；
各Rm和Rn独立地是H、氮保护基，取代或未取代的C1-C10烷基，取代或未取代的C2-C10链烯基、取代或未取代的C2-C10炔基，其中取代基选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苯甲基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、链烯基、炔基；NH3 +、N(Ru)(Rv)、胍基和酰基，其中所述酰基是酰胺或至酯；
或Rm和Rn都是氮保护基，加入了环结构或者是化学官能团，该环结构任选地包含选自N和O的附加杂原子；
Ri是ORz、SRz或N(Rz)2；
各Rz独立地是H、C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C(＝NH)N(H)Ru、C(＝O)N(H)Ru或OC(＝O)N(H)Ru；
Rf、Rg和Rh是具有约4至约7个碳原子或具有约3至约6个碳原子和1或2个杂原子的环系统，其中所属杂原子选资氧、氮和硫，其中所属环系统是脂肪环、不饱和脂肪环、芳环或饱和或不饱和杂环；
Rj是具有1至约10个碳原子的烷基或卤代烷基、具有2至约10个碳原子的链烯基、具有2至约10个碳原子的炔基、具有6至约14个碳原子的芳基、N(Rk)(Rm)ORk、卤素、SRk或CN；
ma是1-10；
各mb独立地是0或1；
mc是0或1至10的整数；
md是1至10的整数；
me是0、1或2；和
条件是当mc是0时，md是大于1。
1998年8月7日提交的题为“加帽的2’-氧乙氧基寡核苷酸”的美国专利申请09/130,973中揭示了式I所示的代表性取代基，该申请被全文纳入本文作为参考。
1998年7月27日提交的题为“靶向RNA的组织构象前的2’-低聚化合物”的美国专利申请09/123,108中揭示了代表性环状取代基式II，该申请被全文纳入本文作为参考。
合适的糖取代基包括O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)CH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON((CH2)nH3))2，其中n和m为1至约10。
1999年7月7日提交的题为“功能化的寡聚物”(Functionalized Oligomers)的共有美国专利申请09/349,040中揭示了式III和IV中显示的代表性胍取代基，该申请被全文纳入本文作为参考。
美国专利6,147,200中揭示了代表性乙酰胺取代基，该申请被全文纳入本文作为参考。
1999年8月6日提交的题为“2’-O-二甲基氨乙基氧乙基-低聚化合物”(2’-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-Oligomeric comounds)的国际专利申请PCT/US99/17895中揭示了代表性的二甲基氨基乙氧基乙基取代基，该申请被全文纳入本文作为参考。
天然核碱基和修饰的核碱基
寡核苷酸也可包含核碱基(本领域中经常简单地称之为“碱基”)的修饰或取代。本文使用的“未修饰”或“天然”碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰核碱基包括其他合成和天然核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代具体是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-氟-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂尿嘧啶和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮尿嘧啶和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮尿嘧啶和3-脱氮腺嘌呤。其他的修饰核碱基包括三环嘧啶，如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶基(5，4-b)(1，4)苯并噁嗪基-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶基(5，4-b)(1，4)苯并噻嗪基-2(3H)-酮)、G-封条(G-clamp)如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶基(5，4-b)(1，4)苯并噁嗪基-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶基(4，5-b)吲哚基-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并(3′，2′：4，5)吡咯并(2，3-d)嘧啶基-2-酮)。
杂环碱基部分也可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环，如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基嘧啶和2-吡啶酮取代的那些碱基。其他核碱基包括美国专利3,687,808中揭示的碱基；《高分子科学和工程的简明百科全书》(The ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering)，第858-859页，Kroschwitz，J.I.编，John Wiley&Sons，1990中揭示的碱基；Englisch等，《应用化学》(AngewandteChemie)，国际版，1991，30，613中揭示的碱基；Sanghvi，Y.S.，第15章，《反义研究和应用》(Antisense Research and Application)，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，CRC出版社，1993中揭示的碱基。这些碱基中某些是具体用于增加本发明低聚化合物的结合亲和力的。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已经显示，其核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi等编，《反义研究和应用》，CRC出版社，Boca Raton，1993，第276-278页)，现在是合适的碱基取代，更具体说是在与2′-O-甲氧基乙基糖修饰结合时是合适的碱基取代。
提供了某些上述修饰核碱基与其他修饰核碱基的制备知识的代表性美国专利包括但不限于，上述美国专利3,687,808，以及：4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121,5,596,091、5,614,617、5,645,985、5,830,653、5,763,588、6,005,096和5,681,941，其中一些一般为本申请所有，它们被全文纳入本文作为参考，也将一般为本申请所有的美国专利5,750,692全文纳入本文作为参考。
在本发明的一个方面，将低聚化合物制备成以聚环杂环化合物替代一种或多种杂环碱基部分的化合物。之前已经报道了很多三环杂环化合物。这些化合物通常用于反义应用，以增加修饰链与靶链的结合性能。研究得最多的修饰是靶向鸟嘌呤的，因此将它们称为G-封条或胞苷类似物。很多这些聚环杂环化合物具有通式：
Figure A20048001141100331
在第二条链上与鸟苷产生3个氢键的代表性胞苷包括1，3-二氮杂吩噁嗪-2-酮(R10＝O，R11-R14＝H)(Kurchavov，等，《核苷和核苷酸》(Nucleosides and Nucleotides)，1997，16，1837-1846)，1，3-二氮杂吩噻嗪-2-酮(R10＝S，R11-R14＝H)，(Lin等，J.Am.Chem.Soc.1995,117，3873-3874)和6，7，8，9-四氟-1，3-二氮杂吩噁嗪-2-酮(R10＝O，R11-R14＝F)(Wang等，Tetrahedron Lett.1998，39，8385-8388)。掺入寡核苷酸的这些碱基修饰显示能与互补鸟嘌呤杂交，后者显示能与腺嘌啉杂交，通过延伸堆积相互作用增强螺旋热稳定性(也可参见2002年5月24日提交的题为“修饰的肽核酸”(Modified Peptide Nucleic Acids)的美国专利申请10/155,920；和2002年5月24日提交的题为“抗核酸酶的嵌合寡核苷酸”(Nuclease Resistant Chimeric Oligonucleotides)的美国专利申请10/013,295，二者一般为本申请所有，皆被全文纳入本文作为参考)。
当胞嘧啶类似物/替代物具有附着在刚性1，3-二氮杂吩噁嗪-2-酮结构(R10＝O，R11＝-0-(CH2)2-NH2，R12-14＝H)上的氨基乙氧基部分时，还观察到螺旋稳定性能(Lin等，M.J.Am.Chem.Soc.，1998,120，8531-8532)。结合研究证明单个掺入可增加模式寡核苷酸与其互补靶DNA或RNA的结合亲和力，相对5-甲基胞嘧啶(dC5me)ΔTm高达18°，这对于单个修饰是已知最高的亲和度增加。另一方面，螺旋稳定性的获得并不牺牲寡核苷酸的特异性。Tm数据说明，与dC5me相比，完全配对和错配序列之间的差异甚至更大。这提示，系留的氨基作为附加氢键供体，与互补鸟嘌呤的Hoogsteen面，称为06作用，从而形成4个氢键。这意味着延伸碱基堆积的组合和附加特异性氢键结合介导了增加G-封条的亲和力。
2000年5月22日批准的美国专利6,028,183和1999年12月28日批准的，美国专利服6,007,992中揭示了服从本发明的另一三环杂环化合物及其使用方法。两者的内容一般为本申请所指派，皆被全文纳入本文作为参考。
吩噁嗪衍生物增加的亲和力与其未降低的序列特异性使它们成为在开发基于反义的更强效药物中有价值的核碱基类似物。实际上，已经从体外实验中获得了有希望的数据，证明含吩噁嗪取代的七核苷酸能够激活RNA酶H，增强细胞摄取并显示出增强的反义活性(Lin等，J.Am.Chem.Soc.1998，120，8531-8532)。在G-封条的情况下，活性增加甚至更加明显，因为单取代就显著提高了20mer 2′-脱氧硫代磷酸核苷酸的体外能力(Flanagan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，96，3513-3518)。然而，为了优化寡核苷酸设计并更好地理解这些杂环修饰对生物活性的影响，评价寡聚物对核酸酶稳定性的影响是十分重要的。
其它用作杂环碱基的修饰聚环杂环化合物揭示于但不限于上述的美国专利3,687,808，以及：4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,434,257、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121，5,596,091、5,614,617、5,645,985、5,646,269、5,750,692、5,830,653、5,763,588、6,005,096和5,681,941，以及2001年9月28日提交的美国专利申请09/996,292，其中一些一般为本申请所有，它们都被全文纳入本文作为参考。
共轭物
本发明寡核苷酸的另一种修饰是化学连接到寡核苷酸的一个或多个部分或共轭物，增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。这些部分或共轭物可包括共价结合到官能团，如第一或第二羟基的共轭基团。本发明的共轭基团包括但不限于嵌入剂、报道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增加寡聚物药效学性能的基团和增加寡聚物药代动力学性能的基团。典型的共轭基团包括但不限于胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。本发明内容中增加药效学性能的基团包括增加摄取、增加降解抗性和/或增强于靶核酸的序列特异性杂交的基团。本发明内容中增加药代动力学性能的基团包括增加本发明化合物的摄取、分布、代谢或排泄的基团。1992年10月23日提交的国际专利申请PCT/US92/09196和美国专利6,287,860中揭示了代表性的共轭基团，它们被全文纳入本文作为参考。
共轭部分包括但不限于脂质部分，如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)、胆酸(Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let.，1994，4，1053-1060)、硫醚如己基-硫-三苯甲基硫(Manoharan等，Ann.N.Y AcadSci.，1992，660，306-309；Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765-2770)、硫胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538)，脂肪链，如十二烷基(dodecandiol)或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO，1991，10，1111-1118；Kabanov等，FEBS Lett.，1990，259，327-330；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75，49-54)，磷脂，如二-十六烷基-射碳-甘油或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-射碳-甘油-3-氢-膦酸酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea等，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783)，聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides，1995，14，969-973)或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta.，1995，1264，229-237)或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分(Crooke等，J Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923-937)。
本发明的低聚化合物也可与活性药物，例如阿司匹林、苯基丁氮酮、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹磺酰肌氨酸、2，3，5-三碘苯甲酸、氟灭酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂、吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸盐、先锋霉素、磺胺药、抗糖尿病、抗菌药或抗生素共轭。
美国专利申请09/334,130(1999年6月15日提交)中描述了寡核苷酸-药物共轭物及其制备，该申请被全文纳入本文作为参考。
提供所述寡核苷酸共轭物的制备知识的代表性美国专利包括但不限于：4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717，5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241，5,391,723、5,416,203，5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928和5,688,941，其中某些一般为本申请所有，纳入本文作为参考。
嵌合化合物
不必对给定化合物的所有位置进行统一地修饰，实际上，可将多于一个的前述修饰掺入单个化合物，甚至是低聚化合物的单个核苷中。
本发明也包括是嵌合化合物的低聚化合物。本发明内容中的“嵌合”低聚化合物或“嵌合物”是低聚化合物，具体是含有两个或更多不同化学区域的反义寡核苷酸，各由至少一个单体单位组成，如果是核苷酸化合物时即核苷。这些寡核苷酸一般包含至少一个区域，其中寡核苷酸被修饰，以使寡核苷酸对核酸酶降解的抗性增加，并赋予靶核酸增加的细胞摄取、增加的稳定性和/或增加的结合亲和力。寡核苷酸的另外一个区域可作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交子的酶的底物。例如，RNA酶H是切割RNA:DNA双链体RNA链的细胞核酸内切酶。因此，RNA酶H的激活导致RNA靶的切割，从而大大增强寡核苷酸-介导的基因表达抑制的效率。RNA:RNA杂交子的切割可以类似的方式，通过核糖核酸内切酶，如切割细胞和病毒RNA的RNA酶L的作用来完成。可用凝胶电泳常规地检测RNA靶的切割，如果需要的话，与本领域已知的核酸杂交技术联用。
本发明的嵌合低聚化合物可形成上述两种或更多种寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的组合结构。本领域中，也将所述化合物称为杂交子或gapmer。提供所述杂交子结构的制备知识的代表性美国专利包括但不限于：5,013,830、5,149,797、5,220,007、5,256,775、5,366,878、5,403,711、5,491,133、5,565,350、5,623,065、5,652,355、5,652,356和5,700,922，其中一些一般为本申请所有，被全文纳入本文作为参考。
3′-内修饰
在本发明的一个方面，低聚化合物包括合成修饰以诱导3′-内糖构象的核苷。核苷可掺入杂环碱基、糖部分或两者的合成修饰以诱导所需的3′-内糖构象。用这些修饰的核苷模拟RNA样核苷，以便在维持所需的3′-内构象几何学时，可以增加低聚化合物合成的具体性能。明显优选RNA型双链体(A型螺旋，主要是3′-内)作为RNA干扰的要求(如引发)，这由下述事实部分支持：由2′-脱氧-2′-氟-核苷组成的双链体在秀丽新小杆线虫(C.elegans)系统中有效地引发了RNAi反应。用更多稳定的3′-内核苷增强的性能包括但不限于通过调节蛋白结合、蛋白分离速率、吸收和清除来调节药代动力学特性；调节核酸酶稳定性以及化学稳定性；调节寡聚物的结合亲和力和特异性(酶和互补序列的亲和力和特异性)；和增加RNA切割的效率。本发明提供了RNAi的寡聚引发剂，它具有一种或多种以满足C3′-内型构象的方式修饰的核苷。
                        方案1
Figure A20048001141100371
     C2′-内/南                       C3′-内/北
各种因素，包括戊呋喃糖的2′、3′或4′-位取代都会影响核苷构象。带负电的取代基通常优选轴向位置，而要求位阻的取代基通常优选赤道位置(《核酸结构原理》(Principles of Nucleic Acid Structure)，Wolfgang Sanger，1984，Springer-Verlag)。在将2′-OH维持为识别元件时，可以获得2′位置的修饰，以满足3′-内构象的要求(Gallo等，Tetrahedron，2001，57，5707-5713；Harry-O′kuru等，J.Org.Chem.，1997，62(6)，1754-1759；和Tang等，J.Org.Chem.，1999，64，747-754)。此外，可以通过剪除2′-OH，例如2′脱氧-2′氟-核苷获得优选的3′-内构象(Kawasaki等，J.Med.Chem.，1993，36，831-841)，它采用3′-内构象在轴相位置上放置了带负电的氟原子。核糖环的其它修饰，如4′-位取代产生的4′-氟修饰的核苷(Guillerm等，Bioorganic and MedicinalChemistry Letters，1995，5，1455-1460和Owen等，J.Org.Chem.，1976，41，3010-3017)，或例如修饰以产生甲烷碳酸(methanocarba)核苷类似物(Jacobson等，J.Med.Chem.Lett.，2000，43，2196-2203，和Lee等，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，2001，11，1333-1337)也优选诱导3′-内构象。沿类似路线，RNAi的寡聚物引发剂反应可能由一种或多种以构象锁定成C3′-内型构象的方式修饰的核苷，即锁定核酸(LNA，Singh等，Chem.Commun.，1998，4，455-456)和乙烯基桥接的核酸(ENA，Morita等，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2002，12，73-76)组成。表1中显示了服从本发明的修饰核苷的实例。这些实例是代表性的，而不是全部。
                       表1
Figure A20048001141100381
修饰核苷及其寡聚物的合适构象可通过各种方法，如分子动力学计算、核磁共振谱和CD测量来估计。因此，选择在寡聚物范围中预测诱导RNA样构象、A-型双链体几何的修饰用于本发明的修饰核苷酸。本领域中已经了解了服从本发明的许多修饰核苷的合成(例如参见《核苷和核苷酸化学》(Chemistry of Nucleosides andNucleotides)，第1-3卷，主编：Leroy B.Townsend，1988，Plenum出版社，实例部分见下)。
在一个方面，本发明是制备的与原始RNA相比对核酸靶具有增强性能的寡核苷酸。确定靶，选择具有有效长度和与部分靶序列互补的序列的寡核苷酸。仔细检查选择序列各核苷的可能的增强修饰。合适的修饰是用具有相同3′-内构象几何的核苷替代一种或多种RNA核苷。相对于原始RNA，所述修饰可以增强化学和核酸酶稳定性，但同时合成和/或掺入寡核苷酸更为廉价和容易。选择序列可被进一步分区，用各区核苷评价可以是嵌合构型结果的增强修饰。关于5′和3′-末端，认为经常有有利修饰，可被制成一种或多种末端核苷。本发明的低聚化合物在单链上或在双链序列的至少一个5′-位置或序列上包括至少一种5′-修饰的磷酸基。也考虑到了其它修饰，例如核苷间连接、共轭基团、取代的糖或碱基、用核苷模拟物取代一种或多种核苷和任何其它可增强选择序列的目的特性的修饰。
用于描述同质双链核酸的构象几何的术语对于RNA是“A型”，对于DNA是“B型”。通过X射线衍射分析核酸纤维确定了RNA和DNA双链体代表性构象几何(Arnott和Hukins，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1970，47，1504)。通常，RNA:RNA双链体更稳定，具有比DNA:DNA双链体的解链温度(Tm)更高(Sanger等，《核酸结构原理》，1984，Springer-Verlag；纽约，纽约州；Lesnik等，Biochemistry，1995，34，10807-10815；Conte等，NucleicAcidsRes.，1997，25，2627-2634)。RNA增加的稳定性归因于几个结构特征，最显著的是A型几何引起碱基堆积相互作用的改进(Searle等，Nucleic Acids Res.，1993，21，2051-2056)。RNA中2′羟基的存在使糖向C3′内折叠，即也称为北方折叠方向偏移，这引起双链体偏向A-型几何。此外，RNA的2′羟基可形成水介导的氢键网络，帮助稳定RNA双链体(Egli等，Biochemistry，1996，35，8489-8494)。另一方面，脱氧核酸优选C2′内糖折叠，即也称为南方折叠，它被认为参与形成了更不稳定的B-型几何(Sanger，W.(1984)《核酸结构原理》，Springer-Verlag，纽约，NY)。本文使用的B-型几何包含C2′-内折叠和04′-内折叠。这与Berger，等，Nucleic Acids Research，1998，26，2473-2480一致，它指出在考虑产生B-型双链体的呋喃糖构象时，也应考虑O4′-内折叠的贡献。
然而，DNA:RNA杂交双链体比纯RNA:RNA双链体不稳定，相对于DNA:DNA双链体的稳定性是高是低还取决于它们的序列(Searle等，NucleicAcids Res.，1993，21，2051-2056)。杂交双链体的结构是介于A-和B-型几何之间，这可导致差的堆积相互作用(Lane等，Eur.J.Biochem.，1993，215，297-306，Fedoroff等，J.Mol.Biol.，1993，233，509-523；Gonzalez等，Biochemistry，1995，34，4969-4982；Horton等，J.Mol.Biol.，1996，264，521-533)。形成于靶RNA和合成序列之间的双链体稳定性对于治疗，如但不限于反义和RNA干扰来说至关重要，因为这些机制需要合成的寡核苷酸链与RNA靶链结合。在反义情况下，对mRNA的有效抑制需要反义DNA与mRNA有很高的结合亲和力。否则将很少发生合成的寡核苷酸链与靶mRNA链之间的相互作用，导致效率降低。
我们通常使用的糖折叠修饰方法是在2′-位用影响糖几何形状的取代基取代糖。对环构象的影响取决于2′-位上取代基的性质。已经研究了很多不同取代基，确定其折叠效果。例如，对2′-卤素的研究显示2′-氟衍生物在C3′-内型中数量最多(65％)，2′-碘数量最少(7％)。腺苷(2′-OH)与脱氧腺苷(2′-H)的数量分别是36％和19％。而且，腺苷二聚物(2′-脱氧-2′-氟腺苷-2′-脱氧-2′-氟-腺苷)中2′-氟基的效果进一步与堆积构象的稳定性相关。
正如期望的那样，用2′-氟基代替2′-OH基可以增强相关双链体稳定性，因此增加C3′-内数量。据推断，2′-氟键的高极性性质和极优选的C3′-内折叠可在A型双链体中稳定堆积构象。获自紫外减色现象、圆二色和1H NMR的数据也说明随着卤素取代基的电负性降低，堆积度降低。而且，糖部分的2’-位上的位阻块在A-型双链体中比B-型双链体中适应地更好。因此认为，二核苷单磷酸的3′-末端上的2′-取代基对堆积构象施加了很多影响：位阻排斥、呋喃糖折叠优选、静电排斥、疏水吸引和氢键合能力。认为取代基的分子大小、电负性和疏水性决定了这些取代基的影响。互补链与2′-取代腺苷二磷酸的解链温度也增加了。还不清楚是构象的3′-内优选还是取代基的存在造成结合增加。然而，用3′-内构象可以获得相邻碱基的更多重叠。
一个合成的将增加的核酸酶抗性和很高的结合亲和力赋予核苷酸的2′-修饰是2-甲氧基乙氧基(2′-MOE，2′-OCH2CH2OCH3)侧链(Baker等，J.Biol.Chem.，1997，272，11944-12000)。2′-MOE取代的直接优点之一是结合亲和力的提高，这比很多类似的2′修饰如氧-甲基、氧-丙基和氧-氨丙基都高。具有2′-O-甲氧基以及取代基的寡核苷酸也是基因表达的反义抑制剂，具有很有希望的体内使用特征(Martin，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504；Altmann等，Chimia，1996，50，168-176；Altmann等，Biochem.Soc.Trans.，1996，24，630-637；和Altmann等，核苷核苷酸，1997，16，917-926)。相对于DNA，具有2′-MOE修饰的寡核苷酸显示了提高的RNA亲和力和更高的核酸酶抗性。在翼状核苷和脱氧硫代磷酸核苷酸(也称为缺口寡核苷酸或gapmer)的内部区域具有2′-MOE取代的嵌合寡核苷酸在低剂量动物模型中减慢了肿瘤生长。2′-MOE取代的寡核苷酸已经在几个病状中显示了作为反义物质的出色效果。现在，一种所述的MOE取代的寡核苷酸已经进入临床试验研究，用于治疗CMV视网膜炎。
除非本文特别限定，烷基指C1-C12、C1-C8或C1-C6的直链或(在可能处)支链脂肪烃基。
除非本文特别限定，烷基指C1-C12、C1-C8或C1-C6的直链或(在可能处)支链脂肪烃基，它的链，包括链的末端部分中含有至少一个或约1至约3个杂原子。合适的杂原子包括N、O和S。
除非本文特别限定，环烷基指C3-C12、C3-Cg或C3-C6的脂肪烃基环
除非本文特别限定，链烯基指C2-C12、C3-C8或C2-C6的链烯基，它可以是至少含有一个碳-碳双键的直链或(在可能处)支链烃基部分。
除非本文特别限定，炔基指C2-C12，C2-C8或C2-C6的炔基，它可以是至少含有一个碳-碳三键的直链或(在可能处)支链烃基部分。
除非本文特别限定，杂环烷基指含有至少三个环成员的环部分，其中至少一个环是碳环，环成员1、2或3中至少一个不是碳环。碳原子的数目可从1变化到约12或从1变化到约6，环成员的总数可从3变化到约15或从约3变化到约8。合适的环杂原子是N、O和S。合适的杂环烷基包括吗啉代、硫代吗啉代、哌啶基、哌嗪基、高哌啶基、高哌嗪基、高吗啉代、高硫代吗啉代、吡咯烷基(pyrrolodinyl)、四氢噁唑基、四氢咪唑基、四氢噻唑基、四氢异噁唑基、四氢吡唑基(tetrahydropyrrazolyl)、呋喃基、吡喃基和四羟基异噻唑基。
除非本文特别限定，芳基指任何含有至少一个芳环的烃环结构合适的芳环具有约6至约20个环碳。合适的芳环也包括苯基、萘基、蒽基和菲基。
除非本文特别限定，杂芳基指含有至少一个完全不饱和环的环部分，该环由碳和非碳原子构成。该环系统包含约1至约4个环。碳原子的数目可以在1至约12或1至约6间变化，环成员总数可以从3至约15或从约3至约8之间变化。合适的环杂原子是N、O和S。合适的杂芳基部分包括吡唑基、苯硫基、吡啶基、咪唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、嘌呤基、喹唑啉基、喹喔啉基、苯并咪唑基、苯并苯硫基等。
除非本文特别限定，部分定义为化合物部分，如杂芳基烷基(杂芳基和烷基)、芳烷基(芳基和烷基)等，各亚部分也如此定义。
除非本文特别限定，拉电子基团是一个基团，如氰基或异氰酰基，它们从其附着的碳上将电子电荷拉开。其它记录的拉电子基团包括那些电负性超过碳的基团，例如卤素、硝基或用一个或多个氰基、异硫氰酰基或卤素基团邻位或对位取代的苯基。
除非本文特别限定，术语卤素具有其普通含义。合适的卤素取代基是Cl、Br和I。
除非本文特别限定，上述的任选取代基是取决于所需性质的合适取代基。包括卤素(Cl、Br、I)、烷基、链烯基和炔基部分、NO2、NH3(取代和未取代)、酸部分(如-CO2H、-OSO3H2等)。杂环烷基部分、杂芳基部分芳基部分等。
在所有前述式中，～指连到5′-磷酸的氧或硫原子的键。
磷酸保护基包括美国专利5,760,209、5,614,621、6,051,699、6,020,475、6,326,478、6,169,177、6,121,437和6,465,628中所描述的基团，它们被全文纳入本文作为参考。
剂型
本发明化合物可与其它分子、分子结构或者化合物混合物，如脂质体、靶向受体的分子，口服、直肠、局部或其他剂型混合、包入、共轭或者剂型结合，从而有助于摄取、分布和/或吸收。提供所述摄取、分布和/或吸收剂型的制备的代表性美国专利包括但不局限于美国专利5,108,921、5,354,844、5,416,016、5,459,127、5,521,291、5,543,158、5,547,932、5,583,020、5,591,721、4,426,330、4,534,899、5,013,556、5,108,921、5,213,804、5,227,170、5,264,221、5,356,633、5,395,619、5,416,016、、5,417,978、5,462,854、5,469,854、5,512,295、5,527,528、5,534,259、5,543,152、5,556,948、5,580,575和5,595,756，它们被全文纳入本文作为参考。
本发明寡聚体化合物可包括任何药学上可接受的盐、酯、所述酯的盐或其他任何在用于动物，包括人时，能够提供(直接或间接)其生物活性代谢物或残留物的化合物。因此，例如，也公开了前药和本发明化合物的药学上可接受的盐，所述前药的药学上可接受的盐或其他生物等效物。
术语“前药”指一种治疗剂，以在体内或者细胞内通过内源性的酶或者其他化学物质和/或条件作用能够转化为活性形势(例如药物)的非活性形式制备。具体说，根据WO 93/24510、WO 94/26764和美国5,770,713所揭示的方法将本发明寡核苷酸的前药形式被制备成SATE((S乙酰基-2-乙硫基)磷酸酯)的衍生物。
术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物的生理学上或药学上可接受的盐：即，能保持母体化合物的所需生物活性而不引起其它不良毒性效应的盐。对于寡核苷酸，美国专利6,287,860进一步描述了药学上可接受的盐及其用途的合适实施例，该申请被全文纳入本文作为参考。
本发明也包括组合物和剂型，包括包括一种或多种本发明寡聚化合物的药学组合物和剂型。本发明的组合物也可以数种方式给药，这取决于局部或系统治疗的需要以及治疗部位。给药可以是局部的(包括眼部和经粘膜，包括阴道、直肠粘膜的输送)，经肺的，例如吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内，鼻内，表皮和真皮；口腔或胃肠道外给药。胃肠道外给药包括但限于，静脉内、动脉内、皮下、腹腔内或肌内注射或注入；或颅内，例如鞘内或心室内给药。具有至少一个2’-O-甲氧基乙基修饰的寡核苷酸被认为尤其适用于口服。用于局部给药的组合物和剂型包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳剂、凝胶剂，滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体，水相、粉末状或油状碱，增稠剂等可能是必需或所需的。有涂层的安全套、手套等也可能有用。
可根据制药工业中公知的常规技术制备可以单位剂型方便地存在的本发明剂型。这些技术包括将活性成分与药学载体或者赋形剂结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或精细研磨的固体载体或者两者均一、密切的结合，然后按需将产物成型来制备剂型。
本发明组合物可被制成很多可能剂型，例如但不局限于，片剂、囊剂、胶囊剂、糖浆、凝胶剂、栓剂和灌肠剂中的任意一种。本发明组合物也可被制成水相、非水相或混合介质的悬液。水相悬液还可包含增加悬液浊度的物质，包括，例如，羧甲基纤维素钠，山梨糖醇和/或葡聚糖。悬液亦可包含稳定剂。
本发明组合物可包括溶液、乳液、泡沫和脂质体包含剂型。本发明的组合物和剂型可包含一种或多种穿透增强剂、载体、赋形剂或其他活性或非活性成分。
乳剂一般是一种液体以通常超过0.1微米直径的液滴形式分布在另一种液体中的不均一体系。乳剂可包含除分散相外的附加组分和可以存在于水相、油相或本身作为单独相的溶液中的活性药物。微型乳剂也作为一种实施方式包括在本发明中。乳剂及其用途是本领域技术人员熟知的，并在美国专利6,287,860中作了进一步描述，该申请被全文纳入本文作为参考。
本发明的剂型可以包括脂质体剂型，本发明中使用的术语“脂质体”指由脂质排列于球形双分子层或双分子层的两性分子脂质所形成的囊泡。脂质体是单层或者多层囊泡，它具有由亲脂材料构成的膜和包含输送成分的水相内部。阳离子脂质体是带正电的脂质体，被认为能够与带负电的DNA相互作用形成稳定复合物。据信，相对于形成复合物，对pH敏感或带负电的脂质体更容易俘获DNA。阳离子和非阳离子脂质体均被用于向细胞输送DNA。
脂质体也包括“空间稳定”脂质体，本文使用的这个术语指含有一种或多种特殊脂质的脂质体，当该脂质掺入脂质体后，能够导致它比缺少此类特殊脂质的脂质体循环寿命更长。空间稳定脂质体的例子是脂质体中脂质体的部分囊泡形成脂质部分包含一种或多种糖脂或衍生自一种或多种亲水聚合物，如聚乙二醇(PEG)部分。美国专利6,287,860中进一步描述了脂质体及其用途，该申请被全文纳入本文作为参考。
本发明剂型和组合物也包括表面活性剂。本领域技术人员了解表面活性剂在药物产品、剂型以及在乳剂中的用途。美国专利6,287,860中进一步描述了表面活性剂及其用途，该申请被全文纳入本文作为参考。
在一个实施方式中，本发明使用各种穿透增强剂影响核酸，具体是寡核苷酸的有效输送。除了有助于非亲脂性药物跨膜扩散以外，穿透增强剂也增加亲脂性药物的穿透性。穿透增强剂可以归于下列五大类之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐类、螯合剂和非螯合非表面活性剂。美国专利6,287,860中进一步描述了穿透增强剂及其用途，该申请被全文纳入本文作为参考。
本领域技术人员将理解，可以根据所需用途，即给药途径常规地设计剂型。
局部给药的合适剂型包括本发明寡核苷酸与一种局部输送剂，如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的剂型，。合适的脂质和脂质体包括中性(如二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬酯酰磷脂酰胆碱)，电负性(如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，DMPG)，阳离子(如二油酰四甲基氨丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺，DOTMA)。
对于局部给药或其他给药方式，本发明寡核苷酸可被包入脂质体或可与脂质，尤其是阳离子脂质形成复合物。另外，寡核苷酸可与脂质，尤其是阳离子脂质形成复合物。美国专利6,287,860中进一步描述了合适的脂肪酸和酯、它们药学上可接受的盐及其用途，以整体纳入本文作为参考。1999年5月20日提交的美国专利申请09/315,298中进一步描述了局部剂型，以整体纳入本文作为参考。
用于口服的组合物和剂型包括：粉末或颗粒、微粒、纳米颗粒、水或非水相介质中的悬液或溶液、囊、胶囊、香囊、片剂或微型片剂。也可能需要增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂。合适的口服剂型是本发明寡核苷酸能够与一种或多种穿透增强剂、表面活性剂和螯合剂结合的剂型。合适的表面活性剂包括但不限于，脂肪酸和/或其酯或其盐，胆汁酸和/或其盐。美国专利6,287,860中进一步描述了合适的胆汁酸/盐和脂肪酸及其用途，该申请被全文纳入本文作为参考。穿透增强剂的组合也是合适的，比如，脂肪酸/盐与胆汁酸/盐组合。尤其合适的组合包括但不限于月桂酸盐、癸酸和UDCA。穿透增强剂还包括但不局限于聚氧乙烯-9-月桂酰醚和聚氧乙烯-20-十六烷基醚。
本发明寡核苷酸能够以粒状包括喷雾干燥颗粒或复合形成微粒或者纳米颗粒口服输送。美国专利6,287,860中进一步描述了寡核苷酸复合剂及其用途，该申请被全文纳入本文作为参考。美国申请09/108,673(1998年7月1日提交)、09/315,298(1999年5月20日提交)和2002年2月8日提交的10/071,822详细描述了寡核苷酸的口服剂型及其制备，该申请被全文纳入本文作为参考。
胃肠道外、胸腔内、心室内给药的组合物及剂型可包括无菌水溶液，其中也可含缓冲液、稀释剂和其他合适添加剂，例如但不局限于，穿透增强剂，载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的某些实施方式提供包含一种或多种寡聚化合物和一种或多种其他通过非反义机制作用的化疗剂的组合物。所述化疗剂的实例包括但不局限于，癌症化疗药物如柔红霉素、柔比霉素、更生霉素、阿霉素、表阿霉素、黄胆素、依索比星、争光霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、双-氯乙基亚硝基脲(bis-chloroethylnitrosurea)、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、光辉霉素、强的松、羟基黄体酮、睾酮、它莫西芬、达卡巴嗪、甲基苄肼、六甲密胺、五甲烯二胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲(methylcyclohexylnitrosurea)、氮芥、苯丙酸氮芥、环磷酰胺、6巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氮胞苷、羟基脲、脱氧助间型霉素、4-羟基过氧化环磷酰胺(peroxycyclophosphoramide)、5氟尿嘧啶(5-FU)、5-荧光脱氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙碱、紫杉酚、长春新碱、长春花碱、依托泊甙(VP-16)、三甲曲沙、依立替康、拓扑替康、吉西他滨、替尼泊苷、顺铂和乙烯雌酚(DES)。当与本发明化合物一起使用时，所述化疗剂可以单独使用(如5-氟尿嘧啶和寡核苷酸)、顺序使用(如5-氟尿嘧啶和寡核苷酸使用一段时间后使用MTX和寡核苷酸)或与一种或多种所述化疗试剂结合使用(例如5-氟尿嘧啶、MTX和寡核苷酸，或者5-氟尿嘧啶、放疗和寡核苷酸)。抗炎药物，包括但不局限于非甾体抗炎药和皮质激素；以及抗病毒药物，包括但不局限于三氮唑核苷，阿糖腺苷，无环鸟苷和更昔洛韦，亦可与本发明组合物组合使用。寡聚化合物和其他非反义药物也在本发明的范围之内。两种或更多种组合化合物可以一起或顺序使用。
在另一相关实施方式中，本发明组合物可包含靶向第一核酸的一种或多种寡聚化合物，具体是反义寡核苷酸，以及靶向第二核酸靶的一种或多种附加寡聚化合物。另外，本发明组合物可包含两种或更多种靶向相同核酸靶的不同区或片段的寡聚化合物。本领域技术人员已知许多寡聚化合物的实例。两种或多种组合化合物可以一起或顺序使用。
输递
在一些实施方式中，本发明涉及向肺部输递包含穿透增强剂、载体化合物和/或转染试剂的寡核苷酸治疗组合物的方法和组合物。国际公告WO 99/60166中公开了这些方法，该申请被全文纳入本文作为参考。
简要说，本发明化合物和方法使用了包含寡核苷酸治疗或诊断的颗粒。该颗粒可为固体或液体，可吸入的大小：也就是该颗粒足够小，以使其在吸入中能够穿过口腔、咽喉进入支气管及肺泡。通常，大小为5至20微米的颗粒可吸入并有望到达细支气管(Allen，Secundum Artem，第6卷，No.3，可从www.paddocklabs.com/secundum/secamdx.Html获得1998年5月8日升级的在线出版)。需要极大关注的是，防止产生不可吸入的尺寸，因为沉淀在喉部并被吞咽会减少到达肺的寡核苷酸量。可通过将寡核苷酸与合适的载体，如无菌无致热源的水或盐溶液混合制备寡核苷酸的液态药学组合物。也可任选包括其他的治疗化合物。
本发明也关注固体粒子组合物的用途。所述组合物可包含可吸入尺寸的寡核苷酸颗粒。所述颗粒可通过，例如，通过常规方法如用臼和杵研磨干寡核苷酸，然后将获得的粉末组合物通过一个400目的筛子以分离大颗粒和附聚物来制备。一种由活性核苷酸组成的固体颗粒可任选地包含促进气溶胶形成的分散剂，如乳糖。
根据本发明方法，雾化寡核苷酸组合物。可通过任意合适手段，如用喷雾器产生液体颗粒的雾化。参见，例如，美国专利4,501,729。喷雾器是一种商品化的设备，它通过将压缩气体，一般是空气或氧气加速通过狭窄的文氏管口的方法、或通过超声搅拌的方法，将溶液或者悬液转化成治疗上的气溶胶喷雾。合适的喷雾器包括Blairex出售的名为PARI LC PLUS、PARI DURA-NEB 2000、PARI-BABYSize、带有LC PLUS的PARI PRONEB压缩器、PARI WALKHALER压缩器/喷雾器系统、PARILC PLUS可重复使用的喷雾器和PARI LC Jet+喷雾器的品种。
在喷雾器中使用的示例性剂型包括：液体中的寡核苷酸，如洁净、无病原菌(pyragen)的水或盐溶液，其中寡核苷酸占剂型的百分数高达约40％ w/w。寡核苷酸可占少于20％ w/w。如果需要，可以向组合物中再加入其它添加剂，如防腐剂(如羧基苯甲酸甲酯)、抗氧化剂和调味剂。
也可用任何本领域技术人员已知的医用固体颗粒气雾发生器使包含寡核苷酸的固体颗粒气雾化。所述气雾发生器产生可吸入的颗粒，如上所述，并进一步产生每单位体积气雾剂的重现性测定剂量。合适的固体颗粒气雾发生器包括吹入器和测定剂量的吸入器。本领域中适用的测定剂量吸入器(与商标名称、制造商和它们用途的说明)和本发明有用的吸入器包括：
输送装置/商品名/生产商/说明
测定剂量吸入器(MDI)/Alupent/Boehringer Ingelheim/β-肾上腺素受体支气管扩张剂
测定剂量吸入器(MDI)/Atrovent/Boehringer Ingelheim/抗胆碱能支气管扩张剂
Aerobid/Aerobid-M/Forest/甾体抗炎
Beclovent/Beconase/Glaxo Wellcome/甾体抗炎
Flovent/Glaxo Wellcome/甾体抗炎
Ventolin/Glaxo Wellcome/β-肾上腺素受体支气管扩张剂
Proventil/Key Pharm./β-肾上腺素受体支气管扩张剂
Maxair/3M Pharm./β-肾上腺素受体支气管扩张剂
Azmacort/Rhone-Poulenc Rorer/甾体抗炎
Tilade/Rhone-Poulenc Rorer/抗炎(抑制炎症介质的释放)
Intal/Rhone-Poulenc Rorer/抑制肥大细胞脱粒(哮喘)
Vanceril/Schering/甾体抗炎
Tomalate/Dura Pharm./β-肾上腺素受体支气管扩张剂
喷雾液
Alupent/Bochringer Ingelheim/β-肾上腺素受体支气管扩张剂
Pulmozyme/Genetech/重组人脱氧核糖核酸I
Ventolin/Glaxo Wellcome/β-肾上腺素受体支气管扩张剂
Tomalate/Dura Pharm./β-肾上腺素受体支气管扩张剂
Intal/Rhone-Poulenc Rorer/抑制肥大细胞脱粒(哮喘)
吸入胶囊(粉末)
Ventolin/Glaxo Wellcome/(用于Rotohaler装置的Rotocaps)/β-肾上腺素受体支气管扩张
吸入粉末
Pulmicort/Astra USA/(Turbuhaler device)/甾体抗炎药
在一些实施方式中，以每分钟约10-150升、每分钟约30-150升或每分钟约60升的速率生产液体或固体气雾剂。
在一些实施方式中，制备了核酸治疗或诊断组合物，使核酸组合物气雾化，将气雾化的核酸组合物导入哺乳动物肺中，其中气雾化的核酸组合物包含至少一种核苷酸，所述核苷酸中至少一个核苷单位的糖部分不是2′-脱氧呋喃核糖糖部分，或者所述寡核苷酸中至少一种核苷酸间连接不是磷酸二酯或硫代磷酸连接。在一些实施方式中，所述寡核苷酸中至少一个核苷单位的糖部分不是2′-脱氧呋喃核糖糖部分。在一些实施方式中，该核苷单位是2′-O-取代的核苷单位。在一些实施方式中，所述2′-O-取代的核苷单位的2′-O-取代基是2′-O-烷氧基烷氧基取代基。在一些实施方式中，所述2′-氧-取代的核苷单位的2′-O-取代基是2′-O-二烷基氨氧基烷基取代基。在一些实施方式中，所述寡核苷酸内至少一种核苷间连接不是磷酸二酯或硫代磷酸连接。在一些实施方式中，所述寡核苷酸内至少一种核苷间连接是3′-亚甲基膦酸酯、不含磷的寡核苷酸连接、2’-5’连接或是3’-脱氧-3’-氨基磷酰胺连接。在一些实施方式中，所述药学组合物还包括一种或者多种药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述核酸治疗或诊断组合物在水相介质中。在一些实施方式中，所述核酸治疗或诊断组合物是无菌、无热原的水。在一些实施方式中，所述核酸治疗或诊断组合物是盐溶液。在一些实施方式中，所述核酸治疗或诊断组合物是粉末。在一些实施方式中，所述核酸治疗或诊断组合物包含多于一种寡核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸是反义寡核苷酸。在一些实施方式中，核酸治疗组合物是主要包含盐溶液中的的反义寡核苷酸的气雾化溶液。在一些实施方式中，对患有或者疑似患有用一种或多种核酸可治疗的疾病或不适的动物，向动物的肺部给予治疗有效量的气雾化核酸组合物，其中气雾化的核酸组合物包含至少一种寡核苷酸，所述寡核苷酸的至少一种核苷单位的糖部分不是2′-脱氧呋喃核糖糖部分，或者所述寡核苷酸内至少一种核酸间连接不是磷酸二酯或硫代磷酸连接。
本发明的化合物也可通过脉冲输送给药。“脉冲输送”指一种药物剂型，其输送第一个脉冲是与穿透增强剂结合的药物，第二个脉冲是穿透增强剂，以促进吸收第一个穿透增强剂脉冲释放时没有吸收的药物。
本发明的一个实施方式是能够增强肠道药物吸收的口服缓释剂型，包含含有药物和穿透增强剂的第一群载体颗粒，其中药物和穿透增强剂在肠内第一位置释放，和含有穿透增强剂和缓释包衣或基质的第二群载体颗粒，其中穿透增强剂在第一位置下游的肠内第二位置释放，从而在药物到达第二位置时使其吸收增强。此外，载体颗粒群中的穿透增强剂是不同的。
这种增强可以通过包入至少两群载体颗粒获得。第一群载体颗粒含有生物活性物质和穿透增强剂，第二群(任选地附加)载体微粒含有穿透增强剂和缓释包衣或基质。
一种应用于口服给药的药物“首过效应”由于胃酸和各种消化酶的作用而被降解。一种改进首过清除效应的方法是增大给药剂量，从而补偿由于首过效应而丢失的药物部分。虽然这容易通过静脉注射而达到，例如，简单地给予动物更多药物，但是其它因素也影响通过非胃肠道外途径给予的药物生物利用度。例如，药物在消化道或血液中可以发生酶降解或化学降解，和/或对各种粘膜可以是不渗透或半渗透的。
当通过直肠、阴道、鼻腔、肺部给予这些药学组合物时，预计这些药学组合物能够增强生物活性物质的吸收。也预计，生物活性物质的释放可在胃肠道中任意部位实现。
也可通过口腔给予本发明组合物和方法实现生物活性物质的生物利用度增加。术语“生物利用度”指，当使用非胃肠道外给药模式将药物引入动物时，所给药物的多少比例到达循环系统的度量。
穿透增强剂包括但不限于下述分子类型成员，例如表面活性剂、脂肪酸、胆汁酸盐、螯合剂和非螯合非表面活性分子(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems，1991，第92页)。载体是可包含于本发明组合物中，以干扰导致生物可利用药物水平降低的过程的惰性分子。
剂量
治疗组合物的剂型和后续给药(剂量)已为本领域技术人员所了解。剂量取决于几个要素，包括所治疗病状的严重性和反应性，疗程可持续几天到数月，或直到治愈，或获得病状的减轻。可从病人体内药物累积的测量中计算出最适剂量安排。普通技术人员可容易地确定最适剂量、剂量方法学和重复率。最适剂量因各个寡核苷酸的相关效能而异，通常可以根据在体外或体内动物模型中有效的EC50估计得到。通常，剂量每千克体重0.01微克到100克，每千克体重0.1微克到10克，每千克体重1微克到1克、每千克体重10微克到100毫克、每千克体重100微克到10毫克或每千克体重100微克到1毫克，可每日、每周、每月或每年给予一次或多次，或甚至每2到20年给予1次。本领域普通技术人员根据药物在体液和组织中的测量存留时间和浓度，可以容易地为剂量估计重复率。成功治疗后，期望病人能够维持治疗防止病状复发，以维持剂量，每千克体重0.01微克到100克，每千克体重0.1微克到10克，每千克体重1微克到1克、每千克体重10微克到100毫克、每千克体重100微克到10毫克或每千克体重100微克到1毫克给予寡核苷酸，每天一次或多次至20年1次。
在一些实施方式中，可以静脉内输送4-6毫克/千克的寡聚物。在其它实施方式中，可以气雾剂形式将100mg的寡聚物输送到肺中。
试剂盒、研究试剂、诊断和治疗
本发明化合物可用于诊断、治疗、预防和作为研究试剂、试剂盒。而且，能够非常特异地抑制基因表达的反义寡核苷酸经常被普通技术人员用于阐明具体基因的功能，或区分某一生物学途径中不同成员的功能。
用于试剂盒和诊断用途时，可以将单独或与其他化合物或疗法结合的本发明化合物用作差异和/或组合分析的工具，以阐明与细胞或组织中表达基因部分或完全互补的表达类型。
作为一个非限制性实施例，用一种或多种寡聚化合物治疗的细胞或者组织的表达类型和未用寡聚化合物治疗的对照细胞或组织比较，分析不同基因表达水平下所产生的模式，因为它们属于所检测基因的，比如，疾病相关、信号途径、细胞定位、表达水平、大小、结构或功能。可以在刺激或未刺激的细胞上，和在其它影响表达模式的化合物存在或不存在下进行这些分析。
为本领域技术人员了解的基因表达分析方法的实例包括但不局限于，DNA阵列或微阵列(Brazma等，FEBS Lett.，2000，480，17-24；Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16)，SAGE(基因表达的系列分析)(Madden等，Drug Discov.Today，2000，5，415-425)，READS(消化cDNA的限制性酶扩增)(Prashar等，Methods Enzymol.，1999，303，258-72)，TOGA(全基因表达分析)(Sutcliffe等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，1976-81)，蛋白阵列和蛋白组学(Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Jungblut等，Electrophoresis，1999，20，2100-10)，表达序列标签(EST)测序(Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Larsson等，J.Biotechnol.，2000，80，143-57)，消减RNA指纹分析(SuRF)(Fuchs等，Anal.Biochem.，2000，286，91-98；Larson等，Cytometry，2000，41，203-208)，消减克隆、差异展示(DD)(Jurecic等，Curr.Opin.Microbiol.，2000，3，316-21)，标价基因组杂交(Carulli等，J.Cell Biochem.Suppl.，1998，31，286-96)，FISH(荧光原位杂交)技术(Going等，Eur.J.Cancer，1999，35，1895-904)和质谱法(To，Comb.Chem.High Throughput Screen，2000，3，235-41)。
本发明化合物可用于研究和诊断，例如，因为这些化合物与编码SARS病毒的核酸杂交。例如，本发明中揭示的在一定条件下以一定效率杂交以成为有效的SARS病毒抑制剂的寡核苷酸，在适合基因扩增或检测的条件下，也将分别是有效的引物或探针。这些引物和探针可用于需要特异性检测编码SARS病毒的核酸分子的方法，也可用于扩增核酸分子以检测或用于进一步研究SARS病毒。通过本领域已知方法可以检测本发明反义寡核苷酸，具体是引物和探针与编码SARS病毒的核酸的杂交。这些方法包括但不局限于，将酶与寡核苷酸共轭、放射性标记寡核苷酸或任何其他合适的检测方法。也可以制备使用这些检测方法在样品中检测SARS病毒水平的试剂盒。
本领域技术人员也掌握了用于治疗性用途的反义的特异性和灵敏度。在治疗动物，包括人的病状中，已经将反义化合物用作治疗剂部分。已经将反义寡核苷酸药物，包括核酶安全有效地给予人体，数个临床试验已在进行当中。因此确定反义化合物可以是有用的治疗形态，经调整可用于治疗细胞、组织和动物，尤其是人的治疗方案。
关于治疗，通过给予寡聚化合物或含有寡聚化合物的组合物，治疗疑似患有可通过调节SARS病毒表达而治疗的疾病或不适的动物如人。例如，在一个非限制性实施方式中，方法包括按治疗需要给予动物治疗有效量的SARS病毒抑制剂的步骤。本发明的SARS病毒抑制剂有效抑制或减少SARS病毒蛋白的活性，或者抑制或减少SARS病毒蛋白的表达。在一个实施方式中，将动物体内SARS病毒的活性或表达减少了约10％或更多、约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多或者100％。
例如，可以在动物的血清、脂肪组织、肝或任何其他体液、组织或器官中测量SARS病毒表达的降低。在一些实施方式中，被分析的体液、组织或器官中含有的细胞包含编码SARS病毒蛋白和/或SARS病毒蛋白本身的核酸分子。
可以通过将有效量的本发明化合物加入到合适的药学上可接受的稀释剂或载体中，将本发明化合物用于药学组合物。使用本发明化合物和方法对于预防同样有效。
虽然依照本发明的实施方式，对其进行了详细描述，但是下面的实施例仅用作说明本发明，并不对其进行限制。为了使本文公开的本发明可以被更有效地理解，下面提供了实施例。应理解，这些实施例仅具说明性目的，不应理解为能以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：核苷亚磷酰胺的合成
如美国专利6,426,220和公开的PCT WO 02/36743所述地，准备包括亚酰胺及其中间体在内的以下化合物：5-甲基脱氧胞苷亚酰胺的中间体5’-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷、5-甲基-脱氧胞苷亚酰胺的中间体5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-脱氧-5-甲基胞苷、5-甲基脱氧胞苷亚酰胺的次末中间体5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-脱氧-N4-苯甲酰-5-甲基胞苷、(5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脱氧-N4-苯甲酰-5-甲基胞苷-3’-O-基)-2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(5-甲基脱氧胞苷亚酰胺)、2’-氟代脱氧腺苷、2’-氟代脱氧鸟苷、2’-氟代尿苷、2’-氟代脱氧胞苷、2’-O-(2-甲氧基乙基)修饰的亚酰胺、中间体2’-O-(2-甲氧基乙基)-5-甲基尿苷、次末中间体5’-O-DMT-2’-O-(2-甲氧基乙基)-5-甲基尿苷、(5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-甲氧基乙基)-5-甲基尿苷-3’-O-基)-2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(MOE胸苷亚酰胺)、中间体5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-(2-甲氧基乙基)-5-甲基胞苷、次末中间体5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-(2-甲氧基乙基)-N4-苯甲酰-5-甲基-胞苷、(5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-甲氧基乙基)-N4-苯甲酰-5-甲基胞苷-3’-O-基)-2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(MOE 5-甲基-胞苷亚酰胺)、(5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-甲氧基乙基)-N6-苯甲酰腺苷-3’-O-基)-2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(MOE腺苷亚酰胺)、(5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-甲氧基乙基)-N4-异丁酰基鸟苷-3’-O-基)-2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(MOE鸟苷亚酰胺)、2’-O-(氨基氧乙基)核苷亚酰胺和2’-O-(二甲基胺基氧-乙基)核苷亚酰胺、2’-O-(二甲基胺基氧乙氧基)核苷亚酰胺、5’-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-O2-2’-脱水-5-甲基尿苷、5’-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2’-O-(2-羟乙基)-5-甲基尿苷、2′-O-((2-苯二甲酰亚氨氧)乙基)-5’-叔丁基二苯基甲硅烷基-5-甲基尿苷、5’-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2’-O-((2-甲醛肟基氧)乙基)-5-甲基尿苷、5’-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2’-O-(N，N-二甲基胺基氧乙基)-5-甲基尿苷、2’-O-(二甲基胺基氧乙基)-5-甲基尿苷、5’-O-DMT-2’-O-(二甲基胺基氧乙基)-5-甲基尿苷、5’-O-DMT-2’-O-(2-N，N-二甲基胺基氧乙基)-5-甲基尿苷-3’-((2-氰乙基)-N，N-二异丙基亚磷酰胺)、2’-(氨基氧乙氧基)核苷亚酰胺、N2-异丁基-6-O-二苯基甲氨酰-2’-O-(2-乙基乙酰)-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)鸟苷-3’-((2-氰乙基)-N，N-二异丙基亚磷酰胺)、2’-二甲基胺基乙氧基乙氧基(2’-DMAEOE)核苷亚酰胺、2’-O-(2-(2-N，N-二甲基胺基乙氧基)乙基)-5-甲基尿苷、5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-(2-(2-N，N-二甲基胺基乙氧基)-乙基)-5-甲基尿苷和5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-(2-(2-N，N-二甲基胺基乙氧基)-乙基)-5-甲基尿苷-3’-O-(氰乙基-N，N-二异丙基)亚磷酰胺。
实施例2：寡核苷酸和寡聚核苷的合成
本发明所使用的寡聚化合物可以通过公知的固相合成技术方便地、程序化地制造。该合成所需的设备可以从包括例如Applied Biosystems(Foster City，CA)等提供商处购得。可以附加地或选择性地使用其他本技术领域中公知的该合成的方法。已知类似技术被用于制备例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物等寡核苷酸。
寡核苷酸
在自动DNA合成器(Applied Biosystems 394型)中使用以碘氧化的标准亚磷酰胺化学合成未取代和取代的磷酸二酯(P＝O)寡核苷酸。
与合成磷酸二酯寡核苷酸类似地合成硫代磷酸酯(P＝S)，除了以下不同：使用10％w/v的3，H-1，2-苯并二硫杂环戊二烯-1，1-二氧化-3-酮的乙腈溶液用于亚磷酸键的氧化从而进行硫杂化。将硫杂化反应步骤的时间增至180秒，并在通常的封端步骤之后进行。从CPG柱分离并在浓缩的氢氧化铵中于55℃去封闭(12-16小时)之后，用大于3体积的乙醇从1M NH4OAc溶液中将寡核苷酸沉淀回收。如被全文纳入本文作为参考的美国专利5,508,270所述，制备次磷酸寡核苷酸。
如被全文纳入本文作为参考的美国专利4,469,863所述，制备烷基磷酸酯寡核苷酸。
如被全文纳入本文作为参考的美国专利5,610,289或5,625,050所述，制备3’-脱氧-3’-亚甲基磷酸酯寡核苷酸。
如被全文纳入本文作为参考的美国专利5,256,775或5,366,878所述，制备亚磷酰胺寡核苷酸。
如被全文纳入本文作为参考的国际公开WO 94/17093或WO 94/02499所述，制备烷基硫代磷酸酯寡核苷酸。
如被全文纳入本文作为参考的美国专利5,476,925所述，制备3’-脱氧-3’-氨基氨基磷酸酯寡核苷酸。
如被全文纳入本文作为参考的美国专利5,023,243所述，制备磷酸三酯寡核苷酸。
如被全文纳入本文作为参考的美国专利5,130,302和5,177,198所述，制备硼烷基磷酸酯寡核苷酸。
寡聚核苷
如被全文纳入本文作为参考的美国专利5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240和5,610,289所述，制备也称作MMI寡聚核苷链的亚甲基甲基亚氨基的寡聚核苷链、也称作MDH寡聚核苷链的亚甲基二甲基-1，2-亚肼基的寡聚核苷链、也称作酰胺-3寡聚核苷链的亚甲基羰基胺基的寡聚核苷链、也称作酰胺-4寡聚核苷链的亚甲基氨基羰基的寡聚核苷链以及具有例如交替的MMI和P＝O或P＝S键的混合骨架的化合物。
如被全文纳入本文作为参考的美国专利5,264,562和5,264,564所述，制备甲醛缩醇寡聚核苷链和硫代甲醛缩醇连接的寡聚核苷。
如被全文纳入本文作为参考的美国专利5,223,618所述，制备环氧乙烷连接的寡聚核苷。
实施例3：RNA的合成
一般，RNA合成化学基于在策略性的中间反应中各种保护基的选择性结合。虽然本领域的普通技术人员会了解保护基在有机合成中的使用，但甲硅烷酯属于一种有用的保护基。具体地，松散的甲硅烷酯被用于与位于2’-羟基上的酸不稳定原酸酯保护基的结合保护5’-羟基。该保护基的组合之后结合标准固相合成技术被使用。必须在所有其他的合成步骤之后最终去除原酸酯保护基。另外，甲硅烷保护基在合成中的早期使用保证了需要时便捷的去除，而没有2’羟基的不希望的脱保护。
在结合通过分别除去且化学物稳定性不同的保护基对2’-羟基的保护，对5’-羟基时序性保护的工序之后，合成RNA寡核苷酸。
RNA寡核苷酸以步进式方式合成。每个核苷酸被依次(3’-到5’-方向)添加到固体支持物结合的寡核苷酸上。分子链3’端的第一个核苷被共价连接于固体支持物上。添加核苷酸前体、核糖核苷亚磷酰胺和活化剂，将第二个碱基连接到5’端的第一个核苷上。洗涤支持物，将所有未反应的5’-羟基用乙酸酐封闭得到5’-乙酰基。然后氧化该键成为更稳定的最终需要的P(V)键。在核苷酸添加循环的最后，将5’甲硅烷基用氟化物离解。每个后续的核苷酸重复该循环。
合成后，在DMF中，用1M 2-甲氨酰-2-氰亚乙基-1，1-连二硫酸二钠三水合物(S2Na2)离解磷酸酯上的甲基保护基。将脱保护溶液从固体支持物结合的寡核苷酸用水洗出。将支持物用40％甲胺的水溶液在55℃处理10分钟。该过程将RNA寡核苷酸释放到溶液中，将环外胺脱保护，修饰2’-基团。在这时，可以用阴离子交换HPLC分析寡核苷酸。
2’-原酸酯基是最后去除的保护基。Dharmacon Research，Inc.(Lafayette，CO)开发的乙二醇一乙酸酯原酸酯保护基是具有以下重要性质的有用的原酸酯保护基的一个例子。所述保护基在核苷亚磷酰胺的合成和寡核苷酸的合成的条件下稳定。然而，在寡核苷酸合成后，用甲胺处理寡核苷酸，甲胺不仅从固体支持物离解寡核苷酸，还将乙酰基从原酸酯上除去。得到的原酸酯上的2-乙基-羟基取代基吸电子能力比乙酰化的前体弱。结果，被修饰的原酸酯变得对酸催化的水解更不稳定。尤其，离解的速率在乙酰基被去除后快了约10倍。因此，该原酸酯具有足够的稳定性以适应寡核苷酸的合成，而且之后被修饰后，可以在适应最终RNA寡核苷酸产物的相对疏水的条件下进行脱保护。
此外，本领域中已知有RNA合成的方法(Scaringe，Ph.D.Thesis，University ofColorado，1996；Scaringe等，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，11820-11821；Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.，1981，103，3185-3191；Beaucage等，Tetrahedron Lett.，1981，22，1859-1862；Dahl等，Acta Chem.Scand，1990，44，639-641；Reddy等，TetrahedronLett.，1994，25，4311-4314；Wincott等，NucleicAcidsRes.，1995，23，2677-2684；Griffin等，Tetrahedron，1967，23，2301-2313；Griffin等，Tetrahedron，1967，23，2315-2331)。
本发明的RNA反义化合物(RNA寡聚核苷酸)可以用本文所述的方法合成，或购自Dharmacon Research，Inc.(Lafayette，CO)。合成后，互补的RNA反义化合物可以用本领域公知的方法退火形成双链(双链体)反义化合物。例如，可以混合30μl RNA寡核苷酸的每条互补链(50μM RNA寡核苷酸溶液)和15μl 5×退火缓冲液(100mM乙酸钾、30mM HEPES-KOH pH7.4、2mM乙酸镁)后，在90℃加热1分钟，再在37℃反应1小时，形成双链体。得到的双链体反义化合物可以被用在试剂盒、测定、筛选或其他方法中，用于研究一个目标核苷酸的功能。
实施例4：嵌合寡核苷酸的合成
本发明的嵌合寡聚化合物，例如寡核苷酸、寡聚核苷或混合的寡核苷酸/寡聚核苷可以是不同的类型。其中包括第一种类型，核苷链的“缺口”片断位于核苷链的5’和3’“翼形”(“wing”)片断之间；第二种“开放端”类型，“缺口”片断位于寡聚化合物的5’或3’端。第一种类型的寡聚核苷酸在本领域中也称作“gapmer”或缺口的寡核苷酸。第二种类型的寡聚核苷酸在本领域中也称作“hemimer”或“wingmer”。
(2’-O-甲基)-(2’-脱氧)-(2’-O-甲基)嵌合硫代磷酸酯寡聚核苷酸
使用Applied Biosystems 394型自动DNA合成器如上地合成具有2’-O-烷基硫代磷酸酯寡聚核苷酸和2’-脱氧硫代磷酸酯寡聚核苷酸片断。寡聚核苷酸使用自动合成器合成，将2’-脱氧-5’二甲氧基三苯甲基-3’-O-亚磷酰胺用于DNA部分，将5’二甲氧基三苯甲基-2’-O-甲基-3’-O-亚磷酰胺用于5’和3’的翼形部分。在标准合成循环中加入增加5’二甲氧基三苯甲基-2’-O-甲基-3’-O-亚磷酰胺的反应时间的连接步骤。从支持物分离被全面保护的寡聚核苷酸，并将其在浓缩的氨(NH4OH)中于55℃脱保护12-16小时。然后，用适当的方法(沉淀、柱层析、真空浓缩以及分光光度分析后用毛细管电泳和质谱进行回收和纯化)回收脱保护了的寡聚物。
(2’O-(2-甲氧基乙基))-(2’-脱氧)-(2’O-(甲氧基乙基))嵌合
硫代磷酸酯寡聚核苷酸
按照上述制造2’-O-甲基嵌合寡聚核苷酸的过程制备(2’-O-(2-甲氧基乙基))-(2’-脱氧)-(2’-O-(甲氧基乙基))嵌合硫代磷酸酯寡聚核苷酸，其中用2’-O-(甲氧基乙基)亚酰胺代替2’-O-甲基亚酰胺。
(2’-O-(2-甲氧基乙基)磷酸二酯)-(2’-脱氧硫代磷酸酯)-(2’O-(2-
甲氧基乙基)磷酸二酯)硫代磷酸酯寡聚核苷酸
按照上述制造2’-O-甲基嵌合寡聚核苷酸的过程制备(2’-O-(2-甲氧基乙基)磷酸二酯)-(2’-脱氧硫代磷酸酯)-(2’-O-(甲氧基乙基)磷酸二酯)硫代磷酸酯寡聚核苷酸，其中用2’-O-(甲氧基乙基)亚酰胺代替2’-O-甲基亚酰胺，以碘氧化在嵌合结构的翼形部分产生核苷磷酸二酯内键，用3，H-1，2-苯并二硫杂环戊二烯-1，1-二氧化-3-酮(BeaucageReagent)硫化在中心缺口处产生硫代核苷酸内键。
根据被全文纳入本文作为参考的美国专利5623065制备其他嵌合寡聚核苷酸、嵌合寡聚核苷和混合的嵌合寡聚核苷酸/寡聚核苷。
寡聚物的合成
适用文献报道的DNA(Protocols for Oligonucleotides and Analogs，Ed.Agrawal(1993)，Humana Press)和/或RNA(Scaringe，Methods(2001)，23，206-217.Gait等，Applications of Chemically synthesized RNA in RNA：Protein Interactions，Ed.Smith(1998)，1-36.Gallo等，Tetrahedron(2001)，57，5707-5713)的合成过程，进行修饰的和未修饰的核苷酸的寡聚。
RNA寡聚物可以通过本文所述的方法合成或者购自各家RNA合成公司，例如Dharmacon Research，Inc.(Lafayette，CO)。
本发明所适用的寡聚化合物可以通过固相合成的公知技术方便地、程序化地制造。该合成所需的设备可以从包括例如Applied Biosystems(Foster City，CA)等提供商处购得。可以附加地或选择性地使用其他本技术领域中公知的该合成的方法。已知类似技术被用于制备例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物等寡聚核苷酸。
实施例5；靶向SARS病毒的双链体反义化合物的设计和筛选
根据本发明，包括本发明的反义化合物及其补体的一系列核酸双链体可以被设计成靶向SARS病毒。双链体的反义链的碱基序列包括序列表中寡聚核苷酸的至少一部分。链末端可以通过添加一个或多个天然或修饰的碱基形成突出端进行修饰。然后，dsRNA的有义链被设计并合成为反义链的补体，也可以在任意末端包含修饰或添加。例如，在一种实施方式中，dsRNA双链体的两条链可以在中心部分的碱基互补，每一条链在一端或两端具有突出端。
例如，包括具有序列CGAGAGGCGGACGGGACCG(SEQ ID NO：1)和一个二碱基的脱氧胸苷(dT)突出端的反义链的双链体具有如下结构：
               cgagaggcggacgggaccgTT 反义链(SEQ ID NO：2)
               |||||||||||||||||||
             TTgctctccgcctgccctggc   互补链(SEQ ID NO：3)
在另一个实施方式中，包括具有同样的序列CGAGAGGCGGACGGGACCG(序列编号1)的反义链的双链体可以制备钝端(没有单链突出端；即，不具有如上所示的两个“TT”突出端)。
双链体的RNA链可以用本文所揭示的方法合成，或购自Dharmacon Research，Inc.(Lafayette，CO)。合成后，互补链进行退火。单链做成等分试样并稀释至50μM。稀释后，每条互补链取30μl混合15μl 5×退火缓冲液。所述缓冲液的最终浓度为100mM乙酸钾、30mM HEPES-KOH pH7.4和2mM乙酸镁。最终体积为75μl。所述溶液在90℃孵育1小时后，离心15秒。dsRNA双链体被用于实验时，试管可以在37℃存放1小时。dsRNA双链体的最终浓度为20μM。所述溶液可以冷冻储存(-20℃)，解冻最多5次。
制备完成后，对双链体反义化合物进行其调谐SARS病毒表达的能力。
细胞铺满80％时，用本发明的双链体反义化合物处理细胞。对于在96孔培养的细胞，各孔用200μl POTI-MEM-1灭活血清培养液(Gibco BRL)洗涤一次，接着用130μl含12μg/mL LIPOFECTIN(Gibco BRL)的POTI-MEM-1处理，所需的双链体反义化合物最终浓度为200nM。处理5小时后，更新培养液。处理之后16小时后收集细胞，同时分离RNA，用RT-PCR测定靶的减少。
靶向SARS病毒假结和移码位点核糖体移码的其它方法
程序性核糖体移码普遍存在于生命的所有三个域。进行移码需要两个部分：滑动位点和稍下游处的稳定的RNA结构。滑动位点具有特征的序列X XXY YYN，空间结构表明该处为起始阅读框，X和Y可以是相同的核苷酸。滑动位点(一般少于8核苷酸)稍下游处的RNA结构元件使核糖体暂时停顿，同时XYY和YYN密码子的tRNA连接到核糖体的mRNA上，从而发生移码。因为这些tRNA也连接到-1框中的RNA并匹配(至少在非摆动的位置)，所有复合物往回滑动一个位置，然后继续在-1框中(XXX YYY N)合成蛋白质。下游的RNA结构使滑动易化。
移码是在病毒、细菌、原生动物和哺乳动物系统中一个普遍的现象。有些哺乳动物基因具有程序性移码位点。当然，因为病毒在真核细胞中复制，我们知道很多种病毒移码信号与真核核糖体配合得很好。天然移码信号根据信号长度的不同，效率的范围从几个百分比到近100％各不相同。
在病毒中，移码被用于以需要的比例产生两种不同的蛋白质。HIV用核糖体移码以一定比例制造结构蛋白gag和其聚合酶。HIV需要大量的gag，但只要少量的聚合酶。约95％的时间没有移码，只有gag结构蛋白被使用mRNA的前一半制造。gag的框内的终止密码子结束翻译。但5％的发生移码的时间内，制造包含HIV少量需要的聚合酶的融合蛋白。移码信号的长度被调整，从而产生所需的各蛋白质的平衡。
移码的另一个功能是制造两种来源于相同序列但不同长度的蛋白质。其中，没有高效的阅读框，移码使翻译在框内终止就立即遇到终止密码子，从而制造比完整长度短的产物。肠道细菌的DnaX基因是其一个例子。DnaX基因产生两种不同长度的蛋白质τ和γ。由于程序性移码，τ比γ短。
实际上，移码位点下游的RNA结构的稳定性控制着移码的频率。在高频率的移码信号中该结构是一个假结，而在低频率的移码中，例如HIV，它是一个简单的发卡结构。此外，发现通过提高RNA结构的稳定性，移码可以被加强。这可以通过一个产生更稳定的结构的定向诱变位点，或者添加反义寡聚核苷酸到原有结构中茎的长度来实现。
SARS病毒中潜在的核糖体移码位点
核糖体移码已经作为许多病毒的一项重要特征被记载。其中包括包括反转录病毒(例如HIV)、冠状病毒科、星状病毒科、全病毒科以及其他病毒家族。冠状病毒科是感染人和动物的病毒家族，包括一种引起类似普通感冒的呼吸道疾病的被称为人冠状病毒229E(HCo-V-229E)的病毒。该家族还包括雏鸡感染性支气管炎病毒(IBV)、鼠肝炎病毒(MHV)、猪传染性胃肠炎病毒PRCoV、猪呼吸道冠状病毒和牛冠状病毒等(Lai和Holmes，病毒手册第35章)。传染性支气管炎病毒，一种感染鸡的冠状病毒，具有研究得比较清楚的移码位点。IBV的结构是下游具有假结的滑动位点(参见图1)。
冠状病毒存在移码位点的原因并不清楚。冠状病毒的移码位点在ORF 1a和1b之间。ORFs 1a包含包括蛋白酶的许多蛋白质，ORF 1b包含RNA依赖性RNA聚合酶。RNA依赖性RNA聚合酶基因是一个重要的基因。不同于其他RNA病毒，冠状病毒在病毒粒子中不带有RNA依赖性RNA聚合酶基因的拷贝。因此，为了完成复制，RNA依赖性RNA聚合酶基因必须直接翻译自基因组RNA。因为RNA依赖性RNA聚合酶基因位于移码位点的下游，为了制造冠状病毒的RNA依赖性RNA聚合酶，必须有移码信号工作，所述聚合酶基因位于上游的ORF 1a的阅读框外-1位置。可能这就是感染性支气管炎病毒移码位点如此高效的原因(大多效率为20-40％)。
如果SARS病毒与前述的冠状病毒具有同样的方式，则移码信号在基因组中类似的位置，移码位点功能对病毒的生命周期非常重要。为了确定SARS病毒是否具有类似的移码信号，将发表于GenBank的SARS病毒序列和已知的冠状病毒进行了比较分析。分析结果显示，SARS病毒具有相当程度的与具有记载了的移码位点的其他冠状病毒的同源性。根据结构的相似性可以确定SARS病毒极有可能具有移码位点。从序列比较可以确定滑动位点所含的区域和假结在对位中更保守。假结中发生变化的地方是改变序列的相关突变碱基对，不是保守结构。
SARS病毒核糖体移码位点的反义抑制
寡聚核苷酸可以被设计来干扰或增强移码位点。寡聚核苷酸可以作用于茎2的末端之前，除外在该结构外成核后使其断裂。
细胞定位
本发明也包括用基序装备或配方的化合物或分子，所述基序调制细胞内的分配、定位或分子在细胞的特定区室中的存留。基序特异地与细胞组分或大分子相互联系、复合或作用，所述细胞组合或大分子主要停留或移动至细胞的某个位置、区室或域，不论是酶还是过程，在所述细胞中产生反义活性的基础。本发明的化合物或分子可以化学合成或天然的，并以序列特异性的方式调控基因表达。
本发明可以用于除了那些已有的或与反义活性相关的分子之外，分配或定位到位点上的基于反义的分子。本发明有望提高反义分子在作用点上的有效的积聚，以提高其效能和/或效力。
以下基序是用于与所关心的反义分子连接或配方候选基序，例如RNA酶HASO(细胞核/核仁)、siRNA(细胞质)、asRNA(细胞质)、5’封闭抑制因子(细胞核)、剪切抑制因子(细胞核)、聚腺苷酸化抑制因子(细胞核)、翻译抑制因子(细胞质或早期在细胞核)、2-5RNA酶L(细胞质)。
肽基序
用于细胞质定位的“富含亮氨酸”的核转运信号(NES)；例如LQLPPLERLTL(rev)(SEQ ID NO：4)、DLQKKLEELEL(MAPKK)(SEQ ID NO：5)、ELALKLAGLDI(PKI-α)(SEQ ID NO：6)、ALPHAIMRLDLA(肌动蛋白)(SEQ IDNO：7)。
用于内质网定位的KDEL(SEQ ID NO：8)。
用于细胞核和/或核仁定位的富含精氨酸/赖氨酸的基序；例如，核仁，PQRRNRSRRRRFRGQ(FXR2P)(SEQ ID NO：9)、IMRRRGL(血管生成素)(SEQ IDNO：10)、GRKKRRQRRR(HIV-1 TAT)(SEQ ID NO：11)。
皮抗菌肽衍生物(抗微生物肽)，例如ALWKTLLKKVLKA(SEQ ID NO：12)，通过摄取入HeLa细胞证明，为细胞质定位。
用于细胞核和核斑定位的RS、RE和RD的重复基序。
用于细胞质定位的RG和KS的重复基序。
疏水基序
烷基链，例如C10到C30。
核苷酸基序
腺苷酸链--聚腺苷酸连接蛋白(细胞核和细胞质形态)，例如An。
富含AU成分——ELAV家族
例如UUAUUUAUU最小的序列/长度。
富含CU成分——ELAV家族
例如被HuD和HuR识别的(CUUU)n。
hnRNP底物
例如hnRNP的A1和K穿梭于细胞核与细胞质，A1在细胞质中与w/PAPB1、转移蛋白和mRNA。A1的高亲和力连接位点为UAGGGA/U。
其他穿梭蛋白底物(类hnRNP)
例如JKTBP，共有连接位点(GG)ACUAGC(A)。
Y链或束
例如hnRNP I的底物(PTBP1/PTB)。
Pumilio识别序列
例如UGUANAUR，其中N为任意碱基，R为嘌呤(Cell，2002，110，501-12)。
组合选择
例如用于识别分配到不同亚细胞区域的序列的N10-荧光或生物素标记。
一旦定位到正确的区室，位于那里的酶可以实现靶核苷酸的修饰。例如，如果实现了位于细胞质的定位，RNA酶L会被激活，并引起核苷酸靶的破坏。
实施例6：寡聚核苷酸的分离
在从受控有孔玻璃固体支持物上分离并在浓缩的氢氧化铵中于55℃去封闭12-16小时后，以大于3体积的乙醇从1M NH4Oac中沉淀回收寡聚核苷酸或寡聚核苷。用电喷射质谱法(测定分子量)和毛细管电泳分析合成的寡聚核苷酸，鉴定为至少70％全长的材料。合成中得到的硫代磷酸酯键和磷酸酯键的相对量通过相对于-16amu产物的校正分子量的比例确定(+/-32+/-48)。在一些研究中使用HPLC纯化寡聚核苷酸，如Chiang等，J.Biol.Chem.1991，266，18162-18171中所述。HPLC纯化材料得到的结果与非HPLC纯化材料得到的结果相似。
实施例7：寡聚核苷酸的合成——96孔板格式
通过固相P(III)亚磷酰胺化学在可以以96孔格式同时组装96条序列的自动合成器中合成寡聚核苷酸。经液态碘氧化形成核苷酸内键。用1，1二氧化3，H-1，2-苯并二噻吩-3-酮(3，H-1，2，-benzodithiole-3-one 1，1 dioxide)(Beaucage试剂)在无水乙腈中硫化产生硫代核苷酸内键。标准碱基保护的β-氰乙基-二异丙基亚磷酰胺购自供应商(例如PE-Applied Biosystems，Foster City，CA或者Pharmacia，Piscataway，NJ)。非标准的核苷可以以任何标准或专利的方法合成。它们被用作碱基保护的β-氰乙基二异丙基亚磷酰胺。
从支持物分离寡聚核苷酸，并将其用浓缩的NH4OH在提高的温度(55-60℃)下脱保护12-16小时，然后将得到的产物真空干燥。再将干燥了的产物悬浮于无菌水中成为样板，之后所有的分析和测试板从该样板中使用吸移管管理器稀释得到。
实施例8：寡聚核苷酸的分析——96孔板格式
稀释样本并使用紫外吸收光谱测定每个孔中寡聚核苷酸的浓度。用毛细管电泳以96孔(Beckman P/ACETM MDQ)格式或对准备每个样本商用毛细管电泳仪(例如Beckman P/ACETM 5000，ABI 270)，对单独的产物的全长完整性进行评估。碱基和骨架的构成使用电喷射质谱法通过化合物的质谱进行确认。所有鉴定测试板从该样板中使用单通道或多通道的吸移管管理器稀释得到。如果板上至少85％的化合物达到至少85％的全长，则该板认为是可以接受的。
实施例9：细胞培养和寡聚核苷酸处理
反义化合物对靶核苷酸表达的影响可以在任何靶核苷酸在可测的水平表达的细胞类型中进行试验。这可以常规地使用例如PCR或Northern印迹分析进行确认。以下的细胞类型仅用于示例，其他细胞类型也可以被常规地使用，只要在被选细胞类型中靶有表达或可以转染到该类型细胞中，或者在感染性物质的情况下，只要外源核苷酸被发现感染到该类型细胞中。这可以容易地通过本领域的常规方法进行确认，例如Northern印迹分析、核糖核酸酶保护测试或RT-PCR。
人细胞系
T-24细胞：
人转移细胞膀胱癌细胞系T-24获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)。T-24细胞常规地培养子完全McCoy’s 5A基础培养基(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)，并添加有10％牛胎血清(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)、100单位/mL青霉素和100mg/mL链霉素(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)。细胞在长到铺满90％常规地通过胰酶消化和稀释进行传代。细胞以7000细胞/孔的密度点样到96孔板(Falcon-Primaria#353872)中用于RT-PCR分析。
对于Northern印迹或其他分析，细胞可以点样到100mm或其他标准组织培养板上，使用适当的培养液体积和寡聚核苷酸进行类似的处理。
A549细胞：
人肺癌细胞系A549获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)。A549细胞常规地培养于DMEM基础培养基(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)，并添加有10％牛胎血清(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)、100单位/mL青霉素和100mg/mL链霉素(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)。细胞在长到铺满90％常规地经过胰酶消化和稀释。
NHDF细胞：
人新生儿皮肤纤维母细胞(NHDF)获自Clonetics公司(Walkersville，MD)。NHDF细胞常规地保存在纤维母细胞生长培养基(Clonetics公司，Walkersville，MD)，按照供应商的要求添加其他成分。按照供应商的要求细胞保存到最多10代。
HEK细胞：
人胚胎角质化细胞(HEK)获自Clonetics公司(Walkersville，MD)。HEK细胞常规地保存在角质化细胞生长培养基(Clonetics公司，Walkersville，MD)，按照供应商的要求进行配方。按照供应商的要求细胞保存到最多10代。
灵长类细胞系
Vero E6细胞：
这些细胞可以被保存、培养和接种生物样本，被认为可以通过Ksiazek等，NewEngland Journal of Medicine，2003，348(20)，1947-1958所述的方法携带SARS病毒。感染后，RNA可以从细胞分离并且可以通过病毒的寡聚核苷酸引物和探针使用Ksiazek等，New England Journal of Medicine，2003，348(20)，1947-1958或者Drosten等，New England Journal of Medicine，2003，348(20)，1967-1976所述的方法用RT-PCR对RNA定量。
反义化合物的处理：
当细胞长到65-75％铺满，用寡聚核苷酸对其进行处理。对于在96孔板中生长的细胞，用100μL 0PTI-MEMTM-1灭活血清培养液(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)清洗一次，然后用130μL含有3.75μg/mL LIPOFECTIN TM(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)和所需浓度的寡聚核苷酸的0PTI-MEMTM-1进行处理。对细胞进行处理并得到数据，重复三次。在37℃处理4-7小时后，换新的培养液。在寡聚核苷酸处理后的16-24小时之后回收细胞。
寡聚核苷酸的浓度根据不同的细胞系而不同。为了确定特定细胞系的最佳寡聚核苷酸浓度，对细胞用阳性对照的寡聚核苷酸在一定浓度范围内进行处理。对于人细胞，阳性对照的寡聚核苷酸选自靶向人H-ras的ISIS 13920(TCCGTCATCGCTCCTCAGGG)(SEQ ID NO：13)或靶向人Jun-N末端激酶-2(JNK2)的ISIS 18078(GTGCGCGCGAGCCCGAAATC)(SEQ ID NO：14)。两个对照都是具有硫代磷酸酯骨架的2’-O-甲氧基乙基gapmer(2’-O-甲氧基乙基突出)。对于小鼠或大鼠，阳性对照的寡聚核苷酸为靶向小鼠和大鼠的c-raf的ISIS 15770TCCGTCATCGCTCCTCAGGG(SEQ ID NO：15)，它是具有硫代磷酸酯骨架的2’-O-甲氧基乙基gapmer(2’-O-甲氧基乙基突出)。对c-H-ras(对于ISIS 13920)、JNK2(对于ISIS 18078)或c-raf(对于ISIS 15770)的mRNA产生80％抑制的阳性对照寡聚核苷酸的浓度在后面作为这些细胞系之后的试验中的新寡聚核苷酸的筛选浓度。如果没有达到80％抑制，则对c-H-ras、JNK2或c-raf的mRNA产生60％抑制的阳性对照寡聚核苷酸的最低浓度在后面作为这些细胞系之后的试验中的新寡聚核苷酸的筛选浓度。如果没有达到60％抑制，则认为该细胞系不适合寡聚核苷酸转染试验。在这里，反义寡聚核苷酸的浓度使用50nM到300nM。
实施例10：寡聚核苷酸对SARS病毒表达抑制的分析
对SARS病毒表达的反义调制可以通过本领域公知的各种方法进行测定。例如，SARS病毒mRNA的水平可以通过例如Northern印迹分析、竞争性聚合酶链式反应(PCR)或实时PCR(RT-PCR)进行定量。实时定量PCR是目前优选的。RNA分析可以对总细胞RNA或poly(A)+mRNA进行。本发明的RNA分析的一种方法是如本文中其他实施例所述使用总细胞RNA。RNA的分离方法在本领域已知。Northern印迹分析在本领域中也是常规的。实时定量(PCR)可以方便地使用可以从PE-AppliedBiosystems，Foster City，CA购买到的ABI PRISMTM7600、7700或7900序列测定系统完成，并根据手册的指示操作。
SARS病毒的蛋白质水平可以通过本领域公知的各种方法进行测定，例如免疫沉淀法、Western印迹分析(免疫印迹)、酶连接免疫吸附剂测试(ELISA)或荧光激活细胞分类术(FACS)。SARS病毒的抗体可以从各种资源识别并获得，例如MSRS抗体目录(Aerie公司，Birmingham，MI)，或通过本领域公知的方便的单克隆或多克隆抗体生成方法制备。
实施例11：表型测验的设计和SARS病毒抑制剂的使用的活体研究
一旦SARS病毒抑制剂通过本文所述的方法鉴定，所述化合物在一个或多个表型测验中进行进一步的考察，每个测验具有可测的根据在某一种疾病状态或情况的处理中的效力可以预测的终点。
表型测验、试剂盒和试剂的使用对本领域的普通技术人员是公知的，它们在这里被用来考察SARS病毒在卫生和疾病中的作用和/或联系。可以购自几个供应商中的任一家的，代表性的表型测验包括用于确定细胞生活力、细胞毒性、增殖或细胞存活的测验(Molecular Probes，Eugene，OR；PerkinElmer，Boston，MA)，包括酶测验(Panvera，LLC，Madison，WI；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ；Oncogene ResearchProducts，Sn Diego，CA)、细胞调节、信号传导、炎症反应、氧化过程和凋亡(AssayDesigns Inc.，Ann Arbor，MI)的基于蛋白质的测验，甘油三酯积聚(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，血管生成测验，管道形成测验，胞质分裂及急速测验和新陈代谢测验(Chemicon International Inc.，Temecula，CA；Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，血液和其他体液的病毒滴度。
在一个未限定的实施例中，对确定适合一个特定的表型测验的细胞(即，为乳癌研究选择的MCF-7细胞；用于肥胖研究的脂肪细胞；用于病毒滴度的血液或痰样本)用从活体研究鉴定的SARS病毒抑制剂和由前述方法确定的最佳浓度的对照化合物进行处理。在处理阶段结束后，将处理和未处理的细胞用一种或多种测验特定的确定表型产量和终点的方法进行分析。
表型终点包括细胞形态学上对于时间或处理量上的变化，以及例如蛋白质、脂类、核苷酸、激素、糖类或无机盐的细胞组分，病毒滴度，感染或发炎标记的水平上的变化。包括pH、细胞周期的阶段、细胞对生物指示剂的摄取或分泌的细胞状态的测定也可以作为终点。
处理后的细胞基因型的分析(测定细胞的一个或多个基因的表达)也作为一个SARS病毒抑制剂的效力或效能的指标。测定处理和未处理的细胞中的标记基因或被认为与某个具体疾病状态、条件或表型相关的基因。
活体研究
这里所说的活体研究的个体对象为恒温的脊椎动物，包括人类。
临床试验受到严格的控制，以确保不会不必要地给个人带来危险，并且被完全地告知他们在研究中的角色。
为了解决接受的治疗带来的心理影响，志愿者被随机地给予安慰剂或SARS病毒抑制剂。此外，为了防止医生出现偏向，他们不被告知所作的药物治疗是SARS病毒抑制剂还是安慰剂。使用这种随机的方法，每个志愿者具有同样的被给予新的治疗或安慰剂的几率。
志愿者服用SARS病毒抑制剂或安慰剂8周，同时在研究期间对与指示的疾病状态或情况相关的生物学参数在开始(任何治疗前的基线测定)、结束(在最终的治疗后)及等间隔地进行测定。这样的测定包括与治疗前的水平相比的编码SARS病毒的核苷酸分子的水平或者体液、组织或器官的SARS病毒蛋白质水平。其他测定包括所治疗的疾病状态或情况的指数、体重、血压、疾病或毒力药理性指示剂的血清滴定度以及ADME(吸收、分布、新陈代谢和排泄)测定，但并不局限于此。
每个病人所记录的信息包括年龄(岁)、性别、身高(cm)、该疾病状态或情况的家族史(有/否)、动机等级(较低/中等/较高)和之前对该疾病状态或情况的治疗方法的数量和类型。
参与该研究的志愿者为健康的成年人(年龄为18到65岁)，大致同样人数的男性和女性参与到该研究。各种特征的志愿者被均等地施予安慰剂和SARS病毒抑制剂治疗。总体上，用安慰剂治疗的志愿者对治疗很少有或没有反应，而用SARS病毒抑制剂治疗的志愿者在他们的疾病状态或情况中表现出正面的趋势，这在研究的结论中会提到。
实施例12：分离RNA
Poly(A)+mRNA的分离
按照Miura等(Clin.Chem.，1996，42，1758-1764)的方法分离Poly(A)+mRNA。其他分离Poly(A)+mRNA的方法在本领域中是公知的。简而言之，对于在96孔板中生长的细胞，移去细胞的生长培养基并对每个孔用200μL的冷的PBS清洗。在每孔中加入60μL溶解缓冲液(10mM pH7.6的Tris-HCl、1mM EDTA、0.5M NaCl、0.5％NP-40、20mM氧钒-核糖核酸复合物)，缓慢摇匀，然后在室温下孵育5分钟。将55μL溶解产物移入铺涂寡聚脱氧胸苷的96孔板(AGCT Inc.，Irvine CA)。在室温下将板孵育60分钟，用200μL清洗缓冲液(10mM pH7.6的Tris-HCl、1mM EDTA、0.3MNaCl)清洗3次。在最后一次清洗后，将板按在纸巾上吸去多余清洗缓冲液并晾干5分钟。在每孔中加入60μL预热到70℃的洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.6)，在板置于90℃的热平板上孵育5分钟，再将洗脱液移入新的96孔板中。
在100mm或其他标准板中生长的细胞可以类似地处理，并且所有溶液使用适当的体积。
总RNA分离
使用购自Qiagen Inc.(Valencia，CA)的RNEASY 96TM试剂盒和缓冲液按照生产商所要求的过程分离总RNA。简而言之，对于在96孔板中生长的细胞，移去细胞的生长培养基并对每个孔用200μL的冷的PBS清洗。在每孔中加入150μL RLT缓冲液并激烈振荡20秒。然后，在每孔中加入150μL 70％酒精并用移液管吹吸三次混合内含物。再将样本移入RNEASY96TM孔板，所述孔板与配合废液槽并连接真空源的QIAVACTM多头导管连接。抽真空1分钟。在RNEASY96TM孔板的每孔中加入500μL RW1缓冲液并孵育15分钟，再抽真空1分钟。在RNEASY 96TM孔板的每孔中再加入500μLRWl缓冲液，并抽真空2分钟。然后，在RNEASY96TM孔板的每孔中加入1mL RPE缓冲液，并抽真空90秒。再次RPE缓冲液清洗并抽真空3分钟。然后，将板从QIAVACTM多头导管上移下，将板按在纸巾上干燥。将板重新连接到配合具有1.2mL收集管的收集管架的QIAVACTM多头导管上。向每孔中移入140μL不含RNA酶的水，孵育1分钟，并再抽真空3分钟，从而洗脱RNA。
重复的移液和洗脱步骤可以使用QIAGEN Bio-Robot 9604(Qiagen Inc.，Valencia，CA)自动进行。重要的是，在培养板上溶解细胞后，将板移到进行移液、DNA酶处理和洗脱步骤的机械平台上。
实施例13：SARS病毒mRNA水平的实时定量PCR分析
SARS病毒mRNA水平的定量通过使用ABI PRISMTM7600、7700或7900序列测定系统(PE-Applied Biosystems，Foster City，CA)的实时定量PCR按照制造商的说明完成。这是一个封闭试管的、不基于凝胶的荧光测定系统，它允许实时的聚合酶链式反应(PCR)产物的高通量的定量。与在PCR完成后对扩增产物定量的标准PCR不同，实时定量PCR的产物在扩增同时定量。这是由在PCR反应中使用在正向和反向PCR引物之间特异性退火的、含有两种荧光染料的寡聚核苷酸探针来实现的。探针的5’端连接一个指示染料(例如FAM或JOE，购自PE-Applied Biosystems，FosterCity，CA、Operon Technologies Inc.，Alameda，CA或Integrated DNA Technologies Inc.，Coralville，IA)，探针的3’端连接一个淬灭染料(例如TAMRA，购自PE-AppliedBiosystems，Foster City，CA、Operon Technologies Inc.，Alameda，CA或Integrated DNATechnologies Inc.，Coralville，IA)。探针和染料是完整的时候，指示染料的发光由于3’淬灭染料的邻近而淬灭。在扩增中，探针向靶序列的退火产生可以由Taq聚合酶的5’核酸外切酶活性切断的底物。在PCR扩增循环的延伸阶段，探针被Taq聚合酶切断并使指示染料与探针的剩余部分分离(因此离开淬灭剂的一半)，从而产生序列特异性的荧光信号。在每个循环中，更多的指示染料分子从它们各自的探针上被剪切下来，并通过ABI PRISMTM序列测定系统中装配的激光光学装置等间隔地监控荧光密度。在每个测验中，包括从未处理的对照样本连续稀释mRNA的一系列平行反应产生一条标准曲线，它被用来对试验样本的反义寡聚核苷酸处理后的抑制百分比进行定量。
在定量PCR分析之前，对于对测定的靶基因特异的引物-探针组合通过GAPDH扩增反应评估它们成为“多链体”(“multiplexed”)的能力。在多链化中，靶基因和内部的标准基因GAPDH在单一样本中被同时扩增。在该分析中，从未处理的细胞上分离的mRNA被连续稀释。每次稀释在只对GAPDH、只对靶基因(“单链体”)或对两者(“多链体”)特异的引物-探针组合的存在下被扩增。在PCR扩增后，从单链体样本和多链体样本中作为稀释的函数产生GAPDH和mRNA信号的标准曲线。如果来自多链体样本的GAPDH和靶信号的斜率和相关性系数都比它们相应的来自多链体样本的值低10％以内，则认为该对靶特异的引物-探针组合是可多链化的。在本领域也已知有其他PCR方法。
PCR试剂获自Invitrogen公司(Carlsbad，CA)。RT-PCR反应是在含有30μL总RNA溶液(20-200ng)的96孔板中加入20μL PCR混合物(无MgCl2的2.5x PCR缓冲液，6.6mM MgCl2，dATP、dCTP、dCTP和dGTP各375μM，正向引物和反向引物各375nM，125nM探针，4单位RNA酶抑制剂，1.25单位PLATINUM Taq，5单位MuLV逆转录酶和2.5xROX染料)进行的。通过在48℃孵育30分钟进行RT反应。在95℃孵育10分钟激活PLATINUMS Taq酶后，进行40个两步PCR程序循环：95℃15秒(变性)，然后60℃ 1.5分钟(退火/延伸)。
用表达不变的GAPDH基因的表达水平或用RiboGreenTM(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)定量总RNA的方法将由实时RT-PCR获得基因靶的量标准化。通过与靶同时、多路或分开进行实时RT-PCR，定量GAPDH的表达。用RiboGreenTM RNA定量试剂(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)定量总RNA。Jones等，(AnalyticalBiochemistry，1998，265，368-374)中提供了通过RiboGreenTM定量总RNA的方法。
在这个测定中，将170微升RiboGreenTM工作试剂(在10毫摩尔Tris-HCI，1mMEDTA，pH7.5中以1:350稀释RiboGreenTM试剂)吸移到含有3-微升纯化的细胞RNA的96孔板中。在CytoFluor 4000(PE Applied Biosystems)中以激发光485纳米、发射光530纳米读板。
用公布的序列信息(GenBank编号NC 004718.1，本文纳入为SEQ ID NO：16)设计SARS病毒的探针和引物，使其与SARS病毒序列杂交。可根据Drosten等的方法制备用于SARS病毒的PCR引物。用于人GAPDH的PCR引物可以是：
正向引物：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO：17)
反向引物：GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO：18)
PCR探针是：
5′JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA3(SEQ ID NO：19)
其中JOE是荧光报道染料，TAMRA是淬灭染料。
实施例14：用Northern印迹分析SARS病毒mRNA的水平
反义处理后18小时，用冷PBS洗涤细胞单层两次，在1毫升RNAZOLTM(TEL-TEST“B”Inc.，Friendswood，TX)中裂解。根据制造商的推荐步骤制备总RNA。用MOPS缓冲液系统(AMRESCO，Inc.Solon，OH)，通过含1.1％甲醛的1.2％琼脂糖凝胶电泳分离20微克总RNA。用Northern/Southern转移缓冲液系统(TEL-TEST“B”Inc.，Friendswood，TX)，通过毛细转移过夜将RNA从凝胶转移到HYBONDTM-N+尼龙膜(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上。用紫外观察证实了RNA转移。用STRATALINKERTM紫外交联器2400(Stratagene，Inc，LaJolla，CA)，通过紫外交联固定膜，然后用QUICKHYBTM杂交溶液(Stratagene，La Jolla，CA)，按照制造商推荐的严谨条件进行杂交。
为检测SARS病毒，制备了SARS病毒特异性探针。为了对上样的变化和转移效率标准化，剪下合适的膜并杂交甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)RNA(Clontech，PaloAlto，CA)。
用PHOSPHORIMAGERTM和IMAGEQUANTTM软件V3.3(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)观察并测定杂交膜。数据标准化至未处理对照的GAPDH水平。
实施例15：通过具有2′-MOE翼和脱氧帽的嵌合硫代磷酸寡核苷酸反义抑制SARS病毒表达
根据本发明，用公布序列(GenBank编号NC_004718.1，本文纳入为SEQ IDNO：16)设计了一系列靶向SARS病毒RNA不同区的反义化合物。附带的序列表中列出了这些化合物。“靶位点”指具体靶序列中与化合物结合的最初(5′-端)几个核苷酸。该化合物可以是长度为20个寡核苷酸的“gapmer”。可以通过本文其它实施例中描述的定量实时PCR分析该化合物对于SARS病毒mRNA水平的作用。
与这些序列互补的靶区在本文中指“合适的靶节段”，因此适用于本发明化合物的靶向。该序列与序列表中列出的化合物反义互补。
因为可以通过与本发明反义化合物进行公开的、可行的杂交实验获得这些“合适的靶节段”，本领域技术人员会认识到或能够确信，只需要常规实验，本发明的进一步实施方式就可以包括与这些合适的靶节段杂交以抑制SARS病毒表达的其它化合物。
根据本发明，反义化合物包括反义低聚化合物、反义寡核苷酸、siRNAs、miRNAs、dsRNAs、双链体化合物、核酶、外部向导序列(EGS)寡核苷酸、交替剪接体、引物、探针和其它至少与靶核酸部分杂交的短低聚化合物。
实施例16：用蛋白质印迹分析SARS病毒蛋白的水平
用标准方法进行蛋白质印迹分析(免疫印迹分析)。寡核苷酸处理后16-20小时收集细胞，用PBS洗一次，悬浮于Laemmli缓冲液(100微升/孔)，煮沸5分钟，然后上至16％ SDS-PAGE凝胶上。凝胶在150V下跑1.5小时，转移到用于蛋白质印迹的膜上。使用指向SARS病毒的合适的第一抗体，和抗第一抗体种的放射性同位素标记或荧光标记的第二抗体。用PHOSPHORIMAGERTM(Molecular Dynamics，Sunnyvale CA)观察条带。
实施例17：SARS-CoV序列
从公共数据库中可以得到SARS变种的几个片段和全基因组序列。根据本发明，可用表2中的公布序列设计反义化合物，以靶向SARS的不同结构区或变种或基序。可以通过本文揭示的方法设计、合成并测试所述化合物。
                                表2
                        SARS基因组和片段的序列
  GENBANK编号   序列长度  SEQ ID NO
  NC_04718.1   29736   16
  AY278741.1   29727   29737
  AY278490.1   29291   29738
  AY278489.1   29429   29739
  AY278488.1   28920   29740
  AY278487.1   29430   29741
  AY278554.1   29206   29742
  AY268049.1   433   29743
  AY278491.2   29742   29744
  AY269391.1   405   29745
  AY274119.1   29736   29746
  AY278554.2   29736   29747
  AY279354.1   24774   29748
  AY274119.2   29736   29749
  NC_004718.2   29736   29750
  AY2741193   29751   29751
  NC_004718.3   29751   29752
  AY278488.2   29725   29753
  AY271716.1   158   29754
  AY283798.1   29711   29755
  AY283797.1   29706   29756
  AY283796.1   29711   29757
  AY283795.1   29705   29758
  AY283794.1   29711   29759
  AY297028.1   29715   29760
  AY286402.1   368   29761
  AY291451.1   29729   29762
  AY282752.1   29736   29763
  AY268070.1   646   29764
  AY268049.1   433   29765
  AY286320.2   1215   29766
  AY307165.1   1269   29767
  AY278487.3   29745   29768
  AY278489.2   29757   29769
  AY278490.3   29740   29770
  AY279354.2   29732   29771
  AY290752.1   1620   29772
  AY291315.1   29727   29773
  AY321118.1   29725   29774
  AY323974.1   666   29775
  AY323975.1   231   29776
  AY323976.1   3768   29777
  AY323977.1   29751   29778
  AY283798.2   29711   29779
  AP006557.1   29727   29780
  AP006558.1   29725   29781
  AP006559.1   29727   29782
  AP006560.1   29727   29783
  AP006561.1   29727   29784
  AY278488.2   29725   29785
  AY278489.2   29757   29786
  AY278490.3   29740   29787
  AY279354.2   29732   29788
  AY282752.2   29736   29789
  AY283794.1   29711   29790
  AY283795.1   29705   29791
  AY283796.1   29711   29792
  AY283797.1   29706   29793
  AY283798.2   29711   29794
  AY297028.1   29715   29795
  AY304486.1   29741   29796
  AY304488.1   29731   29797
  AY304495.1   29720   29798
  AY310120.1   29740   29799
  AY313906.1   29754   29800
  AY323977.2   29751   29801
  AY338174.1   29573   29802
  AY338175.1   29573   29803
  AY345986.1   29736   29804
  AY345987.1   29736   29805
  AY345988.1   29736   29806
  AY348314.1   29573   29807
  AY350750.1   29738   29808
  AY351680.1   29749   29809
  AY357075.1   29738   29810
  AY357076.1   29745   29811
  AY362698.1   29727   29812
  AY362699.1   29727   29813
  AY394850.1   29735   29814
  AY427439.1   29711   29815
  AY461660.1   29715   29816
  AY485277.1   29741   29817
  AY485278.1   29740   29818
  AY463060.1   29013   29819
  AY463059.1   29592   29820
  AY502923.1   29729   29821
  AY502924.1   29727   29822
  AY502925.1   29729   29823
  AY502926.1   29729   29824
  AY502927.1   29729   29825
  AY502928.1   29729   29826
  AY502929.1   29729   29827
  AY502930.1   29729   29828
  AY502931.1   29729   29829
  AY502932.1   29729   29830
实施例18：用与SARS-CoV正义链互补的寡核苷酸反义抑制病毒
根据本发明，可用公布序列(Genbank编号NC_004718.1、NC_004718.3、AY278741.1、AY274119.3或AY278489.1)设计反义化合物，以靶向SARS病毒RNA的不同结构区或变种或基序。
表3中显示了靶向SARS的化合物。“靶位点”指具体靶序列中与化合物结合的最初(5′-端)几个核苷酸。表3中的所有化合物都是长度为20个寡核苷酸的嵌合寡核苷酸(“gapmer”)，包含一个由10个2′-脱氧核苷酸组成的中央“缺口”区，它通过两侧(5′和3′方向)的5核苷酸“翼”与靶相连接。翼由称为2′-MOE的2′-O-甲氧基乙基核苷酸组成。整个寡核苷酸中，核苷间(骨架)连接是硫代磷酸(P＝S)连接。所有胞苷残基都是5-甲基胞苷。
                              表3
                  靶向SARS的嵌合硫代磷酸寡核苷酸
ISIS编号   靶SEQ IDNO 靶 序列(5′至3′)   SEQ IDNO
  329410   16   13971   AGATCCTGATTATCTAATGT   13990
  329411   16   13977   CCATTAAGATCCTGATTATC   13996
  329412   16   15195   GGATAATCCCAACCCATAAG   15214
329413 16 15435 ACAGCTTGACAAATGTTAAA 15454
  329414   16   15618   TCATCAGAAAGAATCATCAT   15637
  329415   16   15714   AACACATTATTTTGATAATA   15733
  329416   16   17079   GCATCAACAGCTGCATGAGA   17098
  329417   16   18543   GGTCCAATCTTGACAAAGTA   18562
  329418   16   18770   ATCTAGTCATGATAGCATCA   18789
  329419   16   25053   CAAACATACCAAGGCCATTT   25072
  329420   16   1   GGTTGGCTTTTCCTGGGTAG   20
  329421   16   2   TGGTTGGCTTTTCCTGGGTA   21
  329422   29737   1   GGTAGGTAAAAACCTAATAT   29831
  329423   29739   1   TGGTTGCGAAAATAAAGGGG   29832
  329424   16   192   CTGATGATCGACTGCAACAC   211
  329425   16   202   CCTAGGTATGCTGATGATCG   221
  329426   16   353   CTCCGATAGGGCCTCTTCCA   372
  329427   16   371   TTTGAGGTGTTCACGTGCCT   390
  329428   16   1316   AGTAGGTAGGTACCCACATG   1335
  329429   16   1753   TTACCGCAGGACTCAACAAT   1772
  329430   16   1755   AGTTACCGCAGGACTCAACA   1774
  329431   16   1850   AGCCTGTGAGGGAAAACCAC   1869
  329432   16   2075   ATTAGACAACCACTGAGAAG   2094
  329433   16   2384   ACGGTAAAGTCCCTTGCTTT   2403
  329434   16   2734   TGAACTTCCCAAACAGTATC   2753
  329435   16   2811   AGACAGAGCACTTTTCATTA   2830
  329436   16   3131   TGAGGCACCAAATTCCAGAG   3150
  329437   16   3289   CATTTAATGGCAACATTGTC   3308
  329438   16   4006   GCATCCTTCTCAAGGAAAGA   4025
  329439   16   4252   TCCTTAGCATTAGGTGCTTC   4271
  329440   16   4823   GTCAAGTGAAAGAACCTCAC   4842
  329441   16   5275   CCAGCACGGGCTCTATAATA   5294
  329442   16   5329   CCAACAGTTTTATTACTGTA   5348
  329443   16   5467   ATCACAGCTTCTACACCCGT   5486
  329444   16   5624   GAATGTACCTTGCTGTAATT   5643
  329445   16   5634   TCGCACATAAGAATGTACCT   5653
  329446   16   5995   GTCATTTGATTTAAATCATC   6014
  329447   16   6462   CCACATAAGCAGCCATAAGA   6481
  329448   16   6600   CTAAGAATGGTTTGACATAA   6619
  329449   16   6975   TAAGATACAATTCTCTAACG   6994
  329450   16   7009   TCACAGAAATCCATAGTAGT   7028
  329451   16   7146   AAACCCACTCAGCGGCCAGA   7165
  329452   16   7522   TTGAGACAATTCCAATTGTG   7541
  329453   16   7952   GGTGTCGACATAAGCATCAA   7971
  329454   16   8006   TGTAGCAACAAGTGCCTTAA   8025
  329455   16   8570   TGTGTAACCATCATGGATTG   8589
  329456   16   8578   ATTTCATTTGTGTAACCATC   8597
  329457   16   9091   GTTACTACTCTAACAQAACC   9110
  329458   16   9132   TTTCGCATGTACCATGTCTA   9151
  329459   16   9365   TCTGAATTTCATAAAGTAGT   9384
  329460   16   9875   TAGAGCCTTTGCTAAGTGGC   9894
  329461   16   9918   GTGGTTGGTAGAGAACATCA   9937
  329462   16   9989   AACTTTGCCTGACGGGAATG   10008
  329463   16   10446   CCATATGATGCATATAGCAG   10465
  329464   16   10777   ATACCATTCTGCAGCAGCTC   10796
  329465   16   11187   CAGACAAGCTAGTGTCAGCC   11206
  329466   16   11494   CACTGTAAGGTGTTGCCAGT   11513
  329467   16   11963   CATTTCCTCGCACAACCTAT   11982
  329468   16   11988   CCTGAAGAGTAGCACGGTTA   12007
  329469   16   12254   TGTTTGCATAGCACTAGTTA   12273
  329470   16   12435   CATATGTAAAGGTGTTACCA   12454
  329471   16   13159   TGGCATCTACAATACAGACA   13178
  329472   16   13176   GATTTGGATGGTCAATGTGG   13195
  329473   16   13223   GGTAGGTATTTGGACGTACT   13242
  329474   16   13608   TTAACCAAGTTATAAATAGT   13627
  329475   16   13978   CCCATTAAGATCCTGATTAT   13997
  329476   16   14039   CCACAATAGGAACTCCGCAG   14058
  329477   16   14239   ACAGTTAATACAATTGGGAT   14258
  329478   16   14705   GATAATAGTCATAATCACTG   14724
  329479   16   14828   GATTGTTAACGATTACTTGG   14847
  329480   16   14976   GCATACTTAAGATTCATTTG   14995
  329481   16   15065   TCAATAATTTCTGATGAAAC   15084
  329482   16   15401   AAGCAGTTGTAGCATCACCG   15420
  329483   16   15725   CCTCAGACATGAACACATTA   15744
  329484   16   15817   CACGTAATCATCTCCTTGTT   15836
  329485   16   15885   GTTTTGACAATATCATCGAC   15904
  329486   16   16634   CCCATGAAAGATGCAATTCT   16653
  329487   16   16869   TAGTGCTCTTGTGGCACTAG   16888
  329488   16   17309   CACGAAGTCTAGCATTGACA   17328
  329489   16   17719   AGGCAATCCTAAGATTTTTG   17738
  329490   16   17749   AGAACCCTGTGATGAATCAA   17768
  329491   16   18401   CTTTATACATGAGTGGTATA   18420
  329492   16   18429   TTAATACGCACTACATTCCA   18448
  329493   16   18507   TCAAAGCCATGCGCCCAAAG   18526
  329494   16   18925   ATGAAGAACTGGAAACTTAT   18944
  329495   16   19520   AACTCTGTAACCTGGTAAAT   19539
  329496   16   19532   CCACATTTTCTAAACTCTGT   19551
  329497   16   20753   CTCTCATGTTGTAGGGTACA   20772
  329498   16   21032   TTTGCTTTATAAATCCACAC   21051
  329499   16   21353   TTTGATTCTCCTTAAGAGAC   21372
  329500   16   22147   ATTTGTAATGTTAATACCAA   22166
  329501   16   22992   CCACAAACCGTGGCCGGTGC   23011
  329502   16   23069   ACACACCAGTACCAGTGAGT   23088
  329503   16   23507   CAGCACCTAAAGACATAGTA   23526
  329504   16   23829   GGGTCAGGTAATATTTGTGA   23848
  329505   16   24421   GGTTTGAAGOCTTTGAAGTC   24440
  329506   16   24871   GAAGTACTTGTCCAGCTCTT   24890
  329507   16   25466   TGGAAGCCCTTATAAAGGGC   25485
  329508   16   25880   GACTCAAGCTGGTAGTAAAC   25899
  329509   16   25899   GTCTGTAGTAATTTGTGTAG   25918
  329510   16   26389   ACGGTAATAGTACCGTTGTC   26408
  329511   16   26433   CTATTACTAGGTTCCATTGT   26452
  329512   16   26482   TTAGAATAGGCAAATTGTAG   26501
  329513   16   26781   CAATGACAAGTTCACTTTCC   26800
  329514   16   27130   CGTCAAGATTCCAAATAGCA   27149
  329515   16   27266   TCAATGTCAGGAAGAGAATA   27285
  329516   16   27406   TAGTGCAAATTTATTGTCAG   27425
  329517   16   27501   ATGAAAAGTTTTGGTGAAAC   27520
  329518   16   27538   TGGCGAGTAGAGCTCTTGTT   27557
  329519   16   27894   CAAAGCCAAGCAGTGCTATA   27913
  329520   16   28161   CAGTTGAATCTGTGGGTCCA   28180
  329521   16   29109   CATCCAATTTAATGGCTCCA   29128
  329522   16   29468   CTTGTGCTGTTTAGTTACGA   29487
  329523   16   29504   AAGATTGCTATGTGAGATTA   29523
  329524   16   13377   ACACCGCAAACCCGTTTAAA   13396
  329525   16   13385   CTGCACTTACACCGCAAACC   13404
  329526   16   13392   AGACGGGCTGCACTTACACC   13411
  329527   16   13396   TGTAAGACGGGCTGCACTTA   13415
  329528   16   13426   GACATCAGTACTAGTGCCTG   13445
  329529   16   13445   TATCAAAAGCCCTGTAGACG   13464
  329530   16   13452   TTGTAAATATCAAAAGCCCT   13471
  329531   16   45   TTTTAAAGTTCGTTTAGAGA   64
  329532   16   21464   TAAACATGTTCGTTTAGTTG   21483
  329533   16   25238   TCCATAAGTTCGTTTATGTG   25257
  329534   16   26087   TACATAAGTTCGTACTCACT   26106
  329535   16   26326   ATAGTTAGTTCGTTTAGACC   26345
  329536   16   26891   AGAAAGCGTTCGTGATGTAG   26910
  329537   16   27245   TTTTCATGTTCGTTTTATGG   27264
  329538   16   27751   GTTTCATGTTCGTTTAGACT   27770
  329539   16   28084   TTAATTTGTTCGTTTATTTA   28103
  348236   29752   2   GGGTAGGTAAAAACCTAATA   29833
  348468   29752   257   AAGGCTCTCCATCTTACCTT   261
  348469   29752   21484   GAAAATAAACATGTTCGTTT   21488
  348470   29752   25260   AAACAAATCCATAAGTTCGT   25264
  348471   29752   25681   AGTTGGCATCATAAAGTAAT   25685
  348472   29752   26109   GAATGAGTACATAAGTTCGT   26113
  348473   29752   26390   GTTGTCTGCCATGATAAGCA   26394
  348474   29752   27066   AAGATGAAACATCTGTTGTC   27070
  348475   29752   27265   AATAATTTTCATGTTCGTTT   27269
  348476   29752   28112   ATTATCAGACATTTTAATTT   28116
  348477   29752   28122   ATTGGGGTCCATTATCAGAC   28126
  348478   29752   248   CATCTTACCTTTCGGTCACA   252
  348479   29752   21475   CATGTTCGTTTAGTTGTTAA   21479
  348480   29752   25251   CATAAGTTCGTTTATGTGTA   25255
  348481   29752   25672   CATAAAGTAATGGGTTCTTG   25676
  348482   29752   26100   CATAAGTTCGTACTCACTTT   26104
  348483   29752   26381   CATGATAAGCAATGTTAAAG   26385
  348484   29752   27057   CATCTGTTGTCACTTACTGT   27061
  348485   29752   27256   CATGTTCGTTTTATGGATAA   27260
  348486   29752   28103   CATTTTAATTTGTTCGTTTA   28107
  348487   29752   28113   CATTATCAGACATTTTAATT   28117
  348488   29752   235   GGTCACACCCGGACGAAACC   239
  348489   29752   21462   TTGTTAACAAGAATATCACT   21466
  348490   29752   25238   ATGTGTAATGTAATTTGACA   25242
  348491   29752   25659   GTTCTTGGATTTGCACTTCC   25663
  348492   29752   26087   TCACTTTCTTGTGCTTACAA   26091
  348493   29752   26368   GTTAAAGTTCCAAACAGAAT   26372
  348494   29752   27044   TTACTGTACTAGCAAAGCAA   27048
  348495   29752   27243   TGGATAATCTAACTCCATAG   27247
  348496   29752   28090   TCGTTTATTTAAAACAACAA   28094
  348497   29752   28100   TTTAATTTGTTCGTTTATTT   28104
表4中显示了靶向SARS的另一系列化合物。“靶位点”指具体靶序列中与化合物结合的最初(5′-端)几个核苷酸。表4中的所有化合物都由2′-O-甲氧基乙基核苷酸，也称为2′-MOE组成。整个寡核苷酸中，核苷间(骨架)连接是磷酸二酯(P＝O)连接。所有胞苷残基都是5-甲基胞苷。
                               表4
            靶向SARS的均一的2′-MOE磷酸二酯寡核苷酸
ISIS编号   靶SEQ IDNO 靶 序列(5′至3′) SEQ ID NO
  329720   16   13377   ACACCGCAAACCCGTTTAAA   13396
  329721   16   13385   CTGCACTTACACCGCAAACC   13404
  329722   16   13392   AGACGGGCTGCACTTACACC   13411
  329724   16   13396   TGTAAGACGGGCTGCACTTA   13415
  329727   16   13426   GACATCAGTACTAGTGCCTG   13445
  329729   16   13445   TATCAAAAGCCCTGTAGACG   13464
  329731   16   13452   TTGTAAATATCAAAAGCCCT   13471
  332768   29752   13418   AGACGGGCT   29834
  334923   29752   13378   AAACGTTGATGCATC   29835
  334924   29752   13379   AAAACGTTGATGCAT   29836
  334925   29752   13380   AAAAACGTTGATGCA   29837
  334926   29752   13381   TAAAAACGTTGATGC   29838
  334927   29752   13382   TTAAAAACGTTGATG   29839
  334928   29752   13383   TTTAAAAACGTTGAT   29840
  334929   29752   13384   GTTTAAAAACGTTGA   29841
  334930   29752   13385   CGTTTAAAAACGTTG   29842
  334931   29752   13386   CCGTTTAAAAACGTT   29843
  334932   29752   13387   CCCGTTTAAAAACGT   29844
  334933   29752   13388   ACCCGTTTAAAAACG   29845
  334934   29752   13389   AACCCGTTTAAAAAC   29846
  334935   29752   13390   AAACCCGTTTAAAAA   29847
  334936   29752   13391   CAAACCCGTTTAAAA   29848
  334937   29752   13392   GCAAACCCGTTTAAA   29849
  334938   29752   13393   CGCAAACCCGTTTAA   29850
  334939   29752   13394   CCGCAAACCCGTTTA   29851
  334940   29752   13395   ACCGCAAACCCGTTT   29852
  334941   29752   13396   CACCGCAAACCCGTT   29853
  334942   29752   13397   ACACCGCAAACCCGT   29854
  334943   29752   13398   TACACCGCAAACCCG   29855
  334944   29752   13399   TTACACCGCAAACCC   29856
  334945   29752   13400   CTTACACCGCAAACC   29857
  334946   29752   13401   ACTTACACCGCAAAC   29858
  334947   29752   13402   CACTTACACCGCAAA   29859
  334948   29752   13403   GCACTTACACCGCAA   29860
  334949   29752   13404   TGCACTTACACCGCA   29861
  334950   29752   13405   CTGCACTTACACCGC   29862
  334951   29752   13406   GCTGCACTTACACCG   29863
  334952   29752   13407   GGCTGCACTTACACC   29864
  334953   29752   13408   GGGCTGCACTTACAC   29865
  334954   29752   13409   CGGGCTGCACTTACA   29866
  334955   29752   13410   ACGGGCTGCACTTAC   29867
  334956   29752   13411   GACGGGCTGCACTTA   29868
  334957   29752   13412   AGACGGGCTGCACTT   29869
  334958   29752   13413   AAGACGGGCTGCACT   29870
  334959   29752   13414   TAAGACGGGCTGCAC   29871
  334960   29752   13415   GTAAGACGGGCTGCA   29872
  334961   29752   13416   TGTAAGACGGGCTGC   29873
  334962   29752   13417   GTGTAAGACGGGCTG   29874
  334963   29752   13418   GGTGTAAGACGGGCT   29875
  334964   29752   13419   CGGTGTAAGACGGGC   29876
  334965   29752   13420   ACGGTGTAAGACGGG   29877
  334966   29752   13421   CACGGTGTAAGACGG   29878
  334967   29752   13422   GCACGGTGTAAGACG   29879
  334968，   29752   13423   CGCACGGTGTAAGAC   29880
  334969   29752   13424   CCGCACGGTGTAAGA   29881
  334970   29752   13425   GCCGCACGGTGTAAG   29882
  334971   29752   13426   TGCCGCACGGTGTAA   29883
  334972   29752   13427   GTGCCGCACGGTGTA   29884
  334973   29752   13428   TGTGCCGCACGGTGT   29885
  334974   29752   13429   CTGTGCCGCACGGTG   29886
  334975   29752   13430   CCTGTGCCGCACGGT   29887
  334976   29752   13431   GCCTGTGCCGCACGG   29888
  334977   29752   13432   TGCCTGTGCCGCACG   29889
  334978   29752   13433   GTGCCTGTGCCGCAC   29890
  334979   29752   13434   AGTGCCTGTGCCGCA   29891
  334980   29752   13435   TAGTGCCTGTGCCGC   29892
  334981   29752   13436   CTAGTGCCTGTGCCG   29893
  334982   29752   13437   ACTAGTGCCTGTGCC   29894
  334983   29752   13438   TACTAGTGCCTGTGC   29895
  334984   29752   13439   GTACTAGTGCCTGTG   29896
  334985   29752   13440   AGTACTAGTGCCTGT   29897
  334986   29752   13441   CAGTACTAGTGCCTG   29898
  334987   29752   13442   TCAGTACTAGTGCCT   29899
  334988   29752   13443   ATCAGTACTAGTGCC   29900
  334989   29752   13444   CATCAGTACTAGTGC   29901
  334990   29752   13445   ACATCAGTACTAGTG   29902
  334991   29752   13446   GACATCAGTACTAGT   29903
  334992   29752   13447   CGACATCAGTACTAG   29904
  334993   29752   13448   ACGACATCAGTACTA   29905
  334994   29752   13449   GACGACATCAGTACT   29906
  334995   29752   13450   AGACGACATCAGTAC   29907
  334996   29752   13451   TAGACGACATCAGTA   29908
  334997   29752   13452   GTAGACGACATCAGT   29909
  334998   29752   13453   TGTAGACGACATCAG   29910
  334999   29752   13454   CTGTAGACGACATCA   29911
  335000   29752   13455   CCTGTAGACGACATC   29912
  335001   29752   13456   CCCTGTAGACGACAT   29913
  335002   29752   13457   GCCCTGTAGACGACA   29914
  335003   29752   13458   AGCCCTGTAQACGAC   29915
  335004   29752   13459   AAGCCCTGTAGACGA   29916
  335005   29752   13460   AAAGCCCTGTAGACG   29917
  335006   29752   13461   AAAAGCCCTGTAGAC   29918
  335007   29752   13462   CAAAAGCCCTGTAGA   29919
  335008   29752   13463   TCAAAAGCCCTGTAG   29920
  335009   29752   13464   ATCAAAAGCCCTGTA   29921
  335010   29752   13465   TATCAAAAGCCCTGT   29922
  335011   29752   13466   ATATCAAAAGCCCTG   29923
  335012   29752   13467   AATATCAAAAGCCCT   29924
  335013   29752   13468   AAATATCAAAAGCCC   29925
  335014   29752   13469   TAAATATCAAAAGCC   29926
  335015   29752   13470   GTAAATATCAAAAGC   29927
  335016   29752   13471   TGTAAATATCAAAAG   29928
  335017   29752   13472   TTGTAAATATCAAAA   29929
  335018   29752   13473   GTTGTAAATATCAAA   29930
  335019   29752   13474   CGTTGTAAATATCAA   29931
  335020   29752   13475   TCGTTGTAAATATCA   29932
  335021   29752   13476   TTCGTTGTAAATATC   29933
  339281   29752   13448   TGTAGACGACATCAGTACTA   13452
  339282   29752   13449   CTGTAGACGACATCAGTACT   13453
  339283   29752   13450   CCTGTAGACGACATCAGTAC   13454
  339284   29752   13451   CCCTGTAGACGACATCAGTA   13455
  339285   29752   13452   GCCCTGTAGACGACATCAGT   13456
  339286   29752   13453   AGCCCTGTAGACGACATCAG   13457
  339287   29752   13454   AAGCCCTGTAGACGACATCA   13458
  339288   29752   13455   AAAGCCCTGTAGACGACATC   13459
  339289   29752   13456   AAAAGCCCTGTAGACGACAT   13460
  339290   29752   13457   CAAAAGCCCTGTAGACGACA   13461
  339291   29752   13458   TCAAAAGCCCTGTAGACGAC   13462
  339292   29752   13459   ATCAAAAGCCCTGTAGACGA   13463
  339293   29752   13461   ATATCAAAAGCCCTGTAGAC   13465
  339294   29752   13462   AATATCAAAAGCCCTGTAGA   13466
  339295   29752   13463   AAATATCAAAAGCCCTGTAG   13467
  339296   29752   13464   TAAATATCAAAAGCCCTGTA   13468
  339297   29752   13465   GTAAATATCAAAAGCCCTGT   13469
  339298   29752   13466   TGTAAATATCAAAAGCCCTG   13470
ISIS 329733也是一个具有磷酸二酯骨架的均一的2′-MOE寡核苷酸(AGTAGGGCT，本文纳入为SEQ ID NO：29934)，将其设计为靶向Genbank编号为NC_004718.1(SEQ ID NO：16)的序列的位点13398。该9-mer模拟了茎2的一侧和部分茎1，并将其设计为通过结合到茎2和茎1上的同轴堆积核苷酸来破坏假结，因此，并不与靶序列上连续臂反义。
表5中显示了靶向SARS的另一系列化合物。“靶位点”指具体靶序列中与化合物结合的最初(5′-端)几个核苷酸。表5中的所有化合物都由2′-O-甲氧基乙基核苷酸，也称为2′-MOE组成。整个寡核苷酸中，核苷间(骨架)连接是硫代磷酸(P＝S)连接。所有胞苷残基都是5-甲基胞苷。
                                       表5
                   靶向SARS的均一的2′-MOE硫代磷酸寡核苷酸
  ISIS编号  靶SEQ ID NO   靶   序列(5′至3′)  SEQ ID NO
  329540   16   1   GGTTGGCTTTTCCTGGGTAG   20
  329541   16   2   TGGTTGGCTTTTCCTGGGTA   21
  329542   29737   1   GGTAGGTAAAAACCTAATAT   29831
  329543   29739   1   TGGTTGCGAAAATAAAGGGG   29832
  329545   29739   13377   ACACCGCAAACCCGTTTAAA   29833
  329546   16   13385   CTGCACTTACACCGCAAACC   13396
  329547   16   13392   AGACGGGCTGCACTTACACC   13404
  329548   16   13396   TGTAAGACGGGCTGCACTTA   13411
  329549   16   13426   GACATCAGTACTAGTGCCTG   13415
  329550   16   13445   TATCAAAAGCCCTGTAGACG   13445
  329551   16   13452   TTGTAAATATCAAAAGCCCT   13464
  329552   16   45   TTTTAAAGTTCGTTTAGAGA   13471
  329553   16   21464   TAAACATGTTCGTTTAGTTG   64
  329554   16   25238   TCCATAAGTTCGTTTATGTG   21483
  329555   16   26087   TACATAAGTTCGTACTCACT   25257
  329556   16   26326   ATAGTTAGTTCGTTTAGACC   26106
  329557   16   26891   AGAAAGCGTTCGTGATGTAG   26345
  329558   16   27245   TTTTCATGTTCGTTTTATGG   26910
  329559   16   27751   GTTTCATGTTCGTTTAGACT   27264
  329560   16   28084   TTAATTTGTTCGTTTATTTA   27770
  330674   16   53   GTTCGTTTAGAGAACAGATC   28103
  332767   29751   13418   AGACGGGCT   57
  348237   29752   2   GGGTAGGTAAAAACCTAATA   58
  348240   29752   3   TGGGTAGGTAAAAACCTAAT   29833
  348241   29752   4   CTGGGTAGGTAAAAACCTAA   29834
  348242   29752   5   CCTGGGTAGGTAAAAACCTA   29835
  348243   29752   6   TCCTGGGTAGGTAAAAACCT   29836
  348244   29752   7   TTCCTGGGTAGGTAAAAACC   29837
  348245   29752   8   TTTCCTGGGTAGGTAAAAAC   29838
  348246   29752   9   TTTTCCTGGGTAGGTAAAAA   29839
  348247   29752   10   CTTTTCCTGGGTAGGTAAAA   29840
  348248   29752   11   GCTTTTCCTGGGTAGGTAAA   29841
  348249   29752   12   GGCTTTTCCTGGGTAGGTAA   29842
  348250   29752   13   TGGCTTTTCCTGGGTAGGTA   29843
  348251   29752   14   TTGGCTTTTCCTGGGTAGGT   29844
  348252   29752   15   GTTGGCTTTTCCTGGGTAGG   29845
  348253   29752   18   TTGGTTGGCTTTTCCTGGGT   29846
  348254   29752   19   GTTGGTTGGCTTTTCCTGGG   22
  348255   29752   20   GGTTGGTTGGCTTTTCCTGG   23
  348256   29752   22   GAGGTTGGTTGGCTTTTCCT   24
  348257   29752   24   TCGAGGTTGGTTGGCTTTTC   26
  348258   29752   26   GATCGAGGTTGGTTGGCTTT   28
  348259   29752   30   AAGAGATCGAGGTTGGTTGG   30
  348260   29752   32   ACAAGAGATCGAGGTTGGTT   34
  348261   29752   34   CTACAAGAGATCGAGGTTGG   36
  348262   29752   36   ATCTACAAGAGATCGAGGTT   38
  348263   29752   38   AGATCTACAAGAGATCGAGG   40
  348264   29752   40   ACAGATCTACAAGAGATCGA   42
  348265   29752   42   GAACAGATCTACAAGAGATC   44
  348266   29752   44   GAGAACAGATCTACAAGAGA   46
  348267   29752   46   TAGAGAACAGATCTACAAGA   48
  348268   29752   48   TTTAGAGAACAGATCTACAA   50
  348269   29752   50   CGTTTAGAGAACAGATCTAC   52
  348270   29752   52   TTCGTTTAGAGAACAGATCT   54
  348271   29752   54   AGTTCGTTTAGAGAACAGAT   56
  348528   29752   257   AAGGCTCTCCATCTTACCTT   58
  348529   29752   21484   GAAAATAAACATGTTCGTTT   261
  348530   29752   25260   AAACAAATCCATAAGTTCGT   21488
  348531   29752   25681   AGTTGGCATCATAAAGTAAT   25264
  348532   29752   26109   GAATGAGTACATAAGTTCGT   25685
  348533   29752   26390   GTTGTCTGCCATGATAAGCA   26113
  348534   29752   27066   AAGATGAAACATCTGTTGTC   26394
  348535   29752   27265   AATAATTTTCATGTTCGTTT   27070
  348536   29752   28112   ATTATCAGACATTTTAATTT   27269
  348537   29752   28122   ATTGGGGTCCATTATCAGAC   28116
  348538   29752   248   CATCTTACCTTTCGGTCACA   28126
  348539   29752   21475   CATGTTCGTTTAGTTGTTAA   252
  348540   29752   25251   CATAAGTTCGTTTATGTGTA   21479
  348541   29752   25672   CATAAAGTAATGGGTTCTTG   25255
  348542   29752   26100   CATAAGTTCGTACTCACTTT   25676
  348543   29752   26381   CATGATAAGCAATGTTAAAG   26104
  348544   29752   27057   CATCTGTTGTCACTTACTGT   26385
  348545   29752   27256   CATGTTCGTTTTATGGATAA   27061
  348546   29752   28103   CATTTTAATTTGTTCGTTTA   27260
  348547   29752   28113   CATTATCAGACATTTTAATT   28107
  348548   29752   235   GGTCACACCCGGACGAAACC   28117
  348549   29752   21462   TTGTTAACAAGAATATCACT   239
  348550   29752   25238   ATGTGTAATGTAATTTGACA   21466
  348551   29752   25659   GTTCTTGGATTTGCACTTCC   25242
  348552   29752   26087   TCACTTTCTTGTGCTTACAA   25663
  348553   29752   26368   GTTAAAGTTCCAAACAGAAT   26091
  348554   29752   27044   TTACTGTACTAGCAAAGCAA   26372
  348555   29752   27243   TGGATAATCTAACTCCATAG   27048
  348556   29752   28090   TCGTTTATTTAAAACAACAA   27247
  348557   29752   28100   TTTAATTTGTTCGTTTATTT   28094
329544 29752 1   ATGATGTTGAGCTGGTTGCGAAAATAAAGGGG 28104
ISIS 329591也是一个具有硫代磷酸骨架的均一的2′-MOE寡核苷酸(AGTAGGGCT，本文纳入为SEQ ID NO：29934)，将其设计为靶向Genbank编号为NC_004718.1(SEQ ID NO：16)的序列的位点13398。该9-mer模拟了茎2的一侧和部分茎1，并将其设计为通过结合到茎2和茎1上的同轴堆积核苷酸来破坏假结，因此，并不与靶序列上连续臂反义。
表6中显示了靶向SARS的另一系列化合物。“靶位点”指具体靶序列中与化合物结合的最初(5′-端)几个核苷酸。表6中的所有化合物都是LNA。整个寡核苷酸中，核苷间(骨架)连接是磷酸二酯(P＝O)连接。所有胞苷残基都是5-甲基胞苷。
                                  表6
                       靶向SARS的LNA寡核苷酸
ISIS编号   靶SEQ IDNO 靶位点 序列(5′至3′) SEQ ID NO
  339335   29752   13453   TGTAGACGACATCAG   29949
  339336   29752   13456   CCCTGTAGACGACAT   29950
可以设计本文揭示的寡核苷酸，使其用于靶向SARS Co-V的具体特征或结构属性。ISIS 329410至ISIS 329419这一系列寡核苷酸靶向SARS和至少一种其它冠状病毒之间保守的位点。ISIS 329424至ISIS 329523这一系列寡核苷酸随机靶向SARS变体中保守的选择位点。ISIS 329420至ISIS 329423和ISIS 329540至ISIS 329544靶向至少一个全长变体的正义链的5′末端。ISIS 329524至ISIS 329530、ISIS 329545至ISIS 329551、ISIS 329720至ISIS 329722、ISIS 329724、ISIS 329727、ISIS 329729和ISIS 329731靶向假结内或假结附近的位点。ISIS 332767和ISIS 332768是靶向假结的茎1和茎2末端的9-mers。ISIS 329531至ISIS 329539和ISIS 329552至ISIS329560靶向可能的引物结合位点。设计ISIS 330674以防止前导区通过靶向前导序列的3′末端杂交。
ISIS 329591(AGTAGGGCT，本文纳入为SEQ ID NO：29934)是具有硫代磷酸骨架的均一的2′-MOE寡核苷酸；ISIS 329733是具有磷酸二酯骨架的2′-MOE寡核苷酸(AGTAGGGCT，SEQ ID NO：29934)；将其设计为靶向Genbank编号为NC_004718.1(SEQ ID NO：16)的序列的位点13398。该9-mer模拟了茎2的一侧和部分茎1，并将其设计为通过结合到茎2的一侧和茎1上的同轴堆积核苷酸来破坏假结。
实施例19：靶向SARS Co-V的RNA/DNA双链体
根据本发明，将一系列含有本发明反义化合物及其补体的核酸双链体设计为靶向SARS的siRNA。通过加入一种或多种核碱基修饰链末端，形成突出端。然后设计并合成dsRNA的正义链，使其与反义链互补，也包含3′-末端。因此，dsRNA双链体的两条链在中心核碱基上互补，各链在其一端或两端有突出端。
例如，反义链具有序列CGAGAGGCGGACGGGACCG(SEQ ID NO：1)和脱氧胸腺嘧啶核苷的2核碱基突出端，包含该反义链的双链体应具有下述结构：
              cgagaggcggacgggaccgTT       反义链(SEQ ID NO：2)
              |||||||||||||||||||
            TTgctctccgcctgccctggc         互补链(SEQ ID NO：3)
一旦合成，就退火互补链。表7中显示了靶向SARS的双链体化合物。各反义寡核苷酸后面紧接着它的补体。“靶位点”指具体靶序列中与化合物的反义链结合的最初(5′-端)几个核苷酸。表7中的所有反义化合物及其补体都是包含核糖核苷酸组成的中心区的寡核苷酸，3′端接有22’-脱氧核糖核苷酸(粗体显示)。整个反义寡核苷酸和双链体的互补序列中，核苷间(骨架)连接是磷酸二酯(P＝O)连接。
                                表7
              靶向SARS的带有3′-突出端的全长寡核苷酸双链体
ISIS编号 链 靶SEQ ID NO   靶位点 序列(5′至3′) SEQ ID NO
  329608329598   反义链互补链   1616   190190   UGAUGAUCGACUGCAACACGGGUGUUGCAGUCGAUCAUCAGC   2995129952
  329609329599   反义链互补链   1616   27322732   GAACUUCCCAAACAGUAUCTTGAUACTGUUUGGGAAGUUCAA   2995329954
  329610329600   反义链互补链   1616   56225622   AAUGUACCUUGCUGUAAUUTAAAUUACAGCAAGGUACAUUCT   2995529956
  329611329601   反义链互补链   1616   80048004   GUAGCAACAAGUGCCUUAAGTUUAAGGCACUUGUUGCUACAG   2995729958
  329612329602   反义链互补链   1616   1077510775   UACCAUUCUGCAGCAGCUCTTGAGCUGCUGCAGAAUGGUATG   2995929960
  329613329603   反义链互补链   1616   1360613606   UAACCAAGUUAUAAAUAGUCTACUAUUUAUAACUUGGUUAAA   2996129962
  329614329604   反义链互补链   1616   1771717717   GGCAAUCCUAAGAUUUUUGAACAAAAAUCUUAGGAUUGCCTA   2996329964
  329615329605   反义链互补链   1616   2135121351   UUGAUUCUCCUUAAGAGACATGUCUCUUAAGGAGAAUCAAAT   2996529966
  329616329606   反义链互补链   1616   2589725897   UCUGUAGUAAUUUGUGUAGACCUACACAAAUUACUACAGACA   2996729968
  329617329607   反义链互补链   1616   2789227892   AAAGCCAAGCAGUGCUAUAAGUAUAGCACUGCUUGGCUUUGT   2996929970
表7中揭示的siRNA双链体随机靶向在SARS变体中保守的选择位点
实施例20：用与SARS-CoV反义链互补的寡核苷酸反义抑制病毒
表8中显示了靶向SARS的化合物。“靶位点”指具体靶序列中与化合物结合的最初(5′-端)几个核苷酸。表8中的所有化合物都是长度为20个寡核苷酸的嵌合寡核苷酸(“gapmers”)，包含一个由10个2′-脱氧核苷酸组成的中央“缺口”区，它通过两侧(5′和3′方向)的5核苷酸“翼”与靶相连接。翼由称为2′-MOE的2′-O-甲氧基乙基核苷酸组成。整个寡核苷酸中，核苷间(骨架)连接是硫代磷酸(P＝S)连接。所有胞苷残基都是5-甲基胞苷。
                               表8
                   靶向SARS的嵌合硫代磷酸寡核苷酸
  ISIS编号  靶SEQ ID NO   靶位点   序列(5′至3′)  SEQ ID NO
  329561   16   192   GTGTTGCAGTCGATCATCAG   29971
  329562   16   1753   ATTGTTGAGTCCTGCGGTAA   29972
  329563   16   2734   GATACTGTTTGGGAAGTTCA   29973
  329564   16   4252   GAAGCACCTAATGCTAAGGA   29974
  329565   16   5624   AATTACAGCAAGGTACATTC   29975
  329566   16   6975   CGTTAGAGAATTGTATCTTA   29976
  329567   16   8006   TTAAGGCACTTGTTGCTACA   29977
  329568   16   9132   TAGACATGGTACATGCGAAA   29978
  329569   16   10777   GAGCTGCTGCAGAATGGTAT   29979
  329570   16   12254   TAACTAGTGCTATGCAAACA   29980
  329571   16   13608   ACTATTTATAACTTGGTTAA   29981
  329572   16   15817   AACAAGGAGATGATTACGTG   29982
  329573   16   17719   CAAAAATCTTAGGATTGCCT   29983
  329574   16   18925   ATAAGTTTCCAGTTCTTCAT   29984
  329575   16   21353   GTCTCTTAAGGAGAATCAAA   29985
  329576   16   23829   TCACAAATATTACCTGACCC   29986
  329577   16   25899   CTACACAAATTACTACAGAC   29987
  329578   16   27130   TGCTATTTGGAATCTTGACG   29988
  329579   16   27894   TATAGCACTGCTTGGCTTTG   29989
  329580   16   29504   TAATCTCACATAGCAATCTT   29990
  330481   16   45   TCTCTAAACGAACTTTAAAA   29991
  330482   16   21464   CAACTAAACGAACATGTTTA   29992
  330483   16   25238   CACATAAACGAACTTATGGA   29993
  330484   16   26087   AGTGAGTACGAACTTATGTA   29994
  330485   16   26326   GGTCTAAACGAACTAACTAT   29995
  330486   16   26891   CTACATCACGAACGCTTTCT   29996
  330487   16   27245   CCATAAAACGAACATGAAAA   29997
  330488   16   27751   AGTCTAAACGAACATGAAAC   29998
  330489   16   28084   TAAATAAACGAACAAATTAA   29999
表9中显示了靶向SARS的另一系列化合物。“靶位点”指具体靶序列中与化合物结合的最初(5′-端)几个核苷酸。表9中的所有化合物都由2′-O-甲氧基乙基核苷酸，也称为2′-MOE组成。整个寡核苷酸中，核苷间(骨架)连接是磷酸二酯(P＝O)连接。所有胞苷残基都是5-甲基胞苷。
                                   表9
                     靶向SARS的均一的2′-MOE磷酸二酯寡核苷酸
  ISIS编号 靶SEQ ID NO  靶位点   序列(5′至3′)  SEQ ID NO
  329581   29752   16   CTACCCAGGAAAAGCCAACC   30000
  329582   29752   17   TACCCAGGAAAAGCCAACCA   30001
  329583   29737   1   ATATTAGGTTTTTACCTACC   30002
  329584   29739   1   CCCCTTTATTTTCGCAACCA   30003
  329585   29739   1   CCCCTTTATTTTCGCAACCAGCTCAACATCAT   30004
  330490   16   45   TCTCTAAACGAACTTTAAAA   30005
  330491   16   21464   CAACTAAACGAACATGTTTA   30006
  330492   16   25238   CACATAAACGAACTTATGGA   30007
  330493   16   26087   AGTGAGTACGAACTTATGTA   30008
  330494   16   26326   GGTCTAAACGAACTAACTAT   30009
  330495   16   26891   CTACATCACGAACGCTTTCT   30010
  330496   16   27245   CCATAAAACGAACATGAAAA   30011
  330497   16   27751   AGTCTAAACGAACATGAAAC   30012
  330498   16   28084   TAAATAAACGAACAAATTAA   30013
可以设计本文揭示的寡核苷酸，使其用于靶向SARS Co-V的具体特征或结构属性。ISIS 329561至ISIS 329580这一系列寡核苷酸随机靶向SARS变体中保守的选择位点。ISIS 329581至ISIS 329585这一系列寡核苷酸模拟至少一个全长变体的正义链的5′末端。ISIS 330481至ISIS 330489和ISIS 330490至ISIS 330498靶向可能的引物结合位点。
靶向GenBank编号为AY274119.3(SEQ ID NO：29751)序列的位点1的ISIS330673(ATATTAGGTTTTTACCTACCCAGGAAAAGCCAACCAACCTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAAC，本文纳入为SEQ ID NO：30014)是具有硫代磷酸骨架(P＝S)的均一的2′-MOE寡核苷酸，也是单3’双脱氧核苷酸。该寡核苷酸是带有不可延伸性3’末端的前导序列的72-mer模拟物。
实施例21：用于SARS实验的对照寡核苷酸
表10中列出了用于实验的对照寡核苷酸。
除了具有硫代磷酸(P＝S)骨架的均一的2′-MOE寡核苷酸ISIS 289606、329586和329587，以及具有磷酸二酯(P＝O)骨架的均一的2′-MOE寡核苷酸ISIS 329804之外，表10中的所有对照化合物都是长度为20个核苷酸的“gapmer”，包含一个由10个2′-脱氧核苷酸组成的中央“缺口”区，它通过两侧(5′和3′方向)的5核苷酸的2’-MOE“翼”与靶相连接。gapmer具有硫代磷酸(P＝S)骨架，所有胞苷残基都是5-甲基胞苷。
                  表10
              对照寡核苷酸
  ISIS编号   序列(5′至3′)   SEQ ID NO
  20569   GTGCGCGCGAGCCCGAAA   30015
  29837   TCGATCTCCTTTTATGCCC   30016
  113529   CTCTTACTGTGCTGTGGAC   30017
  114845   TACGTCCGGAGGCGTACG   30018
  122291   TATTCCACGAACGTAGGCT   30019
  129686   CGTTATTAACCTCCGTTGA   30020
  129687   ACAAGCGTCAACCGTATT   30021
  129688   TTCGCGGCTGGACGATTCA   30022
  129689   GAGGTCTCGACTTACCCGC   30023
  129690   TTAGAATACGTCGCGTTAT   30024
  129691   ATGCATACTACGAAAGGC   30025
  129694   GTACAGTTATGCGCGGTA   30026
  129695   TTCTACCTCGCGCGATTTA   30027
  129696   ATTCGCCAGACAACACTG   30028
  129700   TAGTGCGGACCTACCCAC   30029
  141923   CCTTCCCTGAAGGTTCCTC   30030
  289606   CCTTCCCTGAAGGTTCCTC   30031
  329586   GTGCGCGCGAGCCCGAAA   30032
  329587   TAGTGCGGACCTACCCAC   30033
  329804   CCTTCCCTGAAGGTTCCTC   30034
实施例22：靶mRNA在Vero C1008细胞中降低
为了证实用反义寡核苷酸在可以感染SARS的细胞系中抑制靶mRNA表达的可能性，测试了靶向Vero C1008细胞中内源性mRNA PTEN的ISIS 116847(CTGCTAGCCTCTGGATTTGA，本文纳入为SEQ ID NO：30035)抑制表达的能力。PTEN在猴与人之间高度同源，这允许了设计靶向人PTEN序列的ISIS 116847的使用。也测试了靶向人Forkhead框01A(Forkhead)的ISIS 289841(CTAAGCGCTCAATGAACATG，本文纳入为SEQ ID NO：30036)、靶向人MEKK3的ISIS 122976(TTGTCACCTTGTGCTCCACA，本文纳入为SEQ ID NO：30037)和颠倒对照ISIS 129690(TTAGAATACGTCGCGTTATG，本文纳入为SEQ ID NO：30024)。
ISIS 116847、ISIS 289841和ISIS 122976是长度为20个核苷酸的“gapmer”，包含一个由10个2′-脱氧核苷酸组成的中央“缺口”区，它通过两侧(5′和3′方向)的5核苷酸的2’-MOE“翼”与靶相连接。gapmer具有硫代磷酸(P＝S)骨架，所有胞苷残基都是5-甲基胞苷。
另外，测试了设计靶向人PTEN(Dharmacon，Inc.，Lafayette，CO)的siRNA。该siRNA有反义链和互补链组成，包含通过交替的硫代磷酸和磷酸二酯键连接的19个核糖核苷酸，3′端接有22’-脱氧核糖核苷酸(粗体显示)。对于PTEN siRNA，反义链是ISIS 263186(CTGCTAGCCTCTGGATTTGTT，本文纳入为SEQ ID NO：30038)，互补链是ISIS 263187(CAAATCCAGAGGCTAGCAGTT，本文纳入为SEQ IDNO：30039)。也测试了靶向人MEKK3的siRNA。对于MEKK3 siRNA，反义链是ISIS316404(TGTCACCTTGTGCTCCACATC，本文纳入为SEQ ID NO：30040)，互补链是(TGTGGAGCACAAGGTGACAAC，本文纳入为SEQ ID NO：30041)。设计靶向人PTEN的引物探针组是：
正向引物：AATGGCTAAGTGAAGATGACAATCAT(SEQ ID NO：30042)
反向引物：TGCACATATCATTACACCAGTTCGT(SEQ ID NO：30043)
探针：FAM-TTGCAGCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGG-TAMRA(SEQ IDNO：30044)，
其中FAM是荧光报道染料，TAMRA是淬灭染料。
从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)获得非洲绿猴正常肾细胞系VeroC1008(也称为Vero E6)。(Vero C1008是Vero 76的克隆，Vero 76也获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，并可在同样条件下培养)在含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素、调整到含有4毫摩尔L-谷胺酰胺、1.5克/升碳酸氢钠和4.5克/升葡萄糖(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)的DMEM中常规培养VeroC1008细胞。当细胞达到90％铺满时，通过胰酶消化和稀释常规传代，种入96孔板(Falcon-353047)，用于反义寡核苷酸转染。用2.5微克Lipofectin/100纳摩尔寡核苷酸/毫升Opti-MEM转染细胞。也用5微克Lipofectin/100纳摩尔寡核苷酸/毫升Opti-MEM(表中标记为2x)测试siRNA。用Ribogreen测量总RNA。
表11中显示了该实验的结果，表示为相对于未处理对照的抑制百分数。
                 表11
Vero C1008细胞中的PTEN mRNA靶降低
  治疗组   抑制％
  寡核苷酸剂量(纳摩尔)
  25   50   100
  289841   10   15   24
  129690   7   6   8
  116847   74   86   92
  263186+263187   48   48   64
  263186+2631872x   34   54   82
  122976   0   0   10
  si-122976   0   0   0
  si-1229762x   20   0   0
表11中表示的结果显示出靶向PTEN的反义寡核苷酸(ISIS 116847，si-116847)在Vero C1008细胞中以剂量依赖、靶特异性方式成功降低了表达。
类似地，也测定了Vero C1008细胞中Forkhead mRNA的降低。
设计靶向人Forkhead的探针组是
正向引物：TGCATTTCGCTACCCGAGTT(SEQ ID NO：30045)
反向引物：CATCAACATCAGGCACTTCTCAG(SEQ ID NO：30046)
探针：FAM-CAGTGCAGATTCCACGTTCTTGTTCCGATA-TAMRA(SEQ IDNO：30047)，
其中FAM是荧光报道染料，TAMRA是淬灭染料。
表12中显示了结果，表示为相对于未处理对照的抑制百分数。
                            表12
            Vero C1008细胞中的Forkhead mRNA靶降低
  治疗组   抑制％
  寡核苷酸剂量(纳摩尔)
  25   50   100
  289841   32   51   81
  129690   7   15   8
  116847   17   0   22
  263186+263187   33   17   21
  263186+2631872x   10   3   32
  122976   6   0   8
  si-122976   3   8   11
  si-1229762x   42   15   13
表12中表示的结果显示出靶向Forkhead mRNA的ISIS 289841在Vero C1008细胞中以剂量依赖、靶特异性方式成功降低了表达。
实施例23：在Vero 76细胞中用转染试剂方法确定非特异性抑制SARS-CoV和确认SARS感染测定
在76细胞中测试了转染试剂的毒性。而且，测定对照寡核苷酸，用于确定用多伦多2型SARS-CoV毒株感染Vero 76细胞的效率。
所述的步骤提示，我们针对96孔板形式的转染实验，对体积作了优化。可以调整试剂体积，以适应其它细胞培养形式。
将储存的寡核苷酸板拿出置于室温下。将预加热的Opti-MEM(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)加入寡核苷酸板，体积为50微升/孔。摇动板，使寡核苷酸溶解(通常最少需要15分钟)。寡核苷酸转染前45分钟至1小时，将15微升Lipofectin(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)加入2毫升Opi-MEM中，将20微升OligofectAMINE(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)加入2毫升Opti-MEM中，将5微升Cytofectin(Gene Therapy Systems，San Diego，CA)加入2mLOpti-MEM中。将各混合物在室温下孵育30分钟，然后将各混合物以75微升/孔加入含有200纳摩尔寡核苷酸的寡核苷酸板的合适孔中。将寡核苷酸和转染试剂在室温下孵育约15分钟，以进行复杂的形成。
从含有Vero 76细胞的96孔板，该细胞接种密度为～105细胞/毫升中去除培养基。对于该测定，可以在细胞铺满约65-100％时转染细胞。表13中显示了获自在约90-95％铺满时转染的细胞的结果。
将100微升/孔的寡核苷酸/转染试剂/Opti-MEM从寡核苷酸板转移到细胞上。孵育细胞4小时，去除转染试剂，用含血清的生长培养基洗涤细胞一次，然后每孔加入50微升实验培养基(含有2％FBS，L-谷胺酰胺和青霉素/链霉素的IMEM)。在病毒感染前，细胞至少在标准细胞培养条件中恢复两小时。
对于病毒感染，在实验培养基中稀释预先确定滴度的SARS多伦多-2型病毒(2.1×108pfu/毫升)储存液并以0.3至0.5的感染复数加入，或者将50微升/孔的培养基加入孔中。将板在正常细胞培养条件下孵育72小时。用MTS试剂(Cell Titer 96Aqueous One solution，Promega，Madison，WI)对活细胞定量，计算毒性％和致死％。
对实施例20中描述的对照寡核苷酸ISIS 129686、ISIS 129689、ISIS 129690、ISIS129691、ISIS 129694、ISIS 129695、ISIS 129700和ISIS 141923进行了上述实验，测试毒性和效率。表14中显示了结果，表示为毒性％和病毒活性％。毒性指由于转染试剂或寡核苷酸而引起的毒性。病毒活性反应病毒感染细胞的能力，其中大于100％的病毒活性将说明毒力增加，小于100％的病毒活性将说明毒力抑制。病毒对照的病毒活性是84％。
  化合物   转染试剂   毒性％   病毒活性％  SEQ ID NO
129686   Lipofectin   2.4   89 30020
  OligofectAMINE   2.4   92
  Cytofectin   0   93
129689   Lipofectin   3.7   91 30023
  OligofectAMINE   3.1   93
  Cytofectin   3.9   92
129690   Lipofectin   7.4   88 30024
  OligofectAMINE   0.9   92
  Cytofectin   3   93
129691   Lipofectin   8.3   92 30025
  OligofectAMINE   6.7   92
  Cytofectin   9.7   93
129694   Lipofectin   7.7   90 30026
  OligofectAMINE   5.6   91
  Cytofectin   4.6   91
129695   Lipofectin   6.7   91 30027
  OligofectAMINE   6.2   91
  Cytofectin   5.2   92
129700   Lipofectin   6.2   91 30029
  OligofectAMINE   10.5   91
  Cytofectin   8.2   93
141923   Lipofectin   7.7   88 30030
  OligofectAMINE   6   93
  Cytofectin   8.2   93
没有发现本实验所用的任何转染试剂或寡核苷酸具有明显毒性。证明没有测试化合物对SARS多伦多-2毒株有效。因此认为，该实验对所述寡核苷酸/转染试剂系统的使用来说是有效地。将Lipofectin选作后续研究的转染试剂，以3微升Lipofectin/100nM寡核苷酸/1毫升Opti-MEM的比例使用。
实施例24：反义寡核苷酸在Vero 76细胞中抑制SARS活性：MTS测定
在实施例22中描述的测定中用Lipofectin试剂(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)以3微升Lipofectin/100nM寡核苷酸/1毫升Opti-MEM的比例测试了靶向SARS-CoV基因的反义寡核苷酸。
由4块含化合物的板构成实验，各板重复测试，产生总共8块板。各板含有12个阴性对照寡核苷酸：ISIS 129686、129687、129688、129689、129690、129691、129694、129695、141923、289606、329586、329804，表中以粗体表示。实验中包括了5-10-5MOE gapmers，靶向CEACAM1的ISIS 330538(ATAAATTATTTCTGTGGCTG，本文纳入为SEQ ID NO：30048)，和靶向氨肽酶N的ISIS 333040(TTGAGCTTCTTGCTGTGGAT，本文纳入为SEQ ID N0：30049)、ISIS333048(CATGATGTCCCGCACGGTGG，本文纳入为SEQ ID NO：30050)、ISIS 333049(AATAGCCCGTCACATTGAGG，本文纳入为SEQ ID NO：30051)，ISIS 333054(ACCCACTTGATGTTGGCTIT，本文纳入为SEQ ID NO：30052)和ISIS 333057(GCTGTTTTCTGTGAACCACT，本文纳入为SEQ ID NO：30053)。作为对照的是ISIS2922(GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG，本文纳入为SEQ ID NO：30054)，它是设计针对人疱疹病毒5的一种具有硫代磷酸骨架的均一的2′-脱氧核苷酸。数据表示为每个测试反义寡核苷酸的两个O.D.测量结果(Envision微板阅读器，Perkin-Elmer)的平均值。表14的“板”中示明了用于平均各数据点的复板。各板含有下述各对照孔的四个复孔：仅有培养基没有细胞(培养基)、具有培养基和病毒没有细胞(培养基+病毒)、仅有细胞没有病毒或寡核苷酸治疗(细胞对照)以及具有细胞和病毒没有寡核苷酸治疗(病毒对照)。因此，代表这些对照的O.D.是各组复板中8个测量结果的平均值。因为测定的O.D.与培养中的活细胞数量成正比，所以O.D.即表明“病毒活性”，其中O.D.读数与细胞对照接近则说明该治疗抑制了病毒活性，而O.D.读数与病毒对照接近则说明对病毒活性没有影响。
                              表14
反义抑制剂在Vero 76细胞中对SARS活性的影响：MTS测定
  板   治疗(ISIS编号或描述)   病毒活性(O.D.)  SEQ ID NO
  A+B   培养基   0.09   N/A
  A+B   培养基+病毒   0.09   N/A
  A+B   细胞对照   0.87   N/A
  A+B   病毒对照   0.46   N/A
  A+B   129686   0.5   30020
  A+B   129687   0.55   30021
  A+B   129688   0.52   30022
  A+B   129689   0.52   30023
  A+B   129690   0.52   30024
  A+B   129691   0.52   30025
  A+B   129694   0.51   30026
  A+B   129695   0.51   30027
  A+B   141923   0.53   30027
  A+B   289606   0.47   30030
  A+B   329586   0.5   30031
  A+B   329804   0.55   30032
  A+B   329492   0.54   18448
  A+B   329493   0.57   18526
  A+B   329494   0.53   18944
  A+B   329495   0.53   19539
  A+B   329496   0.4   19551
  A+B   329497   0.46   20772
  A+B   329498   0.45   21051
  A+B   329499   0.47   21372
  A+B   329500   0.49   22166
  A+B   329501   0.45   23011
  A+B   329502   0.49   23088
  A+B   329503   0.42   23526
  A+B   329504   0.49   23848
  A+B   329505   0.48   24440
  A+B   329506   0.53   24890
  A+B   329507   0.47   25485
  A+B   329508   0.52   25899
  A+B   329509   0.5   25918
  A+B   329510   0.51   26408
  A+B   329511   0.49   26452
  A+B   329512   0.46   26501
  A+B   329513   0.45   26800
  A+B   329514   0.54   27149
  A+B   329515   0.45   27285
  A+B   329516   0.51   27425
  A+B   329517   0.52   27520
  A+B   329518   0.5   27557
  A+B   329519   0.41   27913
  A+B   329410   0.47   13990
  A+B   329411   0.45   13996
  A+B   329412   0.51   15214
  A+B   329413   0.56   15454
  A+B   329414   0.47   15637
  A+B   329415   0.46   15733
  A+B   329416   0.5   17098
  A+B   329417   0.44   18562
  A+B   329418   0.49   18789
  A+B   329419   0.49   25072
  A+B   329520   0.48   28180
  A+B   329521   0.5   29128
  A+B   329522   0.51   29487
  A+B   329523   0.53   29523
  A+B   329561   0.49   29971
  A+B   329562   0.51   29972
  A+B   329563   0.45   29973
  A+B   329564   0.48   29974
  A+B   329565   0.45   29975
  A+B   329566   0.49   29976
  A+B   329567   0.51   29977
  A+B   329568   0.53   29978
  A+B   329569   0.31   29979
  A+B   329570   0.46   29980
  A+B   329571   0.47   29981
  A+B   329572   0.31   29982
  A+B   329573   0.43   29983
  A+B   329574   0.35   29984
  A+B   329575   0.41   29985
  A+B   329576   0.48   29986
  A+B   329577   0.5   29987
  A+B   329578   0.53   29988
  A+B   329579   0.53   29989
  A+B   329580   0.52   29990
  A+B   329420   0.49   20
  A+B   329421   0.56   21
  A+B   329422   0.43   29831
  A+B   329423   0.49   29832
  A+B   329540   0.55   20
  A+B   329541   0.56   21
  C+D   培养基   0.09   N/A
  C+D   培养基+病毒   0.09   N/A
  C+D   细胞对照   0.87   N/A
  C+D   病毒对照   0.46   N/A
  C+D   129686   0.5   30020
  C+D   129687   0.55   30021
  C+D   129688   0.52   30022
  C+D   129689   0.52   30023
  C+D   129690   0.52   30024
  C+D   129691   0.52   30025
  C+D   129694   0.51   30026
  C+D   129695   0.51   30027
  C+D   141923   0.53   30027
  C+D   289606   0.47   30030
  C+D   329586   0.5   30031
  C+D   329804   0.55   30032
  C+D   329492   0.54   18448
  C+D   329493   0.57   18526
  C+D   329494   0.53   18944
  C+D   329495   0.53   19539
  C+D   329496   0.4   19551
  C+D   329497   0.46   20772
  C+D   329498   0.45   21051
  C+D   329499   0.47   21372
  C+D   329500   0.49   22166
  C+D   329501   0.45   23011
  C+D   329502   0.49   23088
  C+D   329503   0.42   23526
  C+D   329504   0.49   23848
  C+D   329505   0.48   24440
  C+D   329506   0.53   24890
  C+D   329507   0.47   25485
  C+D   329508   0.52   25899
  C+D   329509   0.5   25918
  C+D   329510   0.51   26408
  C+D   329511   0.49   26452
  C+D   329512   0.46   26501
  C+D   329513   0.45   26800
  C+D   329514   0.54   27149
  C+D   329515   0.45   27285
  C+D   329516   0.51   27425
  C+D   329517   0.52   27520
  C+D   329518   0.5   27557
  C+D   329519   0.41   27913
  C+D   329410   0.47   13990
  C+D   329411   0.45   13996
  C+D   329412   0.51   15214
  C+D   329413   0.56   15454
  C+D   329414   0.47   15637
  C+D   329415   0.46   15733
  C+D   329416   0.5   17098
  C+D   329417   0.44   18562
  C+D   329418   0.49   18789
  C+D   329419   0.49   25072
  C+D   329520   0.48   28180
  C+D   329521   0.5   29128
  C+D   329522   0.51   29487
  C+D   329523   0.53   29523
  C+D   329561   0.49   29971
  C+D   329562   0.51   29972
  C+D   329563   0.45   29973
  C+D   329564   0.48   29974
  C+D   329565   0.45   29975
  C+D   329566   0.49   29976
  C+D   329567   0.51   29977
  C+D   329568   0.53   29978
  C+D   329569   0.31   29979
  C+D   329570   0.46   29980
  C+D   329571   0.47   29981
  C+D   329572   0.31   29982
  C+D   329573   0.43   29983
  C+D   329574   0.35   29984
  C+D   329575   0.41   29985
  C+D   329576   0.48   29986
  C+D   329577   0.5   29987
  C+D   329578   0.53   29988
  C+D   329579   0.53   29989
  C+D   329580   0.52   29990
  C+D   329420   0.49   20
  C+D   329421   0.56   21
  C+D   329422   0.43   29831
  C+D   329423   0.49   29832
  C+D   329540   0.55   20
  C+D   329541   0.56   21
  E+F   培养基   0.09   N/A
  E+F   培养基+病毒   0.09   N/A
  E+F   细胞对照   0.8   N/A
  E+F   病毒对照   0.44   N/A
  E+F   129686   0.46   30020
  E+F   129687   0.44   30021
  E+F   129688   0.5   30022
  E+F   129689   0.46   30023
  E+F   129690   0.47   30024
  E+F   129691   0.45   30025
  E+F   129694   0.48   30026
  E+F   129695   0.48   30027
  E+F   141923   0.52   30027
  E+F   289606   0.49   30030
  E+F   329586   0.45   30031
E+F 329804 0.47 30032
  E+F   329542   0.45   29831
  E+F   329543   0.49   29832
  E+F   329544   0.48   29833
  E+F   329581   0.41   30000
  E+F   329582   0.43   30001
  E+F   329583   0.49   30002
  E+F   329584   0.47   30003
  E+F   329585   0s52   30004
  E+F   329524   0.52   13396
  E+F   329525   0.54   13404
  E+F   329526   0.49   13411
  E+F   329527   0.44   13415
  E+F   329528   0.51   13445
  E+F   329529   0.43   13464
  E+F   329530   0.5   13471
  E+F   329545   0.4   29833
  E+F   329546   0.47   13396
  E+F   329547   0.57   13404
  E+F   329548   0.47   13411
  E+F   329549   0.53   13415
  E+F   329550   0.57   13445
  E+F   329551   0.53   13464
  E+F   329552   0.54   13471
  E+F   329553   0.57   64
  E+F   329554   0.51   21483
  E+F   329555   0.51   25257
  E+F   329556   0.5   26106
  E+F   329557   0.47   26345
  E+F   329558   0.54   26910
  E+F   329559   0.55   27264
  E+F   329560   0.5   27770
  E+F   330490   0.53   30005
  E+F   330491   0.48   30006
  E+F   330492   0.48   30007
  E+F   330493   0.5   30008
  E+F   330494   0.49   30009
  E+F   330495   0.47   30010
  E+F   330496   0.51   30011
  E+F   330497   0.41   30012
  E+F   330498   0.44   30013
  E+F   329531   0.5   64
  E+F   329532   0.54   21483
  E+F   329533   0.48   25257
  E+F   329534   0.54   26106
  E+F   329535   0.51   26345
  E+F   329536   0.52   26910
  E+F   329537   0.52   27264
  E+F   329538   0.55   27770
  E+F   329539   0.49   28103
  E+F   330481   0.46   28103
  E+F   330482   0.41   29992
  E+F   330483   0.46   29993
  E+F   330484   0.54   29994
  E+F   330485   0.51   29995
  E+F   330486   0.49   29996
  E+F   330487   0.51   29997
  E+F   330488   0.48   29998
  E+F   330489   0.52   29999
  E+F   333040   0.56   30049
  E+F   333048   0.55   30050
  E+F   333049   0.51   30051
  E+F   333054   0.48   30052
  E+F   333057   0.41   30053
  E+F   330538   0.45   30048
  E+F   329591   0.49   29934
  E+F   329729   0.38   13464
  E+F   334962   0.41   29874
  E+F   334963   0.46   298975
  G+H   培养基   0.09   N/A
  G+H   培养基+病毒   0.09   N/A
  G+H   细胞对照   0.87   N/A
  G+H   病毒对照   0.38   N/A
  G+H   129686   0.44   30020
  G+H   129687   0.49   30021
  G+H   129688   0.43   30022
  G+H   129689   0.55   30023
  G+H   129690   0.56   30024
  G+H   129691   0.5   30025
  G+H   129694   0.54   30026
  G+H   129695   0.54   30027
  G+H   141923   0.52   30027
  G+H   289606   0.5   30030
  G+H   329586   0.36   30031
  G+H   329804   0.5   30032
  G+H   334996   0.48   30034
  G+H   334998   0.51   29910
  G+H   335001   0.51   29913
  G+H   335003   0.51   29914
  G+H   335005   0.47   29917
实施例25：反义寡核苷酸在Vero 76细胞中抑制SARS活性：中性红(NR)测定
如实施例23所述，用3微升Lipofectin/100nM寡核苷酸/1毫升Opti-MEM转染靶向SARS-CoV基因的反义寡核苷酸。细胞与CoV在MOI 0.3下接触1小时，用替换的测定培养基洗涤。
细胞在转染后恢复72小时后，用NR测试活力。因为如果细胞损失活力，则它们会损失摄取NR的能力。各板含有12个阴性对照寡核苷酸，表中以粗体表示。数据表示为每个测试反义寡核苷酸的两个O.D.测量结果的平均值。表15的“板”中示明了用于平均各数据点的复板。各板含有下述各对照孔的四个复孔：仅有培养基没有细胞(培养基)、具有培养基和病毒没有细胞(培养基+病毒)、仅有细胞没有病毒或寡核苷酸治疗(细胞对照)以及具有细胞和病毒没有寡核苷酸治疗(病毒对照)。因此，代表这些对照的O.D.是各组复板中8个测量结果的平均值。因为测定的O.D.与培养中的活细胞数量成正比，所以O.D.即表明“病毒活性”，其中O.D.读数与细胞对照接近则说明该治疗抑制了病毒活性，而O.D.读数与病毒对照接近则说明对病毒活性没有影响。
                       表15
反义抑制剂在Vero 76细胞中对SARS活性的影响：NR测定
  板   治疗(ISIS编号或描述)   病毒活性(O.D.)   SEQIDNO
  1+2   培养基   0.97   N/A
  1+2   培养基+病毒   0.64   N/A
  1+2   细胞对照   0.83   N/A
  1+2   病毒对照   1.15   N/A
  1+2   129686   0.4   30020
  1+2   129687   0.47   30021
  1+2   129688   0.47   30022
  1+2   129689   0.6   30023
  1+2   129690   0.69   30024
  1+2   129691   0.36   30025
  1+2   129694   0.71   30026
  1+2   129695   0.52   30027
  1+2   141923   1.39   30027
  1+2   289606   0.44   30030
  1+2   329586   1.2   30031
  1+2   329804   1   30032
  1+2   329424   0.39   211
  1+2   329425   0.29   221
  1+2   329426   0.47   372
  1+2   329427   0.56   390
  1+2   329428   0.36   1335
  1+2   329429   0.61   1772
  1+2   329430   1.01   1774
  1+2   329431   0.68   1869
  1+2   329432   0.52   2094
  1+2   329433   0.8   2403
  1+2   329434   0.4   2753
  1+2   329435   0.76   2830
  1+2   329436   1.1   3150
  1+2   329437   0.36   3308
  1+2   329438   0.67   4025
  1+2   329439   0.75   4271
  1+2   329440   1   4842
  1+2   329441   0.56   5294
  1+2   329442   0.78   5348
  1+2   329443   0.64   5486
  1+2   329444   0.37   5643
  1+2   329445   0.85   5653
  1+2   329446   0.54   6014
  1+2   329447   0.31   6481
  1+2   329448   0.81   6619
  1+2   329449   0.87   6994
  1+2   329450   0.55   7028
  1+2   329451   0.7   7165
  1+2   329452   0.53   7541
  1+2   329453   1.1   7971
  1+2   329454   0.57   8025
  1+2   329455   0.55   8589
  1+2   329456   0.77   8597
  1+2   329457   0.6   9110
  1+2   329458   0.86   9151
  1+2   329459   1.1   9384
  1+2   329460   0.57   9894
  1+2   329461   1.07   9937
  1+2   329462   0.5   10008
  1+2   329463   1.16   10465
  1+2   329464   0.92   10796
  1+2   329465   0.85   11206
  1+2   329466   0.72   11513
  1+2   329467   0.61   11982
  1+2   329468   0.81   12007
  1+2   329469   0.63   12273
  1+2   329470   0.85   12454
  1+2   329471   1.08   13178
  1+2   329472   1.11   13195
  1+2   329473   0.84   13242
  1+2   329591   0.43   29934
  1+2   329729   0.4   13464
  3+4   培养基   0.64   N/A
  3+4   培养基+病毒   0.67   N/A
  3+4   细胞对照   1.36   N/A
  3+4   病毒对照   0.47   N/A
  3+4   129686   0.91   30020
  3+4   129687   0.47   30021
  3+4   129688   0.61   30022
  3+4   129689   0.37   30023
  3+4   129690   0.38   30024
  3+4   129691   0.39   30025
  3+4   129694   0.66   30026
  3+4   129695   0.24   30027
  3+4   141923   0.5   30027
  3+4   289606   0.57   30030
  3+4   329586   0.47   30031
  3+4   329804   0.51   30032
  3+4   329410   0.39   13990
  3+4   329411   0.41   13996
  3+4   329412   0.28   15214
  3+4   329413   0.39   15454
  3+4   329474   0.37   13627
  3+4   329475   0.83   13997
  3+4   329476   0.49   14058
  3+4   329477   0.38   14258
  3+4   329478   0.88   14724
  3+4   329479   0.56   14847
  3+4   329480   0.98   14995
  3+4   329481   0.65   15084
  3+4   329482   0.34   15420
  3+4   329483   0.36   15744
  3+4   329484   0.38   15836
  3+4   329485   0.35   15904
  3+4   329486   0.38   16653
  3+4   329487   0.44   16888
  3+4   329488   0.29   17328
  3+4   329489   0.4   17738
  3+4   329490   0.62   17768
  3+4   329491   0.35   18420
  3+4   329492   0.39   18448
  3+4   329493   0.32   18526
  3+4   329494   0.34   18944
  3+4   329495   0.36   19539
  3+4   329496   0.28   19551
  3+4   329497   0.27   20772
  3+4   329498   0.47   21051
  3+4   329499   0.44   21372
  3+4   329500   0.64   22166
  3+4   329501   0.33   23011
  3+4   329502   0.46   23088
  3+4   329503   0.5   23526
  3+4   329504   0.37   23848
  3+4   329505   0.25   24440
  3+4   329506   1.07   24890
  3+4   329507   0.62   25485
  3+4   329508   0.47   25899
  3+4   329509   0.38   25918
  3+4   329510   0.47   26408
  3+4   329511   0.4   26452
  3+4   329512   0.94   26501
  3+4   329513   0.32   26800
  3+4   329514   0.41   27149
  3+4   329515   0.53   27285
  3+4   329516   0.49   27425
  3+4   329517   0.44   27520
  3+4   329518   0.54   27557
  3+4   329519   0.44   27913
  3+4   334962   0.53   29874
  3+4   334963   0.32   29875
  5+6   培养基   0.75   N/A
  5+6   培养基+病毒   0.81   N/A
  5+6   细胞对照   1.24   N/A
  5+6   病毒对照   0.5   N/A
  5+6   129686   0.44   30020
  5+6   129687   0.47   30021
  5+6   129688   0.37   30022
  5+6   129689   0.39   30023
  5+6   129690   0.39   30024
  5+6   129691   0.7   30025
  5+6   129694   0.43   30026
  5+6   129695   0.43   30027
  5+6   141923   0.38   30027
  5+6   289606   0.47   30030
  5+6   329586   0.52   30031
  5+6   329804   0.41   30032
  5+6   329414   0.4   15637
  5+6   329415   0.43   15733
  5+6   329416   0.42   17098
  5+6   329417   0.29   18562
  5+6   329418   0.35   18789
  5+6   329419   0.32   25072
  5+6   329420   0.26   20
  5+6   329421   0.8   21
  5+6   329422   0.38   29831
  5+6   329423   0.35   29832
  5+6   329520   0.38   28180
  5+6   329521   0.32   29128
  5+6   329522   0.36   29487
  5+6   329523   0.51   29523
  5+6   329524   0.3   13396
  5+6   329525   0.29   13404
  5+6   329526   0.39   13411
  5+6   329527   0.52   13415
  5+6   329528   0.49   13445
  5+6   329529   0.43   13464
  5+6   329540   0.61   20
  5+6   329541   0.6   21
  5+6   329542   0.31   29831
  5+6   329543   0.4   29832
  5+6   329544   0.3   28104
  5+6   329561   0.43   29971
  5+6   329562   0.28   29972
  5+6   329563   0.4   29973
  5+6   329564   0.27   29974
  5+6   329565   0.3   29975
  5+6   329566   0.46   29976
  5+6   329567   0.33   29977
  5+6   329568   0.43   29978
  5+6   329569   0.39   29979
  5+6   329570   0.3   29980
  5+6   329571   0.39   29981
  5+6   329572   0.29   29982
  5+6   329573   0.35   29983
  5+6   329574   0.35   29984
  5+6   329575   0.38   29985
  5+6   329576   0.34   29986
  5+6   329577   0.34   29987
  5+6   329578   0.28   29988
  5+6   329579   0.26   29989
  5+6   329580   0.56   29990
  5+6   329581   0.33   30000
  5+6   329582   0.25   30001
  5+6   329583   0.31   30002
  5+6   329584   0.4   30003
  5+6   329585   0.31   30004
  5+6   334996   0.42   29908
  5+6   334998   0.36   29910
  7+8   培养基   0.99   N/A
  7+8   培养基+病毒   0.7   N/A
  7+8   细胞对照   1.21   N/A
  7+8   病毒对照   0.58   N/A
  7+8   129686   0.57   30020
  7+8   129687   0.47   30021
  7+8   129688   0.44   30022
  7+8   129689   0.39   30023
  7+8   129690   0.74   30024
  7+8   129691   1.04   30025
  7+8   129694   0.46   30026
  7+8   129695   0.41   30027
  7+8   141923   0.31   30027
  7+8   289606   0.87   30030
  7+8   329586   0.55   30031
  7+8   329804   0.52   30032
  7+8   329530   0.83   13471
  7+8   329531   0.26   64
  7+8   329532   0.22   21483
  7+8   329533   0.24   25257
  7+8   329534   0.21   26106
  7+8   329535   0.27   26345
  7+8   329536   0.19   26910
  7+8   329537   0.29   27264
  7+8   329538   0.26   27770
  7+8   329539   0.46   28103
  7+8   329545   1.03   29833
  7+8   329546   0.6   13396
  7+8   329547   0.98   13404
  7+8   329548   1   13411
  7+8   329549   0.45   13415
  7+8   329550   0.53   13445
  7+8   329551   0.68   13464
  7+8   329552   0.4   13471
  7+8   329553   0.29   64
  7+8   329554   0.27   21483
  7+8   329555   0.31   25257
  7+8   329556   0.42   26106
  7+8   329557   0.22   26345
  7+8   329558   0.38   26910
  7+8   329559   0.3   27264
  7+8   329560   0.32   27770
  7+8   330481   0.27   29991
  7+8   330482   0.33   29992
  7+8   330483   0.4   29993
  7+8   330484   0.37   29994
  7+8   330485   0.35   29995
  7+8   330486   0.17   29996
  7+8   330487   0.27   29997
  7+8   330488   0.27   29998
  7+8   330489   0.25   29999
  7+8   330490   0.32   30005
  7+8   330491   0.36   30006
  7+8   330492   0.3   30007
  7+8   330493   0.31   30008
  7+8   330494   0.23   30009
  7+8   330495   0.2   30010
  7+8   330496   0.58   30011
  7+8   330497   0.4   30012
  7+8   330498   0.31   30013
  7+8   330538   0.26   30048
  7+8   333040   0.39   30049
  7+8   333048   0.47   30050
  7+8   333049   0.29   30051
  7+8   333054   0.34   30052
  7+8   333057   0.26   30053
  7+8   334996   0.42   29908
  7+8   334998   0.36   29910
  7+8   335001   0.33   29913
  7+8   335003   0.37   29915
  7+8   335005   0.32   29917
根据与复板3和4中的细胞对照和病毒对照比较O.D.，将ISIS 329475、ISIS329478、ISIS 329480、ISIS 329506和ISIS 329512确定为可能的病毒活性抑制剂。根据板5和6，将ISIS 329421、ISIS 329540和ISIS 329541确定为可能的病毒活性抑制剂。根据板7和8，将ISIS 329530、ISIS 329545、ISIS 329547和ISIS 329548确定为可能的病毒活性抑制剂。
实施例26：反义寡核苷酸在Vero 76细胞中抑制SARS活性：NR测定
在附加测定中测试了靶向SARS反义寡核苷酸对SARS活性的抑制。用实施例22中描述的寡核苷酸转染Vero细胞，然后将细胞与SARS冠状病毒Urbani毒株200300592在感染复数0.001下接触。将一对未感染孔作为对照。与病毒接触4天后，对板进行目测记分，评定其细胞病理效应(CPE)。从已评定CPE的板的各孔中移除培养基，向各孔加入0.034％NR。37℃避光孵育2小时后，从孔中移除NR溶液，冲洗，用通过Sorenson柠檬酸盐缓冲液缓冲的乙醇将剩余染料浸出。用微板阅读器(Bio-TekEL 1309；Bio-Tek Instruments，Inc.，Winooski，VT)在540纳米和450纳米的吸光处读出染料摄取量。
该吸光度值说明被细胞摄取的NR量。如果细胞损失活力，它们则损失摄取NR的能力。吸光度值在未感染对照细胞的40％以内的化合物被认为是SARS-CoV的可能抑制剂。
测试化合物中，17个寡核苷酸被确定为SARS-CoV的可能抑制剂：ISIS 329437、ISIS 329474、ISIS 329475、ISIS 329481、ISIS 329483、ISIS 329487、ISIS 329488、ISIS 329497、ISIS 329504、ISIS 329505、ISIS 329513、ISIS 329521、ISIS 329540、ISIS 329541、ISIS 329547、ISIS 329550和ISIS 329551。
实施例27：表征SARS冠状病毒RNA中的移码位点
根据本发明，开发了比较序列分析(CSA)法，以定位RNA中跨种保守的必需“特征”结构，用于药物设计和筛选。CSA方法基于RNA在进化中趋向保守功能相关的结构，通过在不同有机体中比较序列，人们可以确定隐藏的二级结构，即使个别碱基有变化。RNA具有由碱基对相互作用形成的保守的二级结构，它比一级结构更加保守。这是由于引入了代偿性突变以维持碱基对的互补性。可以在用称为多序列比对中进行的相关变异分析技术对比序列的重复过程中鉴定这些代偿性突变。用该方法已经发现了大部分已知的RNA结构(R.R.Gutell，Curr.Opin.Struct.Biol.3，313-322(1993)；R.Durbin，S.Eddy，A.Krogh，G Mitchison，生物学序列分析：蛋白和核酸的概率模型(Cambridge University Press，Cambridge，1998))，这些结果已经通过物理方法，如晶体照相和NMR确证。
为了在SARS冠状病毒和其它冠状病毒中鉴定系统发生上保守的RNA靶，分析了GenBank中冠状病毒的全基因组序列。这些序列代表该家族的所有主要群体，包括：传染性胃肠炎病毒(GenBank编号NC_002306，本文纳入为SEQ ID NO：30055)；人冠状病毒229E(GenBank编号NC_002645，本文纳入为SEQ ID NO：30056)；猪流行性腹泻病毒(GenBank编号NC_003436，本文纳入为SEQ ID NO：30057)；禽感染性支气管炎病毒(GenBank编号NC_001451，本文纳入为SEQ ID NO：30058)；SARS冠状病毒(GenBank编号NC_004718，本文纳入为SEQ ID NO：29752)；鼠肝炎病毒(GenBank编号NC_001846，本文纳入为SEQ ID NO：30059)和牛冠状病毒(GenBank编号NC_003045，本文纳入为SEQ ID NO：30060)。这些序列都显示包含胸腺嘧啶(T)，但本领域普通技术人员将理解，在RNA序列中胸腺嘧啶(T)通常被尿嘧啶(U)取代。
通过上述的重复过程，进行了全覆盖这些病毒的基于结构的对比。冠状病毒基因组中一种良好表征的结构是其假结包含的移码位点，它是病毒生命周期所必需的。序列分析的结果说明，SARS病毒与其它被证明有移码位点的冠状病毒序列(图1)同源程度很高。从序列对比确定，在比对序列中构成滑动位点的区域和假结通常是保守的。该分析证实SARS冠状病毒含有与其它冠状病毒相同的假结基序和移码位点，它们显示出以相似方式控制了必需的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)基因表达。这些特征使SARS冠状病毒1a/1b移码位点成为药物发现的有效靶点。
本领域普通技术人员将认识到，表征病毒的移码位点进一步使人能够表征包括滑动位点和假结的移码位点的亚片段。本领域普通技术人员也将认识到，表征假结也使人能够表征假结中的环和茎。
实施例28：构建质粒pSARS和体外转录包含移码位点的SARS RNA
根据本发明，通过把长DNA寡(15个碱基对重叠)核苷酸退火，然后通过Pfu DNA聚合酶延伸形成双链DNA来构建包括移码位点的79-bp长的SARS冠状病毒DNA构建物。然后用在其5′端引入EcoRI限制性位点和T7 RNA聚合酶识别序列的正向引物和在其3′端引入HindIII限制性位点的反向引物将此片段在PCR反应中再扩增，将PCR产物克隆到先用HindIII和EcoRI消化的pUC19载体内。测序生成的质粒，本文中称为“pSARS”，以确认可从T7启动子开始转录所需SARS RNA。用HindIII将该质粒线性化，用T7MEGAShortTM体外转录实验试剂盒，依照生产商的步骤产生大量RNA。具有由于T7转录启动而连接于SARS序列两侧的GG和AGCU、以及由于HindIII在模板链上切割产生的5′突出端的85-nt的RNA，在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上显示为主要条带(纯度＞95％)。从凝胶中回收该RNA条带，在2mM醋酸铵中4℃孵育洗脱过夜。用10mM的醋酸铵沉淀RNA。
实施例29：构建报道质粒pSARS1、pSARS2和pSARS3
为了确定对移码效率的调节(参见实施例30)，需要3种不同的移码报道质粒，所有都含有与萤火虫荧光素酶报道基因融合的SARS冠状病毒的移码位点，使如果翻译阅读框1b，仅翻译报道基因。因此，如果1a至1b之间不发生移码，就不翻译报道基因。本文中将这三个移码报道质粒称为pSARS1、pSARS2和pSARS3。pSARS1(SEQ ID NO：30061)用作阳性对照，pSARS2(SEQ ID NO：30062)代表天然的SARS冠状病毒移码位点，pSARS3(SEQ ID NO：30063)用作阴性对照。
相对于pSARS2的天然SARS冠状病毒移码位点，pSARS1用CTGCTG替换了序列TTTTT(从距滑动位点5′端2个核苷酸的地方开始)。此修饰导致RNA的滑动位点废除，并且1b阅读框中RNA从核苷酸替代物的5′端开始完全被翻译。因此，发生持续的“刺激移码”，并且翻译蛋白100％含有荧光素酶报道基因。
相对于pSARS2的天然SARS冠状病毒移码位点，阴性对照pSARS3用CTG替换了序列TTTTTA(从距滑动位点5′端2个核苷酸的地方开始)。此修饰导致RNA的滑动位点废除，并且1b阅读框中RNA从核苷酸替换位点的5′端开始完全被翻译。然而，与pSARS1对比，用CTG替换TTTTTA在替换位点下游15个核苷酸处引入了一个终止密码子。该终止密码子防止荧光素酶报道基因被翻译，因此将质粒pSARS3作为阴性对照。
将前面构建pSARS得到的79-bp PCR产物作为模板，进行两个连续的PCR反应，以在滑动位点的5′前延伸所需的DNA片段21-bp，同时在产物两端引入限制性切割位点，用于克隆。第一轮PCR产生在SARS 1a/1b假结紧接的下游位置、但在起始密码子ATG紧接的上游位置加入BamHI位点的中间产物。将反向引物上的ATG设计在SARS 1b基因框内。从来自移码的第一个氨基酸到ATG编码的甲硫氨酸，有编码30个氨基酸的90-bp序列，它们是1b翻译产物的一部分。第二轮PCR使用第一轮PCR的产物作为模板。针对不同构建物的正向引物具有不同的序列。另外，将NheI限制性位点设计在这些正向引物的5′末端。用SARS1_F_NheI产生DNA片段，用于阳性对照质粒pSARS1。将SARS2_F_NheI用于含有天然滑动序列的质粒pSARS2，将SARS3_F_FheI用于阴性对照质粒pSARS3。将萤火虫荧光素酶基因(F-luc，Promega，Madison，WI)单独克隆到商业载体pcDNA5.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，使其在T7启动子的控制下。本文中将该创建质粒称为pFluc，它在T7转录起始位置下游约20个核苷酸具有NheI位点，在ATG起始密码子紧接的上游位置具有BamHI位点。用NheI和BamHI消化该PCR产物，并将其克隆到pFluc中产生pSARS1、pSARS2和pSARS3。
实施例30：体外测定SARS冠状病毒的模式RNA的移码效率
用EcoRI将代表模式RNA构建物的报道质粒(pSARS1、pSARS2和pSARS3)线性化，并用MESSENGER及其试剂盒(Ambion，Austin，TX)将其体外转录产生～2.1k-nt的有帽mRNA。在构建物之间，由该mRNA编码的活性萤火虫荧光蛋白表达单独地取决于核糖体滑动机制。用MEGAclearTM试剂盒(Ambion，Austin，TX)纯化该mRNA，通过LTV阅读确定其浓度。将2微升RNA和2微升H2O(或化合物)在96孔板的孔中混合，以进行闪烁计数，将16微升兔网织红细胞裂解物加入孔中，30℃下孵育一个半小时。将20微升荧光素酶底物(Promega，Madison，WI)加入反应并混合1分钟。在Topcounter(Canberra-Packard Company，Meriden，CT，USA)上测量发射光(LE)。
以下式进行移码效率(FSE)的确定：
FSE＝(pSARS2的LE-pSARS3的LE)/(pSARS1的LE-pSARS3的LE)×100％
因此确定天然SARS冠状病毒的移码位点的移码效率为40±4％。
实施例31：通过2′-O-甲氧基乙基寡核苷酸调节SARS冠状病毒的模式RNA的移码效率
根据本发明，将一系列反义化合物设计为靶向SARS冠状病毒(GenBank编号NC004718，本文纳入为SEQ ID NO：16)的模式RNA构建物的移码位点的不同区域。表16中显示了这些化合物。“靶位点”指具体靶序列中与化合物结合(参考SEQ IDNO：16)的最初(5′-端)几个核苷酸。测试的寡核苷酸包括：ISIS 329721、ISIS 329722、ISIS 329724、ISIS 329727、ISIS 329729、ISIS 329731、ISIS 329550和ISIS 339289。阴性对照寡核苷酸是ISIS 329804。表16中的所有化合物都是长度为20个核苷酸的均一的2′-O-甲氧基乙基寡核苷酸。除ISIS 329550外，整个核苷酸中的核苷间(骨架)连接都是磷酸二酯(P＝O)连接。ISIS 329550的核苷间连接是硫代磷酸(P＝S)连接。所有胞苷残基都是5-甲基胞苷。如实施例30所述，分析了化合物对冠状病毒RNA的核糖体移码的影响。标准差是±4％。抑制百分数说明各寡核苷酸在降低移码效率中的效力，按下式计算：
抑制％＝((40)-(寡核苷酸作用下的FSE)/(40))×100％
                               表16
通过2′-O-甲氧基乙基寡核苷酸调节SARS冠状病毒RNA的移码效率
  寡核苷酸(ISIS编号)   靶位点   靶区域   寡核苷酸浓度(微摩尔) 移码效率(％)   移码效率的抑制％
  329721   13385   茎1上游   50   96   0
  329721   13385   茎1上游   25   105   0
  329721   13385   茎1上游   15   109   0
  329721   13385   茎1上游   10   89   0
  329721   13385   茎1上游   5   88   0
  329721   13385   茎1上游   0.5   69   0
  329721   13385   茎1上游   0.02   52   0
  329721   13385   茎1上游   0.002   55   0
  329722   13392   环1   160   4   91
  329722   13392   环1   20   13   66
  329722   13392   环1   15   13   67
  329722   13392   环1   10   13   68
  329722   13392   环1   5   18   55
  329722   13392   环1   0.2   45   0
  329722   13392   环1   0.02   47   0
  329722   13392   环1   0.002   52   0
  329724   13396   茎2下游   70   8   67
  329724   13396   茎2下游   20   9   66
  329724   13396   茎2下游   10   10   61
  329724   13396  茎2下游   5   15   44
  329724   13396  茎2下游   1   22   15
  329724   13396  茎2下游   0.2   25   4
  329724   13396  茎2下游   0.02   28   0
  329724   13396  茎2下游   0.002   26   1
  329727   13426  环2   58   8   69
  329727   13426  环2   20   7   71
  329727   13426  环2   15   10   60
  329727   13426  环2   10   13   52
  329727   13426  环2   5   13   51
  329727   13426  环2   0.2   27   0
  329727   13426  环2   0.02   29   0
  329727   13426  环2   0.002   27   0
  339289   13441  茎2上游   5   0   100
  339289   13441  茎2上游   2   0   98
  339289   13441  茎2上游   1   2   92
  339289   13441  茎2上游   0.8   3   86
  339289   13441  茎2上游   0.4   6   73
  339289   13441  茎2上游   0.3   6   73
  339289   13441  茎2上游   0.2   9   61
  339289   13441  茎2上游   0.1   14   35
  339289   13441  茎2上游   0.05   20   9
  339289   13441  茎2上游   0.01   20   8
  329729   13445  茎2上游   5   2   96
  329729   13445  茎2上游   1   8   81
  329729   13445  茎2上游   0.5   13   66
  329729   13445  茎2上游   0.2   20   50
  329729   13445  茎2上游   0.1   34   16
  329729   13445  茎2上游   0.01   40   1
  329729   13445  茎2上游   0.001   41   0
  329731   13452  茎2上游   33.8   0   100
  329731   13452  茎2上游   25   2   93
  329731   13452  茎2上游   15   6   76
  329731   13452  茎2上游   10   12   53
  329731   13452  茎2上游   5   12   54
  329731   13452  茎2上游   1   18   30
  329731   13452  茎2上游   0.02   22   15
  329731   13452  茎2上游   0.002   21   19
  329550   13445  茎2上游   28   1   96
  329550   13445  茎2上游   14   0   99
  329550   13445  茎2上游   2.8   3   91
329550 13445 茎2上游 1.4 4 85
  329550   13445   茎2上游   0.7   6   79
  329550   13445   茎2上游   0.14   18   37
  329550   13445   茎2上游   0.014   30   0
  329550   13445   茎2上游   0.0014   28   0
  329804   -   对照   39.5   46   0
  329804   -   对照   25   58   0
  329804   -   对照   15   49   0
  329804   -   对照   10   34   15
  329804   -   对照   5   34   15
  329804   -   对照   0.2   39   3
  329804   -   对照   0.02   41   0
如表16所示，对照寡核苷酸ISIS 329804对移码效率的影响最小。经测量，10和5μM寡核苷酸的移码抑制仅比实验误差略大，然而在其它浓度的寡核苷酸上根本没有观察到移码抑制。
寡核苷酸329722、329724、329727、329550和329731在25-5μM浓度范围内有效抑制了移码效率，估计其IC50值在实验误差内的10-5μM范围内。
寡核苷酸329729和339289在抑制移码效率上甚至更有效，IC50值分别为0.2μM和0.15μM。
寡核苷酸329721具有增加移码效率的效果。
前述实施例表明寡核苷酸在降低和增加病毒RNA的核糖体移码位点的移码效率方面都有效。
对于本领域技术人员来说，从前面的描述中可以明显看出除本文描述外的本发明的各种变化。所述变化也应落入所附的权利要求范围内。本说明术中提到或涉及的各专利、申请、印刷公告和其它出版文件被全文纳入本文作为参考。本领域技术人员将理解，可以对本发明实施方式进行多种变化和修改，这些变化和修改可在不背离本发明精神的情况下作出。因此，所附权利要求应覆盖所有这些等效变化，因为其落入本发明的真实精神和范围之内。

Claims (54)

1.一种靶向编码严重急性呼吸道综合症(SARS)病毒核酸分子的含有8至约80个核碱基的低聚化合物，其中，该化合物与编码SARS病毒的核酸分子杂交并使SARS病毒的表达至少降低50％。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物包含12至约50个核碱基。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述化合物包含15至约30个核碱基。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物是寡核苷酸。
5.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，所述化合物是反义寡核苷酸。
6.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，所述化合物是DNA寡核苷酸。
7.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，所述化合物是RNA寡核苷酸。
8.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，所述化合物是嵌合寡核苷酸。
9.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，至少部分所述化合物与RNA杂交形成寡核苷酸-RNA双链体。
10.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物与编码SARS病毒的核酸分子至少70％互补。
11.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物与编码SARS病毒的核酸分子至少80％互补。
12.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物与编码SARS病毒的核酸分子至少90％互补。
13.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物与编码SARS病毒的核酸分子至少95％互补。
14.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有至少一个修饰的核苷间连接、修饰的糖部分或修饰的核碱基。
15.如权利要求14所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有至少一个2′-O-甲氧基乙基糖部分。
16.如权利要求14所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有至少一个硫代磷酸酯核苷间连接。
17.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有至少一个5-甲基胞嘧啶。
18.一种降低SARS病毒在细胞或组织中表达的方法，该方法包括用权利要求1所述的化合物接触细胞或组织，以降低SARS病毒的表达。
19.一种筛选SARS病毒调节剂的方法，该方法包括：
a)用一种或多种候选SARS病毒调节剂接触编码SARS病毒的核酸分子中合适的靶区域；和
b)鉴定一种或多种调节SARS病毒表达的SARS病毒表达调节剂。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述SARS病毒表达调节剂包括寡核苷酸、反义寡核苷酸、DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸、嵌合寡核苷酸或至少部分与RNA杂交形成寡核苷酸-RNA双链体的RNA寡核苷酸。
21.一种鉴定病状的诊断方法，该方法包括用至少一种引物鉴定样品中SARS病毒的存在情况。
22.包含权利要求1所述化合物的试剂盒或测定装置。
23.一种治疗患有SARS病毒相关疾病或症状的动物的方法，该方法包括给予动物治疗或预防有效量的权利要求1所述的化合物，以降低SARS病毒的表达。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述疾病或症状是病毒感染。
25.一种长度为8至80个核碱基的靶向病毒RNA移码位点的化合物，其中，该化合物与移码位点特异性杂交，并调节病毒RNA的核糖体移码过程。
26.如权利要求25所述的化合物，其特征在于，该化合物的长度为8至50个核碱基。
27.如权利要求26所述的化合物，其特征在于，该化合物的长度为8至30个核碱基。
28.如权利要求25所述的化合物，其特征在于，该化合物包含寡核苷酸。
29.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，该化合物包含反义寡核苷酸。
30.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，该化合物包含DNA寡核苷酸。
31.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，该化合物包含RNA寡核苷酸。
32.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，该化合物包含嵌合寡核苷酸。
33.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，至少部分所述化合物与RNA杂交形成寡核苷酸-RNA双链体。
34.如权利要求25所述的化合物，其特征在于，所述化合物与病毒RNA的移码位点至少70％互补，化合物与移码位点特异性杂交并调节移码位点的功能。
35.如权利要求25所述的化合物，其特征在于，所述化合物与病毒RNA的移码位点至少80％互补，化合物与移码位点特异性杂交并调节移码位点的功能。
36.如权利要求25所述的化合物，其特征在于，所述化合物与病毒RNA的移码位点至少90％互补，化合物与移码位点特异性杂交并调节移码位点的功能。
37.如权利要求25所述的化合物，其特征在于，所述化合物与病毒RNA的移码位点至少95％互补，化合物与移码位点特异性杂交并调节移码位点的功能。
38.如权利要求25所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有至少一个修饰的核苷间连接、糖部分或核碱基。
39.如权利要求25所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有至少一个2′-O-甲氧基乙基糖部分。
40.如权利要求25所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有至少一个磷酸二酯核苷间连接。
41.如权利要求25所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有至少一个5-甲基胞嘧啶。
42.一种调节冠状病毒移码效率的方法，该方法包括将冠状病毒与权利要求25所述的化合物接触，以调节冠状病毒的移码效率。
43.一种筛选移码位点调节剂的方法，该方法包括：
a)将移码位点的靶节段与一种或多种移码位点候选调节剂接触；和
b)测定移码调节程度。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述移码位点调节剂包括寡核苷酸、反义寡核苷酸、DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸、至少其部分能与RNA杂交形成寡核苷酸-RNA双链体的RNA寡核苷酸或嵌合寡核苷酸。
45.包含权利要求25所述化合物的试剂盒或测定装置。
46.一种治疗患有冠状病毒相关疾病或症状的个体的方法，该方法包括给予个体治疗或预防有效量的权利要求25所述的化合物，以通过调节所述冠状病毒的移码位点来抑制冠状病毒的增殖。
47.一种核糖体移码报道质粒，该质粒包含含有核糖体移码位点和荧光素酶报道基因的病毒序列。
48.如权利要求47所述的核糖体移码报道质粒，其特征在于，所述病毒序列是冠状病毒的病毒序列。
49.如权利要求48所述的核糖体移码报道质粒，其特征在于，所述冠状病毒是SARS冠状病毒。
50.如权利要求49所述的核糖体移码报道质粒，其特征在于，所述质粒具有SEQID NO：8、9或10的序列。
51.一种表征冠状病毒RNA中以前未表征的移码位点的方法，该方法包括：
a)获得具有已知移码位点的已知冠状病毒的RNA序列；
b)获得具有未表征移码位点的冠状病毒的RNA序列；和
c)对已知冠状病毒的RNA序列和具有未表征的移码位点的冠状病毒的RNA序列的多序列比对进行协方差分析。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述移码位点的表征包括鉴定滑动位点。
53.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述移码位点的表征包括鉴定假结位点。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，假结的茎和环已被表征。
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