JP3562528B2 - Ｉｋａｒｏｓ：ｔ細胞経路調節遺伝子 - Google Patents
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Description
発明の背景
この発明は、Ikaros遺伝子及びＴ細胞の分化及び生成に関するものである。
前駆幹細胞からのＴ細胞レパトアの生成は、分化経路を通して進行し、後期胸腺内過程はよく実証されているが、初期胸腺外事象は僅かに特徴付けられただけである。最初期の限定的Ｔ細胞分化マーカーはCD3/TCR複合体のCD3δ遺伝子である。
発明の要約
Ikaros遺伝子（Ｔ細胞の初期分化において活性な遺伝子）が発見された。この遺伝子は、独特のジンクフィンガー蛋白質のファミリーであるIkaros蛋白質をコードしている。Ikarosファミリーのイソ型は一般に3'エクソン（IkarosエクソンE7、マウスのIkarosの203〜431アミノ酸残基を含む）を含むが5'領域では異なる。このIkarosファミリーは、Ikaros遺伝子の転写及びプロセッシングから生じるすべてのスプライシング変異体を含む。５つのイソ型をここに記載する。Ikaros蛋白質はCD3δ遺伝子のエンハンサーに結合して活性化し、成熟動物においてはすべてではないにせよ主としてＴ細胞に限定される。この転写因子の胚発生における発現パターンは、Ikaros蛋白質がＴ細胞系列に入ることを調節する遺伝的スイッチとしての役割を演ずることを示唆する。このIkaros遺伝子は又、マウスの初期胚形成の間に近位線条体においても発現している。
一般に、この発明は、１つ以上のIkarosエクソンを含む（又は本質的にこれらからなる）ペプチドをコードする配列を含む（又は本質的にそれらからなる）DNA好ましくは精製したDNAを叙述する。好適具体例において、このIkarosエクソンは、E1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかであり；精製したDNAはエクソンE7をコードしていない。
他の好適具体例において、コードされるペプチドは、更に、第２のIkarosエクソンを含み；その第２のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかであり；第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6の何れかである。
他の好適具体例において、コードされるペプチドは、更に第３のIkarosエクソンを含み；その第３のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかであり；第１のエクソンはE7であり、該第２のエクソンはE3であり、第３のエクソンはE1/2であり；このペプチドはIkarosイソ型５である。
他の好適具体例において、コードされるペプチドは、更に、第４のIkarosエクソンを含み；その第４のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかであり；第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE6であり、第３のエクソンはE4であり、第４のエクソンはE1/2であり；第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE4であり、第３のエクソンはE3であり、第４のエクソンはE1/2であり；ペプチドはIkarosのイソ型３又は４である。
他の好適具体例において、コードされるペプチドは、更に、第５のIkarosエクソンを含み；その第５のエクソンは、E1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかであり；第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE6であり、第３のエクソンはE5であり、第４のエクソンはE4であり、第５のエクソンはE1/2であり；ペプチドはIkarosのイソ型２である。
好適具体例において、コードされるペプチドは、更に、第６のIkarosエクソンを含み；第６のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかであり；第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE6であり、第３のエクソンはE5であり、第４のエクソンはE4であり、第５のエクソンはE3であり、第６のエクソンはE1/2であり；ペプチドはIkarosのイソ型１である。
好適具体例において、コードされたIkarosエクソンの配列は、本質的に、天然のIkarosエクソンの配列又はIkaros活性を有するその断片と同じであり、IkarosエクソンをコードするDNA配列は、天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片をコードするDNA例えば配列番号２又は３からのIkarosエクソンをコードするDNAと少なくとも85％、一層好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98若しくは99％の相同性を有する。Ikarosエクソンをコードする配列は、高又は低緊縮下で、天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片例えば配列番号２、３又は５のIkarosエクソンと同じ又は本質的に同じアミノ酸配列を有するIkarosエクソンをコードする核酸とハイブリダイズする。コードされるIkarosエクソンのアミノ酸配列は、少なくとも30、一層好ましくは少なくとも40、更に好ましくは少なくとも50、最も好ましくは少なくとも60、80、100若しくは200アミノ酸残基の長さである。コードされるIkarosアミノ酸配列は、天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片の少なくとも50％、一層好ましくは60％、更に好ましくは70％、更に好ましくは80％、更に好ましくは90％、最も好ましくは95％の長さである。コードされるIkarosエクソンは本質的に天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片と同じ長さである。コードされるIkarosエクソンのアミノ酸配列は、天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片例えば配列番号２、３又は５のIkarosエクソン配列と少なくとも80％、一層好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98若しくは99％の相同性を有する。コードされるIkarosエクソンのアミノ酸配列は、天然のIkarosエクソン又はその配列の断片の配列例えば配列番号２、３又は５で記載したIkarosエクソンと同じ又は本質的に同じである。そしてこのペプチドはIkarosペプチド活性を有する。
好適具体例において、コードされるペプチド中のこれらのエクソンは、天然のイソ型例えばIkarosイソ型１に見出されるのと同じ相対的直鎖的順序で配置される。例えば、エクソンE3及びE7を有するペプチドにおいてE3はE7のＮ末端に位置する。これらのコードされるエクソンの直鎖的順序は、天然のイソ型に見出されるもの例えばIkarosイソ型１とは異なっている。例えば、エクソンE3、E5及びE7を有するペプチドにおいて、Ｎ末端からＣ末端への方向は、E5、E3、E7である。コードされるペプチド中のこれらのエクソンは、１つ以上の組成（即ち、どのエクソンが存在するか）、直鎖的順序又は数（即ち、幾つのエクソンが存在し又は所定のエクソンが何回存在するか）において天然のIkarosイソ型例えばIkarosイソ型１、２、３、４又は５と異なっている。
他の面において、この発明は、１つ以上のIkarosエクソンを含む（又は本質的にそれらからなる）ペプチド好ましくは純粋なペプチドを叙述する。好適具体例において、このIkarosエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7である。このペプチドはエクソンE7を含まない。
他の好適具体例において、このペプチドは、更に、第２のIkarosエクソンを含む。その第２のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかである。第１のエクソンはR7であり、第２のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6の何れかである。
他の好適具体例において、このペプチドは、更に、第３のIkarosエクソンを含む。その第３のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかである。第１のエクソンはE7である。第２のエクソンはE3であり、第３のエクソンはE1/2である。このペプチドはIkarosイソ型５である。
他の好適具体例において、このペプチドは、更に、第４のIkarosエクソンを含む。その第４のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかである。第１のエクソンはE7である。第２のエクソンはE4であり、第３のエクソンはE3であり、第４のエクソンはE1/2である。第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE4であり、第３のエクソンはE3であり、第４のエクソンはE1/2である。このペプチドはIkarosイソ型３又は４である。
他の好適具体例において、このペプチドは、更に、第５のIkarosエクソンを含む。その第５のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかである。第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE6であり、第３のエクソンはE5であり、第４のエクソンはE4であり、第５のエクソンはE1/2である。このペプチドはIkarosイソ型２である。
他の好適具体例において、このペプチドは、更に、第６のIkarosエクソンを含む。その第６のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかである。第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE6であり、第３のエクソンはE5であり、第４のエクソンはE4であり、第５のエクソンはE3であり、第６のエクソンはE1/2である。このペプチドはIkarosイソ型１である。
好適具体例において、Ikarosエクソンの配列は、本質的に、天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片の配列と同じである。Ikarosエクソンのアミノ酸配列はそれをコードする核酸配列が天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片をコードするDNA例えば配列番号２又は３のIkarosエクソンをコードするDNAと少なくとも85％、一層好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98若しくは99％の相同性を有するようなものである。Ikarosエクソンのアミノ酸配列は、それをコードする核酸配列が高又は低緊縮下で天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片をコードする核酸例えば配列番号２、３又は５のIkarosエクソンと同じ若しくは本質的に同じアミノ酸配列を有するIkarosエクソンにハイブリダイズするようなものである。Ikarosエクソンのアミノ酸配列は、少なくとも30、一層好ましくは少なくとも40、更に好ましくは少なくとも50、最も好ましくは少なくとも60、80、100若しくは200アミノ酸残基長を有する。コードされるIkarosアミノ酸配列は、天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片の少なくとも50％、一層好ましくは60％、更に好ましくは70％、更に好ましくは80％、更に好ましくは90％、最も好ましくは95％の長さを有する。Ikarosエクソンは、本質的に、天然のIkarosエクソンと同じ長さを有する。Ikarosエクソンのアミノ酸配列は、天然のIkarosエクソンの配列又はIkaros活性を有するその断片例えば配列番号２、３又は５のIkarosエクソン配列と、少なくとも80％、一層好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは95％、最も好ましくは98若しくは99％の相同性を有する。Ikarosエクソンのアミノ酸配列は、天然のIkarosエクソン又はその配列の断片と同じ又は本質的に同じである。例えば、配列番号２、３又は５に記載したIkarosエクソン。そして、このペプチドはIkarosペプチド活性を有する。
好適具体例において、ペプチド中のエクソンは、天然のイソ型例えば、Ikarosイソ型１中で見出されるのと同じ相対的直鎖的順序で配置される。例えば、エクソンE3及びE7を有するペプチドにおいて、E3はE7のＮ末端に位置する。これらのエクソンの直鎖的順序は、天然のイソ型例えばIkarosイソ型１で見出されるものと異なっている。例えば、エクソンE3、E5及びE7を有するペプチドにおいて、Ｎ末端からＣ末端への方向はE5、E3、E7である。これらのペプチド中のエクソンは、１つ以上の組成（即ち、どのエクソンが存在するか）、直鎖的順序、又は数（即ち、幾つのエクソンが存在し或は所定のエクソンが何回存在するのか）において天然のIkarosイソ型例えばIkarosイソ型１、２、３、４若しくは５と異なっている。
他の面において、この発明は、Ikarosペプチド例えばIkaros活性を有するIkarosペプチド（例えば、Ikarosイソ型１、２、３、４若しくは５）をコードするDNA配列を含む（又は本質的にそれからなる）DNA好ましくは精製したDNAを叙述する。好適具体例において、コードされるIkarosペプチドの配列は、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片の配列と本質的に同じである。そのDNA配列は、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片例えば配列番号２又は３のDNAと、少なくとも85％、一層好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98若しくは99％の相同性を有する。コードされるペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、３又は５のペプチドと同じ又は本質的に同じペプチドをコードする核酸に高若しくは低緊縮条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ得るようなものである。コードされるペプチドは少なくとも30、一層好ましくは少なくとも40、更に好ましくは少なくとも50、最も好ましくは少なくとも60、80、100若しくは200アミノ酸残基の長さを有する。コードされるペプチドは、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片の、少なくとも50％、一層好ましくは少なくとも60％、更に好ましくは70％、更に好ましくは80％、更に好ましくは90％、最も好ましくは95％の長さを有する。コードされるペプチドは、本質的に、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片と同じ長さを有する。コードされるペプチドは、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片例えば配列番号２、３若しくは５のペプチド配列と同じ若しくは本質的に同じアミノ酸配列と、少なくとも80％、一層好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98若しくは99％の相同性を有する。そして、このペプチドのアミノ酸配列は、本質的に、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片の配列例えば配列番号２、３若しくは５で記載した配列と同じである。
他の面において、この発明は、天然のIkarosペプチドと同じ若しくは本質的に同じアミノ酸配列と少なくとも90％の相同性を有する20アミノ酸以上の長さのペプチドをコードする配列例えば配列番号２、３若しくは５のアミノ酸配列を含む（又は本質液にそれからなる）DNA好ましくは精製したDNAを叙述する。好適具体例において、精製したDNAは、少なくとも30、一層好ましくは少なくとも40、更に好ましくは少なくとも50、最も好ましくは少なくとも60、80、100若しくは200アミノ酸残基の長さを有する。コードされるペプチドは、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片の少なくとも50％、一層好ましくは少なくとも60％、更に好ましくは70％、更に好ましくは80％、更に好ましくは90％、最も好ましくは95％の長さを有する。コードされるペプチドは、本質的に、天然のIkarosペプチドと同じ長さである。Ikarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片と同じ若しくは本質的に同じアミノ酸配列と、少なくとも80％、一層好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは95％、最も好ましくは98若しくは99％相同であるペプチド例えば配列番号２、３若しくは５のアミノ酸配列、並びにIkaros活性を有するペプチド。
他の面において、この発明は、天然のIkarosペプチドと同じ若しくは本質的に同じアミノ酸配列を有するペプチド例えば配列番号２、３若しくは５のペプチドをコードする核酸と高若しくは低緊縮下でハイブリダイズするDNA配列を含む（又は本質的にそれからなる）DNA好ましくは精製したDNAを叙述する。好適具体例において、DNA配列は、天然のIkarosペプチド若しくはIkaros活性を有するその断片をコードするDNA例えば配列番号２又は３のDNAと、少なくとも85％、一層好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは98若しくは99％相同である。精製したDNAは、少なくとも30、一層好ましくは少なくとも40、更に好ましくは少なくとも50、最も好ましくは60、80、100若しくは200アミノ酸残基の長さのペプチドをコードしている。コードされるペプチドは、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片の、少なくとも50％、一層好ましくは少なくとも60％、更に好ましくは70％、更に好ましくは80％、更に好ましくは90％、最も好ましくは95％の長さを有する。コードされるペプチドは、本質的に、天然のIkarosペプチドと同じ長さである。精製したDNAは、天然のIkarosペプチドと同じ若しくは本質的に同じアミノ酸配列例えば配列番号２、３若しくは５のアミノ酸配列と、少なくとも80％、一層好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは95％、最も好ましくは98若しくは99％相同である。そして精製したDNAは、本質的に、配列番号２、３若しくは５に記載したのと同じアミノ酸配列又はその断片を有するペプチドをコードする。
他の面において、この発明は、この発明のペプチドをコードするこの発明のDNA好ましくはこの発明の精製したDNAを含むベクターを含む。
この発明は又、細胞例えば精製したIkaros蛋白質をコードするDNAを含む培養細胞又は幹細胞、Ikaros蛋白質を発現し得る細胞、トランスジェニック動物を生成し得る或は造血細胞例えばリンパ球様細胞（例えば、Ｔ細胞）の均質集団を生成し得る細胞、それぞれ精製したIkaros蛋白質をコードするDNAを含む細胞の本質的に均質な集団、及びこの発明のDNA好ましくは精製したDNAを含む細胞を培地中で培養してこのペプチドを発現させることを含むこの発明のペプチドを製造する方法を含む。
他の面において、この発明は、この発明のペプチド好ましくは実質的に純粋なこの発明のペプチド例えばIkaros活性を有するペプチド（例えば、Ikarosイソ型１、２、３、４若しくは５）を叙述する。好適具体例においては、コードされるIkarosペプチドの配列は、本質的に、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片の配列と同じである。このペプチドの配列は、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片をコードするDNA例えば配列番号２若しくは３のDNAと少なくとも85％、一層好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98若しくは99％相同なDNA配列によってコードされるようなものである。Ikaros活性を有するペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、３若しくは５のペプチドと同じ若しくは本質的に同じアミノ酸配列を有するペプチドをコードする核酸に高若しくは低緊縮条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ得るようなものである。このペプチドは、少なくとも30、一層好ましくは少なくとも40、更に好ましくは少なくとも50、最も好ましくは60、80、100若しくは200アミノ酸残基の長さを有する。このペプチドは、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片の、少なくとも50％、一層好ましくは少なくとも60％、更に好ましくは70％、更に好ましくは80％、更に好ましくは90％、最も好ましくは95％の長さを有する。このペプチドは、本質的に、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片と同じ長さである。このペプチドは、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片例えば配列番号２、３若しくは５のペプチド配列と同じ若しくは本質的に同じであるアミノ酸配列と、少なくとも80％、一層好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは98若しくは99％の相同性を有する。そして、このペプチドのアミノ酸配列は、本質的に、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片例えば配列番号２、３若しくは５で記載された配列の配列と同じである。
好適具体例において、この発明のペプチド若しくはこの発明の精製したペプチドを、この発明のDNA好ましくはこの発明の精製したDNAの発現によって製造する。
この発明は又、Ikaros蛋白質に対する抗体好ましくはモノクローナル抗体の実質的に純粋な調製物、Ikaros蛋白質及び製薬上許容し得るキャリアーを含む治療用組成物、この発明の精製したDNA及び製薬上許容し得るキャリアーを含む治療用組成物をも含む。
他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は免疫系異常例えばＴ細胞若しくはＢ細胞関連異常用の動物モデル例えばヌードマウス若しくはSCIDマウスを治療する方法（治療上有効な量のIkarosペプチドを動物に投与することを含む）を叙述する。
他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は免疫系異常例えばＴ細胞若しくはＢ細胞関連異常用の動物モデル例えばヌードマウス若しくはSCIDマウスを治療する方法（例えば、Ikaros遺伝子産物の発現についてイン・ビトロで選択した細胞（例えば造血幹細胞、例えばIkarosペプチドをコードするDNAでトランスホームした細胞、例えばIkarosペプチドをコードするDNAでトランスホームした造血幹細胞）を動物に投与することを含む）を叙述する。
好適具体例において、これらの細胞をそれらが投与される動物から取り出し；これらの細胞をそれらが投与される動物のMHC適合性の動物から取り出し；これらの細胞をそれらが投与される動物と同系の動物から取り出し；これらの細胞をそれらが投与される動物と同じ種の動物から取り出す。
他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は免疫系異常例えばＴ細胞若しくはＢ細胞関連異常用の動物モデル例えばヌードマウス若しくはSICDマウスを治療する方法（Ikarosペプチドをコードする核酸を動物に投与してその核酸を発現させることを含む）を叙述する。
他の面において、この発明は、例えば造血を促進し又は抑制するようにデザインされた治療の効果を評価する方法（治療を実施してIkaros遺伝子の発現における治療の効果を評価することを含む（即ち、Ikaros遺伝子を評価のための指標として利用する）を叙述する。
好適具体例において、この治療を、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は免疫系異常例えばＴ細胞若しくはＢ細胞関連異常用の動物モデル例えばヌードマウス若しくはSCIDマウス、或は細胞例えば培養幹細胞に施す。
他の面において、この発明は、患者例えばヒトがIkaros遺伝子の誤った発現に関係する異常（例えば、白血病性異常又は免疫不全等の他の免疫系異常、或はＴ細胞若しくはＢ細胞の欠乏により特徴付けられる異常等のＴ細胞若しくはＢ細胞関連の異常）の危険にさらされているかどうかを測定する方法（患者を、Ikaros遺伝子の発現について検査することを含み、非野生型発現又は誤った発現は危険を示す）を叙述する。
他の面において、この発明は、患者例えばヒトがIkaros遺伝子の誤った発現に関係する異常（例えば、白血病性異常又は免疫不全等の他の免疫系異常、或はＴ細胞若しくはＢ細胞の欠乏により特徴付けられる異常等のＴ細胞若しくはＢ細胞関連の異常）の危険にさらされているかどうかを測定する方法（患者からの核酸を供給して患者のIkaros対立遺伝子の構造が野生型と異なるかどうかを測定することを含む）を叙述する。
好適具体例において、この測定は、患者のIkaros対立遺伝子が肉眼的な染色体再配置を有するかどうかを測定することを含む。この測定は、患者のIkaros遺伝子を配列決定することを含む。
他の面において、この発明は、免疫異常例えばＴ細胞関連の異常、Ｔ細胞若しくはＢ細胞の欠乏により特徴付けられる異常についての動物若しくは細胞モデルを評価する方法（動物若しくは細胞モデル中のIkaros遺伝子が予め決めたレベルで発現されるかどうか或はIkaros遺伝子が誤った発現をしているかどうかを測定することを含む）を叙述する。好適具体例において、この予め決めたレベルは、野生型又は正常動物におけるレベルより低い。この予め決めたレベルは、野生型又は正常動物におけるレベルより高い。或は、イソ型発現のパターンは野生型と異なっている。
他の面において、この発明は、トランスジェニックゲッ歯動物例えばIkaros遺伝子即ちIkaros蛋白質をコードするDNAを含むトランス遺伝子（transgene）を有するマウスを叙述する。好適具体例において、Ikaros遺伝子又はDNAは、欠失例えば１つ以上のIkarosエクソンの全部又は一部の欠失（例えば、もし欠失しなければ誤って発現されるエクソンE7の全部又は一部の欠失或はエクソンE3又はE4の全部又は一部の欠失）を含む。
他の面において、この発明は、例えば細胞（例えば幹細胞）中で異種遺伝子を発現させる方法（遺伝子をIkaros応答性制御要素の下に置いてIkaros応答性制御要素をIkaros蛋白質と接触させることを含む）を叙述する。
好適具体例において、Ikaros応答性制御要素は、エンハンサー例えばδＡ要素、NFKB要素又はIkaros結合配列の１つ例えば共通配列の１つを含む（ここに開示する）。Ikaros応答性制御要素はCD3δ遺伝子の調節領域を含む。異種遺伝子及びIkaros応答性制御要素はベクターで運ばれる。この方法は、更に、細胞を、異種遺伝子を含むベクターで、Ikaros応答性制御因子の制御下で、トランスホームする工程を含む。この異種遺伝子は、Ikaros蛋白質を正常に含み又は発現する細胞において発現される。
他の面において、この発明は、Ikaros応答性制御要素の制御下で遺伝子を細胞中で発現させる方法（Ikaros蛋白質を細胞に投与することを含む）を叙述する。
好適具体例において、この方法は、更に、細胞をIkaros蛋白質をコードするDNAでトランスホームしてIkaros蛋白質を供給することを含む。その遺伝子は異種遺伝子である。
他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は神経系異常例えば線条体異常、アルツハイマー病、免疫系異常の動物モデルを治療する方法（治療上有効な量のIkaros蛋白質を動物に投与することを含む）を叙述する。
他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は神経系異常例えば線条体異常、アルツハイマー病の動物モデルを治療する方法（例えば、Ikaros遺伝子産物の発現についてイン・ビトロで選択した細胞（例えば造血幹細胞、例えばIkaros蛋白質をコードするDNAでトランスホームした細胞、例えばIkaros蛋白質をコードするDNAでトランスホームした造血幹細胞）を動物に投与することを含む）を叙述する。
好適具体例において、これらの細胞をそれらが投与される動物から取り出し；これらの細胞をそれらが投与される動物とMHC適合性の動物から取り出し；これらの細胞をそれらが投与される動物と同系の動物から取り出し；これらの細胞をそれらが投与される動物と同じ種の動物から取り出す。
他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は神経系異常例えば線条体異常、アルツハイマー病の動物モデルを治療する方法（Ikarosペプチドをコードする核酸を動物に投与して核酸を発現させることを含む）を叙述する。
他の面において、この発明は、神経系の異常例えば線条体異常、アルツハイマー病の治療の効果を評価する方法（治療を施してIkaros遺伝子の発現における治療の効果を評価することを含む）を叙述する。
好適具体例において、この治療を、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は神経系異常例えば線条体異常、アルツハイマー病の動物モデル、或は細胞例えば培養幹細胞に施す。
他の面において、この発明は、患者例えばヒトがIkaros遺伝子の誤った発現に関連する異常例えば神経系の異常例えば線条体異常、アルツハイマー病の危険にさらされているかどうかを測定する方法（Ikaros遺伝子の発現、非野生型発現又は危険を示す誤った発現について患者を検査することを含む）を叙述する。
他の面において、この発明は、患者例えばヒトがIkaros遺伝子の誤った発現に関連する異常例えば神経系の異常例えば線条体異常、アルツハイマー病の危険にさらされているかどうかを測定する方法（患者からの核酸試料を供給してその患者のIkaros対立遺伝子の構造が野生型と異なっているかどうかを測定することを含む）を叙述する。
好適具体例において、この測定は、患者のIkaros対立遺伝子が肉眼的な染色体再配置を有しているかどうかを測定することを含む。この測定は、患者のIkaros遺伝子を配列決定することを含む。
他の面において、この発明は、神経系の異常例えば線条体異常、アルツハイマー病について動物若しくは細胞モデルを評価する方法（動物若しくは細胞モデル中のIkaros遺伝子が予め決めたレベルで発現しているかどうか或はIkaros遺伝子が誤った発現をしているかどうかを測定することを含む）を叙述する。
好適具体例において、予め決めたレベルは野生型又は正常動物におけるレベルより低い。予め決めたレベルは野生型又は正常動物におけるレベルより高い。
他の面において、この発明は、蛋白質（例えば、第１のIkarosイソ型）とDNA配列（例えば、δＡ配列、NKFB配列、ここに記載したIkaros結合オリゴヌクレオチドに対応する配列の制御下のDNA配列）又はリンパ球限定された遺伝子例えばTCR−α、−β若しくは−δ、CD3−δ、−ε、−γ遺伝子、SL3遺伝子又はHIVLTR遺伝子の制御領域中に存在する部位との間の相互作用（例えば、結合）を抑制する方法を叙述する。これらの方法は、DNA配列を有効量の第２のIkarosイソ型又はIkarosイソ型の（例えば、第２のIkarosイソ型の）DNA結合断片と接触させることを含む。
好適具体例において、この断片は、Ikarosエクソンのすべて又は一部について（例えば、E1/2、E3、E4、E5、E6又はE7のすべて又は一部）、欠失している。
他の面において、この発明は、蛋白質（例えば、第１のIkarosイソ型）とDNA配列（例えば、δＡ配列、NKFB配列、ここに記載したIkaros結合オリゴヌクレオチドに対応する配列）又はリンパ球限定された遺伝子例えばTCR−α、−β若しくは−δ、CD3−δ、−ε、−γ遺伝子、SL3遺伝子又はHIVLTR遺伝子の制御領域中に存在する部位との間の相互作用（例えば、結合）を抑制する方法を叙述する。これらの方法は、蛋白質を有効量のIkaros結合オリゴヌクレオチドと接触させることを含む。好適具体例において、オリゴヌクレオチドは、IK−BS1、IK−BS2、IK−BS3、IK−BS4又はIK−BS5から選択した配列を含む。
好適具体例において、このオリゴヌクレオチドは、選択的に、第１のIkarosイソ型に結合する。このオリゴヌクレオチドは、選択的に、第２のIkarosイソ型に結合する。
他の面において、この発明は、Ikaros結合オリゴヌクレオチド例えばIK−BS1、IK−BS2、IK−BS3、IK−BS4又はIK−BS5を含む。好適具体例において、このオリゴヌクレオチドは、ここに記載したIkaros結合オリゴヌクレオチド配列の１種の少なくとも２、３、４又は５コピーを含む。
他の面において、この発明は、第１のIkarosイソ型の標的DNAへの結合を弱める方法を叙述する。この方法は、標的DNAを有効量の第２のIkarosイソ型と接触させ、或は該第２のイソ型のDNA結合断片と接触させることを含む。
異種遺伝子とは、ここで用いる場合、通常はIkaros応答性制御要素の制御下にない遺伝子のことである。
Ikaros応答性制御要素とは、ここで用いる場合、遺伝子の上流又は下流に存在するときに、調節例えばIkaros蛋白質の存在下での遺伝子の増大した転写を生じるDNAの領域である。
精製したDNAは、この発明のDNAが由来する生物の天然のゲノムにおいて直接隣接している（即ち、5'側と3'側の）両コード配列と直接隣接していないDNAである。従って、この用語は、例えば、ベクター、自律的複製プラスミッド若しくはウイルス又は原核生物若しくは真核生物のゲノムDNAに取り込まれた、或は他のDNA配列とは独立した分離した分子（例えば、PCR又は制限エンドヌクレアーゼ処理により生成したcDNA又はゲノムDNA断片）として存在する組換えDNAを含む。それは又、更なるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAをも含む。
相同とは、２つのポリペプチド分子の間又は２つの核酸分子の間の配列類似性をいう。これらの２つの比較する配列の両方におけるある位置が同じ塩基又はアミノ酸単量体サブユニットで占められているとき、例えば、２つのDNA分子の各々におけるある位置がアデニンで占められているならば、それらの分子はその位置で相同である。２つの配列の間の相同性は、２つの配列により共有される一致する即ち相同な位置の個数の関数である。例えば、２つの配列中の位置の10の内６が一致するか相同であるならば、これら２つの配列は60％相同である。例えば、DNA配列ATTGCCとTATGGCとは50％相同である。
トランス遺伝子とは、技術により細胞に挿入されてその細胞から全部又は一部が発生した動物のゲノムの一部となった一片のDNAのことである。かかるトランス遺伝子は、部分的に又は全体的に、トランスジェニック動物に対して異種である。
トランスジェニック動物例えばトランスジェニックマウスは、トランス遺伝子を含む細胞を有する動物であり、そのトランス遺伝子はその動物に又はその動物の先祖に胎児期例えば胚段階で導入されたものである。
エンハンサー領域とは、エンハンサー領域の上流又は下流に位置するプロモーターからの転写を増大することの出来るシス作用DNA配列のことである。かかるDNA配列は、真核生物の遺伝子発現の分野の当業者には周知である。
実質的に純粋なペプチド調製物とは、天然において細胞中に存在するペプチドを実質的に含まない調製物である。非天然ペプチドの実質的に純粋な調製物は、関心あるペプチドの少なくとも10重量％の調製物である。
誤った発現とは、ここで用いる場合、遺伝子発現の非野生型パターンのことをいう。それは、非野生型レベルでの発現即ち過剰発現又は低発現を含み、遺伝子が発現される時間又はステージに関して野生型と異なる発現パターン例えば予め決めた発生時期又はステージにおける（野生型と比較して）増大した又は減少した発現、発現の組織特異性に関して野生型と異なる発現パターン例えば予め決めた細胞型又は組織型における（野生型と比較して）増大した又は減少した発現、Ikaros遺伝子産物のサイズ、アミノ酸配列、転写後修飾又は生物活性に関して野生型と異なる発現パターン、遺伝子発現における環境刺激又は細胞外刺激の影響に関して野生型と異なる発現パターン例えば刺激の強度の増加又は減少における（野生型と比較して）増大した又は減少した発現パターン、或は野生型と異なるイソ型発現のパターンを含む。
ペプチド、蛋白質及びポリペプチドという用語は、ここでは、互換性を有して用いている。
ペプチドは、次の特性：δＡ要素、NFKB要素又はここに開示するIkaros結合オリゴヌクレオチド共通配列の１つの制御下でDNA配列の転写を刺激する能力、δＡ要素、NFKB要素又はここに開示するIkaros結合オリゴヌクレオチド共通配列の１つの何れかに結合する能力、又は天然のIkarosイソ型のδＡ要素、NFKB要素又はここに開示するIkaros結合オリゴヌクレオチド共通配列の１つの何れかとの結合を競争的に阻害する能力の１つ又はそれより多くを有するならば、Ikaros活性を有する。Ikarosペプチドとは、Ikaros活性を有するペプチドである。
この発明は、Ｔ細胞、Ｔ細胞へ発達し得る細胞を同定し及び一般に造血例えば前駆幹細胞へＴ細胞への分化の研究において有用である。Ikaros遺伝子及びその産物の役割は、例えばIkaros遺伝子若しくはその断片でトランスホームした細胞（例えば、培養細胞）又はトランスジェニック動物において研究することが出来る。この発明は又、細胞系統のマーカー例えばCD3δ遺伝子の発現を促進し、細胞例えば幹細胞のＴ細胞へ発達する能力を増大し、遺伝的なＴ細胞異常例えば白血病の危険のある個人をスクリーニングし、及び、Ｔ細胞の欠乏により特徴付けられる免疫異常（例えば、免疫不全（例えば、AIDS）又は化学物質、薬剤若しくは照射により誘導された免疫不全、又は癌（例えば、白血病））を治療するのにも有用であり、Ikaros遺伝子の構造及び発現又はその遺伝子産物のイソ型を研究し、Ikaros遺伝子の発現又はイソ型の種又は組織による差異を研究し、DNA結合蛋白質の構造及び機能を研究し、ジンクフィンガー含有蛋白質の構造及び機能を研究し、トランスジェニック動物を作成し、Ikarosの標的分子への結合を阻害し、Ikarosイソ型の標的DNAに対する相対的親和性を研究し、及びIkarosイソ型の制御下での遺伝子発現を調べ又は操作するのにも有用である。
この発明の他の特徴及び利点は、下記の説明及び請求の範囲から明らかとなろう。
詳細な説明
先ず、図面を簡単に説明する。
図面
図1Aは、CD3エンハンサーのδＡ要素（配列番号１）のマップである。
図1Bは、種々の要素配列の制御下でtkCATレポーター遺伝子の発現により分析した要素の活性に対するCRE及びＧボックスの寄与を示すグラフである。左側の棒グラフにおいて、塗りつぶした棒はtkcatレポーター遺伝子を、影をつけた棒はtkcat3δＡを、水平線をつけた棒はtkcat3δAmu1（−CRE）を、点刻した棒はtkcat3δAmu2（−Ｇボックス）を表す。右側の棒グラフにおいて、塗りつぶした棒はtkcatを、左側の斜線をつけた棒はtkcatδehnを、点刻した棒はtkcatδenh（−CRE）を、右側の斜線をつけた棒はtkcatδenh（−δＡ）及び空白の棒はtkcatδenh（−Ｇボックス）を表す。
図1Cは、非Ｔ細胞におけるδ要素の活性におけるIkaros発現の影響を示すグラフである。この棒グラフにおいて、塗りつぶした棒はtkcatを、点刻した棒はtkcat3δＡを、斜交平行線をつけた棒はtkcatδenhを表す。
図２は、マウスIkaroscDNAのDNA配列及びそれによりコードされる所望のアミノ酸配列のマップである（配列番号２）。
図３は、ヒトIkaroscDNAの部分配列である（配列番号３）。
図４は、IK−１のcDNA（配列番号５）のアミノ酸構成の描写である。（IK−１は、６つのすべてのコーディングエクソン（Ex1/2;Ex3;Ex4;Ex5;Ex6及びEx7）からなる。）矢印は各エクソンの最初のアミノ酸を示している。
図５は、Ikaros1〜５のcDNAにおけるエクソン使用の図解である。エクソン番号は各ボックスの左下隅に示してある（Ex）。ジンクフィンガーモジュールをコーティングエクソンの上側に示してある（Fx）。第１行はIkaros1を、第２行はIkaros2を、第３行はIkaros3を、第４行はIkaros4を、第５行はIkaros5を表す。
図６は、Ikaros遺伝子座におけるエクソン編成の描写であり、応答性イソ型の増幅に用いるプライマーのセット1/2及び3/4を示してある。特に、図６は、オリゴ1/2IK−1/IK−2/IK−４及びオリゴ3/4IK−1/IK−3/IK−５を表す。
図７は、マウスIkaros遺伝子のゲノム編成のマップである。完全な遺伝子は80〜90kBの長さである。イントロンDNA又は特徴付けられていないDNAは、5'と3'の間の線で示してある。エクソンはボックスで示してある。f2、f10、f4及びf8と番号を付けた線は、直上の配列に対応するファージ挿入物を示している。制限部位は通常の略語で示してある。
図８は、異なる遺伝子発現のIkarosイソ型制御のモデルである。Th＝胸腺、Sp＝脾臓、Ex＝胚発生日数、Dx＝生後日数。左欄は、所定の発生ステージにおけるイソ型の相対的な発現を表している。空白の棒＝Ik−１、水平縞＝Ik−２、斜縞＝Ik−３、塗りつぶした棒＝Ik−４。右欄は、所定の発生ステージで生じたのIkaros結合部位の反応性を示している。薄い棒＝低親和性部位（イソ型１、２、３及び４が同じ親和性で結合する部位）、濃い棒＝高親和性の逆方向又は直列反復配列含有部位（例えば、NFKB部位、Ik1〜４は高い親和性で結合する）、斜線をつけた棒＝単一の高親和性部位（Ik1及びIk2は結合するがIk3及びIk4は結合せずそれ故Ik−１及びIk−２の結合を弱めない部位）。
Ikaros:造血分化の主要な調節物質
適当な微小環境における造血幹細胞は、多くの細胞系統の内の１つに入って分化する。この分化経路における別個のチェックポイントにおいて機能する変換信号分子及び転写因子は、これらの初期前駆細胞の運命を特定する。かかる分子は、発生における主要な調節物質と考えられるが、初期造血ステージに限定される病気のマーカーとして機能するとも考えられる。
Ｔ細胞及びＢ細胞における遺伝子発現の基礎となる転写機構の研究は、リンパ球分化に関与する幾つかの転写因子を同定した。しかしながら、これらの遺伝子の幾つかは、成熟動物及び発生中の胚における発現の非限定的パターンにより測定されたように幾つかの発生系において役割を演じるようである。成熟動物においてＴ細胞及び初期リンパ細胞に限定されるHMGボックスDNA結合蛋白質TCF及びLEFは、発生中の胚においては広く発現されている。Ｔ細胞特異的なGATA−３転写因子も又初期胚における造血系の外で発現している。etsファミリーのメンバーのEts−１及びElf−１も又、広く分布している。更に、これらの蛋白質の殆どの結合親和性及び転写可能性は、他の組織限定分子により制御されている。これらのets蛋白質は同種の配列と結合する高い親和性のために更なる因子と相互作用する、TCFI、LEF及びets−１は、活性転写のための他のリンパ系限定アクセサリー蛋白質と相互作用するに違いない。
初期Ｔ細胞における遺伝子発現の制御におけるリンパ系限定転写エンハンサーの研究において、我々は、ジンクフィンガーDNA結合蛋白質をコードするIkaros遺伝子を単離した。初期胚において、このIkaros遺伝子は造血肝において発現されるが、妊娠中期から後期にかけて胸腺に限定されるようになる。IkarosmRNAを有する他の胚部位は、線条体中の小さい領域のみである。成熟動物において、IkarosmRNAは、胸腺及び脾臓においてのみ検出される（Georgopoulos等、1992）。Ikaros遺伝子は、非リンパ系細胞中で異所的に発現された場合には、転写エンハンサーとして機能する。
Ikaros遺伝子は、初期リンパ球及びＴ細胞分化において重要な役割を演じている。Ikaros遺伝子は、初期胚の造血部位において豊富に発現され、その後発生中の胸腺中に限定される。胸腺は、脾臓と共に、成熟動物における発現の活性部位である。このIkaros遺伝子の高度に豊富な発現は又、初期及び成熟一次Ｔ細胞及び細胞系統においても見出された。このIkaros遺伝子の、胚及び成熟動物のＴ細胞前駆体が共に初期Ｔ細胞分化抗原の調節ドメインからの転写を活性化するコードされた蛋白質の能力を生ずる部位に限定された発現パターンは、Ｔ細胞特性化における決定の役割を支持した。
Ikarosゲノム遺伝子座における差次的（differential）スプライシングは、別個のDNA結合部位を有する蛋白質をコードする少なくとも５つの転写産物を生成する。これらのIkaros蛋白質イソ型（IK−１、IK−２、IK−３、IK−４、IK−５）は、重複を有するが、Ｎ末端のジンクフィンガーモジュールの差次的利用により指図される別個のDNA結合特異性をも有する。これらのIkaros蛋白質の４つのコア結合部位は、GGGAモチーフであるが、この配列の外ではそれらの特異性は劇的に変化する。IK−３蛋白質は、それが結合し得る部位の数を限定する5'及び3'両フランキング配列における塩基に対する強い選択性を示す。Ik−１蛋白質も又、これらのフランキング塩基の幾つかに対する強い選択性を示し、一層広い範囲の配列と結合することが出来る。Ik−２蛋白質（３種の蛋白質の内で最も無差別）は、丁度GGGAa/tモチーフを有する部位に結合することが出来る。最後に、Ik−１に類似の配列特異性を有するIk−４蛋白質は、第２の部位が近接しているときにのみ高い親和性を有して結合し、この蛋白質による協同的部位占有を示している。多くのIkaros蛋白質に対する推定上の結合部位を、Ｔ細胞レセプター−δ、−β及び−α並びにCD3−δ、−ε及び−γ遺伝子のエンハンサー、IL2−Ｒプロモーター中のHIVLTR並びに多様な他のリンパ球限定遺伝子中で同定した。これらの部位の１つ、Il−2Rαエンハンサー中のNFkB変異体は、これらの蛋白質のすべてに高い親和性で結合する。このNFkBモチーフ（Ｔ細胞中のIl2レセプターαの発現に対する重大な調節要素）は、Ｔ細胞及び非Ｔ細胞においてIk−１及びIk−２イソ型によって強く活性化される。IL−2Rα遺伝子は活性化Ｔ細胞中で高レベルに発現されるが、Ikaros遺伝子をやはり高レベルで発現する胎児胸腺細胞においても高レベルに発現される。従って、Ｔ細胞の分化及び活性化の間に少なくともIL2αレセプターの遺伝子調節が、共通基盤上で相互作用するNFkB及びIkaros転写因子の複雑な相互作用によって制御され得る。
Ikarosイソ型の胚における発現パターン及び活性化能力は、著しく異なっている。強い転写因子Ik−１及びIk−２は、初期胎児肝、成熟中の胸腺及び発生中の脳の小さい領域において豊富に発現されているが、弱い活性化因子Ik−３及びIk−４は低レベルで発現されている。しかしながら、Ik−１及び特にIk−２蛋白質はIk−３及びIk−４より広い範囲の部位に結合するので、Ik−３及びIk−４と同じ配列に結合する利用可能な分子は、類似の濃度であろう。更に、14日胚の胸腺において、弱い活性化因子Ik−４は、Ik−１及びIk−２イソ型以上のレベルで存在する。認識モチーフ（NFkB変異体）の完全な若しくは不完全な、逆方向反復若しくは直列反復配列に対するIk−４、Ik−１及びIk−３の間の競争は、初期胸腺においてこれらの部位からの低レベルの転写活性化を媒介することが出来る。非活性化Ik−４蛋白質成熟胸腺細胞の減少したレベルと組合せた活性化Ikaros因子の定常状態レベルは、発生中の胸腺においてこれらの二重の部位の活性をオンにすることが出来る。これは、ステージ特異的なＴ細胞分化抗原の新たな発現を生じ得る。最後に、低親和性の結合部位からの活性化は、Ikaros活性化蛋白質が過剰である場合には、Ｔ細胞分化のこれらの後期ステージにおいてのみ可能である。ショウジョウバエNKkB相同体ドーサル（Dorsal）の濃度勾配及び他の核因子との別個の蛋白質−蛋白質相互作用は、ハエ胚におけるこの活性化レベル及び高及び低親和性結合部位の域値応答の原因である。図８は、異なる発生ステージにおけるIkarosイソ型の相対濃度が種々の部位において異なる反応性を与えるというモデルを提供する。
Ik−３及びIk−４蛋白質の転写活性は、更に、Ｔ細胞信号媒介の翻訳後修飾又は蛋白質−蛋白質相互作用によって調節され得る。Ik−４蛋白質は、NFkBモチーフと協同様式で結合し、それ故、Ikaros若しくはNFkBファミリーの他のメンバーとその場で相互作用し得る。これらの蛋白質−蛋白質−DNA複合体は、分化における転写結果を指図する。
Ｔ細胞個体発生の間のIkarosイソ型の分化における発現、それらの重複及び別個の結合特異性並びにそれらの多様転写（diverse transcription）能力は、ステージ特異的なＴ細胞分化マーカーの規則的な活性化の原因であり得る。発生中のリンパ球における遺伝子発現の多層は、これらの蛋白質の調節を受け易いことはあり得る。これらの細胞中のIkarosファミリーと他の因子との間の、量的に類似の及び別個の標的部位における、共同的相互作用及び／又は競争は、休止及び活性化リンパ球の遺伝的構造を指図し得るであろう。このIkaros遺伝子の機能の詳細な吟味は、提案したリンパ球における主要遺伝子としての機能を強く支持する。Ikaros遺伝子の、初期造血及びＴ細胞発生に必要な遺伝的スイッチとしての役割は、最後は、トランスジェニック動物における遺伝子削除の研究において扱われる。
CD3δエンハンサーのδ要素の突然変異分析
Ｔ細胞分化における初期事象を特徴付けるのに有用な１つのアプローチは、Ｔ細胞限定抗原の転写調節を研究することである。我々は、最初期及び確定Ｔ細胞分化のマーカーの１つ、CD3/TCR複合体のCD3δ遺伝子の転写制御を選択した。Ｔ細胞系統へ入るように調節する遺伝的スイッチとして機能し得るＴ細胞拘束以前に発現される転写因子を同定するために、我々は、この遺伝子のＴ細胞特異的エンハンサー媒介による発現を特徴付けた。このエンハンサーは、Ｔ細胞内に限定された活性を有する２つの機能的に別個の要素δＡ及びδＢとからなる。δＡ要素の突然変異分析は、更に、２つの転写的に活性な結合部位、CRE（環状AMP応答−）様要素及びＧリッチ配列モチーフ（これらの両者は、δＡ要素とCD3エンハンサーの完全な活性に必要とされる。図１を参照されたい。）を同定した。
図１は、CD3δエンハンサーのδＡ要素の機能の精密な吟味を描写している。図1Aは、δ要素（配列番号１）における結合部位を示している。ボックスで囲った配列は、CRE様及びＧリッチモチーフ（両者は、δＡ要素の活性にとって重要である）を表している。δＡ要素に導入された突然変異を配列の下側に示してある。
図1Bは、Ｔ細胞系統EL4における過渡的発現アッセイにより分析したδＡ要素及びCD3δエンハンサーの活性に対するCRE及びＧボックスの寄与を示している。反復要素としての野生型δＡ、δAmu1及びδAmu2の制御下での又はCD3δエンハンサーの関係におけるtkCATレポーター遺伝子の活性を、Georgopoulos等、（1992）Mol.Cell.Biol.12:747に記載されたようにして測定した。レポーター遺伝子活性（R.A.）を、各トランスフェクションアッセイについて評価したクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）の成長ホルモン（GH）に対する比として表した。図1Cは、非Ｔ細胞中でのIkaros遺伝子（Ik−２）の発現がδＡ要素の活性を増大させることを示している。CDM8及びCDM8:Ikaros組換えＩ発現ベクターを、Georgopoulos等、（1992）に記載されたように、tkcat3δＡ、tkcat3δAmu1、tkcat3δAmu2及びtkcatδエンハンサーレポーター遺伝子とCV1（腎臓上皮）細胞中にコトランスフェクトした。Ikaros発現の存在時と不在時のレポーター活性の比（R.A.＝CAT/GH）を評価した。偏在的に発現されるCRE結合蛋白質の３つのイソ型を、δＡ要素のCRE様結合部位と相互作用する能力のためにＴ細胞からクローン化した（Georgopoulos等、（1992）参照）。この蛋白質の主要陰性変異体はＴ細胞におけるこのエンハンサー要素の活性を低下させるが、すべての造血及び非造血細胞におけるこの転写因子の発現は、それが初期プロ胸腺細胞前駆体におけるCD3δエンハンサーを活性化するスイッチであることの反証となる。このδＡ要素の変異体（δAmu1−CRE）を用いて、Georgopoulos等、（1992）に記載されたように、Ｔ細胞発現ライブラリーをスクリーニングした。下記のように、Ａ要素のＧボックスに結合する新規なジンクフィンガー蛋白質（Ikaros）をコードしているＴ細胞限定cDNAをクローン化した。
Ikaros遺伝子のクローン化
成熟Ｔ細胞系統E14からのＴ細胞発現cDNAライブラリーをAZAPファージベクター中に構築した。
CD38エンハンサーの１つの蛋白質結合部位からの配列（配列番号４）をコードする多数化されたオリゴヌクレオチドを放射標識プローブとして用いてこの発現ライブラリーを、SinghとMcKnightのサウスウエスタンプロトコールによって、エンハンサー機能に結合してそれを媒介するＴ細胞特異的蛋白質についてスクリーニングした。４つの遺伝子コードDNA結合蛋白質が単離された。その１つであるIkaros遺伝子はＴ細胞特異的蛋白質をコードしていた。
Ikarosの配列
Ikaros遺伝子の配列を、サンガーのジデオキシ配列決定プロトコールを用いて決定した。誘導されるアミノ酸配列をGCGのMAPプログラム（ウィスコンシン大学から入手可能）及びStriderシーケンス分析プログラムを用いて決定した。図２は、IkaroscDNA及びそれによりコードされる誘導したアミノ酸配列の配列（配列番号２）を与える。
Ikaros蛋白質
図２（Ik−２）に示したIkaros蛋白質は、２つの別々のクラスターに構成される５つのCX2CX12HX3Hジンクフィンガーモチーフを有する431アミノ酸からなる（図５も参照されたい）。３つのフィンガーの第１のクラスターは、開始メチオニンから59アミノ酸の位置にあるが、他方第２のクラスターはこの蛋白質のＣ末端に第１のクラスターから245アミノ酸下流に見出される。この蛋白質の２つのフィンガーモジュールは、ジンクフィンガーのCys−Hisファミリーの共通アミノ酸組成からはずれている。第１のクラスター中のフィンガー３及びＣ末端のフィンガー５はヒスチジン残基の間に４つのアミノ酸を有する。この２つの広く離れた領域内のジンクフィンガーの配置は、ショウジョウバエの体節形成ギャップ遺伝子ハンチバック（Hunchback）の配置の追憶である。蛋白質データにおける類似性の検索は、Ikarosの第２フィンガークラスターとこれらの分子のＣ末端のハンチバックとの間の43％の同一性を明らかにした。これらの蛋白質のＣ末端における類似性及びそれらのフィンガードメインの類似の配置は、これらの蛋白質が進化的に関連していて種を超えて保存されたジンクフィンガー蛋白質のサブファミリーに属している可能性を高める。
Ikarosイソ型
Ik−２に対応するcDNAに加えて、Ikarosゲノム遺伝子座における分化スプライシングにより生成される４つの他のcDNAをクローン化した。これらのcDNAをコードするイソ型を、前に特徴付けしたIkaroscDNA（Ik−１、図１）の3'からの300bp断片を用いて同定した、図４及び５に示すように、各イソ型は、E1/2、E3、E4、E5、E6及びE7という６つのエクソンの３つ以上から導かれる。すべての５つのcDNAは、それぞれＮ−53及びＣ−末端236アミノ酸ドメインをコードするエクソンE1/2及びE7を共有している。これらの５つのcDNAは、Ｎ末端ジンクフィンガードメインをコードするエクソンE3〜E6の種々の組合せからなる。Ik−1cDNAは、Ｎ末端の４つのジンクフィンガー及びＣ末端の２つのジンクフィンガーを有し、ショウジョウバエ体節形成蛋白質ハンチバックに対する最強の類似性を有する58kD蛋白質をコードしている（図５において、ジンクフィンガーはF1、F2＋F3、F4及びF5＋F6で示してある）。Ik−２及びIk−3cDNAは、重複を有するが種々の組合せのジンクフィンガーを有する48kdの蛋白質をコードしている。Ik−３は、フィンガー１、２、３を含んでいるが、他方Ik−２はフィンガー２、３及び４を含む。43.5kDのIk−４蛋白質は、Ｎ末端にIk−１及びIk−２にも存在する２つのフィンガーを有する。Ik−5cDNAは、Ik−１及びIk−３と共通のＮ末端フィンガー１つのみを有する42kdの蛋白質をコードしている（図１）。このIkaros蛋白質によるジンクフィンガーモジュールの分化における利用は、重複を支持するが、分化におけるDNA結合特異性を支持する。
イソ型のcDNAクローン化を下記のように実施した。λZAP中のＴ細胞系統EL4から作成したcDNAライブラリーを、前述のIkaroscDNA（イソ型２）の3'からの300bp断片を用いて高緊縮にてスクリーニングした。陽性クローンを、エクソン７の5'からのアンチセンスプライマーを用いる配列決定によって特徴付けた。
Ikaros発現
Ikaros遺伝子の組織特異的発現
Ikaros遺伝子をＴ細胞及びそれらの子孫において発現させる。成熟マウスにおいて、IkarosmRNAは、胸腺及び脾臓に限定されるが、胸腺内での発現は脾臓の約３倍強である。Ｔ細胞の涸渇した脾臓細胞調製物はこのメッセージを非常に低レベルで発現した。細胞系統中でのIkaros発現の実験は、Ikaros遺伝子がＴ細胞及びそれらの子孫において発現されるという考えを確実にした。IkarosmRNAは、多くのＴリンパ腫細胞系統中で検出された。Ｔ細胞系統EL4は、高レベルで発現したが、他方D011.10、BW5147及びSL12.2リンパ腫は中程度〜低レベルの発現を示した。骨髄性の形態及び分化可能性を示す骨髄由来前駆細胞FDCP1、マスト細胞系統RBL、マクロファージ系統J774（検出された発現は胸腺細胞におけるより25倍低い）及び赤血球細胞に分化誘導されたMEL細胞を含む他の造血系統を表す細胞系統においては、発現が検出されないか又は非常に低レベルの発現が検出された。それにもかかわらず、中レベルのIkarosmRNAが、Ｂ細胞リンパ腫A20及び前赤白血病細胞系統MELにおいて検出された。これらの細胞系統の不滅化及びそれらの白血病の表現型は、正常Ｂ細胞（脾臓のＴ細胞涸渇集団）中又はイン・ビボで赤血球前駆細胞中で有意のレベルで発現するように見えない（in situデータより）この核因子の異所的発現を説明することが出来る。或は、これらの細胞系統中のこの胸腺細胞限定された因子の発現は、リンパ系統又は赤血球系統に分化する能力を有する初期前駆体の存在を反映しているのかもしれない。
Ikaros遺伝子の組織分布を、Ｔリンパ腫細胞系統EL4、BW5147、DO11.10、SL12.1;B細胞リンパ腫A20;成熟マウスから単離した胸腺、脾臓、腎臓、脳及び心臓の組織；脾臓胸腺細胞（全RNA及びポリＡ−RNA）；骨髄由来幹細胞前駆細胞FDCP1;マクロファージ細胞系統J774;マスト細胞系統RBL;未分化MEL及び58時間DMSO誘導したMEL細胞；及び最終的にＴ涸渇した脾臓細胞（TDSC）から調製した全RNAのノーザンハイブリダイゼーションによって測定した。IkarosIk−2cDNAの3'末端からの320bp断片（bp1230〜1550）をプローブとして用いた。
Ikaros遺伝子の発現の一時的な調節
造血においていつIkaros遺伝子が活性化されるのかを測定するために、その発現を、発生中のマウス胚においてイン・シトゥー（in situ）で研究した。造血は、マウス胚の卵黄嚢中で、原始赤芽球の大集団の生成と共に７日目に始まる。IkarosmRNAは、８日目には、発生のこの時期に発現される赤芽球特異的転写因子GATA−１と対照的に、卵黄嚢内で検出されない。胚中で、適当なIkarosの発現は、最初、初期肝臓原基内で、その造血機能の開始時に検出される（9 1/2〜10 1/2日目）。この時期に、多能性幹細胞並びに更に限定された前駆細胞が肝臓中に見出され、造血系統の全スペクトルを有する照射動物を上首尾で再構成することが出来る。Ikaros遺伝子の発現は、14日目まで肝臓中に強く残り、その後、肝臓が妊娠中期を通じて造血の主要部位であり誕生まで活性であり続けるにもかかわらず下降し始める。妊娠中期の胎児の肝臓におけるIkaros遺伝子の下降する発現は、多能性幹細胞から一層拘束された赤芽球前駆細胞への造血プロフィルの変化と一致する。
Ikaros発現の第２の部位は、リンパ球生成幹細胞が最初にクローン化される約12日目の胸腺原基にある。発現している細胞の一群が、周辺の非発現細胞で囲まれた胸腺原基の中心で検出される。発生中の胸腺における発現は、16日目までに極めて顕著になり、胚形成から成熟生物体までを通じて持続する。これらの発生ステージにおいて、IkarosmRNAの発現は、胸腺全体で検出されるが、髄質部分におけるレベルは皮質におけるレベルより僅かに高い。
Ikaros発現は、妊娠後期には、最初、脾臓において検出されるが、胸腺のレベル（19日目）に比べて低レベルである。脾臓は妊娠中期から赤血球生成及び骨髄生成が活性であるが、胸腺からの成熟Ｔ細胞を有する集団は、胚形成の後期に始まり、Ikaros遺伝子の後期発現と相関する。Ikarosメッセージの発現は、骨髄特異的因子Spy1及び赤血球因子GATA−１と対照的に長骨の骨髄又は脊柱（19日目）において検出されない。別個の造血部位で検出されるIkaros遺伝子の発現パターンは、胚発生を通じて、Ｔ細胞及びそれらの前駆細胞への限定と一致している。マウス胚においてIkaros発現を示した唯一の別の部位は、近位線条体のもとである脳内の限定された領域であった（12〜19日目）。
妊娠中のCD1マウス（Charles River）から胚を採取して寸法に応じて２時間から２日間４％パラホルムアルデヒド中で固定した。一連の脱水工程をアルコール中で行ない、次いで、キシレン中で行なってからパラプラスト包埋した。公開されたプロトコールに従って切片を調製して処理した。300bpの寸法のセンス及びアンチセンスＰ−UTPRNAプローブを、IkaroscDNAの3'非翻訳領域から作成し、48℃で一晩選択したスライドにハイブリダイズさせるために用いた。高緊縮洗浄の後に、スライドを脱水し、稀釈した写真用エマルジョン（NBT2）に３週間浸した。浸したスライドを展開し、ギムザ染色して明暗領域顕微鏡観察により分析した。
Ikarosイソ型の発現
発生中の胚におけるIkarosイソ型の発現パターンを研究した。２セットのプライマーを用いて、５つのcDNAを、胚及び生後組織からの別個の寸法のバンドとして増幅した（図６）。β−アクチンcDNAに相補的なプライマーの第３のセットを用いて、反応に用いるcDNAの量を標準化した。プライマー1/2は、Ik−１、Ik−２及びKk−4cDNAからの720、457及び335bpの断片を増幅した。プライマー3/4は、Ik−１、Ik−３及びIk−5cDNAからの715、458及び293bpの断片を増幅した。検出された650bpのバンドは、Ik−１及びIk−２共増幅のアーティファクトである（Ik−1/Ik−２及びIk−1/Ik−３ハイブリッド分子を表す）。それは、プライマーのIk−１、Ik−２及びIk−３に対する比が減少した場合に後期増幅サイクルにおいて有意のレベルで存在する。このバンドは又、Ik−１、Ik−２及びIk−3DNAテンプレートを共増幅したときにも検出される。上述のバンドの同定も又、クローニング及び配列決定によって確実にした。650bp種が新規なcDNAとしてクローン化されなかったことは注目すべきことである。
胚発生の間に、すべての５つのIkarosmRNAは、造血中心及び脳において種々の相対的レベルで発現された。Ik−1RNAは、初期胎児肝及び成熟中の胸腺において豊富に発現されたが、他方Ik−２は、相対濃度において２番目であった。Ik−４イソ型は、初期胎児肝及び成熟中の胸腺（肝臓E14、胸腺E16及びD1）におけるIk−１及びIk−２に比べて低レベルで発現された。しかしながら、それは、初期胸腺及び妊娠中期の肝臓（表１、胸腺E14、肝臓E16）においてIk−１及びIk−２に匹敵する量で発現された。Ik−３及びIk−５イソ型は発現したが発生を通じてIk−１及びIk−２より有意に低レベルであった（表１）。すべての５つのイソ型は、胚の脳において発現した。Ik−１は、mRNAが最も豊富であり、Ik−２とIk−４とは同程度であったが低レベルであり、他方Ik−３及びIk−５はリース発現であった。
後期胚の胸腺において検出されるIkarosイソ型の発現パターンは、誕生後まで持続したが、他方下降する肝臓での発現は停止された。新生児の脾臓は、Ik−１及びIk−2mRNAのみを有意の量で発現した。低濃度のIk−１が、新生児の脳において依然検出された。これらのデータは、すべての同定されたIkarosスプライシング産物に共通するIkaros遺伝子の3'から作成したRNAプローブを用いて行なった我々の前のイン・シトゥーハイブリダイゼーション研究と一致し、更に補うものである。
胚組織は、妊娠中の母親の胎児から得た。胚発生の種々のステージの胸腺、脳及び脾臓から調製した２μｇの全RNAを、ランダムヘキサマーとSuperscript RNアーゼＨとを用いるcDNA合成に用いた。作成したcDNAの1/10を、PCR増幅において、プライマーの1/20、3/4及びアクチンA/Bセットと共に用いた。PCR反応物を95℃５分間で変性させてポリメラーゼを80℃で加え、次いで、94℃45秒間、63℃１分間及び72℃１分間で25サイクルにわたって増幅した。アクチンcDNAのPCR増幅は、30サイクルにわたって行なった。生成物を２％Seakam FMCアガロース上で分離し、バンドを切り出してクローン化し（Clonteck,TAクローニングキット）、配列を決定してそれらの同定を確認した。
Ikarosは、δＡ要素からの転写を刺激する
初期転写の研究
我々は、δＡ要素に結合し得るIkaros蛋白質がこの結合部位からの転写を活性化するかどうかを試験した。tkCATレポーター遺伝子を、反復δＡ結合部位（＋／−CRE/−Ｇ）の制御下又はCDδエンハンサーの制御下において、Ikaros遺伝子を発現する組換えベクターと、腎臓上皮細胞系統CV1においてコトランスフェクトした。非Ｔ細胞中でのIkaros遺伝子の発現は、反復δＡ要素のＧボックス及びCD3δエンハンサー関連の転写を強く刺激した（図1C参照）。δＡ及びδAmu1（−CRE）要素の活性は、それぞれ、８倍及び７倍に刺激されたが、他方CD3δエンハンサーの発現は５倍に刺激された。CD3δエンハンサーは少なくとも２つの調節要素からなっているので、これらの部位に結合するすべての転写因子の発現がその完全な活性化能力のために必要である。Ikaros遺伝子の発現は、チミジンキナーゼプロモーター又はδAmu2（−Ｇボックス）要素の活性を有意に刺激しなかった（図1C参照）。これらのデータは、Ikaros遺伝子はCD3δエンハンサーのＴ細胞特異的δＡ要素の活性を制御することが出来るという我々の仮説を確実にし、それがＴ細胞において少なくともCD3δ遺伝子の発現を媒介することが出来るということを示唆する。
Ikaros蛋白質の発現パターン及びCD3δエンハンサーの活性を調節するその能力は、胚及び成熟動物のＴ細胞における遺伝子発現の媒介における役割と一致する。胎児肝の造血幹細胞におけるその初期の発現は、それが初期の前胸腺細胞前駆体において発現され得ることを示唆し、それが多能性幹細胞からＴ細胞系統への拘束の原因である可能性を高める。
Ikaros1〜３イソ型の結合部位選択
Ikarosイソ型のＮ末端のジンクフィンガーモジュールの分化における利用がそれらのDNA結合特異性に寄与する可能性を研究するために、我々はこれらの蛋白質の３つについて高い親和性の結合部位をクローン化した。Ｎ末端の４フィンガーのプールからの４つ全部（Ik−１）又は３つのフィンガーの２つの別個の組合せ（Ik−２及びIk−３）を含むので、Ik−１、Ik−２及びIk−３蛋白質を選択した（図５）。我々は、これらの蛋白質が特異性において、これらの推定上のDNA結合モジュールの２つ又は１つのみを含むIk−４及びIk−５蛋白質と重複していることを予想した。
ランダムオリゴヌクレオチドのプールからの５回の結合部位選択の後に、Ik−１−、Ik−２−及びIk−３−選択したオリゴマーをクローン化して配列決定し、共通のモチーフについて並べた（表２、３及び４、表において肉太活字は保存配列を示す）。
これらの蛋白質の各々に共通の認識配列を導いた。Ik−１、Ik−２及びIk−３コアモチーフは、それぞれ
及び
である。
Ik−１及びIk−３配列は、７塩基対コア
を共有した。Ik−３蛋白質は、このモチーフの5'及び3'フランキング部分の両方の特定のヌクレオチドに対する強い照合を示した。Ik−２の共通配列は、Ik−１及びIk−３ヘプタヌクレオチドと５塩基を共有し、この配列の外では多数の縮重を示した。これは、Ik−２蛋白質を広範囲の認識配列に高い親和性で結合させることが出来る。Ik−３蛋白質により選択されたこれらのオリゴヌクレオチドの他の特徴は、それらの85％が第２の共通配列を含んでいたことである（表２でアンダーラインを付けてある）。対照的に、Ik−１及びIk−２によって選択したオリゴヌクレオチドは、それぞれ、50％及び38％しか第２の結合部位の可能性を有しなかった（表１及び３でアンダーラインを付けてある）。これは、Ik−１、Ik−２及びIk−３の選択したコアモチーフに対する親和性の差異を示唆しているといえる。二重認識配列は、これらの蛋白質のこれらの部位に対する見かけの結合親和性を増大させ得る。
結合部位の選択を次のようにして行なった。ランダムオリゴマーのプールを5'及び3'の限定配列の25塩基対（BamH I及びEcoR I制限部位を含む）及び中央のランダム配列の15塩基を用いてデザインした。第一回の選択において、グルタチオンアガロースビーズ（20μｌビーズ容積）に結合したIkaros−GST融合体を、結合アッセイにおいて、500,000cpmの末端標識したランダムプライマーと共に用いた。氷上での結合反応の20分後に、これらのビーズを穏やかに遠沈し、10倍過剰の氷冷１×結合緩衝液で２〜３回洗った。結合したプライマーを0.1％SDS、10mMトリス（pH7.5）にて溶出して回収放射能を測定し、次いで、フェノール抽出して10μｇのグリコーゲンの存在下で沈殿させた。回収したDNAの1/5を反応物に含まれるα−P32dCTPを有する限定5'及び3'配列に相補的なプライマーを用いて再増幅して均質に標識された選択したオリゴマーのプールを生成した。すべてのプローブをゲル精製した。何回目かに、減少した量の選択したオリゴマーを結合反応において高親和性部位を増やすために用いた（2000,000/100,000cpm）。５回の選択を行なった。最終回の終わりに、溶出したDNAを増幅し、EcoR I及びBamH I制限酵素で消化し、PGEM3Z中にクローン化して通常プライマー及び逆向プライマーを用いて配列決定した。選択したプライマーの配列をすべてのDNAに存在する共通モチーフについて並べた。
融合蛋白質及びDNA結合の研究を次のようにして行なった。Ikarosイソ型のコード領域をプライマーを用いて各cDNAからのベントポリメラーゼでPCR増幅し、pGEX IIIのBamH I/EcoR I部位にクローン化した。適当な組換えPGEXベクターの培養物（一晩培養）を10倍に稀釈し、37℃で90分間成長させてから2mMIPTGで26℃にて３時間誘導した。粗細菌溶解液を前に記載したようにして生成した（Georgopoulos 1992）。Ikaros−GST融合体をグルタチオンアガロースビーズ上で部分精製し、20mM遊離グルタチオン及び0.5M NaClを含む緩衝液Ｄにて４℃で１時間溶出した。溶出した蛋白質をSDS−PAGEによりチェックし、それらの濃度をローリー法により評価し及び適当な稀釈をDNA結合研究のために用いた。DNA結合アッセイを行なった。結合反応は、50,000cpmの標識オリゴヌクレオチド（0.5〜1ng）、100ngの融合蛋白質、0.1μｇのdI/dCを含み、結合緩衝液に20μＭのZNCl2を補った。メチル化阻害アッセイのための結合反応を、10倍までスケールアップして前に説明したようにして実施した（Georgopoulos 1990）。
Ikarosイソ型Ik−１〜５の結合特異性
５つのIkaros蛋白質の選択した共通配列から導いた単一認識部位に対する結合特異性をゲル遅延アッセイにおいて試験した。３つの選択蛋白質の高親和性結合を提供するようにデザインした24bpオリゴヌクレオチド（IK−BS1 T−ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Cc）（配列番号101）を試験した。Ik−１イソ型は、この配列に最高の親和性で結合し、Ik−２及びIk−３がそれに次いだ。Ik−５及びIk−４のＮ末端の２つ又は１つのジンクフィンガーのみの存在は、この部位ではそれらの安定な相互作用に十分でなかった。第１の部位に非常に近い第２の低親和性部位を含むオリゴヌクレオチドを、次いで、試験した（IK−BS2）TCAGCTTTTGGGAATCTCCTGTCA（配列番号150）。これらのイソ型の４つはこの配列に結合し、単一のＮ末端フィンガーを有するIk−５だけが結合しなかった。我々は、次いで、短いIk−２コアモチーフのこれらの蛋白質（IK−BS3 TCAGCTTTTGGGATTCTCCTGTCA（配列番号151））に結合する能力を試験した。Ik−２は、７塩基対コアに対して同じく良く５塩基に結合したが、他方Ik−１はこの部位に少なくとも３倍低い親和性で結合した。Ik−３及びIk−４イソ型は、この配列に結合しなかった。好適でない塩基及びIk−1/Ik−３コアの3'及び5'フランキング位置を有するオリゴヌクレオチドは、高い親和性でIk−２蛋白質と、低い親和性でIk−１と結合し、Ik−３（IK−BS5、TCAGCGGGGGGGAATACCCTGTCA（配列番号152））とは結合しなかった。これは選択データと調和したが、Ik−２が３つの蛋白質の内で最も無差別であり、Ik−１がそれに次いでおり、Ik−３が最も結合特性が限定されていた。
Ik−５蛋白質は、これらのDNAの何れとも相互作用しなかった。しかしながら、それは、低い親和性であるが配列特異的な様式でCD3δエンハンサーのδＡ要素と結合した。Ik−４について同じ複合体が検出されたが、Ik−１、Ik−２及びIk−３は、定性的及び定量的な別の様式でこのDNAに結合した。Ik−４及びIk−５のδＡ要素への弱い結合は、恐らく２つのＣ末端フィンガーによって媒介され、他方、Ik−１、Ik−２及びIk−３の高親和性結合はＮ末端フィンガードメインによって媒介される（Ｎ末端フィンガードメインを用いる選択及び結合研究によっても実証された）。
これらの５つのIkarosイソ型における結合データは、前に記載された選択を更に実証し、Ikaros蛋白質が重複した配列に結合し得るが別個の認識配列にも結合得ることを示している。
Ikarosイソ型Ik−１〜４の同種の部位における化学的足跡
Ik−１〜４の蛋白質/DNA相互作用を、更に、化学的足跡によって確立した。高い親和性でこれらの４つのイソ型と結合するIK−BS2オリゴヌクレオチド（TCAGCTTTTGGGAATCTCCTGTCA）（配列番号102）をメチル化阻害アッセイにおいて用いた。陽性鎖において、すべての４つの蛋白質は類似の接触をした。共通配列の２、３及び４位の３つのグアニンは、すべての４つの蛋白質の結合を100％阻害した。Ik−２は、−５位のグアニン及び５位のアデニンと更なる主要なグローブ接触をした。陰性鎖において、４つの部分が劇的に足跡を与えた。Ik−２は、−３位のグアニンとのみ接触したが、他方Ik−１は−１位で更なる部分的接触をした。Ik−３蛋白質は、１及び−２位のアデニン並びに−１及び−３位のグアニンと接触した。Ik−４蛋白質の足跡は最も広く、−１、−３及び−４位の３つのグアニン並びに−５位のアデニンを含んでいた。
３つの蛋白質の内で、最も厳密な結合特性を有するIk−３が最もDNAと接触をした。最後に、Ik−４によってなされた広いが定性的な別の足跡が、更に、この蛋白質による非常に近い認識部位の共同的占有を支持した。これらのメチル化阻害データは、４つのIkaros蛋白質が定性的な別個のDNA接触をすることを示し、それらの分化におけるDNAへの結合能力を予告している。
IK蛋白質による転写の活性化
我々は、前に、Ik−２が多数化したδＡ要素からの転写を中レベルに活性化することが出来ることを示した。ここで、我々は、４つのIkarosイソ型の好適結合部位の反復コピーからの転写を活性化する能力を、NTH−3T3繊維芽細胞における一時的発現アッセイにおいて研究する。Ik−１〜４と高い親和性で結合するIK−BS3オリゴヌクレオチドを、これらの蛋白質の発現においてtkCATレポーター遺伝子の転写を刺激するその能力について試験した。この繊維芽細胞系統において検出されたこのレポーター遺伝子の活性は、Ik−1cDNAを有する発現ベクターでコトランスフェクトしたとき、22倍に刺激された。このレポーター遺伝子の活性は、Ik−２発現ベクターにより11倍に刺激された。しかしながら、Ik−３及びIk−4cDNAの発現は、転写を２〜３倍に刺激しただけであった。これは、これらの蛋白質が、Ik−１及びIk−２を与える結合部位からの転写を弱めるように機能し得ることを示唆している（IkaroscDNAの一時的蛋白質発現は同等であった）。
Ik−１及びIk−２エンハンサー蛋白質は、これらの因子の何れとも結合しない変異した結合部位からの転写を活性化することが出来ず、それらの活性化能力が配列特異的であることを示した。
Ikaros高親和性結合部位についての配列組成はIL2−レセプターα及びβインターフェロンプロモーターに存在するNFKbモチーフに等しいので、我々は、成熟Ｔ細胞系統において、分裂刺激の存在下及び不在下におけるその転写活性を試験した。我々は、次の理由により、ヒトのジャーカットＴ細胞系統を選択した。第１に、選択したIkaros結合部位に非常に良く適合するNFkB認識配列の活性がこの細胞系統で広く研究されてきたこと及び第２に、我々は、ヒトのIkaros遺伝子がアミノ酸組成及びスプライシング変異体の両方においてマウスの遺伝子に高度に保存されているということを知っているからである。前の報告と対照的に、我々は、この多数化した部位からの高レベルの転写活性を検出したが、それは分裂処理によって更に刺激されなかった。この活性は、Ikarosアンチセンス発現ベクターをこのレポーター遺伝子と共にコトランスフェクトしたときに、５倍だけ減少した。かかる効果は、RSV又はSL3LTRに駆動されるレポーター遺伝子を並行実験に用いたときには検出されず、IkarosアンチセンスRNAによる転写阻害がこの部位に特異的であることを示唆している。
Ikaros1〜４イソ型によるNIH3T3繊維芽細胞中の反復NFkB変異からの転写の活性化を次のようにして測定した。Ikaros蛋白質の存在下におけるCAT活性の刺激を、組換えCDM8とコトランスフェクトした場合の活性のCDM8ベクター単独の場合の活性に対する比として評価した。このデータは、トランスフェクトしたプラスミッドの各組合せ（実験ごとに２回繰り返した）で行なった3/4実験の平均値を表している。すべてのトランスフェクションを、材料と方法に記載したようにして、GHレベルに標準化した。
ヒトＴ細胞中の反復NFkB様要素の活性及び抑制を次のようにして測定した。Ik−BS2（FNKB様変異体）又はRSV及びSL3LTRの制御下のレポーター遺伝子を、CDM8発現Ikarosアンチセンスプラスミッドの存在下でジャーカット細胞中にトランスフェクトした。エンハンサーを有しないプラスミッドに対して倍の誘導及びアンチセンスRNAの存在下での抑制が測定された。
哺乳動物発現ベクター及びトランスフェクションの実験を次のようにして行なった。５つのIkarosイソ型を、CDM8発現ベクターのHind III〜Not I部位にサブクローン化した。IKBS1、IKBS2、IKBS7及び８の４つのセンスコピーの制御下のtkCATレポーター遺伝子を、前記のように、適当な発現ベクター及びSV40若しくはRSVGHプラスミッドと共に、NIH3T3繊維芽細胞及び成熟Ｔ細胞系統ジャーカット中にコトランスフェクトした。細胞を、36〜48時間後に採集してCAT活性及び成長ホルモンレベルを分析した。結果は、発現プラスミッドのレポーターの各組合せを２回行なった3/4の独立した実験の平均値として測定したものである。
リンパ系細胞限定調節ドメイン中のIkaros蛋白質用の標的部位
Ikaros蛋白質用の潜在的高親和性結合部位を、TCR−α、−β及び−δ、CD3−δ、−ε及び−γ遺伝子、SL3及びHIVLTRのエンハンサー及びプロモーター領域内並びに他のＴ細胞限定抗原の調節ドメイン中に見出した（表５）。これらの部位の幾つかは、すべての４つの蛋白質に結合し得るが、他方、他の部位はIk−２及びIk−１とのみ相互作用する。３つのIkarosイソ型用に選択した認識配列は、IL2−Ｒαのプロモーター、βインターフェロンのPRD II要素及びＨ−2K遺伝子に存在するNFkBモチーフと非常に良く適合する。このNFkB部位は、４つのIkaros蛋白質と高い親和性で結合する。
Ikarosモチーフに関連する配列は又、上述の調節ドメイン並びにIL2遺伝子のプリンボックス、TDTプロモーターのLYF部位並びにHIVLTRのNFkB変異部位に見出された（表５）。Ikaros蛋白質のこれらの部位に対する親和性を研究するために、我々は、選択した認識配列と競争するそれらの能力を研究した。この７塩基対モチーフの内部及び外部に塩基対置換を導入して、リンパ系細胞及びＴ細胞に特異的な調製ドメインに存在するこれらの部位の幾つかの配列組成に合わせた。適当な塩基交換を有するオリゴヌクレオチドを、共通モチーフ（IK−BS1）に対する競争実験において用いた。
IL2−ＲαNFkBモチーフに等しいIk−BS2オリゴヌクレオチドは、共通モチーフの単一コピーより２倍高い親和性で４つの蛋白質に結合した。我々は、これは、対向鎖中の第２の低親和性結合部位のためであると考えている。
調節ドメインの非常に近くに低親和性結合部位が存在することは、これらの部位に対するIkaros蛋白質の相対的親和性を減少させる。これは、δＡの場合に明らかであり、他の要素でも同様であろう。高親和性結合部位の占有は又、隣接領域の低親和性部位によっても影響されるであろう。これらの蛋白質のこれらの部位に対する見かけの結合定数は、更に高い値にさえ高めることが出来るし、発生中のリンパ球において、Ikarosエンハンサーによって活性化された標的遺伝子の順序を指図することが出来るであろう。
ヒトIkaros遺伝子のクローン化
マウスIkaros遺伝子のcDNAが決定されているので、ヒトIkaros遺伝子を、当業者に公知の幾つかの技術の内の１つを用いてクローン化することが出来る。かかるクローン化技術は、（Moleculer Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook等、1989第２版、Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,参考として本明細書中に援用する）に詳細に記載されている。例えば、マウスのIkarosのコード領域の1020アミノ酸残基の範囲に対応するオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド合成装置で合成することが出来る。これらのオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてヒトcDNAライブラリー例えばジャーカットＴ細胞又はヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることが出来る。陽性クローンを配列決定し、その配列をマウスのIkarosの公知の配列と比較する。これらのDNAによりコードされる機能的Ikaros活性をここに記載するようにして試験することが出来る。IkarosヒトcDNAの部分配列を図３に示してある（配列番号３）。
Ikarosゲノム遺伝子座
変異cDNAの配列分析に基づいて、ゲノムの遺伝子座は約９〜11エクソンを含むと考えられる。ゲノム中に存在する殆ど又はすべてのIkarosエクソンを含むゲノムDNAを、種々のIkarosDNAをプローブとして用いて、λDASH IIファージベクター中に作成したマウスゲノムSV129ライブラリーをスクリーニングすることにより単離した。Ikaros遺伝子は、別個のしかし又重複もしているゲノムクローンとして単離した少なくとも80〜90kbのゲノム配列を含む。Ikarosゲノムクローンの幾つかを図７に示す。これらのエクソンはボックスとして描かれているが、他方、イントロンは線で示してある。エクソンE5の5'境界（配列番号143）及び3'境界（配列番号144）、エクソンE3の5'境界（配列番号145）及びエクソンE7の5'境界（配列番号146）及び3'境界（配列番号147）のDNA配列を決定した。
イン・ビトロ及びイン・ビボ並びにノックアウトマウスにおける相同組換え実験
リンパ球様細胞限定された転写因子Ikarosの役割をイン・ビボで定めるために、我々は、胚幹細胞（E.S.）中でマウスIkarosゲノム遺伝子座に狙いを定めて突然変異を起こした。Ikarosゲノム遺伝子座に別個の欠失を運ぶ２つのターゲティングベクターを、SV129マウスから導いたJ1E.S.系統（En li,Cell 1992）中にトランスフェクトした。E.S.細胞中の相同組換え事象を二重選択カウンター選択計画によって記録し、G418及びFIAUを培地中で用いてネオマイシン遺伝子活性及びチミジンキナーゼ遺伝し活性の不在について選択した。このネオ遺伝子は、この構築物の中央に位置しているが、他方、tk遺伝子は、ターゲティングベクターの5'若しくは3'に存在し、非相同組換え事象に対抗する選択を可能にする。突然変異を１つ若しくは２つ運ぶE.S.細胞系統をサザーン分析により確立してBalbe又はC57黒マウスの胚盤胞に注入した。キメラ胚盤胞を偽妊娠マウスに再移植し、キメラ動物を生成した。毛皮の色（アグーチ対白地若しくは黒地）で見てSV129系統が70％より多いマウスを更に繁殖させた。生殖細胞系列の伝達を、毛皮の色（アグーチ）及び尾のDNAのサザーン分析によって測定した。我々は、これらの変異についてホモ接合の動物を得るためにこれらのマウスを繁殖させる過程にいる。
これらの標的突然変異は両者とも欠失である。第１の突然変異は、すべてのIkarosイソ型に共有される最後のエクソンE7を欠失している。これは、DNAに結合することは出来るが転写を活性化することの出来ない蛋白質を生成するはずである。これらの蛋白質は、DNA結合について野生型Ikaros蛋白質と競争することは出来るが転写を活性化することは出来ないので、転写の主要な負の調節物質として機能することが出来る。この突然変異についてヘテロ接合のマウスは、調節についてIkaros蛋白質に依存している遺伝子の発現レベルの減少を示すであろう。これらのマウスは、Ikaros蛋白質の発現をすべて欠いたマウスより少ない分離（sever）表現型を示し得る。もし機能を全部失ったマウスの表現型が過酷であるならば、これらの動物の分析が必要であることが証明され得る。
第２の突然変異（エクソンE3及びE4の欠失）は、Ikaros遺伝子の全機能喪失を生じるはずである。この突然変異についてホモ接合のマウスは、Ikaros遺伝子の重大な損傷を有するかも知れない。この突然変異についてホモ接合のマウスは、Ikaros遺伝子により調節される遺伝子の発現の変化の結果として免疫系の重大な損傷を有するかも知れない。Ikaros調節についての可能な候補は、TDT（組換え経路）CD3複合体、TCR複合体IL2遺伝子HIVLTR等である。これらのマウスから導いたリンパ球様細胞系統を用いて、成熟Ｔ及びＢ細胞へ導く調節経路を叙述することが出来るが、これらのマウス自体を用いて増結経路の種々の系統の間の複合体相互作用を研究し、免疫不全症候群を研究し且つ矯正するためのイン・ビボ実験をデザインすることが出来る。最後に、これらの動物から導いたES細胞系統を、造血／リンパ球生成系列へのイン・ビボ分化によって研究することが出来る。
利用
この発明のペプチドを、伝統的方法（例えば、経口、非経口、経皮又は経粘膜）の１つにより、生物分解性生体適合性ポリマーを用いる持続的放出配合物にて又はミセル、ゲル及びリポソームを用いる現場送達又はトランスジェニック法によって、ほ乳動物特にヒトに投与することが出来る。
他の具体例
Ikaros遺伝子の全部又は一部をコードする核酸を用いて細胞をトランスホームすることが出来る。例えば、Ikaros遺伝子例えば誤った発現若しくは突然変異型のIkaros遺伝子（例えば、欠失）、又はIkaros蛋白質をコードするDNAを用いて細胞をトランスホームして細胞ゲノムのIkaros遺伝子をトランスホームした遺伝子で置き換えた細胞を生成し、例えばIkaros遺伝子について欠失した細胞を生成することが出来る。上述のように、このアプローチを培養（例えば、培養幹細胞）で生長することの出来る細胞について用いてIkaros遺伝子の機能を研究することが出来る。
同様に、Ikaros遺伝子（例えば、誤った発現又は突然変異型の遺伝子、例えば欠失）の全部又は一部をコードする核酸を用いて細胞をトランスホームし、次いで、その細胞でトランスジェニック動物を生成することが出来る。このアプローチを用いて例えばIkaros遺伝子が例えば欠失によって不活性化されたトランスジェニック動物を作成することが出来る。ホモ接合のトランスジェニック動物を創出（founder）トランスジェニック動物の子孫間の交配によって作ることが出来る。トランスジェニック動物から細胞又は組織培養を導くことが出来る。Ｔ細胞の発生又は機能の異常により特徴付けられる異常例えば白血病の危険にさらされている患者を、患者のIkaros遺伝子の構造を野生型のIkaros遺伝子の構造と比較することによって検出することが出来る。例えば、フレームシフト、重大な点突然変異、欠失、挿入又は転座による野生型構造からの逸脱は危険を示している。幾つかのエクソンのコード領域並びに幾つかのイントロンエクソン境界のDNA配列をここに含む。他の領域は、当業者に公知の方法によって得ることが出来又は配列決定することが出来る。
この発明は、実質的にIkaros蛋白質に相同な任意の蛋白質（例えば、配列番号２、３又は５に示したIkaros蛋白質又は他のイソ型）を含む。対立遺伝子変異、自然突然変異、誘導突然変異（例えば、イン・ビトロ欠失）、高若しくは低（例えば、少なくとも40ヌクレオチドのプローブ長にて、40Cにおける２×SSCでの洗浄）緊縮条件下で天然の核酸にハイブリダイズするDNAによってコードされる蛋白質（高若しくは低緊縮の他の定義については、Molecular Biology,John Wiley ＆ Sons,ニューヨーク、1989、6.3.1−6.3.6中のCurrent Protocols（本明細書中に参考として援用）を参照されたい）、及びIkaros蛋白質に対する抗血清特にIkaros蛋白質の活性部位若しくは結合ドメインに対する抗血清により特異的に結合されるポリペプチド若しくは蛋白質も又含まれる。この用語は又、Ikaros蛋白質を含むキメラポリペプチドをも含む。
この発明のDNA及びペプチドの配列は、例えば、マウス、霊長類例えばヒト、又は非天然の配列であって良い。
この発明は又、任意の生物学的に活性なIkaros蛋白質の断片又はアナログをも含む。「生物学的に活性な」とは、Ikarosイソ型例えば（配列番号２）若しくは図３（配列番号３）若しくは（配列番号５）に特徴的な任意のイン・ビボ若しくはイン・ビトロ活性（例えば、上記のIkaros活性）を有することを意味する。Ikaros蛋白質は一連の生理学的特性を示し、かかる特性はIkaros蛋白質分子の異なる部分に起因し得るので、有用なIkaros蛋白質断片又はIkaros蛋白質アナログは、Ikaros蛋白質アッセイの多様性例えば上述のδａ断片若しくはNKFB断片に結合し又はそれらからの転写を刺激する能力の内の１つ（若しくはそれ以上）について生物学的活性を示すものである。Ikaros蛋白質断片又はアナログは、イン・ビボ若しくはイン・ビトロアッセイにおいて、最も好ましくは天然のIkarosイソ型（例えば、配列番号２、３若しくは５で示したIkaros蛋白質）の活性の90％、好ましくは40％、又は少なくとも10％を有する。
好適アナログは、配列が野生型の配列と１若しくは数個の保存アミノ酸の置換により又は１若しくは数個の非保存アミノ酸の置換、欠失又は挿入により異なるが生物学的活性を失っていないIkarosペプチド又はエクソン（又は生物学的に活性なその断片）を含む。保存的置換は典型的に１つのアミノ酸の類似の性質の他のアミノ酸との置換、例えば、次の群の中での置換を含む。バリン、グリシン。グリシン、アラニン。バリン、イソロイシン、ロイシン。アスパラギン酸、グルタミン酸。アスパラギン、グルタミン。セリン、スレオニン。リジン、アルギニン。及びフェニルアラニン、チロシン。他の保存的置換は、下記の表から得ることが出来る。
他の有用な改変物は、ペプチドの安定性を増すようなものを含み、かかるアナログは、例えば、１つ以上の非ペプチド結合（ペプチド結合を置換する）又はＤ−アミノ酸をそのペプチド配列中に含むことが出来る。
アナログは、天然のIkaros蛋白質とアミノ酸配列において異なっているか又は配列に影響を与えない方法で改変してよく、或はその両方であってよい。この発明のアナログは、一般に、天然のIkaros配列の20アミノ酸残基部分、好ましくは40アミノ酸残基部分又は更に好ましくは全配列と、少なくとも70％、更に好ましくは80％、更に好ましくは90％、最も好ましくは95％若しくは99％の相同性を示す。
一次配列の変化は、自然の及び誘導による遺伝的変異を含む。天然のＬ−アミノ酸以外の残基例えばＤ−アミノ酸又は非天然の即ち合成アミノ酸例えばβ若しくはγアミノ酸を含むアナログも又含まれる。或は、増大した安定性は、ペプチド分子を環化することによって与えられ得る。
配列順を変えない修飾は、イン・ビボ又はイン・ビトロでの、ポリペプチドの化学的誘導体化を含む（例えば、アセチル化、メチル化、ホスホリル化、カルボキシル化又はグリコシル化）。グリコシル化は、例えば合成中又はプロセッシング中のポリペプチドのグルコシル化のパターンを改変することにより改変し得るが、更に、プロセス工程（例えば、ポリペプチドを、かかるプロセスを普通に与える細胞から導いたグリコシル化作用を有する酵素例えばほ乳動物のグリコシル化酵素をさらすこと）によって改変することが出来る。ホスホリル化は、ポリペプチドをホスホリル化改変酵素例えばキナーゼ又はホスファターゼにさらすことによって改変することが出来る。
実質的に完全長のポリペプチドに加えて、この発明は又、これらのポリペプチドの生物学的に活性な断片をも含む。ここで用いる場合、ポリペプチドについて用いる用語「断片」は、上述のIkarosの長さのことであり、普通は、少なくとも約20残基、更に典型的には、少なくとも約40残基、好ましくは少なくとも約60残基の長さである。
Ikarosペプチド又はイントロンの断片は、当業者に公知の方法例えば、所望の断片をコードするようにイン・ビトロで操作（例えば、IkarosDNAの制限消化）したIkarosDNA（例えば、配列番号１若しくは２の配列）を発現させることによって作成することが出来る。アナログを、当業者に公知の方法例えばIkarosDNA配列（例えば、配列番号１若しくは２の配列）のイン・ビトロDNA配列改変によって作ることが出来る。例えば、イン・ビトロ突然変異誘発を用いて配列番号１のDNA配列を、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換（例えば、保存的アミノ酸置換の表に記載したような保存的置換）を受けたアナログをコードする配列に変換することが出来る。断片又はアナログは、当業者に公知の方法によって、Ikaros活性の存在について試験することが出来る。
ポリペプチドの生物学的活性に必要でない残基、或は別のmRNAスプライシング又は別の蛋白質プロセッシング事象から生じる残基等、このペプチドの生物学的活性に必要でない残基を含むIkaros蛋白質ポリペプチドも又含まれる。
この発明は又、この発明のポリペプチドをコードする核酸をも含む。
Ikaros蛋白質を得るために、IkarosをコードするDNAを発現ベクター中に挿入し、そのベクターを所望の蛋白質の発現に適した細胞中に導入し及び所望の蛋白質を従来技術の方法によって回収して精製することが出来る。Ikaros蛋白質に対する抗体を、動物例えばウサギ又はマウスを免疫して従来技術の方法によって抗Ikaros抗体を回収することによって作成することが出来る。
特異的なスプライシング生成物（即ち、特異的イソ型）を得るために、所望のスプライシング生成物をコードするエクソンのみを含む合成構造遺伝子を作成してその遺伝子を上記のように発現させることが出来る。
他の具体例は、後記の請求の範囲にある。
配 列 表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：ザ ゼネラル ホスピタル コーポレーション
（Ｂ）通り：フルーツ ストリート55
（Ｃ）都市：ボストン
（Ｄ）州 ：マサチューセッツ
（Ｅ）国 ：米国
（Ｆ）郵便番号:02114
（Ｇ）電話：（617）726−8608
（Ｈ）テレファックス：（617）726−1668
（ii）発明の名称:IKAROS:細胞経路調節遺伝子
（iii）配列数:152
（iv）コンピューター読み取り可能形式：
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換機
（Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:ASCII
（ｖ）現出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（vi）先願のデータ：
（Ａ）出願番号:US 946,233
（Ｂ）出願日 :1992年９月14日
（ix）電信用情報：
（Ａ）電話：（617）227−7400
（Ｂ）テレファックス：（617）227−5941
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:38塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号１）：
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:1788塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:CDS
（Ｂ）存在位置:223..1515
（xi）配列（配列番号２）：
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:1611塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:CDS
（Ｂ）存在位置:1..1611
（xi）配列（配列番号３）：
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:38塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号４）：
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:568アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号５）：
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号６）：
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号７）：
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:12塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号８）：
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号９）：
（２）配列番号10の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号10）：
（２）配列番号11の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号11）：
（２）配列番号12の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号12）：
（２）配列番号13の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号13）：
（２）配列番号14の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号14）：
（２）配列番号15の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号15）：
（２）配列番号16の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号16）：
（２）配列番号17の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:28塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号17）：
（２）配列番号18の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号18）：
（２）配列番号19の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号19）：
（２）配列番号20の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号20）：
（２）配列番号21の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:27塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号21）：
（２）配列番号22の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号22）：
（２）配列番号23の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号23）：
（２）配列番号24の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号24）：
（２）配列番号25の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号25）：
（２）配列番号26の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号26）：
（２）配列番号27の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号27）：
（２）配列番号28の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号28）：
（２）配列番号29の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号29）：
（２）配列番号30の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号30）：
（２）配列番号31の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号31）：
（２）配列番号32の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号32）：
（２）配列番号33の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号33）：
（２）配列番号34の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号34）：
（２）配列番号35の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号35）：
（２）配列番号36の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号36）：
（２）配列番号37の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号37）：
（２）配列番号38の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号38）：
（２）配列番号39の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号39）：
（２）配列番号40の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号40）：
（２）配列番号41の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号41）：
（２）配列番号42の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号42）：
（２）配列番号43の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号43）：
（２）配列番号44の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号44）：
（２）配列番号45の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号45）：
（２）配列番号46の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号46）：
（２）配列番号47の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号47）：
（２）配列番号48の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号48）：
（２）配列番号49の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号49）：
（２）配列番号50の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:26塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号50）：
（２）配列番号51の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号51）：
（２）配列番号52の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号52）：
（２）配列番号53の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号53）：
（２）配列番号54の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号54）：
（２）配列番号55の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号55）：
（２）配列番号56の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号56）：
（２）配列番号57の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号57）：
（２）配列番号58の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号58）：
（２）配列番号59の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号59）：
（２）配列番号60の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号60）：
（２）配列番号61の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号61）：
（２）配列番号62の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号62）：
（２）配列番号63の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号63）：
（２）配列番号64の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号64）：
（２）配列番号65の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号65）：
（２）配列番号66の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号66）：
（２）配列番号67の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号67）：
（２）配列番号68の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号68）：
（２）配列番号69の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号69）：
（２）配列番号70の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号70）：
（２）配列番号71の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号71）：
（２）配列番号72の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号72）：
（２）配列番号73の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号73）：
（２）配列番号74の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:12塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号74）：
（２）配列番号75の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号75）：
（２）配列番号76の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号76）：
（２）配列番号77の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号77）：
（２）配列番号78の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号78）：
（２）配列番号79の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号79）：
（２）配列番号80の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号80）：
（２）配列番号81の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号81）：
（２）配列番号82の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号82）：
（２）配列番号83の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号83）：
（２）配列番号84の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号84）：
（２）配列番号85の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号85）：
（２）配列番号86の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号86）：
（２）配列番号87の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号87）：
（２）配列番号88の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号88）：
（２）配列番号89の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号89）：
（２）配列番号90の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号90）：
（２）配列番号91の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号91）：
（２）配列番号92の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号92）：
（２）配列番号93の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号93）：
（２）配列番号94の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号94）：
（２）配列番号95の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号95）：
（２）配列番号96の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号96）：
（２）配列番号97の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号97）：
（２）配列番号98の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号98）：
（２）配列番号99の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号99）：
（２）配列番号100の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号100）：
（２）配列番号101の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号101）：
（２）配列番号102の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号102）：
（２）配列番号103の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:22塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号103）：
（２）配列番号104の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:14塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号104）：
（２）配列番号105の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:19塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号105）：
（２）配列番号106の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:12塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号106）：
（２）配列番号107の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号107）：
（２）配列番号108の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:14塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号108）：
（２）配列番号109の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:11塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号109）：
（２）配列番号110の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号110）：
（２）配列番号111の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号111）：
（２）配列番号112の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:14塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号112）：
（２）配列番号113の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号113）：
（２）配列番号114の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:11塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号114）：
（２）配列番号115の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:12塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号115）：
（２）配列番号116の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:9塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号116）：
（２）配列番号117の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:8塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号117）：
（２）配列番号118の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号118）：
（２）配列番号119の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:16塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号119）：
（２）配列番号120の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:8塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号120）：
（２）配列番号121の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:22塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号121）：
（２）配列番号122の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号122）：
（２）配列番号123の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:26塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号123）：
（２）配列番号124の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:26塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号124）：
（２）配列番号125の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号125）：
（２）配列番号126の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:9塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号126）：
（２）配列番号127の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:9塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号127）：
（２）配列番号128の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:21塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号128）：
（２）配列番号129の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:9塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号129）：
（２）配列番号130の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号130）：
（２）配列番号131の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号131）：
（２）配列番号132の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:16塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号132）：
（２）配列番号133の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:9塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号133）：
（２）配列番号134の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:11塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号134）：
（２）配列番号135の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:8塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号135）：
（２）配列番号136の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:21塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号136）：
（２）配列番号137の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号137）：
（２）配列番号138の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号138）：
（２）配列番号139の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号139）：
（２）配列番号140の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:6塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号140）：
（２）配列番号141の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号141）：
（２）配列番号142の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:36塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号142）：
（２）配列番号143の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:103塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号143）：
（２）配列番号144の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:116塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号144）：
（２）配列番号145の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:94塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号145）：
（２）配列番号146の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:120塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号146）：
（２）配列番号147の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:120塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号147）：
（２）配列番号148の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号148）：
（２）配列番号149の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:7塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号149）：
（２）配列番号150の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号150）：
（２）配列番号151の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:22塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号151）：
（２）配列番号152の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号152）：
この発明は、Ikaros遺伝子及びＴ細胞の分化及び生成に関するものである。
前駆幹細胞からのＴ細胞レパトアの生成は、分化経路を通して進行し、後期胸腺内過程はよく実証されているが、初期胸腺外事象は僅かに特徴付けられただけである。最初期の限定的Ｔ細胞分化マーカーはCD3/TCR複合体のCD3δ遺伝子である。
発明の要約
Ikaros遺伝子（Ｔ細胞の初期分化において活性な遺伝子）が発見された。この遺伝子は、独特のジンクフィンガー蛋白質のファミリーであるIkaros蛋白質をコードしている。Ikarosファミリーのイソ型は一般に3'エクソン（IkarosエクソンE7、マウスのIkarosの203〜431アミノ酸残基を含む）を含むが5'領域では異なる。このIkarosファミリーは、Ikaros遺伝子の転写及びプロセッシングから生じるすべてのスプライシング変異体を含む。５つのイソ型をここに記載する。Ikaros蛋白質はCD3δ遺伝子のエンハンサーに結合して活性化し、成熟動物においてはすべてではないにせよ主としてＴ細胞に限定される。この転写因子の胚発生における発現パターンは、Ikaros蛋白質がＴ細胞系列に入ることを調節する遺伝的スイッチとしての役割を演ずることを示唆する。このIkaros遺伝子は又、マウスの初期胚形成の間に近位線条体においても発現している。
一般に、この発明は、１つ以上のIkarosエクソンを含む（又は本質的にこれらからなる）ペプチドをコードする配列を含む（又は本質的にそれらからなる）DNA好ましくは精製したDNAを叙述する。好適具体例において、このIkarosエクソンは、E1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかであり；精製したDNAはエクソンE7をコードしていない。
他の好適具体例において、コードされるペプチドは、更に、第２のIkarosエクソンを含み；その第２のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかであり；第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6の何れかである。
他の好適具体例において、コードされるペプチドは、更に第３のIkarosエクソンを含み；その第３のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかであり；第１のエクソンはE7であり、該第２のエクソンはE3であり、第３のエクソンはE1/2であり；このペプチドはIkarosイソ型５である。
他の好適具体例において、コードされるペプチドは、更に、第４のIkarosエクソンを含み；その第４のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかであり；第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE6であり、第３のエクソンはE4であり、第４のエクソンはE1/2であり；第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE4であり、第３のエクソンはE3であり、第４のエクソンはE1/2であり；ペプチドはIkarosのイソ型３又は４である。
他の好適具体例において、コードされるペプチドは、更に、第５のIkarosエクソンを含み；その第５のエクソンは、E1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかであり；第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE6であり、第３のエクソンはE5であり、第４のエクソンはE4であり、第５のエクソンはE1/2であり；ペプチドはIkarosのイソ型２である。
好適具体例において、コードされるペプチドは、更に、第６のIkarosエクソンを含み；第６のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかであり；第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE6であり、第３のエクソンはE5であり、第４のエクソンはE4であり、第５のエクソンはE3であり、第６のエクソンはE1/2であり；ペプチドはIkarosのイソ型１である。
好適具体例において、コードされたIkarosエクソンの配列は、本質的に、天然のIkarosエクソンの配列又はIkaros活性を有するその断片と同じであり、IkarosエクソンをコードするDNA配列は、天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片をコードするDNA例えば配列番号２又は３からのIkarosエクソンをコードするDNAと少なくとも85％、一層好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98若しくは99％の相同性を有する。Ikarosエクソンをコードする配列は、高又は低緊縮下で、天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片例えば配列番号２、３又は５のIkarosエクソンと同じ又は本質的に同じアミノ酸配列を有するIkarosエクソンをコードする核酸とハイブリダイズする。コードされるIkarosエクソンのアミノ酸配列は、少なくとも30、一層好ましくは少なくとも40、更に好ましくは少なくとも50、最も好ましくは少なくとも60、80、100若しくは200アミノ酸残基の長さである。コードされるIkarosアミノ酸配列は、天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片の少なくとも50％、一層好ましくは60％、更に好ましくは70％、更に好ましくは80％、更に好ましくは90％、最も好ましくは95％の長さである。コードされるIkarosエクソンは本質的に天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片と同じ長さである。コードされるIkarosエクソンのアミノ酸配列は、天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片例えば配列番号２、３又は５のIkarosエクソン配列と少なくとも80％、一層好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98若しくは99％の相同性を有する。コードされるIkarosエクソンのアミノ酸配列は、天然のIkarosエクソン又はその配列の断片の配列例えば配列番号２、３又は５で記載したIkarosエクソンと同じ又は本質的に同じである。そしてこのペプチドはIkarosペプチド活性を有する。
好適具体例において、コードされるペプチド中のこれらのエクソンは、天然のイソ型例えばIkarosイソ型１に見出されるのと同じ相対的直鎖的順序で配置される。例えば、エクソンE3及びE7を有するペプチドにおいてE3はE7のＮ末端に位置する。これらのコードされるエクソンの直鎖的順序は、天然のイソ型に見出されるもの例えばIkarosイソ型１とは異なっている。例えば、エクソンE3、E5及びE7を有するペプチドにおいて、Ｎ末端からＣ末端への方向は、E5、E3、E7である。コードされるペプチド中のこれらのエクソンは、１つ以上の組成（即ち、どのエクソンが存在するか）、直鎖的順序又は数（即ち、幾つのエクソンが存在し又は所定のエクソンが何回存在するか）において天然のIkarosイソ型例えばIkarosイソ型１、２、３、４又は５と異なっている。
他の面において、この発明は、１つ以上のIkarosエクソンを含む（又は本質的にそれらからなる）ペプチド好ましくは純粋なペプチドを叙述する。好適具体例において、このIkarosエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7である。このペプチドはエクソンE7を含まない。
他の好適具体例において、このペプチドは、更に、第２のIkarosエクソンを含む。その第２のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかである。第１のエクソンはR7であり、第２のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6の何れかである。
他の好適具体例において、このペプチドは、更に、第３のIkarosエクソンを含む。その第３のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかである。第１のエクソンはE7である。第２のエクソンはE3であり、第３のエクソンはE1/2である。このペプチドはIkarosイソ型５である。
他の好適具体例において、このペプチドは、更に、第４のIkarosエクソンを含む。その第４のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかである。第１のエクソンはE7である。第２のエクソンはE4であり、第３のエクソンはE3であり、第４のエクソンはE1/2である。第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE4であり、第３のエクソンはE3であり、第４のエクソンはE1/2である。このペプチドはIkarosイソ型３又は４である。
他の好適具体例において、このペプチドは、更に、第５のIkarosエクソンを含む。その第５のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかである。第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE6であり、第３のエクソンはE5であり、第４のエクソンはE4であり、第５のエクソンはE1/2である。このペプチドはIkarosイソ型２である。
他の好適具体例において、このペプチドは、更に、第６のIkarosエクソンを含む。その第６のエクソンはE1/2、E3、E4、E5、E6又はE7の何れかである。第１のエクソンはE7であり、第２のエクソンはE6であり、第３のエクソンはE5であり、第４のエクソンはE4であり、第５のエクソンはE3であり、第６のエクソンはE1/2である。このペプチドはIkarosイソ型１である。
好適具体例において、Ikarosエクソンの配列は、本質的に、天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片の配列と同じである。Ikarosエクソンのアミノ酸配列はそれをコードする核酸配列が天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片をコードするDNA例えば配列番号２又は３のIkarosエクソンをコードするDNAと少なくとも85％、一層好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98若しくは99％の相同性を有するようなものである。Ikarosエクソンのアミノ酸配列は、それをコードする核酸配列が高又は低緊縮下で天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片をコードする核酸例えば配列番号２、３又は５のIkarosエクソンと同じ若しくは本質的に同じアミノ酸配列を有するIkarosエクソンにハイブリダイズするようなものである。Ikarosエクソンのアミノ酸配列は、少なくとも30、一層好ましくは少なくとも40、更に好ましくは少なくとも50、最も好ましくは少なくとも60、80、100若しくは200アミノ酸残基長を有する。コードされるIkarosアミノ酸配列は、天然のIkarosエクソン又はIkaros活性を有するその断片の少なくとも50％、一層好ましくは60％、更に好ましくは70％、更に好ましくは80％、更に好ましくは90％、最も好ましくは95％の長さを有する。Ikarosエクソンは、本質的に、天然のIkarosエクソンと同じ長さを有する。Ikarosエクソンのアミノ酸配列は、天然のIkarosエクソンの配列又はIkaros活性を有するその断片例えば配列番号２、３又は５のIkarosエクソン配列と、少なくとも80％、一層好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは95％、最も好ましくは98若しくは99％の相同性を有する。Ikarosエクソンのアミノ酸配列は、天然のIkarosエクソン又はその配列の断片と同じ又は本質的に同じである。例えば、配列番号２、３又は５に記載したIkarosエクソン。そして、このペプチドはIkarosペプチド活性を有する。
好適具体例において、ペプチド中のエクソンは、天然のイソ型例えば、Ikarosイソ型１中で見出されるのと同じ相対的直鎖的順序で配置される。例えば、エクソンE3及びE7を有するペプチドにおいて、E3はE7のＮ末端に位置する。これらのエクソンの直鎖的順序は、天然のイソ型例えばIkarosイソ型１で見出されるものと異なっている。例えば、エクソンE3、E5及びE7を有するペプチドにおいて、Ｎ末端からＣ末端への方向はE5、E3、E7である。これらのペプチド中のエクソンは、１つ以上の組成（即ち、どのエクソンが存在するか）、直鎖的順序、又は数（即ち、幾つのエクソンが存在し或は所定のエクソンが何回存在するのか）において天然のIkarosイソ型例えばIkarosイソ型１、２、３、４若しくは５と異なっている。
他の面において、この発明は、Ikarosペプチド例えばIkaros活性を有するIkarosペプチド（例えば、Ikarosイソ型１、２、３、４若しくは５）をコードするDNA配列を含む（又は本質的にそれからなる）DNA好ましくは精製したDNAを叙述する。好適具体例において、コードされるIkarosペプチドの配列は、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片の配列と本質的に同じである。そのDNA配列は、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片例えば配列番号２又は３のDNAと、少なくとも85％、一層好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98若しくは99％の相同性を有する。コードされるペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、３又は５のペプチドと同じ又は本質的に同じペプチドをコードする核酸に高若しくは低緊縮条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ得るようなものである。コードされるペプチドは少なくとも30、一層好ましくは少なくとも40、更に好ましくは少なくとも50、最も好ましくは少なくとも60、80、100若しくは200アミノ酸残基の長さを有する。コードされるペプチドは、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片の、少なくとも50％、一層好ましくは少なくとも60％、更に好ましくは70％、更に好ましくは80％、更に好ましくは90％、最も好ましくは95％の長さを有する。コードされるペプチドは、本質的に、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片と同じ長さを有する。コードされるペプチドは、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片例えば配列番号２、３若しくは５のペプチド配列と同じ若しくは本質的に同じアミノ酸配列と、少なくとも80％、一層好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98若しくは99％の相同性を有する。そして、このペプチドのアミノ酸配列は、本質的に、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片の配列例えば配列番号２、３若しくは５で記載した配列と同じである。
他の面において、この発明は、天然のIkarosペプチドと同じ若しくは本質的に同じアミノ酸配列と少なくとも90％の相同性を有する20アミノ酸以上の長さのペプチドをコードする配列例えば配列番号２、３若しくは５のアミノ酸配列を含む（又は本質液にそれからなる）DNA好ましくは精製したDNAを叙述する。好適具体例において、精製したDNAは、少なくとも30、一層好ましくは少なくとも40、更に好ましくは少なくとも50、最も好ましくは少なくとも60、80、100若しくは200アミノ酸残基の長さを有する。コードされるペプチドは、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片の少なくとも50％、一層好ましくは少なくとも60％、更に好ましくは70％、更に好ましくは80％、更に好ましくは90％、最も好ましくは95％の長さを有する。コードされるペプチドは、本質的に、天然のIkarosペプチドと同じ長さである。Ikarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片と同じ若しくは本質的に同じアミノ酸配列と、少なくとも80％、一層好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは95％、最も好ましくは98若しくは99％相同であるペプチド例えば配列番号２、３若しくは５のアミノ酸配列、並びにIkaros活性を有するペプチド。
他の面において、この発明は、天然のIkarosペプチドと同じ若しくは本質的に同じアミノ酸配列を有するペプチド例えば配列番号２、３若しくは５のペプチドをコードする核酸と高若しくは低緊縮下でハイブリダイズするDNA配列を含む（又は本質的にそれからなる）DNA好ましくは精製したDNAを叙述する。好適具体例において、DNA配列は、天然のIkarosペプチド若しくはIkaros活性を有するその断片をコードするDNA例えば配列番号２又は３のDNAと、少なくとも85％、一層好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは98若しくは99％相同である。精製したDNAは、少なくとも30、一層好ましくは少なくとも40、更に好ましくは少なくとも50、最も好ましくは60、80、100若しくは200アミノ酸残基の長さのペプチドをコードしている。コードされるペプチドは、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片の、少なくとも50％、一層好ましくは少なくとも60％、更に好ましくは70％、更に好ましくは80％、更に好ましくは90％、最も好ましくは95％の長さを有する。コードされるペプチドは、本質的に、天然のIkarosペプチドと同じ長さである。精製したDNAは、天然のIkarosペプチドと同じ若しくは本質的に同じアミノ酸配列例えば配列番号２、３若しくは５のアミノ酸配列と、少なくとも80％、一層好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは95％、最も好ましくは98若しくは99％相同である。そして精製したDNAは、本質的に、配列番号２、３若しくは５に記載したのと同じアミノ酸配列又はその断片を有するペプチドをコードする。
他の面において、この発明は、この発明のペプチドをコードするこの発明のDNA好ましくはこの発明の精製したDNAを含むベクターを含む。
この発明は又、細胞例えば精製したIkaros蛋白質をコードするDNAを含む培養細胞又は幹細胞、Ikaros蛋白質を発現し得る細胞、トランスジェニック動物を生成し得る或は造血細胞例えばリンパ球様細胞（例えば、Ｔ細胞）の均質集団を生成し得る細胞、それぞれ精製したIkaros蛋白質をコードするDNAを含む細胞の本質的に均質な集団、及びこの発明のDNA好ましくは精製したDNAを含む細胞を培地中で培養してこのペプチドを発現させることを含むこの発明のペプチドを製造する方法を含む。
他の面において、この発明は、この発明のペプチド好ましくは実質的に純粋なこの発明のペプチド例えばIkaros活性を有するペプチド（例えば、Ikarosイソ型１、２、３、４若しくは５）を叙述する。好適具体例においては、コードされるIkarosペプチドの配列は、本質的に、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片の配列と同じである。このペプチドの配列は、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片をコードするDNA例えば配列番号２若しくは３のDNAと少なくとも85％、一層好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98若しくは99％相同なDNA配列によってコードされるようなものである。Ikaros活性を有するペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、３若しくは５のペプチドと同じ若しくは本質的に同じアミノ酸配列を有するペプチドをコードする核酸に高若しくは低緊縮条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ得るようなものである。このペプチドは、少なくとも30、一層好ましくは少なくとも40、更に好ましくは少なくとも50、最も好ましくは60、80、100若しくは200アミノ酸残基の長さを有する。このペプチドは、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片の、少なくとも50％、一層好ましくは少なくとも60％、更に好ましくは70％、更に好ましくは80％、更に好ましくは90％、最も好ましくは95％の長さを有する。このペプチドは、本質的に、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片と同じ長さである。このペプチドは、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片例えば配列番号２、３若しくは５のペプチド配列と同じ若しくは本質的に同じであるアミノ酸配列と、少なくとも80％、一層好ましくは少なくとも85％、更に好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは98若しくは99％の相同性を有する。そして、このペプチドのアミノ酸配列は、本質的に、天然のIkarosペプチド又はIkaros活性を有するその断片例えば配列番号２、３若しくは５で記載された配列の配列と同じである。
好適具体例において、この発明のペプチド若しくはこの発明の精製したペプチドを、この発明のDNA好ましくはこの発明の精製したDNAの発現によって製造する。
この発明は又、Ikaros蛋白質に対する抗体好ましくはモノクローナル抗体の実質的に純粋な調製物、Ikaros蛋白質及び製薬上許容し得るキャリアーを含む治療用組成物、この発明の精製したDNA及び製薬上許容し得るキャリアーを含む治療用組成物をも含む。
他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は免疫系異常例えばＴ細胞若しくはＢ細胞関連異常用の動物モデル例えばヌードマウス若しくはSCIDマウスを治療する方法（治療上有効な量のIkarosペプチドを動物に投与することを含む）を叙述する。
他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は免疫系異常例えばＴ細胞若しくはＢ細胞関連異常用の動物モデル例えばヌードマウス若しくはSCIDマウスを治療する方法（例えば、Ikaros遺伝子産物の発現についてイン・ビトロで選択した細胞（例えば造血幹細胞、例えばIkarosペプチドをコードするDNAでトランスホームした細胞、例えばIkarosペプチドをコードするDNAでトランスホームした造血幹細胞）を動物に投与することを含む）を叙述する。
好適具体例において、これらの細胞をそれらが投与される動物から取り出し；これらの細胞をそれらが投与される動物のMHC適合性の動物から取り出し；これらの細胞をそれらが投与される動物と同系の動物から取り出し；これらの細胞をそれらが投与される動物と同じ種の動物から取り出す。
他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は免疫系異常例えばＴ細胞若しくはＢ細胞関連異常用の動物モデル例えばヌードマウス若しくはSICDマウスを治療する方法（Ikarosペプチドをコードする核酸を動物に投与してその核酸を発現させることを含む）を叙述する。
他の面において、この発明は、例えば造血を促進し又は抑制するようにデザインされた治療の効果を評価する方法（治療を実施してIkaros遺伝子の発現における治療の効果を評価することを含む（即ち、Ikaros遺伝子を評価のための指標として利用する）を叙述する。
好適具体例において、この治療を、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は免疫系異常例えばＴ細胞若しくはＢ細胞関連異常用の動物モデル例えばヌードマウス若しくはSCIDマウス、或は細胞例えば培養幹細胞に施す。
他の面において、この発明は、患者例えばヒトがIkaros遺伝子の誤った発現に関係する異常（例えば、白血病性異常又は免疫不全等の他の免疫系異常、或はＴ細胞若しくはＢ細胞の欠乏により特徴付けられる異常等のＴ細胞若しくはＢ細胞関連の異常）の危険にさらされているかどうかを測定する方法（患者を、Ikaros遺伝子の発現について検査することを含み、非野生型発現又は誤った発現は危険を示す）を叙述する。
他の面において、この発明は、患者例えばヒトがIkaros遺伝子の誤った発現に関係する異常（例えば、白血病性異常又は免疫不全等の他の免疫系異常、或はＴ細胞若しくはＢ細胞の欠乏により特徴付けられる異常等のＴ細胞若しくはＢ細胞関連の異常）の危険にさらされているかどうかを測定する方法（患者からの核酸を供給して患者のIkaros対立遺伝子の構造が野生型と異なるかどうかを測定することを含む）を叙述する。
好適具体例において、この測定は、患者のIkaros対立遺伝子が肉眼的な染色体再配置を有するかどうかを測定することを含む。この測定は、患者のIkaros遺伝子を配列決定することを含む。
他の面において、この発明は、免疫異常例えばＴ細胞関連の異常、Ｔ細胞若しくはＢ細胞の欠乏により特徴付けられる異常についての動物若しくは細胞モデルを評価する方法（動物若しくは細胞モデル中のIkaros遺伝子が予め決めたレベルで発現されるかどうか或はIkaros遺伝子が誤った発現をしているかどうかを測定することを含む）を叙述する。好適具体例において、この予め決めたレベルは、野生型又は正常動物におけるレベルより低い。この予め決めたレベルは、野生型又は正常動物におけるレベルより高い。或は、イソ型発現のパターンは野生型と異なっている。
他の面において、この発明は、トランスジェニックゲッ歯動物例えばIkaros遺伝子即ちIkaros蛋白質をコードするDNAを含むトランス遺伝子（transgene）を有するマウスを叙述する。好適具体例において、Ikaros遺伝子又はDNAは、欠失例えば１つ以上のIkarosエクソンの全部又は一部の欠失（例えば、もし欠失しなければ誤って発現されるエクソンE7の全部又は一部の欠失或はエクソンE3又はE4の全部又は一部の欠失）を含む。
他の面において、この発明は、例えば細胞（例えば幹細胞）中で異種遺伝子を発現させる方法（遺伝子をIkaros応答性制御要素の下に置いてIkaros応答性制御要素をIkaros蛋白質と接触させることを含む）を叙述する。
好適具体例において、Ikaros応答性制御要素は、エンハンサー例えばδＡ要素、NFKB要素又はIkaros結合配列の１つ例えば共通配列の１つを含む（ここに開示する）。Ikaros応答性制御要素はCD3δ遺伝子の調節領域を含む。異種遺伝子及びIkaros応答性制御要素はベクターで運ばれる。この方法は、更に、細胞を、異種遺伝子を含むベクターで、Ikaros応答性制御因子の制御下で、トランスホームする工程を含む。この異種遺伝子は、Ikaros蛋白質を正常に含み又は発現する細胞において発現される。
他の面において、この発明は、Ikaros応答性制御要素の制御下で遺伝子を細胞中で発現させる方法（Ikaros蛋白質を細胞に投与することを含む）を叙述する。
好適具体例において、この方法は、更に、細胞をIkaros蛋白質をコードするDNAでトランスホームしてIkaros蛋白質を供給することを含む。その遺伝子は異種遺伝子である。
他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は神経系異常例えば線条体異常、アルツハイマー病、免疫系異常の動物モデルを治療する方法（治療上有効な量のIkaros蛋白質を動物に投与することを含む）を叙述する。
他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は神経系異常例えば線条体異常、アルツハイマー病の動物モデルを治療する方法（例えば、Ikaros遺伝子産物の発現についてイン・ビトロで選択した細胞（例えば造血幹細胞、例えばIkaros蛋白質をコードするDNAでトランスホームした細胞、例えばIkaros蛋白質をコードするDNAでトランスホームした造血幹細胞）を動物に投与することを含む）を叙述する。
好適具体例において、これらの細胞をそれらが投与される動物から取り出し；これらの細胞をそれらが投与される動物とMHC適合性の動物から取り出し；これらの細胞をそれらが投与される動物と同系の動物から取り出し；これらの細胞をそれらが投与される動物と同じ種の動物から取り出す。
他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は神経系異常例えば線条体異常、アルツハイマー病の動物モデルを治療する方法（Ikarosペプチドをコードする核酸を動物に投与して核酸を発現させることを含む）を叙述する。
他の面において、この発明は、神経系の異常例えば線条体異常、アルツハイマー病の治療の効果を評価する方法（治療を施してIkaros遺伝子の発現における治療の効果を評価することを含む）を叙述する。
好適具体例において、この治療を、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック動物、又は神経系異常例えば線条体異常、アルツハイマー病の動物モデル、或は細胞例えば培養幹細胞に施す。
他の面において、この発明は、患者例えばヒトがIkaros遺伝子の誤った発現に関連する異常例えば神経系の異常例えば線条体異常、アルツハイマー病の危険にさらされているかどうかを測定する方法（Ikaros遺伝子の発現、非野生型発現又は危険を示す誤った発現について患者を検査することを含む）を叙述する。
他の面において、この発明は、患者例えばヒトがIkaros遺伝子の誤った発現に関連する異常例えば神経系の異常例えば線条体異常、アルツハイマー病の危険にさらされているかどうかを測定する方法（患者からの核酸試料を供給してその患者のIkaros対立遺伝子の構造が野生型と異なっているかどうかを測定することを含む）を叙述する。
好適具体例において、この測定は、患者のIkaros対立遺伝子が肉眼的な染色体再配置を有しているかどうかを測定することを含む。この測定は、患者のIkaros遺伝子を配列決定することを含む。
他の面において、この発明は、神経系の異常例えば線条体異常、アルツハイマー病について動物若しくは細胞モデルを評価する方法（動物若しくは細胞モデル中のIkaros遺伝子が予め決めたレベルで発現しているかどうか或はIkaros遺伝子が誤った発現をしているかどうかを測定することを含む）を叙述する。
好適具体例において、予め決めたレベルは野生型又は正常動物におけるレベルより低い。予め決めたレベルは野生型又は正常動物におけるレベルより高い。
他の面において、この発明は、蛋白質（例えば、第１のIkarosイソ型）とDNA配列（例えば、δＡ配列、NKFB配列、ここに記載したIkaros結合オリゴヌクレオチドに対応する配列の制御下のDNA配列）又はリンパ球限定された遺伝子例えばTCR−α、−β若しくは−δ、CD3−δ、−ε、−γ遺伝子、SL3遺伝子又はHIVLTR遺伝子の制御領域中に存在する部位との間の相互作用（例えば、結合）を抑制する方法を叙述する。これらの方法は、DNA配列を有効量の第２のIkarosイソ型又はIkarosイソ型の（例えば、第２のIkarosイソ型の）DNA結合断片と接触させることを含む。
好適具体例において、この断片は、Ikarosエクソンのすべて又は一部について（例えば、E1/2、E3、E4、E5、E6又はE7のすべて又は一部）、欠失している。
他の面において、この発明は、蛋白質（例えば、第１のIkarosイソ型）とDNA配列（例えば、δＡ配列、NKFB配列、ここに記載したIkaros結合オリゴヌクレオチドに対応する配列）又はリンパ球限定された遺伝子例えばTCR−α、−β若しくは−δ、CD3−δ、−ε、−γ遺伝子、SL3遺伝子又はHIVLTR遺伝子の制御領域中に存在する部位との間の相互作用（例えば、結合）を抑制する方法を叙述する。これらの方法は、蛋白質を有効量のIkaros結合オリゴヌクレオチドと接触させることを含む。好適具体例において、オリゴヌクレオチドは、IK−BS1、IK−BS2、IK−BS3、IK−BS4又はIK−BS5から選択した配列を含む。
好適具体例において、このオリゴヌクレオチドは、選択的に、第１のIkarosイソ型に結合する。このオリゴヌクレオチドは、選択的に、第２のIkarosイソ型に結合する。
他の面において、この発明は、Ikaros結合オリゴヌクレオチド例えばIK−BS1、IK−BS2、IK−BS3、IK−BS4又はIK−BS5を含む。好適具体例において、このオリゴヌクレオチドは、ここに記載したIkaros結合オリゴヌクレオチド配列の１種の少なくとも２、３、４又は５コピーを含む。
他の面において、この発明は、第１のIkarosイソ型の標的DNAへの結合を弱める方法を叙述する。この方法は、標的DNAを有効量の第２のIkarosイソ型と接触させ、或は該第２のイソ型のDNA結合断片と接触させることを含む。
異種遺伝子とは、ここで用いる場合、通常はIkaros応答性制御要素の制御下にない遺伝子のことである。
Ikaros応答性制御要素とは、ここで用いる場合、遺伝子の上流又は下流に存在するときに、調節例えばIkaros蛋白質の存在下での遺伝子の増大した転写を生じるDNAの領域である。
精製したDNAは、この発明のDNAが由来する生物の天然のゲノムにおいて直接隣接している（即ち、5'側と3'側の）両コード配列と直接隣接していないDNAである。従って、この用語は、例えば、ベクター、自律的複製プラスミッド若しくはウイルス又は原核生物若しくは真核生物のゲノムDNAに取り込まれた、或は他のDNA配列とは独立した分離した分子（例えば、PCR又は制限エンドヌクレアーゼ処理により生成したcDNA又はゲノムDNA断片）として存在する組換えDNAを含む。それは又、更なるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAをも含む。
相同とは、２つのポリペプチド分子の間又は２つの核酸分子の間の配列類似性をいう。これらの２つの比較する配列の両方におけるある位置が同じ塩基又はアミノ酸単量体サブユニットで占められているとき、例えば、２つのDNA分子の各々におけるある位置がアデニンで占められているならば、それらの分子はその位置で相同である。２つの配列の間の相同性は、２つの配列により共有される一致する即ち相同な位置の個数の関数である。例えば、２つの配列中の位置の10の内６が一致するか相同であるならば、これら２つの配列は60％相同である。例えば、DNA配列ATTGCCとTATGGCとは50％相同である。
トランス遺伝子とは、技術により細胞に挿入されてその細胞から全部又は一部が発生した動物のゲノムの一部となった一片のDNAのことである。かかるトランス遺伝子は、部分的に又は全体的に、トランスジェニック動物に対して異種である。
トランスジェニック動物例えばトランスジェニックマウスは、トランス遺伝子を含む細胞を有する動物であり、そのトランス遺伝子はその動物に又はその動物の先祖に胎児期例えば胚段階で導入されたものである。
エンハンサー領域とは、エンハンサー領域の上流又は下流に位置するプロモーターからの転写を増大することの出来るシス作用DNA配列のことである。かかるDNA配列は、真核生物の遺伝子発現の分野の当業者には周知である。
実質的に純粋なペプチド調製物とは、天然において細胞中に存在するペプチドを実質的に含まない調製物である。非天然ペプチドの実質的に純粋な調製物は、関心あるペプチドの少なくとも10重量％の調製物である。
誤った発現とは、ここで用いる場合、遺伝子発現の非野生型パターンのことをいう。それは、非野生型レベルでの発現即ち過剰発現又は低発現を含み、遺伝子が発現される時間又はステージに関して野生型と異なる発現パターン例えば予め決めた発生時期又はステージにおける（野生型と比較して）増大した又は減少した発現、発現の組織特異性に関して野生型と異なる発現パターン例えば予め決めた細胞型又は組織型における（野生型と比較して）増大した又は減少した発現、Ikaros遺伝子産物のサイズ、アミノ酸配列、転写後修飾又は生物活性に関して野生型と異なる発現パターン、遺伝子発現における環境刺激又は細胞外刺激の影響に関して野生型と異なる発現パターン例えば刺激の強度の増加又は減少における（野生型と比較して）増大した又は減少した発現パターン、或は野生型と異なるイソ型発現のパターンを含む。
ペプチド、蛋白質及びポリペプチドという用語は、ここでは、互換性を有して用いている。
ペプチドは、次の特性：δＡ要素、NFKB要素又はここに開示するIkaros結合オリゴヌクレオチド共通配列の１つの制御下でDNA配列の転写を刺激する能力、δＡ要素、NFKB要素又はここに開示するIkaros結合オリゴヌクレオチド共通配列の１つの何れかに結合する能力、又は天然のIkarosイソ型のδＡ要素、NFKB要素又はここに開示するIkaros結合オリゴヌクレオチド共通配列の１つの何れかとの結合を競争的に阻害する能力の１つ又はそれより多くを有するならば、Ikaros活性を有する。Ikarosペプチドとは、Ikaros活性を有するペプチドである。
この発明は、Ｔ細胞、Ｔ細胞へ発達し得る細胞を同定し及び一般に造血例えば前駆幹細胞へＴ細胞への分化の研究において有用である。Ikaros遺伝子及びその産物の役割は、例えばIkaros遺伝子若しくはその断片でトランスホームした細胞（例えば、培養細胞）又はトランスジェニック動物において研究することが出来る。この発明は又、細胞系統のマーカー例えばCD3δ遺伝子の発現を促進し、細胞例えば幹細胞のＴ細胞へ発達する能力を増大し、遺伝的なＴ細胞異常例えば白血病の危険のある個人をスクリーニングし、及び、Ｔ細胞の欠乏により特徴付けられる免疫異常（例えば、免疫不全（例えば、AIDS）又は化学物質、薬剤若しくは照射により誘導された免疫不全、又は癌（例えば、白血病））を治療するのにも有用であり、Ikaros遺伝子の構造及び発現又はその遺伝子産物のイソ型を研究し、Ikaros遺伝子の発現又はイソ型の種又は組織による差異を研究し、DNA結合蛋白質の構造及び機能を研究し、ジンクフィンガー含有蛋白質の構造及び機能を研究し、トランスジェニック動物を作成し、Ikarosの標的分子への結合を阻害し、Ikarosイソ型の標的DNAに対する相対的親和性を研究し、及びIkarosイソ型の制御下での遺伝子発現を調べ又は操作するのにも有用である。
この発明の他の特徴及び利点は、下記の説明及び請求の範囲から明らかとなろう。
詳細な説明
先ず、図面を簡単に説明する。
図面
図1Aは、CD3エンハンサーのδＡ要素（配列番号１）のマップである。
図1Bは、種々の要素配列の制御下でtkCATレポーター遺伝子の発現により分析した要素の活性に対するCRE及びＧボックスの寄与を示すグラフである。左側の棒グラフにおいて、塗りつぶした棒はtkcatレポーター遺伝子を、影をつけた棒はtkcat3δＡを、水平線をつけた棒はtkcat3δAmu1（−CRE）を、点刻した棒はtkcat3δAmu2（−Ｇボックス）を表す。右側の棒グラフにおいて、塗りつぶした棒はtkcatを、左側の斜線をつけた棒はtkcatδehnを、点刻した棒はtkcatδenh（−CRE）を、右側の斜線をつけた棒はtkcatδenh（−δＡ）及び空白の棒はtkcatδenh（−Ｇボックス）を表す。
図1Cは、非Ｔ細胞におけるδ要素の活性におけるIkaros発現の影響を示すグラフである。この棒グラフにおいて、塗りつぶした棒はtkcatを、点刻した棒はtkcat3δＡを、斜交平行線をつけた棒はtkcatδenhを表す。
図２は、マウスIkaroscDNAのDNA配列及びそれによりコードされる所望のアミノ酸配列のマップである（配列番号２）。
図３は、ヒトIkaroscDNAの部分配列である（配列番号３）。
図４は、IK−１のcDNA（配列番号５）のアミノ酸構成の描写である。（IK−１は、６つのすべてのコーディングエクソン（Ex1/2;Ex3;Ex4;Ex5;Ex6及びEx7）からなる。）矢印は各エクソンの最初のアミノ酸を示している。
図５は、Ikaros1〜５のcDNAにおけるエクソン使用の図解である。エクソン番号は各ボックスの左下隅に示してある（Ex）。ジンクフィンガーモジュールをコーティングエクソンの上側に示してある（Fx）。第１行はIkaros1を、第２行はIkaros2を、第３行はIkaros3を、第４行はIkaros4を、第５行はIkaros5を表す。
図６は、Ikaros遺伝子座におけるエクソン編成の描写であり、応答性イソ型の増幅に用いるプライマーのセット1/2及び3/4を示してある。特に、図６は、オリゴ1/2IK−1/IK−2/IK−４及びオリゴ3/4IK−1/IK−3/IK−５を表す。
図７は、マウスIkaros遺伝子のゲノム編成のマップである。完全な遺伝子は80〜90kBの長さである。イントロンDNA又は特徴付けられていないDNAは、5'と3'の間の線で示してある。エクソンはボックスで示してある。f2、f10、f4及びf8と番号を付けた線は、直上の配列に対応するファージ挿入物を示している。制限部位は通常の略語で示してある。
図８は、異なる遺伝子発現のIkarosイソ型制御のモデルである。Th＝胸腺、Sp＝脾臓、Ex＝胚発生日数、Dx＝生後日数。左欄は、所定の発生ステージにおけるイソ型の相対的な発現を表している。空白の棒＝Ik−１、水平縞＝Ik−２、斜縞＝Ik−３、塗りつぶした棒＝Ik−４。右欄は、所定の発生ステージで生じたのIkaros結合部位の反応性を示している。薄い棒＝低親和性部位（イソ型１、２、３及び４が同じ親和性で結合する部位）、濃い棒＝高親和性の逆方向又は直列反復配列含有部位（例えば、NFKB部位、Ik1〜４は高い親和性で結合する）、斜線をつけた棒＝単一の高親和性部位（Ik1及びIk2は結合するがIk3及びIk4は結合せずそれ故Ik−１及びIk−２の結合を弱めない部位）。
Ikaros:造血分化の主要な調節物質
適当な微小環境における造血幹細胞は、多くの細胞系統の内の１つに入って分化する。この分化経路における別個のチェックポイントにおいて機能する変換信号分子及び転写因子は、これらの初期前駆細胞の運命を特定する。かかる分子は、発生における主要な調節物質と考えられるが、初期造血ステージに限定される病気のマーカーとして機能するとも考えられる。
Ｔ細胞及びＢ細胞における遺伝子発現の基礎となる転写機構の研究は、リンパ球分化に関与する幾つかの転写因子を同定した。しかしながら、これらの遺伝子の幾つかは、成熟動物及び発生中の胚における発現の非限定的パターンにより測定されたように幾つかの発生系において役割を演じるようである。成熟動物においてＴ細胞及び初期リンパ細胞に限定されるHMGボックスDNA結合蛋白質TCF及びLEFは、発生中の胚においては広く発現されている。Ｔ細胞特異的なGATA−３転写因子も又初期胚における造血系の外で発現している。etsファミリーのメンバーのEts−１及びElf−１も又、広く分布している。更に、これらの蛋白質の殆どの結合親和性及び転写可能性は、他の組織限定分子により制御されている。これらのets蛋白質は同種の配列と結合する高い親和性のために更なる因子と相互作用する、TCFI、LEF及びets−１は、活性転写のための他のリンパ系限定アクセサリー蛋白質と相互作用するに違いない。
初期Ｔ細胞における遺伝子発現の制御におけるリンパ系限定転写エンハンサーの研究において、我々は、ジンクフィンガーDNA結合蛋白質をコードするIkaros遺伝子を単離した。初期胚において、このIkaros遺伝子は造血肝において発現されるが、妊娠中期から後期にかけて胸腺に限定されるようになる。IkarosmRNAを有する他の胚部位は、線条体中の小さい領域のみである。成熟動物において、IkarosmRNAは、胸腺及び脾臓においてのみ検出される（Georgopoulos等、1992）。Ikaros遺伝子は、非リンパ系細胞中で異所的に発現された場合には、転写エンハンサーとして機能する。
Ikaros遺伝子は、初期リンパ球及びＴ細胞分化において重要な役割を演じている。Ikaros遺伝子は、初期胚の造血部位において豊富に発現され、その後発生中の胸腺中に限定される。胸腺は、脾臓と共に、成熟動物における発現の活性部位である。このIkaros遺伝子の高度に豊富な発現は又、初期及び成熟一次Ｔ細胞及び細胞系統においても見出された。このIkaros遺伝子の、胚及び成熟動物のＴ細胞前駆体が共に初期Ｔ細胞分化抗原の調節ドメインからの転写を活性化するコードされた蛋白質の能力を生ずる部位に限定された発現パターンは、Ｔ細胞特性化における決定の役割を支持した。
Ikarosゲノム遺伝子座における差次的（differential）スプライシングは、別個のDNA結合部位を有する蛋白質をコードする少なくとも５つの転写産物を生成する。これらのIkaros蛋白質イソ型（IK−１、IK−２、IK−３、IK−４、IK−５）は、重複を有するが、Ｎ末端のジンクフィンガーモジュールの差次的利用により指図される別個のDNA結合特異性をも有する。これらのIkaros蛋白質の４つのコア結合部位は、GGGAモチーフであるが、この配列の外ではそれらの特異性は劇的に変化する。IK−３蛋白質は、それが結合し得る部位の数を限定する5'及び3'両フランキング配列における塩基に対する強い選択性を示す。Ik−１蛋白質も又、これらのフランキング塩基の幾つかに対する強い選択性を示し、一層広い範囲の配列と結合することが出来る。Ik−２蛋白質（３種の蛋白質の内で最も無差別）は、丁度GGGAa/tモチーフを有する部位に結合することが出来る。最後に、Ik−１に類似の配列特異性を有するIk−４蛋白質は、第２の部位が近接しているときにのみ高い親和性を有して結合し、この蛋白質による協同的部位占有を示している。多くのIkaros蛋白質に対する推定上の結合部位を、Ｔ細胞レセプター−δ、−β及び−α並びにCD3−δ、−ε及び−γ遺伝子のエンハンサー、IL2−Ｒプロモーター中のHIVLTR並びに多様な他のリンパ球限定遺伝子中で同定した。これらの部位の１つ、Il−2Rαエンハンサー中のNFkB変異体は、これらの蛋白質のすべてに高い親和性で結合する。このNFkBモチーフ（Ｔ細胞中のIl2レセプターαの発現に対する重大な調節要素）は、Ｔ細胞及び非Ｔ細胞においてIk−１及びIk−２イソ型によって強く活性化される。IL−2Rα遺伝子は活性化Ｔ細胞中で高レベルに発現されるが、Ikaros遺伝子をやはり高レベルで発現する胎児胸腺細胞においても高レベルに発現される。従って、Ｔ細胞の分化及び活性化の間に少なくともIL2αレセプターの遺伝子調節が、共通基盤上で相互作用するNFkB及びIkaros転写因子の複雑な相互作用によって制御され得る。
Ikarosイソ型の胚における発現パターン及び活性化能力は、著しく異なっている。強い転写因子Ik−１及びIk−２は、初期胎児肝、成熟中の胸腺及び発生中の脳の小さい領域において豊富に発現されているが、弱い活性化因子Ik−３及びIk−４は低レベルで発現されている。しかしながら、Ik−１及び特にIk−２蛋白質はIk−３及びIk−４より広い範囲の部位に結合するので、Ik−３及びIk−４と同じ配列に結合する利用可能な分子は、類似の濃度であろう。更に、14日胚の胸腺において、弱い活性化因子Ik−４は、Ik−１及びIk−２イソ型以上のレベルで存在する。認識モチーフ（NFkB変異体）の完全な若しくは不完全な、逆方向反復若しくは直列反復配列に対するIk−４、Ik−１及びIk−３の間の競争は、初期胸腺においてこれらの部位からの低レベルの転写活性化を媒介することが出来る。非活性化Ik−４蛋白質成熟胸腺細胞の減少したレベルと組合せた活性化Ikaros因子の定常状態レベルは、発生中の胸腺においてこれらの二重の部位の活性をオンにすることが出来る。これは、ステージ特異的なＴ細胞分化抗原の新たな発現を生じ得る。最後に、低親和性の結合部位からの活性化は、Ikaros活性化蛋白質が過剰である場合には、Ｔ細胞分化のこれらの後期ステージにおいてのみ可能である。ショウジョウバエNKkB相同体ドーサル（Dorsal）の濃度勾配及び他の核因子との別個の蛋白質−蛋白質相互作用は、ハエ胚におけるこの活性化レベル及び高及び低親和性結合部位の域値応答の原因である。図８は、異なる発生ステージにおけるIkarosイソ型の相対濃度が種々の部位において異なる反応性を与えるというモデルを提供する。
Ik−３及びIk−４蛋白質の転写活性は、更に、Ｔ細胞信号媒介の翻訳後修飾又は蛋白質−蛋白質相互作用によって調節され得る。Ik−４蛋白質は、NFkBモチーフと協同様式で結合し、それ故、Ikaros若しくはNFkBファミリーの他のメンバーとその場で相互作用し得る。これらの蛋白質−蛋白質−DNA複合体は、分化における転写結果を指図する。
Ｔ細胞個体発生の間のIkarosイソ型の分化における発現、それらの重複及び別個の結合特異性並びにそれらの多様転写（diverse transcription）能力は、ステージ特異的なＴ細胞分化マーカーの規則的な活性化の原因であり得る。発生中のリンパ球における遺伝子発現の多層は、これらの蛋白質の調節を受け易いことはあり得る。これらの細胞中のIkarosファミリーと他の因子との間の、量的に類似の及び別個の標的部位における、共同的相互作用及び／又は競争は、休止及び活性化リンパ球の遺伝的構造を指図し得るであろう。このIkaros遺伝子の機能の詳細な吟味は、提案したリンパ球における主要遺伝子としての機能を強く支持する。Ikaros遺伝子の、初期造血及びＴ細胞発生に必要な遺伝的スイッチとしての役割は、最後は、トランスジェニック動物における遺伝子削除の研究において扱われる。
CD3δエンハンサーのδ要素の突然変異分析
Ｔ細胞分化における初期事象を特徴付けるのに有用な１つのアプローチは、Ｔ細胞限定抗原の転写調節を研究することである。我々は、最初期及び確定Ｔ細胞分化のマーカーの１つ、CD3/TCR複合体のCD3δ遺伝子の転写制御を選択した。Ｔ細胞系統へ入るように調節する遺伝的スイッチとして機能し得るＴ細胞拘束以前に発現される転写因子を同定するために、我々は、この遺伝子のＴ細胞特異的エンハンサー媒介による発現を特徴付けた。このエンハンサーは、Ｔ細胞内に限定された活性を有する２つの機能的に別個の要素δＡ及びδＢとからなる。δＡ要素の突然変異分析は、更に、２つの転写的に活性な結合部位、CRE（環状AMP応答−）様要素及びＧリッチ配列モチーフ（これらの両者は、δＡ要素とCD3エンハンサーの完全な活性に必要とされる。図１を参照されたい。）を同定した。
図１は、CD3δエンハンサーのδＡ要素の機能の精密な吟味を描写している。図1Aは、δ要素（配列番号１）における結合部位を示している。ボックスで囲った配列は、CRE様及びＧリッチモチーフ（両者は、δＡ要素の活性にとって重要である）を表している。δＡ要素に導入された突然変異を配列の下側に示してある。
図1Bは、Ｔ細胞系統EL4における過渡的発現アッセイにより分析したδＡ要素及びCD3δエンハンサーの活性に対するCRE及びＧボックスの寄与を示している。反復要素としての野生型δＡ、δAmu1及びδAmu2の制御下での又はCD3δエンハンサーの関係におけるtkCATレポーター遺伝子の活性を、Georgopoulos等、（1992）Mol.Cell.Biol.12:747に記載されたようにして測定した。レポーター遺伝子活性（R.A.）を、各トランスフェクションアッセイについて評価したクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）の成長ホルモン（GH）に対する比として表した。図1Cは、非Ｔ細胞中でのIkaros遺伝子（Ik−２）の発現がδＡ要素の活性を増大させることを示している。CDM8及びCDM8:Ikaros組換えＩ発現ベクターを、Georgopoulos等、（1992）に記載されたように、tkcat3δＡ、tkcat3δAmu1、tkcat3δAmu2及びtkcatδエンハンサーレポーター遺伝子とCV1（腎臓上皮）細胞中にコトランスフェクトした。Ikaros発現の存在時と不在時のレポーター活性の比（R.A.＝CAT/GH）を評価した。偏在的に発現されるCRE結合蛋白質の３つのイソ型を、δＡ要素のCRE様結合部位と相互作用する能力のためにＴ細胞からクローン化した（Georgopoulos等、（1992）参照）。この蛋白質の主要陰性変異体はＴ細胞におけるこのエンハンサー要素の活性を低下させるが、すべての造血及び非造血細胞におけるこの転写因子の発現は、それが初期プロ胸腺細胞前駆体におけるCD3δエンハンサーを活性化するスイッチであることの反証となる。このδＡ要素の変異体（δAmu1−CRE）を用いて、Georgopoulos等、（1992）に記載されたように、Ｔ細胞発現ライブラリーをスクリーニングした。下記のように、Ａ要素のＧボックスに結合する新規なジンクフィンガー蛋白質（Ikaros）をコードしているＴ細胞限定cDNAをクローン化した。
Ikaros遺伝子のクローン化
成熟Ｔ細胞系統E14からのＴ細胞発現cDNAライブラリーをAZAPファージベクター中に構築した。
CD38エンハンサーの１つの蛋白質結合部位からの配列（配列番号４）をコードする多数化されたオリゴヌクレオチドを放射標識プローブとして用いてこの発現ライブラリーを、SinghとMcKnightのサウスウエスタンプロトコールによって、エンハンサー機能に結合してそれを媒介するＴ細胞特異的蛋白質についてスクリーニングした。４つの遺伝子コードDNA結合蛋白質が単離された。その１つであるIkaros遺伝子はＴ細胞特異的蛋白質をコードしていた。
Ikarosの配列
Ikaros遺伝子の配列を、サンガーのジデオキシ配列決定プロトコールを用いて決定した。誘導されるアミノ酸配列をGCGのMAPプログラム（ウィスコンシン大学から入手可能）及びStriderシーケンス分析プログラムを用いて決定した。図２は、IkaroscDNA及びそれによりコードされる誘導したアミノ酸配列の配列（配列番号２）を与える。
Ikaros蛋白質
図２（Ik−２）に示したIkaros蛋白質は、２つの別々のクラスターに構成される５つのCX2CX12HX3Hジンクフィンガーモチーフを有する431アミノ酸からなる（図５も参照されたい）。３つのフィンガーの第１のクラスターは、開始メチオニンから59アミノ酸の位置にあるが、他方第２のクラスターはこの蛋白質のＣ末端に第１のクラスターから245アミノ酸下流に見出される。この蛋白質の２つのフィンガーモジュールは、ジンクフィンガーのCys−Hisファミリーの共通アミノ酸組成からはずれている。第１のクラスター中のフィンガー３及びＣ末端のフィンガー５はヒスチジン残基の間に４つのアミノ酸を有する。この２つの広く離れた領域内のジンクフィンガーの配置は、ショウジョウバエの体節形成ギャップ遺伝子ハンチバック（Hunchback）の配置の追憶である。蛋白質データにおける類似性の検索は、Ikarosの第２フィンガークラスターとこれらの分子のＣ末端のハンチバックとの間の43％の同一性を明らかにした。これらの蛋白質のＣ末端における類似性及びそれらのフィンガードメインの類似の配置は、これらの蛋白質が進化的に関連していて種を超えて保存されたジンクフィンガー蛋白質のサブファミリーに属している可能性を高める。
Ikarosイソ型
Ik−２に対応するcDNAに加えて、Ikarosゲノム遺伝子座における分化スプライシングにより生成される４つの他のcDNAをクローン化した。これらのcDNAをコードするイソ型を、前に特徴付けしたIkaroscDNA（Ik−１、図１）の3'からの300bp断片を用いて同定した、図４及び５に示すように、各イソ型は、E1/2、E3、E4、E5、E6及びE7という６つのエクソンの３つ以上から導かれる。すべての５つのcDNAは、それぞれＮ−53及びＣ−末端236アミノ酸ドメインをコードするエクソンE1/2及びE7を共有している。これらの５つのcDNAは、Ｎ末端ジンクフィンガードメインをコードするエクソンE3〜E6の種々の組合せからなる。Ik−1cDNAは、Ｎ末端の４つのジンクフィンガー及びＣ末端の２つのジンクフィンガーを有し、ショウジョウバエ体節形成蛋白質ハンチバックに対する最強の類似性を有する58kD蛋白質をコードしている（図５において、ジンクフィンガーはF1、F2＋F3、F4及びF5＋F6で示してある）。Ik−２及びIk−3cDNAは、重複を有するが種々の組合せのジンクフィンガーを有する48kdの蛋白質をコードしている。Ik−３は、フィンガー１、２、３を含んでいるが、他方Ik−２はフィンガー２、３及び４を含む。43.5kDのIk−４蛋白質は、Ｎ末端にIk−１及びIk−２にも存在する２つのフィンガーを有する。Ik−5cDNAは、Ik−１及びIk−３と共通のＮ末端フィンガー１つのみを有する42kdの蛋白質をコードしている（図１）。このIkaros蛋白質によるジンクフィンガーモジュールの分化における利用は、重複を支持するが、分化におけるDNA結合特異性を支持する。
イソ型のcDNAクローン化を下記のように実施した。λZAP中のＴ細胞系統EL4から作成したcDNAライブラリーを、前述のIkaroscDNA（イソ型２）の3'からの300bp断片を用いて高緊縮にてスクリーニングした。陽性クローンを、エクソン７の5'からのアンチセンスプライマーを用いる配列決定によって特徴付けた。
Ikaros発現
Ikaros遺伝子の組織特異的発現
Ikaros遺伝子をＴ細胞及びそれらの子孫において発現させる。成熟マウスにおいて、IkarosmRNAは、胸腺及び脾臓に限定されるが、胸腺内での発現は脾臓の約３倍強である。Ｔ細胞の涸渇した脾臓細胞調製物はこのメッセージを非常に低レベルで発現した。細胞系統中でのIkaros発現の実験は、Ikaros遺伝子がＴ細胞及びそれらの子孫において発現されるという考えを確実にした。IkarosmRNAは、多くのＴリンパ腫細胞系統中で検出された。Ｔ細胞系統EL4は、高レベルで発現したが、他方D011.10、BW5147及びSL12.2リンパ腫は中程度〜低レベルの発現を示した。骨髄性の形態及び分化可能性を示す骨髄由来前駆細胞FDCP1、マスト細胞系統RBL、マクロファージ系統J774（検出された発現は胸腺細胞におけるより25倍低い）及び赤血球細胞に分化誘導されたMEL細胞を含む他の造血系統を表す細胞系統においては、発現が検出されないか又は非常に低レベルの発現が検出された。それにもかかわらず、中レベルのIkarosmRNAが、Ｂ細胞リンパ腫A20及び前赤白血病細胞系統MELにおいて検出された。これらの細胞系統の不滅化及びそれらの白血病の表現型は、正常Ｂ細胞（脾臓のＴ細胞涸渇集団）中又はイン・ビボで赤血球前駆細胞中で有意のレベルで発現するように見えない（in situデータより）この核因子の異所的発現を説明することが出来る。或は、これらの細胞系統中のこの胸腺細胞限定された因子の発現は、リンパ系統又は赤血球系統に分化する能力を有する初期前駆体の存在を反映しているのかもしれない。
Ikaros遺伝子の組織分布を、Ｔリンパ腫細胞系統EL4、BW5147、DO11.10、SL12.1;B細胞リンパ腫A20;成熟マウスから単離した胸腺、脾臓、腎臓、脳及び心臓の組織；脾臓胸腺細胞（全RNA及びポリＡ−RNA）；骨髄由来幹細胞前駆細胞FDCP1;マクロファージ細胞系統J774;マスト細胞系統RBL;未分化MEL及び58時間DMSO誘導したMEL細胞；及び最終的にＴ涸渇した脾臓細胞（TDSC）から調製した全RNAのノーザンハイブリダイゼーションによって測定した。IkarosIk−2cDNAの3'末端からの320bp断片（bp1230〜1550）をプローブとして用いた。
Ikaros遺伝子の発現の一時的な調節
造血においていつIkaros遺伝子が活性化されるのかを測定するために、その発現を、発生中のマウス胚においてイン・シトゥー（in situ）で研究した。造血は、マウス胚の卵黄嚢中で、原始赤芽球の大集団の生成と共に７日目に始まる。IkarosmRNAは、８日目には、発生のこの時期に発現される赤芽球特異的転写因子GATA−１と対照的に、卵黄嚢内で検出されない。胚中で、適当なIkarosの発現は、最初、初期肝臓原基内で、その造血機能の開始時に検出される（9 1/2〜10 1/2日目）。この時期に、多能性幹細胞並びに更に限定された前駆細胞が肝臓中に見出され、造血系統の全スペクトルを有する照射動物を上首尾で再構成することが出来る。Ikaros遺伝子の発現は、14日目まで肝臓中に強く残り、その後、肝臓が妊娠中期を通じて造血の主要部位であり誕生まで活性であり続けるにもかかわらず下降し始める。妊娠中期の胎児の肝臓におけるIkaros遺伝子の下降する発現は、多能性幹細胞から一層拘束された赤芽球前駆細胞への造血プロフィルの変化と一致する。
Ikaros発現の第２の部位は、リンパ球生成幹細胞が最初にクローン化される約12日目の胸腺原基にある。発現している細胞の一群が、周辺の非発現細胞で囲まれた胸腺原基の中心で検出される。発生中の胸腺における発現は、16日目までに極めて顕著になり、胚形成から成熟生物体までを通じて持続する。これらの発生ステージにおいて、IkarosmRNAの発現は、胸腺全体で検出されるが、髄質部分におけるレベルは皮質におけるレベルより僅かに高い。
Ikaros発現は、妊娠後期には、最初、脾臓において検出されるが、胸腺のレベル（19日目）に比べて低レベルである。脾臓は妊娠中期から赤血球生成及び骨髄生成が活性であるが、胸腺からの成熟Ｔ細胞を有する集団は、胚形成の後期に始まり、Ikaros遺伝子の後期発現と相関する。Ikarosメッセージの発現は、骨髄特異的因子Spy1及び赤血球因子GATA−１と対照的に長骨の骨髄又は脊柱（19日目）において検出されない。別個の造血部位で検出されるIkaros遺伝子の発現パターンは、胚発生を通じて、Ｔ細胞及びそれらの前駆細胞への限定と一致している。マウス胚においてIkaros発現を示した唯一の別の部位は、近位線条体のもとである脳内の限定された領域であった（12〜19日目）。
妊娠中のCD1マウス（Charles River）から胚を採取して寸法に応じて２時間から２日間４％パラホルムアルデヒド中で固定した。一連の脱水工程をアルコール中で行ない、次いで、キシレン中で行なってからパラプラスト包埋した。公開されたプロトコールに従って切片を調製して処理した。300bpの寸法のセンス及びアンチセンスＰ−UTPRNAプローブを、IkaroscDNAの3'非翻訳領域から作成し、48℃で一晩選択したスライドにハイブリダイズさせるために用いた。高緊縮洗浄の後に、スライドを脱水し、稀釈した写真用エマルジョン（NBT2）に３週間浸した。浸したスライドを展開し、ギムザ染色して明暗領域顕微鏡観察により分析した。
Ikarosイソ型の発現
発生中の胚におけるIkarosイソ型の発現パターンを研究した。２セットのプライマーを用いて、５つのcDNAを、胚及び生後組織からの別個の寸法のバンドとして増幅した（図６）。β−アクチンcDNAに相補的なプライマーの第３のセットを用いて、反応に用いるcDNAの量を標準化した。プライマー1/2は、Ik−１、Ik−２及びKk−4cDNAからの720、457及び335bpの断片を増幅した。プライマー3/4は、Ik−１、Ik−３及びIk−5cDNAからの715、458及び293bpの断片を増幅した。検出された650bpのバンドは、Ik−１及びIk−２共増幅のアーティファクトである（Ik−1/Ik−２及びIk−1/Ik−３ハイブリッド分子を表す）。それは、プライマーのIk−１、Ik−２及びIk−３に対する比が減少した場合に後期増幅サイクルにおいて有意のレベルで存在する。このバンドは又、Ik−１、Ik−２及びIk−3DNAテンプレートを共増幅したときにも検出される。上述のバンドの同定も又、クローニング及び配列決定によって確実にした。650bp種が新規なcDNAとしてクローン化されなかったことは注目すべきことである。
胚発生の間に、すべての５つのIkarosmRNAは、造血中心及び脳において種々の相対的レベルで発現された。Ik−1RNAは、初期胎児肝及び成熟中の胸腺において豊富に発現されたが、他方Ik−２は、相対濃度において２番目であった。Ik−４イソ型は、初期胎児肝及び成熟中の胸腺（肝臓E14、胸腺E16及びD1）におけるIk−１及びIk−２に比べて低レベルで発現された。しかしながら、それは、初期胸腺及び妊娠中期の肝臓（表１、胸腺E14、肝臓E16）においてIk−１及びIk−２に匹敵する量で発現された。Ik−３及びIk−５イソ型は発現したが発生を通じてIk−１及びIk−２より有意に低レベルであった（表１）。すべての５つのイソ型は、胚の脳において発現した。Ik−１は、mRNAが最も豊富であり、Ik−２とIk−４とは同程度であったが低レベルであり、他方Ik−３及びIk−５はリース発現であった。
後期胚の胸腺において検出されるIkarosイソ型の発現パターンは、誕生後まで持続したが、他方下降する肝臓での発現は停止された。新生児の脾臓は、Ik−１及びIk−2mRNAのみを有意の量で発現した。低濃度のIk−１が、新生児の脳において依然検出された。これらのデータは、すべての同定されたIkarosスプライシング産物に共通するIkaros遺伝子の3'から作成したRNAプローブを用いて行なった我々の前のイン・シトゥーハイブリダイゼーション研究と一致し、更に補うものである。
Ikarosは、δＡ要素からの転写を刺激する
初期転写の研究
我々は、δＡ要素に結合し得るIkaros蛋白質がこの結合部位からの転写を活性化するかどうかを試験した。tkCATレポーター遺伝子を、反復δＡ結合部位（＋／−CRE/−Ｇ）の制御下又はCDδエンハンサーの制御下において、Ikaros遺伝子を発現する組換えベクターと、腎臓上皮細胞系統CV1においてコトランスフェクトした。非Ｔ細胞中でのIkaros遺伝子の発現は、反復δＡ要素のＧボックス及びCD3δエンハンサー関連の転写を強く刺激した（図1C参照）。δＡ及びδAmu1（−CRE）要素の活性は、それぞれ、８倍及び７倍に刺激されたが、他方CD3δエンハンサーの発現は５倍に刺激された。CD3δエンハンサーは少なくとも２つの調節要素からなっているので、これらの部位に結合するすべての転写因子の発現がその完全な活性化能力のために必要である。Ikaros遺伝子の発現は、チミジンキナーゼプロモーター又はδAmu2（−Ｇボックス）要素の活性を有意に刺激しなかった（図1C参照）。これらのデータは、Ikaros遺伝子はCD3δエンハンサーのＴ細胞特異的δＡ要素の活性を制御することが出来るという我々の仮説を確実にし、それがＴ細胞において少なくともCD3δ遺伝子の発現を媒介することが出来るということを示唆する。
Ikaros蛋白質の発現パターン及びCD3δエンハンサーの活性を調節するその能力は、胚及び成熟動物のＴ細胞における遺伝子発現の媒介における役割と一致する。胎児肝の造血幹細胞におけるその初期の発現は、それが初期の前胸腺細胞前駆体において発現され得ることを示唆し、それが多能性幹細胞からＴ細胞系統への拘束の原因である可能性を高める。
Ikaros1〜３イソ型の結合部位選択
Ikarosイソ型のＮ末端のジンクフィンガーモジュールの分化における利用がそれらのDNA結合特異性に寄与する可能性を研究するために、我々はこれらの蛋白質の３つについて高い親和性の結合部位をクローン化した。Ｎ末端の４フィンガーのプールからの４つ全部（Ik−１）又は３つのフィンガーの２つの別個の組合せ（Ik−２及びIk−３）を含むので、Ik−１、Ik−２及びIk−３蛋白質を選択した（図５）。我々は、これらの蛋白質が特異性において、これらの推定上のDNA結合モジュールの２つ又は１つのみを含むIk−４及びIk−５蛋白質と重複していることを予想した。
ランダムオリゴヌクレオチドのプールからの５回の結合部位選択の後に、Ik−１−、Ik−２−及びIk−３−選択したオリゴマーをクローン化して配列決定し、共通のモチーフについて並べた（表２、３及び４、表において肉太活字は保存配列を示す）。
Ik−１及びIk−３配列は、７塩基対コア
結合部位の選択を次のようにして行なった。ランダムオリゴマーのプールを5'及び3'の限定配列の25塩基対（BamH I及びEcoR I制限部位を含む）及び中央のランダム配列の15塩基を用いてデザインした。第一回の選択において、グルタチオンアガロースビーズ（20μｌビーズ容積）に結合したIkaros−GST融合体を、結合アッセイにおいて、500,000cpmの末端標識したランダムプライマーと共に用いた。氷上での結合反応の20分後に、これらのビーズを穏やかに遠沈し、10倍過剰の氷冷１×結合緩衝液で２〜３回洗った。結合したプライマーを0.1％SDS、10mMトリス（pH7.5）にて溶出して回収放射能を測定し、次いで、フェノール抽出して10μｇのグリコーゲンの存在下で沈殿させた。回収したDNAの1/5を反応物に含まれるα−P32dCTPを有する限定5'及び3'配列に相補的なプライマーを用いて再増幅して均質に標識された選択したオリゴマーのプールを生成した。すべてのプローブをゲル精製した。何回目かに、減少した量の選択したオリゴマーを結合反応において高親和性部位を増やすために用いた（2000,000/100,000cpm）。５回の選択を行なった。最終回の終わりに、溶出したDNAを増幅し、EcoR I及びBamH I制限酵素で消化し、PGEM3Z中にクローン化して通常プライマー及び逆向プライマーを用いて配列決定した。選択したプライマーの配列をすべてのDNAに存在する共通モチーフについて並べた。
融合蛋白質及びDNA結合の研究を次のようにして行なった。Ikarosイソ型のコード領域をプライマーを用いて各cDNAからのベントポリメラーゼでPCR増幅し、pGEX IIIのBamH I/EcoR I部位にクローン化した。適当な組換えPGEXベクターの培養物（一晩培養）を10倍に稀釈し、37℃で90分間成長させてから2mMIPTGで26℃にて３時間誘導した。粗細菌溶解液を前に記載したようにして生成した（Georgopoulos 1992）。Ikaros−GST融合体をグルタチオンアガロースビーズ上で部分精製し、20mM遊離グルタチオン及び0.5M NaClを含む緩衝液Ｄにて４℃で１時間溶出した。溶出した蛋白質をSDS−PAGEによりチェックし、それらの濃度をローリー法により評価し及び適当な稀釈をDNA結合研究のために用いた。DNA結合アッセイを行なった。結合反応は、50,000cpmの標識オリゴヌクレオチド（0.5〜1ng）、100ngの融合蛋白質、0.1μｇのdI/dCを含み、結合緩衝液に20μＭのZNCl2を補った。メチル化阻害アッセイのための結合反応を、10倍までスケールアップして前に説明したようにして実施した（Georgopoulos 1990）。
Ikarosイソ型Ik−１〜５の結合特異性
５つのIkaros蛋白質の選択した共通配列から導いた単一認識部位に対する結合特異性をゲル遅延アッセイにおいて試験した。３つの選択蛋白質の高親和性結合を提供するようにデザインした24bpオリゴヌクレオチド（IK−BS1 T−ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Cc）（配列番号101）を試験した。Ik−１イソ型は、この配列に最高の親和性で結合し、Ik−２及びIk−３がそれに次いだ。Ik−５及びIk−４のＮ末端の２つ又は１つのジンクフィンガーのみの存在は、この部位ではそれらの安定な相互作用に十分でなかった。第１の部位に非常に近い第２の低親和性部位を含むオリゴヌクレオチドを、次いで、試験した（IK−BS2）TCAGCTTTTGGGAATCTCCTGTCA（配列番号150）。これらのイソ型の４つはこの配列に結合し、単一のＮ末端フィンガーを有するIk−５だけが結合しなかった。我々は、次いで、短いIk−２コアモチーフのこれらの蛋白質（IK−BS3 TCAGCTTTTGGGATTCTCCTGTCA（配列番号151））に結合する能力を試験した。Ik−２は、７塩基対コアに対して同じく良く５塩基に結合したが、他方Ik−１はこの部位に少なくとも３倍低い親和性で結合した。Ik−３及びIk−４イソ型は、この配列に結合しなかった。好適でない塩基及びIk−1/Ik−３コアの3'及び5'フランキング位置を有するオリゴヌクレオチドは、高い親和性でIk−２蛋白質と、低い親和性でIk−１と結合し、Ik−３（IK−BS5、TCAGCGGGGGGGAATACCCTGTCA（配列番号152））とは結合しなかった。これは選択データと調和したが、Ik−２が３つの蛋白質の内で最も無差別であり、Ik−１がそれに次いでおり、Ik−３が最も結合特性が限定されていた。
Ik−５蛋白質は、これらのDNAの何れとも相互作用しなかった。しかしながら、それは、低い親和性であるが配列特異的な様式でCD3δエンハンサーのδＡ要素と結合した。Ik−４について同じ複合体が検出されたが、Ik−１、Ik−２及びIk−３は、定性的及び定量的な別の様式でこのDNAに結合した。Ik−４及びIk−５のδＡ要素への弱い結合は、恐らく２つのＣ末端フィンガーによって媒介され、他方、Ik−１、Ik−２及びIk−３の高親和性結合はＮ末端フィンガードメインによって媒介される（Ｎ末端フィンガードメインを用いる選択及び結合研究によっても実証された）。
これらの５つのIkarosイソ型における結合データは、前に記載された選択を更に実証し、Ikaros蛋白質が重複した配列に結合し得るが別個の認識配列にも結合得ることを示している。
Ikarosイソ型Ik−１〜４の同種の部位における化学的足跡
Ik−１〜４の蛋白質/DNA相互作用を、更に、化学的足跡によって確立した。高い親和性でこれらの４つのイソ型と結合するIK−BS2オリゴヌクレオチド（TCAGCTTTTGGGAATCTCCTGTCA）（配列番号102）をメチル化阻害アッセイにおいて用いた。陽性鎖において、すべての４つの蛋白質は類似の接触をした。共通配列の２、３及び４位の３つのグアニンは、すべての４つの蛋白質の結合を100％阻害した。Ik−２は、−５位のグアニン及び５位のアデニンと更なる主要なグローブ接触をした。陰性鎖において、４つの部分が劇的に足跡を与えた。Ik−２は、−３位のグアニンとのみ接触したが、他方Ik−１は−１位で更なる部分的接触をした。Ik−３蛋白質は、１及び−２位のアデニン並びに−１及び−３位のグアニンと接触した。Ik−４蛋白質の足跡は最も広く、−１、−３及び−４位の３つのグアニン並びに−５位のアデニンを含んでいた。
３つの蛋白質の内で、最も厳密な結合特性を有するIk−３が最もDNAと接触をした。最後に、Ik−４によってなされた広いが定性的な別の足跡が、更に、この蛋白質による非常に近い認識部位の共同的占有を支持した。これらのメチル化阻害データは、４つのIkaros蛋白質が定性的な別個のDNA接触をすることを示し、それらの分化におけるDNAへの結合能力を予告している。
IK蛋白質による転写の活性化
我々は、前に、Ik−２が多数化したδＡ要素からの転写を中レベルに活性化することが出来ることを示した。ここで、我々は、４つのIkarosイソ型の好適結合部位の反復コピーからの転写を活性化する能力を、NTH−3T3繊維芽細胞における一時的発現アッセイにおいて研究する。Ik−１〜４と高い親和性で結合するIK−BS3オリゴヌクレオチドを、これらの蛋白質の発現においてtkCATレポーター遺伝子の転写を刺激するその能力について試験した。この繊維芽細胞系統において検出されたこのレポーター遺伝子の活性は、Ik−1cDNAを有する発現ベクターでコトランスフェクトしたとき、22倍に刺激された。このレポーター遺伝子の活性は、Ik−２発現ベクターにより11倍に刺激された。しかしながら、Ik−３及びIk−4cDNAの発現は、転写を２〜３倍に刺激しただけであった。これは、これらの蛋白質が、Ik−１及びIk−２を与える結合部位からの転写を弱めるように機能し得ることを示唆している（IkaroscDNAの一時的蛋白質発現は同等であった）。
Ik−１及びIk−２エンハンサー蛋白質は、これらの因子の何れとも結合しない変異した結合部位からの転写を活性化することが出来ず、それらの活性化能力が配列特異的であることを示した。
Ikaros高親和性結合部位についての配列組成はIL2−レセプターα及びβインターフェロンプロモーターに存在するNFKbモチーフに等しいので、我々は、成熟Ｔ細胞系統において、分裂刺激の存在下及び不在下におけるその転写活性を試験した。我々は、次の理由により、ヒトのジャーカットＴ細胞系統を選択した。第１に、選択したIkaros結合部位に非常に良く適合するNFkB認識配列の活性がこの細胞系統で広く研究されてきたこと及び第２に、我々は、ヒトのIkaros遺伝子がアミノ酸組成及びスプライシング変異体の両方においてマウスの遺伝子に高度に保存されているということを知っているからである。前の報告と対照的に、我々は、この多数化した部位からの高レベルの転写活性を検出したが、それは分裂処理によって更に刺激されなかった。この活性は、Ikarosアンチセンス発現ベクターをこのレポーター遺伝子と共にコトランスフェクトしたときに、５倍だけ減少した。かかる効果は、RSV又はSL3LTRに駆動されるレポーター遺伝子を並行実験に用いたときには検出されず、IkarosアンチセンスRNAによる転写阻害がこの部位に特異的であることを示唆している。
Ikaros1〜４イソ型によるNIH3T3繊維芽細胞中の反復NFkB変異からの転写の活性化を次のようにして測定した。Ikaros蛋白質の存在下におけるCAT活性の刺激を、組換えCDM8とコトランスフェクトした場合の活性のCDM8ベクター単独の場合の活性に対する比として評価した。このデータは、トランスフェクトしたプラスミッドの各組合せ（実験ごとに２回繰り返した）で行なった3/4実験の平均値を表している。すべてのトランスフェクションを、材料と方法に記載したようにして、GHレベルに標準化した。
ヒトＴ細胞中の反復NFkB様要素の活性及び抑制を次のようにして測定した。Ik−BS2（FNKB様変異体）又はRSV及びSL3LTRの制御下のレポーター遺伝子を、CDM8発現Ikarosアンチセンスプラスミッドの存在下でジャーカット細胞中にトランスフェクトした。エンハンサーを有しないプラスミッドに対して倍の誘導及びアンチセンスRNAの存在下での抑制が測定された。
哺乳動物発現ベクター及びトランスフェクションの実験を次のようにして行なった。５つのIkarosイソ型を、CDM8発現ベクターのHind III〜Not I部位にサブクローン化した。IKBS1、IKBS2、IKBS7及び８の４つのセンスコピーの制御下のtkCATレポーター遺伝子を、前記のように、適当な発現ベクター及びSV40若しくはRSVGHプラスミッドと共に、NIH3T3繊維芽細胞及び成熟Ｔ細胞系統ジャーカット中にコトランスフェクトした。細胞を、36〜48時間後に採集してCAT活性及び成長ホルモンレベルを分析した。結果は、発現プラスミッドのレポーターの各組合せを２回行なった3/4の独立した実験の平均値として測定したものである。
リンパ系細胞限定調節ドメイン中のIkaros蛋白質用の標的部位
Ikaros蛋白質用の潜在的高親和性結合部位を、TCR−α、−β及び−δ、CD3−δ、−ε及び−γ遺伝子、SL3及びHIVLTRのエンハンサー及びプロモーター領域内並びに他のＴ細胞限定抗原の調節ドメイン中に見出した（表５）。これらの部位の幾つかは、すべての４つの蛋白質に結合し得るが、他方、他の部位はIk−２及びIk−１とのみ相互作用する。３つのIkarosイソ型用に選択した認識配列は、IL2−Ｒαのプロモーター、βインターフェロンのPRD II要素及びＨ−2K遺伝子に存在するNFkBモチーフと非常に良く適合する。このNFkB部位は、４つのIkaros蛋白質と高い親和性で結合する。
Ikarosモチーフに関連する配列は又、上述の調節ドメイン並びにIL2遺伝子のプリンボックス、TDTプロモーターのLYF部位並びにHIVLTRのNFkB変異部位に見出された（表５）。Ikaros蛋白質のこれらの部位に対する親和性を研究するために、我々は、選択した認識配列と競争するそれらの能力を研究した。この７塩基対モチーフの内部及び外部に塩基対置換を導入して、リンパ系細胞及びＴ細胞に特異的な調製ドメインに存在するこれらの部位の幾つかの配列組成に合わせた。適当な塩基交換を有するオリゴヌクレオチドを、共通モチーフ（IK−BS1）に対する競争実験において用いた。
IL2−ＲαNFkBモチーフに等しいIk−BS2オリゴヌクレオチドは、共通モチーフの単一コピーより２倍高い親和性で４つの蛋白質に結合した。我々は、これは、対向鎖中の第２の低親和性結合部位のためであると考えている。
調節ドメインの非常に近くに低親和性結合部位が存在することは、これらの部位に対するIkaros蛋白質の相対的親和性を減少させる。これは、δＡの場合に明らかであり、他の要素でも同様であろう。高親和性結合部位の占有は又、隣接領域の低親和性部位によっても影響されるであろう。これらの蛋白質のこれらの部位に対する見かけの結合定数は、更に高い値にさえ高めることが出来るし、発生中のリンパ球において、Ikarosエンハンサーによって活性化された標的遺伝子の順序を指図することが出来るであろう。
ヒトIkaros遺伝子のクローン化
マウスIkaros遺伝子のcDNAが決定されているので、ヒトIkaros遺伝子を、当業者に公知の幾つかの技術の内の１つを用いてクローン化することが出来る。かかるクローン化技術は、（Moleculer Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook等、1989第２版、Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,参考として本明細書中に援用する）に詳細に記載されている。例えば、マウスのIkarosのコード領域の1020アミノ酸残基の範囲に対応するオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド合成装置で合成することが出来る。これらのオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてヒトcDNAライブラリー例えばジャーカットＴ細胞又はヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることが出来る。陽性クローンを配列決定し、その配列をマウスのIkarosの公知の配列と比較する。これらのDNAによりコードされる機能的Ikaros活性をここに記載するようにして試験することが出来る。IkarosヒトcDNAの部分配列を図３に示してある（配列番号３）。
Ikarosゲノム遺伝子座
変異cDNAの配列分析に基づいて、ゲノムの遺伝子座は約９〜11エクソンを含むと考えられる。ゲノム中に存在する殆ど又はすべてのIkarosエクソンを含むゲノムDNAを、種々のIkarosDNAをプローブとして用いて、λDASH IIファージベクター中に作成したマウスゲノムSV129ライブラリーをスクリーニングすることにより単離した。Ikaros遺伝子は、別個のしかし又重複もしているゲノムクローンとして単離した少なくとも80〜90kbのゲノム配列を含む。Ikarosゲノムクローンの幾つかを図７に示す。これらのエクソンはボックスとして描かれているが、他方、イントロンは線で示してある。エクソンE5の5'境界（配列番号143）及び3'境界（配列番号144）、エクソンE3の5'境界（配列番号145）及びエクソンE7の5'境界（配列番号146）及び3'境界（配列番号147）のDNA配列を決定した。
イン・ビトロ及びイン・ビボ並びにノックアウトマウスにおける相同組換え実験
リンパ球様細胞限定された転写因子Ikarosの役割をイン・ビボで定めるために、我々は、胚幹細胞（E.S.）中でマウスIkarosゲノム遺伝子座に狙いを定めて突然変異を起こした。Ikarosゲノム遺伝子座に別個の欠失を運ぶ２つのターゲティングベクターを、SV129マウスから導いたJ1E.S.系統（En li,Cell 1992）中にトランスフェクトした。E.S.細胞中の相同組換え事象を二重選択カウンター選択計画によって記録し、G418及びFIAUを培地中で用いてネオマイシン遺伝子活性及びチミジンキナーゼ遺伝し活性の不在について選択した。このネオ遺伝子は、この構築物の中央に位置しているが、他方、tk遺伝子は、ターゲティングベクターの5'若しくは3'に存在し、非相同組換え事象に対抗する選択を可能にする。突然変異を１つ若しくは２つ運ぶE.S.細胞系統をサザーン分析により確立してBalbe又はC57黒マウスの胚盤胞に注入した。キメラ胚盤胞を偽妊娠マウスに再移植し、キメラ動物を生成した。毛皮の色（アグーチ対白地若しくは黒地）で見てSV129系統が70％より多いマウスを更に繁殖させた。生殖細胞系列の伝達を、毛皮の色（アグーチ）及び尾のDNAのサザーン分析によって測定した。我々は、これらの変異についてホモ接合の動物を得るためにこれらのマウスを繁殖させる過程にいる。
これらの標的突然変異は両者とも欠失である。第１の突然変異は、すべてのIkarosイソ型に共有される最後のエクソンE7を欠失している。これは、DNAに結合することは出来るが転写を活性化することの出来ない蛋白質を生成するはずである。これらの蛋白質は、DNA結合について野生型Ikaros蛋白質と競争することは出来るが転写を活性化することは出来ないので、転写の主要な負の調節物質として機能することが出来る。この突然変異についてヘテロ接合のマウスは、調節についてIkaros蛋白質に依存している遺伝子の発現レベルの減少を示すであろう。これらのマウスは、Ikaros蛋白質の発現をすべて欠いたマウスより少ない分離（sever）表現型を示し得る。もし機能を全部失ったマウスの表現型が過酷であるならば、これらの動物の分析が必要であることが証明され得る。
第２の突然変異（エクソンE3及びE4の欠失）は、Ikaros遺伝子の全機能喪失を生じるはずである。この突然変異についてホモ接合のマウスは、Ikaros遺伝子の重大な損傷を有するかも知れない。この突然変異についてホモ接合のマウスは、Ikaros遺伝子により調節される遺伝子の発現の変化の結果として免疫系の重大な損傷を有するかも知れない。Ikaros調節についての可能な候補は、TDT（組換え経路）CD3複合体、TCR複合体IL2遺伝子HIVLTR等である。これらのマウスから導いたリンパ球様細胞系統を用いて、成熟Ｔ及びＢ細胞へ導く調節経路を叙述することが出来るが、これらのマウス自体を用いて増結経路の種々の系統の間の複合体相互作用を研究し、免疫不全症候群を研究し且つ矯正するためのイン・ビボ実験をデザインすることが出来る。最後に、これらの動物から導いたES細胞系統を、造血／リンパ球生成系列へのイン・ビボ分化によって研究することが出来る。
利用
この発明のペプチドを、伝統的方法（例えば、経口、非経口、経皮又は経粘膜）の１つにより、生物分解性生体適合性ポリマーを用いる持続的放出配合物にて又はミセル、ゲル及びリポソームを用いる現場送達又はトランスジェニック法によって、ほ乳動物特にヒトに投与することが出来る。
他の具体例
Ikaros遺伝子の全部又は一部をコードする核酸を用いて細胞をトランスホームすることが出来る。例えば、Ikaros遺伝子例えば誤った発現若しくは突然変異型のIkaros遺伝子（例えば、欠失）、又はIkaros蛋白質をコードするDNAを用いて細胞をトランスホームして細胞ゲノムのIkaros遺伝子をトランスホームした遺伝子で置き換えた細胞を生成し、例えばIkaros遺伝子について欠失した細胞を生成することが出来る。上述のように、このアプローチを培養（例えば、培養幹細胞）で生長することの出来る細胞について用いてIkaros遺伝子の機能を研究することが出来る。
同様に、Ikaros遺伝子（例えば、誤った発現又は突然変異型の遺伝子、例えば欠失）の全部又は一部をコードする核酸を用いて細胞をトランスホームし、次いで、その細胞でトランスジェニック動物を生成することが出来る。このアプローチを用いて例えばIkaros遺伝子が例えば欠失によって不活性化されたトランスジェニック動物を作成することが出来る。ホモ接合のトランスジェニック動物を創出（founder）トランスジェニック動物の子孫間の交配によって作ることが出来る。トランスジェニック動物から細胞又は組織培養を導くことが出来る。Ｔ細胞の発生又は機能の異常により特徴付けられる異常例えば白血病の危険にさらされている患者を、患者のIkaros遺伝子の構造を野生型のIkaros遺伝子の構造と比較することによって検出することが出来る。例えば、フレームシフト、重大な点突然変異、欠失、挿入又は転座による野生型構造からの逸脱は危険を示している。幾つかのエクソンのコード領域並びに幾つかのイントロンエクソン境界のDNA配列をここに含む。他の領域は、当業者に公知の方法によって得ることが出来又は配列決定することが出来る。
この発明は、実質的にIkaros蛋白質に相同な任意の蛋白質（例えば、配列番号２、３又は５に示したIkaros蛋白質又は他のイソ型）を含む。対立遺伝子変異、自然突然変異、誘導突然変異（例えば、イン・ビトロ欠失）、高若しくは低（例えば、少なくとも40ヌクレオチドのプローブ長にて、40Cにおける２×SSCでの洗浄）緊縮条件下で天然の核酸にハイブリダイズするDNAによってコードされる蛋白質（高若しくは低緊縮の他の定義については、Molecular Biology,John Wiley ＆ Sons,ニューヨーク、1989、6.3.1−6.3.6中のCurrent Protocols（本明細書中に参考として援用）を参照されたい）、及びIkaros蛋白質に対する抗血清特にIkaros蛋白質の活性部位若しくは結合ドメインに対する抗血清により特異的に結合されるポリペプチド若しくは蛋白質も又含まれる。この用語は又、Ikaros蛋白質を含むキメラポリペプチドをも含む。
この発明のDNA及びペプチドの配列は、例えば、マウス、霊長類例えばヒト、又は非天然の配列であって良い。
この発明は又、任意の生物学的に活性なIkaros蛋白質の断片又はアナログをも含む。「生物学的に活性な」とは、Ikarosイソ型例えば（配列番号２）若しくは図３（配列番号３）若しくは（配列番号５）に特徴的な任意のイン・ビボ若しくはイン・ビトロ活性（例えば、上記のIkaros活性）を有することを意味する。Ikaros蛋白質は一連の生理学的特性を示し、かかる特性はIkaros蛋白質分子の異なる部分に起因し得るので、有用なIkaros蛋白質断片又はIkaros蛋白質アナログは、Ikaros蛋白質アッセイの多様性例えば上述のδａ断片若しくはNKFB断片に結合し又はそれらからの転写を刺激する能力の内の１つ（若しくはそれ以上）について生物学的活性を示すものである。Ikaros蛋白質断片又はアナログは、イン・ビボ若しくはイン・ビトロアッセイにおいて、最も好ましくは天然のIkarosイソ型（例えば、配列番号２、３若しくは５で示したIkaros蛋白質）の活性の90％、好ましくは40％、又は少なくとも10％を有する。
好適アナログは、配列が野生型の配列と１若しくは数個の保存アミノ酸の置換により又は１若しくは数個の非保存アミノ酸の置換、欠失又は挿入により異なるが生物学的活性を失っていないIkarosペプチド又はエクソン（又は生物学的に活性なその断片）を含む。保存的置換は典型的に１つのアミノ酸の類似の性質の他のアミノ酸との置換、例えば、次の群の中での置換を含む。バリン、グリシン。グリシン、アラニン。バリン、イソロイシン、ロイシン。アスパラギン酸、グルタミン酸。アスパラギン、グルタミン。セリン、スレオニン。リジン、アルギニン。及びフェニルアラニン、チロシン。他の保存的置換は、下記の表から得ることが出来る。
アナログは、天然のIkaros蛋白質とアミノ酸配列において異なっているか又は配列に影響を与えない方法で改変してよく、或はその両方であってよい。この発明のアナログは、一般に、天然のIkaros配列の20アミノ酸残基部分、好ましくは40アミノ酸残基部分又は更に好ましくは全配列と、少なくとも70％、更に好ましくは80％、更に好ましくは90％、最も好ましくは95％若しくは99％の相同性を示す。
一次配列の変化は、自然の及び誘導による遺伝的変異を含む。天然のＬ−アミノ酸以外の残基例えばＤ−アミノ酸又は非天然の即ち合成アミノ酸例えばβ若しくはγアミノ酸を含むアナログも又含まれる。或は、増大した安定性は、ペプチド分子を環化することによって与えられ得る。
配列順を変えない修飾は、イン・ビボ又はイン・ビトロでの、ポリペプチドの化学的誘導体化を含む（例えば、アセチル化、メチル化、ホスホリル化、カルボキシル化又はグリコシル化）。グリコシル化は、例えば合成中又はプロセッシング中のポリペプチドのグルコシル化のパターンを改変することにより改変し得るが、更に、プロセス工程（例えば、ポリペプチドを、かかるプロセスを普通に与える細胞から導いたグリコシル化作用を有する酵素例えばほ乳動物のグリコシル化酵素をさらすこと）によって改変することが出来る。ホスホリル化は、ポリペプチドをホスホリル化改変酵素例えばキナーゼ又はホスファターゼにさらすことによって改変することが出来る。
実質的に完全長のポリペプチドに加えて、この発明は又、これらのポリペプチドの生物学的に活性な断片をも含む。ここで用いる場合、ポリペプチドについて用いる用語「断片」は、上述のIkarosの長さのことであり、普通は、少なくとも約20残基、更に典型的には、少なくとも約40残基、好ましくは少なくとも約60残基の長さである。
Ikarosペプチド又はイントロンの断片は、当業者に公知の方法例えば、所望の断片をコードするようにイン・ビトロで操作（例えば、IkarosDNAの制限消化）したIkarosDNA（例えば、配列番号１若しくは２の配列）を発現させることによって作成することが出来る。アナログを、当業者に公知の方法例えばIkarosDNA配列（例えば、配列番号１若しくは２の配列）のイン・ビトロDNA配列改変によって作ることが出来る。例えば、イン・ビトロ突然変異誘発を用いて配列番号１のDNA配列を、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換（例えば、保存的アミノ酸置換の表に記載したような保存的置換）を受けたアナログをコードする配列に変換することが出来る。断片又はアナログは、当業者に公知の方法によって、Ikaros活性の存在について試験することが出来る。
ポリペプチドの生物学的活性に必要でない残基、或は別のmRNAスプライシング又は別の蛋白質プロセッシング事象から生じる残基等、このペプチドの生物学的活性に必要でない残基を含むIkaros蛋白質ポリペプチドも又含まれる。
この発明は又、この発明のポリペプチドをコードする核酸をも含む。
Ikaros蛋白質を得るために、IkarosをコードするDNAを発現ベクター中に挿入し、そのベクターを所望の蛋白質の発現に適した細胞中に導入し及び所望の蛋白質を従来技術の方法によって回収して精製することが出来る。Ikaros蛋白質に対する抗体を、動物例えばウサギ又はマウスを免疫して従来技術の方法によって抗Ikaros抗体を回収することによって作成することが出来る。
特異的なスプライシング生成物（即ち、特異的イソ型）を得るために、所望のスプライシング生成物をコードするエクソンのみを含む合成構造遺伝子を作成してその遺伝子を上記のように発現させることが出来る。
他の具体例は、後記の請求の範囲にある。
配 列 表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：ザ ゼネラル ホスピタル コーポレーション
（Ｂ）通り：フルーツ ストリート55
（Ｃ）都市：ボストン
（Ｄ）州 ：マサチューセッツ
（Ｅ）国 ：米国
（Ｆ）郵便番号:02114
（Ｇ）電話：（617）726−8608
（Ｈ）テレファックス：（617）726−1668
（ii）発明の名称:IKAROS:細胞経路調節遺伝子
（iii）配列数:152
（iv）コンピューター読み取り可能形式：
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換機
（Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:ASCII
（ｖ）現出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（vi）先願のデータ：
（Ａ）出願番号:US 946,233
（Ｂ）出願日 :1992年９月14日
（ix）電信用情報：
（Ａ）電話：（617）227−7400
（Ｂ）テレファックス：（617）227−5941
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:38塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号１）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:1788塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:CDS
（Ｂ）存在位置:223..1515
（xi）配列（配列番号２）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:1611塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:CDS
（Ｂ）存在位置:1..1611
（xi）配列（配列番号３）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:38塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号４）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:568アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列（配列番号５）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号６）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号７）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:12塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号８）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号９）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号10）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号11）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号12）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号13）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号14）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号15）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号16）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:28塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号17）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号18）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号19）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号20）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:27塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号21）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号22）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号23）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号24）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号25）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号26）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号27）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号28）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号29）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号30）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号31）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号32）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号33）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号34）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号35）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号36）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号37）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号38）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号39）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号40）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号41）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号42）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号43）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号44）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号45）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号46）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号47）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号48）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号49）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:26塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号50）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号51）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号52）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号53）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号54）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号55）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号56）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号57）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号58）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号59）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号60）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号61）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号62）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号63）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号64）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号65）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号66）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号67）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号68）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号69）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号70）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号71）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号72）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号73）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:12塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号74）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号75）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号76）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号77）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号78）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号79）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号80）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号81）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号82）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号83）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号84）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号85）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号86）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号87）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号88）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号89）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号90）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号91）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号92）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号93）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号94）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号95）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号96）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:25塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号97）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号98）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号99）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号100）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号101）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号102）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:22塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号103）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:14塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号104）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:19塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号105）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:12塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号106）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号107）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:14塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号108）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:11塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号109）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号110）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号111）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:14塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号112）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号113）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:11塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号114）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:12塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号115）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:9塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号116）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:8塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号117）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号118）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:16塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号119）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:8塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号120）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:22塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号121）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号122）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:26塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号123）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:26塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号124）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:13塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号125）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:9塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号126）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:9塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号127）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:21塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号128）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:9塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号129）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号130）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号131）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:16塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号132）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:9塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号133）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:11塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号134）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:8塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号135）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:21塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号136）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号137）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号138）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号139）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:6塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号140）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号141）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:36塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号142）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:103塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号143）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:116塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号144）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:94塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号145）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:120塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号146）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:120塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号147）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号148）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:7塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号149）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号150）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:22塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号151）：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列（配列番号152）：
Claims (12)
- 配列番号:2若しくは配列番号:3のDNAの断片を含み、又は配列番号:5のペプチドの断片をコードする精製したDNAであって、該DNAが、CD3δ遺伝子のδエンハンサーに結合し又は該エンハンサーを活性化することのできるポリペプチドをコードする、当該精製したDNA。
- 配列番号:2若しくは配列番号:3のDNAの断片によりコードされ又は配列番号:5のペプチドの断片を含む精製したポリペプチドであって、該ポリペプチドが、CD3δ遺伝子のδエンハンサーに結合し又は該エンハンサーを活性化することのできる、当該精製したポリペプチド。
- 請求項１に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項３に記載のベクターを含む細胞。
- 請求項４に記載の細胞を培地中で培養してIkarosポリペプチドを発現させることを含む当該Ikarosポリペプチドの製造方法。
- 請求項２に記載のIkarosポリペプチドに対する抗体の実質的に純粋な調製物。
- Ikaros遺伝子を含むトランス遺伝子を有するトランスジェニックゲッ歯動物であって、該トランス遺伝子が、配列番号:2若しくは配列番号:3のDNAの全部又は断片を含み、又は配列番号:5のペプチドの全部又は断片をコードする、当該トランスジェニックゲッ歯動物。
- 第１のIkarosイソ型及びDNAの結合をイン・ビトロで阻止する方法であって、当該DNAを有効量の請求項２に記載のポリペプチドと、又は請求項２に記載のポリペプチドのDNA結合性断片と接触させることを含む上記の方法。
- 配列番号:2又は配列番号:3のDNAのコード配列を含む精製したDNA。
- 配列番号:5のポリペプチド配列をコードする配列を含む、精製したDNA。
- 配列番号:2又は配列番号:3のDNAによりコードされる配列を含む、精製したポリペプチド。
- 配列番号:5のポリペプチド配列を含む、精製したポリペプチド。
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