CN1227035C - 缀合物及其制备方法和用于跨生物膜转运分子的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及缀合物、它们的制备方法和这些缀合物用于经由生物膜转运低分子量化合物与大分子的用途，特别是转运分子进入细胞。本发明还涉及药物、诊断剂和试验试剂盒，其中含有或引入这些缀合物。

Description

缀合物及其制备方法和用于跨生物膜转运分子的用途

本发明提供缀合物、它们的制备方法和这些缀合物用于跨生物膜转运低分子量化合物与大分子的用途，特别是转运分子进入细胞。本发明还提供药物与诊断助剂和试验试剂盒，其中含有或使用这些缀合物。

靶在细胞内的分子的治疗应用的限制性因素经常是它们的细胞摄取是不理想的，细胞内分布是不适宜的。典型的实例是诸如核酸等大分子，它们以序列特异性方式与细胞DNA或RNA结合，因而抑制基因表达。反义寡核苷酸是短的单链核酸，它们经由Watson-Crick碱基对与互补mRNA结合，抑制后者转译为相应的蛋白质。形成三股螺旋的寡核苷酸经由所谓的“Hoogsteen碱基配对”与DNA双螺旋深沟结合，形成三螺旋，因而以序列特异性方式抑制基因转录。其他细胞内作用性寡核苷酸例如所谓的“圈套(decoy)”寡核苷酸，它们模拟转录因子的结合区域。通过圈套寡核苷酸的处理，能够以序列特异性方式拦截某些转录因子，因而抑制转录的活化作用。另一组细胞内作用性寡核苷酸是chimeraplast，用于定向基因校正(Cole-Strauss等《科学》273(1996)1386-1389)。关于这种基因校正，chimeraplast寡核苷酸摄取进入细胞也是必需的。其他细胞内作用性核酸的实例是与细胞酶、特别是端粒酶发生相互作用的那些(Norton等《天然生物技术》(1996)14，615)。在基因疗法的意义上，另一类核酸、优选为双链DNA，能够编码某些细胞内表达的蛋白质。

例如，寡核苷酸体外摄取进入细胞是相对低效的过程，例如简单地向细胞培养基中加入寡核苷酸，这是因为实际上仅有一小部分所加入的寡核苷酸被摄入细胞。摄取过程花费很多小时，在多数情况下，仅在8至16小时后达到平台期。推定寡核苷酸是在胞饮作用样过程中被摄入的。不过，经由胞饮作用摄取所面临的一个普遍问题是大比例的寡核苷酸不是游离于细胞质中，而是被包封在某些细胞结构中，即溶酶体和内体。在荧光标记的寡核苷酸的情况下，通过荧光显微法的确能够观察到这种定位分布。由于这种囊性定位作用，实际上可用于与mRNA杂交的游离寡核苷酸浓度大为减少。而且，根据细胞类型和现有条件，首先仅有某一部分的细胞摄入寡核苷酸。因此，关于反义寡核苷酸的有效利用，普遍采用与透入增强剂，例如阳离子脂质的混合物(Bennett等《分子药理学》41(1992)1023)。

本发明的目的是提高分子、特别是大分子的细胞摄取，例如寡核苷酸。

寡核苷酸细胞摄取的检查普遍是利用放射性标记或荧光标记的寡核苷酸进行的。寡核苷酸的荧光标记例如是通过寡核苷酸的氨基官能与异硫氰酸荧光素(FITC)的反应进行的。荧光素例如可以经由商业上可得到的荧光素类固相载体而引入到寡核苷酸的3’末端，或者经由商业上可得到的荧光素亚磷酸化试剂而引入到5’末端。在所有情况下，由于羧酸官能，与寡核苷酸结合的荧光素都是带负电的强荧光性结构单元。

                FDA原子团(F3)                                          荧光素原子团(F0)

与荧光素相反，荧光素二乙酸酯(fluorescein diacetate，FDA)是一种中性活体染剂，它仅在两个酯基的除去和内酯环的打开之后才转化为荧光性荧光素，但是内酯形式不是荧光性的。

已知FDA(以下也称“F3”)作为一种中性、非荧光性分子，经由被动扩散而被活体细胞摄入，被酯酶细胞内裂解得到荧光性荧光素(Breeuwer等《应用环境微生物学》(1995)61，1614；Maeda等《细胞结构与功能》(1982)7，177)。迄今，所述唯一FDA衍生物是含有胺反应性基团的那些，例如异硫氰酸酯；这些FDA衍生物用于染色细胞内蛋白质或细胞组分。FDA与其他分子的缀合物迄今尚未被描述过；相应地，FDA-标记的寡核苷酸(FDA与寡核苷酸的缀合物)同样迄今尚未被描述过。

在细胞质中，FDA被酯酶裂解；相应地，有可能通过寡核苷酸的FDA标记测定“游离”寡核苷酸的比例，也就是有多少寡核苷酸存在于细胞质中——可用于杂交——关于存在于囊泡中的寡核苷酸(“被捕获的”寡核苷酸)——相应地不可用于杂交的寡核苷酸。由于寡核苷酸中的负电荷总数高和FDA-标记与荧光素-标记的寡核苷酸的区别仅在于一个净电荷这一事实，预期FDA-标记与荧光素-标记的寡核苷酸将表现非常相似的细胞摄取和分布。

不过，已经惊人地发现FDA-标记与荧光素-标记的寡核苷酸关于摄取进入细胞是大不相同的，也就是关于寡核苷酸摄取的持续时间和效率，另外关于已被摄入的寡核苷酸的细胞定位作用。FDA-标记的寡核苷酸比相应的荧光素-标记的寡核苷酸更加迅速地被细胞摄入。放射性标记与荧光素标记的寡核苷酸的摄取要求若干小时，而FDA-标记的寡核苷酸在简单的例如与人细胞培养之后能够仅在五分钟之后在细胞内检测到。也惊人的是，FDA-标记的寡核苷酸事实上被摄入任何细胞(＞90％细胞)，而迄今关于转移寡核苷酸或多核苷酸进入细胞所述方法中的摄取率普遍偏低；在后者情况下，经常仅有约30至60％的细胞荷载寡核苷酸。FDA-标记的寡核苷酸的细胞内分布更加均匀，这也是有利的。这种更均匀的分布表明寡核苷酸不是——如上所述——主要被包封在囊泡(例如内体、溶酶体)内，而是分布在整个细胞中——也就是在细胞溶质和细胞核中；这是存在大部分“游离”寡核苷酸的象征。仅有这些“游离”寡核苷酸可用于与靶(靶分子、靶核酸)结合或者用作活性化合物。另一个优点是当使用FDA-标记的寡核苷酸时，观察到没有细胞损害；相反，脂阳离子透入增强剂的使用经常导致细胞膜的损害。作为这些意外性质的结果，FDA-标记的寡核苷酸与迄今关于向细胞内引入寡核苷酸或多核苷酸所述方法相比，具有决定性的优点，它们能够被更有效地引入细胞，在那里它们的可利用性也更好。有鉴于此，FDA-标记的寡核苷酸的生物活性大为提高。因为提高了生物活性，所用的寡核苷酸更少。有鉴于此和FDA-标记的寡核苷酸被更有效地摄入细胞——关于量和时间——这一事实，减少了(毒)副作用。

已经惊人地发现这些有利性质并不限于FDA-标记的寡核苷酸，事实上借助FDA-标记——也就是偶联所要转运的分子与FDA或缀合之(“FDA缀合物”)，任何分子都能够被有效引入细胞或者跨生物膜转运。此外，已经发现这种理论并不限于FDA缀合物，也适用于某一化学结构的所有芳基酯缀合物。因而，本发明是新颖的关于跨生物膜转运分子的理论。由于这些化合物(除一例外)迄今尚未在现有技术中描述过，相应的缀合物——所要转运的分子与某一化学结构的芳基酯偶联或缀合——同样构成本发明主题的一部分。这些缀合物不能用已知方法制备；本发明因此还提供制备这些缀合物的方法。

作为寡核苷酸前体药物而被提出的生物可逆性O-酰基芳基缀合物是已知的(Iyer等《生物有机与医药化学快报》7(1997)871-876)。这些化合物的化学结构——在芳基原子团是芳族6-元环的情况下——类似于根据本发明的缀合物。不过，在生物可逆性O-酰基芳基缀合物中，酯的水解导致芳基原子团与寡核苷酸的磷酸三酯之间的键的去稳定作用，以致生物可逆性O-酰基芳基缀合物裂解为它的组分，即游离寡核苷酸和O-酰基芳基原子团。这种前体药物概念适合屏蔽核苷酸间磷酸酯桥的负电荷，因而促进寡核苷酸摄取进入细胞。不过，与根据本发明的缀合物相反，关于这些前体药物已经发现寡核苷酸摄取进入细胞没有加速，寡核苷酸的细胞内分布没有改变。此外，寡核苷酸摄取进入其他生物体尚未见诸报道。相反，在根据本发明的缀合物中，芳基原子团与寡核苷酸之间的共价键在摄取进入细胞期间得以保留；如果芳族单元只在酯的裂解之后是荧光性的，例如在FDA的情况下，那么芳基原子团与寡核苷酸之间的共价键的保留可以通过荧光显微法轻易测定。

本发明提供一种缀合物，它包含至少一个所要转运的分子和至少一个式I芳基原子团，

其中

芳基是这样的基团，它含有至少一个具有芳族特征的环；

X是O或N；优选地X＝O；

Y是O、S或NH-R²；优选地Y＝O；

R¹是取代或未取代的C₁-C₂₃烷基原子团，它可以是直链或支链的，并且可以含有双键和/或叁键；例如芳基烷基原子团；

R²是取代或未取代的C₁-C₁₈烷基原子团，它可以是直链或支链的，并且可以含有双键和/或叁键；

n是大于或等于1的整数，

其中该芳基原子团与该所要转运的分子是直接经由化学键或间接经由化学基团连接的，其中如果通过该所要转运的分子的核苷酸间磷酸二酯键连接，那么该化学基团不是CH₂-S基团。

所要转运的分子可以是任何分子。所要转运的分子优选地具有≥350道尔顿的分子量。本发明的一种实施方式涉及这样的缀合物，其中所要转运的分子是一种大分子，例如分子量≥500道尔顿，优选地＞1000道尔顿，特别优选地＞2000道尔顿或以上。

所要转运的分子也可以是低分子量化合物，例如分子量＜500道尔顿，优选地具有350至500道尔顿的分子量。低分子量化合物可以是一种单核苷酸。

所要转运的分子可以属于不同的化学物质种类；例如，它可以是一种生物聚合物，例如多核苷酸、优选为寡核苷酸，多肽、优选为肽或蛋白质，包含三个芳环咪唑、吡咯和羟基吡咯的聚酰胺或肽-核酸(PNA)(Kielkopf等《科学》282，111-115(1998))，或多糖、优选为寡糖，或者所述化合物的衍生物。所要转运的分子可以是一种肽模拟物。

多核苷酸、寡核苷酸和单核苷酸是天然存在的核酸或其已知的衍生物。衍生物被认为尤其表示从缀合物或所要转运的分子衍生的盐，特别是其生理学上可接受的盐，还例如是经过修饰或稳定化的核酸。

所要转运的分子可以是如下物质的抑制剂：转录因子，例如NF-κB、c-fos或c-jun，细胞周期蛋白质，例如细胞周期蛋白D，激酶，例如c-Src-、酪氨酸或MAP激酶，细胞内离子通道，亲免素，例如FK506结合蛋白，脯氨酰-4-羟基化酶，拓扑异构酶，病毒蛋白酶，多药耐受蛋白，磷酸酶，例如蛋白质酪氨酸磷酸酶。

所要转运的分子可以与一个或多个芳基原子团缀合，例如二、三、四、五、六、七、八、九、十、十五、二十个或以上的芳基原子团。

芳基原子团(“芳基原子团”特别是式I芳基原子团和/或式II芳基原子团)可以与所要转运的分子连接一次或一次以上，其中的键可以定位于芳基原子团的不同位置。如果大量芳基原子团与所要转运的分子连接，那么它们可以是相同或不同的。

芳基原子团含有芳基(在式I和II中称为“芳基”)；芳基可以包含一个或多个环，其中至少一个环具有芳族特征。芳基还可以含有杂环，杂环可以具有或没有芳族特征。芳基例如含有1至8个或以上的环(也称“环系”)，优选为1、2、3、4、5、6、7或8个环。各环具有3至7个环原子，优选为5至6个环原子。环系的实例是苯基环、吡啶基环、嘧啶基环、吡咯基环、呋喃基环、苯硫基(thiophenyl)环、5-元内酯、6-元内酯、螺甾内酯、苯醌、环己二烯基环和环己烯基环。这些环系、芳基或芳基的各环可以是单或多取代的。优选地，芳基的至少一个环携带酰基原子团。

酰基例如可以具有式F1’、F2’、F3’、F4’、F6’、F7’、F8’、F9’、F10’、F11’之一。这些结构式如图1所示。

芳基原子团可以直接或经由化学基团与所要转运的分子连接。本发明提供一种缀合物，其中该化学基团与该芳基原子团一起具有式II

其中芳基、X、Y和R¹是如上所定义的，

R³是该化学基团，R³例如是-C(＝O)基团或-NH-C(＝S)基团。

式II芳基原子团的实例是式F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10和F11的芳基原子团；这些结构式如图2a和图2b所示。

在确切的实施方式中，所要转运的分子是一种寡核苷酸。寡核苷酸例如可以完全由如下核苷酸构成：磷酸腺苷、磷酸鸟苷、磷酸肌苷、磷酸胞苷、磷酸尿苷和磷酸胸苷。在本发明的其他实施方式中，如果适当的话，寡核苷酸可以含有一种或多种修饰，例如化学修饰。寡核苷酸可以具有大量相同和/或不同的修饰。

化学修饰的实例是本领域技术人员已知的，例如参见E.Uhlmann和A.Peyman《化学评论》90(1990)543；“关于寡核苷酸与类似物的协议”《合成与性质和合成与分析技术》S.Agrawal，Ed.，HumanaPress，Totowa，USA 1993；J.Hunziker和C.Leumann“核酸类似物：合成与性质”《现代合成方法》(Ed.Beat Ernst和C.Leumann)，Verlag Helvetica Chimica Acata，Basle，pp.331-417。

寡核苷酸的化学修饰例如可以包含

a)磷酸二酯桥例如完全或部分被硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯、NR¹R^1’-氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯、磷酸(C₁-C₂₁)-O-烷基酯、磷酸[(C₆-C₁₂)芳基-(C₁-C₂₁)-O-烷基]酯、(C₁-C₈)烷基膦酸酯和/或(C₆-C₁₂)芳基膦酸酯桥取代，其中

R¹和R^1’彼此独立地是氢、(C₁-C₁₈)烷基、(C₆-C₂₀)芳基、(C₆-C₁₄)芳基-(C₁-C₈)烷基，优选为氢、(C₁-C₈)烷基和/或甲氧基乙基，特别优选为氢、(C₁-C₄)烷基和/或甲氧基乙基，或者

R¹和R^1’与携带它们的氮一起构成5-至6-元杂环，该杂环可以另外含有选自O、S和N的杂原子；

b)3’-和/或5’-磷酸二酯桥完全或部分被“脱磷酸”桥取代(例如参见Uhlmann，E.和Peyman，A.《分子生物学方法》Vol.20“关于寡核苷酸与类似物的协议”S.Agrawal，Ed.，Humana Press，Totowa 1993，16章，355ff.)，例如被formacetal、3’-thioformacetal、甲基羟胺、肟、亚甲基二甲基亚肼基、二亚甲基砜和/或甲硅烷基取代；

c)磷酸糖主链例如完全或部分被“吗啉”寡聚物(例如参见E.P.Stirchak等《核酸研究》17(1989)6129；J.Summerton和D.Weller《反义与核酸药物开发》7(1997)187-195)和/或聚酰胺核酸(PNA)(例如参见P.E.Nielsen等《生物缀合物化学》5(1994)3)和/或膦酸一酯核酸(PHONA)(例如参见Peyman等《应用化学国际英文版》35(1996)2632-2638)取代；

d)β-D-2’-脱氧核糖单元例如完全和/或部分被如下取代：α-D-2’-脱氧核糖、L-2’-脱氧核糖、2’-F-2’-脱氧核糖、2’-O-(C₁-C₆)烷基-核糖、2’-O-(C₂-C₆)烯基-核糖、2’-[O-(C₁-C₆)烷基-O-(C₁-C₆)烷基]-核糖、2’-NH₂-2’-脱氧核糖、β-D-木呋喃糖、α-阿拉伯呋喃糖、2，4-二脱氧-β-D-赤型-吡喃己糖、构象限制的糖类似物，例如LNA(锁定核酸；Singh等《化学通报》4(1998)455；Singh等《化学通报》12(1998)1247)和碳环的(例如参见Froehler《美国化学会志》114(1992)8320)和/或开链的糖类似物(例如参见Vandendriessche等《四面体》49(1993)7223)和/或二环糖类似物(例如参见M.Tarkov等《瑞士化学学报》76(1993)481)；

e)天然核苷碱基例如被如下修饰和/或完全或部分取代：5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、假尿嘧啶、假异胞嘧啶、二氢尿嘧啶、5-(C₁-C₆)烷基-尿嘧啶、5-(C₂-C₆)烯基-尿嘧啶、5-(C₂-C₆)炔基-尿嘧啶、5-(C₁-C₆)烷基-胞嘧啶、5-(C₂-C₆)烯基-胞嘧啶、5-(C₂-C₆)炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶或7-去氮杂-7-取代的嘌呤。

寡核苷酸的化学修饰进一步涵盖寡核苷酸与一个或多个其他分子连接，这些分子对寡核苷酸的特定性质具有有利的影响，例如对核酸酶的稳定性、对靶序列的亲合性和药动学，例如在经过修饰的寡核苷酸与靶序列杂交期间与靶序列结合和/或交联。这类其他分子的实例是聚赖氨酸，嵌入剂、例如芘、吖啶、吩嗪或菲啶，荧光化合物、例如荧光素，交联剂、例如补骨脂素或叠氮基硫酸原黄素(azidoproflavine)，亲脂性分子、例如(C₁₂-C₂₀)烷基、优选为(C₁₂-C₂₀)烷基，脂质、例如1，2-二-十六烷基-外-甘油(1，2-dihexadecyl-rac-glycerol)，类固醇、例如胆固醇或睾酮，维生素、例如维生素E，多或寡乙二醇，(C₁₂-C₁₈)烷基磷酸二酯、优选为(C₁₄-C₁₈)烷基磷酸二酯，和-O-CH₂-CH(OH)-O-(C₁₂-C₁₈)烷基、优选为-O-CH₂-CH(OH)-O-(C₁₂-C₁₆)烷基。这些其他分子可以在5’-和/或3’-末端和/或序列内例如与核苷碱基缀合。用于制备这些经过修饰的寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的，例如参见Uhlmann，E.和Peyman，A.《化学评论》90(1990)543和/或M.Manoharan《反义研究与应用》Crooke和Lebleu，Eds.，CRC Press，Boca Raton，1993，17章，p.303ff.和/或EP-A 0 552766。

在本发明的其他具体实施方式中，寡核苷酸可以在3’-和/或5’-末端具有3’-3’和/或5’-5’反转。这种类型的化学修饰是本领域技术人员已知的，例如参见M.Koga等《有机化学杂志》56(1991)3757。

在由一个或多个寡核苷酸和一个或多个芳基原子团组成的缀合物、优选为式I或II的缀合物中，芳基原子团与寡核苷酸的缀合例如可以发生在寡核苷酸的5’-末端(A)、3’-末端(F)、杂环碱基(E和G)、糖(C)或核苷间桥(B)。不过，缀合例如还可以经由非核苷酸构件发生，例如在(D)的情况下。这些实例如图3所示。

所述修饰当然还可以相应适用于相对长的多核苷酸，如果适合的话，还适用于一-或二-核苷酸或-核苷。

寡核苷酸例如长8至50个核苷酸，优选为10-20个核苷酸。不过，具有更长寡或多核苷酸的寡核苷酸、例如长50至10,000个核苷酸、优选为100至1000个核苷酸也是适合的，如果适当的话，它们也可以呈双链形式。

寡核苷酸可以具有任意序列。寡核苷酸的序列根据所选择的靶加以选择或设计，也就是说，如果靶是核酸，那么根据它的序列，或者如果靶是蛋白质，那么根据编码该靶蛋白质的核酸序列。例如，如果靶是病毒，例如CMV、HIV、HSV-1、HSV-2、流感病毒、VSV、乙肝病毒或乳头瘤病毒，那么寡核苷酸例如可以具有下列序列之一：

a)抗CMV

SEQ ID NO.12    5′-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG

b)抗HIV，例如

SEQ ID NO.13    5′-ACACCCAATTCTGAAAATGG-3′或

SEQ ID NO.14    5′-AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA-3′或

c)抗HSV-1，例如

SEQ ID NO.15    5′-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3′

靶例如可以是参与癌的形成或负责癌的生长的蛋白质。这类靶的实例是：

1)核癌蛋白，例如c-myc、N-myc、c-myb、c-fos、c-fos/jun、PCNA、p120；

2)胞质/膜结合癌蛋白，例如EJ-ras、c-Ha-ras、N-ras、rrg、bcl-2、cdc-2、c-raf-1、c-mos、c-src、c-abl、c-ets；

3)细胞受体，例如EGF受体、Her-2、c-erbA、VEGF受体(KDR-1)、视黄醛受体、蛋白激酶的调节性亚单位、c-fms、Tie-2、c-raf-1激酶、PKC-α、蛋白激酶A(R1α)；

4)细胞因子、生长因子、细胞外基质，例如CSF-1、IL-6、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、bFGF、VEGF、成髓细胞素、纤连蛋白。

定向于这些靶的寡核苷酸例如可以具有下列碱基序列：

a)抗c-Ha-ras，例如

SEQ ID NO.16    5′-CAGCTGCAACCCAGC-3′或

SEQ ID NO.17    5′-TATTCCGTCAT-3′或

SEQ ID NO.18    5′-TTCCGTCATCGCTCCTCAGGGG-3′

b)bFGF，例如

SEQ ID NO.19    5′-GGCTGCCATGGTCCC-3′

c)c-myc，例如

SEQ ID NO.20    5′-GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC-3′

SEQ ID NO.21    5′-AACGTTGAGGGGCAT-3′

d)c-myb，例如

SEQ ID NO.22    5′-GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3′

e)c-fos，例如

SEQ ID NO.23    5′-CGAGAACATCATCGTGG-3′

SEQ ID NO.24    5′-GGAGAACATCATGGTCGAAAG-3′

SEQ ID NO.25    5′-CCCGAGAACATCATGGTCGAAG-3′

SEQ ID NO.26    5′-GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG-3′

f)p120，例如

SEQ ID NO.27    5′-CACCCGCCTTGGCCTCCCAC-3′

g)EGF受体，例如

SEQ ID NO.28    5′-GGGACTCCGGCGCAGCGC-3′

SEQ ID NO.29    5′-GGCAAACTTTCTTTTCCTCC-3′

h)p53肿瘤抑制基因，例如

SEQ ID NO.30    5′-GGGAAGGAGGAGGATGAGG-3′

SEQ ID NO.31    5′-GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG-3′

i)bcl-2

SEQ ID NO.32    5′-TCTCCCAGCGTGCGCCAT

k)VEGF

SEQ ID NO.33    5′-GCGCTGATAGACATCCATG

SEQ ID NO.34    3′-CCAGCCCGGAGG-5′，5′-GGAGGCCCGACC-3′

SEQ ID NO.35    3′-CGGAGGCTTTGG-5′，5′-GGTTTCGGAGGC-3′；

SEQ ID NO.36    3′-GATGGAGGTGGT-5′，5′-TGGTGGAGGTAG-3′

SEQ ID NO.37    3′-GGAGGTGGTACG-5′，5′-GCATGGTGGAGG-3′

SEQ ID NO.38    3′-GGTGGTACGGTT-5′，5′-TTGGCATGGTGG-3′

SEQ ID NO.39    3′-CACCAGGGTCCG-5′，5′-GCCTGGGACCAC-3′

SEQ ID NO.40    3′-CCAGGGTCCGAC-5′，5′-CAGCCTGGGACC-3′

SEQ ID NO.41    3′-AGGGTCCGACGT-5′，5′-TGCAGCCTGGGA-3′

SEQ ID NO.42    3′-GGGTCCGACGTG-5′，5′-GTGCAGCCTGGG-3′

SEQ ID NO.43    3′-GGTCCGACGTGG-5′，5′-GGTGCAGCCTGG-3′

SEQ ID NO.44    3′-CCGACGTGGGTA-5′，5′-ATGGGTGCAGCC-3′

SEQ ID NO.45    3′-GTAGAAGTTCGG-5′，5′-GGCTTGAAGATG-3′

SEQ ID NO.46    3′-ACGCCCCCGACG-5′，5′-GCAGCCCCCGCA-3′

或

SEQ ID NO.47    3′-CCCCCGACGACG-5′，5′-GCAGCAGCCCCC-3′

l)c-raf激酶

SEQ ID NO.48    5′-TCCCGCCTGTGACATGCATT

m)PKC-α

SEQ ID NO.49    5′-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA

n)蛋白激酶A

SEQ ID NO.50    5′-GCGTGCCTCCTCACTGGC

如果靶是整联蛋白或细胞-细胞粘着受体，例如VLA-4、VLA-2、ICAM、VCAM或ELAM，那么寡核苷酸例如可以具有下列序列之一：

a)VLA-4，例如

SEQ ID NO.51    5′-GCAGTAAGCATCCATATC-3′或

b)ICAM-1，例如

SEQ ID NO.52    5′-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA

SEQ ID NO.53    5′-CCCCCACCACTTCCCCTCTC-3′

SEQ ID NO.54    5′-CTCCCCCACCACTTCCCCTC-3′

SEQ ID NO.55    5′-GCTGGGAGCCATAGCGAGG-3′

c)ELAM-1，例如

SEQ ID NO.56    5′-ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG-3′

SEQ ID NO.57    5′-CAATCAATGACTTCAAGAGTTC-3′

d)整联蛋白α(V)

SEQ ID NO.58    5′-GCGGCGGAAAAGCCATCG

如果靶是负责增殖或迁移或参与这些/这种过程的蛋白质，例如：

1)核反式激活蛋白和细胞周期蛋白，例如c-myc、c-myb、c-fos、c-fos/jun、细胞周期蛋白和cdc2激酶；

2)促分裂原或生长因子，例如PDGF、bFGF、VEGF、EGF、HB-EGF和TGF-β；

3)细胞受体，例如bFGF受体、EGF受体和PDGF受体；

那么寡核苷酸例如可以具有下列碱基序列之一：

a)c-myb

SEQ ID NO.59    5′-GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3′

b)c-myc

SEQ ID NO.60    5′-CACGTTGAGGGGCAT-3′

c)cdc2激酶

SEQ ID NO.61    5′-GTCTTCCATAGTTACTCA-3′

d)PCNA(大鼠增殖性细胞核抗原)

SEQ ID NO.62    5′-GATCAGGCGTGCCTCAAA-3′.

如果靶例如是腺苷A1受体、腺苷A3受体、缓激肽受体或IL-13，那么例如可能是碱基序列

SEQ ID NO.63    5′-GATGGAGGGCGGCATGGCGGG

制备了下列寡核苷酸(5’-->3’)：

ON1：5′-d(G^*CGAC^*GC^*CAT^*GAC^*G^*G)      SEQ ID NO.1

ON2：5′-d(C^*GAC^*GC^*CAT^*G^*A^*C)         SEQ ID NO.2

ON3：5′-d(A^*T^*GAC^*GGAA^*T^*T^*C)         SEQ ID NO.3

ON4：5′-d(TATTCCGTCAT)                        SEQ ID NO.4

ON5：5′-(dA)₂₀                               SEQ ID NO.5

ON6：5′-(dA)₅₀                               SEQ ID NO.6

ON7：5′-(dA)₈₀                               SEQ ID NO.7

ON8：5′-T^*T^*CC^*AT^*GG^*TG^*G^*C          SEQ ID NO.8

ON9：5′-T^*T^*CA^*CT^*GT^*GG^*G^*C          SEQ ID NO.9

ON10：5′-T^*G^*GC^*GC^*CG^*GG^*C^*C         SEQ ID NO.10

ON11：5′-T^*G^*CC^*GG^*CC^*GG^*G^*C         SEQ ID NO.11

其中*表示磷酸二酯桥被硫代磷酸酯核苷间桥取代的位置。

将这些序列转化为下列缀合物(CO)：

CO_1：     F3-Li1-ON1

CO_2：     F0-Li1-ON1

CO_3：     F3-Li1-ON2

CO_4：     F0-Li1-ON2

CO_5：     F3-Li1-ON3

CO_6：     F9-Li1-ON3

CO_7：     F2-Li-1ON3

CO_8：     F0-Li1-ON3

CO_9：     F3-Li1-ON3-若丹明

CO_10：    F9-Li1-ON3-若丹明

CO_11：    F6-Li1-ON3-若丹明

CO_12：    F0-Li1-ON3-若丹明

CO_13：    F3-Li1-ON4

CO_14：    F3-Li1-ON5

CO_15：    F3-Li1-ON6

CO_16：    F3-Li1-ON7

CO_17：    F3-Li1-ON8

CO_18：    F3-Li1-ON9

CO_19：    F3-Li1-ON10

CO_20：    F3-Li1-ON11

CO_21：    F7-Li1-ON3

其中

“F1至F11”是式F1至F11的芳基原子团(例如图2)；

“Li1”是6-氨基己基磷酸酯原子团，它与寡核苷酸的5’-末端连接(例如见附图4)；

“ON1至ON11”是所述序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.11的寡核苷酸；

“若丹明”是寡核苷酸3’-末端的若丹明标记，除了荧光素以外，它也是可检测的。

本发明还提供用于制备根据本发明的缀合物的方法。本发明涉及用于制备缀合物的方法，该缀合物包含所要转运的分子和至少一个芳基原子团，优选为式I或II，其中

a)制备所要转运的分子，它在将与芳基原子团连接的位置含有反应性官能团；

b)制备芳基原子团；和

c)使该所要转运的分子与该芳基原子团反应，得到缀合物。

反应性官能团优选为氨基、巯基、氯乙酰基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、羧酸基、N-羟基琥珀酰亚胺基或碳酰氯基。所要转运的分子与芳基原子团的反应在pH≤7.5下进行；优选为pH≤7.3，特别优选为pH≤7.0或更低的pH，例如pH＜7，优选为pH≤6.5。在这些偶联反应中，所有其他反应性基团必须在反应之前用本领域技术人员已知的保护基团加以保护。在该方法的特别优选的实施方式中，所要转运的分子是多核苷酸、寡核苷酸或单核苷酸。

制备方法在第一步中包括所要转运的分子的制备。在本文中，本发明还涉及制备寡核苷酸的方法。寡核苷酸可以借助各种已知的化学方法加以制备，例如参见Eckstein，F.(1991)《寡核苷酸与类似物：实用方法》IRL Press，Oxford。如果适当的话，寡核苷酸也可以用包括一个或多个酶步骤的方法加以制备。寡核苷酸缀合物的制备原则上如文献所述(J.Goodchild《生物缀合物化学》1(1990)165；S.Beaucage和R.Iyer《四面体》49(1993)1925；S.Agrawal《分子生物学方法》Vol.26“关于寡核苷酸缀合物的方法(Protocols foroligonucleotide conjugates)”(1994)Humana Press)。

不过，在合成根据式I的寡核苷酸缀合物时，必须注意它们可能在碱性介质中分解这一事实。因此例如不可能利用习惯方法在寡核苷酸合成仪中合成FDA-标记的寡核苷酸，因为FDA基团的酯基将在氨处理期间水解，而从载体上裂解寡核苷酸和裂解杂环碱的氨基保护基团都需要氨的处理。因而，最初所制备的寡核苷酸是脱保护形式的前体，在最后一步中与式I基团融合(图5)。寡核苷酸前体具有反应性或可活化的官能，随后通过本领域技术人员已知的方法，将该官能用含有根据本发明的式I基团的试剂衍生。适合的反应性或可活化的官能例如氨基、巯基、氯乙酰基、异(硫)氰酸酯和羧酸官能。借助商业上可得到的试剂，向寡核苷酸引入所谓的氨基连接子是特别容易的。然后使带有氨基连接子的寡核苷酸例如与含有式I基团的反应性试剂反应。这样的反应性试剂例如是相应的异硫氰酸酯。式I基团在这种情况下经由硫脲官能连接(附图4)。其他反应性试剂是例如碳酰氯。温和的反应性试剂是例如相应羧酸的N-羟基琥珀酰亚胺。可活化的试剂是例如相应的羧酸，它们能够与肽偶联试剂偶联，例如HBTU、TBTU或TOTU。在这种情况下，式I基团经由酰胺官能连接。原则上，根据本发明的式I基团可以被引入寡核苷酸的任何位置。优选为图3所示位置。

经过修饰的寡核苷酸是这样合成的，通过标准方法构造寡核苷酸链，例如亚磷酰胺法固相合成，再用商业上可得到的5’-氨基-改性剂C6(例如来自Eurogentec，Seraing，Belgium)衍生5’-末端。

5’-氨基-改性剂C6(Mmt＝4-一甲氧基三苯甲基)

从载体上裂解寡核苷酸衍生物和通过氨处理去保护所有碱不稳定性保护基团之后，在环境温度下用80％乙酸处理，除去一甲氧基三苯甲基，得到5’-氨基己基-磷酸酯-修饰的寡核苷酸。然后使这种寡核苷酸衍生物的氨基官能与FDA-异硫氰酸酯在0.2M三乙铵碳酸氢盐缓冲液(TBK缓冲液)pH7/DMF中反应。仅二至三小时后，带有氨基连接子的寡核苷酸就已经完全转化为所需的FDA衍生物(图4)。与荧光素异硫氰酸酯的反应通常在pH8下进行。不过，在该pH下，FDA基的二乙酸酯水解。

使用其他氨基连接子试剂当然也是可能的，例如5’-氨基-改性剂C3、5’-氨基-改性剂C12、5’-氨基-改性剂C5或5’-巯基-改性剂C6(均来自Eurogentec)。

利用3’-氨基-改性剂固相，例如3’-氨基-改性剂C3 CPG(来自Eurogentec)，有可能制备具有3’-氨基烷基的寡核苷酸衍生物，随后使其与FDA-异硫氰酸酯反应，得到寡核苷酸衍生物，它含有连接在3’-末端的根据本发明的式I基团。

3’-氨基-改性剂C3 CPG(Fmoc＝芴基甲氧羰基)

为了在核苷的杂环碱引入缀合物，有可能在合成中使用相应的从胸苷衍生的氨基改性剂C6 dT(来自Eurogentec)代替正常的亚磷酰胺构件。在寡核苷酸合成结束时，通过氨的处理除去三氟乙酰基保护基团，使游离的氨基官能在溶液中与FDA-异硫氰酸酯反应。

氨基改性剂C6 dT

按照类似的方式，有可能在寡核苷酸的任何位置引入根据本发明的式I基团。可以轻易看到，即使多次引入相同或不同的基团也是可能的。

在其中所要转运的分子是肽核酸(PNA)的缀合物的制备方法中，有可能例如使氨基乙基的伯氨基官能与FDA-异硫氰酸酯反应。

在用于制备其中所要转运的分子是多肽的缀合物的方法中，有可能例如用多肽的氨基末端或赖氨酸侧链的氨基官能与FDA-异硫氰酸酯反应。

本发明还提供缀合物的用途，特别是基于该缀合物的上述有利性质的用途。本发明的确切实施方式涉及缀合物用于跨生物膜转运分子的用途。本发明还涉及芳基原子团(优选为式I或II)用于转运与该芳基原子团连接的分子、用于跨生物膜转运该分子的用途。生物膜优选为细胞组分、囊泡或细胞器。

本发明还提供用于跨膜转运分子的方法，其中

a)制备一种缀合物，其中所要转运的分子与至少一个式I或II芳基原子团连接，

b)温育该缀合物与该膜。

确切地提供了用于转运分子进入细胞的方法，其中

a)制备一种缀合物，其中所要转运的分子与至少一个式I或II芳基原子团连接，

b)将该缀合物与该细胞温育，于是

c)该缀合物被转运进入细胞，且没有裂解除去该芳基原子团。

本发明确切地涉及这样的方法，其中该细胞是真核生物或原核生物细胞，例如细菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞，优选为人细胞。在确切的实施方式中，该细胞是病理改变的细胞，例如肿瘤细胞。

不仅在哺乳动物细胞中观察到缀合物的细胞摄取提高，而且在其他真核生物、甚至原核生物中都已得到证明。

用显微镜检查根据本发明的缀合物摄取进入活体细胞的情况。最初，检查FDA-标记的寡核苷酸CO_1和CO_3进入细胞的能力。使用相应的荧光素-标记的寡核苷酸CO_2和CO_4作为现有技术已知的化合物。所有所研究的活体动物细胞培养物都在5至10分钟内摄入CO_1和CO_3(FDA-缀合物)，而在此时间后在活体细胞中不可能检测到CO_2和CO_4(荧光素缀合物)(表1)。

即使摄取进入细菌和酵母大大慢于哺乳动物细胞，有些细胞在两小时后也已摄入根据本发明的寡核苷酸，而正常荧光素-标记的寡核苷酸在这些条件未被摄入。惊人的是，原则上所有迄今所研究的生物体摄入根据本发明的寡核苷酸都好于已知的寡核苷酸衍生物。这些生物体尤其包括动物细胞、鞭毛虫、酵母、真菌和细菌(表3)。

此外，已经发现癌细胞摄入这些寡核苷酸特别充分。根据本发明的寡核苷酸的用途因此特别适合于肿瘤疗法。FDA-标记的反义寡核苷酸CO_1定向于eg5，它在简单地加入到培养基中后可抑制A549细胞的增殖，而相应的未经修饰的反义寡核苷酸ON1和荧光素-标记的寡核苷酸CO_2仅在与透入增强剂、例如CellFectin配制之后才抑制癌细胞的增殖。

本发明涉及其中所要转运的分子是寡核苷酸的缀合物的用途，用于与单链和/或双链核酸、例如DNA(例如基因、cDNA)和/或RNA(例如pre-mRNA、mRNA)杂交。这些缀合物还能够序列特异性地与细胞内蛋白质结合，例如酶，例如聚合酶或端粒酶，或者与转录因子结合。本发明此外涉及这些缀合物用于调节和完全或部分抑制某些靶基因表达的用途，例如用于转录和/或转译的完全或部分抑制。本发明还涉及这些缀合物作为反义寡核苷酸、核酶、有义寡核苷酸、形成三螺旋的寡核苷酸、chimeraplast和/或圈套寡核苷酸的用途。另外，这些缀合物可以用作分子生物学中的助剂。

本发明此外涉及寡核苷酸作为药物和/或诊断助剂的用途和寡核苷酸用于制备药物和/或诊断助剂的用途。确切地说，在用于与某些基因的表达或过度表达有关的疾病的预防和/或治疗的药物中可以采用所述寡核苷酸。此外，寡核苷酸可以用于诊断这样的疾病或者用于早期检测它们。由于根据本发明的寡核苷酸进入细胞的能力非常之好，因此它们可以用于体内诊断，例如用于在整个器官或完整生物体中就地杂交。

本发明还提供包含一种或多种根据本发明的缀合物的药物。本发明还提供包含一种或多种根据本发明的缀合物的诊断助剂。本发明还提供包含一种或多种根据本发明的缀合物的试验试剂盒。

本发明还涉及寡核苷酸用于核酸及其类似物的检测、分离和扩增的用途。缀合物特别适合于检测细胞、特别是活体细胞中的核酸。这些细胞可以是人或动物来源的。缀合物还特别适合于表3所列生物体，特别适合于病原性生物体的检测。根据本发明的寡核苷酸可以用在已知的核酸扩增技术中，特别是LMPCR(连接反应介导的聚合酶链反应)、“Invader Assay”(商标，Third Wave Technologies，Inc.，Wisconsin)、TaqMan System(商标)和多样性基因定型。借助光循环器用寡核苷酸扩增核酸的用途也是有利的，可实时进行扩增检测。根据本发明的寡核苷酸的进一步可能的用途是基于分子“信标”原理的检测，其中荧光性染剂在未被结合时不发出荧光，因为它被寡聚物中的第二基团猝火。例如有可能使FDA衍生物(例如在寡核苷酸的5’-末端)与Dabcyl原子团(例如在3’-末端缀合的)组合，后者猝火未结合状态下的荧光信号，即使在FDA衍生物转化为荧光素衍生物之后也是如此。这些FDA-修饰的信标仅在摄取进入细胞和与靶mRNA杂交之后才发出荧光信号。

本发明还涉及寡核苷酸或包含这些寡核苷酸的药物的用途，用于治疗由确定基因的过度表达所导致的或与之有关的疾病。本发明的药物例如可以用于治疗由病毒例如CMV、HIV、HSV-1、HSV-2、流感病毒、VSV、乙肝病毒或乳头状瘤病毒所导致的机能障碍。本发明的药物例如还适合于治疗癌症。本发明的药物此外例如适合于治疗受整联蛋白或细胞-细胞粘着受体影响的机能障碍，例如VLA-4、VLA-2、ICAM、VCAM或ELAM。本发明的药物例如还适合于预防再狭窄，用于白斑和其他脱色素疾病或脱色素紊乱(例如皮肤、头发、眼)的治疗，例如白化病和牛皮癣，和哮喘的治疗。

药物例如涉及药物制剂，它们的给药可以是a)口服方式，例如剂型是片剂、糖衣片、硬或软胶囊剂、溶液、乳剂或悬液，b)直肠方式，例如剂型是栓剂，或c)肠胃外方式，例如剂型是注射溶液。关于制备药物，缀合物例如可以被加工在治疗学上的惰性有机和/或无机载体中；适合于片剂、糖衣片和硬胶囊剂的载体例如乳糖、玉米淀粉或其衍生物、动物脂肪(tallow)和硬脂酸或其盐。适合于溶液的载体是水、多元醇、蔗糖、转化糖和葡萄糖，适合于注射溶液的载体是水、醇、多元醇、甘油和植物油，适合于栓剂的载体是氢化和植物油、蜡、脂肪和半液体多元醇。药物此外可以包含防腐剂、溶剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、矫味剂、改变渗透压的盐、缓冲剂、包衣剂、抗氧化剂，如果适当的话，还可包含其他治疗学上的活性化合物。药物优选地是局部用药的，例如借助导管，或者吸入，或者通过注射或输注给药。关于注射，将缀合物配制在液体溶液中，优选为生理学上可接受的缓冲液，例如汉克氏溶液或林格氏溶液。不过，缀合物也可以配制成固体剂型，使用前溶解或悬浮。全身给药所优选的剂量从大约0.01mg/kg至大约50mg/kg体重每天。

缀合物和/或其生理学上可接受的盐作为药物可以独自、彼此混合或以药物制剂形式对动物给药，优选为哺乳动物，特别是人，该药物制剂允许局部、经皮、肠胃外或肠内使用，包含有效剂量的至少一种缀合物作为活性组分，以及惯用的药学上可接受的载体和添加剂。制剂通常包含大约0.1至90重量％的治疗学上的活性化合物。关于皮肤疾病的治疗，例如牛皮癣或白斑，优选为局部使用，例如剂型是软膏剂、洗剂或酊剂、乳剂、悬液。药物是按照本身已知的方式制备的(例如《Remingtons药物科学》Mack Publ.Co.，Easton，PA.)，并使用药学上惰性的无机和/或有机载体。关于丸剂、片剂、糖衣片和硬胶囊剂的制备，有可能使用例如乳糖、玉米淀粉和/或其衍生物、滑石、硬脂酸和/或其盐等。适合于软胶囊剂和/或栓剂的载体是例如脂肪、蜡、半固体与液体多元醇、天然和/或氢化油等。适合于溶液和/或糖浆剂制备的载体是例如水、蔗糖、转化糖、葡萄糖、多元醇等。适合于注射溶液制备的载体是水、醇、甘油、多元醇、植物油等。适合于微囊、植入物和/或药条的载体是乙醇酸与乳酸的混合聚合物。此外适合的是本领域技术人员已知的脂质体制剂(N.Weiner《Drug Develop Ind Pharm》15(1989)1523；《皮肤脂质体制剂》Springer Verlag 1992)，例如HVJ脂质体(Hayashi《基因疗法》3(1996)878)。

除了活性化合物和载体以外，药物还可以包含添加剂，例如填充剂、膨胀剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、湿润剂、稳定剂、乳化剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、矫味剂或芳香剂、增稠剂、稀释剂、缓冲物质、进一步的溶剂和/或增溶剂和/或达到药库效果的试剂，和改变渗透压的盐、包衣剂和/或抗氧化剂。药物还可以包含两种或多种不同的寡核苷酸和/或其生理学上可接受的盐，此外除了至少一种寡核苷酸以外，还包含一种或多种其他治疗学上的活性物质。剂量可以在宽限内变化，必须根据具体情况加以调整。

附图

图1显示式I芳基原子团的实例。

图2a和2b显示式II芳基原子团的实例。

图3显示所要转运的分子(这里是寡核苷酸)与式I芳基原子团之间的缀合作用的不同实例(A，B，C，D，E，F，G)。“R”是式I原子团；“B”是杂环碱。

图4显示制备根据本发明的缀合物(这里由FDA-异硫氰酸酯和寡核苷酸组成)的可能性。

图5显示缀合物CO_5经过一定时间从培养基摄取进入REH细胞，其中在一种情况下使用不含血清的培养基(◆)，在另一种情况下使用含有血清的培养基(●)。借助FACS测定进入细胞的摄取量。

图6显示通过FACS测量的CO_1(FDA缀合物；◆)和CO_2(FITC寡聚物；▲)摄取进入细胞的测定图。细胞外寡核苷酸缀合物的最初浓度为1μM；○和□是对照。

图7显示REH细胞中与FDA缀合的聚A-核苷酸的转染作为长度的函数。

图8显示荧光素二乙酸酯与荧光素二新戊酸酯寡核苷酸缀合物摄取进入细胞的对比。K39：来自实施例15的羧基荧光素二乙酸酯(F3等于FDS)；K41：来自实施例10的羧基荧光素二新戊酸酯(F2)。

图9显示用荧光显微法检查双重标记的Cy3寡核苷酸F3缀合物[1μM]在与REH细胞培养期间摄取进入细胞。4小时后摄取。左：荧光标记；中：花青染剂；右：相差图；顶：寡核苷酸K33；底：寡核苷酸K34。

实施例

实施例1：寡核苷酸合成

利用标准亚磷酰胺化学法和碘氧化作用，在自动DNA合成仪(Applied Biosystems 380B或394)上合成寡核苷酸(F.Eckstein，Ed《寡核苷酸与类似物：实用方法》IRL Press，Oxford，1991)。关于在混合的硫代磷酸酯与磷酸二酯寡核苷酸中引入硫代磷酸酯桥，利用TETD(二硫化四乙基秋兰姆)或Beaucage试剂代替碘进行氧化作用。从固体载体(CPG或Tentagel)上裂解，在55℃下用浓NH₃处理18h以除去保护基团，寡核苷酸先经过丁醇沉淀纯化(Sawadogo，VanDyke《核酸研究》19(1991)674)。寡核苷酸再经过制备型凝胶电泳或FPLC纯化。然后利用2.5体积份乙醇，从0.5M NaCl溶液中沉淀得到钠盐。

寡核苷酸经过如下分析：

a)分析型凝胶电泳：20％丙烯酰胺，8M尿素，454M Tris-硼酸缓冲液pH7.0，和/或

b)HPLC分析：Waters GenPak FAX，梯度CH₃CN(400ml)，H₂O(1.6l)，NaH₂PO₄(3.1g)，NaCl(11.7g)，pH6.8(0.1M NaCl)至CH₃CN(400ml)，H₂O(1.6l)，NaH₂PO₄(3.1g)，NaCl(175.3g)，pH6.8(1.5MNaCl)和/或

c)毛细管凝胶电泳：Beckmann毛细管eCAP^TM，U100P凝胶柱，长65cm，I.D.100mm，窗口距一端15cm，缓冲液含140μM Tris、360mM硼酸、7M尿素，和/或

d)电喷射质谱法。

寡核苷酸的分析显示纯度均大于90％，在多数情况下大于95％。

实施例2：向寡核苷酸引入5’-氨基-连接子

如实施例1所述合成寡核苷酸。偶联最后一个核苷酸之后，裂解除去5’-末端的二甲氧基三苯甲基。使游离羟基与商业上可得到的5’-氨基-改性剂C6(来自Eurogentic，Seraing，Belgium)在四唑催化下反应，用碘水氧化。然后在50℃下用浓氨处理过夜，从载体上裂解下寡核苷酸，裂解除去所有核苷间基团上的碱不稳定性保护基团和杂环碱的氨基官能。在最后一步中，在环境温度下用80％乙酸处理3小时，裂解除去一甲氧基三苯甲基保护基团。如实施例1所述分析所得寡核苷酸。

实施例3：带有氨基-连接子的寡核苷酸与FDA-异硫氰酸酯的缀合

将10 OD(260)来自实施例2的带有5’-氨基-连接子的寡核苷酸溶于16μl 0.2M三乙铵碳酸氢盐(TBK)缓冲液，与125μl二甲基甲酰胺(DMF)混合。向该混合物中加入1.5mg FDA-异硫氰酸酯，然后在避光下摇动混合物3小时。用HPLC检查反应结果。然后加入2μl浓乙酸，将混合物在减压下浓缩。产物然后经过丁醇沉淀纯化。用ESI质谱法测定正确的质量。为了避免芳族酯的水解，样本总是保持在pH小于7。

实施例4：CO_1(5′-F3-G^*CGAC^*GC^*CAT^*GAC^*G^*G-3′；F3＝FDA)的合成

从经由3’-末端连接有1μmol脱氧鸟苷的CPG载体开始，如实施例1所述合成寡核苷酸。将标有*的位置用Beaucage试剂氧化，以引入硫代磷酸酯桥。然后如实施例2所述进行与5’-氨基-改性剂C6的偶联。用浓氨和80％乙酸去保护，得到96 OD(260)5’-氨基-连接子-G^*CGAC^*GC^*CAT^*GAC^*G^*G-3′。

然后使10 OD(260)带有5’-氨基-连接子的寡核苷酸与FDA-异硫氰酸酯如实施例3所述反应。用丁醇沉淀，得到8.4 OD(260)所需的FDA-标记的寡核苷酸。关于二钠盐的ESI-MS：5395.93(二钠盐计算值：5395.09)。

实施例5：CO_13(5′-F3-TATTCCGTCAT-3′)的合成

从经由3’-末端连接有1μmol胸苷的CPG载体开始，如实施例1所述合成寡核苷酸。利用碘水进行所有氧化作用。然后如实施例2所述进行与5’-氨基-改性剂C6的偶联。用浓氨和80％乙酸去保护，得到72 OD(260)5’-氨基-连接子-TATTCCGTCAT-3’。经过制备型聚丙烯酰胺凝胶纯化，得到43 OD(260)。

然后使10 OD(260)带有5’-氨基-连接子的寡核苷酸与FDA-异硫氰酸酯如实施例3所述反应。用丁醇沉淀，得到9.1 OD(260)所需的FDA-标记的寡核苷酸。ESI-MS：3934.1(MW计算值3933.8)。

实施例6：CO_21(5′-F7-A^*T^*GAC^*GGAA^*T^*T^*C)的合成

从经由3’-末端连接有1μmol N6-苯甲酰胞苷的CPG载体开始，如实施例1所述合成寡核苷酸。利用碘水进行所有氧化作用。然后如实施例2所述进行与5’-氨基-改性剂C6的偶联。用浓氨和80％乙酸去保护，得到145 OD(260)5’-氨基-连接子-A^*T^*GAC^*GGAA^*T^*T^*C-3′。

然后将10 OD(260)带有5’-氨基-连接子的寡核苷酸溶于16μl0.2M TBK缓冲液与95μl DMF，使混合物与30μl预先制备的对-乙酰氧基苯甲酸的活化酯反应。活化酯是这样制备的，在DMF的情况下，将50μl 0.2M对-乙酰氧基苯甲酸与50μl 0.3M TBTU混合，然后在环境温度下反应一小时。氨基-连接子-寡核苷酸与活化酯反应4小时后，加入2μl半浓缩的乙酸，将混合物在减压下浓缩。用丁醇沉淀以除去过量试剂。得到10.7 OD(260)所需的寡核苷酸缀合物。ESI-MS：4109.2(MW计算值4108.2)。

实施例7：寡核苷酸缀合物的细胞摄取检查

为了检查细胞摄取，在显微镜检控制下，在Bachofer腔内，将在培养基中的1ml细胞悬液(或者在培养基具有固有荧光的情况下，在PBS中清洗之后)与1ml 1μmol寡核苷酸缀合物溶液混合，混合是利用取液器进行的，并且摇动腔。按照相差模式，借助Zeiss Axiovert135 TV仪器(100x Plan-Neofluar)进行显微镜检查。所用荧光滤器是09(450-490/FT 510/LP 520)/HBO 59W滤器。所用参照是FDA(Aldrich Chem.Co.，FW.416.39)在丙酮/PBS缓冲液中(1∶1000；v∶v)的2.4μM溶液。在FDA缀合物的情况下，在摄取之后可以监测由酯裂解所生成的荧光素配体的固有荧光。在非荧光性配体的情况下，例如乙酰氧基萘羧酸，另外将适合的荧光标记物(FITC、若丹明、花青染剂Dy3或Dy5)与寡核苷酸连接。如CO_9中的双重标记用来证明FDA不从寡核苷酸中裂解。在加入寡核苷酸缀合物2至120分钟之后评价各样本。在Reh细胞的情况下，5至10分钟后清楚地显现荧光，在K562和粘附细胞以及昆虫细胞的情况下，荧光在加入后长达60分钟才有所增加。在自由活体原生动物的情况下，摄取花费1小时。在酵母的情况下，摄取仅在长时间后才发生，并且在所有细胞中不是均匀的。FDA寡核苷酸缀合物摄取进入真菌孢子好于菌丝细胞。结果总结在表1至3中。

实施例8：寡核苷酸缀合物的抗增殖作用检查

在37℃和5％CO₂下，将REH细胞(人白血病前B细胞，DSM ACC22)或A549肿瘤细胞在含有10％胎牛血清(FCS；GIBCO-BRL)的OptiMEM中培养。实验前一天，将细胞进行传代培养，以便细胞浓度在24小时后达到大约1×10⁶/ml。将寡核苷酸或其缀合物溶于蒸馏水，得到1mM储备溶液，贮存在-20℃冰箱内。将细胞接种在24-孔平板上(含10％FCS的OptiMEM中1×10⁶个细胞/ml)。关于检查，将寡核苷酸衍生物稀释至2μM(在不含FCS的OptiMEM中)。在每孔中，将100μl寡核苷酸溶液与100μl细胞悬液混合(总体积200μl/孔；寡聚物浓度1μM，血清浓度5％FCS，细胞浓度0.5×10⁶个细胞/ml)。在37℃和5％CO₂下培养4小时后，每孔加入800μl含11％FCS的OptiMEM(细胞浓度现在是1×10⁵个细胞/ml，血清浓度现在是10％FCS)，继续培养。在37℃和5％CO₂下96小时后，用Casy1(来自Scharfe)测量细胞浓度。为此，将每孔中的细胞吸入1000μl取液器再吹出各10次，进行混合，立即用Casyton稀释1∶100(在细胞生长更强的情况下稀释1∶200)。测定细胞密度的平均值，在每种情况下一批有3份相同的样本。

实施例9：5′-F4′(CO-NH)-A^*T^*GAC^*GGAA^*T^*T^*C的合成

从经由3’-末端连接有1μmol N-苯甲酰胞苷的CPG载体开始，如实施例1所述合成寡核苷酸。为了引入硫代磷酸酯原子团(如果*存在于序列中)，利用碘水或Beaucage试剂进行氧化作用。然后如实施例2所述进行与5’-氨基-改性剂C6的偶联。用浓氨和80％乙酸去保护，得到145 OD(260)5’-氨基-连接子-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3’。

然后将10 OD(260)5’-氨基-连接子-寡核苷酸溶于16μl 0.2MTBK缓冲液与95μl DMF，使混合物与12.5μl二氯荧光素二乙酸酯羟基琥珀酰亚胺(MW：626.36)反应。氨基-连接子-寡核苷酸与羟基琥珀酰亚胺反应3小时后，加入2μl半浓缩的乙酸，将混合物在减压下浓缩。经过NAP柱^TM(Pharmacia)脱盐后，用丁醇进行沉淀。得到2.8 OD(260)所需的寡核苷酸二氯荧光素二乙酸酯缀合物。ESI-MS：4403.3(MW计算值4403.2)。

实施例10：5′-F2′-(CO-NH)-A^*T^*GAC^*GGAA^*T^*T^*C的合成

如实施例9所述制备5’-氨基-连接子-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3’寡聚物。将10 OD(260)5’-氨基-连接子-寡核苷酸溶于16μl 0.2M TBK缓冲液与95μl DMF，使混合物与12.5μl羧基荧光素二新戊酸酯羟基琥珀酰亚胺(MW：641.64)反应。氨基-连接子-寡核苷酸与羟基琥珀酰亚胺反应2小时后，另加入12.5μl羟基琥珀酰亚胺，继续反应2小时。然后加入2μl半浓缩的乙酸，将混合物在减压下浓缩。经过NAP柱^TM(Pharmacia)脱盐后，用丁醇沉淀。得到8.1 OD(260)所需的寡核苷酸荧光素二新戊酸酯缀合物。ESI-MS：4472.9(MW计算值4471.6)。

实施例11：5′-F9-A^*T^*GAC^*GGAA^*T^*T^*C的合成

如实施例9所述制备5’-氨基-连接子-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3’寡聚物。将10 OD(260)5’-氨基-连接子-寡核苷酸溶于16μl 0.2M TBK缓冲液与95μl DMF，使混合物与25μl乙酰氧基萘羧酸的活化酯反应。活化酯是这样制备的，将12.5μl 0.2M乙酰氧基萘羧酸(2.5mg的50μlDMF溶液)与12.5μl TBTU(4mg的50μl DMF溶液)混合，然后在环境温度下反应一小时。氨基-连接子-寡核苷酸与活化酯反应17小时后，加入2μl半浓缩的乙酸，将混合物在减压下浓缩。经过NAP柱^TM(Pharmacia)脱盐后，用丁醇沉淀。得到8.5 OD(260)所需的寡核苷酸乙酰氧基萘基缀合物。ESI-MS：4158.2(MW计算值4157.2)。

实施例12：5′-F8-A^*T^*GAC^*GGAA^*T^*T^*C的合成

如实施例9所述制备5’-氨基-连接子-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3’寡聚物。将10 OD(260)5’-氨基-连接子-寡核苷酸溶于16μl 0.2M TBK缓冲液与95μl DMF，使混合物与25μl乙酰氧基香豆素羧酸的活化酯反应。活化酯是这样制备的，将12.5μl 0.2M乙酰氧基香豆素羧酸(2.7mg的50μl DMF溶液)与12.5μl TBTU(4mg的50μl DMF溶液)混合，然后在环境温度下反应一小时。氨基-连接子-寡核苷酸与活化酯反应17小时后，加入2μl半浓缩的乙酸，将混合物在减压下浓缩。经过NAP柱^TM(Pharmacia)脱盐后，用丁醇沉淀。得到8.0 OD(260)所需的寡核苷酸乙酰氧基香豆素缀合物。ESI-MS：4178.5(MW计算值4175.2)。

实施例13：5’-F3-(dA)ndA*dA*dA(n＝17、47和77；F3＝FDA)的合成

从经由3’-末端用N6-苯甲酰基-2’-脱氧腺苷衍生的CPG载体开始，如实施例1所述合成寡核苷酸。前两步偶联之后，利用Beaucage试剂进行氧化，以引入硫代磷酸酯原子团(在序列中用*标记)，利用碘水进行所有其他氧化作用。然后如实施例2所述进行与5’-氨基-改性剂C6的偶联。用浓氨和80％乙酸去保护，经过制备型聚丙烯酰胺凝胶纯化，得到2.95 OD(260)5’-氨基-连接子-(dA)₁₇dA*dA*dA、4.9 OD(260)5’-氨基-连接子-(dA)₄₇dA*dA*dA和5 OD(260)5’-氨基-连接子-(dA)₇₇dA*dA*dA。在每种情况下，将5’-氨基-连接子-寡核苷酸溶于8μl 0.2M TBK缓冲液与62μl DMF，使混合物与1.6μl FDA异硫氰酸酯反应。反应3小时后，另加入FDA异硫氰酸酯，继续反应2小时。然后加入2μl半浓缩的乙酸，将混合物在减压下浓缩。经过NAP柱^TM(Pharmacia)脱盐后，用丁醇沉淀。得到1.5 OD(260)5’-F3-(dA)₁₇dA*dA*dA、2.2 OD(260)5’-F3-(dA)₄₇dA*dA*dA和0.9OD(260)5’-F3-(dA)₇₇dA*dA*dA。

实施例14：双重标记的寡核苷酸5’-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-F3(F3＝FDA)的合成

从允许在3’-末端引入C6-氨基-连接子的CPG载体(Petrie等(1992)《生物缀合物化学》3，85-87)开始，如实施例1所述合成寡核苷酸。利用碘水或Beaucage试剂进行氧化，以引入硫代磷酸酯原子团(如果*存在于序列中)。裂解除去最后一个二甲氧基三苯甲基保护基团后，使寡核苷酸的5’-末端与Cy3-CE亚磷酰胺(来自GlenResearch，Sterlin，VA；Catalog No.10-5913-xx)反应，用碘水氧化。用浓氨去保护(在70℃下2小时)，得到64 OD(260)粗产物。经过制备型聚丙烯酰胺凝胶纯化，得到3.8 OD5’-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-氨基-连接子-3’，将3.5 OD(260)溶于8μl 0.2M TBK缓冲液与62μl DMF，使混合物与1.6μmol FDA异硫氰酸酯反应。氨基-连接子-寡核苷酸与羟基琥珀酰亚胺反应3.5小时后，加入1μl半浓缩的乙酸，将混合物在减压下浓缩。经过NAP柱^TM(Pharmacia)脱盐后，用丁醇沉淀。得到3.5 OD(260)所需的双重标记的寡核苷酸5’-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-F3。ESI-MS：4926.2(MW计算值4927.1)。

实施例15：5’-F3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C(F3＝FDA)的合成

如实施例9所述制备5’-氨基-连接子-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3’寡聚物。将10 OD(260)5’-氨基-连接子-寡核苷酸溶于16μl 0.2M TBK缓冲液与95μl DMF，使混合物与25μl FDA异硫氰酸酯(5mg的100μlDMF溶液)反应。氨基-连接子-寡核苷酸与异硫氰酸酯反应3小时后，另加入5μl异硫氰酸酯，继续反应2小时。然后加入2μl半浓缩的乙酸，将混合物在减压下浓缩。经过NAP柱^TM(Pharmacia)脱盐后，用丁醇沉淀。得到8.5 OD(260)所需的寡核苷酸荧光素二乙酸酯缀合物。ESI-MS：4418.4(MW计算值4418.5)。

实施例16：不同长度寡核苷酸缀合物5’-F3-(dA)_ndA*dA*dA(n＝17、47和77；F3＝FDA)的细胞摄取对比

利用REH细胞，原则上如实施例7所述进行来自实施例12的不同长度与分子量的缀合物的细胞摄取。借助流式细胞计进行量化。60分钟后，5’-F3-(dA)₁₇dA*dA*dA(“A20”)的相对荧光信号是49，5’-F3-(dA)₄₇dA*dA*dA(“A50”)的相对荧光信号是34，5’-F3-(dA)₇₇dA*dA*dA(“A80”)的相对荧光信号是91。惊人的是，REH细胞对具有最大寡核苷酸部分、即包含总计80个核苷酸的FDA缀合物的摄入是最有效的。

实施例17：不同衍生化的寡核苷酸缀合物的细胞摄取对比

荧光素二新戊酸酯是与荧光素二乙酸酯(FDA)有联系的化合物，它增加了酯基的稳定性。利用流式细胞计检查相应寡核苷酸缀合物的摄取。新戊酸酯对碱和酯酶的稳定性增加导致相应寡核苷酸缀合物的摄取减少。因而，60分钟后测量荧光素二乙酸酯缀合物的相对荧光为195，而相应荧光素二新戊酸酯缀合物的相对荧光仅为55。

实施例18：来自实施例13的双重标记的寡核苷酸缀合物5’-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-FDA的细胞摄取检查

FAC Scan显示Cy3寡核苷酸F3缀合物被REH细胞迅速摄入。将细胞用寡核苷酸缀合物/Cellfectin复合物处理，得到相似但更不均匀的摄取。FDA缀合物的效果大大干扰Cellfectin寡核苷酸复合物的效果。

还检查了寡核苷酸中两种不同的标记基团在与细胞培养中的共同定位作用，以排除所测量的荧光仅基于所裂解的FDA或荧光素的可能性。Cy3寡核苷酸F3缀合物具有与5’-末端共价结合的花青染剂和与3’-末端共价结合的FDA。图9显示REH细胞与Cy3寡核苷酸F3缀合物培养4小时后的绿色与红色荧光。由于可以观察到细胞中两种标记物的共同定位作用，可以断定寡核苷酸是以完整形式被摄入的。仅有FDA部分的乙酰基大概被酯酶水解，因为非荧光性FDA原子团明显转化为荧光性荧光素原子团。Cy3/FDA缀合物的摄取是非常迅速的，因为加入后仅7分钟即可检测到两种标记物。

检查了四种浓度的来自实施例4的寡核苷酸FDA缀合物CO_1对A549肿瘤细胞的抗增殖活性。没有加入透入增强剂，缀合物即抑制增殖。没有F3缀合物的相应寡核苷酸(ON1)仅在与透入增强剂(CellFectin，Gibco-BRL)形成复合物之后才抑制增殖。结果如表4所示。

表1：FDA-标记的寡核苷酸(寡核苷酸-FDA缀合物)摄取进入哺乳动物细胞的荧光显微检查

哺乳动物细胞：细胞系名称	5分钟后的荧光		20分钟后的荧光		60分钟后的荧光		120分钟后的荧光
									A	B	A	B	A	B	A	B
	REH	+	-	+	-	++	-	++									*
K562											(+)		+		+
	Lu 18					(+)		+
KB3-1													+		+
	Ptk2					(+)		+

A：与FDA-标记的寡核苷酸CO_1和CO_3培养

B：与荧光素-标记的寡核苷酸CO_2和CO_4培养

(+)弱摄取

+中等摄取

++非常强的摄取

-没有摄取

*仅摄取进入受损细胞

表2：FDA-标记的寡核苷酸摄取进入昆虫细胞的荧光显微检查(关于图例说明见表1)

昆虫细胞	20分钟后的荧光		60分钟后的荧光		120分钟后的荧光
							A	B	A	B	A	B
	SF9细胞	+	-	++	-	++							-

表3：FDA-标记的寡核苷酸摄取进入各种生物体的荧光显微检查

生物体	20分钟后的荧光		60分钟后的荧光		120分钟后的荧光
							A	B	A	B	A	B
	枯草芽孢杆菌(6633)#	-	-	-	-	+							-
L.bulgaricus#							-	-	+	-	+	-
	大肠杆菌(K12)#	-	-	+	-	+							-
Yarrowia lipolytica#(野生型H 222)							-	-	-	-	+	-
	酿酒酵母#	-	-	-	-	+							-
Fusarium clumorum(大刀镰孢)孢子(JP15，真菌)							(+)	-	+	-	+	-
	Reticulomyxa filosa孢囊(淡水阿米巴虫)	-	-	++特别是核	-	++							-
Haematococcuspluvialis(绿藻，鞭毛虫)							-	-	+	-	+	-
	Chlorogonium sp.(绿藻，鞭毛虫)	-	-	+	-	+							-
Dunaliella salina(海洋硅藻)							-	-	+	-	+	-

A：与FDA-标记的寡核苷酸CO_1和CO_3培养

B：与荧光素-标记的寡核苷酸CO_2和CO_4培养

(关于评价的图例说明见表1)

#仅被摄入这些迅速分裂生物体的一些细胞

表4：实施例8结果

物质	细胞密度	抑制％
			无	5.96	-
FDA	6.05	-1.5
			100nM CO_1	5.65	5.2
200nM CO_1	5.3	11.1
			500nM CO_1	5.03	15.6
1000nM CO_1	4.16	30.2

表5：FDA缀合物(来自实施例15的A20、A50、A80)的转染作为长度的函数

时间[分钟]         荧光            荧光         荧光

                   A20             A50         A80

    0              0.0103          0.0103      0.0103

   10              11.71           8.9         43.31

   20              39.68           28.06       88.36

   30              48.59           34.38       91.28

   40              54.7            38.75       92.35

   50              58.66           41.64       93.19

   60              62.13           44.33       93.62

表6：荧光素二乙酸酯与荧光素二新戊酸酯寡核苷酸缀合物的细胞摄取对比(实施例16，图8)

       时间[分钟]          荧光           荧光

                           K39            K41

        0                  2,66           2.75

        10                 72.37          8.49

        20                 112.34         18.17

        30                 142.97         28.67

        40                 164.64         38.34

        50                 184.96         46.62

        60                 195.57         55.26

        70

        80                 218.12         68.02

        90

        100                231.04         83.7

        110

        120                253.84         97

                              序列表

<110>Aventis Pharma Deutschland GmbH

<120>缀合物及其制备方法和用于跨生物膜转运分子的用途

<130>1999/L045

<140>

<141>

<150>19935302.6

<151>1999-07-28

<160>63

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<223>合成序列描述：经修饰的寡核苷酸

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<400>1

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<223>合成序列描述：经修饰的寡核苷酸

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tgccggccgg gc                                                          12

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<223>合成序列描述：寡核苷酸

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gcgtttgctc ttcttcttgc g                                                21

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tattccgtca t                                                           11

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ttccgtcatc gctcctcagg gg                                               22

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ggctgccatg gtccc                                                       15

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cacgttgagg ggcat                                                       15

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gatggagggc ggcatggcgg g                                                21

Claims (24)

1、一种缀合物，它包含寡核苷酸和至少一个式I芳基，

其中

芳基是这样的基团，它含有至少一个具有芳族特征的环；

X是O或N；

Y是O、S或NH-R²；

R¹是取代或未取代的C₁-C₂₃烷基原子团，它可以是直链或支链的，并且可以含有双键和/或叁键；

R²是取代或未取代的C₁-C₁₈烷基原子团，它可以是直链或支链的，并且可以含有双键和/或叁键；

n是大于或等于1的整数，

其中该芳基与该寡核苷酸是直接经由化学键或间接经由化学基团连接的，其中如果通过该寡核苷酸的核苷酸间磷酸二酯键相连接，那么该化学基团不是CH₂-S基团。

2、如权利要求1所要求保护的缀合物，其中该寡核苷酸是分子量＞500道尔顿的大分子。

3、如权利要求1所要求保护的缀合物，其中该寡核苷酸是经过修饰的。

4、如权利要求1所要求保护的缀合物，其中该寡核苷酸是分子量＜500道尔顿的低分子量化合物。

5、如权利要求1至4中任一项所要求保护的缀合物，其中该化学基团与该芳基一起具有式II

其中芳基、X、Y和R¹是如上所定义的，并且

R³是该化学基团。

6、如权利要求5所要求保护的缀合物，其中R³为-C(＝O)基团或-NH-C(＝S)基团。

7、如权利要求1至4中任一项所要求保护的缀合物，其中该化学基团与该芳基一起具有式F1至F11之一：

8、权利要求1要求保护的缀合物，其中该芳基直接经由化学键或者间接经由化学基团与如下连接：

5’-末端，和/或

3’-末端，和/或

一个或多个核碱基，和/或

一个或多个糖基，和/或

一个或多个核苷间键，

其中如果经由核苷酸间磷酸二酯键相连接，那么该化学基团不是CH₂-S基团。

9、用于制备权利要求1所述缀合物的方法，该缀合物包含寡核苷酸和至少一个芳基，其中

a)制备寡核苷酸，它在将与芳基连接的位置具有反应性官能；

b)制备芳基；和

c)使该寡核苷酸与该芳基反应，得到缀合物。

10、如权利要求9所要求保护的方法，其中该反应性官能是氨基、巯基、氯乙酰基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、羧酸基、N-羟基琥珀酰亚胺基或碳酰氯基。

11、如权利要求9或10所要求保护的方法，其中寡核苷酸与芳基的反应是在pH≤7.5下进行的。

12、如权利要求9或10所要求保护的方法，其中寡核苷酸与芳基的反应是在pH7.0下进行的。

13、用于体外跨膜转运寡核苷酸的方法，它包括

a)制备缀合物，在该缀合物中寡核苷酸与至少一个式I或II芳基连接，和

b)将该缀合物与该膜温育。

14、权利要求13的方法，其中所述缀合物被转运进入细胞，且没有裂解除去该芳基。

15、如权利要求14所要求保护的方法，其中该细胞是真核生物细胞或原核生物细胞。

16、如权利要求14或15所要求保护的方法，其中该细胞是细菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。

17、如权利要求14或15所要求保护的方法，其中该细胞是人细胞。

18、如权利要求14或15所要求保护的方法，其中该细胞是肿瘤细胞。

19、用于制备药物的方法，它包括

a)制备寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在将与芳基连接的位置含有至少一个反应性官能，

b)制备式I或II芳基，

c)使该寡核苷酸或其衍生物与该芳基反应，得到缀合物。

20、如权利要求19所要求保护的方法，其中还包括将该缀合物与其他添加剂和/或赋形剂混合。

21、一种药物，其包含如权利要求1至8中任一项所要求保护的缀合物。

22、一种诊断助剂，其包含如权利要求1至8中任一项所要求保护的缀合物。

23、一种检验试剂盒，其包含如权利要求1至8中任一项所要求保护的缀合物。

24、权利要求1至8中任一项要求保护的缀合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

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