CN1124980A - 具有改良抗流感活性的经修饰寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了比先前描述的寡核苷酸具有更强的抑制流感病毒复制或增殖效力的经修饰抗流感寡核苷酸。较强的效力是由如嵌合或杂种骨架、赋予核酸酶抗性的末端帽结构和/或自身互补区域的结构特征所引起的。

Description

具有改良抗流感活性的 经修饰寡核苷酸
本申请是1992年7月2日提交的编号为07/909,069的部分继续申请，也是1992年7月23日提交的编号为07/918,239的部分继续申请，也是1991年5月10日提交的编号为07/69 8,568的部分继续申请。
本发明涉及反义寡核苷酸，本发明尤其涉及可抑制流感病毒复制或增殖的经修饰的寡核苷酸。
甲型流感病毒是膜包裹病毒，其基因组是成段的负链RNA。在A株(Strain)和B株的八个单链RNA片段、在C株的七个单链RNA片段上存在十个流感病毒基因。片段的大小不同(长度在890至2341个核苷酸之间)，每一个都是不同mRNA合成的模板。流感病毒的病毒粒子含有自这些模板合成mRNA所必需的病毒特异性RNA聚合酶，当这种特异性聚合酶缺乏时，流感病毒RNA负链不具感染力。当流感病毒mRNA聚合酶从细胞mRNA或mRNA前体的5＇末端取走12至15个核苷酸并使用该外来寡核苷酸作为引物时，就会发生mRNA转录的起始。通常，通过此过程得到的mRNA只编码一种蛋白质。M RNA和NS RNA也编码剪接过的mRNA，这可导致这两个片段的每一个都产生两种不同的蛋白质。
流感病毒感染人和动物(例如猪、鸟、马)，可导致急性呼吸道疾病。已有大量尝试想制出能有效抵抗流感病毒的疫苗。然而没有一个完全成功，尤其是在长期这个基础上。这至少部分是由于流感病毒基因组成片段的特征，使得通过片段的重排，以众多形式存在成为可能。例如，已提出动物和人流感病毒之间RNA片段可相互交换以导致将新的抗原亚型引入两个种群中。因此由于新亚型(抗原“转变”)的出现使得长期接种法失败。另外，病毒的表面蛋白质，血凝素和神经氨酸苷酶经常有细微的抗原变化(抗原“漂变”)。这一高度变化性解释了对特异流感病毒产生的特异免疫力不能建立对新变异体的防护的原因。因此，需要另外的抗病毒策略。尽管乙型和丙型流感病毒与甲型流感病毒相比较少引起临床疾病，化学抗病毒药也应有助于控制这些病毒引起的感染。
因此，人们很有兴趣开发能够抑制流感病毒复制或增殖的反义寡核苷酸。这种反义寡核苷酸有希望提供较宽的抗不同流感病毒株的保护，因为它们可被设计为能与多种流感病毒株上存在的流感病毒基因组的保守区域杂交。
Agrawal等人在美国专利5,194,428中的内容列入本文作为参考，它公开了具有某种经修饰的核苷酸间连键的寡核苷酸，通过与流感病毒PB1聚合酶基因杂交可抑制流感病毒的复制。Cowsert等人在WO92/03454(1992)中公开了通过用反义寡核苷酸、与流感病毒聚合酶1、2或3、或血凝素、核蛋白、神经氨酸苷酶、基质蛋白或非结构蛋白质基因杂交，或者与不同的剪接连接位点或包装序列杂交，可抑制流感病毒增殖。
Pederson等人在美国专利5,149,797和5,XXX,XXX(编号为07/839,472，于1992年12月24日被准许)中的内容列入本文作为参考，它公开了嵌合混合的磷酸酯骨架的寡核苷酸，此寡核苷酸具有与RNase H失活片段(inactivating segment)相邻的RNase H激活片段。
因此，反义寡核苷酸有希望成为抗流感的治疗剂。然而，同其它任何这类药剂一样，仍需要改善它以使其抑制流感病毒复制或增殖的效力更高。这种经改良的反义寡核苷酸有助于研究流感病毒基因组中的哪个区域是具有宽的跨品系抑制性，和作为抗流感治疗剂应用的最佳候选者。
本发明提供了经修饰的寡核苷酸，它与先前已知的寡核苷酸相比，具有较高的抑制流感病毒复制或增殖的效力。这些经修饰的寡核苷酸的特征在于：具有与来源于流感病毒的必需核酸充足互补的核苷酸序列，以使之能与细胞中这种流感病毒的核酸杂交。在优选的实施方案中，这种必需核酸是流感病毒PB1、2或3聚合酶基因或血凝素、核蛋白、神经氨酸苷酶、基质蛋白或非结构蛋白质基因的一部分，或者是不同的流感病毒剪接连接位点或包装序列的一部分。
在不同的实施方案中，根据本发明的经修饰的寡核苷酸具有一种或多种类型的经修饰的核苷酸间连键。在优选的实施方案中，至少一些经修饰的核苷酸间连键是硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键。在一些优选的实施方案中，硫代磷酸酯核苷酸间连键存在于经修饰的寡核苷酸中，后者还含有其它修饰，即非磷酸二酯键。优选地，这些其它经修饰的核苷酸间连键是烷基膦酸酯键或烷基硫代膦酸酯键。最优选地，这些其它经修饰的核苷酸间连键存在于寡核苷酸的一端或两端或者在其附近。
在另外的根据本发明的经修饰寡核苷酸的优选实施方案中，硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键存在于具有一个或多个经修饰核苷的寡核苷酸中。优选地，这种经修饰的核苷是2＇-O烷基核苷。最优选地，至少一些经修饰的核苷位于寡核苷酸的一端或两端或者在其附近。
在另外的根据本发明的经修饰寡核苷酸的优选实施方案中，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷酸间连键存在于一端或两端具有帽结构因而被赋予核酸外切酶抗性的寡核苷酸中。优选地，这种帽结构至少位于分子的3＇末端。这种帽结构也可存在于根据本发明的经修饰寡核苷酸所有实例的一端或两端，优选至少存在于寡核苷酸的3＇末端。
在另一个根据本发明的经修饰寡核苷酸的优选实施方案中，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷酸间连键存在于一寡核苷酸中，此寡核苷酸通过位于一端或两端或其附近的，优选至少为3＇末端或其附近的、涉及自身互补区域的核苷酸，来达到自身的稳定。该寡核苷酸因而形成了发夹样结构。
这些根据本发明的经修饰的寡核苷酸中的每一种与和相同基因杂交的任何已知的寡核苷酸或经修饰的寡核苷酸相比，具有更强的抑制流感病毒复制或增殖的效力。这些根据本发明的经修饰的寡核苷酸中的每一种也可任选地含有其它对寡核苷酸的糖或碱基的修饰，也可任选地具有除硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯键以外的其它核苷酸间连键。
图的简要描述
图1所示为流感病毒PB1(聚合酶1)基因的核苷酸序列，由此可制得互补的反义寡核苷酸。
图2所示为根据本发明的自身稳定化抗流感的经修饰寡核苷酸。
图3所示为根据本发明的自身稳定化抗流感的经修饰寡核苷酸的可替换形式。
图4所示为可赋予寡核苷酸核酸外切酶抗性的一些优选的帽结构。
图5所示为5＇端加帽、3＇端加帽、未加帽的寡核苷酸的体内降解模式。
图6所示为自身稳定化和非自身稳定化寡脱氧核苷酸磷酸二酯的DNA聚合酶I的3＇-核酸外切酶降解模式。
图7所示为自身稳定化和非自身稳定化寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯的RNA聚合酶I的3＇-核酸外切酶降解模式。
优选实施方案的详细描述
本发明涉及具有抗流感活性的反义寡核苷酸。本文的活体内具有抗流感活性的经修饰寡核苷酸被称为经修饰抗流感寡核苷酸。本发明所提供的经修饰抗流感寡核苷酸与已知的与相同基因杂交的寡核苷酸或经修饰寡核苷酸相比，所具有的抑制流感病毒复制或增殖的效力更强。根据本发明的经修饰寡核苷酸所具有的特别优选的特征将在以下的每个优选实施方案中更详细地讨论。除了这些特征以外，根据本发明的经修饰寡核苷酸可任选地具有附加的核糖核苷酸、2-取代的核糖核苷酸、和/或脱氧核糖核苷酸单体，它们中的任何一个都通过包括本领域中已知的任何核苷酸间连键的5＇至3＇连键连接在一起。优选地，这种经修饰寡核苷酸可任选地含有磷酸二酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基醚、乙酰胺化物(acetamidate)、氨基甲酸酯、硫醚、桥连氨基磷酸酯、桥连亚甲基膦酸酯、桥连硫代磷酸酯和/或砜核苷酸间连键。本技术领域普通技术人员会认为含有这些核苷酸间连键中任一个的寡核苷酸的合成对他们来说都是熟知的，正如Uhlmann和Peyman在Chemical Re-views 90：543-584(1990)以及Schneider和Banner在TetrahedronLett.31：335(1990)中的论文所阐明的那样。优选地，根据本发明的经修饰寡核苷酸应含有总量约为从6至100的单体。这种经修饰的寡核苷酸也可任选地含有经修饰的核酸碱基和/或糖基，以及附加的取代基，例如二胺、胆甾烯基或其它亲脂基团。
根据本发明的经修饰寡核苷酸的各种优选实施方案示于下列表I。尽管这些实施方案都具有来自流感病毒PB1聚合酶基因相同区域的核苷酸序列，本技术领域的普通技术人员会认为，通过将根据本发明的经修饰寡核苷酸较优选实施方案的结构特征与具有流感病毒的其它必需核酸序列互补的寡核苷酸结合，也可加强这些寡核苷酸之抗流感效力。为了本发明的目的，互补意味着在生理条件下具有与必需核酸序列杂交的序列。流感病毒的必需核酸序列指的是流感病毒复制或增殖所需要的核酸序列。这种必需的核酸序列可来自任何已知的流感病毒株。例如表I中美国专利5,194,428所示，这种寡核苷酸也可具有来自流感病毒PB1聚合酶基因(聚合酶1)的其它序列，其内容引入本文作为参考。实际上来自流感病毒PB1(聚合酶1)基因[SEQ.ID.NO.1](见图1)的任何序列都可作为根据本发明的经修饰寡核苷酸的基础。另外，也可使用来自其它流感病毒序列或基因的序列(见表II)。实际上，根据本发明的经修饰寡核苷酸较优选实施方案的结构特征应可加强具有在细胞中可与流感病毒任何必需核酸序列杂交的核苷酸序列的任何反义寡核苷酸的抗流感活性。
                    表I具有高的抗流感活性的经修饰寡核苷酸化合物名称         序列和结构                    [SEQ.   IDNo.1CMPD A      CAGAGCAAAATCATCAGAAGA1             [SEQ.ID NO.2]CMPD B      CAGAGCAAAATCATCAGAAGA2             [SEQ.ID NO.31CMPD C      CAGAGCAAAATCATCAGAAGA3             [SEQ.ID NO.4]CMPD D      CAGAGCAAAATCATCAGAAGA3             [SEQ.ID NO.5]CMPD E      CAGAGCAAAATCATCAGAAGA2             [SEQ.ID NO.6]CMPD F      CAGAGCAAAATCATCAGAAGA2             [SEQ.ID NO.7]CMPD G      CAGAGCAAAATCATCAGAAGA3             [SEQ.ID NO.8]CMPD H      CAGAGCAAAATCATCAGAAGA3             [SEQ.ID NO.9]CMPD I      CAGAGCAAAATCATCAGAAGA-C12 4         [SEQ.ID NO.10]CMPD J      AGAGCAAAATCATCAGAAG3               [SEQ.ID NO.12]CMPD K      GAGCAAAATCATCAGAA3                 [SEQ.ID NO.14]CMPD L      CAGAGCAAAATCATCAGAAGA3             [SEQ.ID NO.15]CMPD M      CAGAGCAAAATCATCAGAAGATTCTGATGA5    [SEQ.ID NO.16]0 所有序列以5＇至3＇表示，未划线区域是寡核苷酸硫代磷酸酯。1 下面划线处表示通过甲基膦酸酯核苷酸间连键连接的核苷酸。2 下面划线处表示通过甲基硫代膦酸酯连键连接的核苷酸。3 下面划线处表示2＇-OMe核苷酸。4 C12表示帽结构。5 自身稳定化的
               表II其它的有抗流感潜力的寡核苷酸序列序列                           靶子         [SEQ.ID.No.1]CTT TCC ATA TTG AAT ATA AT    AUG片段1      [SEQ.ID.No.17]
                          聚合酶3ACA TCC ATT CAA ATG GTT TG    AUG片段2      [SEQ.ID.No.18]
                          聚合酶1TCT TCC ATT TTG GAT CAG TA    AUG片段3      [SEQ.ID.No.19]
                          聚合酶2GCC TTC ATT TTG GTT GTT TT    AUG片段4      [SEQ.ID.No.20]
                          血凝素GAC GCC ATG ATT TTG ATG TC    AUG片段5      [SEQ.ID.No.21]GGA TTC ATT TTA AAC CCC TG    AUG片段6      [SEQ.ID.No.22]
                          神经氨酸苷酶AGA CTC ATC TTT CAA TAT CT    AUG片段7      [SEQ.ID.No.23]
                          基质蛋白GAT AGA GAG AAC GTA CGT TT    左剪接        [SEQ.ID.No.24]
                          连接片段7TCT GAT AGG CCT GCA AAT TT    右剪接        [SEQ.ID.No.25]
                          连接片段7GGA TCC ATT ATG TCT TTG TC    AUG片段8      [SEQ.ID.No.26]
                          非结构蛋白质CAT GTC GGT TAG GTA ACG CG    剪接分支      [SEQ.ID.No.27]
                          片段8GCA ATC TAC CTG AAA GCT TG    右剪接        [SEQ.ID.No.28]
                          连接片段8AGC AGT ATG TCC TGG AAG AG    左剪接        [SEQ.ID.No.29]
                          连接片段8AAA ACG ACC TTG TTT CTA CT    包装          [SEQ.ID.No.30]
                          序列片段1AAA AAT GCC TTG TTC CTA CT    包装          [SEQ.ID.No.31]
                          序列片段2AAA AGT ACC TTG TTT CTA CT    包装          [SEQ.ID.No.32]
                          序列片段3AAA ACA CCC TTG TTT CTA CT    包装          [SEQ.ID.No.33]
                          序列片段4AAA ATA CCC TTG TTT CTA CT    包装          [SEQ.ID.No.34]
                          序列片段5AAA AAC TCC TTG TTT CTA CT    包装          [SEQ.ID.No.35]
                          序列片段6AAA ACT ACC TTG TTT CTA CT    包装          [SEQ.ID.No.36]
                          序列片段7AAA ACA CCC TTG TTT CTA CT    包装          [SEQ.ID.No.37]
                          序列片段8
在第一个优选的实施方案中，根据本发明的经修饰抗流感寡核苷酸的形式是混合骨架的嵌合寡核苷酸，它具有一个或多个通过硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷酸间连键连接的核苷酸区域(“硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯区域”)以及一个或多个通过烷基膦酸酯核苷酸间连键连接的核苷酸区域(“烷基膦酸酯区域”)。在此实施方案中，至少一个烷基膦酸酯区域优选地包括在寡核苷酸5＇末端或其附近和/或在3＇末端或其附近的核苷酸。为了本发明的目的，“在寡核苷酸的5＇末端或其附近或在3＇末端或其附近”指的是包括自寡核苷酸的5＇或3＇末端起约5个核苷酸的范围内的至少一个核苷酸。优选地，烷基膦酸酯区域包含约为2个至10个的由烷基膦酸酯键连接的相邻核苷酸。优选地，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯区域包含至少3个，直至约100个由硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键连接的相邻核苷酸。根据本发明此实施方案的经修饰抗流感寡核苷酸的例子示于表I中的CMPD A。
根据本发明此实施方案的经修饰抗流感寡核苷酸可通过固相法合成，在硫代磷酸酯区域用H-膦酸酯化学法和硫氧化法，在烷基膦酸酯区域改换为烷基亚膦酰胺化学法。优选的H-膦酸酯法可按照Agrawal等人在美国专利5,149,798中所述方法进行，其内容在此引入作为参考。烷基亚膦酰胺化学法在本技术领域是公知的，如Agrawal和Goodchild在Tetrahedron Lett.28：3539-3542(1987)中所述。如美国专利5,151,510中所阐明的，含有二硫代磷酸酯的寡核苷酸的合成在本技术领域中也是公知的，其内容引入本文作为参考(也见Marshall和Caruthers,Science 259：1564-1570(1993)，及其所列参考文献)。
在第二个较优选的实施方案中，根据本发明的经修饰抗流感寡核苷酸的形式是混合骨架的嵌合寡核苷酸，它具有一个或多个通过硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷酸间连键相连的核苷酸区域(“硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯区域”)，以及一个或多个通过烷基硫代膦酸酯或芳基硫代膦酸酯核苷酸间连键相连的核苷酸区域(“烷基硫代膦酸酯区域”)。在此实施方案中，至少一个烷基硫代膦酸酯区域优选包括寡核苷酸5＇末端或其附近和/或3＇末端或其附近的核苷酸。优选地，烷基硫代膦酸酯区域包含约为2至10个的由烷基硫代膦酸酯键连接的相邻核苷酸。优选地，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯区域包含至少3个直至100个由硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键连接的相邻核苷酸。根据本发明此实施方案的经修饰抗流感寡核苷酸的例子示于表I中的CMPD B、CMPD E和CMPD F。
根据本发明此实施方案的经修饰抗流感寡核苷酸可通过固相法合成，用不同的化学方法合成每一区域。如第一实施方案所述合成硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯区域。通过烷基亚磷酸酯键将两个或多个核苷结合到一起，然后氧化法硫化烷基亚磷酸酯键以形成烷基硫代膦酸酯键，从而合成烷基硫代膦酸酯区域。此合成步骤在实施例1中详细阐明。
在第三个优选的实施方案中，根据本发明的经修饰抗流感寡核苷酸的形式是杂种寡核苷酸，它具有脱氧核糖核苷酸区域(“脱氧核糖核苷酸区域”)以及核糖核苷酸或2＇-取代的核糖核苷酸区域(“核糖核苷酸区域”)。优选地，约从一个至所有的核苷酸间连键是硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键。较优选的2＇-取代的核糖核苷酸是卤素、氨基、烷基、芳基或低级烷基(1-6个碳原子)取代的核糖核苷酸，尤其是OMe(O-甲基)-核糖核苷酸。优选地，至少有些核糖核苷酸区域包括位于寡核苷酸5＇末端或其附近和/或3＇末端或其附近的核苷酸。最优选地，每个核糖核苷酸区域包含约从2，优选地从4至100个相邻核糖核苷酸和/或2＇-取代的寡核苷酸。脱氧核糖核苷酸区域可任选。当其存在时可含有约从1至100的相邻脱氧核糖核苷酸。根据本发明此实施方案的经修饰抗流感寡核苷酸的例子示于表I中的CMPD C、CMPD D、CMPD G、CMPD H、CMPD K、CMPDM和CMPD N。
根据本发明此实施方案的经修饰抗流感寡核苷酸典型地可通过固相法合成，优选地通过H-膦酸酯法，它对脱氧核糖核苷酸区域使用脱氧核苷酸H-膦酸酯，对核糖核苷酸区域使用核糖核苷酸或2＇-取代的核糖核苷酸H-膦酸酯。
在第四个优选的实施方案中，根据本发明的经修饰抗流感寡核苷酸以在其5＇和/或3＇末端具有帽结构因而赋予其核酸外切酶抗性的寡核苷酸的形式存在。优选地，这种经修饰的寡核苷酸也具有1个至约所有个经修饰(非磷酸二酯)的核苷酸间连键。优选的帽结构包括那些示于图4中的基团、以及低级烷基(C1-C12)或醇基。较优选的经修饰核苷酸间连键包括磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基醚、乙酰胺化物(acetamidate)、氨基甲酸酯、硫醚、桥连氨基磷酸酯、桥连亚甲基膦酸酯、桥连硫代磷酸酯、砜、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯键。
可根据本技术领域公知的方法合成根据本发明此实施方案的经修饰抗流感的寡核苷酸(如Uhlmann和Peyman，Chemical Reviews90：543-584(1990)；Schneider和Banner，Tetrahedron Lett.31：335(1990))。对于在3＇末端具有帽结构的寡核苷酸而言，合成方案中帽结构先可逆地结合于固体支持物上，再与第一个核苷酸单体结合。对于在5＇末端具有帽结构的寡核苷酸而言，合成方案中在加入最后一个核苷酸单体后，将帽结构与寡核苷酸的末端结合。
在第五个实施方案中，经修饰的抗流感寡核苷酸通过具有可在寡核苷酸分子内杂交以形成抗核酸外切酶的发夹样结构的自自互补区域来自身稳定化。根据本发明此实施方案的经修饰抗流感寡核苷酸通常的特征是具有两个区域：与流感病毒杂交的区域和自身互补区域。与流感病毒杂交的区域具有与流感病毒必需核酸序列互补的核苷酸序列。优选地，此区域约有6至100个核苷酸。本发明此实施方案的一种类型示于图2。在此类型中，与流感病毒杂交的区域以相连的长方块表示，自身互补区域以相连的圆圈表示。靶流感病毒mRNA分子的互补核酸序列以相连的菱形表示。核苷酸间的氢键以点表示。寡核苷酸是稳定的，即通过靶杂交区域和自身互补区域之间的碱基配对和/或通过自身互补区域内互补序列之间的碱基配对而获得对核酸外切酶降解的抗性。当该寡核苷酸遇到具有互补核酸序列的流感病毒核酸分子时，寡核苷酸的流感病毒杂交区域和自身互补区域之间的碱基配对被破坏并由该寡核苷酸的流感病毒杂交区域和该核酸分子的互补核酸序列之间的碱基配对所取代。碱基配对的破坏和取代的发生是由于，通过靶核酸序列和靶杂交区域之间的杂交所形成的分子间碱基对结构与通过自身互补寡核苷酸所形成的分子内碱基对结构相比，具有更好的热动力学稳定性。
根据本发明此实施方案的寡核苷酸的第二种类型与第一种类型的作用方式相同，但是它通过自身互补碱基配对形成了不同的结构。这种可替换的类型形成了如图3所示的锤样结构。在此类型中，自身互补区域含有可与自身互补区域内的其它寡核苷酸序列碱基配对的寡核苷酸序列。该自身互补区域也可含有与流感病毒杂交区域互补的寡核苷酸序列。
根据本发明的自身稳定化寡核苷酸的第二个重要区域是自身互补区域。该自身互补区域含有与寡核苷酸内其它寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列。这些其它的寡核苷酸序列可在流感病毒杂交区域内，或者在自身互补区域内，或者它们也可跨越两个区域。该互补序列形成碱基对，导致示于图2的发夹结构的形成或示于图3的锤样结构的形成。发夹结构或锤样结构可具有由非配对碱基核苷酸所引起的环，如图2所示的发夹结构；或者也可不具有这种环，如图3所示的锤样结构。通过自身互补区域的分子内杂交所形成的碱基对数目可以不同，但是应足以维持双链结构以使3＇末端不与核酸内切酶接触。通常需要约4个或更多个碱基对以维持这种双链结构。在优选的实施方案中，自身稳定化的寡核苷酸中形成了约10个分子内碱基对，这10个碱基对是连续的并包括3′-最末端核苷酸。当然，分子内碱基配对也可以很广泛以至于可涉及寡核苷酸的每个核苷酸。优选地，它是涉及约50个或少于50个核苷酸的自身互补区域。
根据此实施方案的寡核苷酸如第四个实施方案所述，可具有1个至约所有个经修饰的核苷酸间连键。优选地，至少或是流感病毒杂交区域或是自身互补区域，最优选地是两者都含有通过硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯键结合的约2个至约所有的核苷酸。
根据本发明此实施方案的经修饰抗流感寡核苷酸的例子是示于表I中的CMPD O。
本领域中的普通技术人员可认为，上述各个优选实施方案的特征可以联合以产生具有更高抗流感活性的其它的实施方案。因此，本发明期望经修饰的杭流感寡核苷酸具有本文中所描述的嵌合特性、杂交特性、帽结构和自身稳定化特性的每一种可能的联合。
本发明优选的每一个实施方案比先前技术中与相同的流感病毒mRNA杂交的反义寡核苷酸具有更强的抑制流感病毒复制或增殖的能力。例如，美国专利5,194,428，讲述了可抑制流感病毒复制的经修饰的寡核苷酸。在那些经修饰的寡核苷酸中，与流感病毒PBl(聚合酶1)基因杂交的是寡核苷酸硫代磷酸酯。在本研究中，检测了一个与流感病毒PBl聚合酶基因杂交的寡核苷酸硫代磷酸酯的抑制流感病毒复制的能力，并与本发明优选的各个实施方案相比较。所检测的本发明的每一个实施方案相对于同相同基因的相同位点结合的寡核苷酸硫代磷酸酯来说，表现出令人惊奇的、改良的抗流感效力。如下列表III所示，根据本发明的经修饰抗流感寡核苷酸将百分之五十抑制浓度(IC50)降低了2至近15倍。
                         表III寡核苷酸的抗-流感活性寡核苷酸                   IC50(ug/ml)          降低倍数CAGAGCAAAATCATCAGAAGA1       3172                  -CMPD A                        N.T.                    -CMPD B                         34                   9.3CMPD C                         55                   5.8CMPD D                         582                 5.5CMPD E                        N.T.                    -CMPD F                        178                   1.8CMPD G                        147                   2.2CMPD H                         59                   5.4CMPD I                         45                   7.0CMPD J                         272                11.7CMPD K                         222                14.4CMPD L                         61                   5.2CMPD M                        175                   1.8CMPD N                        1042                 3.0CMPD O                         232                13.81、寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯对照2、两次实验的平均值N.T.没有检测
这种寡核苷酸可用于不同的目的。首先可用于研究确定哪个流感病毒基因和这种基因内位点可为具有广泛的抗多种流感病毒株效力的反义寡核苷酸提供最佳基础。第二，可用于确定什么结构特征或结构特征的联合可提供最强的体外和体内抗流感病毒效力。最后，这种寡核苷酸可用作治疗流感病毒感染的治疗剂。对于这种治疗，寡核苷酸可经腹内、鼻内、口腔内或肛门内施用。优选地，这种寡核苷酸的施用浓度约为从1至50mg/kg体重。
以下实施例的目的是进一步阐明本发明的一些优选的实施方案，而不是限制本发明。
                   实施例1
具有甲基膦酸酯和硫代磷酸酯区域的嵌合寡核苷酸的合成
对甲基膦酸酯区域使用甲基亚膦酰胺，对硫代磷酸酯区域使用核苷H-膦酸酯以合成具有甲基膦酸酯和硫代磷酸酯区域的嵌合寡核苷酸。
甲基亚膦酰胺(methylphosphonamidite)按下述方法合成：
通过在15℃、氮气下在醚中使甲基二氯膦(51mmol)与二异丙基胺(102mmol)反应可制得甲基氯-N，N-二异丙基氨基膦。通过过滤除去盐和溶剂的挥发后，可得到油状的甲基氯-N，N-二异丙基氨基膦(48mmol，95％理论值)，通过1H和31P NMR(核磁共振)鉴定之，它在-20℃下可保持稳定至少达8周。在室温下将此产品在含有N，N-二异丙基乙胺的二氯甲烷中与常规保护的核苷反应10-20分钟。水相逐步形成，在-30℃至-48℃下使用戊烷从乙酸乙酯中沉淀得到产品的白色固体，产率为80-90％。用于CH2C12∶EtoAc∶Et3N(9∶9∶2)中的二氧化硅薄层层析纯化此产品，并通过1H和31P NMR鉴定之。
这些产品可用于使用条件和方案与标准亚磷酰胺反应剂所用相同的自动化DNA合成仪中。核苷酸以33mg/ml的浓度溶于乙腈中，并用四唑激活。使用1分钟的偶联时间在预装的CPG支持物上进行合成。
通过二甲氧基三苯甲基测定法测定偶联效率，并发现它与使用亚磷酰胺的平行对照合成途径的效率相同。
偶联后，在室温下将产品脱三苯甲基，然后室温下用NH4OH从支持物上割离2小时，并在室温下用乙二胺∶乙醇(1∶1)封闭4小时。在通过HPLC测定的模式研究中，此碱性处理可导致大致1％的核苷间膦酸酯基团降解。
H-膦酸酯的合成可参阅美国专利5,149,798，其内容引入本文作为参考。然后，通过用置于二硫化碳/吡啶/三乙基胺(9∶9∶1体积/体积)中的0.2M硫的氧化作用可使H-膦酸酯转变成为硫代磷酸酯。
                实施例2
具有甲基硫代膦酸酯和硫代磷酸酯区域的嵌合寡核苷酸的合成
为了制备具有在任一端有四个相邻核苷酸甲基硫代膦酸酯区域和在中间有12个相邻寡核苷酸硫代磷酸酯区域的经修饰寡核苷酸，可使用8个微摩规模的下述步骤。将第一单体与可控孔度玻璃(CPG)固体支持物预先结合，使用标准的amidite偶联循环将第二单体脱氧核苷酸甲基亚膦酰胺与第一单体偶联(见Agrawal和Goodchild，Tetrahedron Lett.28：3539-3542(1987))。在另外的循环中，另外三个脱氧核苷酸甲基亚膦酰胺与正在延长的链相继偶联。然后在室温下使用于乙腈中的1％Beaucage反应剂(3H-1，2-苯并二硫杂环戊二烯-2-酮(3H-1，2-benzodithiole-2-one)进行氧化硫代反应，以产生与CPG结合的五核苷酸甲基硫代膦酸酯。通过Agrawal和Zam-ecnik在美国专利5,149,79 8中的H-膦酸酯法相继加入其次的12个单体，其内容引入本文作为参考。然后，通过用置于二硫化碳/吡啶/三乙基胺(9∶9∶1体积/体积)中的0.2M硫的氧化作用可使H-膦酸酯转变成为硫代磷酸酯。加入最后的四个单体脱氧核苷酸甲基硫代膦酸酯，然后如上所述氧化硫代。在室温下将所得寡核苷酸在0.5ml乙二胺中脱保护达30分钟，然后在室温下放置6小时，并时而搅拌。最后过滤混合物并在真空中挥发以得到固体块，将此固体块溶于水中并在Sep Pak C18上脱盐。
               实施例3
具有甲基硫代膦酸酯键的寡核苷酸对核酸酶降解的抗性
检测3＇末端具有2-4个相邻脱氧核苷酸甲基膦酸酯以及另外的所有连键为脱氧核苷酸二磷酸酯的寡核苷酸对3＇核酸外切酶降解的相对抗性，并与寡核苷酸磷酸二酯相比较。对于每个寡核苷酸，将冷冻干燥的0.4A260单位的寡核苷酸，溶于0.5ml缓冲液中(10mMTris，10mM MgCl2，pH8.5)，并与5μl(1.5毫单位)蛇毒磷酸二酯酶相混合。将混合物置于37℃下热调节小室中保温，相对于时间将A260作图。增色性的增加可用作寡核苷酸降解的指标，结果示于下表IV。
这些结果表明，在3＇末端附近具有甲基硫代膦酸酯连键的寡核苷酸比缺乏这种连键的寡核苷酸更加稳定。另外，随着甲基硫代膦酸酯连键数目的增加，寡核苷酸的稳定性也有所增加(4个连键>>3个连键>>2个连键)。
                      表IV
           寡核苷酸对核酸酶裂解的抗性
                                            增加百分数％寡核苷酸增色性                 t1/2(秒)寡核苷酸磷酸二酯                  44               22.56具有2个3＇末端脱氧核苷           210               24.58酸甲基硫代膦酸酯的寡核苷酸具有3个3＇末端脱氧核苷           264               18酸甲基硫代膦酸酯的寡核苷酸具有4个3＇末端脱氧核苷           401               15.54酸甲基硫代膦酸酯的寡核苷酸
                 实施例4
具有脱氧核糖核苷酸和2＇-OMe-核糖核苷酸区域的杂种寡核苷酸硫代磷酸酯的合成
使用美国专利5,149,798中所述的H-膦酸酯法，通过自动化合成仪(8700型，Millipore，Milford，MA)，按5-6μmol的规模在CPG上合成杂种寡核苷酸硫代磷酸酯，其内容引入本文作为参考。
脱氧核糖核苷酸H-膦酸酯得自Millipore。通过标准方法合成2＇-OMe核糖核苷酸H-膦酸酯。通过对所需循环使用2′-OMe核糖核苷H-膦酸酯可装配含有2＇-OMe核苷的寡核苷酸片段。类似地，通过对所需循环使用脱氧核苷H-膦酸酯可装配含有脱氧核糖核苷的寡核苷酸片段。装配后，如实施例2所述用硫氧化与CPG结合的寡核苷酸H-膦酸酯以产生硫代磷酸酯连键。然后在40℃下，于浓NH4OH中将寡核苷酸脱保护48小时。
在C18反相介质的反相低压层析中分析寡核苷酸的粗产物(约为500个A260单位)。用80％醋酸水溶液处理以除去DMT基团，然后对双蒸水透析寡核苷酸并冷冻干燥。
                  实施例5
杂种寡核苷酸硫代磷酸酯的相对核酸酶抗性
为了检测不同的杂种寡核苷酸硫代磷酸酯的相对核酸酶抗性，可用蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)处理寡核苷酸。将约为0.2A260单位的分别为没有2＇-OMe-RNA区域，或在5＇和3＇末端分别具有3和4个相邻2′-OMe核糖核苷酸，或具有全部为2-OMe核苷酸的寡核苷酸溶于500μl缓冲液中(40mM NH4CO3，pH4.0＋20mM MgCl2)，并与0.1单位的SVPD相混合。将混合物在37℃下保温420分钟。在0、200和420分钟后，移出165μl等分试样并用离子交换HPLC分析。具有全部为2′-OMe-核糖核苷酸的寡核苷酸对SVPD有很强抗性，而没有2＇-OMe-核糖核苷酸的寡核苷酸几乎被完全消化，具有5＇和3＇末端2＇-OMe-RNA区域的寡核苷酸被消化了50％。使用十分之一这一浓度的SVPD在1分钟内可将寡核苷酸磷酸二酯消化约80％。
这些结果表明在寡核苷酸硫代磷酸酯内存在2＇-OMe核糖核苷酸会增强对核酸外切酶裂解消化的抗性，当使用具有较大比例的2＇-OMe核糖核苷酸时这种被增强的抗性还会增加。由于核糖核苷酸，其它2＇-取代的核糖核苷酸和2＇-OMe核糖核苷酸相似的特征和行为，这些结果也可表明，对于具有核糖核苷酸，2＇-取代的核糖核苷酸，或核糖核苷酸和2′-取代的核糖核苷酸的混合的杂种寡核苷酸硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯而言，也可得到类似的核酸酶抗性的增强。
                  实施例6
具有3＇帽结构的寡核苷酸硫代磷酸酯的合成
在可控孔度玻璃(CPG)上使用H-膦酸酯化学法，再接着用存在于二硫化碳/吡啶/三乙基胺(9∶9∶1体积/体积)中的0.2M硫氧化，可在8700型自动化合成仪(Milligen-Biosearch，Burlington，MA)上合成寡核苷硫代磷酸酯。合成以5-10微摩尔的规模进行。通过低压离子交换层析(DEAE-纤维素，DE-50Whatman)，再经过反相层析(C18)和透析纯化寡核苷硫代磷酸酯。通过在装配了所需序列后，用N-Fmoc(芴基甲氧基羰基)-O＇-DMTr(二对甲氧基三苯甲基)-3-氨基-1，2-丙二醇-H-膦酸酯进行最后的偶联可制备5＇-加帽的寡核苷硫代磷酸酯。然后用硫氧化5＇-加帽的寡核苷H-膦酸酯。在N-FmocO＇-DMTr-3-氨基-1，2-丙二醇-CPG上装配3＇-加帽的寡核苷硫代磷酸酯，再用硫氧化。这些步骤的联合可用于产生3、5＇-加帽的寡核苷硫代磷酸酯。
可替换地，在加帽步骤中通过用膦酸酯或衍生于CPG的帽结构替代N-Fmoc-O＇-DMTr-3-氨基-1，2-丙二醇-H-膦酸酯或CPG可制备具有其它3＇或5＇帽结构的寡核苷硫代磷酸酯(见图4)。类似地，不同于寡核苷酸硫代磷酸酯的加帽经修饰寡核苷酸可通过在适当合成步骤中附加加帽步骤，以相似的方法制备。
               实施例7
具有末端帽结构的寡核苷酸硫代磷酸酯的体内稳定性
将溶于200微升生理盐水中的剂量为30mg/kg的经放射性标记的寡核苷酸通过静脉内或腹膜内注射以处理雄性CDC2F1小鼠(平均体重为20克)。将每种加帽或未加帽的寡核苷酸施用给三只小鼠。用药后24小时分别收集每只动物的尿液，然后在37℃下用溶于0.5％SDS、10mM 20 mM Tris Cl(pH7.6)、10mM EDTA中的蛋白酶K(终浓度为2mg/ml)抽提1小时，再用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀。然后先用PAGE(20％聚丙烯酰胺/7M尿素)、再用放射性自显影分析所得寡核苷酸。自笼洗涤液中测量放射活性以描述撒掉的尿液。
用药后24小时，无论是加帽的或是未加帽的，都约有30％寡核苷酸硫代磷酸酯被排泄出来。如图5所示，所排泄的未加帽和5＇-加帽的寡核苷酸硫代磷酸酯被广泛降解。相反，所排泄的3＇-加帽和3＇、5＇-加帽的寡核苷酸硫代磷酸酯实际上未显示出降解。这表明，排泄至尿中的寡核苷酸硫代磷酸酯的体内降解是由3＇-核酸外切酶活性引起的，通过在寡核苷酸的3＇羟基加帽可将其抑制。
                   实施例8
自身稳定化的寡核苷酸磷酸二酯的核酸酶抗性
本研究所用对照寡核苷酸是没有自身互补区域的寡脱氧核苷酸磷酸二酯。除了具有10个核苷酸的3＇自身互补区域，所检测的化合物与对照相同。为了作任何大小影响的对照，可使用另一个对照寡脱氧核苷酸磷酸二酯，除了在其3＇末端具有10个错配核苷酸(T10)，它与第一个对照寡核苷酸相同。
检测寡核苷酸对3＇核酸外切酶降解的相对抗性。对于每种寡核苷酸而言，冷冻干燥0.4 A260单位的寡核苷酸，溶解于0.5ml缓冲液中(10mM Tris，10mM MgCl2，pH8.5)并与5μl(1.5个毫单位)蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)相混合。在37℃下将混合物置热调节小室中保温，对时间将A260作图。寡核苷酸降解被测定为增色性增加的函数。
这些实验的结果示于下列表V。这些结果表明，根据本发明的自身稳定化寡核苷酸磷酸二酯与寡核苷酸磷酸二酯或者具有非互补尾的寡核苷酸磷酸二酯相比，对3＇核酸外切酶降解的抗性更高。
除了上述检测外，将这些寡核苷酸也用DNA聚合酶I3′-核酸外切酶消化。如图6所示，非自身稳定化的寡核苷酸可在30分钟内完全消化，而具有10个核苷酸自身互补区域的自身稳定化寡核苷酸在超过30分钟的时间内仅有部分被消化。
                      表V
             寡核苷酸的SVPD半衰期互补区域                      SVPD消化的半衰期
没有                           75秒
10个核苷酸                    950秒
错配                           75秒
                 实施例9
自身稳定化的寡核苷酸硫代磷酸酯的核酸酶抗性
为了检测自身稳定化的和非自身稳定化的寡核苷酸硫代磷酸酯的相对核酸酶抗性，可使用DNA聚合酶I3′-核酸外切酶活性检测法，因为SVPD降解寡核苷酸硫代磷酸酯的速度很慢。
用gamma-32P-ATP和激酶标记所有寡核苷酸的5＇末端。在于20μl缓冲液(40mM Tris HCl，pH8.0，10mM MgCl2，5mM DTT，50mM KCl，50μg/ml BSA)中的40Pmole 5′-标记寡核苷酸溶液中加入5个单位的DNA聚合酶I并在37℃下温育。在0、30、60、120分钟时，取出4μl等分试样并与6μ终止溶液(98％甲酰胺，10mMEDTA，0.1％二甲苯靛，0.1％溴酚蓝)相混合。用15％丙烯酰胺凝胶(尿素)和放射性自显影分析样品。
结果示于图7。具有非自身互补区域或在3＇末端仅有错配核苷酸(T10)(如实施例8中所描述的寡核苷酸磷酸二酯)的寡核苷酸硫代磷酸酯在4小时内消化了约50％。具有10个核苷酸自身互补区域的寡核苷酸硫代磷酸酯4小时后仍未被降解。具有6个或4个核苷酸自身互补区域的寡核苷酸硫代磷酸酯也被发现是稳定的。这些结果表明，自身稳定化的寡核苷酸硫代磷酸酯与非自身稳定化的寡核苷酸硫代磷酸酯相比，对核酸酶降解的抗性更强。
                 实施例10
经修饰寡核苷酸的抗流感活性
将MDCK犬肾细胞接种于96孔组织培养板(Corning，Corning，New York)中的含有非必需氨基酸(GIBCO BRL.Grand Island，NewYork)、5％小牛血清(Hyclone实验室，Logen，Utah)，0.1％NaHCO3的基本必需培养基(Minimum Essential Medium，MEM)中，接种浓度为4×105个细胞/毫升，每孔0.2毫升。将细胞温育过液以建立细胞单层。除去生长培养基，并加入于含有0.18％NaHCO3和50μg/ml庆大霉素的无血清MEM中的0.1ml预先选择浓度的寡核苷酸。对每种化合物的4个孔都这样做：1个孔是毒性对照，3个孔是抗病毒检测。三个细胞对照孔和六个病毒对照孔接受0.1ml含有0.18％NaHCO3和50μg/ml庆大霉素的无血清MEM。在加入寡核苷酸化合物的10分钟内，在每个检测孔和病毒对照孔中加入于0.1ml含有0.18％NaHCO3、20μg/ml胰蛋白酶、2μg/ml EDTA和50μg/ml庆大霉素的MEM中的流感病毒A/NWS/33(H1N1)。细胞对照和毒性对照孔接受0.1ml没有病毒的相同培养基。
在37℃的含5％CO2、95％空气的潮湿恒温箱中温育培养板。通过显微观察检测细胞病毒特异性的细胞病变效应(CPE)以及非感染毒性对照孔中由于该化合物作用引起的形态变化。病毒CPE被划分为0-4级，4级即为95-100％CPE。通过对可观察到50％病毒对照活性以划分CPE级的每种浓度化合物平均CPE级的回归分析，计算出有效剂量、50％终点(ED50)。使用自无毒性(0％)至细胞完全裂解(100％)(增量为20％)的标准，通过显微观察将毒性对照孔中细胞形态的可见变化定级。与用于那些毒性级别的该化合物浓度相比较，通过对归类为50％终点的那些毒性级别的回归分析可计算出细胞毒剂量，50％终点(CD50)。使用公式TI＝CD50/ED50可计算出每种化合物的治疗系数(TI)，结果示于下列表VI。
                           表VI
              经修饰寡核苷酸的抗-流感活性CMPD          ED50(μg/ml)       CD50(μg/ml)       TIA              未检测B               34.3                147             4.3C               55                  562             10D               61                  649             11E             未检测F              178                  261             1.5G              147                  649             4.4H               59                  562             9.5I               45                  750             17J              175                  750             4.3K               22                  825             38L               32                  422             13M               23.7                383             16对照1           440                 422           ＜1.01对照是具有序列5＇CAGAGAAAATCAGAAGA3＇的寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯
这些结果表明，根据本发明的经修饰抗流感寡核苷酸的所有较优选结构特征，即嵌合的、杂种的、加帽的和自身稳定化的特征，能够改善反义寡核苷酸抑制流感病毒复制或增殖的效力。这些结果进一步表明，在一个反义寡核苷酸中，这些结构特征的联合可具有更强的效力。
                 实施例11
经修饰抗流感寡核苷酸对不同流感病毒株的抑制
为了检测根据本发明的经修饰抗流感寡核苷酸是否可抑制其它流感病毒株，可使用化合物M(CMPD M)相对于不同流感病毒株，重复实施例10所描述的实验。此研究所选择的流感病毒株是H1N1的A/NWS/33株和A/PR/8/34株，H3N2的A/Washington/897/80株，A/Vic-toria/3/75株和A/Port Chalmers/1/73株，和H2N2的A2/Japan/305/57株。结果按实施例10所描述的计算，并示于下列表VII。
                    表VII
         化合物M对不同流感病毒株的作用流感病毒株           FD50(μg/ml)  CD50(μg/ml)      TIA/NWS/33                  7.6          ＞100          ＞13A/PR/8/34               ＞100          ＞100            ？A2/Japan/305/57           61           ＞100          ＞1.6A/Washington/897/80        6           ＞100            17A/Victoria/3/75           6.2          ＞100          ＞16A/Port Chalmers/1/73    ＞100          ＞100            ？
根据这些结果，化合物M显示出对所检测六株流感病毒中的三株抑制效力强，对第四株有一些效力。这些结果表明，根据本发明的经修饰抗流感寡核苷酸可有效地抗多种流感病毒株。为了使跨毒株效力具有最大的宽度，可比较几个不同流感病毒的不同基团的核苷酸序列，可使用最保守的核苷酸序列来制备进行抑制的寡核苷酸。
                       序列表(1)一般资料
(i)申请人：HYBRIDON，INC.(ii)发明题目：新型抗流感寡核苷酸(iii)序列数目：37(iv)联系地址：
(A)通信人：Allegretti & Witcoff，Ltd.
(B)街道：Ten South Wacker Drive
(C)城市：Chicago
(D)州：Illinois
(E)国家：U.S.A.
(F)邮编：60606(v)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)本申请数据：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类号：(viii)代理/代理人资料：
(A)姓名：Michael S.Greenfield
(B)登记号：37,142
(C)档案号：93,161-A(ix)电子通讯资料：
(A)电话：312/715-1000
    (B)电传真：617/715-1234(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：2149个碱基对(bp)
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：AGCGAAAGCA  GGCAAACCAT  TTGAATGGAT  GTCAATCCGA  CTTTACTTTT  CTTAAAAGTG        60CCAGCACAAA  ATGCTATAAG  CACAACTTTC  CCTTATACTG  GAGACCCTCC  TTACAGCCAT       120GGGACAGGAA  CAGGATACAC  CATGGATACT  GTCAACAGGA  CACATCAGTA  CTCAGAAAGG       180CGAAGATGGA  CAACAAACAC  CGAAACTGGA  GCACCGCAAC  TCAACCCGAT  TGATGGGCCA       240CTGCCAGAAG  ACAATGAACC  AAGTGGTTAT  GCCCAAACAG  ATTGTGTATT  GGAAGCAATG       300GCCTTCCTTG  AGGAATCCCA  TCCTGGTATC  TTTGAGACCT  CGTGTCTTGA  AACGATGGAG       360GTTGTTCAGC  AAACACGAGT  GGACAAGCTG  ACACAAGGCC  GACAGACCTA  TGACTGGACT       420CTAAATAGGA  ACCAGCCTGC  TGCAACAGCA  TTGGCCAACA  CAATAGAAGT  GTTCAGATCA       480AATGGCCTCA  CGGCCAATGA  ATCCGGAAGG  CTCATAGACT  TCCTTAAGGA  TGTAATGGAG       540TCAATGAACA  AAGAAGAAAT  GGAGATCACA  ACTCATTTTC  AGAGAAAGAG  ACGAGTGAGA       600GACAATATGA  CTAAGAAAAT  GGTGACACAG  AGAACAATAG  GTAAAAGGAA  GCAGAGATTG       660AACAAAAGGA  GTTATCTAAT  TAGGGCATTG  ACCCTGAACA  CAATGACCAA  AGATGCTGAG       720AGAGGGAAGC  TAAAACGGAG  AGCAATTGCA  ACCCCAGGGA  TGCAAATAAG  GGGGTTTGTA       780TACTTTGTTG  AGACACTAGC  AAGGAGTATA  TGTGAGAAAC  TTGAACAATC  AGGATTGCCA       840GTTGGAGGCA  ATGAGAAGAA  AGCAAAGTTG  GCAAATGTTG  TAAGGAAGAT  GATGACCAAT       900TCTCAGGACA  CTGAAATTTC  TTTCACATCA  CTGGAGATAA  CACCAAATGG  AACGAAAATC       960AGAACCCTCG  GATGTTTTTG  GCCATGATCA  CATATATAAC  CAGAAATCAG  CCCGAATGGT      1020TCAGAAATGT  TCTAAGTATT  GCTCCAATAA  TGTTCTCAAA  CAAAATGGCG  AGACTGGGAA      1080AGGGGTACAT  GTTTGAGAGC  AAGAGTATTA  AAATTAGAAC  TCAAATACCT  GCAGAAATGC      1140TAGCAAGCAT  CGATTTGAAA  TACTTCAATG  ATTCAACTAG  AAAGAAGATT  GAAAAAATCC      1200GGCCGCTCTT  AATAGATGGG  ACTGCATCAT  TGAGCCCTGG  AATGATGATG  GGCATGTTCA      1260ATATGTTAAG  TACTGTATTA  GGCGTCTCCA  TCCTGAATCT  TGGACAAAAG  AGACACACCA      1320AGACTACTTA  CTGGTGGGAT  GGTCTTCAAT  CTTCTGATGA  TTTTGCTCTG  ATTGTCAATG      1380CACCCAATCA  TGAAGGGATT  CAAGCCGGAG  TCAACAGGTT  TTATCGAACC  TGTAAGCTAC      1440TTGGAATTAA  TATGAGCAAG  AAAAAGTCTT  ACATAAACAG  AACAGGTACA  TTTGAATTCA      1500CAAGTTTTTT  CTATCGTTAT  GGGTTTGTTG  CCAATTTCAG  CATGGAGCTT  CCCAGCTTTG      1560GGGTGTCTGG  GATCAACGAG  TCTGCGGACA  TGAGTATTGG  AGTTACTGTC  ATCAAAAACA      1620ATATGATAAA  CAATGATCTT  GGTCCAGCAA  CCGCTCAAAT  GGCCCTTCAG  CTGTTCATCA      1680AAGATTACAG  GTACACGTAC  CGCTGCCATA  GAGGTGACAC  ACAAATACAA  ACCCGAAGAT      1740CATTTGAAAT  AAAGAAACTG  TGGGAGCAAA  CCCATTCCAA  AGCTGGACTG  CTGGTCTCCG      1800ACGGAGGCCC  AAATTTATAC  AACATTAGAA  ATCTCCACAT  TCCTGAAGTC  TGCTTGAAAT      1860GGGAATTAAT  GGATGAGGAT  TACCAGGGGC  GTTTATGCAA  CCCACTGAAC  CCATTTGTCA      1920ACCATAAAGA  CATTGAATCA  GTGAACAATG  CAGTGATAAT  GCCAGCACAT  GGTCCAGCCA      1980AAAACATGGA  GTATGATGCT  GTTGCAACAA  CACACTCCTG  GATCCCCAAA  AGAAATCGAT      2040CCATCTTGAA  TACAAGCCAA  AGAGGAATAC  TTGAAGATGA  ACAAATGTAC  CAAAAGTGCT      2100GCAACTTATT  TGAAAAATTC  TTCCCCAGCA  GTTCATACAG  AAGACCAGT                   2149(2)SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
    CAGAGCAAAA  TCATCAGAAG  A(2)SEQ ID NO：3的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
    CAGAGCAAAA  TCATCAGAAG  A(2)SEQ ID NO：4的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
    CAGAGCAAAA  TCATCAGAAG  A(2)SEQ ID NO：3的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
    CAGAGCAAAA  TCATCAGAAG  A(2)SEQ ID NO：4的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
    CAGAGCAAAA  TCATCAGAAG  A(2)SEQ ID NO：5的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
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    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
    CAGAGCAAAA  TCATCAGAAG  A(2)SEQ ID NO：6的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
    CAGAGCAAAA  TCATCAGAAG  A(2)SEQ ID NO：7的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
    CAGAGCAAAA  TCATCAGAAG  A(2)SEQ ID NO：8的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
    CAGAGCAAAA  TCATCAGAAG  A(2)SEQ ID NO：9的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
    CAGAGCAAAA  TCATCAGAAG  A(2)SEQ ID NO：10的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
    CAGAGCAAAA  TCATCAGAAG  A
(2)SEQ ID NO：11的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：19bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
    AGAGCAAAAT  CATCAGAAG(2)SEQ ID NO：12的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：19bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
    AGAGCAAAAT  CATCAGAAG(2)SEQ ID NO：13的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：17bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
    GAGCAAAATC  ATCAGAA(2)SEQ ID NO：14的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：17bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
    GAGCAAAATC  ATCAGAAA(2)SEQ ID NO：15的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
    CAGAGCAAAA  TCATTCAGAAG  A(2)SEQ ID NO：16的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：30bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：
    CAGAGCAAAA  TCATCAGAAG  ATTCTGATGA(2)SEQ ID NO：17的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
    CTTTCCATAT  TGAATATAAT(2)SEQ ID NO：18的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：
    ACATCCATTC  AAATGGTTTG(2)SEQ ID NO：19的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：
    TCTTCCATTT  TGGATCAGTA(2)SEQ ID NO：20的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：是
(iv)反义的：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：
    GCCTTCATTT  TGGTTGTTTT(2)SEQ ID NO：21的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：
    GACGCCATGA  TTTTGATGTC(2)SEQ ID NO：22的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：是
(iv)反义的：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：
    GGATTCATTT  TAAACCCCTG(2)SEQ ID NO：23的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：
    AGACTCATCT  TTCAATATCT(2)SEQ ID NO：24的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：
    GATAGAGAGA  ACGTACGTTT(2)SEQ ID NO：25的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：
    TCTGATAGGC  CTGCAAATTT(2)SEQ ID NO：26的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：
GGATCCATTA  TGTCTTTGTC(2)SEQ ID NO：27的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：
    CATGTCGGTT  AGGTAACGCG(2)SEQ ID NO：28的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：
    GCAATCTACC  TGAAAGCTTG(2)SEQ ID NO：29的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：
    AGCAGTATGT  CCTGGAAGAG(2)SEQ ID NO：30的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：
    AAAACGACCT  TGTTTCTACT(2)SEQ ID NO：31的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：
    AAAAATGCCT  TGTTCCTACT(2)SEQ ID NO：32的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：
    AAAAGTACCT  TGTTTCTACT(2)SEQ ID NO：33的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：
    AAAACACCCT  TGTTTCTACT(2)SEQ ID NO：34的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：
    AAAATACCCT  TGTTTCTACT(2)SEQ ID NO：35的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：
    AAAAACTCCT  TGTTTCTACT(2)SEQ ID NO：36的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：
    AAAACTACCT  TGTTTCTACT(2)SEQ ID NO：37的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设的：否
(iv)反义的：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：
    AAAACACCCT  TGTTTCTACT

Claims (46)

1、一种经修饰的抗流感寡核苷酸，含有与流感病毒必需核酸序列互补的核苷酸序列，其中，该寡核苷酸是含有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯区域以及烷基膦酸酯区域的混合骨架的嵌合寡核苷酸。
2、根据权利要求1的寡核苷酸，其中，烷基膦酸酯区域位于寡核苷酸的5＇末端或其附近或者3＇末端或其附近。
3、根据权利要求1的寡核苷酸，其中，烷基膦酸酯区域包含从约2至约10个由烷基膦酸酯连键相连接的相邻核苷酸。
4、根据权利要求2的寡核苷酸，其中，烷基膦酸酯区域包含从约2至约10个由烷基膦酸酯连键相连接的相邻核苷酸。
5、根据权利要求1的寡核苷酸，其中硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯区域包含从约3至约100个由硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连键相连接的相邻核苷酸。
6、根据权利要求2的寡核苷酸，其中，硫代磷酸酯或二硫代磷酯区域包含从约3至约100个由硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连键相连接的相邻核苷酸。
7、根据权利要求3的寡核苷酸，其中，硫代磷酸酯或二硫代磷酯区域包含从约3至约100个由硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连键相连接的相邻核苷酸。
8、根据权利要求4的寡核苷酸，其中，硫代磷酸酯或二硫代磷酯区域包含从约3至约100个由硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连键相连接的相邻核苷酸。
9、一种经修饰的抗流感寡核苷酸，含有与流感病毒必需核酸序列互补的核苷酸序列，其中，该寡核苷酸是含有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯区域以及烷基硫代膦酸酯区域的混合骨架的嵌合寡核苷酸。
10、根据权利要求10的寡核苷酸，其中，烷基硫代膦酸酯区域位于寡核苷酸的5＇末端或其附近或者3＇末端或其附近。
11、根据权利要求9的寡核苷酸，其中，烷基硫代膦酸酯区域包含从约2至约10个由烷基硫代膦酸酯连键相连接的相邻核苷酸。
12、根据权利要求10的寡核苷酸，其中，烷基硫代膦酸酯区域包含从约2至约10个由烷基硫代膦酸酯连键相连接的相邻核苷酸。
13、根据权利要求9的寡核苷酸，其中硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯区域包含从约3至约100个由硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连键相连接的相邻核苷酸。
14、根据权利要求10的寡核苷酸，其中，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯区域包含从约3至约100个由硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连键相连接的相邻核苷酸。
15、根据权利要求11的寡核苷酸，其中，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯区域包含从约3至约100个由硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连键相连接的相邻核苷酸。
16、根据权利要求12的寡核苷酸，其中，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯区域包含从约3至约100个由硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连键相连接的相邻核苷酸。
17、一种经修饰的抗流感寡核苷酸，含有与流感病毒必需核酸序列互补的核苷酸序列，其中，该寡核苷酸是含有脱氧核糖核苷酸区域和核糖核苷酸区域的杂种寡核苷酸。
18、根据权利要求17的寡核苷酸，进一步包含约从1至所有个硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷酸间连键。
19、根据权利要求17的寡核苷酸，其中，核糖核苷酸区域位于寡核苷酸的5＇末端或其附近或者3＇末端或其附也
20、根据权利要求17的寡核苷酸，其中，核糖核苷酸区域包含约2至约100个相邻核糖核苷酸。
21、根据权利要求18的寡核苷酸，其中，核糖核苷酸区域包含约2至约100个相邻核糖核苷酸。
22、根据权利要求19的寡核苷酸，其中，核糖核苷酸区域包含约2至约100个相邻核糖核苷酸。
23、根据权利要求17的寡核苷酸，其中，脱氧核糖核苷酸区域包含约0至约100个脱氧核糖核苷酸。
24、根据权利要求18的寡核苷酸，其中，脱氧核糖核苷酸区域包含约0至约100个脱氧核糖核苷酸。
25、根据权利要求19的寡核苷酸，其中，脱氧核糖核苷酸区域包含约0至约100个脱氧核糖核苷酸。
26、根据权利要求20的寡核苷酸，其中，脱氧核糖核苷酸区域包含约0至约100个脱氧核糖核苷酸。
27、根据权利要求21的寡核苷酸，其中，脱氧核糖核苷酸区域包含约0至约100个脱氧核糖核苷酸。
28、根据权利要求22的寡核苷酸，其中，脱氧核糖核苷酸区域包含约0至约100个脱氧核糖核苷酸。
29、一种经修饰的抗流感寡核苷酸，含有与流感病毒必需核酸序列互补的核苷酸序列，其中，该寡核苷酸在其5＇和/或3＇末端具有帽结构以赋予核酸酶抗性，此帽结构选自一组包括图4所示帽结构以及低级烷基(C1-C12)或醇基的基团，其中该寡核苷酸具有从1至约所有个经修饰的核苷酸间连键，它们选自一组含有磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基醚(carboxymethylester)、乙酰胺化物、氨基甲酸酯、硫醚、桥连氨基磷酸酯、桥连亚甲基膦酸酯、桥连硫代磷酸酯、砜、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯连键的基团。
30、一种经修饰的抗流感寡核苷酸，含有抗流感病毒的杂交区域和自身互补区域。
31、根据权利要求30的寡核苷酸，其中与流感病毒杂交的区域包含与流感病毒必需核酸序列互补的约6至约100个核苷酸。
32、根据权利要求30的寡核苷酸，其中该自身互补区域包含约4至约50个可形成分子内碱基对的核苷酸。
33、根据权利要求30的寡核苷酸，其中，自身互补区域位于寡核苷酸的5＇末端或其附近或者3＇末端或其附近。
34、根据权利要求31的寡核苷酸，其中，自身互补区域位于寡核苷酸的5＇末端或其附近或者3＇末端或其附近。
35、根据权利要求32的寡核苷酸，其中，自身互补区域位于寡核苷酸的5＇末端或其附近或者3＇末端或其附近。
36、根据权利要求30的寡核苷酸，其中，约从2至所有的核苷酸是通过硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯核苷酸间连键结合的。
37、根据权利要求31的寡核苷酸，其中，约从2至所有的核苷酸是通过硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯核苷酸间连键结合的。
38、根据权利要求32的寡核苷酸，其中，约从2至所有的核苷酸是通过硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯核苷酸间连键结合的。
39、根据权利要求33的寡核苷酸，其中，约从2至所有的核苷酸是通过硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯核苷酸间连键结合的。
40、根据权利要求34的寡核苷酸，其中，约从2至所有的核苷酸是通过硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯核苷酸间连键结合的。
41、根据权利要求35的寡核苷酸，其中，约从2至所有的核苷酸是通过硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯核苷酸间连键结合的。
42、根据权利要求1的寡核苷酸，其中，该必需核酸序列选自下组序列：流感病毒聚合酶3基因、流感病毒聚合酶1基因、流感病毒聚合酶2基因、流感病毒血凝素基因、流感病毒核蛋白质基因、流感病毒神经氨酸苷酶基因、流感病毒基质蛋白质基因、流感病毒片段7或8的左或右剪接连接、流感病毒片段8的剪接分枝和流感病毒片段1、2、3、4、5、6、7或8的包装序列。
43、根据权利要求9的寡核苷酸，其中，该必需核酸序列选自下组序列：流感病毒聚合酶3基因、流感病毒聚合酶1基因、流感病毒聚合酶2基因、流感病毒血凝素基因、流感病毒核蛋白质基因、流感病毒神经氨酸苷酶基因、流感病毒基质蛋白质基团、流感病毒片段7或8的左或右剪接连接、流感病毒片段8的剪接分枝和流感病毒片段1、2、3、4、5、6、7或8的包装序列。
44、根据权利要求17的寡核苷酸，其中，该必需核酸序列选自下组序列：流感病毒聚合酶3基因、流感病毒聚合酶1基因、流感病毒聚合酶2基因、流感病毒血凝素基因、流感病毒核蛋白质基因、流感病毒神经氨酸苷酶基因、流感病毒基质蛋白质基因、流感病毒片段7或8的左或右剪接连接、流感病毒片段8的剪接分枝和流感病毒片段1、2、3、4、5、6、7或8的包装序列。
45、根据权利要求29的寡核苷酸，其中，该必需核酸序列选自下组序列：流感病毒聚合酶3基因、流感病毒聚合酶1基因、流感病毒聚合酶2基因、流感病毒血凝素基因、流感病毒核蛋白质基因、流感病毒神经氨酸苷酶基因、流感病毒基质蛋白质基因、流感病毒片段7或8的左或右剪接连接、流感病毒片段8的剪接分枝和流感病毒片段1、2、3、4、5、6、7或8的包装序列。
46、根据权利要求31的寡核苷酸，其中，该必需核酸序列选自下组序列：流感病毒聚合酶3基因、流感病毒聚合酶1基因、流感病毒聚合酶2基因、流感病毒血凝素基因、流感病毒核蛋白质基因、流感病毒神经氨酸苷酶基因、流感病毒基质蛋白质基因、流感病毒片段7或8的左或右剪接连接、流感病毒片段8的剪接分枝和流感病毒片段1、2、3、4、5、6、7或8的包装序列。
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