CN1171112A

CN1171112A - 氨基酸核酸

Info

Publication number: CN1171112A
Application number: CN95196989A
Authority: CN
Inventors: K·拉马沙米; 王广义; W·塞弗特
Original assignee: ICN Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Valeant Pharmaceuticals International Inc USA
Priority date: 1994-11-02
Filing date: 1995-11-02
Publication date: 1998-01-21
Also published as: PL185852B1; EP0789707A1; HU218086B; AU4234196A; WO1996014330A1; AU693622B2; RU2154638C2; MX9703188A; CA2202274A1; SI9520112A; PL320084A1; UA48150C2; JPH10508312A; HUT77435A; EP0789707A4; KR100393336B1; KR970707144A

Abstract

本发明提供了各种新的寡核苷酸类似物,这些类似物具有的一种或多种性能造成在寡核苷酸应用的操作中使用标题化合物比使用常规寡核苷酸优越。本发明的化合物是寡核苷酸类似物,其中天然核酸中的呋喃糖环被一个氨基酸或修饰的氨基醇残基取代。本发明的新化合物的一些具体实例中特别有用基因表达的反义控制。本发明的化合物还可用作核酸杂交探针或引物。本发明的另一个方面是提供本发明的寡核苷酸类似物的单聚前体。这些单聚前体可用于合成标题的多聚核苷酸类似物。本发明的另一个方面是提供标题的多聚核苷酸类似物的配方,这些配方是设计用于治疗或预防疾病的。本发明还有一个方面是提供治疗或预防疾病的方法,尤其是提供治疗病毒感染和细胞生长失调的方法。标题疾病的治疗方法包括服用有效量的作为反义抑制剂的标题多聚核苷酸类似物的步骤。

Description

氨基酸核酸

本发明的领域

本发明的领域是缺少呋喃环的多聚核苷酸类似物。

本发明的背景

通过氢键结合序列专属性地结合到互补性核酸(即有意义链)以便抑制基因表达的寡核苷酸一般称为反义寡核苷酸。这些合成的寡核苷酸结合到靶(mRNA)上，进而抑制信使RNA的翻译。这种反义原理在自然界被用于调控基因表达(见Uhlmann，E.et al.，Chem.Reviews，1990，90，543-584；and Stein，C.A.et al.，Cancer Res.，1988，48，2659-2688)。在实验室里，这种反义原理不仅一直用于抑制基因表达，还一直用于活化基因表达。Zamecnik and Stephenson在1978年最早假设了将合成的寡核苷酸用于治疗目标(见Stephenson，M.L.；and Zamecnik，P.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1978，75，280和285)。反义寡核苷酸专属性抑制作用的基础是反义寡核苷酸和病毒核酸的杂环碱基之间的专属性Watson-Crick碱基配对。寡核苷酸结合到互补性核酸的过程称杂交。具有与编码疾病发展必须的蛋白的mRNA的碱基序列互补的寡聚体特别有意义。通过往mRNA上专属性地杂交，可以干扰由这种mRNA编码的蛋白的合成。

制备未修饰的寡核苷酸，即具有DNA结构的寡核苷酸，一直是过去的10年里许多研究组的兴趣中心。Caruthers(见McBride，L J.；andCaruthers，M.H.，Tetrahedron Letts，1983，24，245)的经由氨基磷酸酯(phosphoramidites)的合成方法最初是由Letsinger作为亚磷酸三酯法引入的(见Letsinger，R.L.；and Lunsford，W.B.，J.Amer.Chem.Soc.，1976，98，3655)，该法现在是制备磷酸二酯(phosphodiaster)寡核苷酸的最有效的方法。使用正常的即未修饰的寡核苷酸作为反义寡核苷酸时出现的问题是对核酸酶的不稳定性和膜穿透性不足。为了使反义寡核苷酸有能力抑制翻译，它们就必须到达未改变的细胞内部。用于反义抑制的寡核苷酸的有用的性质包括：(i)寡核苷酸对细胞外和细胞内酶的稳定性；(ii)穿透细胞膜的能力；(iii)与靶性DNA或RNA的杂交能力(见Agawal，K.Let al.，Nucleic Acids Res.，1979，6，3009；Agarwal S.et al.，Proc.Natl.AcadSci.USA.1988，85，7079)。这样一来，提供具有用作反义或用作引物或杂交和探针的优秀性质的多聚核苷酸类似物很有意义。

过去曾合成过修饰的多聚核苷酸，这些多聚核苷酸修饰包括甲基磷酸酯(methylphosphoates)，硫代磷酸酯(phosphorathioates)，各种酰胺和核酸部分的糖残基的修饰。这些骨架取代虽然在一定程度上增强了稳定性，但在起连接作用的手性磷上造成了负面结果，即导致生成2ⁿ个非对映异构体，其中n为寡聚物中修饰的二酯连接物的个数。这些多个非对映异构体的存在明显削弱了修饰的寡核苷酸杂交到靶序列上的能力。有些这样的取代也保持支持负电荷的能力，而且存在这种负电荷基团可降低化合物穿透细胞膜的能力。还存在与修饰的连接物相联系的一系列其它缺点，这些缺点取决于连接物的精确性质。

曾合成一些包含糖环修饰的寡核苷酸类似物。以前使用的去氧核糖核酸的糖修饰包括α-DNA，同DNA，吗啉代和硫代核苷与多肽核苷酸(PNA)以便提供已经理解的被改进的结构获得改进的DNA，尤其是提供细胞摄入获得改进的结构。一般的合成这类类似物的路线包括将核苷或它的核苷酸的一级羟基通过5价或3价氧化态磷原子或者结合到高聚载体上，或者接到一序列专属的3’-核苷酸上。专一性的偶联方法称为亚磷酸三酯法(氨基磷酸酯法)，亚磷酸二酯法和磷酸氢酯法。市场上可以买到用于这类方法的单聚体和高聚载体连接的单聚体，为便于保存和防止偶联反应中发生非专属性反应，所述单聚体的碱基(G，A，C，T，U和其它杂环)和磷原子都已保护。

含修饰糖环、非离子化骨架或非环聚酰胺(PNA)的核酸在一定程度上具有一种或多种对介导基因有用的如下性质：增强复式稳定性(杂交率)、增加对靶的专属性，抗核酸酶的稳定性，改善细胞摄入，以及协助核酸的重要终止事件(例如RNase H的活性，催化裂解，终止杂交，以及其它)。也已建议使用碳酸二酯。不过，这些化合物高度不稳定，而且碳酸二酯连接不保持磷酸二酯中的亚磷显示的四面体构型。类似地氨基甲酸酯连接造成三角对称性为非手性的，而且已经明确了具有这种连接的聚dT与聚dA不发生强杂交作用(见Coull，J.M.et al.，Tetra-hedron Letts，1987，28，745；Strichak，E.P.et al.，J.Org.Chem.，1987，52，4202)。

更近以来文献中报道了非环糖类似物(Augustyns，K.A.et al.，NucleicAcids Res.，1991，19，2587-2593)。将这些非环核苷酸插入到寡核苷酸中引起Tm减小，减小的程度取决于寡聚物中的连接体的数目。发现这些寡核苷酸对酶稳定以及与互补序列的碱基配对。多聚核苷酸和已知的多聚核苷酸类似物的给定缺点使得提供新的多聚核苷酸类似物用于反义抑制和用于使用寡聚物的其它技术中变得格外有意义。

在糖环和骨架两个成分中的修饰的尝试对于治疗和其它方法中的使用来说有些缺点。所以，在有效的治疗、诊断和研究工具实用化之前这些质量仍需进行较大的改进。相应地，改进作为药物的寡核苷酸的寡聚类似物是长期需要。

本发明提供了新的寡核苷酸及它们的结构前体，这些化合物的抗酶降解性质得到改善，生理条件下的稳定性得到提高，电中性或电正性可增强细胞穿透能力。而且，本发明的新寡核苷酸对核酸杂交靶的杂交性能得到改善。

本发明的寡聚物一般的特征是包含一系列适合于杂环碱基以序列专属的方式结合到靶性核酸上的强制性连接物或单聚体。这里描述的强制性连接物当插入到寡聚体中时，可以具有比单纯的氢键还要大的力，通过这种力有利于形成结合允许的构象。

本发明的核单聚体一般的特点是以一种氨基酸或修饰的氨基醇的残基代替天然存在的核苷酸中的呋喃糖环。本发明的单聚物和寡聚物的实例见于分子式1至41。将这里描述的这些单聚体插入到寡核苷酸中引发性能改进的化合物的合成，这些改进的性能包括：(i)通过消除与磷酸二酯键相联系的电荷增加脂溶性(Dalge，J.M.et al.，NucleicAcids.Res.，1991，19，1805)；和(ii)阻止被核酸酶一类的酶降解。含这些单聚体的寡聚体对靶序列的杂交可以十分稳定，而且在一种或多种应用中比未修饰的核苷残基优越。

本发明概述

本发明提供了各种具有一种或多种性质的新寡核苷酸类似物，这些性质使得标题化合物在运用寡核苷酸的操作中比使用常规的寡核苷酸优越。本发明的化合物为寡核苷酸类似物，其中天然核酸的呋喃糖环被氨基酸或修饰的氨基醇残基取代。本发明的新化合物的一些实例对于基因表达的反义控制特别有用。本发明的化合物还可用作核酸杂交的探针或引物。

本发明的另一个方面是提供本发明的寡核苷酸类似物的单聚前体。这些单聚前体可用于合成标题寡核苷酸类似物。

本发明的另一个方面是提供设计用于治疗或预防疾病的标题多聚核苷酸类似物的配方。本发明还有一个方面是提供治疗或预防疾病的方法，尤其是治疗或预防病毒感染和细胞生长失调一类的疾病的方法。所述疾病的治疗方法包括服用有效量的用作反义抑制剂的标题多聚核苷酸类似物的步骤。

图的简介

图1到图25是可用于合成本发明的单聚体和寡核苷酸的化学反应顺序图解。特别是，图1表述在胸腺嘧啶和丝氨醇之间用-CH₂-CO-连接合成L-丝氨醇偶联到胸腺嘧啶单聚体氨基磷酸酯。

图2表述在胸腺嘧啶和丝氨醇之间用-CH₂-CH₂-连接，合成L-丝氨醇偶联的胸腺嘧啶单聚体氨基磷酸酯。

图3和图4表示在胸腺嘧啶和丝氨醇之间用-CH₂-CO-连接合成取代的L-丝氨醇偶联的胸腺嘧啶单聚体氨基磷酸酯。

图5表示含一个中央含羟胺的5个原子长的核苷酸间键，该核苷酸间链中的胸腺嘧啶和丝氨醇之间用-CH₂-CO-连接的T-T二聚体的合成。

图6表示其中胸腺嘧啶通过-CH₂-CO-键连接到N-乙基羟胺上的胸腺嘧啶单聚体氨基磷酸酯的合成。

图7表示其中L-丝氨酸的氨基连接到2-羟乙酰基和羟基功能基用DMT基封锁的L-丝氨醇偶联的其中丝氨酸的NH₂连接到2-羟基乙酰基上，而且羟基用DMT封锁的胸腺嘧啶单聚体氨基磷酸酯的合成。这种建筑块被用于2’-5’连接。该图还表示其中L-丝氨酸的氨基连接到2’-羟乙基功能基上的胸腺嘧啶单聚体的合成。

图8表示含2’-5’键的具有异羟肟酸酯(hydroxamate)骨架的T-T二聚体的合成。在该二聚体中，一个建筑块是由L-天冬氨酸和胸腺嘧啶构成的，另一个建筑块是由L-丝氨酸与胸腺嘧啶构成的。该二聚体的骨架中有两个外加的酰胺键。

图9表示含2’-5’键的具有异羟肟酸酯骨架的T-T二聚体的合成。在该二聚体中，一个建筑块是由L-天冬氨酸和胸腺嘧啶构成的，另一个建筑块是由L-丝氨酸与胸腺嘧啶构成的。该二聚体骨架中没有酰胺键。

图10表示其中由β-丙氨酸连接胸腺嘧啶和丝氨醇的L-丝氨醇-β-丙氨酸偶联的胸腺嘧啶单聚体氨基磷酸酯的合成。

图11表示其中由烷基胺连接胸腺嘧啶和丝氨醇的L-丝氨醇-烷基胺偶联的胸腺嘧啶单聚体氨基磷酸酯的合成。

图12表示含4’-5’键的具有异羟肟酸酯骨架的T-T二聚体的合成。该图中二聚体通过乙酰基在胸腺嘧啶和天冬氨酸之间连接，由两个L-天冬氨酸单元和两个胸腺嘧啶单元构成。

图13表示含4’-5’键的具有异羟肟酸酯骨架的T-T二聚体的合成。该图中二聚体通过乙基在胸腺嘧啶和天冬氨酸之间连接，由两个L-天冬氨酸单元和两个胸腺嘧啶单元构成。

图14表示N-羟基氨基酸偶联的胸腺嘧啶建筑块的合成。

图15表示用N-羟基胺在胸腺嘧啶和天冬氨酸之间连接的L-天冬氨酸偶联的胸腺嘧啶建筑块的合成。

图16表示含4’-5’键的具有异羟肟酸酯骨架的T-T二聚体的合成。在该图中二聚体中，羧酸基通过N-羟胺连接物偶联到胸腺嘧啶建筑块上。

图17表示取代的N-羟基氨基酸胸苷乙酸建筑块150和它的类似物149。这些单聚体建筑块可用于制备含异羟肟酸酯骨架的核酸。

图18表示含氨基酸建筑块157和158的胸苷乙酸取代的羟胺的合成。这些单聚体可用于设计具有含羟胺功能基的酰胺骨架的核酸。

图19表示在胸腺嘧啶和丝氨醇之间含羟胺残基的L-丝氨醇偶联的胸苷核苷建筑块166的合成。该建筑块可用于设计4’-5’键连的核酸。

图20表示谷氨酸-甘氨酸偶联的胸苷单聚体174的合成。该单聚体建筑块可用于合成含酰胺骨架和2’-5’键连的核酸。

图21表示在胸腺嘧啶和甘氨醇之间具有羟胺残基的甘氨醇-甘氨酸偶联的胸苷建筑块181和182的合成。这些建筑块可用于制备2’-5’键连的核酸。

图22至图25表示核糖氨基酸偶联的胸苷建筑块191，199和207的合成。这些建筑块可用于制备含核糖-酰胺骨架的寡核苷酸的合成。

图22表示含核糖-酰胺骨架的寡核苷酸211的固相合成。

图23表示1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶基乙酰基)〕-L-丙基-3-O-(N，N-二异丙基-1)基-β-氰乙基氨基磷酸酯的合成。

图24表示1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶基乙酰基)〕-D-丙基-3-O-(N，N-二异丙基)-β-氰乙基氨基磷酸酯的合成。

图25表示2-〔(β-4，4’-二甲氧基三苯甲基)-O-乙酰基)氨基〕-3-胸腺嘧啶基-L-丙基-1-O-(N，N-二异丙基)-β-氰乙基氨基磷酸酯的合成。

图26表示N-(胸腺嘧啶基乙酰基)-N-〔〔(2-异丁酰)氧〕乙基〕-O-苄基羟胺的合成。

图27表示(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-〔N₃-苯甲酰基(胸腺嘧啶-1-基)〕甲基-4-邻苯二甲酰亚胺基-吡咯烷的合成。

特殊实例的详细描述A.定义和缩写

描述本发明时，将使用如下述语，并按如下指明的那样定义这些术语。

这里使用的“反义”治疗是服用或就地生成DNA或RNA寡聚体，或它们的类似物，这些寡聚体或类似物可以专属性地结合到互补的靶核酸序列上。这种结合既可以是常规的互补性碱基配对，也可以是经历别的机制的结合，例如在结合到DNA双链时，就是通过在双螺旋的主要沟区发生特异的相互作用。“反义”是指在文献中按这种描述一般使用的技术范围，并且包括依赖于和寡核苷酸序列专属性结合的任何治疗。反义基因调控技术为分子生物学领域里的一般技术人员熟悉，在文献中可以查到有关反义基因调控的描述，例如见于美国专利U.S.5,107,065，U.S.5,166,195，US 5,087,617和Crooke，Annual Review PharmacologyToxicology 992 32，329-376。

术语“寡聚体”或“寡核苷酸”交互使用并包括RNA和DNA一类天然化合物，以及它们的合成类似物，这些合成类似物中又包括本发明的化合物。只要不特别指明，术语“寡聚体”和“寡核苷酸”就是指DNA/RNA和指它们的合成类似物两类化合物。术语“寡聚体”指由两个或多个核单聚体通过磷酸二酯链或任何其它取代链以共价键相互连接的化合物。只要不特别指明，就不应把长度限制理解到术语“寡聚体”中去。这样一来，一个寡聚体或可以有少至2个共价键连接的核单聚体(一种二聚体)，或可以长很多。寡聚体可以互补性地结合，因而能够与单链或双链核酸序列的碱基配对。寡聚体(例如二聚体至六聚体)也可用于这里描述的更长的寡聚体的合成子。寡聚体可以含非碱性位置和伪核苷。

寡聚体包括寡核苷酸、寡核苷、聚去氧核糖核酸(含2’-去氧-D-核糖或它们的修饰体)，即DNA，聚核糖核苷酸(含D-核糖或它们的修饰体)，即RNA，和嘌呤或嘧啶为碱基，或修饰的嘌呤或嘧啶为碱基的氮苷或碳苷的任何类型的聚核苷酸。这里使用的寡聚体还包括邻接的核单聚体通过异羟肟酸酯链连接的化合物寡聚体中的一般元素，例如呋喃糖环和/或磷酸二酯链可以被任何别的合适的功能等价元素取代。术语“寡聚体”包括用作碱基的底盘或载体的任何结构，其中底盘允许以序列依赖的方式结合到靶性核酸上。目前已知可分为四类的寡聚体的特点是具有：(i)磷酸二酯或磷酸二酯类似物(硫代磷酸酯，甲基磷酸酯等等)链；(ii)含非亚磷电子等排体的取代链(核糖缩醛，甲醛缩醛，氨基甲酸酯，等等)，(iii)吗啉代残基，碳环残基，或其它呋喃糖，例如阿拉伯糖，或己糖取代核糖或去氧核糖，和(iv)经酰胺键连接的核单聚体或经任何其它合适的取代链连接的非环核单聚体。

这里使用的术语“核单聚体”指包含(1)以共价键连接到(2)第二个残基上的残基。核单聚体包括核苷，核苷酸或与氨基醇相连的碱基。核单聚体能够连接形成寡聚体，该寡聚体能够以序列专属的方式结合到靶或核酸的互补性碱基序列上。

这里使用的“第二残基”指连接到核单聚体上的化合物，并包括氨基酸/氨基醇残基，通常是丝氨醇、天冬氨酸、谷氨酸。甘氨酸和含有修饰的氨基酸残基的那些化合物，例如其中的一个或多个氢被别的功能基取代(见分子式24-41)，或一个羧酸初功能化醇、胺、硫醇、羟胺等。这里定义的核单聚体还包括连接到连接到一氨基酸或氨基醇和/或氨基酸/具有游离羧基和/或游离氨基和/或它们的保护形态的醇类似物上的。

这里使用的术语“核苷”是指下面描述的它们的氨基酸和氨基醇衍生物，如同下面定义的那样，这些类似物含嘌呤，嘧啶或它们的类似物，但不含磷酸二酯类似物或修饰的核苷间键的一类的连接残基。“5’”核苷是指核苷提供5’位碳与连接残基结合。连接残基的“5’”端与“5’”核苷偶联。连接残基的“3’”端连接到下一个核苷的3’位。若存在明确不包括3’和/或5’碳的修饰核苷，技术人员就应理解为该“3’”和“5’”术语用于描述与DNA和RNA中使用的链极类似。

这里使用的术语“核苷”指碱基以共价键连接到氨基醇/氨基酸类似物，并且在碱基和氨基醇及氨基酸之间含有连接基。正常情况下，术语核苷包括核糖核苷，去氧核糖核苷或任何其它碱基的氮苷或碳苷的核苷。

这里使用的术语“核苷酸”指具有磷酸酯基或磷酸酯基类似物(含与磷酸酯中的亚磷相同氧化态的磷的基团，例如硫代磷酸酯，酰胺)。

这里使用的术语“碱基”指各种核苷碱基，包括嘌呤，嘧啶杂环，杂环类似物和它们的互变异构体。嘌呤包括腺嘌呤，鸟嘌呤，黄嘌呤，范例性的嘌呤类似物包括8-氧代-N₆-甲基腺嘌呤和7-去氮杂黄嘌呤。嘧啶包括尿嘧啶和胞嘧啶，以及它们的类似物例如5-甲基胞嘧啶，5-(1-丙炔基尿嘧啶)，5-(1-丙炔基胞嘧啶)，5-甲基尿嘧啶和4，4-桥亚乙基胞嘧啶。“碱基”连接到一个合适的分子骨架上时，例如连接到磷酸二酯骨架上时该碱基即有能力进入双链DNA或其它类似结构的双链核酸的碱基配对关系。碱基还有能力进入三重螺旋核酸的碱基配对关系。

这里使用的术语“糖修饰”指2’-去氧核糖以外的任何氨基酸或氨基醇残基。

这里使用的术语“氨基酸/氨基醇”指任何天然氨基酸和醇的“R”和“S”两种异构体。

这里使用的术语“核苷链”是指存在于单聚体中的链。

这里使用的术语“链”是指用于连接碱基与氨基酸/氨基醇及它们的衍生物的残基。

这里使用的术语“核苷酸间链”指以共价键连接相邻的核单聚体的磷酸二酯残基(-O-P(O)(O)-O-)或任何其它功能等价的残基。

这里使用的术语“取代链”指以共价键偶联相邻核单聚体天然基团或任何合适的残基的类似物。取代链包括磷酸二酯类似物，例如磷酸硫代酯和甲基磷酸酯，以及含非磷的链，例如酰胺，异羟肟酸酯，羟胺等。取代链包括本发明的含非磷链(2’，5’-链，3’，5’链和4’，5’链)。

这里使用的术语“交连残基”指与靶性核酸共价键结合的寡聚体中的基团或残基。交连残基包括将寡聚体与靶性核酸共价键连接的共价结合的亚基，或者即时发生结合(例如N⁴，N⁴-桥亚乙基胞嘧啶)或经光活化发生结合(例如补骨脂灵)等等。

这里使用的术语“封锁基”指H以外的取代基，该取代基以共价键偶联到寡聚体或核单聚体上，或作为保护基，或作为合成中的偶联基，OPO_3-2，或其它常规的共价共轭物，例如固相载体，标记物，抗体，单克隆抗体或它们的片段，等等。正如这里使用的，俚语“封锁基”单纯指不保护基，还包括H-磷酸酯或氨基磷酸酯一类的偶合基。

这里使用的术语“保护基”指能够保护与之相连的氧原子，硫原子或氮原子的任何基团，使这些原子不参加反应或结合。核单聚体碱基氮原子上的这类保护基以及这些保护基的引入按常规为文献已知。非限制性的合适保护基的例子包括：二异丁基甲咪基，苯甲酰基，硅烷基，等等。氧原子和硫原子的合适保护基有DMT，MMT，FMOC或酯类。这里使用的“保护基”包括能够保护与之相连的氧原子，硫原子或氮原子不参与反应或结合的任何基团。核单聚体中的氧原子，硫原子和氮原子的这类保护基的描述及其引入方法常规地都有文献报道。保护基还包括能够防止羧酸和硫醇等反应和结合的任何基团。

这里使用的“偶联基”指适合于核单聚体之间生成链或取代链的任何基团，例如磷酸氢酯和氨基磷酸酯。

这里使用的术语“共轭物”或“共轭残基”指连接到寡聚体末端或连接到寡聚体自身之内的任何基团。共轭物包括固相载体，例如硅胶，控制孔径的玻璃和聚苯乙烯；标记物，例如荧光粉，化学发光物，放射性原子或分子，酶性残基，以及信息基团；寡聚转运剂，例如聚阳离子，血清蛋白和糖蛋白以及高聚物等等。其它共轭残基，包括O-胆甾醇，聚乙二醇(PEG)，氨基酸，嵌入剂，多核苷酸纯化残基，交联功能基，脂类，异羟肟酸酯，烷基化试剂等等。

这里使用的术语“合成子”指在本发明的寡核苷酸类似物内的结构单元。

这里使用的术语“转染作用”指适合于加强寡聚体向细胞转运的任何方法。

这里使用的术语“受试者”指植物或动物，包括哺乳动物，尤其是人。

术语“衍生物”和它们的单聚成分寡聚体包括文献中常规认可的那些衍生物和寡聚体。例如寡核苷酸可以经共价键连接到各种残基，例如连接到嵌入剂上，连接到专属地与DNA双螺旋的微沟相互作用的化合物上，以及连接到任意选择的共轭物例如标记物(放射性物质，荧光物质，酶等等)。这些附加的残基可以(但不必须)通过作为链本身一部分的修饰的骨架链衍生。例如吖啶一类的嵌入剂可以通过与RNA或DNA末端的5’位或RNA的2’位的含有-OH或-SH用R-CH₂-连接，或将OH基或SH基引入嘧啶的5位，例如以5位含-CH₂CH₂CH₂OH或-CH₂CH₂CH₂SH的衍生化形式代替胞嘧啶的5-甲基。可以连接范围广泛的取代基，包括通过常规链连接的那些取代基。这样一来，通式(I)的寡聚物中指明的OH残基可以被磷酸酯基取代，可以被标准的保护基保护或可以被活化以便制备另外的与别的核苷酸相连的链，或可以结合到共轭取代基上。5’末端OH基按常规方法进行磷酸化，2’-OH基或3’末端的羟基取代基也可以被磷酸化。羟基也可以被衍生化成标准的保护基。

这里使用的术语“磷酸二酯类似物”指常规磷酸二酯链类似物以及变换的连接基团。这些变换的连接基团其中包括O-P-(O)以P(O)S，P(O)NR₂，P(O)R，P(O)OR’取代，其中R为H或(C1-7)烷基，R’为(1-7C)烷基的实例，当然不限于这些。相同寡聚体中的磷酸二酯链不必要相同，唯一的要求是这些链中至少有一个是这里描述的修饰的核苷酸间链。

嘌呤和嘧啶的“类似物”形态是文献中一般都是已知的形态，它们中的许多化合物都用作化疗剂。一个例证性清单包括：4-乙酰基胞嘧啶，8-羟基-N₆-甲基腺嘌呤，吖丙啶基胞嘧啶，，伪异胞嘧啶，5-(羧羟甲基)尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，肌苷，N₆-异戊烯基腺嘌呤，1-甲基腺嘌呤，1-甲基伪尿嘧啶，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N₆-甲基腺嘌呤，7-甲基腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶，β-D-甘露糖基鸟嘌呤，5’-甲氧羰基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N₆-异戊烯基腺嘌呤，N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧乙酸，氧丁氧肌苷，伪尿嘧啶，gueosine，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧乙酸，伪尿嘧啶，guesme，2-硫胞嘧啶，以及2，6-二氨基嘌呤。该清单并非遗漏无余。特别优选的类似物为5-甲基胞嘧啶(这里缩写为“Cme”)。

这里使用的术语“电子等排”指核苷间链的空间或取向性质，以及这样一个事实，即这些性质与天然磷酸二酯键的性质是如此相似，以至于含电子等排键的修饰的寡核苷酸将取代，仿生天然寡核苷酸和/或与天然寡核苷酸杂交。

这里使用的术语“核糖-酰胺”指存在于两个核碱基之间的核苷酸间链。核糖-酰胺核苷酸间链兼有核糖/(2’-去氧)核糖和氨基酸功能。

本申请书使用了各种缩写表示功能基和化合物。这些缩写容易为有机化学领域的专业人员理解，例如“Ph”指苯基，“Me”指甲基，“(1-7C)”指一给定的碳链含1个至7个碳原子，等等。

本发明的说明

本发明提供了在碱基和骨架(磷酸二酯、磷酸硫酯和表1中所示的其它亚基)之间含修饰氨基酸/氨基醇的新寡核苷酸类似物，本发明还涉及修饰的寡核苷酸链。本发明也涉及它每的的修饰或功能基的等价变换，即用氨基酸衍生物取代处于骨架和碱基之间的糖残基，例如分子式24所示的那种方式。本发明还提供了新核单聚体和把它们插入到含核单聚体的寡聚体中的方法学。

本发明提供了具有分子式1-23的各种核单聚体化合物。

本发明的寡聚体为高聚体，这类高聚体包括1个或多个连接的标题单聚体化合物，以便提供DNA或RNA的结构类似物。本发明的寡聚体包括两种或多种核单聚体，虽然200个残基的寡聚体或200残基以下的核寡聚体一般容易合成，但可以实质性地含有任何数目的核单聚体。分子式1-23的化合物可以象分子式24-41中所示的那样通过4’-5’链，3’-5’链和2’-5’链相互连接。

本发明的化合物中的核苷酸链由丝氨酸和甘氨酸一类的氨基酸或它们的衍生物构成。本发明的寡核苷酸在体内稳定，具有抗内源性核酸酶的性能，能够杂化到靶性核苷酸序列上。本发明的化合物的范例见于分子式24至41，而且从构象上看更加严格地与未修饰的DNA或RNA中的磷酸二酯链相关。这种构象限制部分可由于标题化合物与多聚核苷酸靶性序列的互补性结合的性能增强；不过本发明的应用并不依赖于增强结合性能的理论。

在另一个具体例中，本发明指向修饰的寡核苷酸或它们的衍生物，其中天然寡核苷酸例如DNA或RNA中的呋喃糖残基被氨基酸/氨基醇残基取代，包括在氨基酸位置上取代的修饰，见于分子式25至41。相邻核单聚体间的核苷酸间链是相邻的核单聚体的4’和5’位之间的链。换句话说，磷酸二酯核苷酸间链或它们的功能等价物原始来源于一个核单聚体的5’位和相邻单聚体的4’位连接，作为范例见于分子式24-33。

其中每个”R”各自独立为H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph，-(CH₂)x-F；其中“x”是1-7C和“F”是NH₂，SH，OH，COOH，OCH₃，SCH₃，SPh，NOH，NOH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃，Ph。

其中每个“碱基”各自独立为核苷碱基。

其中每个“R₁”各自独立为H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph，-(CH₂)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH₂，SH，OH，COOH，OCH₃，SCH₃，SPh，NOH，NOH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃，Ph。

其中每个“R₂”各自独立为H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph，-(CH₂)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH₂，SH，OH，COOH，OCH₃，SCH₃，SPh，NOH，NOH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃，Ph。

其中每个“R₃”各自独立为H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph，-(CH₂)x-F；其中“x”是1-7C和“F”是NH₂，SH，OH，COOH，OCH₃，SCH₃，SPh，NOH，NOH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃，Ph。

其中每个“R₄”各自独立为H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph，-(CH₂)x-F；其中“x”是1-7C和“F”是NH₂，SH，OH，COOH，OCH₃，SCH₃，SPh，NOH，NOH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃，Ph。

其中各个“A”各自独立为(CH₂)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH₃，NR₅，和Se，其中“x”是1-7。

其中各个“B”各自独立为(CH₂)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH₃，NR₅，和Se，其中“x”是1-7。

其中各个“X”各自独立为(CH₂)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH₃，和NR₅，其中“x”是1-7。

其中各个“Z”各自独立为(CH₂)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH₃，和NR₅，其中“x”是1-7。

R₅为H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH₃，ONH₂，乙基，丙基，低级烷基(1-7C)，甲基，杂烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，-(CH₂)xF；其中“x”是1-7，和“F”独立为H，OH，SH，OCH₃，CN，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃，Ph。

其中每个“V”各自独立的磷酸二酯类似物，磷酸硫代酯，甲基膦酸酯，磷酸二硫代酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，氨基磷酸酯，乙酰基酰胺化物，氧化甲酰胺基，氧化乙酰胺基，二异丙基硅烷，氨基甲酸酯，二亚甲基硫醚，二亚甲基亚砜，二亚甲基砜和/或2至4个原子长的核苷间链，这些原子选自碳、氮、氧、硫、和硒。寡聚体的长度可以从2聚体变至200聚体，甚至更长。优选的修饰核苷酸间链包括表1中的结构“V”。

相应地通式的化合物可以共轭到1个或多个共轭残基上。适宜的共轭残基包括O-甾醇、聚乙二醇、氨基酸、嵌入剂，分隔残基(Cleavingmoieties)(例如咪唑)，交联功能基(例如补骨脂灵)、类酯、多肽、烷基化试剂、异羟肟酸酯、以及荧光标记物。共轭残基可以独立地取代R， R₁，R₂，R₃，R₄，和R₅中的1个或多个。

在其它实例中，本发明提供了分子式34-36中指明的寡聚体结构和它们的衍生物：式34

在分子式34-36的化合物中，相邻核单聚体为3’至5’连接。

其中每个”R”各自独立为H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph，-(CH₂)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH₂，SH，OH，COOH，OCH₃，SCH₃，SPh，NOH，NOH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃，Ph。

其中每个“碱基”各自独立为核苷碱基。

其中每个“R₃”各自独立为H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph，-(CH₂)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH₂，SH，OH，COOH，OCH₃，SCH₃，SPh，NOH，NOH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃，Ph。

其中每个“R4”各自独立为H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph，-(CH₂)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH₂，SH，OH，COOH，OCH₃，SCH₃，SPh，NOH，NOH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃，Ph。

其中各个“X”各自独立为(CH₂)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH₃和NR₅，其中“x”是1-7。

其中各个“Y”各自独立为(CH₂)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH₃和NR₅，其中“x”是1-7。

其中各个“Z”各自独立为(CH₂)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH₃和NR₅，其中“x”是1-7。

其中每个“V”各自独立为磷酸二酯类似物，磷酸硫代酯，甲基膦酸酯，磷酸二硫代酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，氨基磷酸酯和/或2至4个原子长的核苷间链，这些原子选自碳、氯、氧、硫、和硒。寡聚物的长度可以由二聚体变至200聚体或更长。优选的修饰核苷间链包括表1中的结构“V”。

本发明的另一个实例中，本发明的目标是提供分子式为37至41的寡聚体或它们的变形，提供包括2’，5’链的新核苷间链的寡聚体。这些寡核苷酸在体内稳定，已经改善了对内源性核苷酶的稳定性，并有能力往靶性寡核苷酸序列上杂交。

其中每个“碱基”各自独立为核苷碱基。

其中每个“R₂”各自独立为H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂ONH(CH₃)，Ph，-(CH₂)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH₂，SH，OH，COOH，OCH₃，SCH₃，SPh，NOH，NOH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃，Ph。

其中每个“R₄”各自独立为H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph，-(CH₂)x-F；其中“x”是1-7和“F”是NH₂，SH，OH，COOH，OCH₃，SCH₃，SPh，NOH，NOH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃，Ph。

其中各个“X”各自独立为(CH₂)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH₃和NR₅其中“x”是1-7。

其中每个“V”各自独立为磷酸二酯类似物，磷酸硫代酯，甲基膦酸酯，磷酸二硫代酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，氨基磷酸酯和/或2至4个原子长的核苷间链，这些原子选自碳、氮、氧、硫、和硒。寡聚物的长度可以由二聚体变至200聚体。优选的修饰核苷间链包括表1中的结构“V”。

在本发明的另一个实例中，标题发明涉及下面分子式的寡聚体(分子式42)以及它们的单聚成分(分子式85-90)。

其中X为选自(CH₂)_n，其中n＝1-3，CO(CH₂)_n，其中n＝0-2，和(CH₂)_nSO₂，其中n＝1-2的基团，

Y为选自CH₂，CO，COOH，CS，及SO₂的基团。

Y’为选自CH₂，CO，COOH，CS和SO₂的基团。

Z为选自O，S，NH和CH₂的基团。

R为选自CH₂OH，CH₂NH₂，CH₂NHCHO，CONH₂和COOH的基团。B为核苷碱基。

其中X为选自(CH₂)_n，其中n＝1-3，CO(CH₂)_n，其中n＝0-2，和(CH₂)_nSO₂其中n＝1-2的基团

Y为选自CH₂，CO，COOH，CS，及SO₂的基团。

Y’为选自CH₂，CO，COOH，CS和SO₂的基团。

Z为选自O，S，NH和CH₂的，基团。

在另一个实例中，本发明提供了通过核苷酸序列介导治疗疼痛的方法，该方法包括给予需要进行这种治疗的对象服用一定量的上面修饰的寡核苷酸，这些寡核苷酸能够专属性地结合到核苷酸序列上，一般使该序列失活。

在本发明的寡核苷酸中，至少有一种包括在分子式24-41的“Vs”中的磷酸二酯基被这里描述的修饰核苷间链取代。理想的是未修饰寡核苷酸中的多个磷酸二酯链被可以反复在该结构中使用的修饰的核苷间链取代，或者在期望时一系列修饰的核苷间链可用于各个寡核苷酸。在目标寡核苷酸的优选实例中，这些取代链是非手性的，以便增强寡核苷酸往期待的靶上杂交的能力，不过本发明的有用的化合物包括那些使用了手性形态的实例。

优选的修饰核苷酸间链包括表1中的”V”结构。Ｘ

表1

-O-

-S-

-S(O)-

-S(O)(O)-

-Se-

-Si-

-C(O)-

-C(S)-

-NH-

-NOH-

-NCH₃-

-NR₅-

-CH₂-

-O-CH₂-

-CH₂-O-

-O-CH₂-CH₂-

-CH₂-CH₂-O-

-CH₂-O-CH₂-

-O-CH₂-O-

-S-CH₂-

-CH₂-S-

-S-CH₂-CH₂-

-CH₂-CH₂-S-

-CH₂-S-CH₂-

-S-CH₂-S-

-O-CH₂-S-

-S-CH₂-O-

-S(O)-CH₂-

-CH₂-S(O)--S(O)-CH₂-CH₂--CH₂-CH₂-S(O)--CH₂-S(O)-CH₂--S(O)-CH₂-S(O)-

-O-CH₂-S(O)-

-S(O)-CH₂-O-

-S(O)(O)-CH₂-

-CH₂-S(O)(O)--S(O)(O)-CH₂-CH₂--CH₂-CH₂-S(O)(O)--CH₂-S(O)(O)-CH₂--S(O)(O)-CH₂-S(O)(O)--O-CH₂-S(O)(O)--S(O)(O)-CH₂-O-

-S-S-

-S(O)-S(O)-

-S(O)(O)-S(O)-(O)-

-Se-CH₂-

-CH₂-Se-

-Se-CH₂-CH₂-

-CH₂-CH₂-Se-

-CH₂-Se-CH₂-

-Se-CH₂-Se-

-O-CH₂-Se-

-Se-CH₂-O-

-Se(O)-CH₂-

-CH₂-Se(O)-

-Se(O)-CH₂-CH₂-

-CH₂-CH₂-Se(O)-

-CH₂-Se(O)-CH₂-

-Se(O)-CH₂-Se(O)-

-O-CH₂-Se(O)-

-Se(O)-CH₂-O-

-Se(O)(O)-CH₂-

-CH₂-Se(O)(O)--Se(O)(O)-CH₂-CH₂--CH₂-CH₂-Se(O)(O)--CH₂-Se(O)(O)-CH₂--Se(O)(O)-CH₂-Se(O)(O)-

-Se-Se-

-Se(O)-Se(O)--Se(O)(O)-Se(O)-(O)-

-O-CH₂-Se(O)(O)-

-Se(O)(O)-CH₂-O-

-S-CH₂-Se-

-Se-CH₂-S-

-S(O)-CH₂-Se(O)-

-Se(O)-CH₂-S(O)--S(O)(O)-CH₂-Se(O)(O)--Se(O)(O)-CH₂-S(O)(O)-

-S-S-

-S(O)-S(O)-

-S(O)(O)-S(O)(O)-

-Se-Se-

-Se(O)-Se(O)--Se(O)(O)-Se(O)(O)-

-N(R₅)-CH₂-

-CH₂-N(R₅)-

-N(R₅)-CH₂-CH₂-

-CH₂-CH₂-N(R₅)-

-CH₂-N(R₅)-CH₂-

-N(R₅)-O-

-O-N(R₅)-

-N(R₅)-O-CH₂-

-CH₂-O-N(R₅)-

-CH₂-N(R₅)-O-

-O-N(R₅)-CH₂-

-O-CH₂-N(R₅)-

-N(R₅)-CH₂-O-

-N(R₅)-S-

-S-N(R₅)-

-N(R₅)-S-CH₂-

-CH₂-S-N(R₅)-

-CH₂-N(R₅)-S-

-S-N(R₅)-CH₂-

-S-CH₂-N(R₅)-

-N(R₅)-CH₂-S-

-N(R₅)-S(O)-

-S(O)-N(R₅)--N(R₅)-S(O)-CH₂--CH₂-S(O)-N(R₅)--CH₂-N(R₅)-S(O)--S(O)-N(R₅)-CH₂--S(O)-CH₂-N(R₅)--N(R₅)-CH₂-S(O)-

-N(R₅)-S(O)(O)-

-S(O)(O)-N(R₅)--N(R₅)-S(O)(O)-CH₂--CH₂-S(O)(O)-N(R₅)--CH₂-N(R₅)-S(O)(O)--S(O)(O)-N(R₅)-CH₂--S(O)(O)-CH₂-N(R₅)--N(R₅)-CH₂-S(O)(O)-

-O-N(R₅)-S-

-S-N(R₅)-O-

-O-N(R₅)-S(O)-

-S(O)-N(R₅)-O-

-O-N(R₅)-S(O)(O)-

-S(O)(O)-N(R₅)-O-

-O-S-O-

-O-S(O)-O-

-O-S(O)(O)-O-

-N(R₅)-S-N(R₅)-

-N(R₅)-S(O)-N(R₅)--N(R₅)-S(O)(O)-N(R₅)-

-CH₂-S-O-

-CH₂-S(O)-O-

-CH₂-S(O)(O)-O-

-CH₂-C(O)-O-

-CH₂-C(S)-O--CH₂-N(R₅)-C(O)-O--CH₂-N(R₅)-C(S)-O--N(R₅)-C(O)-O-CH₂--N(R₅)-C(S)-O-CH₂-

-O-C(O)-N(R₅)-O-

-O-C(S)-N(R₅)-O--O-C(O)-N(R₅)-CH₂--O-C(S)-N(R₅)-CH₂- -O-C(O)-CH₂-N(R₅)--O-C(S)-CH₂-N(R₅)--O-C(O)-CH₂-O-N(R₅)--O-C(S)-CH₂-O-N(R₅)--O-C(O)-N(R₅)-O-CH₂--O-C(S)-N(R₅)-O-CH₂--O-N(R₅)-C(O)-O-CH₂--O-N(R₅)-C(S)-O-CH₂--CH₂-O-C(O)-N(R₅)-O--CH₂-O-C(S)-N(R₅)-O--CH₂-O-C(O)-N(R₅)-CH₂--CH₂-O-C(S)-N(R₅)-CH₂--CH₂-O-C(O)-CH₂-N(R₅)--CH₂-O-C(S)-CH₂-N(R₅)--CH₂-O-C(O)-N(R₅)--CH₂-O-C(S)-N(R₅)--CH₂-O-C(O)-N(R₅)-O--CH₂-O-C(S)-N(R₅)-O--CH₂-O-N(R₅)-C(O)-O--CH₂-O-N(R₅)-C(S)-O--CH₂-N(R₅)-C(O)-S--CH₂-N(R₅)-C(S)-S--N(R₅)-C(O)-S-CH₂--N(R₅)-C(S)-S-CH₂--S-C(O)-N(R₅)-O--O-C(S)-N(R₅)-S--S-C(O)-N(R₅)-CH₂--S-C(S)-N(R₅)-CH₂--S-C(O)-CH₂-N(R₅)--S-C(S)-CH₂-N(R₅)--S-C(O)-CH₂-O-N(R₅)--O-C(S)-CH₂-S-N(R₅)--O-C(O)-N(R₅)-S-CH₂--S-C(S)-N(R₅)-O-CH₂--S-N(R₅)-C(O)-O-CH₂--O-N(R₅)-C(S)-S-CH₂--CH₂-S-C(O)-N(R₅)-O--CH₂-O-C(S)-N(R₅)-S--CH₂-S-C(O)-N(R₅)-CH₂--CH₂-S-C(S)-N(R₅)-CH₂--CH₂-S-C(O)-CH₂-N(R₅)--CH₂-S-C(S)-CH₂-N(R₅)--CH₂-S-C(O)-N(R₅)--CH₂-S-C(S)-N(R₅)--CH₂-S-C(O)-N(R₅)-O--CH₂-S-C(S)-N(R₅)-O--CH₂-S-N(R₅)-C(O)-O--CH₂-S-N(R₅)-C(S)-O--CH₂-O-C(O)-N(R₅)-S--CH₂-O-C(S)-N(R₅)-S--CH₂-O-N(R₅)-C(O)-S--CH₂-O-N(R₅)-C(S)-S-

-N(R₅)-N(R₅)--N(R₅)-N(R₅)-CH₂--CH₂-N(R₅)-N(R₅)--N＝C(NH₂)-N(R₅)--N(R₅)-N＝C(NH₂)-

-S(O)-CH₂-O-

-O-CH₂-S(O)-

-S-CH(R₅)-O-

-O-CH(R₅)-S-

-O-CH₂-CH＝CH-

-S-CH₂-CH＝CH-

-S-CH₂-C＝C--N(R₅)-CH₂-N(R₅)--N(R₅)-C(O)-N(R₅)--N(R₅)-C(S)-N(R₅)--N(R₅)-C(O)-S--N(R₅)-C(S)-S--N(R₅)-C(S)-O--N(R₅)-C(O)-O--O-C(O)-N(R₅)--O-C(S)-N(R₂)--S-C(O)-N(R₅)--S-C(S)-N(R₅)-

R₅为H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH₃，ONH₂，乙基，丙基，低级烷基(1-7C)，Me，杂烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，-(CH₂)xF，其中“x”为1-7，“F”独立为H，OH，SH，OCH₃，CN，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃，Ph。另外，一个或多个共轭物残基可以并连接到链上以便形成寡聚共轭物。适宜的共轭物残基包括O-胆甾醇，聚乙二醇，氨基酸，嵌入物，间隔残基(例如咪唑)，交联功能基(例如补骨脂灵)，类酯，多肽，烷化剂，异羟肟酸酯，以及荧光标记物。

特别优选的4’-5’链包括磷酸二酯，磷酸硫代酯，甲基磷酸酯，氨基甲酸酯，硫代氨基甲酸酯，异羟肟酸酯，磺胺，羟胺和氨基甲酸酯。相同的修饰对于2’-5’和3’-5’链也是优选的。

本发明的寡聚体不限于均链型的寡聚体，也包括2’，5’链交替变化或随机分布性取代的链。由于本发明的寡聚体可以一次合成一个核单聚体残基，所以每一个链，和/或取代链，以及每一个“碱基”取代基的性质都可以独立地选择，以便生成具有期望的序列的寡核苷酸。

本发明的寡聚体可以含有任何期望数目的取代链。通过选择包括其它非发明取代链的“V”的实例的功能可以使这些取代链相同或不同。由于寡聚体是逐步制备的，所以可以使用任何链或取代链的类型，可使用任何碱基和糖基的任何修饰。

本发明的优选实例中，本发明的取代链按规定的模式交替。例如，一个取代链后面接两个磷酸二酯链，然后接一个本发明的取代链等等。另外的实例包括，改变的链例如一个取代链后接一个磷酸二酯类似物(例如磷酸硫酯等等)，然后再接一个本发明的取代链，该取代链之后再接磷酸二酯类似物等等。即本发明的寡聚体可以由两种类型的取代链一个一个地交替排列。由一种以上类型的链组成的本发明的寡聚体可以具有任何数目有规律的模式，这种模式是由存在于寡聚体的亚单位之间的不同类型的链交替排列形成的。

本发明的寡聚体中的一个或多个核单聚体残基都可以进行糖修饰，不过当氨进行这类修饰时，氨基酸残基之间的4’-5’，3’-5’和2’-5’核苷酸链优选。在这种情况下，可以使用进一步的缩写表示寡核苷酸类似物碱基序列。例如在标准DNA(或RNA)中一般仅用碱基表示序列，例如ATG，CGC，TGA。一般情况下事先都简单说明到底这是表示RNA序列还是表示DNA序列。这里使用一套对应的表述体系以便描述具有给定的碱基序列的寡核苷酸类似物。另外的核单聚体修饰

除本发明的取代链外，本发明的寡聚体也可以包括不同的修饰。另外的修饰包括寡聚体中(I)在2’，3’，4’，和5’位对一个或多个核单聚体残基进行修饰，(ii)插入一个或多个共价交联的残基，(iii)包括其它非发明的取代链，(iv)包括其它碱基类似物，例如8-氧代-N⁶-甲基腺嘌呤，和(v)包括分别增强对靶性核酸序列结合率或增强寡聚体与细胞关联的嵌入剂或聚赖氨酸。

本发明的寡聚体的序列特异性聚核苷酸对单股或双股靶的结合性质与对寡聚体进一步进行修饰是一致的。这些进一步的修饰也可以贡献别的有用的性质，例如对核苷酶裂解的稳定性(例如在具有磷酸二酯链的本发明的寡聚体的一个区域内)，或增强它们的穿透细胞膜的能力，等等。

本发明的寡聚体可以包括一个或多个取代链，例如硫化物链或砜链(Bemer，S.A.，International Publication No.wo 89/12060)，Sulfamate链(International Publication No.wo 91/15500)，吗啉代连接的寡聚体中的氨基甲酸酯或其它取代链(Stirchak，E.P.et al.，Nucleic Acids Res，1989，17，6129-6141；Summerton，J.et al.，International Pubhcation No.216860)以及有关的链。

这样一来，本发明的寡聚体的例证性实例包括具有以下特点的寡聚体(1)有至少一个取代链和一个连接到相邻的单聚体上的氨基酸，以及(2)有一个或多个非发明的取代链，这些取代链选自磷酸硫代酯，甲基磷酸酯和硫代甲基磷酸酯和/或(3)有一个或多个磷酸二酯链和/或(4)有可以增强对互补性靶序列结合率的嘌呤或嘧啶。其它例证性寡聚体包括(1)在3’和/或5’端有发明的取代链和其它部位有磷酸硫酯链的寡聚体；(2)具有本发明的取代链和标准嘌呤或嘧啶碱基(例如腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶)的寡聚体；(3)具有本发明的取代链和一个或多个可以增强寡聚体的结合率或渗透感受态的寡聚体(例如5-甲基胞嘧啶，5’-(1-丙炔基)尿嘧啶，5-(1-丙炔基)胸腺嘧啶)。还包括含经由异羟肟酸酯连接的核单聚体残基的寡聚体。寡聚体的合成

本发明的寡聚体可以单独使用本发明的核单聚体或与常规的核单聚体结合来形成，并使用标准的固相(或液相)寡聚体合成技术来合成，这些原料现在都可以买到。一般来说，本发明的寡聚体可以通过由下述步骤组成的方法合成：合成具有保护基的核单聚体或寡聚体合成子、碱基以及能够往核单聚体或寡聚体上偶联的偶联基；将核单聚体或寡聚体合成子偶联到收受性核单聚体或收受性寡聚体上；去保护基；按需要重复这个循环直至合成出期待的寡聚体。

本发明的寡聚体可以是包括比40，50，100，200或500个核单聚体还大的任何长度的寡聚体。一般说来，优选的寡聚体含2-30个核单聚体。只要具有适当的碱基序列大于或等于大约8至20个核单聚体的长度对于治疗或诊断应用就有用。本发明特别包括含2，3，4，或5个核单聚体的短寡聚体并可用作合成子。

具有随机序列并含大约6，7或8个核单聚体的寡聚体可以用作克隆中的引物或用作随机序列引物中的糖增强本底，只要寡聚物在3’端含大约1个或2个残基就可用作聚合酶或递转录酶的引物或者否则分话不干扰聚合酶的活性。

除了这里首次描述的链以外，本发明的寡聚体可以包括常规磷酸二酯链或可以含有除本发明的取代链以外的氨基磷脂链一类的其它取代链。这些取代链包括但不限于下述实例，其中通式-O-P(O)(S)-O-(“磷酸硫代酯”)，-O-P(O)(NR₂”)-X²，-O-P(O)(R”)-O-，-O-P(S)(R”)-O-(“硫代烷基磷酸酯”)，-P(O)(OR”)-X²，-O-C(O)-X²，或-O-C(O)(NR₂”)-X²-的残基中R¹¹为H(或一种盐)或烷基(1-12C，包括甲基和乙基)，R³为烷基(1-9C)，而且链通过与核单聚体的碳连接的-O-或-S-连接到相邻核单聚体上，X为O或S。磷酸硫酯和磷酸二酯链是已知的。本发明的寡聚体中使用的特别优选的取代链包括磷酸二酯、磷酸硫酯、甲基磷酸酯和硫甲基磷酸酯取代链。磷酸硫酯和甲基磷酸酯取代链为必需是同一的寡聚体提供了附加的稳定性，本发明的特别优选的寡聚体含有一个或多个磷酸硫酯或甲基磷酸酯取代链。

本发明的寡聚体或它们的片段可以使用本专业的技术人员已知的方法合成。采用适当的保护核单聚体按照该领域和这里描述的合成方法可以用来合成本发明的含取代链的寡聚体以及文献中已知的其它链或取代链。已经合成了具有含亚磷链的寡聚体的方法，例如见于Froehler，B.，etal.，Nucleic Acids Res.，1986，14，5399-5467；Nucleic Acids Res.，1988，16，4831-4839；Nucleosides & Nucleotides，1987，6，287-291；Froehler，B.，Tetrahedron Letts.，1986，27，5575-5578；Caruthers，M.H.in Oligodeoxynucleotides Antisense Inhibitions of Gene Expression，1989，J.S.Cohen，editor，CRC Press，Boca Raton，p7-24； Reese，C.B.et al，Tetrahedron Letts.，1985，26，2245-2248。经由甲基氨基磷酸酯化学合成甲基磷酸酯链连接的寡聚体的方法业已有描述(Agrawal，S.etal.，Tetrahedron Letts.，1987，28，3539-3542；Klem，R.E.，et al，International Publication Number WO 92/07864)。

含本发明的链的寡聚体也可以适当地通过用液相方法制备二聚体或三聚体化合物，接着通过固相或液相法将合成子转变为插入到寡聚体中的衍生物来合成。典型的合成子为5’DMT或MMT封锁的3’磷酸酯或氨基磷酸酯衍生物，它们可通过标准方法制备。(见Gait，M.J.ed.，Oligonucleotide Synthesis；A Practical Approach 1984，IRL Press，Oxford)。

包括在本发明范围内的合成子包括用固相法或液相法制备的二聚体，三聚体，四聚体，六聚体和更长的寡聚体。三聚体和更长的合成子可以含1个以上类型的链。这种合成子可以包括上面叙述过的任何碱基，或诸如前面描述的OH，DMTO，MMTO，O-烯丙基，磷酸酯，phosphonate或酰胺化物一类的2’，3’4，和5’基。

使用标准的固相多肽合成(Fmoc化学)条件可以合成核糖-酰胺寡聚核苷酸(见图26)。用于本发明化合物合成的封锁基

1.偶联基

适宜的偶联基包括，例如H-磷酸酯，甲基磷酰胺(methylphosphonamidite)，或氨基磷酸酯。能够使用的氨基磷酸酯包括β-氰乙基氨基磷酸酯(优选)。也可以使用甲基磷酰胺，烷基磷酸胺(包括乙基磷酰胺和丙基磷酰胺)。例证性的氨基磷酸酯见于图1至图21。

经过氨基磷酸三酯化学，这里称为“氨基酯(amidite)”化学，在2’，3’，4’或5’位合成寡聚体的“偶联基”包括：N，N-二异丙基氨基-β-氰乙氧基膦，N，N-二异丙基氨基-甲氧基膦，：N，N-二乙氨基-氰乙氧基膦和(N-吗啉代)-甲氧基膦(Moore，M.F.et al，J Org Chem.，1985，50，2019-2025；Uznanski，A.W.，et al，Tetrahedron Letts.，1987，28，3401-3404； Bjergarde，K.，et al，Nucl Acids Res.，1991，19，5843-5850；Dahl，O.Sulfur Reporrs，1991，11，167-192)。也可以使用相关的偶联基例如N，N-二异丙基-甲基膦或N，N-二乙氨基-甲基膦制备甲基磷酸酯。使用N，N-二异丙基氨基-甲基氨基磷酸酯一类的偶联基可以适当地合成甲基磷酸酯寡聚体。可以用常规方法合成本发明的氨基酯核单聚体(例如Gryaznov，S.M.，et al，Nucl Acids Res.，1992，20，1879-1882；Vinayak，R.，et al，Nucl Acids Res.，1992，20，1265-1269；Sinha，N.D.，et al，Nucl Acids Res.，1984，12，4539-4557；以及这里引用的其它参考文献)。2.保护基

可以使用诸如二异丁基甲咪，苯甲酰基，异丁酰基，FMOC，二烷基甲咪，二烷基乙咪或文献报道的其它基保护胞嘧啶，腺嘌呤，或鸟嘌呤杂环中的外向环氮。反过来胞苷可以使用描述的方法。不保护外向环氮直接插入寡聚体(Gryaznov，S.M.et al，J Amer Chem Soc.，1991，113，5876-5877；Gryaznov，S.M.et al，Nucl Acids Res.，1992，20，1879-1882；Kung，P.-P.et al，Tetrahedron Letts.，1992，33，5869-5872)。

5’端的适宜保护基为DMT(二甲氧基三苯甲基)，B_z(苯甲酰基)，Bu(异丁酰基)，苯氧乙酰基，MMT(单甲氧基三苯甲基)或FMOC和/或3’端的适宜保护基磷酸氢酯，甲基氨基磷酸酯，甲基磷酰胺，β-氰乙基氨基磷酸酯，TBS(叔丁基二甲基硅基)或TBDPS(叔丁基二苯基硅基)。

优选的保护基为5’位的B_z(苯甲酰基)，DMT(二甲氧基三苯甲基)，MMT(单甲氧基三苯甲基)或FMOC和/或3’位的TBS，磷酸氢酯，甲基氨基磷酸酯，甲基磷酰胺，β-氰乙基氨基磷酸酯。不过倾向于按照需要封锁的位置可以反过来(例如5’位用氨基磷酸酯，3’位用MMT)。一般来说，本发明的核单聚体和寡聚体按照文献已知方法可以衍生化为贴切通式中指出的“封锁基”。共轭物

本发明还提供了本发明的寡聚体的“共轭物”。常规的“共轭物”寡聚体为本领域的技术人员熟知。例如本发明的寡聚体可以共价键连接到各种残基上，例如连接到嵌入剂和专属性地与DNA双螺旋的微沟相互作用的化合物上。与本发明的寡聚体共轭的其它残基包括标记物(例如放射性物质，荧光性物质，酶)或者可以促进细胞使用间隔连接物连接的残基等等。适宜的放射性标记物包括³²P，³⁵S，³H，¹³¹I和¹⁴C，适宜的荧光标记物包括荧光，试卤灵，若丹明，BODIPY(分子探针)以及Texas红；适宜的酶包括碱性磷酸酯酶和辣根过氧化酶。能用作共价键连接残基的其它化合物包括生物素，抗体或抗体片段，亚西亚糖蛋白，铁传递蛋白，HIV Tat蛋白也可以适宜地连接到本发明的寡聚体上。

这些额外的残基可以通过任何适宜的残基衍生化得到。例如吖啶或补骨脂灵一类的嵌入剂可以通过寡聚体端基5’位，RNA2’位的-OH基或-SH基连接到本发明的寡聚体上，或者通过-OH基，-NH₂基，-COOH基或-SH插入到嘧啶的5位。例如嘧啶的5位含-CH₂CH₂CH₂OH或-CH₂CH₂CH₂SH的衍生化形态是适宜的。包含聚赖氨酸或赖氨酸的共轭物可以按照描述的那样合成，而且可以进一步增强寡聚体对它的靶性核酸序列的结合率。(Lemaitre，M.et al.，Proc Natl Acad Sci.USA，1987，84，648-652；Lemaiter，M.et al.，Nucleosides and Nucleotides，987，6，311-315)

可以连接上广泛的取代基，包括那些通过链或取代链连接的取代基，寡聚体中的OH基可以被磷酸酯基取代，可以通过标准的保护基保护，或通过偶联基制备连到别的核单聚体上的另外的链，或能够连接到共轭取代基上。5’端的OH基可以被磷酸酯化，2’-OH基或3’端的OH基取代基亦可以被磷酸酯化。羟基也可以被衍生化成标准的保护基。

本发明的寡聚体可以通过共价键衍生化为使用隔离链促进细胞缔合的残基。适宜的共轭物还包括寡聚体合成中的固相载体以便促进核酸序列检测。固相载体包括担不限于硅胶，控孔玻璃，聚苯乙烯和磁玻璃珠。糖修饰

通过糖上取代可以制备衍生物。本发明的寡聚体的优选衍生物中2’-O-烯丙基或3’-烯丙基似乎可以增强渗透性和对核酸酶降解的稳定性。但似乎不减小寡聚体对单链或双链靶的亲和力。尤其是在核糖-酰胺骨架寡核苷酸中可以在核糖残基的1’，2’，3’，4’和5’位引入不同的功能基，以便改善对应寡核苷酸的药代动力学性质。取代链

除这里发明的2’-5’，3’-5’和4’-5’链外，本发明的寡聚体还可以含1个或多个在文献中有报道的“取代链”。这些“取代链”包括磷酸硫酯，甲基磷酸酯，硫代甲基磷酸酯，磷酸二硫代酯，烷基磷酸酯，吗啉代磺胺，硼代磷酸酯(-O-P(OCH₃)(BH₃)-O-)，硅氧烷(-O-Si(X⁴)(X⁴)-O-；X⁴为1-6C烷基或苯基)及氨基磷酸酯(甲氧乙胺(-O-P(OCH₂CH₂OCH₃)(O)-O-等等)，这些”取代链“可以按照一般可以看到的文献中描述的方法合成，所述文献包括以下参考文献(Sood，A.，et al，J.Am.Chem.Soc.，1990，112，9000-9001；WO 91/08213；WO90/15065；WO 91/15500；Stirchak，E.P.et al Nucleic Acid Res.，1989，17，6129-6141；U.S.Patent 5,034,506；U.S.Patent 5,142,047；Hewitt，J.M.et al，Nucleosides & Nucleotides，1992，11，1661-1666；Summerton，J.et al International Publication No.216 860)。可用于这里发明的寡聚体的取代链还包括磺酰胺(-O-SO₂-NH-)，硫化物(-CH₂-S-CH₂)，砜(-O-SO₂-CH₂-)，氨基甲酸酯(-O-C(O)-NH-，-NH-C(O)-O-)，二甲基肼基(-NH-N-(CH₃)-)，氨基磺酸酯(-O-S(O)(O)-N-；-N-S(O)(O)-N-)，3’-氨基(-NH-CH₂-)，N-甲基羟胺(-CH₂-NCH₃-O-)和2’，5’链(例如2’，5’氨基甲酸酯(2’-N(H)-C(O)-O-5’)，5’，2’氨基甲酸酯(2’-O-C(O)-N(H)-5’)，5’，2’甲基氨基甲酸酯(2’-O-C(O)-N(CH₃)-5’)和5’，2’硫代甲缩醛(2’-O-CH₂-S-5’)。另外一些适宜的取代链包括酰胺链(Buchardt，D.et al，(International Publication No.WO 92/20702)和Cook.P.D.等描述的取代链(International Publication No.WO.92/20822)和De Mesmacker A.等描述的取代链(International Publication No.WO 92/20823)以及在PCT/US92/04294中描述的取代链。

只要不特别指明，象甲缩醛一类的取代链-O-CH₂-O-，就是连接到左边核单聚体的4’，3’，2’碳中的一个上并接到右边核单聚体的5’碳上。当核糖，去氧核糖或阿拉伯糖以外的结构连接到相邻的核单聚体上时，4’，3’，2’，或5’碳的标号可被相应地修饰。这类结构包括木糖，己糖，吗啉代环，碳环(例如环戊烷)等等。

已经发表了氨基甲酸酯，碳酸酯，硫化物，亚砜，砜，N-甲基羟胺和二甲基肼基链在合成子或寡聚体中的应用(Vaseur，J-J.et al，J.AmerChem Soc.，1992，114，4006-4007；WO 89/12060；Musicki，B.et al，JOrg Chem.，1990，55，4231-4233；Reynolds，R.C.etal.，J.Org.Chem.，1992，57，2983-2985；Mertes，M.P.，et al，J.Med.Chem.，1969，12，154-157；Mungall，W.S.，et al，J.Org.Chem.，1977，42，703-706；Stirchak，E.P.，et al，J.Org.Chem.，1987，52，4202-4206；Wang，H.，et al，Tetrahedron Letts.，1991，32，7385-7388；International ApplicationNo.PCT US 91/03680)。聚代链在寡聚体中可用于一系列目标，例如进一步促进与互补靶性核酸序列的结合和/或增加寡聚体对核酸酶的稳定性。碱基

本发明的化合物中用作核苷碱基的适宜的碱基不仅包括天然的嘌呤和嘧啶碱基，还包括这些杂环碱基的类似物和它们的互变异构体。这些类似物包括烷基化的嘌呤或嘧啶，酰基化的嘌呤或嘧啶，或其它的杂环。这类“类似的嘌呤”和“类似的嘧啶”或嘌呤或嘧啶类似物是文献已知的化合物，其中有些用作化疗剂。一个实例清单，但不是全部例子的清单包括N⁴，N⁴-桥亚乙基胞嘧啶，7-去氮黄苷，7-去氮鸟苷，8-氧代-甲基腺嘌呤，4-乙酰基胞嘧啶，5-(羧羟甲基)尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，肌苷，N⁶-异戊烯基腺嘌呤，1-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，5-甲基胞嘧啶，N⁶-甲基腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-(1-丙炔基)-4-硫尿嘧啶，5-(1-丙炔基)-2-硫代尿嘧啶，5-(1-丙炔基)-2-硫代胞嘧啶，2-硫代胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。除这些碱基类似物外，嘧啶类似物包括6-氮杂胞嘧啶，6-氮杂胸苷和5-三氟甲基尿嘧啶(见于(Cook，D.P.，et al，International Publication No.WO 92/02258)，本文引作参考文献)也可以适宜地插入到本发明的寡聚体中。

已经报道了将4-硫尿苷和2-硫代胸苷插入寡聚体(Nikiforov，T.T.et al，Tetrahedron Letts.，1992，33，2379-2382；Clivio，P.，et al，Tetrahedron Letts.，1992 33：65-68；Nikiforov，T.T.，et al，Tetrahedron Letts.，1991 32：2505-2508；Xu，Y.-Z.，et al.Tetrahedron Letts.，1991 32：2817-2820；Clivio，P.，et al，TetrahedronLetts.，1992 33：69-72；Connolly，B.A.，et al.，Nucl.Acids Res.，198917：4957-4974)。优选的碱基包括腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，尿嘧啶，胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-(1-丙炔基)尿嘧啶，胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-(1-丙炔基)尿嘧啶，5-(1-丙炔基)胞嘧啶，8-氧代-N⁶-甲基腺嘌呤，7-去氮杂-7-甲基鸟嘌呤，7-去氮杂-7-甲基腺嘌呤和7-去氮杂黄苷。共价键结合的残基

包括在本发明的寡聚体中的一些共价键结合的残基是能够在寡聚体和双链间产生至少一根共价键的残基。提供这类多重性的交联基也可以形成多个共价键。虽然共价键最好接在靶链的碱基残基上，但也可以形成在靶的其它部位，包括糖或磷酸二酯部分。影响交联的残基的反应性质决定双链中的靶的性质。优选的交联残基包括酰化剂和烷化剂，而且尤其包括那些定位于与序列专属性赋予部分有关的交联基以便与链中的靶部位反应。

很清楚，杂环不需要是嘌呤或嘧啶；连接有功能基的伪碱基确实根本不必要是杂环。只要定位正确便可以满意于反应功能基的任何连接途径。寡聚体的极性

在它们的最普遍的形式中，符号3’…5’表示寡聚体的一种伸展方式，在这种伸展中连接的链始终是在左边的核单聚体的氨基酸残基的5’-羟基与右边核单聚体的氨基酸残基3’羟基(或具有2’-5’链的寡聚体的2’-，或具有4’-5’链的4’-)之间形成(即唯一的极性区域)，从而保持右边核单聚体的氨基酸残基的5’-羟基游离并可用于另一个共轭。类似地，符号5’…3’表示寡聚体按相反方向的伸展，在这种伸展中，连接的链始终在左边核单聚体的氨基酸残基的3’羟基与右边核单聚体的氨基酸残基的5’-羟基之间形成，从而保持右边核单聚体的3’-羟基游离并可用于另一个共轭。寡聚体的5’…4’伸展也确实是相同的情形。药物上可以接受的盐

本发明还提供了这里发明的所有化合物的不同的盐，包括给哺乳动物或人服用的药物上可以接受的盐。药物上可以接受的盐和生成这类盐的物料为文献已知。药物上可以接受的盐优选为本发明的寡聚体的金属盐或铵盐，并包括碱金属或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐、镁盐或钙盐；或者有利地包括来自氨或有机胺的容易结晶的铵盐，例如单-，双，或三-低级(烷基、环烷基、或羟烷基)-酰胺，低级的亚烷基二胺，或低级(羟烷基或芳烷基)-烷基季铵碱，例如甲胺，二乙胺，三乙胺，二环己基胺，三乙醇胺，亚乙基二胺，三-(羟甲基)-氨基乙烷或氢氧化苄基三乙胺。本发明的寡聚体可以形成酸加合的盐，优选为治疗上可以接受的无机酸或有机酸的盐，例如强矿酸的盐，例如亲水性的盐酸或氢溴酸，硫酸，磷酸的盐；亲酯性的脂肪羧酸或芳香羧酸或磺酸盐，例如甲酸，乙酸，丙酸，丁二酸，乙醇酸，乳酸，羟基丁二酸，酒石酸，葡糖酸，枸橼酸，抗坏血酸，顺丁烯二酸，反丁烯二酸，羟基顺丁烯二酸，丙酮酸，苯乙酸，苯甲酸，4-氨基苯甲酸，邻氨基苯甲酸，4-羟基苯甲酸，水杨酸，4-氨基水杨酸，甲磺酸，乙磺酸，羟基乙磺酸，苯磺酸，对氨基苯磺酸，环己基氨基磺酸的盐等等。应用和给药方式

由于本发明的寡聚体明显地有与单链或双链靶核酸结合的能力，从而可与天然的多聚核苷酸及它们的结构类似物形成双链，三链或其它稳定的缔合，所以本发明的寡聚体可以用于使用常规寡聚体的大多数操作。这样一来，本发明的寡聚体可以用作例如多聚核苷酸杂交探针，用作聚合酶的链反应及类似的环扩增反应的引物，用作序列引物等等。本发明的寡聚体还可用于疾病的诊断和治疗。本发明的寡聚体用于治疗包括专属性地抑制基因表达(或抑制由这些基因编码的RNA序列的翻译)，也就是通过使用反义寡聚体抑制或者与病理状态的建立有关或者与病理状态的维持有关的基因表达。本发明的寡聚体可用来介导大量基因靶的反义抑制。通过反义地使用这些寡聚体寻靶的例证性的基因或这些基因编码的RNAS包括编码酶，激素，血清蛋白，跨膜蛋白，粘附分子(LFA-1，GPIIb/IIIa，ELAM-1，VACM-1，ICAM-1，E-selection等等)，受体分子包括cytokine受体，cytokines(IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5等等)，致瘤物，生长因子，以及白细胞介素。靶基因或RNAS可以与任何病理状态相关，例如与炎症，心血管疾病，免疫反应，癌，病毒感染，细菌感染，酵母感染，寄生虫感染等等相关。

本发明的寡聚体适合于体内和体外两种治疗应用。用于半体外治疗的适应症包括处理白血病(慢性骨髓性白血病，急性淋巴细胞性白血病)或病毒感染时骨髓或外周血液一类的细胞。由能够作为癌症治疗的靶的这些基因编码的靶基因或RNAS包括致癌物，例如ras，k-ras，bc1-2，c-mgb，bcr，c-myc，c-ab1或过度表达的序列，例如mdm2，制瘤素M，IL-6(kaposi’s肉瘤)，HER-2以及移位物例如bcr-ab1。由这些基因编码的病毒基因序列或RNAS例如聚合酶或疱疹病毒基因的逆转录酶，例如CMV，HSV-1，HSV-2，逆转录病毒HTLV-1，HIV-1，HIV-2或其它DNA或RNA病毒，例如HBV，HPV，VZV，流感病毒，腺病毒，黄素病毒，鼻病毒等等也是适宜的靶。使用专属性结合的寡聚体时可以和别的治疗剂共轭。本发明的寡聚体的其它治疗应用包括(1)通过调节基因表达，例如调节IL-1受体，IL-1，ICAM-1或在介导炎症中起重要作用的E-selection调节炎症响应，和(2)血管成形术后的调节例如血管成形术后发生的动脉堵塞(再狭窄)中的细胞增生，这是通过调节(a)生长因子或有丝分裂因子，例如非肌肌蛋白myc，fox，PCNA，PDGF或FGF或它们的受体的表达，(b)细胞增生因子例如c-myb的表达来实现的。其它适宜的增生因子或信号传导因子，例如TGFx，IL-6，gINF，蛋白激酶C，酪氨酸激酶(例如p210，p190)可以考虑为牛皮癣或其它疾病的靶。此外，EGF受体，TGFa或MHC等位基因可以是自动免疫疾病的靶。

本发明的寡聚体释放到细胞内可以被任何适宜的方法增强，这些方法包括磷酸钙，DMSO，甘油或右旋糖酐的转运，electroporation或通过(International Publications NOS.WO 90/14074，WO 91/16024，WO91/17424，U.S.Patent 4,897,355)中描述的方法使用阳离子，阴离子和/或中性类脂组合物或脂质体。寡聚物通过与阳离子型类脂类如与DOTMA形成复合物(可以形成脂质体也可以不形成脂质体)，这种复合物然后与细胞接触，这样使可将寡聚体携入细胞。适宜的阳离子型类脂包括但不限于N-(2，3-二(9-(Z)-十八烯酰氧基))-丙-1-基-N，N，N-三甲铵(DOTMA)及它的盐，1-O-油酰-2-O-油酰-3-二甲基氨基丙基-β-羟乙基铵及它的盐和2，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨基)丙烷及它的盐。

通过使用(i)病毒，例如Sendai病毒(Bartzatt，R.，Biotechnol ApplBiochem.，1989，11，133-135)或腺病毒(wagner，E.et al.，Porc Natl Acad.Sci.USA，1992，89，6099-6013)；(ii)使用化合物例如聚赖氨酸，鱼精蛋白或N12-双(乙基)精胺的聚氨或聚阳离子共轭物(wagner，E.et al.，Porc NatlAcad.Sci.USA，1991，88，4255-4259；Zenke，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1990，87，3655-3659；Chank，B.K.et al.，Biochem Biophys ResCommun.，1988，157，264-270；U.S.Patent 5,138,045)；(iii)用化合物类脂精氨形成的类脂聚胺复合物(Behr，J.-P.et al.，Proc Natl Acad Sci.USA，1989，86，6982-6986；Loeffler，J.P.et al.，J.Neurochem.，1990，54，1812-1815)；(iv)用化合物包括阴离子磷酸类脂例如磷脂酰甘油，心磷脂，磷脂酸或磷脂酰乙醇胺形成的阴离子型，中性或pH敏感的类脂(Lee，K.-D.etal.，Biochem Biophys ACTA，1992，1103，185-197；Cheddar，G.et al.，ArchBiochem Biophys，1992，294，188-192；Yoshimura，T.，et al.，Biochem Int.，1990，20，697-706)；(v)与诸如铁传递蛋白或生物素一类的化合物的共轭物或(vi)可以增强目标寡聚体的药物动力学性质的与蛋白(包括单宁白蛋白或抗体)，糖蛋白或高聚物(包括聚乙二醇)形成的共轭物。这里使用的转运是指适合于寡聚体释放到细胞中的任何方法。能用于转运方案的任何化学试剂例如类脂式任何生物剂例如病毒，在这里集合地称为“渗透增强剂”。寡聚体可以经由与其它核酸例如与(i)编码蛋白或蛋白片段的可表达的DNA片段(ii)编码蛋白或蛋白片段的可转录RNAs共转运释放到细胞中。

本发明的寡聚体可以掺到能增强寡聚体释放到细胞中的任何适宜的配方中。适宜的配方也包括普遍应用的场合的配方，在这些应用中局部给药将化合物释放到细胞或组织中。在含寡聚体的局部制剂中可以使用聚乙二醇，丙二醇，azone，nonoxony1-9，油酸，DMSO，聚胺或类脂聚胺等化合物。

在希望抑制基因表达的研究或生产目标中可以适宜地使用本发明的寡聚体。目前仅可以得到极少的可以通过任何机制有效地并专属性地抑制靶基因表达的试剂。以前已经报道的可以抑制靶基因表达的寡聚体常常具有非专属性和/或者不能将靶基因的表达降到很低的水平(低于非抑制水平约40％)。

这样一来，这里描述的寡聚体构成了可以用于抑制选择性蛋白或目标或细胞中的蛋白的方法，其中蛋白是由DNA序列编码而且蛋白是由RNA序列翻译的，该方法包括以下步骤：将本发明的寡聚体导入细胞；允许寡聚体与DNA或RNA或双链形成三链或与DNA或RNA形成双链，由此抑制蛋白表达或抑制蛋白。本发明的方法和化合物适宜调控原核性和真核性两种细胞中例如细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞中的基因表达。

使用本发明的取代链容易设计核糖核酸酶H“感受态”或核糖核酸酶H“非感受态”寡聚体。核糖核酸酶H的感受态寡聚体可以由一个或多个核糖核酸酶H感受态的区域组成，该区域由连接的核糖核酸酶H感受态核单聚体组成。修饰的寡聚体例如2’取代(2’-O-烯丙基等等)或一些未荷电的链(甲基磷酸酯，氨基磷酸酯等等)作为被核糖核酸酶H识别和/或作用的取代基通常是非感受态。通过降解RNA-寡聚体双链中的靶RNA核糖核酸酶H的能力可以促进反义寡聚体的功能(Dagle，J.M.et al.，Nucl.Acids Res.，1990，18，4751-4757；Walder，J.A.et al.，InternationalPublication Number.WO 89/05358)。该酶切断RNA-DNA双链中的RNA。

为了保留核糖核酸酶H的感受性，一种寡聚体需要三个或更多感受态的位于其中的邻近核单聚体的核糖核酸酶感受态区域(Quartin，R.S.，etal.，Nucl.Acids Res.，1989，17，7253-7262)。设计的抗核酸酶分解的寡聚体应具有端链，糖和/或碱基修饰以便产生抗核酸酶作用。这样，设计寡聚体时可以使它的5’位或3’位或同时两个位置同时具有修饰的核单聚体残基，同时具有一个内部的核糖核酸酶H感受态区域。保持核糖核酸酶H感受性的例证性寡聚体一般应具有唯一的极性并应在5’位和使寡聚体对核酸酶降解稳定的3’位包含大约2至大约12个核单聚体，并在核糖核酸酶H的非感受态3’和5’端之间应含作为核糖核酸酶H的感受态区域发挥功效的大约3个至大约26个核单聚体。这类寡聚体上的变化包含(1)由1或2个核糖核酸酶感受态链或取代链组成的一个较短的核糖核酸酶H感受态区域，(2)由多达15，20或更多取代链或核单聚体组成的一个较长的核糖核酸酶H非感受态区域，(3)由多达30，40或更多链组成的一个较长核糖核酸酶H感受态区域，(4)在3’端或5’端的仅具单一核糖核酸酶H非感受态区域的寡聚体。

通过与靶核酸序列形成双链或三链结构含少至8个核单聚体的寡聚体可用来影响靶蛋白的表达。不过经由形成双链或三链的用于抑制靶蛋白表达的寡聚体优选具有大约10至大约20个核单聚体残基。

含本发明的取代链的寡聚体可以按照所述的方法适宜地环化(International Publication No.WO 92/19732；Kool，E.T.J Am Chem Soc.1991，113，6265-6266；Prakash，G.et al.，J.Am Chem Soc.，1992，114.，3523-3527)。这类寡聚体适宜于结合到单链或双链核酸靶上。环状寡聚体可以是各种尺寸。尺寸在大约22-50个核单聚体的这类寡聚体能够适宜地制备。如所述(Prakash，G.ibid)的那样，这类环状寡聚体的分离寡聚体结合区域的环区域含有大约3个至大约6个核单聚体残基。通过配位酶或化学途径经由5’-和3’-端糖和/或碱基的链，寡聚体可以发生酶法环化。

该寡聚体可以通过抑制负责调控转录(Maher，L.J.，et al.，Science，1989，245，725-730)或翻译的核酸结合蛋白的相互作用被用于调控靶基因表达。这样一来，该寡聚体是与核酸结合蛋白(包括核糖体，RNA聚合酶，DNA聚合酶，翻译的启动子，或者增加或者减少转录的转录因子，蛋白-激素转录因子等等)竞争的适宜的序列专属性化合物。这样，设计适当的寡聚体可以用于增加靶蛋白的合成，依赖的机制是结合到或接近到转录因子用来表现表达的的调节位点，或抑制选择的受体蛋白本身的表达。

包括可以增强结合率的另外的修饰的本发明的寡聚体能够设计含二级或三级结构，例如含伪绳结或半伪绳结(pseudo-half-knots)结构(Ecker，D.J.et al.，Science，1992，257，958-961)。与对应的未修饰寡聚体相比，这类结构具有更稳定的二级或三级结构。这类结构的增强的稳定性有赖于单一寡聚体中的自身互补区域或形成给定结构的两个或多个寡聚体之间的互补区域之间结合率的增大。这类结构能用来仿HIV TAR的结构以便干扰HIV Tat蛋白(一种往TAR结合的蛋白)的结合。类似的途径能用于其它转录或翻译因子，这些因子识别更高级的核酸结构例如柄结构，环结构，发夹结构，绳结结构等等。另外本发明的寡聚体能够用于(1)破坏或(2)结合到这类结构上，作为(1)干扰或(2)增强蛋白往核酸结构上结合的一种方法。

除它们在反义或三股螺旋治疗中的应用外，本发明的寡聚体通过直接取代核酸双链中的一条链亦可用作治疗或诊断剂。取代天然双链中的一根链，例如取代杂色体DNA或双链病毒DNA，RNA或杂交DNA/RNA中的一根链对具有高结合率的寡聚体是可能的，由于它们的互补序列不足以有效地取代双链中的DNA或RNA的一条链。通过D-环发生作用的寡聚体的疗效源于对互补序列的高结合率，该互补序列介导了与核酸靶相联系的正常生理功能。靶核酸的类型包括但不限于(i)包括外显子、内含子、外显子/内含子正常接合，启动/强化区域和5’或3’非翻译区域的基因序列，(ii)利用二级结构以便生效的核酸区域(例如HIV TAR柄-环元素或tRNAs)，(iii)发挥结构或其它功能的其它核酸，例如端粒染色体，着丝点或复制区域(病毒，细菌等等)，和(iv)任何其它双链区域。很明显，寡聚体能使用离散功能区合成，该区域中一种寡聚体的一个区域通过D-环结合到靶上，而相邻的一个区域通过所说的形成三重螺旋结合到靶分子上或作为一个隔离物结合到蛋白上。另外，D-环状的寡聚体能够通过伸展寡聚体与之结合的链而与双链中的每一条结合(即寡聚体的一个区域结合到一条链上，另一个区域结合到互补链上)。支配结合模式(即三重螺旋或D0环)的控制元素是寡聚体的序列和建构到寡聚体中的固有的亲和力。Watson-Crick双链结合碱基识别规则不同于Hoogsteen控制的三链结合规则。因为这个原因，寡聚体的碱基序列可以用于支配寡聚体将使用的结合规则的类型。在自然界中D-环结构是通过酶介导的过程形成的(Harris，L D.et al.，J Biol Chem.，1987，262.，9285-9292)或与DNA发生复制的区域相联系的(Jacobs，H.T.et al.，Nucl Acids Res，1989，17，8949-8966)。出现在寡聚体结合中的D-环可以来自一步过程或两步过程。靶链的直接取代将通过单链结合事件产生D-环。不过，D-环也能通过形成三链螺旋出现，该三链螺旋促进了导向D-环的链取代事件。

可以设计含有本发明的取代链的核糖酶以便设计特性改变了的类别。已经描述了断裂单链RNA或DNA的核糖酶(Roberson，D.L.，et al.，Nature，1990，344，467-468)。已经假定了核糖酶在治疗中的应用(Sarver，N.et al.，Science，1990，247，1222-1225；International Publication Number WO91/04319)。设计适宜的寡聚体序列可以影响核糖酶功能必需的二级结构或三级结构。例如，含有本发明的取代链的并具有核酸酶稳定的靶区域的核糖酶对靶序列可以具有较高的结合率同时保持碱基配对的专属性。由于本发明的取代链的较高的亲和力和/或核酸酶的稳定性可以设计核糖酶中的较短的识别区域(制备上有利)，这种设计可以导向更有利的底物转换(有利于核糖酶的功能)。

在治疗应用中，本发明的寡聚体可以按照合适的方式通过抑制适宜的靶基因的表达用于治疗各种疾病。对于这类治疗来说，寡聚体可以按各种给药模式配方，给药模式包括系统给药，局部给药或区域性给药。配方技术和处方一般可以从Remington’s Pharmaceutical Sciences，MerckPublishing CO.，Easton，PA，最后一版中查到。寡聚体活性成分一般与载体结合，例如与稀释剂或赋型剂结合，赋型剂可以包括填充剂，扩散剂，粘合剂，保湿剂，崩解剂，表面活性剂，或润滑剂，这取决于给药模式的性质和剂型。典型的剂型包括片剂，粉剂，液体剂包括悬浮剂，乳化剂和溶液剂，颗粒剂，胶囊剂和栓剂，以及用于注射的液体剂，包括脂质体制剂。

对于系统给药，注射为优选，包括肌肉注射，静脉注射，腹膜内注射及皮下注射。对于注射给药，本发明的寡聚体配方到液体溶液中，优选配方到与生理上一致的缓冲溶液中，例如配方到Hank’s溶液中或Ringer’s溶液中。此外，寡聚体可以配方成固体形并在使用前再溶解或悬浮。也包括冻干剂型。能用于系统给药的剂量优选为从大约0.01mg/kg至50mg/kg，每天1次或2次。不过可以使用不同的剂量计划，这取决于(i)抑制它的靶DNA或RNA活性的各寡聚体的强度，(ii)与给定的靶基因相关的疾病状态的严重性和程度，或(iii)给定的寡聚体的药物动力学行为。

也可以通过转化粘液质或透皮途径系统给药，或化合物可以口服。对于转化粘液质给药或透皮给药，在配方时使用对被渗透的屏障的适宜的穿透力。这类穿透力一般为文献已知并包括例如用于转化粘液质给药的胆盐和羧链孢酸衍生物。此外可使用洗涤剂以便促进渗透。转化粘液质给药例如可以通过鼻喷雾使用，或使用栓剂，对于口服给药，寡聚体配方到适宜的口服给药剂型中，例如配方到胶囊剂，片剂和舌下剂中。

对于局部给药，本发明的寡聚体配方到散膏剂，油膏，凝胶和霜剂中，这些都是文献已知的。用于眼部疾患例如病毒感染的本发明的寡聚体的配方应以文献已知的组合物为基础。

除用于治疗之外，本发明的寡聚体还可以用作诊断剂以便确定它们专属性结合的核酸序列是否存在。本发明的寡聚体的增强的结合率有利于它们用作引物和探针。通过或者形成双螺旋或者形成三螺旋的杂交可以完成诊断测定，形成的螺旋然后可以通过适当的途径确定。例如，寡聚体可以用放射标记，荧光标记或生色标记进行标记，而且可以测定结合到固相载体上标记物的存在。另外，双链或三链螺旋的存在可以通过专属性识别这些螺旋的抗体来测定。使用这类寡聚体作为探针进行检测的途径一般是已知的。

使用本发明的取代链通过形成三重螺旋作为诊断剂具有好处，由于三重螺旋在温和的条件下形成，适当进行测定时无需将样品置于过分苛刻的条件下。诊断检测是以测定细菌，真菌或原生物的RNA序列的同一性为基础的，常常需要从样品中或实验室培养的生物分离RNA，由于RNA对普遍存在的核酸酶极端敏感，该分离过程既费工又费时。

寡聚体探针也可以引进另外的修饰，例如引入糖和/或取代链的修饰使寡聚体对核酸酶特别稳定，这样便可在正常含有核酸酶活性的细胞或组织的萃取液存在下进行检测。含端基修饰的寡聚体常常在不损失专属性的情况下保持对互补序列的结合(Uhlmann et al.，Chemical Reviews，1990，90，543-584)。正如上面说的，通过在本发明的探针中引入容许与DNA的另一条链专属性结合的连接物，那么本发明的探针也可以含这样的连接物(Froehler，B.C.et al.，Biochemistry，1992，31，1603-1609；Horne etal.，J.Am.Chem.Soc.，1990，112，2435-2437)。

往也含有共价交联剂的探针中引入本发明的碱基类似物有能力在诊断或检测测定中增加敏感性并降低本底。此外，使用交联剂将允许新的检测革新，例如(1)使用交联增加探针的分辨能力，(2)引入变性的洗涤步骤以便降低本底和(3)在杂交熔融温度或接近杂交的熔融温度进行杂交和交联以便减少靶中的二级结构和增加探针的专属性。以前曾叙述杂化条件的改进(Gamper et al.，Nucleic Acids Res.，1986，14，9943)。

本发明的寡聚体适用于这里使用方法的诊断检测，其中被检测的或为寡聚体或为核酸按所述通过共价键连接到固相载体之上(U.S.Patent No.4,775,619)。寡聚体还适用于按照描述的方法可以放大靶序列的依赖于聚合酶链反应技术的诊断检测(European Patent Publication No.0393，744)。本发明的具有3’末端可作为引物的寡聚体可以和诸如Tag或Vent^TMjxhem(New England Biolabs)一类的聚合酶链反应方法中使用的聚合酶兼容。这样，本发明的寡聚体可以用作PCR操作中的引物。

本发明的寡聚体在不连续序列或随机序列中可用作引物。随机序列的引物一般有大约6，7或8个核寡聚体的长度。这种引物可用于各种核酸扩增操作(PCR，连结酶链反应等等)或用于克隆操作。本发明的取代链一般不干扰寡聚物作为引物发挥功能的能力。在3’端位残基以外的位置具有2’位修饰的寡聚体，由于其它的修饰成为核糖核酸酶非感染态或不然的话对核酸酶稳定，因而可以有利地用作细胞萃取液或含核酸酶的其它溶液中的RNA或DNA序列的探针或引物。因而寡聚体可用于样品中的核酸扩增操作，即将寡聚体与含靶核酸的样品混合，接着将寡聚体与靶核酸杂交，并使用PCR，LCR或其它方法扩增靶核酸。

衍化到螯合剂例如EDTA，DTPA或1，2-二氨基环己基乙酸上的寡聚体可以用于所述的各种体外诊断测定(U.S.Patent Nos，4,772,548，4,707,440和4,707,352)。另外，本发明的寡聚体能使用5-(3-碘代乙酰胺基丙-1-基)-2’-去氧尿苷或5-(3-(4-溴丁酰胺基)丙-1-基)-2’-去氧尿苷一类的交联剂衍生化并用于所述的各种检测方法和试剂盒(InternationalPublication No.WO 90/14353)。

除上面的应用外，本发明的寡聚体抑制基因表达的能力可以通过使用合适的方法测定细胞或重组体系中的表达水平而进行体外核实(Graessmann，M.et al.，Nucleic Acids Res.，1991，19，53-59)。

上面描述的本发明通过现用下述实施例更好地进行解释。这些实施例仅用来解释本发明而不应理解为限制本发明。

实施例合成核单聚体合成子和寡聚体的综述寡聚体

本发明的寡聚体可以使用文献中合成寡核苷酸衍生物的已知反应进行合成。例如见于Flandor，J.懊恼Yam，S.Y.，Tetrahedron Letts.，1990，31，597-600；Mattson，R.J.et al.，J Org Chem.，1990，55，2552-2554；Chung，C.K.et al.，J Org Chem.，1989，54，2767-2769。

如同从表1中列出的各种特殊的取代链中可以看出的那样，本发明的取代链可以变化以便在它们的结构中含1个或多个氮，硫和/或氧原子。取代链中的这些原子的位置可以从5’位变至“中”位，变至2’位或3’位和4’位。本部分叙述了一系列表述合成反应图，这些合成反应图提供了其中含不同部位和不同组合的氮和氧原子的取代链的合成路线。

图1-25描述的合成可以按寡核苷酸化学领域里已知的实践进行修改。例如虽然合成图中并未总是指出碱基的保护，但这类保护可以是期待的，并能够使用文献中已知的试剂和技术完成保护，(例如见于Protective Groups in Organic Synthesis，Theodora W.Greene，John Wileyand Sons，1981)。类似地虽然在一些场合表明使用了保护基，但为了合成例证性的本发明寡聚物，并非总需要封锁反应物。

实施例1

图1中的头5步反应是关于制备异丁酰基保护的氨基酸醇，丝氨醇。图1中的第6步和后面的反应是合成丝氨醇取代的胸腺嘧啶氨基磷酸酯建筑块。

在图1的第1步中，丝氨酸的氨基通过1与酸式碳酸二叔丁酯反应生成化合物2进行保护。也可使用其它等价的保护基。下一步，化合物2的β-羟基用二氢吡喃封锁，得到完全保护的氨基酸3。氨基酸3然后与二硼烷-二甲硫醚复合物反应，得到醇4，4与异丁酰氯反应生成5。这步还原反应也可以用氯甲酸异丁酯和硼氢化钠进行(见K.Ramasamy，R.K.Olsen and T.Emery，Synthesis，1982，427。5与三氟乙酸反应3。分钟，然后用NaHCO₃洗涤，得到6。

胸腺嘧啶乙酸7按照文献制备(见L.Kosynkina，W.Wang and T.C.Liang，Tetrahedron Letts，1994，35，5173)。在混合酸酐条件下7和6偶联，得到8。8用DMTCl进行二甲氧基三苯甲基化得到9，9在碱中水解得到10。10在标准条件下进行Phophysitylation得到丝氨醇偶联的胸腺嘧啶建筑块11。该合成子然后可以通过常规的化学方法加到生长的寡聚体中。任何DNA合成化学，例如氨基磷酸酯化学或磷酸酯化学均可用于按类似于前面阐明的方式连接单聚体或二聚体。

实施例2

在反应图2中，通过胸腺嘧啶与溴乙醛二甲缩醛反应，生成的12用TFA水溶液水解制得胸腺嘧啶乙醛13。按照与图1中使用的类似的步骤将醛13和胺及6偶联，生成的对应中间体然后转变为氨基磷酸酯建筑块17。

实施例3

在反应图3中，起始原料为β-取代的氨基酸18。按照图1和图2中使用的步骤，该取代氨基酸可以转变为氨基磷酸酯建筑块27。

实施例4

在图4中，原料氨基醇21用CrO₃/吡啶混合物氧化，得到醛28。在碱存在下该醛与卤代烷反应，生成化合物29。然后氨基醇29按照图1和图2使用的类似步骤转化为建筑块35。

实施例5

注意图5，头4步基本与图1的步骤相同，在这里天门冬氨酸代替丝氨酸用作原料。由天门冬氨酸甲酯36制得完全保护的醇40，40用乙酸选择性脱保护得到41。41用CrO₃/吡啶氧化，得到对应的醛42，醛42在三乙酰氧基硼氢化钠存在下用O-苄基羟胺进行还原性氨化，得到43(见T.Kolasa and M.J.Miller，J.Org.Chem.，1990，55，1711)。采用基本与上面叙述的相同反应条件，但使用烯丙基保护基保护39的羟基，使醇39转变为醛46。在三乙酰氧基硼氢化钠的存在下醛46和羟胺43偶联，接着脱去氨基的保护基得到双胺48。按照图1的步骤，该双胺48可以转变为二聚体53。

实施例6

图6中，在Mitsunobu反应条件下(见O.Mitsunobu，Synthesis，1981，1)醇54与O-苄基羟胺55偶联得到化合物56。该中间体56氢化之后再乙酰化，得到57。57用TFA去除”TBDMSi”保护基得到58。58与7偶联之后二甲氧基三苯甲基化得到60。60用碱水解后再亚磷酸酯化，得到终建筑块62。

实施例7

在图7中，丝氨醇4转变为卤化物59并用胸腺嘧啶烷基化，得到63。脱去63中的保护基，与DMT-保护的羟基乙酸偶联并亚磷酸酯化得到66。

实施例8

在图8中，醇64与N-羟基氨基丙酸69偶联得到70。胸腺嘧啶用卤化物73烷基化得到74，74脱保护并与76偶联后水解得到78。78与70缩合，然后亚磷酸酯化得到异羟肟酸酯二聚体80。

实施例9

在图9中，用N-羟氨基丙酸醛81与醇64偶联。按照图8中的类似步骤从83和86制备二聚体88。

实施例10

在图10中，α-溴代-β-氨基丙酸甲酯89用胸腺嘧啶烷基化(见T.Kolasa and M.J.Miller，J.Org.Chem.，1990，55，4246)得到90。中间体90用氢氧化钠水解得到酸91，再与6偶联得到92。用图1中描述的步骤，然后可将化合物92转变为氨基磷酸酯建筑块95。

实施例11

在图11中，胸腺嘧啶用卤代烷基胺烷基化(见R.K.Olsen，K.Ramasamyand T.Emery，J.Org.Chem.，1984，49，3527和Islam et al.，J.Med.Chem.，1994，37，293-304制备氨基卤代烷)得到97。97与TFA反应，然后烷基化得到100。100进行二甲氧基三苯甲基化，水解，然后亚磷酸酯化得到建筑块103。

实施例12

图12是由N-羟胺43和由天门冬氨酸制备的醛107制备异羟肟酸酯骨架二聚体111的另一条路线。

实施例13

在图13中按照图2中描述的相同的反应步骤由中间体108和13制备二聚体115。

实施例14

在图14中，制备N-羟基胸腺嘧啶(见Kim，CU.，et al.，TetrahedronLetts.，1992，33，25-28)并与N-羟基邻苯二甲酰亚胺偶联，得到117后在乙醇中与肼反应得到118。118与DMT-保护的甘氨醇环氧化物119反应得到120。采用标准的方法将中间体120转变为氨基磷酸酯121。在第二个合成中，化合物118与氨基酸醛122在还原性胺化条件下偶联，得到123。用FMOCCl保护的第二氨基水解后得到125。

实施例15

在图15中，1，2-二羟基丙酸126与N-羟胺胸腺嘧啶118偶联得到127，在标准条件下将127转变为氨基磷酸酯合成子129。化合物118还与己二酸偶联并转变为核酸建筑块133。

实施例16

在图16中，首先按照图1中描述的类似方法由118和134合成建筑块136。139与118偶联得到140。137与118反应得到138，138与140缩合，得到二聚体141。

实施例17

在图17中，醛142与甘氨酸苄酯偶联得143。143与7反应得到145，145与乙酸反应得到148。148用Boc-NH-O-乙酰羟胺进行Mitsunobu烷基化得到147，147氢化得到建筑块150。143与13进行类似的偶联，然后进行与上面相同的反应，得合成子149。

实施例18

在图18中，醛142和Boc-NH-O-苄基羟胺进行还原胺化，得到151。151氢化得到152，然后用乙醇酸153酰化(B.C.Borer andD.C.Balogh，Tetrahedron Letts.，1991，32，1039)得到154。154与TFA反应除去Boc保护基并偶联后得到155。155的羟基保护基用乙酸选择性脱保护得到156。采用标准的反应条件化合物156转变为建筑块157。类似地，按照制备157的步骤154与13偶联可以制得建筑块158。

实施例19

在图19中，胸腺嘧啶-N-羟胺160用醇162烷基化得163。按照图1中的反应步骤，化合物163转变为氨基磷酸酯建筑块166。

实施例20

在图20中，首先使用标准的反应条件由谷氨酸合成中间体169。胸腺嘧啶用169烷基化得到170，170与TFA反应得到171。中间体171与Boc-甘氨酸偶联得到173，水解后得到单聚体合成子174。类似地，118与Boc-氨基乙酸醛偶联然后水解得到的苄酯得到172。

实施例21

在图21中，使用标准的反应条件由Boc-NH-O-苄基羟胺和175制备中间体177。177氢化之后与N-羟基胸腺嘧啶116偶联，得到178。脱去THP保护基，然后经二甲氧基三苯甲基化和亚磷酸酯化之后，得到建筑块合成子181。类似地，按照上述反应，用THP-羟基乙酸醛代替THP-羟基乙酸可制得182。

实施例22

在图22中，使用已知原料183按照图22底部指明的反应条件制备建筑块191。

实施例23

在图23中，使用原料183，按照图23底部指明的反应条件制备建筑块199。

实施例24

在图24中，按照图24底部指明的反应条件，将原料200转变为建筑块207。

实施例25

本实施例中使用的和生成的化合物见图1。

胸腺嘧啶乙酸(1)：胸腺嘧啶(37.8g，300mmol)溶于氢氧化钾(64.5g，1150mmol)与200ml水的溶液中。当该溶液于40℃水浴上温热时，加入溴乙酸(62.5g，450mmol)与100ml水的溶液，历时1小时。在该温度下反应混合物再搅拌1小时。冷却至室温，用浓盐酸调pH至5.5。然后溶液在冰箱中冷却2小时。过滤除去生成的任何沉淀(未反应的胸腺嘧啶)。滤液用浓盐酸调pH至2，冰冻2小时。过滤收集白色沉淀，40℃真空干燥6小时。产量为44g(88％)。

N-Boc-L-丝氨酸甲酯(2)：室温下将L-丝氨酸甲酯(15.6g，100mmol)悬浮于THF/DMF(各100ml)混合物中。搅拌下往该混合物中加三乙胺(11.13g，110mmol)，接着加酸式碳酸二异丁酯(24.0g，110mmol)，继续于室温下搅拌30分钟。加水(20ml)，溶液室温搅拌8小时。溶液蒸发至干。残留物悬浮于乙酸乙酯(250ml)并用硫酸氢钾(0.25N溶液，100ml)处理。产物立即用乙酸乙酯溶液萃取。有机萃取液用水(100ml)洗涤，饱和食盐水(100ml)洗涤，无水硫酸钠干燥。蒸发除去有机溶剂，得到油状残留物26g(90％)。

N-Boc-L-丝氨酸(OTHP)甲酯(3)：化合物2(15g，68.49mmol)溶于无水CH₂Cl₂(100ml)中，并与3，4-二氢-2H-吡喃(8.4g，100mmol)和催化量对甲苯磺酸(100mg)室温反应。反应混合物室温搅拌12小时并蒸发至干。残留物溶于乙酸乙酯(200ml)，用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(50ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，蒸发至干。残留物的纯度足以用于下步反应。产量15g(72％)。

N-Boc-L-丝氨醇(OTHP)(4)：在氩气保护下，丝氨酸(OTHP)甲酯(10g，33mmol)溶于无水THF(100ml)并用冰浴冷至0℃。0℃搅拌下往该冰冻溶液中加硼烷-甲硫醚络合物(2M THF溶液，100ml，200mmol)，历时1小时。加完硼烷后，反应混合物升温至室温并于40℃加热6小时。反应混合物冷至0℃，用水和乙酸中和至pH6-7，用乙醚(3×100ml)萃取。乙醚萃取液用水(2×100ml)洗涤，饱和食盐水(100ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，蒸发至干得到油状粗产品。该油状物用闪式硅胶层析纯化，用己烷→丙酮洗脱，得到8g(88％)纯产物。

N-Boc-L-丝氨酸(OTHP)O异丁酸酯(5)：化合物4(8g，29.09mmol)与无水CH₂Cl₂(100ml)的溶液搅拌并于0℃加TEA(3.54g，35mmol)，然后加异丁酰氯(3.71g，35mmol)，历时30分钟。然后将反应混合物于室温搅拌4小时并蒸发至干。残留物溶于乙酸乙酯(200ml)，用5％NaHCO₃溶液(50ml)洗涤，水(50ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，蒸发至干得到油状粗产品。该油状物用闪式硅胶层析纯化，用己烷→丙酮洗脱，得到7.9g(79％)纯产物。

L-丝氨醇(O异丁酸酯)(6)：化合物5(10g，28.98mmol)溶于CH₂Cl₂(100ml)中，室温下与TFA(50ml)搅拌1小时，蒸发至干。残留物溶于甲醇(50ml)中并再蒸发。残留物溶于CH₂Cl₂(200ml)中，用饱和NaHCO₃溶液(2×100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得到4.5g(96％)油状产物。

N-(胸腺嘧啶乙酰基)-L-丝氨醇(O异丁酸酯)(8)：胸腺嘧啶乙酸7(7.3g，40mmol)和N-甲基吗啉(4.4ml，40mmol)溶于100ml DMF中。在氩气保护下将溶液冷至-20℃。搅拌下往该冰冷溶液中一次加氯代甲酸异丁酯(5.2ml，40mmol)。15分钟后加入化合物6(6.44g，40mmol)与30ml DMF(冷至相同温度)的溶液。反应混合物于-20℃搅拌30分钟，升温至室温，继续搅拌1小时，反应混合物蒸发至干，残留物溶于CH₂Cl₂(200ml)中，有机溶液用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得到泡泡糖状粗产品。该粗产品用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→丙酮洗脱，得到12g(92％)纯产物。

4，4-二甲氧基三苯甲基-N-(胸腺嘧啶乙酰基)-L-丝氨醇(O异丁酸酯)(9)：化合物8(10g，30.58mmol)与无水吡啶(3×50mmol)共蒸，然后溶于无水吡啶(100ml)中。在室温和氩气保护下往该溶液中加TEA(3.54g，35mmol)，接着加DMTCl(11.83g，35mmol)。反应混合物搅拌12小时，用甲醇(20ml)淬火并搅拌30分钟。溶液蒸发至干并溶于CH₂Cl₂(200ml)。有机萃取液用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。CH₂Cl₂层用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得到泡泡糖状粗产品。该粗产品用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→丙酮洗脱，得到17g(88％)纯产物。

1-O-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙酰基)〕-L-丙基-1，3-二醇(10)：化合物9(10g，15.89mmol)溶于甲醇(20ml)中。0℃下往该溶液中加1N NaOH溶液(20ml，20mmol)。反应混合物搅拌1小时后用乙酸淬火至pH7。溶液用乙酸乙酯(2×100ml)萃取。有机萃取液用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得到泡泡糖状粗产品。该粗产品用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷-丙酮洗脱，得到8.2g(92％)纯产物。

1’-O-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙酰基)〕-L-丙-3’-O-(N，N-二异丙基)-β-氰乙基氨基磷酸酯(11)：化合物10(8.00g，14.31mmol)与无水吡啶(3×50ml)共蒸发，然后在氢氧化钠固体上真空干燥过夜。该干物料溶于无水CH₂Cl₂(100ml)并在氩气保护下冷至0℃。在氩气保护下往该冰冷溶液中加N，N-二异丙基乙胺(5.23g，25mmol)，然后加2-氰乙基-N，N-二异丙基氯代氨基磷酸酯(4.72g，20.00mmol)。反应混合物在0℃搅拌1小时，再在室温搅拌1小时。反应混合物用CH₂Cl₂(100ml)稀释。该CH₂Cl₂溶液用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。该CH₂Cl₂层用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得到泡泡糖状粗产品。该粗产品用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→含0.1％TEA的丙酮洗脱，得到10g(x％)纯产物。该泡泡糖状物在NaOH固体上真空干燥过夜。该泡泡糖状产品溶于CH₂Cl₂(15ml)中并在氩气保护下于1小时内滴入搅拌的无水己烷(2000ml)中。加完CH₂Cl₂溶液后生成的沉淀再搅拌1小时并过滤，用无水己烷(200ml)洗涤，在固体NaOH上干燥过夜。产量9.5g(87％)。

实施例26(见图23)

N-(叔丁氧羰基)-O-苄基-L-丝氨酸(2)：室温下将O-苄基-L-丝氨酸1(10g，51.28mmol)悬浮在THF/H₂O(8∶2，100ml)混合物中。往该搅拌的混合物中加三乙胺(6.06g，60mmol)，然后加酸式碳酸二叔丁酯(13.08g，60mmol)，反应混合物继续在室温搅拌过夜。均相溶液蒸发至干，残留物溶于乙酸乙酯(300ml)中。有机萃取液用0.5N KHSO₄溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得到14g(93％)油状残留物。

N-(叔丁氧羰基)-O-苄基-L-丝氨醇(3)：N-(叔丁氧羰基)-O-苄基-L-丝氨酸2(6.0g，20.34mmol)溶于无水THF中，然后在氩气保护下冷至-20℃。搅拌下往该冷溶液中加TEA(2.32g，23mmol)及氯代甲酸异丁酯(3.13g，23mmol)。在氩气保护下和-20℃下继续搅拌30分钟，反应混合物在氩气保护下立即过滤，沉淀用无水THF(50ml)洗涤。合并的滤液缓慢地加到冷的(0℃)NaBH₄(7.4g，200mmol)与THF/水(80∶20，200ml)的溶液中，历时10分钟。加完后，反应混合物在0℃搅拌2小时，并用乙酸调pH至7，溶液蒸发至干。在乙酸乙酯/水(300∶150ml)间分配，并萃入乙酸乙酯中。有机萃取液用饱和食盐水(100ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，蒸发至干。该粗产品用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脱，纯馏分倾到一起，蒸发至干，得到4.7g(82％)纯油状产物。

¹HNMR(CDCl₃)：δ1.41(s，9H，Boc)，3.60-3.70(m，4H)，3.82(d，2H)，4.53(s，2H，OCH₂Ph)，5.20(bs，1H，NH) and7.30-7.40(m，5H，Ph).

N-(叔丁氧羰基)-O-苄基-L-丝氨醇-O-异丁酸酯(4)：室温下往N-(叔丁氧羰基)-O-苄基-L-丝氨醇3(4.3g，14.3mmol)于无水吡啶(50ml)的无水溶液中加TEA(2.02g，20mmol)。搅拌下往该溶液中加异丁酸酐(3.16g，20mmol)，并在氩气保护下继续搅拌过夜。反应混合物蒸发至干，在乙酸乙酯(100ml)和NaHCO₃(5％溶液，100ml)之间分配，并萃入乙酸乙酯中。有机萃取液用水(100ml)洗涤，饱和食盐水(50ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，干燥后的溶液蒸发至干，得到粗残留物。该残留物用闪式硅胶色谱纯化，用己烷→乙酸乙酯洗脱，合并纯馏分，蒸发至干，得到4.5g(84％)纯油状产物。¹HNMR(CDCl₃)：δ1.04(d，6H，IbCH₃)，

1.39(s，9H，Boc)，2.46(m，1H，IbCH)，3.40(m，2H)，3.92(m，

2H)，4.12(m，1H)，4.46(s，2H，OCH₂Ph)，6.84(d，1H，NH)and

7.24-7.40(m，5H，Ph).

N-(胸腺嘧啶乙酰基)-O-苄基-L-丝氨醇-O-异丁酸酯(6)：N-(叔丁氧羰基)-O-苄基-L-丝氨醇-O-异丁酸酯4(4.3g，12mmol)，三氟乙酸(20ml)和CH₂Cl₂(20ml)在室温下搅拌30分钟。反应混合物蒸干，残留物溶于CH₃OH(10ml)，再蒸发至干。残留物在固体KOH上真空干燥12小时。该干残留物不经鉴定，直接用于后面的反应。

胸腺嘧啶乙酸5(2.76g，15mmol)溶于无水DMF(75ml)并在氩气保护下冷至-20℃。搅拌下往该冷却的溶液中加N-甲基吗啉(1.72g，17mmol)后再加氯代甲酸异丁酯(2.31g，17mmol)。搅拌15分钟后，上面的TFA盐与无水DMF(50ml)的溶液用N-甲基吗啉(1.72g，17mmol)中和并立即加到搅拌着的冷的胸腺嘧啶乙酸中。反应混合物在-20℃搅拌1小时后升温至室温并继续搅拌过夜。反应溶液蒸发至干，残留物溶在CH₂Cl₂(250ml)和水(100ml)中并萃入CH₂Cl₂中。有机萃取液用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。CH₂Cl₂萃取液干燥，蒸发至干，得到粗产品。该粗产品用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→丙酮洗脱，收集必需的馏分，蒸发，得到4.8g(94％)纯产物。该纯产物用CH₂Cl₂/己烷重结晶。mp：122-124℃ ¹HNMR(CDCl₃)：

δ1.04(d，6H，IbCH₃)，1.72(s，3H，CH₃)，2.44(m，1H，IbCH)，

3.42(m，2H)，4.06(m，2H)，4.18(m，1H)，4.30(s，2H)，4.46

(s，2H，OCH₂Ph)，7.24-7.40(m，6H，C₆H and Ph)，8.22(d，1H，

NH)and 11.22(s，1H，NH).

N-(胸腺嘧啶乙酰基)-L-丝氨醇-O-异丁酸酯(7)：将N-(胸腺嘧啶乙酰基)-O-苄基-L-丝氨醇-O-异丁酸酯6(2.08g，5mmol)溶于乙醇(50ml)中。室温下往该溶液中加Pd(OH)₂(0.6g)和环己烯(5ml)。反应混合物在70℃加热12小时。滤去催化剂，并用甲醇(20ml)洗涤。滤液蒸发至干，得到白色固体。该白色固体溶于少量甲醇中并冷至室温。结晶性的产物为细粉。mp：196-198℃。收率：1.48g(91％)¹HNMR(Me₂SO-d₅)：δ1.04(d，

6H，IbCH₃)，1.72(s，3H，CH₃)，2.42(m，1H，IbCH)，3.40(m，

2H)，3.94(m，2H)，4.06(m，1H)，4.23(s，2H)，4.90(t，1H，

OH)，7.20(s，1H，C₆H)，8.12(d，1H，NH)and 11.22(s，1H，

NH).

4，4’-二甲氧基三苯甲基-N-(胸腺嘧啶乙酰基)-L-丝氨醇-O-异丁酸酯(8)：在氩气保护下将N-(胸腺嘧啶乙酰基)-L-丝氨醇-O-异丁酸酯7(1.48g，4.5mmol)溶于无水吡啶(50ml)。搅拌下往该溶液中加TEA(0.51g，5mmol)和N，N-二甲氨基吡啶(0.10g)。10分钟后加氯代4，4’-二甲氧基三苯甲烷(1.69g，5mmol)，并继续在氩气保护下于室温搅拌过夜。反应混合物用甲醇(10ml)淬火，搅拌10分钟，蒸发至干。残留物溶于乙酸乙酯(200ml)，用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。有机萃取液用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得到粗产品。该粗产品用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脱，合并纯馏分，蒸发，得到2.5g(88％)泡泡糖状纯产物。

¹HNMR(CDCl：δ1.4(d，6H，IbCH₃)，1.72

(s，3H，CH₃)，2.40(m，1H，IbCH)，3.38(m，2H)，3.72(s，6H，

2.OCH₃)，4.12(m，2H)，4.20(m，1H)，4.32(d，2H)，6.84(m，

4H，Ph)，7.20-7.40(m，12H，C₆H and Ph)，8.30(d，1H，NH)

and 11.28(s，1H，NH).

1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙酰基)〕-L-丙基-1，3-二醇(9)：4，4’-二甲氧基三苯甲基-N-(胸腺嘧啶乙酰基)-L-丝氨醇-O-异丁酸酯8(3.4g，5.41mmol)溶在甲醇(30ml)中，并用冰浴冷至0℃。搅拌下往该冷溶液中加2N NaOH溶液(10ml，20mmol)，再于0℃搅拌30分钟。用乙酸调溶液的pH至7并蒸发至干。残留物在水(50ml)和CH₂Cl₂(150ml)之间分配，并萃入CH₂Cl₂中，水层再用CH₂Cl₂萃取(50ml)萃取。合并有机萃取液，用饱和食盐水(50ml)洗涤。干燥，蒸发至干，残留物用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→丙酮洗脱，得到3.0g(99％)产物。 ¹HNMR(CDCl₃)：1.72(s，3H，

CH₃)，3.0(m，2H)，3.42(m，2H)，3.72(s，6H，2.OCH₃)，3.94

(m，1H)，4.32(d，2H)，4.68(m，1H，OH)，6.84(m，4H，Ph)，

7.20-7.40(m，12H，C₆H and Ph)，8.06(d，1H，NH) and 11.28

(bs，1H，NH).

1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙酰基)〕-L-丙基-3-O-(N，N-二异丙基)-β-氰乙基氨基磷酸酯(10)：将1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙酰基)〕-L-丙-1，3-二醇9(3.1g，5.55mmol)在固体NaOH上真空干燥过夜并溶入无水CH₂Cl₂(100ml)。溶液在氩气保护下冷至0℃。搅拌下往该冷却的溶液中加N，N-二异丙基乙胺(1.29g，10mmol)，然后加2-氰乙基-N，N-二异丙基氯代氨基磷酸酯(1.96g，8.3mmol)。反应混合物0℃搅拌1小时，室温搅拌2小时。反应混合物用CH₂Cl₂(100ml)稀释，有机层用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。CH₂Cl₂萃取液用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得油状残留物。该残留物用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→含0.1％TEA的乙酸乙酯洗脱，合并纯馏分，蒸发，得到泡泡糖状物。该泡泡糖状物在固体NaOH上干燥过夜。在氩气保护下将干泡泡糖状物溶入无水CH₂Cl₂(20ml)并滴加到搅拌的无水己烷(2000ml)中，历时1小时。加完后生成的沉淀再搅拌1小时，过滤，用无水己烷(100ml)洗涤，收集到的固体在固体NaOH上真空干燥4小时。产量3.5g(83％)。

实施例27(见图24)

N-(叔丁氧羰基)-O-苄基-D-丝氨酸(12)：室温下将O-苄基-D-丝氨酸11(5g，25.64mmol)悬浮在THF/H₂O(8∶2，70ml)混合物中。往该搅拌的混合物中加三乙胺(4.04g，40mmol)，然后加酸式碳酸二叔丁酯(6.54g，30mmol)，反应混合物继续在室温搅拌过夜。均相溶液蒸发至干，残留物溶于乙酸乙酯(150ml)中。有机萃取液用0.5N KHSO₄溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。乙酸乙酯萃取液用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得到7.56克(100％)油状残留物。

N-(叔丁氧羰基)-O-苄基-D-丝氨醇(13)：N-(叔丁氧羰基)-O-苄基-D-丝氨酸10(7.56g，25.63mmol)溶于无水THF中，然后在氩气保护下冷至-20℃。搅拌下往该冷溶液中加TEA(3.03g，30mmol)及氯代甲酸异丁酯(4.08g，30mmol)。在氩气保护下于-20℃再搅拌30分钟。反应混合物立即在氩气罩下过滤，沉淀用无水THF(50ml)洗涤。合并的滤液缓慢地加到冷的(0℃)NaBH₄(7.4g，200mmol)与THF/水(80∶20，200ml)的溶液中，历时10分钟。加完后，反应混合物在0℃搅拌2小时，并用乙酸调pH至7。，溶液蒸发至干。在乙酸乙酯/水(300∶150ml)间分配，并萃入乙酸乙酯中。有机萃取液用饱和食盐水(100ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，该粗产品用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脱，纯馏分倾倒一起，蒸发至干，得到6.68g(92％)纯油状产物。

¹HNMR(CDCl₃)：δ1.41(s，9H，Boc)，3.60-3.70(m，

4H)，3.82(d，2H)，4.53(s，2H，OCH₂Ph)，5.20(bs，1H，NH)and

7.30-7.40(m，5H，Ph).

N-(叔丁氧羰基)-O-苄基-D-丝氨醇-O-异丁酸酯(14)：室温下往N-(叔丁氧羰基)-O-苄基-D-丝氨醇13(6.6g，23.5mmol)与无水吡啶(50ml)的无水溶液中加TEA(3.03g，30mmol)。搅拌下往该溶液中加异丁酸酐(4.74g，30mmol)，并在氩气保护下继续搅拌过夜。反应混合物蒸发至干，在乙酸乙酯(200ml)和NaHCO₃(5％溶液，100ml)之间分配，并萃入乙酸乙酯中。有机萃取液用水(100ml)洗涤，饱和食盐水(50ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，干燥后的溶液蒸发至干，得到粗残留物。该粗产品用闪式硅胶色谱纯化，用己烷→乙酸乙酯洗脱，合并纯馏分，蒸发至干，得到8.0g(97％)纯油状产物。

¹HNMR(CDCl₃)：δ1.04(d，6H，IbCH₃)，1.39(s，

9H，Boc)，2.46(m，1H，IbCH)，3.40(m，2H)，3.92(m，2H)，4.12

(m，1H)，4.46(s，2H，OCH₂Ph)，6.84(d，1H，NH)and 7.24-

7.40(m，5H，Ph).

N-(胸腺嘧啶乙酰基)-O-苄基-D-丝氨醇-O-异丁酸酯(15)：N-(叔丁氧羰基)-O-苄基-D-丝氨醇-O-异丁酸酯14(5.0g，14.25mmol)，三氟乙酸(20ml)和CH₂Cl₂(20ml)在室温下搅拌30分钟。反应混合物蒸干，残留物溶于无水CH₃OH(10ml)，再蒸发至干。残留物溶解到CH₂Cl₂(150ml)中，用5％NaHCO₃水溶液调pH至7，并萃入CH₂Cl₂中。有机层用水(100ml)洗涤，饱和食盐水(50ml)洗涤。CH₂Cl₂萃取液干燥并蒸发至干。得到的残留物在固体KOH上真空干燥12小时。该干残留物不经鉴定，直接用于后面的反应。

胸腺嘧啶乙酸5(2.57g，14mmol)溶于无水DMF(50ml)并在氩气保护下冷至-20℃。搅拌下往该冷却的溶液中加N-甲基吗啉(1.52g，15mmol)后再加氯代甲酸异丁酯(2.04g，15mmol)。搅拌15分钟后，上面的胺与无水DMF(50ml)的溶液立即加到搅拌着的胸腺嘧啶乙酸中。反应混合物于-20℃搅拌1小时，升温至室温，继续搅拌过夜，溶液蒸发至干，残留物溶入CH₂Cl₂(250ml)和水(100ml)中并萃入CH₂Cl₂。有机萃取液用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。CH₂Cl₂萃取液用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得到粗产品。该粗产品用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→丙酮洗脱，收集必需的馏分，蒸发，得到2.8g(54％)纯产物。 ¹HNMR(CDCl₃)：δ1.04

(d，6H，IbCH₃)，1.72(s，3H，CH₃)，2.44(m，1H，IbCH)，3.42

(m，2H)，4.06(m，2H)，4.18(m，1H)，4.30(s，2H)，4.46(s，

2H，OCH₂Ph)，7.24-7.40(m，6H，C₃H and Ph)，8.22(d，1H，NH)

and 11.22(s，1H，NH).

标题化合物亦可按照制备“L-”异构体的方法制备。使用的试剂为：胸腺嘧啶乙酸(2.2g，12mmol)；氯代甲酸异丁酯(1.77g，13mmol)；N-甲基吗啉(1.52克，15mmol)；TFA盐(3.65g，10mmol)，N-甲基吗啉(1.5g，15mmol)和无水DMF(100ml)。产量3.5g(84％)。

N-(胸腺嘧啶乙酰基)-D-丝氨醇-O-异丁酸酯(16)：将N-(胸腺嘧啶乙酰基)-O-苄基-D-丝氨醇-O-异丁酸酯15(3.5g，8.39mmol)溶于乙醇(50ml)中。室温下往该溶液中加Pd(OH)₂(1.00g)和环己烯(10ml)。反应混合物在70℃加热12小时。滤去催化剂，并用甲醇(20ml)洗涤。滤液蒸发至干得到白色固体。产量：2.7g(98％)。

¹HNMR(Me₂SO-d₆)：δ1.04(d，6H，IbCH₃)，1.72(s，3H，

CH₃)，2.42(m，1H，IbCH)，3.40(m，2H)，3.94(m，2H)，4.06(m，

1H)，4.28(s，2H)，4.90(t，1H，OH)，7.20(s，1H，C₆H)，8.12

(d，1H，NH)and 11.22(s，1H，NH).

4，4’-二甲氧基三苯甲基-N-(胸腺嘧啶乙酰基)-D-丝氨醇-O-异丁酸酯(17)：在氩气保护下将N-(胸腺嘧啶乙酰基)-D-丝氨醇-O-异丁酸酯16(2.7g，8.26mmol)溶于无水吡啶(50ml)。搅拌下往该溶液中加TEA(1.01g，10mmol)，再加氯代4，4’-二甲氧基三苯甲烷(3.38g，10mmol)，并继续在氩气保护下室温搅拌过夜。反应混合物用甲醇(10ml)淬火，搅拌10分钟，蒸发至干。残留物溶于乙酸乙酯(250ml)，用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。有机萃取液用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得到粗产品。该粗产品用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脱，合并纯馏分，蒸发，得到5.0g(96％)泡泡糖状纯产物。¹HNMR(CDCl₃)：δ1.04(d，6H，IbCH₃)，1.72

(s，3H，CH₃)，2.40(m，1H，IbCH)，3.38(m，2H)，3.72(s，6H，

2.OCH₃)，4.12(m，2H)，4.20(m，1H)，4.32(d，2H)，6.84(m，

4H，Ph)，7.20-7.40(m，12H，C₆H and Ph)，8.30(d，1H，NH)

and 11.28(s，1H，NH).

1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙酰基)〕-D-丙-1，3-二醇(18)：将4，4’-二甲氧基三苯甲基-N-(胸腺嘧啶乙酰基)-D-丝氨醇-O-异丁酸酯17(5.0g，7.95mmol)溶在甲醇(30ml)中，并用冰浴冷至0℃。搅拌下往该冷溶液中加2N NaOH溶液(10ml，20mmol)，再于0℃搅拌30分钟。用乙酸调溶液的pH至7并蒸发至干。残留物在水(50ml)和CH₂Cl₂(250ml)之间分配，并萃入CH₂Cl₂中，水层再用CH₂Cl₂(50ml)萃取。合并有机萃取液，用饱和食盐水(50ml)洗涤。干燥，蒸发至干，残留物用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→丙酮洗脱，得到4.0g(90％)。

¹HNMR(CDCl₃)：1.72(s，3H，CH₃)，

3.0(m，2H)，3.42(m，2H)，3.72(s，6H，2.OCH₃)，3.94(m，1H)，

4.32(d，2H)，4.68(m，1H，OH)，6.84(m，4H，Ph)，7.20-7.40

(m，12H，C₆H and Ph)，8.06(d，IH，NH)and 11.28(bs，1H，NH).

1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙酰基)〕-D-丙基-3-O-(N，N-二异丙基)-β-氰乙基氨基磷酸酯(19)：将1-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-〔氨基(胸腺嘧啶乙酰基)〕-D-丙-1，3-二醇18(2.79g，5.0mmol)在固体NaOH上真空干燥过夜并溶入无水CH₂Cl₂(100ml)。溶液在氩气保护下冷至0℃。搅拌下往该冷却的溶液中加N，N-二异丙基乙胺(1.29g，10mmol)，然后加2-氰乙基-N，N-二异丙基氯代氨基磷酸酯(1.96g，8.3mmol)。反应混合物0℃搅拌1小时，室温搅拌2小时。反应混合物用CH₂Cl₂(100ml)稀释，有机层用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。CH₂Cl₂萃取液用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得油状残留物。该残留物用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→含0.1％TEA的乙酸乙酯洗脱，合并纯馏分，蒸发，得到泡泡糖状物。该泡泡糖状物在固体NaOH上干燥过夜。干泡泡糖状物溶入无水CH₂Cl₂(20ml)中，在搅拌和氩气保护下滴入搅拌的无水己烷(2000ml)中，历时1小时。加完后生成的沉淀再搅拌1小时，过滤，用无水己烷(100ml)洗涤，收集到的固体在固体NaOH上真空干燥4小时。产量3.3g(87％)。

实施例28(图25)

1-O-苄基-2-〔(叔丁氧羰基)氨基〕-3-〔N3-苯甲酰基(胸腺嘧啶基)-L-丙醇(21)：氩气保护、室温和搅拌下往N3-苯甲酰基胸腺嘧啶20(5.75g，25mmol)与无水THF(200ml)的溶液中加三苯基膦(10.48g，40mmol)和Nα-叔丁氧羰基-β-苯甲酰氧-L-丝氨醇3(5.3g，18.86mmol)。15分钟后缓慢加入二乙基偶氮二羧酸酯(6.96g，40mmol)，历时30分钟。该反应混合物用铝铂盖上并在氩气保护下室温搅拌24小时。蒸去溶剂使干，残留物溶解到乙酸乙酯(300ml)中。有机萃取液用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得到桔红色油状物。该粗产品用闪式硅胶层析纯化，用己烷→乙酸乙酯洗脱，合并含所需的产品的纯馏分，蒸发，得到浅粉色油状物。产量：8.0g(86％)。 ¹HNMR (CDCl₃)：1.41(s，9H，

Boc)，1.72(s，3H，CH₃)，3.56(m，2H)，4.20(m，2H)，4.32(m，

1H)，4.52(d，2H，OCH₂Ph)，5.20(d，1H，NH)，7.06(s，1H，C₆H)

and 7.20-7.60(m，10H，Ph).

2-〔(叔丁氧羰基)氨基〕-3-〔N3-苯甲酰基(胸腺嘧啶基)-L-丙-1-醇(22)：1-O-苄基-2-〔(叔丁氧羰基)氨基〕-3-〔N3-苯甲酰基(胸腺嘧啶基)-L-丙醇21(4.93g，10mmol)溶解在甲醇(100ml)中并用Pd/C(10％，1g)处理。反应混合物在50磅/英寸2氢气压下氢化12小时。滤去催化剂，用甲醇(50ml)洗涤，滤液蒸发至干。残留物用丙酮/己烷结晶，得3.70g(92％)纯产品。 ¹HNMR(CDCl₃)：1.42(s，

9H，Boc)，1.94(s，3H，CH₃)，3.64(m，4H)，3.84(m，H)，4.14

(m，1H)，5.22(d，1H，NH)，7.18(s，1H，C₆H)，7.48(t，2H，

Ph)，7.62(t，lH，Ph)and 7.98(d，2H，Ph).

1-O-异丁酰基-2-〔(叔丁氧羰基)氨基〕-3-〔N3-苯甲酰基(胸腺嘧啶基)-L-丙醇(23)：将2-〔(叔丁氧羰基)氨基〕-3-〔N3-苯甲酰基(胸腺嘧啶基)-L-丙-1-醇22(1.6g，3.97mmol)溶解到无水吡啶(30ml)中，然后在氩气保护下室温搅拌。搅拌下往溶液中加TEA(0.51g，5mmol)和异丁酸酐(0.79g，5mmol)。反应混合物室温搅拌12小时后蒸发至干。将残留物溶解到乙酸乙酯(150ml)中，用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。有机萃取液用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，残留物用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脱，合并纯馏分，蒸发，得到1.6g(85％)泡泡糖状的产物。该纯产物用丙酮/己烷结晶。 mp：165-167℃.¹HNMR(CDCl₃)：1.16(d，6H，

IbCH₃)，1.42(s，9H，Boc)，1.94(s，3H，CH₃)，2.52(m，lH)，

3.64(m，4H)，3.84(m，1H)，4.14(m，1H)，5.22(d，1H，NH)，

7.18(s，1H，C₆H)，7.48(t，2H，Ph)，7.62(t，1H，Ph)and 7.98

(d，2H，Ph).

1-O-异丁酰基-2-〔(β-羟乙酰基)氨基〕-3-〔N₃-苯甲酰基(胸腺嘧啶基)-L-丙醇(24)：1-O-异丁酰基-2-〔(叔丁氧羰基)氨基〕-3-〔N₃-苯甲酰基(胸腺嘧啶基)-L-丙醇23(1.6g，3.38mmol)在TEA(5ml)和CH₂Cl₂(10ml)的混合物中室温搅拌30分钟，然后蒸发至干。残留物溶解在无水甲醇(10ml)中，再蒸发至干。得到的残留物在固体NaOH上真空干燥过夜。该干物料直接用于下面的反应。

搅拌下往乙醇酸(0.53g，7mmol)与无水DMF(50ml)的溶液中加1-羟基苯并三唑(0.67g，5mmol)和l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)(1.91g，10mmol)。搅拌15分钟后于室温下加入TEA(1.01g，10mmol)和上面制得的TFA盐的DMF(20ml)溶液。反应混合物搅拌12小时并蒸发至干。残留物在CH₂Cl₂(150ml)和水(100ml)之间分配并萃取到CH₂Cl₂中。有机萃取液用饱和食盐水(50ml)洗涤。干燥，蒸发至干，残留物用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→丙酮洗脱，合并含所需产物的纯馏分，蒸发，得到l.35g(92％)泡泡糖状的产物。

¹HNMR(CDCl₃)：1.16(d，6H，IbCH₃)，1.94(s，3H，CH₃)，

2.52(m，1H)，3.20(bs，1H)，3.80-4.30(m，6H)，4.56(m，

1H)，7.14(d，2H，C₆H and NH)，7.50(t，2H，Ph)，7.64(t，1H，

Ph)and 7.94(d，2H，Ph).

1-O-异丁酰基-2-〔(β-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-O-乙酰基)氨基〕-3-〔N₃-苯甲酰基(胸腺嘧啶基)-L-丙醇(25)：1-O-异丁酰基-2-〔(β-羟乙酰基)氨基〕-3-〔N₃-苯甲酰基(胸腺嘧啶基)-L-丙醇24(1.2g，2.78mmol)溶解在无水吡啶(50ml)中，并在氩气保护下室温搅拌。搅拌下往该溶液中加TEA(0.35g，3.5mmol)和氯代4，4’-二甲氧基三苯甲烷(1.18g，3.5mmol)。反应混合物室温搅拌12小时后用甲醇(10ml)淬火，然后蒸发至干。残留物溶于乙酸乙酯(150ml)，用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。有机萃取液用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，残留物用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脱，合并纯馏分，蒸发，得到1.7g(83％)纯产物。

¹HNMR(CDCl₃)：1.16(d，6H，IbCH₃)，1.94(s，3H，

CH₃)，2.52(m，1H)，3.74(s，6H，2.OCH₃)，3.80-4.30(m，6H)，

4.56(m，1H)，6.82(d，4H，Ph)，7.14(d，2H，C₆H and NH)and

7.26-8.00(m，14H，Ph).

2-〔(β-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-O-乙酰基)氨基〕-3-胸腺嘧啶基-L-丙醇(26)：1-O-异丁酰基-2-〔(β-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-O-乙酰基)氨基〕-3-〔N₃-苯甲酰基(胸腺嘧啶基)-L-丙醇25(1.55g，2.05mmol)溶于甲醇(20ml)中，用冰浴冷至0℃。搅拌下往该冰冷溶液中加2N NaOH(5ml，10mmol)，0℃继续搅拌30分钟。用乙酸调pH至7，蒸发至干。残留物在水(50ml)和CH₂Cl₂(50ml)之间分配，并萃入CH₂Cl₂中，水层再用CH₂Cl₂(50ml)萃取。合并有机萃取液，用饱和食盐水(50ml)洗涤。干燥，蒸发至干，残留物用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→丙酮洗脱，得到1.0g(99％)。

¹HNMR(CDCl₃)：1.94(s，3H，CH₃)，3.74(s，6H，2.OCH₃)，

3.80-4.30(m，6H)，4.56(m，1H)，6.82(d，4H，Ph)，7.14(d，

2H，C₆H and NH)and 7.26-8.00(m，14H，Ph).

2-〔(β-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-O-乙酰基)氨基〕-3-胸腺嘧啶基-L-丙基-1-O-(N，N-二异丙基)-β-氰乙基氨基磷酸酯(27)：2-〔(β-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-O-乙酰基)氨基〕-3-胸腺嘧啶基-L-丙醇26(1.00g，2.09mmol)在固体NaOH上真空干燥过夜并溶于无水CH₂Cl₂(50ml)中。在氩气保护下将该溶液冷至0℃。搅拌下往该冰冷溶液中加N，N-二异丙基乙胺(0.54g，4.2mmol)，再加2-氰乙基-N，N-二异丙基氯代氨基磷酸酯(0.73g，3.1mmol)。反应混合物0℃搅拌1小时，室温搅拌2小时。反应混合物用CH₂Cl₂(100ml)稀释，CH₂Cl₂萃取液用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得油状残留物。该残留物用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→含0.1％TEA的乙酸乙酯洗脱，合并纯馏分，蒸发，得到泡泡糖状产物。该泡泡糖状产物在固体NaOH上真空干燥。干泡泡糖样产物溶解在无水CH₂Cl₂(10ml)中，在氩气保护和搅拌下滴加到无水己烷(800ml)中，历时30分钟。加完后，生成的沉淀再搅拌30分钟，过滤，用无水己烷(100ml)洗涤，固体在固体NaOH上真空干燥4小时。产量：1.3g(82％)。

实施例29(图26)

N^α-叔丁氧羰基-O-苄基羟胺(28)：将O-苄基羟胺盐酸盐(15.9g，100mmol)悬浮在THF(150ml)和水(50ml)的混合物中。搅拌下往该溶混合物中加TEA(15.15g，150mmol)，然后加酸式碳酸二叔丁酯(23.98g，110mmol)。反应混合物室温搅拌12小时，蒸发至干。残留物在乙酸乙酯(250ml)和水(200ml)之间分配，并使萃入乙酸乙酯中。乙酸乙酯萃取液用硫酸氢钾溶液(100ml)及饱和食盐水(100ml)洗涤，干燥，蒸发至干，得15g(91％)清亮的油。

1-氯-2-(四氢吡喃基)氧-乙烷(29)：1-氯乙醇(8.06g，100mmol)溶解在无水CH₂Cl₂(100ml)中，在氩气保护下用冰浴冷至0℃。搅拌下往该溶液中加二氢吡喃(12.6g，150mmol)接着加对甲苯磺酸吡啶盐(1.25g，5mmol)并继续搅拌过夜。将反应混合物蒸发至干并溶于乙酸乙酯(200ml)中。乙酸乙酯萃取液用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(100ml)洗涤。有机层干燥，蒸发至干，粗产物用闪式硅胶层析纯化，用己烷→二氯甲烷洗脱，合并纯馏分，蒸发，得到11g(67％)纯产物。

N-叔丁氧羰基-N-〔(四氢吡喃)氧〕乙基-O-苄基羟胺(30)：0℃和氩气保护及搅拌下往N-叔丁氧羰基-O-苄基羟胺28(5.79g，25.96mmol)与无水DMF(50ml)的溶液中缓慢加NaH(60％，1.2g，30mmol)，历时15分钟。反应混合物0℃搅拌30分钟，室温搅拌1小时。加1-氯-2-(四氢吡喃基)氧-乙烷29(4.95g，30mmol)，反应混合物于80℃加热12小时。反应混合物冷却后蒸发至干。残留物悬浮于水(50ml)中，调pH至7，萃入乙酸乙酯(150ml)中。乙酸乙酯萃取液用水洗涤，饱和食盐水洗涤，干燥并蒸发至干。残留物用闪式硅胶层析纯化，用己烷→二氯甲烷洗脱，收集所需的馏分，蒸发，得到6.0g(66％)油状产物。

¹HNMR(CDCl₃)：δ1.48(s，9H，Boc)，1.49-1.84(m，

6H，3.CH₂)，3.48-3.70(m，4H，2.CH₂)，3.86(m，2H，CH₂)，

4.60(t，1H，CH)，4.84(s，2H，CH₂Ph)and 7.32-7.42(m，5H，

Ph).

N-叔丁氧羰基-N-[(2-羟)乙基]-O-苄基羟胺(31)：将N-叔丁氧羰基-N-〔(四氢吡喃)氧〕乙基-O-苄基羟胺30(3.51g，10mmol)与THF∶水∶乙酸(1∶1∶1，100ml)混合物的溶液在70℃搅拌加热3小时。反应混合物冷至0℃后用固体NaHCO₃调pH至7。反应混合物用乙酸乙酯(2×75ml)萃取。合并有机萃取液，用水(100ml)洗涤，饱和食盐水(100ml)洗涤，干燥，蒸发至干。残留物用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脱，合并纯馏分，蒸发，得到2.5g(94％)泡泡糖样产物。¹HNMR(CDCl₃)：δ

1.48(s，9H，Boc)，3.60(t，2H，CH₂)，3.74(m，2H，CH₂)，4.84

(s，2H，CH₂Ph)and 7.32-7.42 (m，5H，Ph).

N-叔丁氧羰基-N-〔〔(2-异丁酰基)氧〕乙基〕-O-苄基羟胺(32)：室温，氩气保护和搅拌下往N-叔丁氧羰基-N-〔(2-羟)乙基〕-O-苄基羟胺31(4.2g，16.6mmol)与无水吡啶(50ml)的溶液中加TEA(2.02g，20mmol)，接着加异丁酸酐(3.16g，20mmol)。反应混合物室温搅拌12小时，蒸发至干。残留物溶于乙酸乙酯(200ml)中，用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(50ml)洗涤。有机萃取液干燥，蒸发至干，残留物用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷洗脱，收集纯馏分，蒸发，得到4.5g(80％)纯产物。

¹HNMR(CDCl₃)：δ1.04(d，6H，IbCH₃)，1.48(s，9H，Boc)，2.44(m，1H，

IbCH)，3.60(t，2H，CH₂)，3.74(m，2H，CH₂)，4.84(s，2H，

CH₂Ph)and 7.32-7.4 2(m，5H，Ph).

N-(胸腺嘧啶乙酰基)-N-〔〔(2-异丁酰基)氧〕乙基〕-O-苄基羟胺(33)：N-叔丁氧羰基-N-〔〔(2-异丁酰基)氧〕乙基〕-O-苄基羟胺32(5.0g，14.84mmol)溶解在CH₂Cl₂(10ml)中，在TFA(12ml)中搅拌30分钟。反应混合物蒸发至干并溶于无水甲醇(10ml)。在蒸发至干，在固体NaOH上真空干燥过夜。该干物料不经鉴定直接用于后面的反应。

将胸腺嘧啶乙酸5(3.13g，17mmol)溶解到无水DMF中，在氩气保护下冷至-20℃。搅拌下往该冰冷溶液中加N-甲基吗啉(2.02g，20mmol)，接着加氯代甲酸异丁酯(2.72g，20mmol)。搅拌15分钟后，上面的TFA盐与无水DMF(50ml)的溶液用N-甲基吗啉(2.02g，20mmol)中和并立即加到冷却的搅拌的胸腺嘧啶乙酸中。反应混合物于-20℃搅拌1小时，升温至室温并继续搅拌过夜。该溶液蒸发至干，残留物溶解到CH₂Cl₂(25ml)和水(100ml)中，并萃入CH₂Cl₂。有机萃取液用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤，饱和食盐水(50ml)洗涤，CH₂Cl₂萃取液干燥，蒸发至干，得粗产物。该粗产物用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→丙酮洗脱，合并必需的馏分，蒸发，得到4.0g(70％)纯产物。该纯产物用CH₂Cl₂/己烷结晶。

mp：185-188℃)¹HNMR(Me₂SO-d₆)：δ1.00(d，6H，IbCH₃)，1.74

(s，3H，CH₃)，2.44(m，1H，IbCH)，3.92(m，2H)，4.18(t，2H)，

4.68(bs，2H)，4.98(s，2H)，7.34(s，1H，C₆H)，7.40-7.50

(m，5H，Ph)and 11.32(bs，1H，NH).

实施例30(见图27)

(2R，4R)-2-羧甲氧基-4-羟基吡咯烷(35)：250ml园底烧瓶装有电磁搅拌和回流冷凝器，加无水甲醇(40ml)，然后在氩气保护下用冰浴冷却。搅拌下往该溶液中加乙酰氯(4.32g，55mmol)，接着加顺式-4-羟基-D-脯氨酸34(5.00g，38.17mmol)。得到的溶液加热回流7至8小时，然后冷至室温。该溶液用乙醚稀释，抽滤收集生成的白色固体，用乙醚洗，在固体NaOH上真空干燥。产量6.9g(100％)。

¹HNMR(CDCl₃)：2.09(2 dd，1H)，2.34(m，1H)，3.49-

3.73(m，3H)，3.79(s，3H，CH₃)，4.34(m，2H).

(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-羧甲氧基-4-羟基吡咯烷(36)：室温和搅拌下往(2R，4R)-2-羧甲氧基-4-羟基吡咯烷35(6.9g，38.12mmol)与THF/水(8∶2，150ml)的溶液中加TEA(10.1g，100mmol)，再加酸式碳酸二叔丁酯(10.9g，50mmol)。反应混合物室温搅拌6小时，蒸发至干。残留物溶于乙酸乙酯(200ml)中，用0.5％硫酸氢钾溶液(50ml)洗涤，水(100ml)洗涤，饱和食盐水(50ml)洗涤，有机萃取液用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得到7.8g(84％)油状产物。该油状产物干燥后变为无色固体。mp：75-77℃.¹HNMR

(CDCl₃)：1.45(s，9H，Boc)，2.09(2 dd，1H)，2.34(m，1H)，

3.49-3.73(m，3H)，3.79(s，3H，CH₃)，4.34(m，2H).

(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-羟甲基-4-羟基吡咯烷(37)：(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-羧甲氧基-4-羟基吡咯烷36(7.0g，28.6mmol)溶于无水THF(100ml)并在氩气保护下用冰浴冷却。往该冰冷溶于中分批加入硼氢化锂(1.88g，85.8mmol)，历时15分钟。加完硼氢化锂后，反应混合物在氩气保护下0℃搅拌1小时，室温搅拌15小时。该溶液冷至0℃，用水(50ml)稀释，用乙酸调pH至6。反应混合物蒸发至干，溶入乙酸乙酯(200ml)中，用水(100ml)洗，饱和食盐水(100ml)洗涤，乙酸乙酯萃取液干燥并蒸发至干。残留物用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脱，收集纯馏分，蒸发至干，得到5.00g(81％)无色油状物。该油状产物放置后变为无色固体。 mp：95-97C.¹HNMR

(CDCl₃)：1.45(s，9H，Boc)，1.90(dd，1H)，2.34(m，1H)，3.40

-3.62(m，3H)，4.00(m，2H)，4.28(bs，1H)，4.44(m，1H).

(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)氧甲基-4-羟基吡咯烷(38)：(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-羟甲基-4-羟基吡咯烷37(4.4g，20.28mmol)溶解于无水吡啶(50ml)并使在氩气保护下搅拌。搅拌下往该溶于中加TEA(2.53g，25mmol)，再加氯代4，4’-二甲氧基三苯甲烷(7.45g，22mmol)。反应混合物室温搅拌12小时后用甲醇(10ml)淬火。得到的溶液蒸发至干并溶入乙酸乙酯(200ml)。乙酸乙酯层用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤和饱和食盐水(100ml)洗涤，有机萃取液用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，残留物用闪式硅胶层析纯化，用己烷→乙酸乙酯洗脱，合并需要的馏分，蒸发，得到8.09g(100％)桔红色泡泡糖样产物。

¹HNMR(CDCl₃)：1.45(s，9H，Boc)，1.90(dd，1H)，2.34

(m，1H)，3.40-3.62(m，3H)，3.74(s，6H，2.OCH₃)，4.00(m，

2H)，4.28(bs，1H)，4.44(m，1H)，6.82(d，4H，Ph)，and 7.26-

8.00(m，9H，Ph).

(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)氧甲基-4-〔(对甲苯磺酰基)氧〕吡咯烷39-：(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)氧甲基-4-羟基吡咯烷38(8.09g，20.27mmol)溶于无水吡啶/CH₂Cl₂(2∶1，200ml)中并在氩气保护下用冰浴冷却。往该冰冷的溶于中加TEA(3.03g，30mmol)，再加对甲苯磺酰氯(5.7g，30mmol)。反应混合物0℃搅拌3小时，30℃以下搅拌8小时。反应混合物蒸发至干后在乙酸乙酯(200ml)和5％NaHCO₃溶液(100ml)之间分配，并使萃入乙酸乙酯中。乙酸乙酯萃取液用水(100ml)洗涤，饱和食盐水(100ml)洗涤，干燥，蒸发至干，粗产物用闪式硅胶层析纯化，用己烷→乙酸乙酯洗脱，合并纯馏分，蒸发，得到12.2g(89％)桔黄色油状物。 ¹HNMR(CDCl₃)：1.45(s，

9H，Boc)，1.90(dd，1H)，2.34(m，1H)，2.40(s，3H，CH₃)，

3.40-3.62(m，3H)，3.74(s，6H，2.OCH₃)，4.00(m，2H)，4.28

(bs，1H)，4.44(m，1H)，6.82(d，4H，Ph)，and 7.26-8.00(m，

13H，Ph).

(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)氧甲基-4-叠氮基-吡咯烷(40)：将(2R，4R)-1-(叔丁氧羰基)-2-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)氧甲基-4-〔(对甲苯磺酰基)氧〕吡咯烷39(5.1g，7.58mmol)溶于二甲基甲酰胺(50ml)并用水(5ml)稀释。搅拌下往该溶液中加叠氮化钠(0.65g，10mmol)并于80℃加热8小时。放冷，蒸发至干。残留物在CH₂Cl₂(200ml)和水(100ml)之间分配，并萃入CH₂Cl₂。有机萃取液用饱和食盐水(50ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸发至干，粗产物用闪式硅胶层析纯化，用己烷→乙酸乙酯洗脱，合并纯馏分，蒸发，得到3.8g(92％)清亮的油状物。

¹HNMR(CDCl₃)：1.45(s，9H，Boc)，1.90(dd，1H)，2.34(m，

1H)，3.40-3.62(m，3H)，3.74(s，6H，2.OCH₃)，4.00(m，2H)，

4.28(bs，1H)，4.44(m，1H)，6.82(d，4H，Ph)，and 7.26-7.80

(m，9H，Ph).

(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-羟甲基-4-氨基吡咯烷(41)：(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)氧甲基-4-叠氮基-吡咯烷40(2.72g，5mmol)在甲醇(75ml)中在10％钯炭(0.3g)存在下于室温及5个大气压下氢化。12小时后，滤去催化剂，用甲醇(20ml)洗，减压蒸去溶剂。得1.0g(93％)产物。¹HNMR(CDCl₃)：1.45(s，9H，

Boc)，1.90(dd，1H)，2.34(m，1H)，3.40-3.62(m，3H)，4.00

(m，2H)，4.28(bs，1H)and 4.44(m，1H).

(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-羟甲基-4-邻苯二甲酰亚胺基吡咯烷(42)：(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-羟甲基-4-氨基吡咯烷41(1.00g，4.63mmol)溶解在无水甲醇(20ml)中，然后在室温下用N-乙氧羰基邻苯二甲酰亚胺(1.09g，5mmol)处理。反应混合物搅拌6小时后蒸发至干。残留物用闪式硅胶层析纯化，用二氯甲烷→乙酸乙酯洗脱，合并纯馏分，蒸发，得到1.5g(94％)纯泡泡糖样产物。¹HNMR(CDCl₃)：1.45

(s，9H，Boc)，1.90(dd，1H)，2.34(m，1H)，3.40-3.62(m，

3H)，4.00(m，2H)，4.28(bs，1H)，4.44(m，1H)and 7.3-7.6

(m，4H，Ph).

(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-〔N3-苯甲酰基(胸腺嘧啶-1-基)〕甲基-4-邻苯二甲酰亚胺基吡咯烷(43)：氩气保护、室温及搅拌下往N₃-苯甲酰基胸腺嘧啶20(1.15g，5mmol)与无水THF(70ml)的溶液中加三苯基膦(2.62g，10mmol)和(2R，4S)-1-(叔丁氧羰基)-2-羟甲基-4-邻苯二甲酰亚胺基吡咯烷(1.4g，4.05mmol)。15分钟后缓慢加偶氮二羧酸二乙酯(1.74g，10mmol)，历时10分钟。该反应混合物用铝铂盖住并在氩气保护下室温搅拌24小时。蒸去溶剂至干，残留物溶入乙酸乙酯(150ml)。有机萃取液用5％NaHCO₃溶液(100ml)洗涤，水(100ml)洗涤，饱和食盐水(50ml)洗涤，有机萃取液用无水硫酸钠干燥，干燥后的乙酸乙酯萃取液蒸发至干，得桔红色油状产物。该粗产物用闪式硅胶层析纯化，用己烷→乙酸乙酯洗脱，合并含所需产物的馏分，蒸发，得到2g(89％)浅粉色的油状物。

¹HNMR(CDCl₃)：1.41(s，9H，Boc)，1.72(s，3H，CH₃)，

1.90(dd，1H)，2.34(m，1H)，3.40-3.62(m，3H)，4.00(m，

2H)，4.28(bs，1H)，4.44(m，1H)，7.06(s，1H，C₆H)and 7.20-

7.60(m，9H，Ph).

实施例31

寡核苷酸的合成：用DNA自动合成仪(Applied Biosystems model 394)和标准的氨基磷酸酯化学法合成含修饰的氨基酸核酸骨架的寡核苷酸。β-氰乙基氨基磷酸酯，合成试剂和CPG聚苯乙烯柱均购自AppliedBiosystems(Foster City，CA)。合成硫代磷酸酯寡核苷酸时，用二硫代四乙基二烃氨基硫羰/乙腈代替标准氧化瓶，在磷酸酯链的硫化步骤使用标准的ABI硫代磷酸酯程序。从控孔的玻璃柱裂解下来之后，使寡核苷酸与浓氢氧化铵于55℃反应8小时，除去保护基。得到的寡核苷酸(DMT-on)用HPLC纯化，用seriprep C₃反相柱(ABI)，用0.1M乙酸三乙铵的5％乙腈(缓冲液A)和乙腈(缓冲液B)线型梯度洗脱。用80％乙酸脱DMT保护基，产品用乙醇沉淀。产物纯度用HPLC检查，用分析型C18柱(Beckman)。在DNA序列的3’端、5’端和中间序列插入该氨基酸核酸单聚体的偶联效率为100％。制备含16个氨基酸修饰的胸腺嘧啶的同型高聚体亦无任何问题。

实施例32

杂交分析：本发明的氨基酸修饰的寡核苷酸往它们的互补性RNA和DNA序列杂交的能力通过热熔分析测定。互补RNA用Genset corporation(La Jolla，CA)合成，用变性尿素PAGE纯化。将计量浓度的天然反义寡核苷酸或特定位置含功能基的寡核苷酸或加到RNA或加到DNA互补序列上形成杂交双链。增色性吸收(260nm)取决于当双链向随机盘绕跃迁时的温度，用Varian Cary IE UV-可见分光光度计监测。在10nm磷酸钠，pH 7.4，0.1mM EDTA，和NaCl的缓冲溶液中测定，缓冲溶液的离子强度或为0.1M或为1.0M。用1/Tm对ln[Ct]作图表示分析数据，其中[Ct]为总寡核苷酸浓度。从该分析确定热动力学参数。根据从双链或形成的杂双链的稳定性得到的信息，估价修饰的嘧啶放入寡核苷酸中对螺旋稳定性的影响。剧烈地改变杂交稳定性的修饰显示为自由能(4G)的降低或增高以及决定它们在反义寡核苷酸中的用途。

用3’端和5’端含氨基酸核酸骨架的寡核苷酸进行杂交研究。初步的研究表明，修饰的寡核苷酸与它们的互补性RNA及DNA序列形成双链与未修饰的寡核苷酸相似。

实施例33

抗核苷酶的作用：天然的，磷酸硫代酯和本发明的修饰寡核苷酸在含各种浓度的胎牛血清或成年人血清的介质中孵育评价它们的抗血清核酸酶作用。标记的寡核苷酸孵育不同的时间，用蛋白酶K处理，然后在20％聚丙烯酰胺-尿素变性凝胶上进行凝胶电泳分析，然后进行自动放射照相或磷成相。激光光密度法对放射照相进行定量。根据修饰的位置和寡核苷酸的已知长度，有可能确定特定的修饰对核酸酶降解的影响。测定抗胞浆核酸酶作用时使用HL₆₀细胞株。通过微分离心制备线粒体后上清液，标记的寡核苷酸在该上清液中孵育不同的时间。孵育后象上面指出的那样评价血清核酸酶对寡核苷酸的降解。自动放射照相的结果定量以便比较未修饰的寡核苷酸即磷酸硫代酯和修饰的寡核苷酸。

对氨基酸修饰的寡核苷酸的初步研究表明，它们有抗蛇毒磷酸二酯酶降解作用。

编入的参考文献：

所有的专利，专利申请书和引用的出版物这里都编入作为参考文献。

等量物

前面写的说明书被认为足以使专业人员实施本发明。前面叙述的各种修饰确实使进行本发明。

Claims

1.选自下述一组通式表示的化合物：

其中“Base”为核苷碱基，

其中R为选自H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph和-(CH₂)x-F的基；

其中R₅为选自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH₃，ONH₂，乙基，丙基，烷基(1-7C)，甲基，杂烷基(1-7C)，芳基(6-7C)和-(CH₂)xF的基；

其中x为1-7，和

F为选自H，OH，SH，OCH₃，CN，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃和Ph，

其中X为选自(CH₂)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH₃和NR₅的基，其中x为1-7；

其中R₅为选自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH₃，ONH₂，乙基，丙基，烷基(1-7C)，甲基，杂烷基(1-7C)，芳基(6-7C)，和-(CH₂)xF的基；

其中x为1-7，和

F为选自H，OH，SH，OCH₃，CN，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃和Ph的基

其中Z为选自(CH₂)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH₃和NR₅的基，

其中x为1-7，和

R₅为选自H，OH，OMe，CN，NH，NOH，ONCH₃，ONH₂，乙基，丙基，烷基(1-7C)，甲基，杂烷基(1-7C)，芳基(6-7C)和-(CH₂)xF的基；

其中x为1-7；和

F为选自H，OH，SH，OCH₃，CN，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃和Ph的基。

2.选自下述一组通式表示的化合物：

其中“Base”为核苷碱基，

其中R为选自H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph和-(CH₂)x-F；

其中x为1-7，和

F选自NH₂，SH，OH，COOH，OCH₃，SCH₃，SPh，NOH，NOH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃和Ph；

其中R₁选自H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH3，ONH2，ONH(CH₃)，Ph和-(CH₂)x-F；

其中x为1-7，和

F为选自NH₂，SH，OH，COOH，OCH₃，SCH₃，SPh，NOH，NOH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃和Ph；

其中R₂为选自H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph和-(CH₂)x-F的基；其中x为1-7，和

F为选自NH₂，SH，OH，COOH，OCH₃，SCH₃，SPh，NOH，NOH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃和Ph的基；

其中R₃为选自H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph和-(CH₂)x-F的基；其中x为1-7，和

其中R₄为选自H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph和-(CH₂)x-F的基；其中x为1-7，和

其中A为选自(CH₂)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH₃，NR₅和Se的基；

其中x为1-7；

其中B为选自(CH₂)x，CO，CS，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH₃，NR₅和Se的基；

其中x为1-7；

其中x为1-7，和

F为选自H，OH，SH，OCH₃，CN，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃和Ph的基；

其中X为选自(CH₂)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH₃和NR₅的基，

其中x为1-7；

其中x为1-7，和

其中Y为选自(CH₂)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH₃和NR₅的基，

其中x为1-7；

其中x为1-7，和

其中x为1-7；

其中x为1-7，和

3.选自下述通式表示的化合物：

其中“Base”为核苷碱基，

其中x为1-7；和

其中R₁为选自H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph和-(CH₂)x-F的基；

其中x为1-7，和

F为选自H，OH，SH，OCH₃，CN，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂和Ph的基；

其中x为1-7，和

F为选自H，OH，SH，OCH₃，CN，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃，和Ph的基；

其中x为1-7；

其中x为1-7，和

4.由许多单聚体组成的寡聚体，其中至少有一个单聚体为权利要求1的化合物，而且其中所述的化合物通过4’位与核苷酸间链相连之后再通过该核苷酸间链与第二个单聚体的5’位相连。

5.权利要求4的寡聚体，其中核苷酸间链选自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，异羟肟酸酯，羟胺和氨基磷酸酯。

6.由许多单聚体组成的寡聚体，其中至少有一个单聚体为权利要求2的化合物，而且其中所述的化合物通过4’位与核苷酸间链相连之后再通过该核苷酸间链与第二个单聚体的5’位相连。

7.权利要求6的寡聚体，其中核苷酸间链选自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，异羟肟酸酯，羟胺和氨基磷酸酯。

8.由许多单聚体组成的寡聚体，其中至少有一个单聚体为权利要求3的化合物，而且其中所述的化合物通过4’位与核苷酸间链相连之后再通过该核苷酸间链与第二个单聚体的5’位相连。

9.权利要求8的寡聚体，其中核苷酸间链选自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，异羟肟酸酯，羟胺和氨基磷酸酯。

10.由许多单聚体组成的寡聚体，其中至少有一个单聚体为权利要求1的化合物，而且其中所述的化合物通过3’位与核苷酸间链相连之后再通过该核苷酸间链与第二个单聚体的5’位相连。

11.权利要求10的寡聚体，其中核苷酸间链选自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，异羟肟酸酯，羟胺和氨基磷酸酯。

12.由许多单聚体组成的寡聚体，其中至少有一个单聚体为权利要求2的化合物，而且其中所述的化合物通过3’位与核苷酸间链相连之后再通过该核苷酸间链与第二个单聚体的5’位相连。

13.权利要求12的寡聚体，其中核苷酸间链选自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，异羟肟酸酯，羟胺和氨基磷酸酯。

14.由许多单聚体组成的寡聚体，其中至少有一个单聚体为权利要求3的化合物，而且其中所述的化合物通过3’位与核苷酸间链相连之后再通过该核苷酸间链与第二个单聚体的5’位相连。

15.权利要求14的寡聚体，其中核苷酸间链选自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，异羟肟酸酯，羟胺和氨基磷酸酯。

16.由许多单聚体组成的寡聚体，其中至少有一个单聚体为权利要求1的化合物，而且其中所述的化合物通过2’位与核苷酸间链相连之后再通过该核苷酸间链与第二个单聚体的5’位相连。

17.权利要求16的寡聚体，其中核苷酸间链选自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，异羟肟酸酯，羟胺和氨基磷酸酯。

18.由许多单聚体组成的寡聚体，其中至少有一个单聚体为权利要求2的化合物，而且其中所述的化合物通过2’位与核苷酸间链相连之后再通过该核苷酸间链与第二个单聚体的5’位相连。

19.权利要求18的寡聚体，其中核苷酸间链选自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，异羟肟酸酯，羟胺和氨基磷酸酯。

20.由许多单聚体组成的寡聚体，其中至少有一个单聚体为权利要求3的化合物，而且其中所述的化合物通过2’位与核苷酸间链相连之后再通过该核苷酸间链与第二个单聚体的5’位相连。

21.权利要求20的寡聚体，其中核苷酸间链选自磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，硼代膦酸酯，硒代膦酸酯，酰胺，异羟肟酸酯，羟胺和氨基磷酸酯。

22.选自下述通式表示的化合物：

其中n为1-200，

其中“Base”为核苷碱基，

其中x是1-7；其中

其中F为选自NH₂，SH，OH，COOH，OCH₃，SCH₃，SPh，NOH，NOH(CH₃)，SNH₂，S(O)NH₂，S(O)(O)NH₂，CH₃和Ph的基；

其中x为1-7，和

其中R₂为选自H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph和-(CH₂)x-F的基；

其中x为1-7，其中

其中R₃为选自H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph和-(CH₂)x-F的基；

其中x为1-7，其中

其中R₄为选自H，OH，SH，CN，CH₃，OCH₃，SCH₃，ONH₂，ONH(CH₃)，Ph和-(CH₂)x-F的基；

其中x为1-7，其中

其中x为1-7；

其中x为1-7，和

其中Y为选自(CH₂)x，CO，CS，O，S，S(O)，S(O)(O)，NH，NOH，NCH₃和NR₅的基，其中x为1-7；

其中x为1-7，和

其中X为1-7；

其中x为1-7，和

其中V为核苷酸间链

23.权利要求22的化合物，其中V为表1的核苷酸间链。

24.选自下述通式表示的化合物：

其中X为选自(CH₂)n，其中n＝1-3，CO(CH₂)n，其中n＝0-2和(CH₂)nSO₂，其中n＝1-2的基，

Y为选自CH₂，CO，COOH，CS和SO₂的基；

Y’为选自CH₂，CO，COOH，CS和SO₂的基；

Z为选自O，S，NH和CH₂的基；

R为选自CH₂OH，CH₂NH₂，CH₂NHCHO，CONH₂和COOH的基，

B为核苷碱基。

25.由许多单聚体组成的寡聚体，其中至少有一个单聚体为权利要求1的化合物。

26.选自下述通式表示的化合物

其中n为1-2O0，

X为选自(CH₂)n，其中n＝1-3，CO(CH₂)n，其中n＝0-2和(CH₂)nSO₂，其中n＝1-2的基，

Y为选自CH₂，CO，COOH，CS和SO₂的基；

Y’为选自CH₂，CO，COOH，CS和SO₂的基；

Z为选自O，S，NH和CH₂的基；

R为选自CH₂OH，CH₂NH₂，CH₂NHCHO，CONH₂和COOH的基，

B为核苷碱基。

27.选自下述通式表示的化合物

其中“Base”为核苷碱基，

其中R为选自H，CH₃，-(CH₂)p-NR¹R²，Ph，CH₂Ph，-(CH₂)p-Im，NR¹R²的基，其中p为1-10，其中R¹和R²各自独立为H和CH₃，和其中Im为咪唑基。

28.由许多单聚体组成的寡聚体，其中至少有一个单聚体为权利要求27的化合物，而且其中所述的单聚体中至少有一个单聚体是通过核苷酸间链与第二个单聚体相连。

29.权利要求28的寡聚体，其中核苷酸间链选自磷酸二酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，酰胺，异羟肟酸酯，胺，羟胺和氨基磷酸酯。

30.选自下述通式表示的化合物，

其中n为1-200，

其中“Base”为核苷碱基；

其中A，B，C和X各自独立地选自NH，NR，O，S，-C(O)，-(CH₂)p；其中R为选自H，CH₃，-(CH₂)p-NR¹R²，Ph，CH₂Ph，-(CH₂)p-Im，NR¹R²，OH，OCH₃，-O(CH₂)p-NR⁵R⁶，OPh，OCH₂Ph，-O(CH₂)p-Im，NR⁵R⁶，-C(O)-OH，-C(O)-CH₃，-C(O)-(CH₂)p-CH₃，-C(O)-(CH₂)p-Ph，-C(O)-(CH₂)p-NR⁵R⁶，-C(O)-Ph，-C(O)CH₂Ph，-C(O)-(CH₂)p-Im，-C(O)-NR⁵R⁶的基；p为1-10，R¹和R²各自独立为H和CH₃；和Im为咪唑基。

31.选自下述通式表示的化合物，

其中n为1-200，

其中“Base”为核苷碱基；

其中A，B，C各自独立地选自磷酸二酯链和硫代磷酸酯链，和

其中X为选自NH，NR，O，S，-C(O)，-(CH₂)p的基；其中R为选自H，CH₃，-(CH₂)p-NR¹R²，Ph，CH₂Ph，-(CH₂)p-Im，NR¹R²，OH，OCH₃，-O(CH₂)p-NR⁵R⁶，OPh，OCH₂Ph，-O(CH₂)p-Im，NR⁵R⁶，-C(O)-OH，-C(O)-CH₃，-C(O)-(CH₂)p-CH₃，-C(O)-(CH₂)p-Ph，-C(O)-(CH₂)p-NR⁵R⁶，-C(O)-Ph，-C(O)CH₂Ph，-C(O)-(CH₂)p-Im，-C(O)-NR⁵R⁶的基；p为1-10，R¹和R²各自独立为H和CH₃；和Im为咪唑基。