HU218086B - Aminosavat tartalmazó nukleotid monomer analógok - Google Patents

Abstract

A találmány különböző új oligonukleotid-analógokra vonatkozik, amelyekegy vagy több, a szokásos oligo- nukleotidokat felülmúlótulajdonsággal rendelkeznek az oligonukleotidokat alkalmazóeljárásokban. A találmány szerinti vegyületek olyan oligonukleotid-analógok, amelyekben a természetes nukleinsavak furanózgyűrűjétaminosavval vagy módosított amino-alkohollal helyettesítették. Atalálmány szerinti vegyületek különösen alkalmasak a génexpresszióantiszensz szabályozására. A találmány szerinti vegyületekalkalmazhatók továbbá hibridizációs próbákként vagy primerekként. Atalálmány kiterjed továbbá az oligonukleotid-analógok monomerprekurzoraira is, amelyek az oligonukleotidok szintézisébenalkalmazhatók, valamint az oligonukleotidokat tartalmazógyógyszerkészítményekre. ŕ

Description

A találmány olyan polinukleozidanalógokra vonatkozik, amelyek nem tartalmaznak füranózgyűrűt.

Az olyan oligonukleotidokat, amelyek hidrogénkötéssel komplementer nukleinsavakhoz (azaz az értelmes vagy szensz szálhoz) kötődő szekvenciával rendelkeznek és így gátolják a génexpressziót, általánosságban antiszensz oligonukleotidoknak nevezik. Ezek a szintetikus oligonukleotidok a megcélzott molekulához (mRNS) kötődnek és ezzel gátolják az mRNS transzlálódását. Ez az antiszenszelv [Uhlmann E. et al., Chem. Reviews, 90., 543-584. (1990); Stein C. A. et al., Cancer Rés., 48., 2659-2688. (1988)] érvényesül a természetben a génexpresszió szabályozásában. Ezt az antiszensz elvet alkalmazzák a laboratóriumban a génexpressziónak nemcsak a gátlására, hanem aktiválására is. Zamecnik és Stephenson javasolta először - 1978ban - a szintetikus oligonukleotidok terápiás célra való alkalmazását [Zamecnik P. C. és Stephenson M. L., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75., 280-285. (1978)]. Az antiszensz polinukleotid fajlagos gátlása az antiszensz oligonukleotid heterociklusos bázisai és a vírus nukleinsavai közötti fajlagos Watson-Crick-féle bázispárosodáson alapszik. Az oligonukleotidoknak a komplementer nukleinsavakhoz történő kötődését hibridizációnak nevezzük. Különösen érdekesek az olyan oligomerek, amelyeknek szekvenciája komplementer egy, a betegség fejlődéséhez szükséges proteint kódoló mRNS szekvenciájával. Az mRNS-hez való hibridizálódással az illető mRNS által kódolt proteinek szintézisét megzavarhatjuk.

Az utóbbi tíz évben a nem módosított oligonukleotidok, azaz DNS-szerkezettel rendelkező oligonukleotidok előállítása központi érdeklődés tárgya volt számos kutatócsoport számára. Az eredetileg Letsinger által bevezetett [Letsinger R. L. és Lundsford W. B., J. Amer. Chem. Soc., 98., 3655. (1976)], Caruthers szerinti, foszforamiditeken keresztül történő szintézis [McBride L. J. és Caruthers Μ. H., Tetrahedron Letts.,

24., 245. (1983)] mint a foszfit-triészter-módszer, jelenleg a leghatékonyabb módszer foszfodiészter oligonukleotidok előállítására. Ha antiszensz oligonukleotidokként normál, azaz nem módosított oligonukleotidokat használnak, akkor a nukleázokkal szembeni instabilitás és a membránba való nem kellő behatolás problémája merül fel. Az antiszensz oligonukleotidoknak ahhoz, hogy gátolni tudják a transzlációt, anélkül kell elérniük a sejt belsejét, hogy megváltoznának. Az antiszensz gátlás céljára alkalmazható oligonukleotidok fontos tulajdonságai többek között: i) stabilitás az extracelluláris és intracelluláris enzimekkel szemben; ii) a sejtmembránon való átjutás képessége; és iii) a megcélzott DNShez vagy RNS-hez való hibridizálás képessége [Agarwal K. L. et al., Nucleic Acids Rés., 6., 3009. (1979); Agawal S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

85., 7079. (1988)]. Szükség van tehát olyan polinukleotidanalógokra, amelyek kiváló tulajdonságokat mutatnak antiszensz oligonukleotidokként vagy primerként, vagy hibridizációs próbaként való felhasználásra.

Módosított polinukleotidokat régebben is szintetizáltak, e módosítások többek között a nukleinsavak metil-foszfonátjainak, foszforotioátjainak, különféle amidátjainak előállítását és a cukorrész módosítását jelentette. Ezek a láncrészben végzett helyettesítések bizonyos mértékig fokozott stabilitást biztosítottak, viszont hátrányuk volt, hogy a kötésbe egy királis foszforatomot vittek be, így 2ⁿ diasztereomer képződéséhez vezettek, ahol n az oligomerben lévő módosított diészterkötések száma. E többszörös diasztereomerek jelenléte jelentősen gyengíti a módosított oligonukleotid azon képességét, hogy a megcélzott szekvenciához hibridizálódjék. E helyettesítések közül néhány szintén fenntartja azt a képességét, hogy negatív töltést biztosítson, és a töltéssel rendelkező csoportok jelenléte csökkenti a vegyületek azon képességét, hogy átjussanak a sejtmembránon. E módosított kötésekkel számos további hátrány jár, az illető kötés természetétől függően.

Szintetizáltak már néhány olyan oligonukleotid-analógot, amelyek a cukorrészben vannak módosítva. A (dezoxi)ribóz nukleinsavak cukorrészében korábban alkalmazott módosítások például az α-DNS, homoDNS, morfolino- és tio-nukleozidok és peptid-nukleinsavak (PNA), amelyek javított szerkezetet biztosítottak, különösen olyan szerkezetet, ami javította a sejtek által történő felvételt. Az ilyen analógok előállítása általános szintézisútjának érintenie kell a nukleozid vagy nukleotid primer hidroxilcsoportját, ahol a nukleotid lehet egy polimerhez kötve, vagy olyan foszforatomot tartalmazó, szekvenciaspecifikus 3’-nukleotidhoz kötve, amelyben a foszforatom akár ötértékű, akár háromértékű oxidációs állapotban lehet. Az egyes kapcsolási eljárásokat foszfit-triészter- (foszforamidit), foszfor-diészterés hidrogén-foszfonát-eljárasként említik. Ezen eljárásokhoz kereskedelemben kapható monomereket és polimer hordozóhoz kötött monomereket alkalmaznak, amelyek védett bázisokat (G, A, C, T, U és más heterociklusos vegyületek) tartalmaznak, védett foszforatomok mellett, ami lehetővé teszi a tárolást és megakadályozza a nem specifikus reakciókat a kapcsolási eljárás során.

A génmódosításra alkalmasak a cukorrészben módosítást, nemionos láncot vagy aciklusos poliamidokat (PNA) tartalmazó nukleinsavak, amelyek - legalább bizonyos fokig - rendelkeznek a következő tulajdonságokkal : a duplex stabilitásának fokozása (hibridizációs hatékonyság), csökkent célmolekula-fajlagosság, stabilitás nukleázokkal szemben, sejtek általi jobb felvétel és a nukleinsavak fontos lezárófolyamataiban (például RN-áz H aktivitás, katalitikus hasítás, hibridizáció gátlása stb.) való részvétel. Javasolták a karbonát-diészterek alkalmazását is. Ezek a vegyületek azonban nagymértékben instabilak, és a karbonát-diészter-kötés nem tartja meg a tetrahedrális konfigurációt, amellyel a foszforatom a foszfodiészter-kötésben rendelkezik. Hasonlóképpen a karbamátkötés, bár akirális, hozzájárul a trigonális szimmetriához, és kimutatták, hogy az ilyen kötéssel rendelkező poli-dT nem hibridizálódik erősen a poli-dA-hoz [Coull J. M. et al., Tetrahedron Letts., 28., 745 (1987); Stirchak, E. P. et al., J. Org. Chem., 52., 4202. (1987)].

A közelmúltban aciklusos cukoranalógokra vonatkozó ismertetések jelentek meg az irodalomban [Augustyns

HU 218 086 Β

K. A. et al., Nucleic Acids Rés., 19., 2587-2593. (1991)]. Ilyen aciklusos nukleozidoknak oligonukleotidba történő beépítésével a Tm-érték csökkent, az oligomerbe beépített kötések számától függően. Ezek az oligonukleotidok enzimatikusan stabilak és a komplementer szekvenciával bázispárképzésben vesznek részt. Tekintetbe véve a polinukleotidok és az ismert polinukleotidanalógok terén mutatkozó hiányt, fontos, hogy olyan új polinukleotidanalógokat hozzunk létre, amelyek antiszensz gátlásra és más, oligomereket alkalmazó módszerek céljára alkalmazhatók.

Az ilyen kísérletek, amelyek a cukorrész és a láncrész komponenseinek módosítására irányulnak, bizonyos hátrányokkal járnak a terápiás és más módszerekben való felhasználás terén. Ezért e tekintetben még jelentősebb javításokra van szükség, hogy hatékony terápiás szerek, diagnosztikumok és kutatási eszközök váljanak hozzáférhetővé. Ennek megfelelően hosszú ideje fennálló szükséglet van a gyógyszerhatóanyagként oligonukleotidok oligomer analógjainak javítására.

A találmány olyan új oligonukleotidokra és szerkezeti prekurzoraikra vonatkozik, amelyek fokozottan ellenállnak a nukleázok által történő lebontásnak, és amelyek fokozott stabilitást mutatnak fiziológiás körülmények között, továbbá amelyek lehetnek semlegesek vagy rendelkezhetnek pozitív töltéssel, ami elősegíti a sejtekbe történő bejutást. A találmány szerinti új oligonukleotidok ezenkívül nukleinsavak mint hibridizációs célpontok vonatkozásában javított hibridizációs tulajdonságokkal rendelkeznek.

A találmány szerinti oligomerekre általában jellemző, hogy egy sorozat nem természetes kapcsolóelemet vagy monomert tartalmaznak, amely megfelelő arra, hogy heterociklusos bázisokat egy megcélzott nukleinsavhoz kössön szekvenciaspecifikus módon. A nem természetes kapcsolóelemek, ha az oligomerbe beépítjük, nagyobb erőt fejthetnek ki, mint a szimpla hidrogénkötés, és így elősegítheti a kompetens konformáció kötésének ki alakulását.

A találmány szerinti nukleomonomerekre általában jellemző, hogy olyan csoportok vagy maradékok, amelyekben a természetben a nukleotidokban jelen lévő furanózgyűrűt aminosav- vagy módosított amino-alkohol-maradékra cseréljük ki. Találmány szerinti monomereket és oligomereket mutatunk be példaképpen az 1 -41 képlettel. Az ilyen monomerek beépítése az oligonukleotidokba olyan vegyületek szintézisét teszi lehetővé, amelyek javított tulajdonságokkal rendelkeznek, többek között: i) fokozott lipofilitás, ami megszünteti a foszfodiészter-kötéssel kapcsolatos töltést [Dalge J. M. et al., Nucleic Acids Rés., 19., 1805. (1991)]; és ii) enzimek, például nukleázok által okozott lebontással szembeni ellenállás. Az ilyen monomereket tartalmazó oligomerek különösen stabilak megcélzott szekvenciákhoz való hibridizációnál és egyes alkalmazások esetén sokkal kiválóabbak a nem módosított nukleozidmaradékokhoz képest.

A találmány különböző új oligonukleotid-analógokra vonatkozik, amelyek egy vagy több olyan tulajdonsággal rendelkeznek, amely felülmúlja az ismert oligonukleotidok megfelelő tulajdonságát az oligonukleotidokat alkalmazó eljárásokban való alkalmazás esetén. A találmány szerinti vegyületek olyan oligonukleotid-analógok, amelyekben a természetben előforduló nukleinsav furanózgyűrűjét egy aminosav- vagy módosított amino-alkohol-maradékkal cseréljük ki. A találmány szerinti új vegyületek némelyike különösen előnyösen alkalmazható a génexpresszió antiszensz szabályozására. A találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók továbbá nukleinsav-hibridizációs próbák és primerek gyanánt.

A találmány továbbá az említett oligonukleotid-analógok monomer prekurzoraira is vonatkozik. Ezek a monomer prekurzorok a találmány szerinti polinukleotidanalógok szintézisében alkalmazhatók.

A találmány továbbá olyan készítményekre vonatkozik, amelyek a találmány szerinti polinukleotidanalógokat tartalmazzák, és alkalmasak betegségek kezelésére vagy megelőzésére. E készítmények különösen a vírusfertőzések és sejtnövekedési rendellenességek kezelésére vagy megelőzésére alkalmazhatók.

A mellékelt 1-25. ábra a találmány szerinti monomerek és oligonukleotidok szintézisének reakcióvázlatait szemlélteti. Közelebbről:

Az 1. ábra az L-szerinollal kapcsolt timinmonomer foszforamidit-módszer szerint történő szintézisét mutatja, ahol -CH₂-CO- kötés található a timin és a szerinol között.

A 2. ábra az L-szerinollal kapcsolt timinmonomer foszforamidit-módszer szerint történő szintézisét mutatja. ahol -CH₂CH₂- kötés található a timin és a szerinol között.

A 3. és 4. ábra a helyettesített L-szerinollal kapcsolt timinmonomer foszforamidit-módszer szerint történő szintézisét mutatja, ahol -CH₂CO- kötés található a timin és a szerinol között.

Az 5. ábra a T-T dimer szintézisét mutatja, ahol egy 5 atomos intemukleotidkötés található, amelyben az intemukleotidkötés közepén egy hidroxil-amin-csoport található, és -CH₂CO- kötés található a timin és a szerinol között.

A 6. ábra a timinmonomer foszforamidit-módszer szerint történő szintézisét mutatja, ahol a timin egy -CH₂CO- kötésen keresztül egy N-etil-hidroxilaminhoz kapcsolódik.

A 7. ábra az L-szerinollal kapcsolt timinmonomer foszforamidit-módszer szerint történő szintézisét mutatja, amelyben az L-szerint NH₂-csoportja egy 2-hidroxiacetil-csoporthoz kapcsolódik, és a hidroxilcsoport DMT-csoporttal van védve. Ezt az építőelemet 2’-5’ kapcsolóként alkalmazzuk. Ez az ábra az olyan timinmonomer szintézisét is mutatja, amelyben az L-szerin NH₂-csoportja egy 2’-hidroxil-etil-csoporthoz kapcsolódik.

A 8. ábra a T-T dimer szintézisét mutatja, amely egy 2’-5’ kötést tartalmazó hidroxamátláncot tartalmaz. Ebben a dimerben az egyik építőelem L-aszpartinsavból és timinből, míg a másik L-szerinből és timinből készült. Ez a dimer két további amidkötést tartalmaz a láncban.

HU 218 086 Β

A 9. ábra az olyan T-T dimer szintézisét mutatja, amely 2’-5’ kötést tartalmazó hidroxamátláncot tartalmaz. Ebben a dimerben az egyik építőelemet L-aszpartinsavból és timinből, míg a másikat L-szerinből és timinből készítettük. Ebben a dimerben nincsen amidkötés a láncban.

A 10. ábra L-szerinből β-alaninnal kapcsolt timinmonomer foszforamidit-módszer szerint történő szintézisét mutatja, amelyben a β-alanin összeköti a timint és a szerinolt.

All. ábra az L-szerinol-alkil-aminnal kapcsolt timinmonomer foszforamidit-módszer szerint történő szintézisét mutatja, ahol az alkil-amin összeköti a timint és a szerinolt.

A 12. ábra az olyan T-T dimer szintézisét mutatja, amelyben 4’-5’ kötést tartalmazó hidroxamátlánc található. Ebben a dimer két L-aszpartinsav-egységből és két timinegységből készült, amelyeket acetilkötés köt össze.

A 13. ábra az olyan T-T dimer szintézisét mutatja, amelyben 4’-5’ kötést tartalmazó hidroxamátlánc található. Ebben a dimer két L-aszpartinsav-egységből és két timinegységből készült, ahol a timint és az aszpartinsavat etilkötés köti össze.

A 14. ábra az N-hidroxi-aminosavval kapcsolt timin építőegység szintézisét mutatja.

A 15. ábra az L-aszpartinsavval kapcsolt timin építőegység szintézisét mutatja, ahol a timin és az aszpartinsav között N-hidroxil-amin-kötés található.

A 16. ábra az olyan dimer szintézisét mutatja, ahol 4’-5’ kötést tartalmazó hidroxamátlánc található. Ebben a karboxilcsoport egy N-hidroxil-amin-kapcsolón keresztül a timin építőegységhez kapcsolódik.

A 17. ábra a 150 képletű timidin-ecetsavval helyettesített N-hidroxi-aminosav-építőegység és annak 149 képletű analógja szintézisét mutatja. Ezek a monomer építőegységek hidroxamátlánccal rendelkező nukleinsavak készítésére alkalmazhatók.

A 18. ábra a 157 és 158 képletű timidin-ecetsavval helyettesített hidroxil-amint tartalmazó aminosav építőegységek szintézisét mutatja. Ezek a monomerek hidroxil-amin-csoportokat tartalmazó amidlánccal rendelkező nukleinsavak készítésére alkalmazhatók.

A 19. ábra a 166 képletű L-szerinollal kapcsolt timidin építőegység szintézisét mutatja, ahol a timin és a szerinol között hidroxil-amin-csoport található. Ez az építőegység a 4’-5’ kötéssel rendelkező nukleinsavak előállítására alkalmazható.

A 20. ábra a 174 képletű glutaminsav-glicinnel kapcsolt timidin monomer szintézisét mutatja. Ez a monomer építőegység amidlánccal és 2’-5’ kötéssel rendelkező nukleinsavak előállítására alkalmazható.

A 21. ábra a 181 és 182 képletű glicinol-glicinnel kapcsolt timidin építőegység szintézisét mutatja, ahol a timin és a glicinol között hidroxil-amin-csoport található. Ezek az építőegységek a 2’-5’ kötést tartalmazó nukleinsavak előállítására alkalmazhatók.

A 22-24. ábra a 191, 199 és 207 képletű ribózaminosavval kapcsolt timidin építőegységek szintézisét mutatja. Ezek az építőegységek a ribóz-amid láncot tartalmazó oligonukleotidok előállítására alkalmazhatók.

A 25. ábra a 211 képletű oligonukleotid szilárd fázisú szintézisét mutatja, amely ribóz-amid láncot tartalmaz.

A 26. ábra az 1-0-(4,4’-dimetoxi-tritil)-2-[amino(timinil-acetil)]-L-propán-3-O-(N,N-diizopropil)^ciano-etil-foszforamidit szintézisét mutatja.

A 27. ábra az l-O-(4,4’-dimetoxi-tritil)-2-[amino(timinil-acetil)]-D-propán-3-O-(N,N-diizopropil)^ciano-etil-foszforamidit szintézisét mutatja.

A 28. ábra a 2-[$-(4,4’-dimetoxi-tritil)-O-acetilamino]-3-timinil-L-propán-l-O-(N,N-diizopropil)^3ciano-etil-foszforamidit szintézisét mutatja.

A 29. ábra az N-(timinil-acetil)-N-{[(2-izobutiril)oxi]-etil}-O-benzil-hidroxil-amin szintézisét mutatja.

A 30. ábra a (2R,4S)-l-(terc-butil-oxi-karbonil)-2[N₃-benzoil-(timin-1 -il)-metil-4-ftálimido-pirrolidin szintézisét mutatja.

Leírásunkban a következő definíciókat és rövidítéseket alkalmazzuk.

Az „antiszensz terápia” alatt olyan DNS- vagy RNS-oligomereknek vagy ezek analógjának adagolását vagy in situ képzését értjük, amelyek specifikusan kötődnek egy komplementer megcélzott nukleinsavszekvenciához. A kötődés történhet szokásos bázispárosodással vagy más mechanizmuson keresztül, például DNS-duplexhez való kötődés esetén a kettős hélix nagy hurkában végbemenő specifikus kölcsönhatásokon keresztül. Az „antiszensz” kifejezés általában olyan módszerekre vonatkozik, amelyeket a technika állása szerint ismert módon alkalmazunk, és olyan terápia értendő alatta, amely oligonukleotid-szekvenciákhoz való fajlagos kötődésen alapszik. Az antiszensz génszabályozás módszere a molekuláris biológia terén jártas szakember számára jól ismert, az antiszensz génszabályozás ismertetése található például US-5 107 065, US-5 166 195, US-5 087 617 és Crooke, Annual Review Pharmacology Toxicology, 32., 329-376. (1992) irodalmi helyen.

Az „oligomer” és „oligonukleotid” kifejezések felcserélhető módon alkalmazhatók, és a természetben előforduló vegyületeket, mint például RNS-t és DNS-t, valamint ezek szintetikus analógjait - beleértve a találmány szerinti vegyületeket - jelentik. Hacsak másképpen nem jelöljük, az oligomer és oligonukleotid kifejezés mind a DNS-re, illetve RNS-re, továbbá szintetikus analógjaira vonatkozik. Az oligomer kifejezés olyan vegyületre vonatkozik, amely két vagy több, egymáshoz kovalens kötéssel egy foszfodiészter-kötésen vagy bármely más alkalmas kötésen keresztül kapcsolt nukleomereket tartalmaz. Hacsak másképpen nem jelezzük, az oligomer kifejezés nem foglal magában hosszúságbeli korlátot. így az oligomer tartalmazhat csupán két, kovalens módon összekapcsolt nukleomert (dimer) vagy lehet jelentősen hosszabb. Az oligomerek megfelelően kötődhetnek, és így egyszálú vagy kettős szálú nukleinsavszekvenciákkal bázispárosodásra képesek. Az oligomerek (például dimerek-hexamerek) alkalmazhatók hosszabb oligomerekhez szintűnként is, amint a későbbiekben ismertetjük. Az oligomerek tartalmazhatnak bázismentes helyeket és pszeudonukleozidokat.

HU 218 086 Β

Az oligomerek közé tartoznak az oligonukleotidok, oligonukleozidok, polidezoxiribonukleotidok (amelyek 2’-dezoxi-D-ribózt vagy ennek módosított formáját tartalmazzák), azaz a DNS, poliribonukleotidok (amelyek D-ribózt vagy annak módosított formáit tartalmazzák), azaz RNS, továbbá bármely más olyan polinukleotidok, amelyek purin- vagy pirimidinbázis vagy módosított purin- vagy pirimidinbázis N-glikozidjai vagy C-glikozidjai. Az oligomer kifejezésen továbbá olyan vegyületeket értünk, amelyekben a szomszédos nukleomonomerek hidroxamátkötésen keresztül kapcsolódnak. Az oligomerekben rendszerint található elemek, mint például a furanózgyűrű és/vagy a foszfodiészterkötés bármely más alkalmas funkcionális ekvivalens elemmel helyettesíthető. Az oligomer kifejezésen bármely olyan szerkezetet értünk, amely bázisok számára vázként vagy hordozóként szolgál, ahol a váz lehetővé teszi a kötődést a megcélzott nukleinsavakhoz, szekvenciától függő módon. A jelenleg ismert oligomerek négy csoportba oszthatók, amelyekre jellemző, hogy i) foszfodiészter-kötést vagy foszfodiészter-analóg (foszforotioát, metil-foszfonát stb.) kötést tartalmaznak; ii) helyettesítő kötést tartalmaznak, amely nem nemfoszfor izosztert tartalmaz (riboacetál, formacetál, karbamát stb.); iii) morfolinocsoportokat, karbociklusos maradékokat vagy más furanózcukrokat, mint például arabinózt vagy a ribóz vagy a dezoxiribóz helyén egy hexózt tartalmaznak, továbbá iv) amidkötéseken keresztül kapcsolódó nukleomonomereket vagy bármilyen alkalmas kötésen keresztül kapcsolódó aciklusos nukleomonomereket tartalmaznak.

A „nukleomonomer” kifejezésen olyan csoportot értünk, amely 1. egy bázist tartalmaz 2. egy második csoporthoz kovalensen kapcsolva. A nukleomonomerek közé tartoznak a nukleozidok, nukleotidok, továbbá egy amino-alkoholhoz kapcsolt bázisok. A nukleomonomerek oligomerekké kapcsolhatók össze, amelyek szekvenciaspecifikus módon kötődnek nukleinsavak megcélzott vagy komplementer bázisszekvenciáihoz.

A „második csoport” kifejezésen olyan vegyületet értünk, amely egy nukleomonomerhez kapcsolódik és magában foglal egy aminosav/amino-alkohol csoportot, rendszerint szerinolt, aszpartinsavat, glutaminsavat, glicint vagy olyan csoportot, amely az aminosavrészben módosítást tartalmaz, például ahol egy vagy több hidrogén más csoporttal van helyettesítve (lásd a 24-41 képleteket), vagy egy karbonsav alkohollá, aminná, tiollá, hidroxil-aminná stb. van alakítva. A nukleomonomer kifejezés alatt értjük továbbá az olyan bázisokat, amelyek egy aminosavhoz vagy amino-alkoholhoz és/vagy aminosav/amino-alkohol analóghoz vannak kapcsolva, amelyek szabad karboxil/hidroxil csoportot és/vagy szabad aminocsoportot, és/vagy ezek védett formáját tartalmazzák.

A „nukleozid” kifejezés alatt olyan aminosavat vagy annak amino-alkohol-származékát értjük, amely egy purint vagy pirimidint, vagy ezek analógját hordozza, amint a későbbiekben ismertetjük, de nem tartalmaz összekötő csoportot, mint például foszfodiészter-analógot vagy módosított intemukleozidkötést. Az 5’-nukleozidon azt a nukleozidot értjük, amely az 5’-szénatomon való kötődést biztosítja egy kapcsolóelemhez. A kapcsolóelem 5’-vége kapcsolódik az 5’-nukleozidhoz. A kapcsolóelem 3 ’-vége kapcsolódik a következő nukleozid 3'-helyzetéhez. Ha olyan módosított nukleozid van jelen, amely nem tartalmaz 3’- és/vagy 5'-szénatomot, akkor egy szakember számára nyilvánvaló, hogy ez az a 3’- és 5'-terminológia a DNS és RNS analógiájára a szál polaritását írja le.

A „nukleozid” kifejezés olyan bázisra vonatkozik, amely kovalensen kapcsolódik egy amino-alkohol/aminosav analóghoz, és amely egy összekötő csoportot tartalmaz a bázis és az aminosav/amino-alkohol között. A nukleozid kifejezés rendesen a ribonukleozidokat, dezoxiribonukleozidokat vagy bármely más nukleozidot foglal magában, amelyek egy bázis N-glikozidjai vagy C-glikozidjai.

A „nukleotid” kifejezésen olyan nukleozidot értünk, amely egy foszfátcsoportot vagy egy foszfátanalógot tartalmaz (olyan csoportokat, amelyek a foszforatomot ugyanolyan oxidációs állapotban tartalmazzák, mint a foszfátcsoport, például a tiofoszfátok, amidátok).

A „bázis” kifejezésen a nukleozidbázisok széles változatát értjük, így például purin- és pirimidinszármazékokat és ezek heterociklusos analógjait és tautomer formáit. A purinszármazékok közé tartozik az adenin, guanin és xantin, a purinanalógok közé tartozik például a 8-oxo-N₆-metil-adenin és a 7-dezazaxantin. A pirimidinszármazékok közé tartozik például az uracil és a citozin és ezek analógjai, mint például az 5-metil-citozin, 5-(l-propinil-uracin), 5-(l-propinil-citozin), 5-metil-uracil és a 4,4-etanocitozin. A bázisok, ha egy alkalmas molekuláris kerethez, például foszfodiészter-lánchoz kapcsolódnak, alkalmasak arra, hogy bázispárosodásra lépjenek, amint ez a kettős szálú DNS-ben vagy más kettős szálú, hasonló szerkezetű nukleinsavakban előfordul. A bázisok alkalmasak továbbá arra, hogy bázispárosodási kapcsolatba kerüljenek nukleinsavak hármas hélixében.

A „cukormódosulat” kifejezésen bármilyen olyan aminosav- vagy amino-alkohol-csoportot értünk, amely a 2’-dezoxi-ribóztól eltérő.

Az „aminosav/amino-alkohol” kifejezésen bármely természetes aminosav és amino-alkohol értendő, mind R-, mind S-izomerek.

A „nukleozidkötés” kifejezésen olyan kötést értünk, amely a monomeren belül létezik.

A „kötés” kifejezésen olyan csoportot értünk, amely bázisok és aminosavak/amino-alkoholok, illetve ezek származékának összekötésére alkalmazható.

Az „intemukleotid” kötés kifejezésen egy foszfodiészter-csoportot [-O-P(O)(O)-O-] vagy annak bármely más funkcionális ekvivalensét értjük, amely kovalensen kapcsolja a szomszédos nukleomonomereket.

A „helyettesítő kötés” kifejezésen egy természetes csoport bármilyen analógját vagy bármilyen alkalmas olyan csoportot értünk, amely kovalensen kapcsol össze szomszédos nukleomonomereket. Helyettesítő kötések közé tartoznak például a foszfodiészter-analógok, például a foszforotioát és metil-foszfonát, és a nem foszfor5

HU 218 086 Β atomot tartalmazó kötések, mint például az amidok, hidroxamátok, hidroxil-aminok. Idetartoznak a találmány szerinti, nem foszforos kötések is (2’-5’-kötések, 3’-5’ kötések, 4’-5’ kötések).

A „térhálósító csoport” kifejezésen egy oligomerben lévő olyan csoportot értünk, amely kovalens kötést képez egy megcélzott nukleinsavval. A térhálósító csoportok közé tartoznak az olyan, kovalens kötést képező csoportok, amelyek egy oligomert egy megcélzott nukleinsavhoz vagy spontán módon (például N⁴,N⁴-etanocitozin) vagy fotoaktiváláson keresztül (például pszoralen) stb. kapcsolnak.

A „blokkolócsoport” kifejezésen egy hidrogéntől eltérő szubsztituenst értünk, amely oligomerekhez vagy nukleomerekhez kovalensen kapcsolódik, vagy védőcsoportként, a szintézisben összekötő csoportként, OPO₃_₂, vagy pedig más szokásos konjugátként, például szilárd hordozóként, jelzőanyagként, antitestként, monoklonális antitestként vagy ezek fragmenseként stb. A blokkolócsoport kifejezés alatt nemcsak védőcsoportot értünk, hanem például összekötő csoportokat, mint például H-foszfonát vagy foszforamidit-csoportokat.

A „védőcsoport” kifejezésen bármilyen olyan csoportot értünk, amely alkalmas azon oxigén-, kén- vagy nitrogénatomnak egy reakcióban vagy kapcsolásban való részvételtől történő megvédésére, amelyhez kapcsolódik. Egy nukleomonomer báziscsoportjának nitrogénatomja esetén az ilyen védőcsoportok és ezeknek a molekulába való bevezetése szakember számára jól ismert. Alkalmas védőcsoportok például, de nem kizárólag, a diizobutil-formamidin-, benzoil-, szililcsoport stb. Oxigén- és kénatom esetén alkalmas védőcsoportok például a DMT, MMT, FMOC és az észtercsoportok. Védőcsoportokon bármilyen olyan csoportot értünk, amely alkalmas azon oxigén-, kén- vagy nitrogénatom megvédésére egy reakcióban vagy kötésben való részvételtől, amelyhez kapcsolódik. A nukleomonomerekben lévő oxigén-, kén- és nitrogénatomok ilyen védőcsoportjai és a molekulába való bevezetésük szakember számára jól ismert. A védőcsoportok közé tartoznak az olyan csoportok is, amelyek a karboxilcsoport és tiolcsoport reakcióban és kötésben való részvételét gátolják.

Az „összekötő csoport” kifejezés alatt bármely olyan csoportot értünk, amely alkalmas kötések vagy helyettesítő kötések létrehozására nukleomonomerek között, ilyenek például a hidrogén-foszfonát- és a foszforamidit-csoport.

A „konjugát” vagy „konjugátcsöpört” kifejezés alatt bármely olyan csoportot értünk, amely az oligomerhez kapcsolódik valamely végén vagy az oligomeren belül. Konjugátumok közé tartoznak a szilárd hordozók, mint például a szilikagél, a szabályozott pórusméretű üvegek és polisztirolok; a jelzőcsoportok, például a fluoreszcens, kemilumineszcens, radioaktív atomok vagy molekulák, enzimmaradékok és riportercsoportok; az oligomer transzportálóágensek, mint például a polikationok, szérumproteinek és glikoproteinek, és polimerek stb. További konjugátmaradékok például az O-koleszterin, polietilénglikol (PEG), az aminosavak, interkalátorok, polinukleotid hasítócsoportok, keresztkötések létrehozására alkalmas csoportok, lipidek, hidroxamátok, alkilezőszerek stb.

A „szinton” kifejezés alatt egy, a találmány szerinti oligonukleotid-analógon belüli szerkezeti egységet értünk.

A „transzfekció” alatt bármely olyan módszert értünk, amely alkalmas az oligomerek sejtekbe való gyorsított bejuttatására.

Az „egyed” kifejezés alatt növényt vagy állatot, beleértve az emlősöket is, különösen az embereket, értjük.

Az „oligomerek származékai” és monomer alkotórészei alatt a technika állása szerint ismert elemeket értjük. Az oligonukleotidok például kovalensen kapcsolhatók számos csoporthoz, például interkalátorhoz, a DNS kettős hélix kisebbik hurkával kölcsönhatásba lépő anyagokhoz és más, önkényesen választott konjugátumokhoz, például jelzőanyagokhoz (radioaktív, fluoreszcens, enzim stb.). Ezek a csoportok a láncbeli módosított kötésen keresztül a kötés részeiként származékká alakíthatók. így például az interkalátorok, mint például az akridin, az RNS vagy DNS 5’-terminális helyzetében, az RNS 2'-helyzetében jelen lévő OH- vagy SHcsoportokon keresztül egy R-CH₂-csoporton keresztül kapcsolható, vagy egy, a pirimidinek 5-helyzetébe bevitt OH- vagy SH-csoporton keresztül, például a citozin 5-metilcsoportja helyett egy származékká alakított -CH₂CH₂CH₂OH- vagy -CH₂CH₂CH₂SH-csoportokat tartalmazó csoporton keresztül kapcsolható. Számos helyettesítő kapcsolható, beleértve azokat, amelyek szokásosan kapcsolódnak. Ennek megfelelően az 1 képletű oligomer említett hidroxilcsoportjai kicserélhetők foszfonátcsoportokra, védhetők szokásos védőcsoportokkal vagy aktiválhatok, hogy olyan további kötéseket alakítsunk ki, amelyek más nukleotidokhoz kapcsolódnak vagy köthetők konjugált helyettesítőhöz. Az 5'-terminális hidroxilcsoport szokásos módon foszforilezhető, a 2'-hidroxilcsoport vagy a 3’-terminális hidraxilhelyettesítők szintén foszforilezhetők. A hidroxilcsoport szokásos védőcsoportokkal szintén védhető.

A „foszfodiészter-analóg” kifejezésen a szokásos foszfodiészter-kötés analógját, valamint alternatív kapcsolócsoportokat értünk. Ezek az alternatív kapcsolócsoportok lehetnek, nem kizárólag, olyan csoportok, amelyekben az O-P(O) csoport helyett P(O)S, P(O)NR₂, P(O)R, P(O)OR’ csoport található, ahol R jelentése hidrogénatom vagy 1-7 szénatomos alkilcsoport, és R’ jelentése 1-7 szénatomos alkilcsoport. Egy oligomerben a foszfodiészter-analógoknak nem szükséges azonosaknak lenniük, az egyetlen kívánalom, hogy az összekötő csoportok közül legalább egynek módosított intemukleotidkötésnek kell lennie.

A purinok és pirimidinek analógjai általában ismertek, ezek közül sokat kemoterápiás ágensként alkalmaznak. Idetartoznak például, nem kizárólag, a 4-acetil-citozin, 8-hidroxi-N⁶-metil-adenin, aziridinil-citozin, pszeudoizocitozin, 5-(karboxi-hidroxi-metil)-uracil, 5-fluoruracil, 5-bróm-uracil, 5-karboxi-metil-amino-metil-2tiouracil, 5-karboxi-metil-amino-metil-uracil, dihidrouracil, inozin, N₆-izopentenil-adenin, 1-metil-adenin, 1-metil-pszeudouracil, 1-metil-guanin, 1-metil-inozin, 2,2-di6

HU 218 086 Β metil-guanin, 2-metil-adenin, 2-metil-guanin, 3-metil-citozin, 5-metil-citozin, N₆-metil-adenin, 7-metil-adenin, 7-metil-guanin, 5-metil-amino-metil-uracil, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracil, béta-D-mannozil-guanozin, 5’metoxi-karbonil-metil-uracil, 5-metoxi-uracil, 2-metiltio-N₆-izopentenil-adenin, uracil-5-oxi-ecetsav-metil-észter, uracil-5-oxi-ecetsav, oxi-butoxozin, pszeudouracil, guozin, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metil-uracil, N-uracil5-oxi-ecetsav-metil-észter, uracil-5-oxi-ecetsav, pszeudouracil, queozín, 2-tiocitozin és 2,6-diamino-purin. Különösen előnyös analóg az 5-metil-citozin (a továbbiakban Cme).

Az „izoszterikus” kifejezésen egy intemukleozidkötés térbeli és orientációs tulajdonságait értjük, és azt a tényt, hogy ezek a tulajdonságok annyira hasonlóak a natív foszfodiészter-kötés tulajdonságaihoz, hogy az izoszterikus kötést tartalmazó módosított oligonukleotid kicserélheti, helyettesítheti, utánozhatja és/vagy hibridizálódhat a natív oligonukleotidhoz.

A „ribózamid” kifejezés alatt olyan intemukleotidkötést értünk, amely két nukleobázis között van. A ribóz-amid intemukleotidkötés a ribóz/(2’-dezoxi) és aminosavfunkciók kombinációja.

Leírásunkban további számos rövidítés alkalmazunk funkciós csoportok és vegyületek jelölésére. Ezek a rövidítések a szerves kémiában jártas szakember számára érthetők, így például Ph jelentése fenilcsoport, Me jelentése metilcsoport stb.

A „rövid szénláncú alkilcsoport” kifejezésen 1-6 szénatomos, egyenes vagy elágazó szénláncú alkilcsoportot, előnyösen metil-, etil-, η-propil-, izopropil-, terc-butil-, izobutil- és n-hexil-csoportot, továbbá 3-6 szénatomos cikloalkilcsoportot értünk.

A találmány I általános képletü vegyületekre vonatkozik, ahol a vegyületek I. csoportja esetén

X jelentése CHR₂OH, ahol

R₂ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkilamin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

Y jelentése bázis — (CH₂)_n -, ahol a bázis különböző, nem halogénezett nukleozidbázis,

R] jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport, n értéke 1-7,

A jelentése karbonilcsoport,

Z jelentése hidrogénatom vagy OR₃ képletü csoport, ahol

R₃ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

W jelentése CHR₄OH képletü csoport, ahol

R₄ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

L jelentése semmi; vagy a vegyületek II. csoportja esetén

X jelentése bázis - (CH₂)_n -, ahol a bázis különböző, nem halogénezett nukleozidbázis,

R[ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport, n értéke 1-7,

Y jelentése CHR₂OH, ahol

R₂ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkilamin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

A jelentése karbonil- vagy metiléncsoport,

Z jelentése hidrogénatom vagy OR₃ képletü csoport, ahol

R₃ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

W jelentése CHR₄OH képletü csoport, ahol

R₄ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

L jelentése semmi; vagy a vegyületek III. csoportja esetén

X jelentése CHR₂OH, ahol

R₂ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkilamin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

Y jelentése bázis - (CH₂)_n -, ahol a bázis különböző, nem halogénezett nukleozidbázis,

R, jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport, n értéke 1-7,

A jelentése metiléncsoport,

Z jelentése hidroxilcsoport vagy OR₃ képletü csoport, ahol

R₃ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

W jelentése CHR₄OH képletü csoport, ahol föl jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

L jelentése semmi; vagy a vegyületek IV. csoportja esetén

X jelentsée bázis - (CH₂)_n -, ahol a bázis különböző, nem halogénezett nukleozidbázis,

R, jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport, n értéke 1-7,

Y jelentése COOH vagy CHR₂OH képletü csoport, ahol

R₂ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkilamin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

A jelentése karbonil- vagy metiléncsoport,

Z jelentése metiléncsoport,

W jelentése metiléncsoport,

HU 218 086 Β

L jelentése CHNHR_S, ahol

R₅ jelentése hidrogénatom, hidroxil- vagy OR₃ képletű csoport, ahol

R₃ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport; vagy a vegyületek V. csoportja esetén

X jelentése CH₂OH, CH₂NH₂, CONH, vagy COOH képletü csoport,

Y jelentése semmi,

Z jelentése CH₂ vagy CHO-I^B képletü csoport,

W jelentése oxigén- vagy kénatom, vagy metiléncsoport,

N jelentése CH képletü csoport, és

L és A jelentése egymástól függetlenül COOH, CHCOOH, CHCH₂COOH, NH₂, CHNH₂, L,-NH-L,-B vagy CH-L,-NH-L₂-B képletü csoport, ahol

B jelentése hidrogénatom vagy nukleozidbázis, és L, és L₂ jelentése egymástól függetlenül (CH₂)_n, ahol n értéke 0, 1, 2 vagy 3, vagy (CH,)_mCO képletü csoport, ahol m értéke 0, 1 vagy 2.

A találmány tehát olyan új oligonukleotid-analógokra vonatkozik, amelyek módosított aminosav/aminoalkohol kötéseket tartalmaznak a bázisok és a lánc között (foszfodiészter, foszforotioátok és mások, lásd 1. táblázat), amelyeket módosított nukleotidkötésként is említünk. A módosításokat, illetve azok funkcionális ekvivalensét, ahol a lánc és a bázis között elhelyezkedő cukorcsoportot egy aminosav helyettesíti, például az 1/24 képieméi mutatjuk be. A találmány továbbá új nukleomonomerekre és ezeknek az oligomerekbe történő beépítésére is vonatkozik.

A találmány tárgykörébe tartoznak az I/1-I/23 általános képletü szerkezettel rendelkező nukleomonomer vegyületek.

A találmány szerinti oligomerek olyan polimerek, amelyek egy vagy több monomert tartalmaznak úgy kapcsolva, hogy azok a DNS vagy az RNS strukturális analógját képezik. A találmány szerinti oligomerek két vagy több nukleomonomert tartalmaznak és virtuálisan akárhány nukleomonomert tartalmazhatnak, de a 200 vagy ennél kevesebb nukleomonomert tartalmazó oligomereket általában könnyebb szintetizálni. Az 1/1-1/23 általános képletü vegyületek 4’-5’, 3’-5’ és 2’-5’ kötésen keresztül kapcsolódhatnak, amint ezt az 1/24—1/41 általános képlet mutatja.

A találmány szerinti vegyületekben a nukleotidkötést szerin- vagy glicinaminosavak, vagy ezek származékai képezik. A találmány szerinti oligonukleotidok in vivő stabilak, endogén nukleázokkal szemben ellenállóak és a megcélzott nukleotidszekvenciákkal hibridizálnak. A találmány szerinti vegyületeket például az 1/24—1/41 általános képlet szemlélteti, és szerkezetileg korlátozottabbak, mint a nem módosított DNS-ben vagy RNS-ben található foszfodiészter-kötések. Ez a szerkezeti korlátozottság részben hozzájárulhat a komplementer polinukleotidszekvenciához való fokozott kötődéshez, a találmány alkalmazása azonban nem függ a fokozott kötődési tulajdonságokhoz fűzött elmélettől.

Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány olyan módosított oligonukleotidokra vagy származékaikra vonatkozik, amelyekben a természetes oligonukleotid, például a DNS vagy az RNS furanózmaradékát egy aminosav/amino-alkohol maradékkal cseréljük ki, és további módosításokat végzünk az aminosavrészben, amint ezt az 1/25-1/41 általános képletek mutatják. A szomszédos nukleomonomerek közötti intemukleotidkötés a szomszédos nukleomonomerek 4’- és 5’helyzetében lévő kötést jelentik. Más szóval a foszfodiészter intemukleotidkötése vagy ennek funkcionális ekvivalense az egyik nukleomonomer 5’-helyzetétől kiindulva a szomszédos monomer 4’-helyzetét köti össze, amint azt az 1/24—1/33 általános képlet szemlélteti.

A képletekben R jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, CN, CH₃, OCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), Ph, -(CH₂)_x-F képletü csoport; ahol x értéke 1-7, és F jelentésé NH₂, SH, OH, COOH, OCH₃, SCH₃, SPh, NOH, NOH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, ch₃ és Ph képletü csoport.

A „bázis” egymástól függetlenül nukleozidbázisokat jelent.

R, jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, CN, CH₃, OCH₃, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), Ph, -(CH₂)_X-F képletü csoport; ahol x értéke 1-7, és F jelentése NH_?, SH, OH, COOH, OCH₃, SCH₃, SPh, NOH, NOH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, CH₃ és Ph képletü csoport.

R₂ jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, CN, CH₃, OCH₃, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), Ph, -(CH₂)_x-F képletü csoport; ahol x értéke 1-7, és F jelentése NH₂, SH, OH, COOH, OCH₃, SCH₃, SPh, NOH, NOH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, CH₃ és Ph képletü csoport.

R₃ jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, CN, CH₃, OCH₃, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), Ph, -(CH₂)_X-F képletü csoport; ahol x értéke 1-7, és F jelentése NH₂, SH, OH, COOH, OCH₃, SCH₃, SPh, NOH, NOH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, ch₃ és Ph képletü csoport.

A képletekben R₄ jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, CN, CH₃, OCH₃, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), Ph, -(CH₂)_x-F képletü csoport; ahol x értéke 1 -7, és F jelentése NH₂, SH, OH, COOH, OCH₃, SCH₃, SPh, NOH, NOH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, CH₃ és Ph képletü csoport.

A jelentése egymásól függetlenül (CH_?)_X, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NHC₃, NR₅ és Se képletü csoport, ahol x értéke 1-7.

B jelentése egymásól függetlenül (CH₂)_X, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NHC₃, NR₅ és Se képletü csoport, ahol x értéke 1-7.

X jelentése egymásól függetlenül (CH₂)_X, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NHC₃ és NR₅ képletü csoport, ahol x értéke 1-7.

Z jelentése egymásól függetlenül (CH₂)_X, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NHC₃ és NR₅ képletü csoport, ahol x értéke 1-7.

R₅ jelentése H, OH, OMe, CN, NH, NOH, ONCH₃, ONH₂, etil-, propil-, 1-7 szénatomos alkil-, Me,

HU 218 086 Β

1-7 szénatomos heteroalkil-, 6-7 szénatomos arilcsoport, -(CH,)_XF képletű csoport, ahol x értéke 1-7, és F egymástól függetlenül H, OH, SH, OCH₃, CN, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, CH₃ és Ph képletű csoport.

V jelentése egymástól függetlenül foszfodiészteranalóg, foszforotioát-, metil-foszfonát-, foszforoditioát, bórfoszfonát-, szelén-foszfonát-, foszforamidát-, acetamidát-, oxi-formamido-, oxi-acetamido-, diizopropilszilil-, karbamát-, dimetilén-szulfid-, dimetilén-szulfoxid-, dimetilén-szulfon-csoport és/vagy kettő-négy atom hosszúságú intemukleozidkötés, az atomok lehetnek szén-, nitrogén-, oxigén-, kén- vagy szelénatom. Az oligomer hosszúsága terjedhet dimertől 200-merig, vagy lehet ennél hosszabb. V előnyös jelentéseit az 1. táblázatban foglaltuk össze.

Emellett a képletekkel megadott vegyületek egy vagy több konjugálómaradékhoz lehetnek kapcsolva. Alkalmas konjugálócsoportok például az O-koleszterin, polietilénglikol, aminosavak, interkalátorok, hasítócsoportok (például imidazol), térhálósító funkciós csoportok (például pszoralén), lipidek, peptidek, alkilezőszerek, hidroxamátok és fluoreszcens jelzőanyagok. A konjugálócsoportok egymástól függetlenül az R, R_b ^2’ ^3’ ^4 és R₅ közül egy vagy több csoportot helyettesíthetnek.

Egy további előnyös megvalósítási mód szerint a találmány az 1/34-1/3 6 általános képlettel szemléltetett oligomer szerkezetekre vonatkozik.

Az 1/34-1/36 általános képletű vegyületekben a szomszédos nukleomonomerek között előforduló kötés 3’-5’ kötést képvisel.

A képletekben R jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, CN, CH₃, OCH₃, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), Ph, -(CH,)_X-F képletű csoport; ahol x értéke 1-7, és F jelentése NH₂, SH, OH, COOH, OCH₃, SCH₃, SPh, NOH, NOH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, CH₃ és Ph képletű csoport.

A „bázis” egymástól függetlenül nukleozidbázisokat jelent.

R[ jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, CN, CH₃, OCH₃, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), Ph, -(CH₂)_X-F képletű csoport; ahol x értéke 1-7, és F jelentése NH,, SH, OH, COOH, OCH₃, SCH₃, SPh, NOH, NOH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, CH₃ és Ph képletű csoport.

R₂ jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, CN, CH₃, OCH₃, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), Ph, -(CH₂)_x-F képletű csoport; ahol x értéke 1-7, és F jelentése NH₂, SH, OH, COOH, OCH₃, SCH₃, SPh, NOH, NOH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, CH₃ és Ph képletű csoport.

R₃ jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, CN, CH₃, OCH₃, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), Ph, -(CH₂)_x-F képletű csoport; ahol x értéke 1 -7, és F jelentése NH₂, SH, OH, COOH, OCH₃, SCH₃, SPh, NOH, NOH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, CH₃ és Ph képletű csoport.

A képletekben R₄ jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, CN, CH₃, OCH₃, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃),

Ph, -(CH₂)_x-F képletű csoport; ahol x értéke 1-7, és F jelentése NH₂, SH, OH, COOH, OCH₃, SCH₃, SPh, NOH, NOH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, ch₃ és Ph képletű csoport.

A jelentése egymásól függetlenül (CH₂)_X, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NCH₃, NR₅ és Se képletű csoport, ahol x értéke 1-7.

B jelentése egymásól függetlenül (CH₂)_X, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NCH₃, NR₅ és Se képletű csoport, ahol x értéke 1-7.

X jelentése egymásól függetlenül (CH₂)_X, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NHC₃ és NR₅ képletű csoport, ahol x értéke 1-7.

Z jelentése egymásól függetlenül (CH₂)_X, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NHC₃ és NR₅ képletű csoport, ahol x értéke 1-7.

R_s jelentése H, OH, OMe, CN, NH, NOH, ONCH₃, ONH₂, etil-, propil-, 1-7 szénatomos alkil-, Me, 1-7 szénatomos heteroalkil-, 6-7 szénatomos arilcsoport, ~(CH₂)_xF képletű csoport, ahol x értéke 1-7, és F egymástól függetlenül H, OH, SH, OCH₃, CN, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, ch₃ és Ph képletű csoport.

V jelentése egymástól függetlenül foszfodiészteranalóg, foszforotioát-, metil-foszfonát-, foszforoditioát, bór-foszfonát-, szelén-foszfonát-, foszforamidát-, acetamidát-, oxi-formamido-, oxi-acetamido-, diizopropilszilil-, karbamát-, dimetilén-szulfid-, dimetilén-szulfoxid-, dimetilén-szulfon-csoport és/vagy kettő-négy atom hosszúságú intemukleozidkötés, az atomok lehetnek szén-, nitrogén-, oxigén-, kén- vagy szelénatom. Az oligomer hosszúsága terjedhet dimertől 200-merig, vagy lehet ennél hosszabb. V előnyös jelentéseit az 1. táblázatban foglaltuk össze.

Egy további előnyös megvalósítási mód szerint a találmány az 1/37—1/41 általános képletű oligomerekre és ezek variánsaira vonatkozik, ahol az oligomerek a 2’-5’ kötést képviselő új intemukleotidkötésekkel rendelkeznek. Ezek az oligonukleotidok in vivő stabilak és az endogén nukleázokkal szemben javított ellenállást mutatnak, továbbá a megcélzott oligonukleotid-szekvenciákkal hibrizidálnak.

A képletekben R jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, CN, CH₃, OCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), Ph, -(CH₂)_x-F képletű csoport; ahol x értéke 1-7, és F jelentése NH,, SH, OH, COOH, OCH₃, SCH₃, SPh, NOH, NOH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, CH₃ és Ph képletű csoport.

A „bázis” egymástól függetlenül nukleozidbázisokat jelent.

R, jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, CN, CH₃, OCH₃, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), Ph, -(CH₂)_x-F képletű csoport; ahol x értéke 1-7, és F jelentése NH,, SH, OH, COOH, OCHj, SCH₃, SPh, NOH, NOH(CH₃), SNH,, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, CH₃ és Ph képletű csoport.

R, jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, CN, CH₃, OCH₃, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), Ph, -(CH₂)_x-F képletű csoport; ahol x értéke 1-7, és F jelentése NH₂, SH, OH, COOH, OCH₃, SCH₃, SPh, NOH, NOH(CH₃),

HU 218 086 Β

SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, CHj és Ph képletű csoport.

R₃ jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, CN, CH₃, och₃, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), Ph, -(CH₂)_x-F képletű csoport; ahol x értéke 1-7, és F jelentése NH₂, SH, OH, COOH, OCH₃, SCH₃, SPh, NOH, NOH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, CH₃ és Ph képletű csoport.

A képletekben R4 jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, CN, CH₃, OCH₃, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), Ph, -(CH₂)_X-F képletű csoport; ahol x értéke 1-7, és F jelentése NH₂, SH, OH, COOH, OCH₃, SCH₃, SPh, NOH, NOH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, ch₃ és Ph képletű csoport.

A jelentése egymásól függetlenül (CH₂)_X, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NCH₃, NR₅ és Se képletű csoport, ahol x értéke 1 -7.

B jelentése egymásól függetlenül (CH₂)_X, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NHC₃, NR₅ és Se képletű csoport, ahol x értéke 1 -7.

X jelentése egymásól függetlenül (CH₂)_X, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NHC₃ és NR₅ képletű csoport, ahol x értéke 1-7.

Z jelentése egymásól függetlenül (CH₂)_X, CO, CS, S, S(O), S(O)(O), NH, NOH, NHC₃ és NR₅ képletű csoport, ahol x értéke 1-7.

R₅ jelentése H, OH, OMe, CN, NH, NOH, ONCH₃, ONH₂, etil-, propil-, 1-7 szénatomos alkil-, Me, 1-7 szénatomos heteroalkil-, 6-7 szénatomos arilcsoport, -(CH₂)_x-F képletű csoport, ahol x értéke 1-7, és F egymástól függetlenül H, OH, SH, OCH₃, CN, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), SNH₂, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, CH₃ és Ph képletű csoport.

V jelentése egymástól függetlenül foszfodiészteranalóg, foszforotioát-, metil-foszfonát-, foszforoditioát, bór-foszfonát-, szelén-foszfonát-, foszforamidát-, acetamidát-, oxi-formamido-, oxi-acetamido-, diizopropilszilil-, karbamát-, dimetilén-szulfid-, dimetilén-szulfoxid-, dimetilén-szulfon-csoport és/vagy kettő-négy atom hosszúságú intemukleozidkötés, az atomok lehetnek szén-, nitrogén-, oxigén-, kén- vagy szelénatom. Az oligomer hosszúsága teijedhet dimertől 200-merig, vagy lehet ennél hosszabb. V előnyös jelentéseit az 1. táblázatban foglaltuk össze.

A találmány egy további előnyös megvalósítási mód szerint az I/42A-I/42F általános képletű oligomerre és annak 85-90 általános képletű monomer komponenseire vonatkozik.

Az I/42A-I/42F képletekben X jelentése (CH₂)_n, ahol n értéke 1-3, CO(CH₂)_n, ahol n értéke 0-2 vagy (CH₂)_nSO₂, ahol n értéke 1 -2,

Y jelentése CH₂, CO, COOH, CS vagy SO₂,

Y’ jelentése CH₂, CO, COOH, CS vagy SO₂,

Z jelentése O, S, NH vagy CH₂,

R jelentése CH₂OH, CH₂NH₂, CH₂NHCHO, CONH₂ vagy COOH,

B jelentése nukleozidbázis.

Az 1/85-1/90 képletekben

X jelentése (CH₂)_n, ahol n értéke 1 -3, CO(CH₂)_n, ahol n értéke 0-2 vagy (CH₂)_nSO₂, ahol n értéke 1-2,

Y jelentése CH₂, CO, COOH, CS vagy SO₂,

Y’ jelentése CH₂, CO, COOH, CS vagy SO₂,

Z jelentése O, S, NH vagy CH₂,

R jelentése CH₂OH, CH₂NH₂, CH₂NHCHO, CONH₂ vagy COOH,

B jelentése nukleozidbázis.

A találmány szerinti vegyületek alkalmasak egy nukleotid jelenléte által közvetített betegség kezelésére, melynek során a kezelendő személynek az illető nukleotidszekvenciához specifikusan kötődni képes módosított oligonukleotid hatékony mennyiségét adagoljuk.

A találmány szerinti oligonukleotidokban az 1/24-1/41 általános képlettel szemléltetett vegyületekben V által képviselt foszfodiészter-csoportok közül legalább egyet az itt ismertetett intemukleozidkötéssel cserélünk ki. Kívánt esetben a nem módosított oligonukleotid több foszfodiészter-kötését helyettesíthetjük módosított intemukleozidkötéssel, vagy kívánt esetben egyetlen oligonukleotidban különböző módosított intemukleotidkötéseket alkalmazhatunk. A találmány szerinti oligonukleotidok egy előnyös megvalósítási módja szerint ezek a helyettesítő kötések nem királisak, hogy elősegítsük az oligonukleotid hibrizidálását a kívánt célszekvenciához; azonban a találmány tárgykörébe tartoznak azok a vegyületek is, amelyek királis formában vannak.

A V módosított intemukleotidkötés előnyös képviselőit az 1. táblázatban foglaljuk össze.

1. táblázat

-O-s-S(O)-S(O)(O)-Se-Si-C(O)-C(S)-NH-NOH-nch₃-nr₅-ch₂-o-ch₂-ch₂-o-o-ch₂-ch₂-ch₂-ch₂-o-ch₂-o-ch₂-o-ch₂-o-s-ch₂-ch₂-s-s-ch₂-ch₂-ch₂-ch₂-s-ch₂-s-ch₂-s-ch₂-s-o-ch₂-s-S-CH₂-O-S(O)-CH₂10

HU 218 086 Β

1. táblázat (folytatás) -CH₂-S(O)-S(O)-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-S(O)-CH₂-S(O)-CH₂-S(O)-CH₂-S(O)-O-CH₂-S(O)-S(O)-CH₂-O-S(O)(O)-CH₂-CH₂-S(O)(O)-S(Ó)(O)-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-S(O)(O)~ -CH₂-S(O)(O)-CH₂-S(Ó)(O)-CH₂-S(O)(O)-O-CH₂-S(O)(O)-S(O)(O)-CH₂-O-S-S-S(O)-S(O)-S(O)(O)-S(O)-(O)-Se-CH₂-CH₂-Se-Se-CH₂-CH₂-CH,-CH₂-Se-CH₂-Se-CH₂-Se-CH₂-Se-O-CH₂-Se-Se-CH₂-O-Se-(O)-CH₂-CH₂-Se(O)~ -Se(O)-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-Se(O)-CH₂-Se(O)-CH₂-Se(O)-CH₂-Se(O)-O-CH₂-Se(O)-Se(O)-CH,-O-Se(O)(O)-CH₂-CH₂-Se(O)(O)-Se(O)(O)-CH₂-CH₂-CH,-CH₂-Se(O)(O)-CH₂-Se(O)(O)-CH₂- Se(Ö)(O)-CH₂- Se(O)(O)-Se-Se-Se(O)-Se(O)-Se(O)(O)-Se(O)-(O)~ -O-CH₂-Se(O)(O)-Se(O)(O)-CH,-O-S-CH,-Se-Se-CH₂-S-S(O)-CH,-Se(O)-Se(O)-CH₂-S(O)-S(O)(O)-CH₂-Se(O)(O)-Se(O)(O)-CH₂-S(O)(O)-S-S-S(O)-S(O)-S(O)(O)-S(O)(O)-Se-Se-Se(O)-Se(O)~ -Se(O)(O)-Se(O)(O)-N(R₅)-CH₂-CH₂-N(R₅)-N(R₅)-CH₂-CH₂-CH₂-CH,-N(R₅)-CH₂-N(R₅)-CH₂-N(R₅)-O-O-N(R₅)-N(R₅)-O-CH₂-CH₂-O-N(R₅)-CH₇-N(R₅)-O-O-N(R₅)-CH₂-O-CH₂-N(R₅)-N(R₅)-CH₂-O-N(R₅)-S-S-N(R₅)-N(R₅)-S-CH₂-CH₂-S-N(R₅)-CH₂-N(R₅)-S-S-N(R₅)-CH₂-S-CH,-N(R₅)-N(R₅)-CH₇-S-N(R₅)-S(Ó)-S(O)-N(R_s)-N(R₅)-S(O)-CH₂-CH₂-S(O)-N(R₅)-CH₂-N(R₅)-S(O)-S(O)-N(R₅)-CH₂-S(O)-CH₂-N(R₅)-N(R₅)-CH₂-S(O)-N(R₅)-S(O)(O)-S(O)(O)-N(R₅)-N(R₅)-S(O)(O)-CH₂-CH₂-S(O)(O)-N(R₅)-CH₂-N(R₅)-S(O)(O)-S(O)(O)-N(R₅)-CH₂-S(O)(O)-CH₂-N(R₅)-N(R₅)-CH,-S(O)(O)-O-N(R₅)-s-S-N(R₅)-O-O-N(R_s)-S(O)-S(O)-N(R₅)-O-O-N(R₅)-S(O)(O)~

-S(O)(O)-N(R₅)-O-o-s-o-O-S(O)-O-O-S(O)(O)-O-N(R₅)-S-N(R₅)-N(R₅)-S(O)-N(R₅)-N(R₅)-S(O)(O)-N(R₅)-CH7-S-O-CH₂-S(O)-O-CH,-S(O)(O)-O-CH,-C(O)-O-CH₂-C(S)-O-CH,-N(R₅)-C(O)-O-CH₂-N(Rj)-C(S)-O-N(R_s)-C(O)-O-CH₂-N(R₅)-C(S)-O-CH₂-O-C(O)-N(R₅)-O-O-C(S)-N(R₅)-O-O-C(O)-N(R₅)-CH₂-O-C(S)-N(Rj)-CH₇11

HU 218 086 Β

1. táblázat (folytatás) -O-C(O)-CH₂-N(R₅)-O-C(S)-CH₂-N(R₅)-O-C(O)-CH₂-O-N(R₅)-O-C(S)-CH₂-O-N(R₅)-O-C(O)-N(R₅)-O-CH₂-O-C(S)-N(R₅)-O-CH₂-O-N(R₅)-C(O)-O-CH₂-O-N(R₅)-C(S)-O-CH₂-CH₂-O-C(O)-N(R₅)-Ö-CH₂-O-C(S)-N(R₅)-O-CH₂-O-C(O)-N(R₅)-CH₂-CH₂-O-C(S)-N(R₅)-CH₂-CH₂-O-C(O)-CH₂-N(R₅)-CH₂-O-C(S)-CH₇-N(R₅)-CH₂-O-C(O)-N(R₅)-CH₇-O-C(S)-N(R₅)-CH₂-O-C(O)-N(R₅)-O-CH₇-O-C(S)-N(R₅)-O-CH₂-O-N(R₅)-C(O)-O-CH₂-O-N(R₅)-C(S)-O-CH₂-N(R₅)-C(O)-S-CH₇-N(R_s)-C(S)-S-N(R_s)-C(O)-S-CH₂-N(R₅)-C(S)-S-CH₂-S-C(O)-N(R₅)-O-O-C(S)-N(R₅)-S-S-C(O)-N(R₅)-CH₂-S-C(S)-N(R_s)-CH₂-S-C(O)-CH₂-N(R_s)-S-C(S)-CH₂-N(R_s)-S-C(O)-CH₇-O-N(R₅)-O-C(S)-CH₂-S-N(R₅)~ -O-C(O)-N(R₅)-S-CH₇-S-C(S)-N(R₅)-O-CH₂-S-N(R₅)-C(O)-O-CH₂-O-N(R₅)-C(S)-S-CH₂-CH₇-S-C(O)-N(R₅)-O-CH₇-O-C(S)-N(R₅)-S-CH₂-S-C(O)-N(R₅)-CH₂-CH₂-S-C(S)-N(R₅)-CH₂-CH₂-S-C(O)-CH₂-N(R₅)-CH₂-S-C(S)-CH₂-N(R_s)-CH₂-S-C(O)-N(R₅)-CH₇-S-C(S)-N(R₅)-CH₇-S-C(O)-N(R₅)-O-CH₂-S-C(S)-N(R₅)-O-CH₂-S-N(R₅)-C(O)-O-CH₂-S-N(R₅)-C(S)-O~ -CH₂-O-C(O)-N(R₅)-S-CH₇-O-C(S)-N(R₅)-S-CH₂-O-N(R₅)-C(O)-S-CH₂-O-N(R₅)-C(S)-S-N(R₅)-N(Rs)-N(R₅)-N(R₅)-CH₂-CH₂-N(R₅)-N(R_s)-N=C(NH₂)-N(R₅)-N(R₅)-N=C(NH₂)-S(O)-CH₇-O-O-CH₂-S(O)-S-CH(R₅)-O-O-CH(R_s)-S-o-ch₂-ch=ch-S-CH₇-CH=CH5 -S-CH₇-C=C-N(R₅)-CH₂-N(R₅)-N(R₅)-C(O)-N(R₅)-N(R₅)-C(S)-N(R₅)-N(Rj)-C(O)-S10 -N(R_s)-C(S)-S-N(R_s)-C(S)-O-N(R₅)-C(O)-O-O-C(O)-N(R₅)-O-C(S)-N(R₅)15 -S-C(O)-N(R₅)-S-C(S)-N(R₅)ahol R5 jelentése H, OH, OMe, CN, NH, NOH, ONCH₃, ONH₂, etil-, propil-, 1-7 szénatomos alkil-, Me,

1-7 szénatomos heteroalkil-, 6-7 szénatomos arilcsoport, -(CH₂)_xF képletű csoport, ahol x értéke 1-7, és F jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, OCH₃, CN, SCH₃, ONH₂, ONH(CH₃), SNH₇, S(O)NH₂, S(O)(O)NH₂, CH₃, Ph. Emellett a kötőcsoporthoz egy vagy több konjugálócsoportot kapcsolhatunk, konjugált oligomerek előállításához. Előnyös konjugálócsoportok az O-koleszterin, polietilénglikol, aminosavak, interkalátorok, hasítócsoportok (például imidazol), térhálósító csoportok (például pszoralén), lipidek, peptidek, alkilező30 szerek, hidroxamátok és fluoreszcens jelzőanyagok.

Különösen előnyös 4’-5’ kötések a foszfodiészter-, foszforotioát-, metil-foszfonát-, karboxamid-, tiokarboxamid-, hidroxamát-, szulfonamid-, hidroxil-aminés karbamátcsoportok. Ugyanilyen módosítások előnyö35 seka2’-5’és3’-5’ kötések esetén.

A találmány szerinti oligomerek nem korlátozódnak homogén kötéstípust tartalmazó oligomerekre, hanem idetartoznak a váltakozó vagy véletlenszerűen elosztó helyettesítő kötések is, beleértve a 2’-5’ kötése40 két is. Mivel a találmány szerinti oligomerek szintetizálása során egy időben egyetlen nukleomonomert alkalmazunk, az egyes kötések és/vagy helyettesítő kötések és az egyes bázisok természete egymástól függetlenül úgy választható meg, hogy az oligonukleotid a kívánt szekvenciával rendelkezzék.

A találmány szerinti oligonukleotidok kívánt számú helyettesítő kötést tartalmazhatnak. Ezek a helyettesítő kötések lehetnek egymással azonosak vagy egymástól eltérőek a V megfelelő formájának kiválasztása szerint, be50 leértve más, nem a találmány szerinti helyettesítő kötéseket is. Mivel az oligomereket szekvenálással állítjuk elő, a kötések vagy helyettesítő kötések, bázisok és cukrok módosításának bármilyen mintázatát alkalmazhatjuk.

A találmány szerinti megoldás egy előnyös megva55 lósítási módja szerint a találmány szerinti helyettesítő kötések szabályos sorrendben váltakoznak. így például egy helyettesítő kötést két foszfodiészter-kötés követ, amelyet ismét egy, találmány szerinti helyettesítő kötés követ, és így tovább. Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint például egy helyettesítő kötést egy fosz12

HU 218 086 Β fodiészter-analóg (például tioát stb.) követ, majd ezután egy, a találmány szerinti helyettesítő kötés következik, ezután egy foszfodiészter-analóg stb. következik, azaz a találmány szerinti oligomerben a kétféle típusú helyettesítő kötések egyenként váltakoznak. A többféle típusú kötést tartalmazó, találmány szerinti oligomerek esetén az oligomer alegységei között jelen lévő különböző kötéstípusok váltakozása bármilyen számban előfordulhat.

A találmány szerinti oligomerekben egy vagy több nukleomonomer maradékon hajthatunk végre cukormódosítást, azonban előnyösen, ha az aminosavak közötti 4’-5’, 3’-5’ és 2’-5’ nukleotidkötésen végzünk ilyen módosítást. Ilyen esetben az oligonukleotid-analóg bemutatására további rövidítések alkalmazhatók. így például a standard DNS- (vagy RNS-) szekvenciákat általában csak a bázisok megjelölésével adjuk meg, például ATG CGC TGA. Általában egyszerűen kijelentjük, hogy ez RNS-t vagy DNS-t képvisel. Ennek megfelelő jelölési rendszert alkalmazunk egy adott bázisszekvenciával rendelkező oligonukleotid-analóg megjelenítésére.

További nukleomonomer-módositások

A találmány szerinti oligomerek a helyettesített kötések mellett további különböző módosításokat tartalmazhatnak. Ilyen további módosításokat tartalmazó monomerek azok, ahol i) egy vagy több nukleomonomer van módosítva a 2’-, 3’-, 4’- és 5’-helyzetben, ii) egy vagy több kovalens keresztkötést képző csoport van beépítve, iii) más, nem találmány szerinti helyettesített kötés van beépítve, iv) más bázisanalógok, például 8oxo-N⁶-metil-adenin van beépítve, v) konjugálócsoportok vannak beépítve, például interkalálószerek vagy polilizin, amelyek fokozzák a megcélzott nukleinsavszekvenciához való kötődés affinitását, vagy amelyek fokozzák az oligomer és a sejtek asszociálódását.

A találmány szerinti oligomerek egyszálú és kettős szálú célszekvenciákhoz való szekvenciaspecifikus kötődési tulajdonságai kompatibilisek az oligomer további módosításaival. Ezek a további módosítások más hasznos tulajdonságokhoz, például a nukleázok által végzett hasítással szembeni stabilitáshoz (például a találmány szerinti oligomemek egy olyan doménjében, amelyben foszfodiészter-kötés van jelen) járulhatnak hozzá, vagy fokozhatják a sejtmembránon való áthatolóképességet stb.

A találmány szerinti oligomerek egy vagy több helyettesített kötést, például szulfid- vagy szulfonátkötést (Benner S. A., WO 89/12060), szulfamátkötést (WO 91/15500), karbamátkötést vagy más helyettesített kötést tartalmazhatnak a morfolino-oligomerekben [Stirchak, E. P. et al., Nucleic Acids Rés., 17., 6129-6141. (1989)] (Summerton J. et al., WO 216 860), vagy ehhez hasonló kötéseket tartalmazhatnak.

így a találmány szerinti oligomerek előnyös megvalósítási módjai például azok, amelyek 1. legalább egy helyettesített kötést és egy aminosavat tartalmaznak, amely a szomszédos monomerhez kapcsolódik, és 2. egy vagy több, nem találmány szerinti helyettesített kötést tartalmaznak a következők közül: foszforotioát, metil-foszforát-, tiono-metil-foszfonát, és/vagy 3. egy vagy több foszfodiészter-kötést tartalmaznak, és/vagy 4. purin- vagy pirimidinanalógokat tartalmaznak, amelyek fokozzák a komplementer megcélzott szekvenciához való kötődési affinitást. További oligomerek például 1. az olyan oligomerek, amelyek találmány szerinti helyettesített kötést tartalmaznak a 3’- és/vagy 5’-végen, és foszforotioát-kötést valahol az oligomerben; 2. az olyan oligomerek, amelyek a találmány szerinti helyettesített kötéseket tartalmazzák, és szokásos purin- vagy pirimidinbázisokat taratlmaznak (például adenint, guanint, citozint, timint vagy uracilt); 3. az olyan oligomerek, amelyek találmány szerinti helyettesített kötést tartalmaznak és egy vagy több olyan bázist, amelyek fokozzák a kötési affinitást vagy az oligomer áthatolási tulajdonságait [például 5-metil-citozin, 5’-(l-propinil)-uracil, 5-(l-propinil)-citozin], Idetartoznak az olyan oligomerek is, amelyek a nukleomonomer maradékokat hidroxamátkötésen keresztül kötve tartalmazzák.

Oligomerek szintézise

A találmány szerinti oligomerek képezhetők csak a találmány szerinti nukleomonomerekből vagy más szokásos nukleomerekkel kombinálva ezekből, és ismert szilárdfázisú- (vagy oldatban végzett) oligomerszintézis-módszerekkel szintetizálhatok, amelyek kereskedelemben hozzáférhetők. Általánosságban a találmány szerinti oligomerek a következő lépéseket tartalmazó módszerrel szintetizálhatok: szintetizálunk egy nukleomonomert vagy oligomer szintont, amely tartalmaz védőcsoportokat és bázist, és egy kapcsolócsoportot, amely az oligomerhez vagy a nukleomonomerhez képes kapcsolódni; összekapcsoljuk a nukleomonomert vagy oligomer szintont egy akceptor-nukleomonomerré vagy akceptoroligomerré; eltávolítjuk a védőcsoportokat; és a ciklust annyiszor ismételjük, amennyi az oligomer szintéziséhez szükséges.

A találmány szerinti oligomerek bármilyen hosszúságúak lehetnek, így például 40, 50, 100, 200 vagy 500 nukleomert vagy ennél többet tartalmazhatnak. Az előnyös oligomerek általában 2-30 nukleomonomert tartalmaznak. A körülbelül 8-20 nukleomonomer vagy ennél nagyobb hosszúságú oligomerek alkalmasak lehetnek terápiás vagy diagnosztikai alkalmazásra, feltéve, hogy megfelelő bázisszekvenciával rendelkeznek. A 2, 3, 4, vagy 5 nukleomonomert tartalmazó rövid oligomerek különösen beletartoznak a találmány tárgykörébe, és szintűnként alkalmazhatók.

A véletlenszerű szekvenciával rendelkező, 6, 7 vagy 8 nukleomonomert tartalmazó oligomerek olyan klónozó- vagy amplifikálóeljárásokban printerként alkalmazhatók, ahol véletlenszerű szekvenciával rendelkező printereket alkalmaznak, feltéve, hogy az oligomer a 3’ végnél egy vagy két olyan maradékot tartalmaz, amelyek a polimerázok vagy reverz transzkriptázok számára printerként szolgálhatnak, vagy egyébként nem interferálnak a polimerázaktivitással.

A találmány szerinti oligomerek - az itt először ismertetett kötések mellett - tartalmazhatnak szokásos foszfodiészter-kötéseket vagy más helyettesített kötéseket, például foszforamidit-kötéseket. Az ilyen helyettesített kötések például, de nem kizárólag, az

HU 218 086 Β

-O-P(O)(S)-O- (foszforotioát), -O-P(O)(NR₂)-X², -O-P(O)(R)-O-, -O-P(S)(R)-O- (tiono-alkilfoszfonát), -P(O)(OR⁹)-X², -O-C(O)-X² vagy -O-C(O)(NR₂ ^U)-X², ahol R¹¹ jelentése H (vagy egy só) vagy 1-12 szénatomos alkilcsoport (beleértve a metil- és etilcsoportot), és R⁹ jelentése 1-9 szénatomos alkilcsoport, és a kötés a szomszédos nukleomonomerhez egy oxigén- vagy kénatomon keresztül kapcsolódik a nukleomonomer szénatomjához, és X² jelentése oxigénvagy kénatom. A foszforotioát- és foszfodiészter-kötések jól ismertek. A találmány szerinti oligomerekben alkalmazható, különösen előnyös kötések a foszfodiészter, foszforotioát, metil-foszfonát és tiono-metil-foszfonát helyettesített kötések. A foszforotioát és metil-foszfonát helyettesített kötések további stabilitást adnak az oligomereknek. Különösen előnyös oligomerek azok, amelyek egy vagy több foszforotioát vagy metil-foszfonát helyettesített kötést tartalmaznak.

A találmány szerinti oligomerek vagy azok szegmensei szakember számára ismert módszerekkel szintetizálhatok. Az ismert szintézismódszerek, valamint az itt ismertetett módszerek alkalmazhatók olyan oligomerek szintetizálására, amelyek a találmány szerinti helyettesített kötést, valamint más kötéseket vagy ismert helyettesített kötéseket tartalmaznak, kiindulási anyagként megfelelően alkalmasan védett nukleomonomereket alkalmazva. Az olyan oligomerek szintetizálására szolgáló módszereket, amelyek foszfort tartalmazó kötéssel rendelkeznek, például a következő irodalmi helyek ismertetik: Froehler B. et al., Nucleic Acids Rés., 14., 5399-5467. (1986); Nucleic Acids Rés., 16., 4831-4839. (1988), Nucleosides & Nucleotides, 6., 287-291. (1987); Froehler B., Tetrahedron Letters, 27., 5575-5578. (1986); Caruthers Μ. H„ in Oligodeoxynucleotides Antisense Inhibitions of Gene Expression (1989), J. S. Cohen, szerk., CRC Press, Boca Raton, 7-24. oldal; Reese C. B. et al., Tetrahedron Letters, 26., 2245-2248. (1985). A metil-foszfonát-kötéseket tartalmazó oligomerek szintézisét például a következő helyen ismertetik: Agrawal S. et al., Tetrahedron Letters, 28., 3539-3542. (1987), Klem R. E. et al., WO 92/07864.

A találmány szerinti kötéseket tartalmazó oligomerek úgy is szintetizálhatok, hogy oldatban dimer vagy trimer vegyületeket szintetizálunk, majd a szintonokat olyan származékokká alakítjuk, amelyeket az oligomerekbe szilárd fázisú szintézissel vagy oldatban beépítünk. Tipikus színtanok például az 5’-DMT-vel vagy MMT-vel védett 3’-foszfonát- vagy foszforamidát-származékok, amelyeket standard műszerekkel állíthatunk elő [Gait M. J. ed., Oligonucleotide Synthesis; A. Practical Approach, IRL Press, Oxford (1984)].

A találmány tárgykörébe tartozó színtanok lehetnek dimerek, trimerek, tetramerek, hexamerek és hosszabb oligomerek, amelyeket szilárd fázisú vagy oldatban végzett szintézissel állítunk elő. A trimerek és a hosszabb szintonok többféle típusú kötést tartalmazhatnak. A szintonok tartalmazhatnak bármilyen bázist, illetve 2’-, 3’-, 4’- és 5'-csoportokat, például OH, DMTO, MMTO, Ο-allil-, foszfát-, foszfonát- vagy amiditcsoportokat, amint a fentiekben ismertettük.

A ribóz-amid oligonukleotidok standard szilárd fázisú peptidszintézis (Fmoc-kémia) körülményei között szintetizálhatok (lásd a 26. ábrát).

A találmány szerinti vegyületek szintéziséhez alkalmazható blokkolócsoportok

1. Kapcsolócsoportok

Alkalmas kapcsolócsoportok például a H-foszfonát-, metil-foszfonamidit- és a foszforamidit-csoportok. Alkalmazható foszforamidit-csoportok például a β-ciano-etil-foszforamidit-csoportok. Metil-foszfonamidit- és alkil-foszfonamidit-csoportok (beleértve az etil-foszfonamidit- és propil-foszfonamidit-csoportokat is) szintén alkalmazhatók. Foszforamidit-csoportokat mutatunk be például az 1-21. ábrán.

Az oligomerek foszforamidit-triészter-módszerrel történő szintézisénél a 2’-, 3’-, 4’- és 5'-helyzetekben alkalmas kapcsolócsoportok például N,N-diizopropil-aminoβ-ciano-etoxi-foszfm, N,N-diizopropil-amino-metoxifoszftn-, Ν,Ν-dietil-amino-ciano-etoxi-foszfm- és (Nmorfolino)-metoxi-foszfm-csoport [Moore M. F. et al., J. Org. Chem., 50., 2019-2025. (1985); Uznanski A. W. et al., Tetrahedron Letters, 28., 3401-3404. (1987); Bjergarde K. et al., Nucl. Acids. Rés., 19., 5843-5850. (1991); Dahl O., Sulfur Reports, 11., 167-192. (1991)]. Hasonló kapcsolócsoportok, például az N,N-diizopropilamino-metil-foszfin- és az N,N-dietil-amino-metil-foszfin-csoport szintén alkalmazható metil-foszfonátok előállítására. Metil-foszfonát-oligomerek olyan kapcsolócsopoilok alkalmazásával is szintetizálhatok, mint például az Ν,Ν-diizopropil-amino-metil-foszforamidit. A találmány szerinti nukleomonomer amiditok előállítása szokásos módszerekkel végezhető [lásd például Gryaznov S. M. et al., Nucl. Acids Rés., 20., 1879-1882. (1992); Vinayak R. et al., Nucl. Acids Rés., 20., 1265-1269. (1992); Sinha N. D. et al., Nucl. Acids Rés., 12., 4539-4557. (1984), és további idézett hivatkozások].

2. Védőcsoportok

A citozin-, adenin- és guaningyűrűn kívüli nitrogénjének védésére alkalmazható védőcsoportok például a diizobutil-formamidin-, benzoil-, izobutiril-, FMOC-, dialkil-formamidin-, dialkil-acetamidin- és egyéb, a technika állása szerint ismert védőcsoportok. A citidin közvetlenül is beépíthető az oligomerekbe, a gyűrűn kívüli nitrogén védelme nélkül, amint azt a következő helyeken ismertetik: Gryaznov S. M. et al., J. Amer. Chem. Soc., 113., 5876-5877. (1991); Gryaznov S. M. et al., Nucl. Acids Rés., 20., 1879-1882. (1992); KungP.-P. et al.. Tetrahedron Letters, 33., 5869-5872. (1992).

Az 5’-végen alkalmazható védőcsoportok például DMT (dimetoxi-tritil-), Bz (benzoil-), Bu (izobutiril-), fenoxi-acetil-, MMT (monometoxi-tritil-) és FMOC-csoportok, a 3'-végen továbbá a hidrogén-foszfonát-, metilfoszforamidit-, metil-foszfonamidit-, β-ciano-etil-foszforamidit-, TBS- (terc-butil-dimetil-szilil-) és TBDPS(terc-butil-difenil-szilil-) csoportok.

Az 5'-végen alkalmazható előnyös védőcsoportok Bz (benzoil-), DMT- (dimetoxi-tritil-), MMT- (monometoxi-tritil-) és FMOC-csoport, a 3'-végen továbbá TBS-, hidrogén-foszfonát-, metil-foszforamidit-, metilfoszfonamidit-, β-ciano-etil-foszforamidit-csoport.

HU 218 086 Β

A blokkolócsoport helyzete azonban szükség szerint változtatható (például az 5’-helyzetben foszforamidit-csoport és a 3 ’-helyzetben DMT). A találmány szerinti nukleomonomerek és oligomerek a technika állása szerint ismert módszerekkel láthatók el ilyen blokkolócsoportokkal.

Konjugátumok

A találmány tárgykörébe tartoznak a találmány szerinti oligomerek konjugátumai is. A szokásos oligomerek konjugátumai a szakember számára jól ismertek, így például a találmány szerinti oligomerek különböző csoportokhoz, például interkalátorokhoz és olyan vegyületekhez kapcsolhatók kovalens módon, amelyek specifikusan kölcsönhatásba lépnek a DNS kettős hélix kisebbik hurkával. A találmány szerinti oligomerekkel képzett konjugátumokhoz alkalmas csoportok továbbá a jelzőanyagok (például radioaktív, fluoreszcens, enzim), vagy az olyan csoportok, amelyek elősegítik a sejttel való asszociálódást lehasítható kapcsolóanyagok által stb. Radioaktív jelzőanyagok például ³²P, ³⁵S, ³H, ¹³¹H és ¹⁴C; alkalmas fluoreszcens jelzőanyagok például a fluoreszcein, rezorufin, rodamin, BODIPY (molekuláris próba) és a Texas-vörös; alkalmas enzimek például az alkalikus foszfatáz és a torma-peroxidáz. További, kovalens kapcsolócsoportok kialakítására alkalmas vegyületek például a biotin, antitestek vagy antitest-ffagmensek, aszialoglikoprotein, transzferrin és a HÍV Tat protein szintén kovalensen kapcsolhatók a találmány szerinti oligomerekhez.

Ezek a csoportok bármilyen alkalmas csoporton keresztül kapcsolhatók. így például az interkalátorok, például az akridin vagy pszoralén, a találmány szerinti oligomerekhez bármelyik OH- vagy SH-csoporton keresztül kapcsolhatók, így például az oligomer 5'-helyzetében, az RNS 2'-helyzetében vagy a piridin 5-helyzetébe bevitt OH-, NH₂-, COOH- vagy SH-csoporton keresztül. Előnyös egy olyan forma, amely például a pirimidinek 5-helyzetében CH₂CH₂CH₂OH- vagy CH₂CH₂CH₂SH-csoportot tartalmaz. A polilizint vagy lizint tartalmazó konjugátumok ismert módon szintetizálhatok, ezek tovább fokozhatják az oligomer kötési aktivitását a megcélzott nukleinsavszekvenciához [Lemaitre M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84., 648-652. (1987); Lemaitre M. et al., Nucleosides and Nucleotides, 6., 311-315. (1987)].

Számos helyettesítő kapcsolható, többek között olyanok, amelyek kötőcsoporton vagy helyettesített kötőcsoporton keresztül kapcsolódnak. Az oligomerek OHcsoportjai kicserélhetők foszfátcsoportokkal, védhetők szokásos védőcsoportokkal vagy kapcsolhatók kapcsolócsoportokkal további kötések kialakítására más nukleomonomerekhez, vagy köthetők konjugált helyettesítőkhöz. Az 5'-terminális hidroxilcsoport foszforilezhető, a 2'-hidroxilcsoport vagy a 3'-terminális hidroxilhelyettesítők szintén foszforilezhetők. A hidroxilcsoportok szokásos védőcsoportokkal is helyettesíthetők.

A találmány szerinti oligomerek kovalensen kapcsolhatók olyan csoportokhoz, amelyek elősegítik a sejtekkel való asszociálódást, lehasítható kapcsolócsoportokon keresztül. Az alkalmas konjugátumok közé tartoznak az oligomerszintézishez alkalmazott szilárd hordozók, továbbá az olyan szilárd hordozók, amelyek elősegítik a nukleinsavszekvenciák detektálását. Szilárd hordozók például - nem kizárólag - a szilikagél, szabályzóit pórusméretű üveg, polisztirol és mágneses üveggyöngyök.

Módosítások a cukorrészben

Származékok készíthetők úgy, hogy a cukorrészben alakítunk ki helyettesítést. A találmány szerinti oligomerek előnyös származékai között a 2’-O-allil- vagy a 3'-allilcsoport fokozza az áthatolási képességet és a nukleázok által végzett bontással szembeni stabilitást, de nem csökkenti az oligomerek affinitását az egyszálú vagy kétszálú célvegyületekkel szemben. Közelebbről, a ribóz-amid láncot tartalmazó oligonukleotidok esetén különböző funkciós csoportok vihetők be a ribózrész 1’-, 2’-, 3’-, 4’- és 5'-helyzetében a megfelelő oligonukleotidok farmakokinetikus tulajdonságainak javítására.

Szubsztituált kötések

A találmány szerinti oligomerek tartalmazhatnak egy vagy több szubsztituált kötést is a 2’-5’, a 3’-5’ és a 4'-5' kötések mellett. Az ilyen szubsztituált kötések például foszforotioát, metil-foszfonát, tiono-metilfoszfonát, foszforoditioát, alkil-foszfonátok, morfolinoszulfamid, borán-foszfát [-O-P(OCH₃)(BH₃)-O-], sziloxán [-O-Si(X⁴)(X⁴)-O-]; X⁴ jelentése 1-6 szénatomos alkil vagy fenil] és foszforamidát {metoxi-etilamin [-O-P(OCH₂CH₂OCH₃)(O)-O-]} stb. Ezek a szakirodalomban ismert módon szintetizálhatok [Sood A. et al., J. Am. Chem. Soc., 112., 9000-9001. (1990); WO 91/08213, WO 90/15065; WO 91/15500; Stirchak E. P. et al., Nucleic Acids Rés., 17., 6129-6141. (1989); US 5 034 506; US 5 142 047; Hewitt J. M. et al., Nucleosides and Nucleotides, 11., 1661-1666. (1992); Summerton J. et al., WO-216 860]. A találmány szerinti oligomerekben alkalmazható szubsztituált kötések például szulfonamid- (-O-SO₂-NH-), szulfid(-CH₂-S-CH₂-), szulfonát- (-O-SO₂-CH₂-), karbamát- [O-C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-], dimetil-hidrazino- (-CH₂-NHC₃-), szulfamát- [-O-S(O)(O)-N; -N-S(O)(O)-N-], 3’-amin- (-NH-CH₂-), N-metilhidroxil-amin- (-CH₂-NCH₃-O-) és 2’-5’ kötések {például 2’,5’-karbamát [2’-N(H)-C(O)-5’], 5’,2’-karbamát [2’-O-C(O)-N(H)-5’], 5’,2’-metil-karbamát [2'-O-C(O)-N(CH₃)-5’] és 5’,2’-tioformacetál (2’-O-CH₂-S-5’)}. További szubsztituált kötések a következő irodalmi helyeken ismertetett amidkötések (Buchardt O. et al., WO 92/20702; Cook P. D. et al., WO 92/20822, De Mesmaeker A. et al., WO 92/20823, továbbá PCT/US92/04294).

Hacsak másképpen nem jelezzük, az alkalmas kötések, például a formacetálkötés, -O-CH₂-O- vagy a bal oldali nukleomonomer 4’-, 3’-, 2’-helyzetű szénatomjához vagy a jobb oldali nukleomonomer 5'-helyzetű szénatomjához kapcsolódnak. A 4’-, 3’-, 2’-, illetve 5'-helyzetű szénatomjelölés megfelelően módosítható, ha ribóztól, dezoxi-ribóztól vagy arabinóztól eltérő szerkezet kapcsolódik a szomszédos nukleomonomerhez. Ilyen szerkezet például a xilóz, hezóx, morfolinogyűrű, karbociklusos gyűrű (például ciklopentán) stb.

HU 218 086 Β

A karbamát-, karbonát-, szulfid-, szulfoxid-, szulfon-, N-metil-hidroxil-amin- és dimetil-hidrazino-kötések alkalmazása szintonokban vagy oligomerekben ismeretes például a Vaseur, J-J. et al., J. Amer. Chem. Soc., 114., 4006-4007. (1992); WO 89/12060; Musicki B. et al., J. Org. Chem., 55., 4231-4233. (1990); Reynolds R. C. et al., J. Org. Chem., 57., 2983-2985. (1992); Mertes Μ. P. et al., J. Med. Chem., 12., 154-157. (1969); Mungall W. S. et al., J. Org. Chem., 42., 703-706. (1977); Stirchak E. P. et al., J. Org. Chem., 52., 4202-4206. (1987); Wang H. et al., Tetrahedron Letters, 32., 7385-7388. (1991); PCT/US91/03680 irodalmi helyekről. A szubsztituált kötések az oligomerekben számos célra alkalmazhatók, így például a komplementer megcélzott nukleinsavszekvenciához való kötődés további fokozására és/vagy a nukleázokkal szembeni stabilitás fokozására.

Bázisok

A találmány szerinti vegyületekben alkalmazható nukleozidbázisokként alkalmas bázisok nemcsak a természetben előforduló purin- és pirimidinbázisok, hanem ezek analógjai és tautomer formái. Ilyen analógok például az alkilezett purinok és pirimidinek, acilezett purinok és pirimidinek, és további heterociklusos vegyületek. Az ilyen analóg purinok és analóg pirimidinek a technika állása szerint ismertek, ezek közül némelyik kemoterápiás szerként alkalmazható. Idetartoznak - nem kizárólag -: N⁴N⁴-etán-citozin, 7-dezaza-xantozin, 7-dezaza-guanozin, 8-oxo-N⁶-metil-adenin, 4-acetil-citozin, 5-(karboxi-hidroxi-metil)-uracil, 5-fluor-uracil, 5-brómuracil-, 5-karboxi-metil-amino-metil-2-tiouracil, 5-karboxi-metil-amino-metil-uracil, inozin, N⁶-izopenteniladenin, 1-metil-adenin, 2-metil-guanin, 5-metil-citozin, N⁶-metil-adenin, 7-metil-guanin, 5-metil-amino-metiluracil, 5-metoxi-amino-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4tiouracil, 5-(l-propinil)-4-tiouracil, 5-(l-propinil)-2tiouracil, 5-(l-propinil)-2-tiocitozin, 2-tiocitozin és 2,6diamino-purin. A találmány szerinti oligomerekben alkalmazhatók továbbá a WO 92/02258 számú dokumentumban ismertetett 6-aza-citozin, 6-aza-timidin és 5-trifluormetil-uracil.

A 4-tiouridin és a 2-tiotimidin oligomerekbe való bevitelét ismertették például a következő irodalmi helyeken [Nikiforov T. T. et al., Tetrahedron Letters, 33., 2379-2382. (1992); Clivio, P. et al., Tetrahedron Letters, 33., 65-68. (1992); Nikiforov T. T. et al., Tetrahedron Letters, 32., 2505-2508. (1991); Xu Y.-Z. et al., Tetrahedron Letters, 32., 2817-2820. (1991); Clivio P. et al., Tetrahedron Letters, 33., 69-72. (1992); Connolly B. A. et al., Nucl. Acids. Rés., 17., 4957-4974. (1989)]. Előnyös bázisok az adenin, guanin, timin, uracil, citozin, 5-metil-citozin, 5-(l-propinil)-uracil, citozin, 5-metilcitozin, 5-(l-propinil)-uracil, 5-(l-propinil)-citozin, 8oxo-N⁶-metil-adenin, 7-deaza-7-metil-guanin, 7-dezaza7-metil-adenin és 7-dezaza-xantozin.

Kovalens kötőcsoport

A találmány szerinti oligomerek némelyikébe olyan csoportot viszünk be, amely alkalmas arra, hogy legalább egy kovalens kötést alakítson ki az oligomer és a duplex között. Többszörös kovalens kötés szintén kialakítható ilyen keresztkötéseket alakító csoportok többszörös alkalmazásával. A kovalens kötést előnyösen a megcélzott szál egy bázisával alakítjuk ki, de a célvegyület más részével is kialakítható, így például a szachariddal vagy a foszfodiészterrel. A keresztkötést kialakító csoport reakciójának természete meghatározza a duplexben lévő célvegyület természetét. Előnyös, keresztkötést képező csoportok például az acilező- és alkilezőszerek, és különösen az olyan csoportok, amelyek a szekvenciaspecifitáshoz hozzájáruló részhez képest úgy helyezkednek el, hogy lehetővé tegyék a szálban a megcélzott helyzettel való reakciót.

Nyilvánvaló, hogy a heterociklusos csoportnak nem szükséges purin- vagy pirimidincsoportnak lennie, valójában a pszeudobázisnak, amelyhez a reaktív funkciós csoportot kapcsoljuk, egyáltalán nem szükséges heterociklusos vegyületnek lennie. A reaktív csoport kapcsolására bármilyen eszköz megfelelő mindaddig, amíg a pozicionálás helyes.

Az oligomerek polaritása

A legáltalánosabb értelemben véve a 3’-—5’ jelölés az oligomemek egy olyan kiterjedését jelenti, ahol a kötések a bal oldali nukleomonomer aminosavmaradékának 5’-hidroxilcsoportja és a jobb oldali nukleomonomer aminosavmaradékának 3’-hidroxilcsoportja (illetve 2’- a 2’-5’ kötéseket tartalmazó oligomerek esetén, illetve 4’-hidroxilcsoport a 4’-5’ kötéseket tartalmazó oligomerek esetén) között vannak kialakítva (azaz egy egyforma polaritású terület), így a nukleomonomer jobb oldali utolsó aminosavának 5’-hidroxilcsoportja szabadon marad a további konjugáláshoz. Hasonlóképpen az 5’—3’ jelölés egy oligomerkiterjedés ellentétes orientációját jelöli, ahol a bal oldali nukleomonomer aminosavának 3’-hidroxilcsoportja és a jobb oldali nukleomonomer aminosavmaradékának 5’-hidroxilcsoportja között van kialakítva a kötés, így a jobb oldali legutolsó nukleomonomer 3’-hidroxilcsoportja szabadon marad további konjugálásra. Hasonló igaz az 5’—4’ oligomer-kiterjedésre is.

Farmakológiailag elfogadható sók

A találmány kiterjed az ismertetett vegyületek különböző sóira, beleértve a farmakológiailag elfogadható sókat is, állatnak, illetve embernek történő adagolás céljára. A farmakológiailag elfogadható sók és az ilyen sók előállításának módja a technika állása szerint jól ismertek. Farmakológiailag elfogadható sók előnyösen a találmány szerinti oligomerek fém-, illetve ammóniumsói, beleértve az alkálifém- és alkálifoldfémsókat, például a nátrium-, kálium-, magnézium-, illetve kalciumsókat, továbbá a könnyen kristályosítható, ammóniával, illetve szerves aminokkal, például mono-, di- vagy tri(alkil-, cikloalkil- vagy hidroxi-alkil)-amidokból származó ammóniumsókat, a rövid szénláncú alkilén-diaminokkal vagy rövid szénláncú hidroxil-alkil- vagy aralkil-alkil-ammónium-bázisokból származó sók, például metil-amin, dietil-amin, trietil-amin, diciklohexilamin, trietanol-amin, etilén-diamin, trisz(hidroxi-metil)-amino-metán vagy benzil-trimetil-ammónium-hidroxid. A találmány szerinti oligomerek savaddíciós sókat is képezhetnek, e célra alkalmasak a terápiásán elfo16

HU 218 086 Β gadható szervetlen és szerves savak, például erős ásványi savak, például sósav vagy hidrogén-bromid, kénsav, foszforsav, alifás vagy aromás karbociklusos szulfonsavak, például hangyasav, ecetsav, propionsav, borostyánkősav, glikolsav, tejsav, maleinsav, borkősav, glukonsav, citromsav, aszkorbinsav, fumársav, hidroximaleinsav, piroszőlősav, fenil-ecetsav, benzoesav, 4amino-benzoesav, antraciklinsav, 4-hidroxi-benzoesav, szalicilsav, 4-amino-szalicilsav, metánszulfonsav, etánszulfonsav, hidroxi-etánszulfonsav, benzolszulfonsav, szulfanilsav, ciklohexil-szulfámsav stb.

Alkalmazás és adagolás

Mivel a találmány szerinti oligomerek jelentős mértékben képesek a megcélzott egyszálú vagy kettős szálú nukleinsavakra kötőaktivitást kifejteni és a természetben előforduló polinukleotidokkal és szerkezeti analógjaikkal duplexet, triplexet vagy más stabil asszociációs képződményt kialakítani, ezért a találmány szerinti oligomerek alkalmazhatók a legtöbb olyan eljárásban, amelyekben szokásosan oligomereket használunk. így a találmány szerinti oligomerek alkalmazhatók például polinukleotidhibridizációs próbaként, polimeráz láncreakciókban (és hasonló ciklikus amplifikációs reakciókban) láncindítóként (primerként), szekvenálóprimerként stb. A találmány szerinti oligomerek alkalmazhatók továbbá betegségek diagnosztizálására és terápiájára. A találmány szerinti oligomerek terápiás alkalmazása lehet például az antiszensz oligomerek alkalmazásával olyan gének expressziójának specifikus gátlása (vagy ezen gének által kódolt RNS-szekvenciák transzlációjának gátlása), amelyek kapcsolatosak a patológiás állapot keletkezésével vagy fennállásával. A találmány szerinti oligomerek számos genetikai célpont antiszensz gátlását közvetíthetik. A találmány szerinti antiszensz oligomerek által megcélozható gének, illetve az ezen gének által kódolt RNS-ek például olyan oligomerek, amelyek enzimeket, hormonokat, szérumproteineket, transzmembránproteineket, tapadómolekulákat (LFA-1, GPII_b/III_a, ELAM-1, VACM-1, ICAM-1, E-szelekció stb.), receptormolekulákat, beleértve a citokinreceptorokat, citokinokat (IL—1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6 stb.), onkogéneket, növekedési faktorokat és interleukinokat kódolnak. A megcélzott gének, illetve RNS-ek bármilyen patológiás állapottal lehetnek kapcsolatosak, így gyulladásos állapotokkal, kardiovaszkuláris rendellenességekkel, immunreakciókkal, rákkal, vírusos fertőzésekkel, bakteriális fertőzésekkel, élesztőfertőzésekkel, parazitás fertőzésekkel stb.

A találmány szerinti oligomerek mind in vivő, mind ex vivő terápiás felhasználásra alkalmasak. Ex vivő alkalmazás lehet például sejtek, például csontvelő- vagy perifériás vérsejtek leukémiás (krónikus mielogén leukémiás, akut limfocitás leukémiás) vagy vírusos fertőzéses állapotban történő kezelése. Rák kezelésében megcélzott gének vagy az ilyen gének által kódolt RNS-ek lehetnek például onkogének, például ras, k-ras, bcl-2, c-myb, bcr, c-myc, c-abl, vagy túlzott mértékben expresszált szekvenciák, például mdm2, onkosztatin M, IL-6 (Kaposi-szarkóma), HER-2 és transzlokációk, például bcr-abl. Vírusgén-szekvenciák, illetve az ilyen gének által kódolt RNS-ek, mint például herpeszvírusok, például CMV, HSV-1, HSV-2, retrovírusok, például HTLV-1, HIV-1, HIV-2 vagy más DNS- vagy RNS-vírusok, például HBV, HPV, VZV, influenzavírus, adenovírusok, flavivírusok, rinovírusok stb. polimeráz vagy reverz transzkriptáz génjei szintén alkalmas célok lehetnek. A specifikusan kötődő oligomerek alkalmazása más terápiás kezelésekkel együtt történhet. A találmány szerinti oligomerek további terápiás alkalmazása lehet például 1. gyulladásos válaszreakciók módosítása gének, például az IL— 1 receptor, IL—1, ICÁM-1 vagy E-szelekciós gének expressziójának módosításával, amelyek szerepet játszanak a gyulladás közvetítésében, illetve 2. a sejtproliferáció módosítása olyan állapotok, mint például artériaelzáródás (resztenozis) érplasztika után a) a növekedés vagy a mitogén faktorok, például nem izom eredetű miozin, myc, fox, PCNA, PDGF vagy FGF és receptoraik, vagy b) sejtproliferációs faktorok, például c-myb expressziójának módosításával. További alkalmas proliferációs faktorok vagy szignáltranszdukciós faktorok, például TGFa, IL -6, gINF, protein-kináz C, tirozin-kinázok (például p210, pl90) szintén megcélozhatok pszoriázis vagy más állapotok kezelésekor. Emellett autoimmunbetegségekben EGF receptor, TGFa vagy MHC allélek is megcélozhatok.

A találmány szerinti oligomerek sejtekbe történő bejuttatása elősegíthető bármilyen módszerrel, például kalcium-foszfát, DMSO, glicerin vagy dextrán jelenlétében végzett transzfekcióval, elektroporációval vagy kationos, anionos és/vagy semleges lipidkészítményekkel vagy liposzómákkal, a WO 90/14074, WO 91/16024, WO 91/17424 számon publikált nemzetközi szabadalmi bejelentésekben vagy az US 4 897 355 számú szabadalmi leírásban ismertetett módon. Az oligomerek kationos lipidekkel, például DOTMA segítségével (amely lehet liposzómás vagy nem liposzómás formában) történő komplexképzéssel, és a komplexeknek a sejtekkel történő érintkeztetésével juttathatók be a sejtekbe. Alkalmas kationos lipidek például - de nem kizárólag - az N{2.3-di[9-(Z)-oktadecenoil-oxi]} -prop-1 -il-N,N,N-trimetil-ammónium (DOTMA) és sói, l-O-oleil-2-Ooleil-3-dimetil-amino-propil-P-hidroxi-etil-ammónium és sói, valamint a 2,2-bisz(oleil-oxi)-3-(trimetil-ammónio)-propán és sói.

A találmány szerinti oligomerek szállítását fokozhatjuk a következő anyagok alkalmazásával: i) vírusok, például Sendai-vírus [Bartzatt R., Biotechnoi. Appl. Biochem., 11., 133-135. (1989)] vagy adenovírus [Wagner E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89., 6009-6013. (1992)]; ii) olyan vegyületek, mint például polilizin, protamin vagy Na,N₁₂-dietil-spermin poliamin- vagy polikationkonjugátumai [Wagner E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88., 4255-4259. (1991); Zenke M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87., 3655-3659. (1990); Chank Β. K. et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun., 157., 264-270. (1988); US-5 138 045]; iii) olyan vegyületek, mint például lipospermin lipopoliamin-komplexei [Behr J. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86., 6982-6986. (1989);

HU 218 086 Β

Loeffler J. P. et al., J. Neurochem., 54., 1812-1815. (1990)]; ív) anionos, semleges vagy pH-érzékeny lipidek, beleértve az anionos foszfolipideket is, például foszfatidil-glicin, kardiolipin, foszfatidsav vagy foszfatidil-etanol-amin [Lee K. D. et al., Biochem. Biophys. ACTA, 1103., 185-197. (1992); Cheddar G. et al., Arch. Biochem. Biophys., 294., 188-192. (1992); Yoshimura T. et al., Biochem. Int., 20., 697-706. (1990)]; v) olyan vegyületek konjugátumai, mint például transzferrin vagy biotin; vi) proteinek (beleértve az albumint és az antitesteket), glikoproteinek vagy olyan polimerek (beleértve a polietilénglikolt) konjugátumai, amelyek fokozzák a kezelt személyben az oligomerek farmakokinetikai tulajdonságait.

Transzfekció alatt olyan módszert értünk, amely alkalmas az oligomerek sejtekbe történő bejuttatására. Az olyan reagenseket, mint például a lipidek, vagy az olyan ágneseket, mint például a vírusok, amelyek a transzfekciós eljárásokban alkalmazhatók, együttesen „behatolást elősegítő ágens”-nek nevezzük. Az oligomerek sejtekbe való bejuttatása történhet más nukleinsavakkal, például i) expresszálható, protein(eke)t vagy proteinfragmenseket kódoló DNS-fragmensekkel vagy ii) transzlatálható, protein(eke)t vagy proteinfragmenseket kódoló RNS-ekkel együtt végzett kotranszfekcióval.

A találmány szerinti oligomerek tehát bármely olyan alkalmas formába hozhatók, amely elősegíti az oligomerek sejtekbe történő bejuttatását. Alkalmas gyógyszerformák közé tartoznak a szokásos olyan alkalmazási formák, amelyeket vegyületek topikális alkalmazás útján sejtekbe vagy szövetekbe történő bejuttatására alkalmaznak. Az oligomereket tartalmazó gyógyszerkészítményekben alkalmazhatunk olyan vegyületeket, mint például polietilénglikol, propilénglikol, azon, nonoxonil-9-oleinsav, dimetil-szulfoxid, poliaminok vagy lipopoliaminok.

A találmány szerinti oligomerek olyan kutatási vagy termelési célokra alkalmazhatók reagensekként, ahol a génexpresszió gátlása kívánatos. Jelenleg nagyon kevés olyan reagens hozzáférhető, amely bármilyen mechanizmussal hatékonyan és specifikusan gátolja a megcélzott gén expresszióját. A korábban a megcélzott gének expresszálásának gátlására javasolt oligomerek gyakran nem specifikus hatással rendelkeztek, és/vagy nem csökkentették a megcélzott gén expresszióját kellően alacsony szintre (a nem gátolt szint körülbelül 40%-a alá).

A találmány szerinti oligomerek olyan reagensek, amelyek egy kiválasztott protein vagy proteinek expresszióját gátló módszerben alkalmazhatók egy személyben vagy sejtekben, ahol az illető proteineket DNS-szekvenciák kódolják, és a proteinek RNS-szekvenciákról transzlatálódnak, a módszer a következő lépéseket foglalja magában: egy találmány szerinti oligomert a sejtekbe juttatunk, lehetővé tesszük, hogy az oligomer triplexet képezzen a DNS-sel vagy RNS-sel, vagy duplexet képezzen a DNS-sel vagy RNS-sel, miáltal a protein vagy proteinek expressziója gátlódik. A találmány szerinti vegyületek és módszerek alkalmasak arra, hogy a génexpressziót módosítsák mind prokarióta-, mind eukariótasejtekben, így baktérium-, gombaparazita-, élesztő- és emlőssejtekben.

RN-áz H „kompetens” vagy RN-áz H „inkompetens” oligomerek könnyen tervezhetők a találmány szerinti helyettesített kötések alkalmazásával. Az RN-áz H kompetens oligomerek egy vagy több RN-áz H kompetens domént tartalmazhatnak kapcsolt RN-áz H kompetens nukleomonomerekben. Az olyan oligomerek, amelyek módosításokat tartalmaznak például a 2'-helyettesítésekben (2’-O-allil-csoport stb.) vagy bizonyos nem módosított kötéseket (metil-foszfonát, foszforamidát stb.) általában inkompetensek szubsztrátként, azaz az RN-áz H ezeket felismeri és/vagy hat rájuk. Az RNáz H kompetencia elősegítheti az antiszensz oligomer funkcióját azáltal, hogy degradálja a megcélzott RNS-t az RNS-oligomer duplexben [Dagle J. M. et al., Nucl. Acids Rés., 18., 4751-4757. (1990); Walder J. A. et al., WO 89/05358], Az enzim hasítja az RNS-t az RNS-DNS duplexekben.

Ahhoz, hogy egy oligomer RN-áz H kompetenciája megmaradjon, az szükséges, hogy három vagy több kompetens összefüggő nukleomonomerből álló RN-áz H kompetens dómén legyen benne [Quartin R. S. et al., Nucl. Acids Rés., 17., 7253-7262. (1989)]. Nukleázok által okozott lebontással szemben rezisztens oligomereknek terminális kötést, a cukorrészben és/vagy a bázisban olyan módosítást kell tartalmazniuk, amelyek befolyásolják a nukleázokkal szembeni rezisztenciát. így az oligomereket megtervezhetjük úgy, hogy módosított nukleomonomer maradékokat tartalmazzanak vagy az 5’-, vagy a 3’-végen, vagy mindkét végen, miközben közbülső RN-áz H kompetens domént tartalmazzanak. Az RN-áz H kompetenciát megtartó oligomerek például általában egyforma polaritással rendelkeznek és körülbelül 2-12 nukleomonomert tartalmaznak az 5’és a 3’-végen, ami stabilizálja az oligomert a nukleázok általi lebontással szemben, és körülbelül 3-26 nukleomonomert, amelyek RN-áz H kompetens doménként funkcionálnak az RN-áz H inkompetens 3’- és 5'-végek között. Egy ilyen oligomer változatai lehetnek például 1. egy rövidebb RN-áz H kompetens dómén, amely egy vagy két RN-áz H kompetens kötést vagy helyettesített kötést tartalmaz, 2. egy hosszabb RN-áz H inkompetens dómén, amely 15, 20 vagy több helyettesített kötést vagy nukleomonomert tartalmaz, 3. egy hosszabb RN-áz H kompetens dómén, amely 30, 40 vagy több kötést tartalmaz, 4. olyan oligomerek, amelyek egyetlen RN-áz H inkompetens domént tartalmaznak a 3’-végnél vagy az 5’-végnél.

A mindössze 8 nukleomonomert tartalmazó oligomerek megcélzott proteinek expressziójának gátlására használhatók, a megcélzott nukleinsavszekvenciákkal történő duplex- vagy triplexképzés által. A megcélzott proteinek expressziójának duplex- vagy triplexképzéssel történő gátlására alkalmazott lineáris oligomerek azonban előnyösen körülbelül 10-20 nukleomonomer maradékot tartalmaznak.

A találmány szerinti, helyettesített kötéseket tartalmazó oligomerek ismert módon cirkularizálhatók [WO

HU 218 086 Β

92/19732; Kool E. T., J. Am. Chem. Soc., 113., 6265-6266. (1991); Prakash G. et al., J. Am. Chem. Soc., 114., 3523-3527. (1992)]. Az ilyen oligomerek alkalmasak egyszálú vagy kettős szálú megcélzott nukleinsavakhoz való kötődésre. A cirkularizált oligomerek különböző méretűek lehetnek. A körülbelül 22-50 nukleomonomert tartalmazó oligomerek az előnyösek. A cirkuláris oligomerek a hurokrégióban körülbelül 3-6 nukleomonomert tartalmazhatnak, amelyek elválasztják az oligomer kötődési doménjeit (lásd Prakash G., idézett helyen). Az oligomerek cirkularizálhatók enzimatikusan a terminális foszfátcsoportokon keresztül ligáz segítségével, vagy kémiai úton az 5’- és 3’terminális cukor- és/vagy bázismaradékokon keresztül történő kötéssel.

A találmány szerinti oligomerek alkalmazhatók megcélzott gének expressziójának oly módon történő módosítására, hogy gátolják a transzkripció módosításáért vagy a transzlációért felelős kötőproteineknek megfelelő nukleinsavak közötti kölcsönhatást [Maher L. J. et al., Science, 245., 725-730. (1989)]. Az oligomerek tehát alkalmas szekvenciaspecifikus ágensek, amelyek nukleinsavakkal versengenek proteinek megkötésében (például riboszómákat, RNS-polimerázokat, DNS-polimerázokat, transzlációs iniciációs faktorokat, transzkripciós faktorokat, amelyek fokozzák vagy csökkentik a transzkripciót, protein-hormon transzkripciós faktorokat stb.). Az alkalmasan megtervezett oligomerek tehát alkalmazhatók a megcélzott proteinek szintézisének fokozására egy olyan mechanizmuson keresztül, mint például egy szabályozó helyhez vagy annak közelében történő kötődéssel, amely transzkripciós faktorok elnyomják az expressziót, vagy oly módon, hogy gátolják magának egy kiválasztott represszorproteinnek az expresszióját.

A találmány szerinti oligomerek, amelyek további olyan módosításokat tartalmaznak, amelyek fokozzák a kötési aktivitást, megtervezhetők úgy, hogy szekunder vagy tercier szerkezeteket tartalmazzanak, például látszólagos csomókat vagy látszólagos fél csomókat [Ecker D. J. et al., Science, 257., 958-961. (1992)]. Az ilyen szerkezetek stabilabb szekunder vagy tercier szerkezettel rendelkeznek, mint a megfelelő nem módosított oligomerek. Az ilyen szerkezetek fokozott stabilitása az egyszálú oligomer önmagával komplementer területei közötti fokozott kötési aktivitáson, illetve az adott szerkezetű két vagy több oligomer komplementer területei közötti fokozott kötési aktivitáson alapszik. Az ilyen szerkezetek alkalmazhatók arra, hogy bizonyos szerkezeteket utánozzanak, mint például a HÍV TAR szerkezetét abból a célból, hogy akadályozza a HÍV Tat protein (a TAR-hoz kötődő protein) kötődését. Hasonló megközelítés hasznosítható más transzkripciós vagy transzlációs faktorokkal, amelyek nagyobb nukleinsavszerkezeteket ismernek fel, például törzseket, hurkokat, hajtűhurkokat, csomókat stb. A találmány szerinti oligomerek alkalmazhatók az ilyen szerkezetek megszakítására vagy az ilyen szerkezetekhez való kötődésre oly módon, hogy akadályozzák vagy fokozzák proteinek kötődését nukleinsavszerkezetekhez.

A találmány szerinti oligomerek az antiszensz vagy tripla hélix képzésén alapuló terápiában való felhasználás mellett olyan terápiás vagy diagnosztikus ágensekként is alkalmazhatók, amelyek egy nukleinsavduplexben lévő egyik szál közvetlen helyettesítésére szolgálnak. Természetes duplexek, mint például kromoszómaDNS vagy virális DNS, RNS-duplex vagy hibrid DNS/RNS egyik szálának a helyettesítése olyan oligomerekkel lehetséges, amelyek nem elég nagy kötési aktivitást mutatnak komplementer szekvenciájukhoz. A D hurkot képező oligomerek terápiás hatékonysága a komplementer szekvenciához való kötődési affinitásból származik, ami a megcélzott nukleinsavval kapcsolatos normális biológiai funkció módosulását eredményezi. Megcélzott nukleinsavak lehetnek - nem kizárólag - i) génszekvenciák, például exonok, intronok, exon/intron kapcsolatok, promoter/enhanszer régiók és 5’- vagy 3’-, nem transzlatált régiók, ii) olyan nukleinsavak régiói, amelyek szekunder szerkezeteket hasznosítanak túlműködés céljára (például a HÍV TAR törzs-hurok eleme vagy a transzfer RNS-ek), iii) olyan nukleinsavak, amelyek strukturálisan vagy más módon funkcionálnak, például a telomérák, centromérák vagy replikációs origók (vírus, baktérium stb.) és iv) bármely más duplex régiók. Nyilvánvaló, hogy oligomerek szintetizálhatok határozott funkcionális doménekkel, ahol egy oligomer bizonyos régiója egy célponthoz D hurokképzéssel kötődik, miközben a szomszédos területek egy megcélzott molekulát megkötnek, például tripla hélix képzése vagy egy proteinhez aptamer formában való kötődés által. Lehetséges az is, hogy egy D hurkot képező oligomer a duplex mindkét szálához kötődik, átkapcsolva arra a szálra, amelyhez az oligomer kötődik (azaz az oligomemek van egy régiója, amely az egyik szálhoz és egy másik régiója, amely a komplementer szálhoz kötődik). A kötés módját meghatározó kontrollelemek (azaz tripla hélix vagy D hurok) az oligomer szekvenciája és az oligomerbe beépített inherens affinitás képezik. A Watson-Crick-féle duplex kötődés bázisfelismerési szabályai eltérnek a Hoogsteen-féle kontrollált triplexkötődés szabályaitól. Ezért az oligomer bázisszekvenciája alkalmazható arra, hogy meghatározzuk a kötődési szabályok típusát, amelyeket az oligomer hasznosít. A D hurok-szerkezetek a természetben enzimmel közvetített eljárásokban képződnek [Harris L. D. et al., J. Bioi. Chem., 262., 9285-9292. (1987)], vagy olyan régiókkal kapcsolatosak, ahol a DNS-replikáció történik [Jacobs Η. T. et al., Nucl. Acids Rés., 17., 8949-8966. (1989)]. Az oligomerek kötődéséből képződő D hurkok egy- vagy kétlépéses eljárások eredménye. Egy megcélzott szál közvetlen kicserélése olyan D hurkot eredményez, amely egyszeres kötési eseménnyel képződik. A D hurkok képződése azonban triplahélix-képződéssel is bekövetkezhet, ami meggyorsítja a D-hurokhoz vezető szál kicserélési eseményét.

A találmány szerinti helyettesített kötéseket tartalmazó ribozimok megváltoztatott jellemzőkkel rendelkező fajták tervezéséhez alkalmazhatók. Az egyszálú RNS-t vagy DNS-t hasító ribozimok ismertek Robertson D. L.

HU 218 086 Β et al., Natúré, 344., 467-468. (1990). A ribozimok terápiás alkalmazását szintén ismertették: Sarver N. et al., Science, 247., 1222-1225. (1990); WO 91/04319. A ribozimfunkcióhoz szükséges szekunder vagy tercier szerkezetet a megfelelő oligomer szekvenciák tervezésével befolyásolhatjuk. így például az olyan ribozimok, amelyek a találmány szerinti helyettesített kötéseket tartalmazó, nukleázokkal szemben stabil célzódoméneket tartalmaznak, nagyobb affinitással rendelkeznek, miközben megtartják bázispár-képző specificitásukat a megcélzott szekvencia iránt. A találmány szerinti helyettesített kötések nagyobb affinitása és/vagy nukleázokkal szembeni stabilitása következtében a ribozimban lévő rövidebb felismerődomén (előny a gyártásban) úgy tervezhető, hogy az előnyösebb szubsztrátforgalomhoz vezessen (ribozimfünkció előnye).

A találmány szerinti oligomerek a terápiás alkalmazás során különféle állapotok kezelésére hasznosíthatók a megcélzott gének expressziójának gátlásával. Az ilyen terápiás célokra az oligomerek különféle adagolási úthoz formulálhatók, például szisztémás, topikális vagy lokalizált adagoláshoz. Ilyen technikákat és formulálási alakokat ismertet például Remington’s Pharmaceutical Sciences, Merck Publishing Co., Easton, PA, utolsó kiadás. Az aktív komponensként alkalmazott oligomerek általában hordozóanyagokkal, például hígító- és egyéb segédanyagokkal kombinálhatok, ezek lehetnek töltőanyagok, kötőanyagok, nedvesitőszerek, dezintegrálószerek, felületaktív anyagok vagy síkosítóanyagok, az adagolás módjától és az adagolási formától függően. Tipikus adagolási formák például a tabletták, porok, folyékony készítmények, így a szuszpenziók, emulziók és oldatok, a granulátumok, kapszulák és kúpok, valamint az injekciós célra szolgáló folyékony készítmények, így a liposzómakészítmények.

Szisztémás adagolásra előnyös az injekció, így az intramuszkuláris, intravénás, intraperitoneális és szubkután injekció. Injekciós célra a találmány szerinti oligomereket folyékony oldatok formájában készítjük el, például fiziológiásán elfogadható pufferekkel, például Hank-féle oldattal vagy Ringer-féle oldattal. Ezenkívül a találmány szerinti oligomerek az alkalmazás előtt újraoldható vagy szuszpendálható szilárd formában is formulálhatók. A liofilizált formák szintén ideértendők. Szisztémás adagolás esetén a napi adag általában 0,01-50 mg/kg naponta egyszer vagy kétszer. Ettől eltérő adagolás is alkalmazható attól függően, hogy milyen i) az illető oligomer gátlási potenciálja a megcélzott DNS vagy RNS aktivitására nézve, ii) az adott génnel kapcsolatos betegségi állapot komolysága, súlyossága, iii) az adott oligomer farmakokinetikai viselkedése.

A szisztémás adagolás történhet nyálkahártyán vagy bőrön át, vagy a vegyületek adagolhatok orálisan. Nyálkahártyán vagy bőrön át történő adagoláshoz készítmény esetén alkalmas penetrációt elősegítő anyagot adagolunk a készítményhez. Ilyenek a technika állása szerint jól ismertek, idetartoznak például az epesók és a fuzidinsav-származékok a nyálkahártyás adagoláshoz. Ezenkívül az áthatolás elősegítésére adagolhatok felületaktív anyagok is. A nyálkahártyán át történő adagolás történhet orrspray vagy kúp segítségével. Orális adagoláshoz a találmány szerinti oligomerek a szokásos orális adagolási formákban készíthetők el, így például kapszula, tabletta vagy tonik formájában.

Topikális adagolás céljára a találmány szerinti oligomerek kenőcsök, krémek, gélek formájában a technika állása szerint ismert módon készíthetők. Szembe történő adagolás céljára, például vírusfertőzések esetén a találmány szerinti oligomerek a technika állása szerint ismert módon és ismert kompozíciók formájában készíthetők el.

Terápiás alkalmazás mellett a találmány szerinti oligomerek diagnosztikai reagensekként is használhatók olyan nukleinsavszekvenciák jelenlétének vagy hiányának kimutatására, amelyekhez specifikusan kötődnek. A találmány szerinti oligomerek fokozott kötési aktivitása előnyt jelent primerként vagy próbaként való alkalmazás során. A diagnosztikai tesztek végezhetők úgy, hogy kettős vagy tripla hélix képződésén keresztül történő hibridizáció jöjjön létre, amelyet azután a szokásos eszközökkel mutatunk ki. így például az oligomerek radioaktív, fluoreszcens vagy kromogén jelzőanyagokkal láthatók el, és a jelzőanyag kötődése a szilárd hordozóanyaghoz detektálható. Eljárhatunk úgy is, hogy a kettős vagy tripla hélix jelenlétét olyan antitesttel mutatjuk ki, amely specifikusan felismeri ezeket a formákat. Az ilyen, oligomereket hasznosító vizsgálatok eszközei jól ismertek.

A találmány szerinti helyettesített kötéseket tartalmazó oligomerek tripla hélix képződésén alapuló diagnosztikai ágensekként történő alkalmazása előnyös, mivel a tripla hélixek enyhe körülmények között képződnek, és így a vizsgálatok úgy végezhetők, hogy a vizsgálati anyagokat nem kell túl szélsőséges körülményeknek kitenni. Baktériumok, gombák vagy protozoák szekvenciáinak azonosítása céljából végzett RNS-detektáláson alapuló diagnosztikai vizsgálatok esetén gyakran az RNS-t izolálni kell a mintából vagy a laboratóriumban növesztett organizmusból, ami munka- és időigényes, mivel az RNS különösen érzékeny a mindenütt jelen lévő nukleázokkal szemben.

Az oligomerpróbák további módosításokat is tartalmazhatnak, így például módosításokat a cukorrészben és/vagy helyettesített kötéseket, amelyek az oligomereket különösen stabillá teszik nukleázokkal szemben, ami különösen hasznos olyan vizsgálatok esetén, amelyeket sejtek vagy szövetextraktumok jelenlétében végzünk, amelyek normálisan nukleázaktivitást tartalmaznak. A terminális módosításokat tartalmazó oligomerek gyakran megtartják a komplementer szekvenciákhoz való kötődési tulajdonságukat anélkül, hogy specificitásukat elveszítenék [Uhlmann et al., Chemical Reviews, 90., 543-584. (1990)]. Amint a fentiekben ismertettük, a találmány szerinti próbák olyan linkereket is tartalmazhatnak, amelyek az alternatív DNS-szálhoz való specifikus kötődést lehetővé teszik, oly módon, hogy ilyen kötődést lehetővé tevő linkereket építünk be [Froehler, B. C. et al., Biochemistry, 31., 1603-1609. (1992); Home et al., J. Am. Chem. Soc., 112., 2435-2437. (1990)].

HU 218 086 Β

A találmány szerinti bázisanalógok beépítése próbákba, amelyek kovalens keresztkötést képező ágenseket is tartalmaznak, lehetővé teszi, hogy fokozzuk az érzékenységet és csökkentsük a zavaró hatásokat a diagnosztikai vagy detektálóvizsgálatokban. Emellett a keresztkötést képező ágensek használata új vizsgálatokat tesz lehetővé, mint például 1. a keresztkötés használata a próba megkülönböztetőképességének fokozására, (2) denaturáló mosási lépés beiktatása a zavaró hatások csökkentésére, továbbá 3. hibridizáció és keresztkötés kivitelezése a hibrid olvadási pontjánál vagy annak közelében, a szekunder szerkezetek kialakulásának csökkentésére a célvegyületben, valamint a próba specificitásának fokozására. A hibridizációs körülmények módosításait korábban ismertették [Gamper et al., Nucleic Acids Rés., 14., 9943. (1986)].

A találmány szerinti oligomerek alkalmazhatók olyan diagnosztikai vizsgálatokban, amelyekben az oligomert vagy a kimutatandó nukleinsavat kovalens módon kapcsoljuk egy szilárd hordozóhoz, amint ez ismert például az US 4 775 619 számú szabadalmi leírásból. Az oligomerek szintén alkalmazhatók olyan diagnosztikai vizsgálatokban, amelyek a megcélzott szekvenciák amplifikálására szolgáló polimeráz láncreakciós technikákon alapulnak, amint ez ismert például az EP 0 393 744 számú közzétételi iratból. A primerként alkalmazható 3’-terminust tartalmazó, találmány szerinti oligomerek kompatibilisek a polimeráz láncreakciós (PCR) módszerekben alkalmazott polimerázokkal, például Taq vagy Vént polimerázokkal (New England Biolabs). A találmány szerinti oligomerek tehát a PCR-protokollokban primerként hasznosíthatók.

A találmány szerinti oligomerek olyan primerekként hasznosíthatók, amelyek meghatározott szekvenciával vagy olyan primerekként, amelyek véletlenszerű szekvenciával rendelkeznek. A véletlenszerű szekvenciával rendelkező primerek általában 6, 7 vagy 8 nukleomonomer hosszúságúak. Az ilyen primerek különböző nukleinsavamplifikációs protokollokban (PCR, ligáz-láncreakciók stb.) vagy klónozási protokollokban használhatók. A találmány szerinti helyettesített kötések általában nem interferálnak az oligomer primerként történő funkcionálási kapacitásával. A találmány szerinti 2'-módosításokat a 3’-terminális maradéktól eltérő helyen, továbbá az oligomemek RN-áz H inkompetenciát biztosító más módosításokat vagy más nukleázstabilitást biztosító módosításokat tartalmazó oligomerek előnyösen hasznosíthatók próbákként vagy primerekként RNS- és DNS-szekvenciákhoz sejtextraktumokban vagy más, nukleázokat tartalmazó oldatokban. így az oligomerek olyan protokollokban használhatók, ahol egy mintában lévő nukleinsavat amplifikálunk oly módon, hogy az oligomert keverjük a megcélzott nukleinsavat tartalmazó mintával, majd az oligomert hibridizáltatjuk a megcélzott nukleinsavval, és a megcélzott nukleinsavat PCR, LCR vagy más alkalmas módon amplifikáljuk.

Az oligomerekből kelátképző szerekkel, például EDTA-, DTP A- vagy 1,2-diamino-ciklohexán-ecetsavanalógok segítségével képezett származékok különböző in vitro diagnosztikai vizsgálatokban használhatók, amint ezt például az US 4 772 548, US 4 707 440 és az US 4 707 352 számú szabadalmi leírások ismertetik. A találmány szerinti oligomerek ezenkívül keresztkötést képező szerekkel, például 5-(3-jód-acetamido-prop-lil)-2’-dezoxi-uridin vagy 5-[3-(4-bróm-butiramido)prop-l-il]-2’-dezoxi-uridin segítségével is származékká alakíthatók, és különböző vizsgálati módszerekben és készletekben alkalmazhatók, amint ezt a WO 90/14353 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés ismerteti.

A fenti alkalmazások mellett az oligomerek génexpressziót gátló képessége in vitro rendszerekben kiértékelhető oly módon, hogy a kérdéses sejtekben vagy rekombináns rendszerekben mérjük az expresszió szintjét alkalmas módszerekkel [Graessmann M. et al., Nucleic Acids Rés., 19., 53-59. (1991)].

A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.

Példák

Nukleomonomer szintonok és oligomerek szintézisének áttekintése

A találmány szerinti oligomerek az oligonukleotidszármazékok szintézise esetén jól ismert módszerekkel szintetizálhatók. Lásd például Flandor J. és Yam S. Y., Tetrahedron Letters, 31., 597-600. (1990); Mattson R. J. et al., J. Org. Chem., 55., 2552-2554. (1990); Chung C. K. et al., J. Org. Chem., 54., 2767-2769. (1989).

Amint az 1. táblázatban felsorolt helyettesített kötések széles választékából látható, a találmány szerinti helyettesített kötések tartalmazhatnak egy vagy több nitrogén-, kén- és/vagy oxigénatomot. Ezen atomok helyzete a helyettesített kötésben változhat az 5’-végtől a középig, a 2’-végig, a 3’-végig vagy a 4’-végig. A következőkben reprezentatív szintetizálóreakciókat mutatunk be az ábrák segítségével, amelyek a különböző helyzetekhez, valamint a nitrogén- és oxigénatomok különböző kombinációinak eléréséhez vezetnek.

Az 1-25. ábrán bemutatott szintézismódszerek az oligonukleotid-kémiában jártas szakemberek számára ismert módon módosíthatók. így például a bázisok védőcsoporttal való ellátása nincs mindig jelezve, ez kívánatos lehet és a technika állása szerint ismert módon és ismert reagensekkel végezhető [lásd például Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W. Greene, John Wiley and Sons (1981)]. Hasonlóképpen bizonyos esetekben a védőcsoport alkalmazása jelezve van, azonban nem minden esetben szükséges blokkolni a reagenseket a találmány szerinti oligomerek szintézisében.

1. példa

Az 1. ábra első öt lépése az izobutirilcsoporttal védett szerinol-amino-alkohol előállítását mutatja be. Az 1. ábra hatodik és azt követő lépései a szerinollal helyettesített timin-foszforamidit-építőegység szintézisét mutatja.

Az 1. ábra első lépésében a szerinaminosav aminocsoportját védőcsoporttal látjuk el úgy, hogy az 1 kép21

HU 218 086 Β letű vegyületet di(terc-butil)-dikarbonáttal reagáltatjuk, így 2 képletű vegyületet kapunk. Más megfelelő védőcsoportok is alkalmazhatók. A következő lépésben a 2 képletű vegyület β-hidroxilcsoportját dihidropirán védőcsoporttal látjuk el, így a teljesen védett 3 képletű aminosavat kapjuk. A 3 képletű aminosavat azután diborán-dimetil-szulfid komplexszel reagáltatjuk, így a 4 képletű alkoholt kapjuk, amelyet izobutiril-kloriddal kezelünk, így az 5 képletű vegyületet kapjuk. Ezt a redukciót úgy is végezhetjük, hogy izobutil-kloroformátot és nátrium-bór-hidridet alkalmazunk [lásd K.. Ramasamy, R. K. Olsen és T. Emery, Synthesis, 42. (1982)]. Az 5 képletű vegyületet trifluor-ecetsavval reagáltatjuk 30 percig, majd nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal mossuk, így a 6 képletű vegyületet kapjuk.

A 7 képletű timin-ecetsavat az irodalomból ismert módon állítjuk elő [lásd L. Kosynkina, W. Wang és T. C. Liang, Tetrahedron Letters, 35., 5173. (1994)]. A 6 és 7 képletű vegyületeket kevert anhidrides reakcióban kapcsoljuk, így a 8 képletű vegyületet kapjuk. A 8 képletű vegyületet DMTC1 segítségével dimetoxitritilezzük, így a 9 képletű vegyületet kapjuk, amelyet hidrolizálva a 10 képletű vegyülethez jutunk. A 10 képletű vegyület ismert körülmények között végzett foszfoszililezésével a szerinollal kapcsolt timin 11 képletű építőegységhez jutunk. Ezt a szintont azután az oligomer szintéziséhez használhatjuk. Monomerek és dimerek a fentiekben ismertetetthez hasonló módon történő egymáshoz kapcsolásához bármilyen, a DNS-szintetizáló kémiából ismert módszer, így a foszforamidát- vagy foszfonátmódszer alkalmazható.

2. példa

A 2. ábrán bemutatott reakcióban a 13 képletű timin-acetaldehidet úgy állítjuk elő, hogy timint brómacetaldehid-dimetil-acetállal kezelünk, majd a 12 képletű vegyületet vizes TFA segítségével hidrolizáljuk. Ezután a 13 képletű aldehidet és a 6 képletű amint kapcsoljuk, és a megfelelő intermediert az 1. ábra szerintihez hasonló módon 17 képletű foszforamidit építőegységgé alakítjuk.

3. példa

A 3. ábrán bemutatott reakcióban a kiindulási anyag a 18 képletű β-helyettesített aminosav. A helyettesített aminosavat az 1. és 2. ábrán bemutatott eljárással alakítjuk 27 képletű foszforamidit építőegységgé.

4. példa

A 4. ábrán bemutatott reakcióban a kiindulási 21 képletű amino-alkoholt króm-trioxid és piridin elegyével oxidáljuk, így 28 képletű aldehidet kapunk. Az aldehidet bázis jelenlétében alkil-halogeniddel reagáltatjuk, így 29 képletű vegyületet kapunk. A 29 képletű amino-alkohol azután az 1. és 2. ábrán bemutatott reakcióval 35 képletű építőegységgé alakítható.

5. példa

Az 5. ábra első négy lépése lényegében megegyezik az 1. ábra hasonló lépéseivel, itt azonban szerin helyett aszpartinsavat alkalmazunk. A 36 képletű aszpartinsavmetil-észterből teljesen védett 40 képletű alkoholt kapunk, amelyről ecetsavval szelektív módon távolítjuk el a védőcsoportot, így a 41 képletű vegyületet kapjuk. A 41 képletű vegyületet króm-trioxid és piridin elegyével oxidáljuk, így a megfelelő 42 képletű aldehidet kapjuk. A 42 képletű aldehidet nátrium-triacetoxi-bór-hidrid jelenlétében o-benzil-hidroxil-amin egységével redukítv módon aminezzük, így a 43 képletű vegyületet kapjuk [T. Kolasa és M. J. Miller, J. Org. Chem., 55., 1711. (1990)]. A 39 képletű alkoholt 46 képletű aldehiddé alakítjuk, lényegében véve a fentiekhez hasonló módon, azonban a 39 képletű vegyület hidroxilcsoportját allilcsoporttal védjük. A 46 képletű aldehidet és a 43 képletű hidroxil-amint nátrium-triacetoxi-bór-hidrid jelenlétében kapcsoljuk, majd az amino védőcsoportokat eltávolítjuk, így a 48 képletű bisz-amint kapjuk. A 48 képletű bisz-amint aztán az 1. ábra lépései szerint 53 képletű dimerré alakítjuk.

6. példa

A 6. ábrán bemutatott reakcióban az 54 képletű alkoholt 55 képletű o-benzil-hidroxil-aminnal kapcsoljuk Mitsunobu-körülmények között [lásd O. Mitsunobu, Synthesis, 1. (1981)], így az 56 képletű vegyületet kapjuk. Az 56 képletű intermediert hidrogénezzük, majd acetilezzük, így a 27 képletű vegyületet kapjuk. Az 57 képletű vegyületről TFA segítségével eltávolítjuk a TBDMSi védőcsoportot, így az 58 képletű vegyületet kapjuk. Az 58 képletű vegyületet 7 képletű vegyülettel kapcsoljuk, majd dimetoxi-tritilezzük, így a 60 képletű vegyületet kapjuk. A 60 képletű vegyületből bázikus hidrolízissel, majd foszfitilezéssel kapjuk a 62 képletű építőelemet.

7. példa

A 7. ábrán bemutatott reakcióban a 4 képletű szerinolt 59 képletű halogeniddé alakítjuk, majd timinnel alkilezzük, így a 63 képletű vegyületet kapjuk. A 63 képletű vegyületről a védőcsoportokat eltávolítjuk, DMTvel védett hidroxi-ecetsavval kapcsoljuk és foszfitilezzük, így 66 képletű vegyületet kapunk.

8. példa

A 8. ábrán bemutatott reakcióban a 64 képletű alkoholt a 69 képletű N-hidroxil-amino-propánsavval kapcsoljuk, így a 70 képletű vegyületet kapjuk. A timin 73 képletű halogeniddel végzett alkilezésével a 74 képletű vegyületet kapjuk, amelyet a védőcsoportok eltávolítása után a 76 képletű vegyülettel kapcsolunk, majd hidrolizáljuk, így a 78 képletű vegyületet kapjuk. A 78 képletű és a 70 képletű vegyület kondenzálásával, majd foszfitilezésével a 80 képletű hidroxamátot kapjuk.

9. példa

A 9. ábrán bemutatott reakcióban a 81 képletű Nhidroxil-amino-propánsav-aldehidet alkalmazzuk a 64 képletű alkohollal történő kapcsolásban. A 88 képletű dimer előállítására a 8. ábra szerinti lépésekben a 83 és 86 képletű vegyületeket alkalmazzuk.

HU 218 086 Β

10. példa

A 10. ábra szerinti reakcióban a 89 képletü a-brómβ-amino-propánsav-metil-észtert timinnel alkilezzük [lásd T. Kolasa és M. J. Miller, J. Org. Chem., 55., 4246. (1990)], így a 90 képletü vegyületet kapjuk. A 90 képletü intermediert nátrium-hidroxiddal hidrolizáljuk, így a 91 képletü savat kapjuk, amelyet 6 képletű vegyülettel kapcsolunk, így a 92 képletü vegyületet kapjuk. A 92 képletü vegyületet azután az 1. ábrán bemutatott lépésekkel 95 képletü foszforamidit építőegységgé alakítjuk.

11. példa

All. ábrán bemutatott reakcióban timint 96 képletű alkil-amin-halogeniddel alkilezünk [lásd R. K. Olsen, K. Ramasamy és T. Emery, J. Org. Chem., 49., 3527. (1984); és Islam et al., J. Med. Chem., 37., 293-304. (1994) az amino-alkil-halogenid előállítására], így a 97 képletü vegyületet kapjuk. A 97 képletü vegyületet TFA-val kezeljük, majd alkilezzük, így a 100 képletü vegyületet kapjuk. A 100 képletü vegyületből dimetoxi-tritilezéssel, hidrolízissel, majd foszfitezéssel a 103 képletü építőegységet kapjuk.

12. példa

A 12. ábrán bemutatott módszer a 111 képletü hidroxamátláncot tartalmazó dimer előállításának alternatív módja, a 43 képletü N-hidroxil-aminból és a 107 képletű aszpartinsavból előállított aldehidből.

13. példa

A 13. ábrán bemutatott reakcióban a 115 képletü dimert a 108 és 13 képletü intermedierekből állítjuk elő a 2. ábrán bemutatott reakciólépésekkel.

14. példa

A 14. ábrán bemutatott reakcióban N-hidroxil-timint állítunk elő [lásd Kim C. U. et al., Tetrahedron Letters, 33., 25-28. (1992)] és N-hidroxil-ftálimiddel kapcsoljuk, így a 117 képletü vegyületet kapjuk, amelyet azután hidrazinnal és etanollal kezelünk, így a 118 képletü vegyületet kapjuk. A 118 képletü vegyületet 119 képletü, DMT-vel védett glicerin-epoxiddal kezeljük, így a 120 képletü vegyületet kapjuk. A 120 képletű intermediert azután standard módszerrel 121 képletű foszforamiditté alakítjuk. Egy másik eljárásban a 118 képletü vegyületet a 122 képletü aminosav-aldehiddel kapcsoljuk reduktív aminezési körülmények között, így a 123 képletü vegyületet kapjuk. A szekunder aminocsoportot FMOCC1 segítségével védjük, majd hidrolizáljuk, így a 125 képletü vegyületet kapjuk.

15. példa

A 15. ábrán bemutatott reakcióban a 126 képletü 1,2-dihidroxi-propánsavat 118 képletü N-hidroxil-amintiminnel védjük, így a 127 képletü vegyületet kapjuk, amelyet azután standard körülmények között 129 képletű foszforamidit szintonná alakítunk. A 118 képletü vegyületet adipinsawal kapcsoljuk és 133 képletü nukleinsav építőegységgé alakítjuk.

16. példa

A 16. ábrán bemutatott reakcióban először a 136 képletű építőegységet szintetizáljuk a 118 és 134 képletü vegyületekből az 1. ábránál ismertetett módon. A 139 és 118 képletü vegyületek kapcsolásával a 140 képletü vegyületet kapjuk. A 137 képletü vegyület 118 képletü vegyülettel történő kezelésével a 138 képletü vegyületet kapjuk, amelyet azután 140 képletü vegyülettel kondenzál tatunk, így a 141 képletü dimert kapjuk.

17. példa

A 17. ábrán bemutatott reakcióvázlat szerint a 142 képletü aldehidet egy glicin-benzil-észterrel kapcsoljuk, így a 143 képletü vegyületet kapjuk. A 143 képletű vegyületet 7 képletü vegyülettel kezeljük, így a 145 képletü vegyületet kapjuk, amelyet ecetsavval kezelünk, így a 148 képletü vegyületet kapjuk. A 148 képletű vegyület Mitsunobu-alkilezésével, amelyet Boc-NHO-acetil-hidroxil-aminnal végzünk, a 147 képletü vegyületet kapjuk, amelyet hidrogénezünk, így a 150 képletű építőegységet kapjuk. Hasonlóképpen a 143 képletű vegyület 13 képletü vegyülettel végzett kapcsolásával, majd az utána következő lépések elvégzésével a 149 képletü szintont kapjuk.

18. példa

A 18. ábrán bemutatott reakcióban a 142 képletü aldehidet reduktív módon aminezzük és Boc-NH-O-benzil-hidroxil-aminnal kezeljük, így a 151 képletü vegyületet kapjuk. A 151 képletü vegyületet hidrogénezzük, majd a 152 képletü vegyületet alkilezzük a 153 képletü glikolsavval [B. C. Borer és D. C. Balogh, Tetrahedron Letters, 32., 1039. (1991)], így a 154 képletü vegyületet kapjuk. A 154 képletü vegyületről TFA segítségével eltávolítjuk a Boc védőcsoportot, majd kapcsoljuk, így a 155 képletü vegyületet kapjuk. A 155 képletü vegyület hidroxil védőcsoportjai ecetsavval szelektív módon eltá\ oldhatók, így a 156 képletü vegyületet kapjuk. A 156 képletü vegyületet azután standard reakciókörülmények között 157 képletü építőegységgé alakítjuk. A 158 képletü építőegységet hasonlóképpen, a 154 és 13 képletü vegyület kapcsolásával állítjuk elő, a 157 képletií vegyület előállításához alkalmazott módszerekkel.

19. példa

A 19. ábrán bemutatott reakcióban a 160 képletü timin-N-hidroxil-amin alkilezését 162 képletü alkohollal végezzük, így a 163 képletü vegyületet kapjuk. A 163 képletü vegyület az 1. ábrán bemutatott lépésekkel 166 képletü foszforamidit építőegységgé alakítható.

20. példa

A 20. ábrán bemutatott reakcióban először a 169 képletü intermediert szintetizáljuk glutaminsavból standard reakciókörülmények között. A 169 képletü vegyülettel timint alkilezünk, így a 170 képletü vegyületet kapjuk, amelyet azután TFA-val kezelünk, így a 171 képletü vegyületet kapjuk. A 171 képletü intermediert Boc-glicinnel kapcsoljuk, így a 173 képletü vegyületet kapjuk, amelyet hidrolizálunk, így a 174 képletü

HU 218 086 Β monomer szintont kapjuk. A 172 képletű vegyület hasonló módon, a 118 képletű vegyület és Boc-aminoacetaldehid kapcsolásával, majd a benzil-észter hidrolízisével állítható elő.

21. példa

A 21. ábrán bemutatott reakcióban a 177 képletű intermediert Boc-NH-O-benzil-hidroxil-aminból és a 175 képletű vegyületből állítjuk elő standard reakciókörülmények között. A 177 képletű vegyületet hidrogénezzük, majd a 116 képletű N-hidroxi-timinnel kapcsoljuk, így a 178 képletű vegyületet kapjuk. A THP-védőcsoportokat eltávolítjuk, majd dimetoxi-tritilezzük és foszfitilezzük, így a 181 képletű építőegység szintont kapjuk. A 182 képletű vegyület hasonló módon állítható elő, THP-hidroxi-ecetsav helyett THP-hidroxi-ecetsav-aldehid alkalmazásával.

22. példa

A 22. ábrán bemutatott reakcióban a 191 képletű építőegységet a 183 képletű ismert kiindulási anyagból állítjuk elő a 22. ábra alján jelzett reakciókörülmények között.

23. példa

A 23. ábrán bemutatott reakcióban a 199 képletű építőegység szintézisét a 183 képletű kiindulási anyagból végezzük, a 23. ábra alján jelzett reakciókörülmények között.

24. példa

A 24. ábrán bemutatott reakcióban a 200 képletű kiindulási anyagot 207 képletű építőegységgé alakítjuk a 24. ábra alján jelzett reakciókörülmények között.

25. példa

Az ezen példában használt és előállított vegyületeket az 1. ábra szemlélteti.

képletű 4-szerin-metil-észter

37,8 (300 mmol) timint feloldunk 64,5 g (1150 mmol) kálium-hidroxid 200 ml vízzel készült oldatában és 40 °C-os vízfürdőn történő melegítés közben 1 óra alatt hozzáadjuk 62,5 g (450 mmol) brómecetsav 100 ml vízzel készült oldatát. A reakcióelegyet további 1 óra hosszat ezen a hőmérsékleten keverjük, majd szobahőmérsékletre hagyjuk lehűlni és pH-ját koncentrált sósavval 5,5 értékre állítjuk. Ezután az oldatot 2 óra hosszat hűtőszekrényben hűtjük. A képződött csapadékot (el nem reagált timin) leszűrjük. Az oldat pH-ját ezután koncentrált sósavval 2 értékre állítjuk, és az oldatot további 2 óra hosszat hűtőszekrényben hűtjük. A kivált fehér csapadékot leszűrjük és vákuumban 40 °C-on 6 óra hosszat szárítjuk, így 44 g (88%) terméket kapunk.

képletű N-Boc-L-szerin-metil-észter

16,5 g (100 mmol) L-szerin-metil-észtert szobahőmérsékleten szuszpendálunk 100 ml THF és 100 ml DMF elegyében. Az elegyhez keverés közben hozzáadunk 11,13 g (110 mmol) trietil-amint, majd 24,0 g (110 mmol) di(terc-butil)-dikarbonátot, és az elegyet szobahőmérsékleten további 30 percig keverjük. Ezután hozzáadunk 20 ml vizet, és az oldatot szobahőmérsékleten 8 óra hosszat keverjük. Ezután szárazra pároljuk, és a maradékot 250 ml etil-acetátban szuszpendáljuk és 100 ml 0,25 n kálium-hidrogén-szulfát-oldattal kezeljük. A terméket azonnal extraháljuk etil-acetáttal. A szerves extraktumot 100 ml vízzel és 100 ml konyhasóoldattal mossuk és vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk. Bepárlás után 26 g (90%) olajos maradékot kapunk.

képletű N-Boc-L-szerin-(OTHP)-metil-észter g (68,49 mmol) 2 képletű vegyületet feloldunk 100 ml vízmentes diklór-metánban és szobahőmérsékleten 8,4 g (100 mmol) 3,4-dihidro-2H-piránnal, és katalitikus mennyiségű (100 mg) p-toluolszulfonsavval kezeljük. A reakcióelegyet 12 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradékot 200 ml etil-acetátban oldjuk és mossuk sorban 100 ml 5 römeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 50 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd szárazra pároljuk. A maradék elég tiszta a következő lépésben való felhasználáshoz. Hozam: 15 g (72%).

képletű N-Boc-L-szerinol (OTHP) g (33 mmol) szerin (OTHP)-metil-észtert feloldunk 100 ml vízmentes THF-ben és argonatmoszférában jeges fürdőben 0 °C-ra hűtjük. Az oldatot ezen a hőmérsékleten tartjuk, és 1 óra alatt hozzáadjuk a borán-metil-szulfid komplex 2 mol/l-es tetrahidrofurános oldatának 100 ml-ét (200 mmol). A borán adagolása után a reakcióelegyet szobahőmérsékletre melegítjük, majd 6 óra hosszat 40 °C-on hevítjük. Ezután a reakcióelegyet 0 °C-ra hűtjük, pH-ját vízzel és ecetsavval 6-7 értékre állítjuk, majd 3x 100 ml dietil-éterrel extraháljuk. A dietil-éteres extraktumot 2 χ 100 ml vízzel és 100 ml konyhasóoldattal mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk, így nyerstermékként olajat kapunk. Az olajat szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: hexán—>aceton, így 8 g (88%) tiszta terméket kapunk.

képletű N-Boc-L-szerin (OTHP) Olb g (29,09 mmol) 4 képletű vegyület 100 ml vízmentes diklór-metánnal készült oldatához 0 °C-on, keverés közben 30 perc alatt hozzáadunk 3,54 g (35 mmol) TEA-t, majd 3,71 g (35 mmol) izobutiril-kloridot. Ezután a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 óra hosszat keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradékot 200 ml etil-acetátban oldjuk és mossuk sorban 50 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonátoldattal, 50 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk, így a nyersterméket olaj formájában kapjuk. Az olajat szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: hexán—>aceton, így 7,9 g (79%) tiszta terméket kapunk.

képletű L-szerinol (Olb) g (28,98 mmol) 5 képletű vegyületet feloldunk 100 ml diklór-metánban és 50 ml TFA-val szobahőmérsékleten 1 óra hosszat keveijük, majd szárazra pároljuk. A maradékot 50 ml metanolban oldjuk, és újra bepároljuk. A maradékot 200 ml diklór-metánban oldjuk,

HU 218 086 Β és mossuk sorban 2 χ 100 ml telített nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal. Ezután a szerves fázist vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk, így 4,5 g (96%) olajos terméket kapunk.

képletü N-(timinil-acetil)-L-szerinol (Olb)

7,3 g (40 mmol) 7 képletü timin-ecetsavat és 4,4 ml (40 mmol) N-metil-morfolint feloldunk 100 ml DMFben. Az oldatot argonatmoszférában -20 °C-ra hűtjük, majd keverés közben egy részletben hozzáadunk 5,2 ml (40 mmol) izobutil-kloroformátot. 15 perc múlva hozzáadjuk 6,44 g (40 mmol) 6 képletü vegyület 30 ml DMF-fel készült, ugyanilyen hőmérsékletre hűtött oldatát. A reakcióelegyet 30 percig -20 °C-on keveijük, majd szobahőmérsékletre melegítjük és további 1 óra hosszat keverjük. A reakcióelegyet szárazra pároljuk, és a maradékot 200 ml diklór-metánban oldjuk és 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk, így a nyersterméket hab formájában kapjuk. A nyersterméket gyorskromatográfiával szilikagélen tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán—»aceton, így 12 g (92%) tiszta terméket kapunk.

képletü 4,4’-dimetoxi-tritil-N-(timinil-acetil)-Lszerinol (Olb) g (30,58 mmol) 8 képletü vegyületet 3x50 ml vízmentes piridinnel együtt elpárologtatunk, majd 100 ml vízmentes piridinben oldunk. A kapott oldathoz szobahőmérsékleten argomatmoszférában hozzáadunk 3,54 g (35 mmol) TEA-t, majd 11,83 g (35 mmol) DMTCl-t. A reakcióelegyet 12 óra hosszat keveijük, 20 ml metanollal hígítjuk és további 30 percig keverjük. Ezután az oldatot szárazra pároljuk, a maradékot 200 ml diklór-metánban oldjuk, amelyet azután 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonátoldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mosunk, majd vízmentes nátrium-szulfáton szárítunk és szárazra párolunk, így a nyersterméket hab formájában kapjuk. A nyersterméket gyorskromatográfiával szilikagélen tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán—>aceton, így 17 g (88%) tiszta terméket kapunk.

képletü l-O-(4,4'-dimetoxi-tritil)-2-[amino(timinil-acetil)]-L-propán-l,3-diol g (15,89 mmol) 9 képletü vegyületet feloldunk 20 ml metanolban, és a kapott oldathoz 0 °C-on hozzáadunk 20 ml 1 n nátrium-hidroxid-oldatot (20 mmol). A reakcióelegyet 1 óra hosszat keverjük, pH-ját ecetsavval 7 értékre állítjuk. A kapott oldatot 2x100 ml etilacetáttal extraháljuk. Az extraktumot 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk, így a nyersterméket hab formájában kapjuk. A nyersterméket gyorskromatográfiával szilikagélen tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán—»aceton, így 8,2 g (92%) tiszta terméket kapunk.

képletü 1 ’-O-(4,4’-dimetoxi-tritil)-2-[ammo-(timinil-acetil)]-L-propán-3 ’-O-(N,N-diizopropil)-$cianoetil-foszforamidit

8,00 g (14,31 mmol) 10 képletü vegyületet 3 χ 50 ml vízmentes piridinnel együtt elpárologtatunk, majd egy éjszakán át vákuumban szilárd nátrium-hidroxidon szárítjuk. A száraz anyagot 100 ml diklór-metánban oldjuk és argonatmoszférában 0 °C-ra hűtjük. A hideg oldathoz argonatmoszférában hozzáadunk 5,23 g (25 mmol) N,Ndiizopropil-etil-amint, majd 4,72 g (20,00 mmol) 2ciano-etil-N,N-diizopropil-klór-foszforamiditot. A reakcióelegyet 0 °C-on 1 óra hosszat, majd szobahőmérsékleten 1 óra hosszat keveijük, ezután 100 ml diklór-metánnal hígítjuk, majd 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk, ezután vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk, így a nyersterméket hab formájában kapjuk. A nyersterméket gyorskromatográfiával szilikagélen tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán->aceton, amely 0,1 térfogat% TEA-t tartalmaz, így 010 g tiszta terméket kapunk. A habot vákuumban egy éjszakán át szilárd nátrium-hidroxidon szárítjuk. A habot 15 ml diklór-metánban oldjuk és argonatmoszférában 1 óra alatt 2000 ml vízmentes hexánhoz csepegtetjük. Diklór-metános oldat adagolása után képződött csapadékot további 1 óra hosszat keveijük, majd leszűijük és 200 ml vízmentes hexánnal mossuk, majd egy éjszakán át szilárd nátrium-hidroxidon szárítjunk, így 9,5 g (87%) terméket kapunk.

26. példa (lásd 26. ábra)

26-2 képletü N-(terc-butil-oxi-karbonil)-O-benzilL-szerin g (51,28 mmol) 26-1 képletü O-benzil-L-szerint szobahőmérsékleten szuszpendálunk tetrahidrofurán és víz 8:2 térfogatarányú elegyének 100 ml-ében. Az elegyhez keverés közben hozzáadunk 6,06 g (60 mmol) trietilamint, majd 13,08 g (60 mmol) di(terc-butil)-dikarbonátot, és a keverést egy éjszakán át szobahőmérsékleten folytatjuk. A homogén oldatot szárazra pároljuk, és a maradékot 300 ml etil-acetátban oldjuk, amelyet 100 ml 0,5 n kálium-hidrogén-szulfát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mosunk, majd vízmentes nátrium-szulfáton szárítunk és szárazra párolunk, így 14 g (93%) terméket kapunk olaj formájában.

26-3 képletü N-(terc-butil-oxi-karbonil)-O-benzilL-szerinol

6,0 g (20,34 mmol) 26-2 képletü N-(terc-butil-oxikarbonil)-O-benzil-L-szerint vízmentes tetrahidrofuránban oldunk és argonatmoszférában -20 °C-ra hűtünk, majd hozzáadunk 2,32 g (23 mmol) TEA-t és 3,13 g (23 mmol) izobutil-klór-formiátot. A keverést argonatmoszférában -20 °C-on további 30 percig folytatjuk. Ezután a reakcióelegyet argonfedés alatt azonnal leszűrjük, a csapadékot 50 ml vízmentes tetrahidrofuránnal mossuk. Az egyesített szűrletet 10 perc alatt lassan hozzáadjuk 7,4 g (200 mmol) nátrium-bór-tetrahidrid tetrahidrofurán és víz 80:20 térfogatarányú elegyének 200 ml-ével készült 0 °C-os oldatához. Az adagolás után a reakcióelegyet 2 óra hosszat 0 °C-on keveijük, majd a pH-t ecetsavval 7 értékre állítjuk. Ezután az oldatot szárazra pároljuk és 300 ml etil-acetát és 150 ml víz között megosztjuk, majd etil-acetáttal extraháljuk.

HU 218 086 Β

A szerves extraktumot 100 ml konyhasóoldattal mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk. A nyersterméket szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán—>etil-acetát. A nyersterméket összegyűjtjük és szárazra pároljuk, így 4,7 g (82%) nyersterméket kapunk olaj formájában.

Ή-NMR (CDClj): δ=1,41 (s, 9H, Boc), 3,60-3,70 (m, 4H), 3,82 (d, 2H), 4,53 (s, 2H, OCH₂Ph), 5,20 (széles s, 1H, NH) és 7,30-7,40 (m, 5H, Ph).

26-4 képletű N-(terc-butil-oxi-karbonil)-O-benzilL-szerinol-O-lb

4,3 g (14,3 mmol) 26-3 képletű N-(terc-butil-oxikarbonil)-O-benzil-L-szerinol 50 ml vízmentes piridinnel készült szárított oldatához szobahőmérsékleten hozzáadunk 2,02 g (20 mmol) TEA-t. A kapott oldathoz keverés közben hozzáadunk 3,16 g (20 mmol) izovajsavanhidridet, és a keverést egy éjszakán át argonatmoszférában folytatjuk. Ezután a reakcióelegyet szárazra pároljuk, majd 100 ml etil-acetát és 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldat között megosztjuk, majd etil-acetáttal extraháljuk. A szerves extraktumot 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk. A szárított oldatot szárazra pároljuk, a maradékot gyorskromatográfiával szilikagélen tisztítjuk, eluálószer: hexán—>etil-acetát. A tiszta farkciókat egyesítjük és bepároljuk, így 4,5 g (84%) olajos terméket kapunk.

Ή-NMR (CDC1₃): δ=1,04 (d, 6H, IbCH₃), 1,39 (s, 9H, Boc), 2,46 (m, 1H, IbCH), 3,40 (m, 2H),

3,92 (m, 2H), 4,12 (m, 1H), 4,46 (s, 2H, OCH₂Ph), 6,84 (d, 1H, NH) és 7,24-7,40 (m, 5H, Ph).

26-6 képletű N-(timinil-acetil)-O-benzil-Lszerinol-O-Ib

4,3 g (12,25 mmol) 26-4 képletű N-(terc-butil-oxikarbonilj-O-benzil-L-szerinol-O-Ib 20 ml trifluor-ecetsavval és 20 ml diklór-metánnal készült oldatát szobahőmérsékleten 30 percig keverjük. A reakcióelegyet ezután szárazra pároljuk, a maradékot 10 ml vízmentes metanolban oldjuk és újra szárazra pároljuk. A maradékot vákuumban 12 óra hosszat szilárd kálium-hidroxidon szárítjuk. A szárított terméket a következő reakcióban alkalmazzuk.

2,76 g (15 mmol) 7 képletű timin-ecetsavat feloldunk 75 ml vízmentes dimetil-formamidban, és argonatmoszférában -20 °C-ra hűtjük. A hideg oldathoz keverés közben hozzáadunk 1,72 g (17 mmol) N-metil-morfolint, majd 2,31 g (17 mmol) izobutil-klór-formiátot. Az elegyet 15 percig keverjük, majd a fenti trifluorecetsavas só 50 ml vízmentes dimetil-formamiddal készült és 1,72 g (17 mmol) N-metil-morfolinnal semlegesített oldatát egyben hozzáadjuk. A reakcióelegyet -20 °C-on 1 óra hosszat keverjük, majd szobahőmérsékletre melegítjük, és a keverést egy éjszakán át folytatjuk. Ezután az oldatot szárazra pároljuk, és a maradékot 250 ml diklór-metán és 100 ml víz elegyében oldjuk, majd diklór-metánnal extraháljuk. A szerves extraktumot 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk, szárítjuk és szárazra pároljuk, így nyersterméket kapunk, amelyet szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítunk, eluálószer: diklór—»metánaceton. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 4,8 g (94%) tiszta terméket kapunk, amelyet diklórmetán és hexán elegyéből kristályosítunk, olvadáspont: 122-124 °C.

Ή-NMR (CDC1₃): 5=1,04 (d, 6H, IbCH₃),

1,72 (s, 3H, CH₃), 2,44 (m, 1H, IbCH), 3,42 (m, 2H), 4,06 (m, 2H), 4,17 (m, 1H), 4,30 (s, 2H), 4,46 (s, 2H, OCH₂Ph), 7,24-7,40 (m, 6H, C₆H és Ph), 8,2 (d, 1H, NH) és 11,22 (s, 1H, NH).

képletű N-(timinil-acetil)-L-szerinol-O-Ib

2,08 g (5 mmol) 26-6 képletű N-(timinil-acetil)-Obenzil-L-szerinol-O-Ib-t feloldunk 50 ml metanolban, és szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,6 g palládiumdihidroxidot és 5 ml ciklohexént. A reakcióelegyet 12 óra hosszat 70 °C-on melegítjük, majd a katalizátort leszűrjük és 20 ml metanollal mossuk. A szűrletet szárazra pároljuk, így fehér, szilárd terméket kapunk, amelyet minimális mennyiségű metanolban oldunk, és szobahőmérsékletre hűtjük. A termék finom por formájában kristályosodik, olvadáspont: 196-198 °C. Hozam: 1,48 g (91%).

Ή-NMR (Me₂SO-d₆): δ=1,04 (d, 6H, IbCH₃),

1,72 (s, 3H, CH₃), 2,42 (m, 1H, IbCH), 3,40 (m, 2H),

3,94 (m, 2H), 4,06 (m, 1H), 4,28 (s, 2H), 4,90 (t, 1H, OH), 7,20 (s, 1H, C₆H), 8,12 (d, 1H, NH) és 11,22 (s, ΙΗ,ΝΗ).

képletű 4,4’-dimetoxi-tritil-N-(timinil-acetil)-Lszerinol-O-íb

1,48 g (4,5 mmol) 8 képletű N-(timinil-acetil)-Lszerinol-O-Ib-t argonatmoszférában feloldunk 50 ml vízmentes piridinben, majd keverés közben hozzáadunk 0,51 g (5 mmol) TEA-t és 0,10 g N,N-dimetilamino-piridint. 10 perc múlva hozzáadunk 1,69 g (5 mmol) 4,4’-dimetoxi-tritil-kloridot, és a keverést argonatmoszférában, szobahőmérsékleten egy éjszakán át folytatjuk. A reakcióelegyet 10 ml metanollal hígítjuk, további 10 percig keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradékot 200 ml etil-acetátban oldjuk és 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk. A kapott nyersterméket szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán—>etil-acetát. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 2,5 g (88%) terméket kapunk hab formájában.

Ή-NMR (CDC1₃): δ=1,04 (d, 6H, IbCH₃),

1.72 (s, 3H, CH₃), 2,40 (m, 1H, IbCH), 3,38 (m, 2H),

3.72 (s, 6H, 2,OCH₃), 4,12 (m, 2H), 4,20 (m, 1H),

4,32 (d, 2H), 6,84 (m, 4H, Ph), 7,20-7,40 (m, 12H, C₆H és Ph), 8,30 (d, 1H, NH) és 11,28 (s, 1H, NH).

képletű l-O-(4,4’-dimetoxi-tritil)-2-[amino(timinil-acetil)]-L-propán-1,3-diol

3,4 g (5,41 mmol) 9 képletű 4,4’-dimetoxi-tritil-N(timinil-acetil)-L-szerinol-O-Ib-t feloldunk 30 ml metanolban, és jeges fürdőn 0 °C-ra hűtjük. A hideg oldathoz keverés közben hozzáadunk 10 ml (20 mmol) 2 n nát26

HU 218 086 Β rium-hidroxidot, és a keverést 0 °C-on 30 percig folytatjuk. Ezután az oldat pH-ját ecetsavval 7 értékre állítjuk, majd szárazra pároljuk. A maradékot 50 ml víz és 150 ml diklór-metán között megosztjuk, és diklór-metánnal extraháljuk. A vizes fázist újabb 50 ml diklór-metánnal extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat 50 ml konyhasóoldattal mossuk, szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán—»aceton, így 3,0 g (99%).

‘H-NMR (CDC1₃): 5=1,72 (s, 3H, CH₃), 3,0 (m, 2H), 3,42 (m, 2H), 3,72 (s, 6H, 2.OCH₃), 3,94 (m, 1H),

4,32 (d, 2H), 4,68 (m, 1H, OH), 6,84 (m, 4H, Ph), 7,20-7,40 (m, 12H, C₆H és Ph), 8,06 (d, 1H, NH) és

11,28 (széles s, 1H, NH).

képletű l-O-(4,4’-dimetoxi-tritil)-2-[amino(timinil-acetil)]-L-propán-3-O-(N,N-diizopropil)-$ciano-etil-foszforamidit

3,1 g (5,55 mmol) 10 képletű 1-0-(4,4’-dimetoxitritil)-2-[amino-(timinil-acetil)]-L-propán-1,3-dióit vákuumban, egy éjszakán át szilárd nátrium-hidroxidon szárítunk, majd 100 ml vízmentes diklór-metánban feloldjuk. Az oldatot argonatmoszférában 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 1,29 g (10 mmol) N,Ndiizopropil-etil-amint, majd 1,96 g (8,3 mmol) 2-cianoetil-N,N-diizopropil-klór-foszforamiditet. A reakcióelegyet 0 °C-on 1 óra hosszat, majd szobahőmérsékleten 2 óra hosszat keverjük. Ezután 100 ml diklór-metánnal hígítjuk, és a szerves fázist 100 ml 5 tömeg/térfogat%os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk. A diklór-metános extraktumot szárítjuk és szárazra pároljuk, így olajos maradékot kapunk, amelyet szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítunk, eluálószer: diklór-metán—>0,1 térfogat% TEA-t tartalmazó etil-acetát. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így hab formájú terméket kapunk, amelyet vákuumban egy éjszakán át szilárd nátrium-hidroxidon szárítunk. A szárított habot 20 ml vízmentes diklór-metánban oldjuk, és argonatmoszférában 1 óra alatt keverés közben cseppenként hozzáadjuk 2000 ml hexánhoz. Az adagolás után kapott csapadékot további 1 óra hosszat keverjük, majd leszűrjük és 100 ml vízmentes hexánnal mossuk. A szilárd terméket 4 óra hosszat vákuumban szilárd nátrium-hidroxidon szárítjuk, így 3,5 g (83%) terméket kapunk.

27. példa (lásd 27. ábra)

27-2 képletű N-(terc-butil-oxi-karbonil)-O-benzilD-szerin g (25,64 mmol) 27-1 képletű O-benzil-D-szerint szobahőmérsékleten szuszpendálunk tetrahidrofurán és víz 8:2 térfogatarányú elegyének 70 ml-ében. A kapott elegyhez keverés közben hozzáadunk 4,04 g (40 mmol) trietil-amint, majd 6,54 g (30 mmol) di(terc-butil)-dikarbonátot, és a keverést szobahőmérsékleten egy éjszakán át folytatjuk. A homogén oldatot szárazra pároljuk, és a maradékot 150 ml etil-acetátban oldjuk. A szerves fázist 100 ml 0,5 n kálium-hidrogén-szulfát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk, így 7,56 g (100%) olajos terméket kapunk.

27—3 képletű N-(terc-butil-oxi-karbonil)-O-benzilD-szerinol

7,56 g (25,63 mmol) 27-2 képletű N-(terc-butil-oxikarbonil)-O-benzil-D-szerint feloldunk vízmentes tetrahidrofuránban, és argonatmoszférában -20 °C-ra hűtjük. A hideg oldathoz keverés közben hozzáadunk 3,03 g (30 mmol) TEA-t és 4,08 g (30 mmol) izobutil-kloroformátot. A keverést argonatmoszférában -20 °C-on további 30 percig folytatjuk, majd a reakcióelegyet argonfedés alatt azonnal leszűrjük, a csapadékot 50 ml vízmentes tetrahidrofuránnal mossuk. Az egyesített szűrleteket 10 perc alatt lassan hozzáadjuk 7,4 g (200 mmol) nátrium-bór-tetrahidrid tetrahidrofurán és víz 80:20 térfogatarányú elegyének 200 ml-ével készült 0 °C-os oldatához. Az adagolás után a reakcióelegyet 0 °C-on 2 óra hosszat keveijük, majd a pH-ját ecetsavval 7 értékre állítjuk. Ezután az oldatot szárazra pároljuk, a maradékot 300 ml etil-acetát és 150 ml víz között megosztjuk, és etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázist 100 ml konyhasóoldattal mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk. A nyersterméket szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán-»etil-acetát. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és szárazra pároljuk, így 6,68 g (92%) olajos terméket kapunk.

‘H-NMR (CDCI3): 5=1,41 (s, 9H, Boc), 3,60-3,70 (m, 4H), 3,82 (d, 2H), 4,53 (s, 2H, OCH₂Ph), 5,20 (széles s, 1H, NH) és 7,30-7,40 (m, 5H, Ph).

27-4 képletű N-(terc-butil-oxi-karbonil)-O-benzilD-szerinol-O-Ib

6,6 g (23,5 mmol) 27-3 képletű N-(terc-butil-oxikarbonil)-O-benzil-D-szerinol 50 ml vízmentes piridinnel készült szárított oldatához szobahőmérsékleten hozzáadunk 3,03 g (30 mmol) TEA-t. Az oldathoz keverés közben hozzáadunk 4,74 g (30 mmol) izovajsavanhidridet, és a keverést argonatmoszférában egy éjszakán át folytatjuk. A reakcióelegyet szárazra pároljuk, 200 ml etil-acetát és 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldat között megosztjuk, és etil-acetáttal extraháljuk. A szerves extraktumot 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk. A szárított oldatot szárazra pároljuk, a kapott nyersterméket szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: hexán—>etil-acetát. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 8,0 g (97%) olajos terméket kapunk.

‘H-NMR (CDCI3): 5=1,04 (d, 6H, IbCH₃), 1,39 (s, 9H, Boc), 2,46 (m, 1H, IbCH), 3,40 (m, 2H),

3,92 (m, 2H), 4,12 (m, 1H), 4,46 (s, 2H, OCH₂Ph), 6,84 (d, 1H, NH) és 7,24-7,40 (m, 5H, Ph).

27-6 képletű N-(timinil-acetil)-O-benzil-Dszerinol-O-Ib

5,0 g (14,25 mmol) 27-4 képletű N-(terc-butil-oxikarbonil)-O-benzil-D-szerinol-O-Ib 20 ml trifluor-ecetsavval és 20 ml diklór-metánnal készült elegyét szobahőmérsékleten 30 percig keveijük. Ezután a reakcióelegyet szárazra pároljuk, a maradékot 10 ml vízmentes metanolban oldjuk, és újra szárazra pároljuk. A maradékot 150 ml diklór-metánban oldjuk, pH-ját 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal 7 értékre

HU 218 086 Β állítjuk, és diklór-metánnal extraháljuk. A szerves fázist 50 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk, majd szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékot vákuumban 12 óra hosszat szilárd kálium-hidroxidon szárítjuk, majd így használjuk a következő lépésben.

2,57 g (14 mmol) 7 képletű timin-ecetsavat feloldunk 50 ml vízmentes dimetil-formamidban, és argonatmoszférában -20 °C-ra hűtjük. A hideg oldathoz keverés közben hozzáadunk 1,52 g (15 mmol) N-metil-morfolint, majd 2,04 g (15 mmol) izobutil-kloroformátot. 15 percig végzett keverés után egy részletben, keverés közben hozzáadjuk a fenti amin 50 ml vízmentes dimetil-formamiddal készült oldatát. A reakcióelegyet -20 °C-on 1 óra hosszat keverjük, majd szobahőmérsékletre melegítjük, és a keverést egy éjszakán át folytatjuk. Ezután az oldatot szárazra pároljuk, a maradékot 250 ml diklór-metánban és 100 ml vízben oldjuk, és diklór-metánnal extraháljuk. A szerves extraktumot 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk, majd szárítjuk és szárazra pároljuk. A kapott nyersterméket szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán—>aceton. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 2,8 g (54%) tiszta terméket kapunk.

Ή-NMR (CDC1₃): δ=1,04 (d, 6H, IbCH₃),

1,72 (s, 3H, CH₃), 2,44 (m, 1H, IbCH), 3,42 (m, 2H), 4,06 (m, 2H), 4,18 (m, 1H), 4,30 (s, 2H), 4,46 (s, 2H, OCH₂Ph), 7,24-7,40 (m, 6H, C₆H és Ph), 8,22 (d, 1H, NH) és 11,22 (s, 1H, NH).

A cím szerinti terméket az L-izomer előállításánál ismert módszerrel is előállítjuk. Alkalmazott reagensek: 2,2 g (12 mmol) timin-ecetsav, 1,77 g (13 mmol) izobutil-klór-formiát, 1,52 g (15 mmol) N-metil-morfolin, 3,65 g (10 mmol) TFA-só, 1,5 g (15 mmol) Nmetil-morfolin és 100 ml vízmentes dimetil-formamid. Hozam: 3,5 g(84%).

27-8 képletű N-(timiml-acetil)-D-szerinol-O-Ib

3,5 g (8,39 mmol) 27-6 képletű N-(timinil-acetil)O-benzil-D-szerinol-O-Ib-t feloldunk 50 ml etanolban és szobahőmérsékleten hozzáadunk 1,0 g palládiumdihidroxidot és 10 ml ciklohexént. A reakcióelegyet 70 °C-on 12 óra hosszat melegítjük, majd a katalizátort leszűrjük és 20 ml metanollal mossuk. A szűrletet szárazra pároljuk, így 2,7 g (98%) fehér, szilárd terméket kapunk. Hozam: 2,7 g (98%).

Ή-NMR (Me₂SO-d₆): δ=1,04 (d, 6H, IbCH₃),

1,72 (s, 3H, CH₃), 2,42 (m, 1H, IbCH), 3,40 (m, 2H),

3,94 (m, 2H), 4,06 (m, 1H), 4,28 (s, 2H), 4,90 (t, 1H, OH), 7,20 (s, 1H, C₆H), 8,12 (d, 1H, NH) és 11,22 (s, 1H, NH).

27-9 képletű 4,4’-dimetoxi-tritil-N-(timinil-acetil)D-szerinol-O-lb

2,7 g (8,26 mmol) 27-8 képletű N-(timinil-acetil)D-szerinol-O-Ib-t argonatmoszférában feloldunk 50 ml vízmentes piridinben. Az oldathoz keverés közben hozzáadunk 1,01 g (10 mmol) TEA-t, majd 3,38 g (10 mmol) 4,4’-dimetoxi-tritil-kloridot, és a keverést szobahőmérsékleten argonatmoszférában egy éjszakán át folytatjuk. A reakcióelegyet 10 ml metanollal hígítjuk, 10 percig keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradékot 250 ml etil-acetátban oldjuk, 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk. A nyersterméket szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán—>etil-acetát. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 5,0 g (96%) terméket kapunk hab formájában.

Ή-NMR (CDClj): δ=1,04 (d, 6H, IbCH₃),

1.72 (s, 3H, CH₃), 2,40 (m, 1H, IbCH), 3,38 (m, 2H),

3.72 (s, 6H, 2.OCH₃), 4,12 (m, 2H), 4,20 (m, 1H),

4,32 (d, 2H), 6,84 (m, 4H, Ph), 7,20-7,40 (m, 12H, C₆H és Ph), 8,30 (d, 1H, NH) és 11,28 (s, 1H, NH).

27-10 képletű l-O-(4,4’-dimetoxi-tritil)-2-[amino(timinil-acetil)]-D-propán-l ,3-diol

5,0 g (7,95 mmol) 27-9 képletű 4,4’-dimetoxi-tritilN-(timinil-acetil)-D-szerinol-O-Ib-t feloldunk 30 ml metanolban és jeges fürdőn 0 °C-ra hűtjük. A hideg oldathoz keverés közben hozzáadunk 10 ml (20 mmol) 2 n nátrium-hidroxid-oldatot, és a keverést 0 °C-on 30 percig folytatjuk. Ezután az oldat pH-ját ecetsavval 7 értékre állítjuk, és az oldatot bepároljuk. A maradékot 50 ml víz és 250 ml diklór-metán között megosztjuk és diklórmetánnal extraháljuk. A vizes fázist további 50 ml diklór-metánnal extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat 50 ml konyhasóoldattal mossuk, szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer diklór-metán—>aceton. Hozam : 4,0 g (90%).

Ή-NMR (CDC1₃): δ= 1,72 (s, 3H, CH₃), 3,0 (m, 2H), 3,42 (m, 2H), 3,72 (s, 6H, 2.0CH₃), 3,94 (m, 1H),

4,32 (d, 2H), 4,68 (m, 1H, OH), 6,84 (m, 4H, Ph), 7,20-7,40 (m, 12H, C₆H és Ph), 8,06 (d, 1H, NH) és

11.28 (széles s, 1H, NH).

27-11 képletű 1 -0-(4,4’-dimetoxi-tritil)-2-[amino(timinil-acetil)]-D-propán-3-O-(N,N-diizopropil)-$ciano-etil-foszforamidot

2,79 g (5,0 mmol) 27-10 képletű 1-0-(4,4’-dimetoxi-tritil)-2-[amino-(timinil-acetil)]-D-propán-1,3diolt vákuumban egy éjszakán át szilárd nátrium-hidroxidon szárítunk, majd 100 ml vízmentes diklór-metánban oldunk. Az oldatot argonatmoszférában 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 1,29 g (10 mmol) N,Ndiizopropil-etil-amint, majd 1,96 g (8,3 mmol) 2-cianoetiI-N,N-diizopropil-klór-foszforamiditet. A reakcióelegyet 0 °C-on 1 óra hosszat, majd szobahőmérsékleten 2 óra hosszat keverjük. Ezután 100 ml diklór-metánnal hígítjuk, és a szerves fázist 100 ml 5 tömeg/térfogat%os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk, szárítjuk és szárazra pároljuk. A kapott olajos maradékot szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer diklór-metán—>0,1 térfogat% TEA-t tartalmazó etil-acetát. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így habot kapunk, amelyet vákuumban egy éjszakán át szilárd nátrium-hidroxidon szárítunk. A szárított habot 20 ml diklór-metánban oldjuk, és argonatmoszférában keverés közben 1 óra alatt 2000 ml hexánba csöpögtetünk. Az adagolás után a képződött csapadékot további 1 óra

HU 218 086 Β hosszat keverjük, majd leszűrjük és 100 ml vízmentes hexánnal mossuk. A kapott szilárd anyagot vákuumban óra hosszat szilárd nátrium-hidroxidon szárítjuk, így 3,3 g (87%) terméket kapunk.

28. példa (lásd 28. ábra)

28-21 képletű l-O-benzil-2-[(terc-butil-oxi-karbonil)-amino]-3-[N₃-benzoil-(timinil)]-L-propanol

5,75 g (25 mmol) N₃-benzoil-timin 200 ml vízmentes tetrahidrofúránnal készült oldatához argonatmoszférában keverés közben szobahőmérsékleten hozzáadunk 10,48 g (40 mmol) trifenil-foszfint és 5,3 g (18,86 mmol) 28 3 képletű N_a-terc-butil-oxi-karbonilβ-benzil-oxi-L-szerinolt. 10 perc múlva 30 perc alatt lassan hozzáadunk 6,96 g (40 mmol) dietil-azo-dikarboxilátot. A reakcióelegyet alumíniumfóliával lefedjük, és szobahőmérsékleten argonatmoszférában 24 óra hosszat keverjük. Ezután szárazra pároljuk, és a maradékot 300 ml etil-acetátban oldjuk. A szerves fázist 100 ml tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonátoldattal, 100 ml vízzel és 100 ml konyhasóoldattal mossuk, és nátrium-szulfáton szárítjuk. A szárított etil-acetátos extraktumot szárazra pároljuk, így narancsszínű olajat kapunk. A nyersterméket szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: hexán—>etil-acetát. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így halványrózsaszín olajat kapunk, hozam : 8,0 g (86%).

Ή-NMR (CDC1₃) : 1,41 (s, 9H, Boc), 1,72 (s, 3H, CH₃), 3,56 (m, 2H), 4,20 (m, 2H), 4,32 (m, 1H), 4,52 (d, 2H, OCH₂Ph), 5,20 (d, 1H, NH), 7,06 (s, 1H, C₆H) és 7,20-7,60 (m, 10H, Ph).

28-22 képletű 2-[(terc-butil-oxi-karbonil)-amino]3-[N₃-benzoil-(timinil)]-L-propan-l-ol

4,93 g (10 mmol) 28-21 képletű l-O-benzil-2[(terc-butil-oxi-karbonil)-amino]-3-[N₃-benzoil-(timinil)]-L-propanolt feloldunk 100 ml metanolban, és hozzáadunk 1 g 10%-os szénhordozós palládiumot. A reakcióelegyet 12 óra hosszat 345 kPa nyomáson hidrogénezzük, ezután a katalizátort leszűrjük és 50 ml metanollal mossuk, majd a szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot aceton és hexán elegyéből kristályosítjuk, így 3,76 g (92%) tiszta terméket kapunk, olvadáspont: 156-159°C.

Ή-NMR (CDC1₃): 1,42 (s, 9H, Boc), 1,94 (s, 3H, CH₃), 3,64 (m, 4H), 3,84 (m, 1H), 4,14 (m, 1H), 5,22 (d, 1H, NH), 7,18 (s, 1H, C₆H), 7,48 (t, 2H, Ph), 7,62 (t, 1H, Ph) és 7,98 (d, 2H, Ph).

28-23 képletű l-O-izobutiril-2-[(terc-butil-oxikarbonil)-amino]-3-[N₃-benzoil-(timinil)]-L-propanol

1,60 g (3,97 mmol) 28-22 képletű 2-[(terc-butiloxi-karbonil)-amino]-3-[N₃-benzoil-(timinil)]-L-propan-l-ol-t feloldunk 30 ml vízmentes piridinben, és argonatmoszférában szobahőmérsékleten keverjük. Az oldathoz keverés közben hozzáadunk 0,51 g (5 mmol) TEA-t és 0,79 g (5 mmol) izovajsavanhidridet. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 12 óra hosszat keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradékot 150 ml etilacetátban oldjuk, és 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk. A szerves fázist szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán—>etilacetát. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 1,6 g (85%) terméket kapunk hab formájában, amelyet aceton és hexán elegyéből átkristályosítunk, olvadáspont: 165-167 °C.

Ή-NMR (CDC1₃): 1,16 (d, 6H, IbCH₃), 1,42 (s, 9H, Boc), 1,94 (s, 3H, CH₃), 2,52 (m, 1H), 3,64 (m, 4H), 3,84 (m, 1H), 4,14 (m, 1H), 5,22 (d, 1H, NH), 7,18 (s, 1H, C₆H), 7,48 (t, 2H, Ph), 7,62 (t, 1H, Ph) és 7,98 (d, 2H, Ph).

28-24 képletű l-O-izobutiril-2-[($-hidroxi-acetil)amino]-3-[N₃-benzoil-(timinil)]-L-propanol

1,6 g (3,38 mmol) 28-23 képletű 1-O-izobutiril-2[(terc-butil-oxi-karbonil)-amino]-3-[N₃-benzoil-(timinil)]-propanol és 5 ml TFA, valamint 10 ml diklórmetán elegyét szobahőmérsékleten 30 percig keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradékot 10 ml vízmentes metanolban oldjuk, és újra bepároljuk. A maradékot vákuumban egy éjszakán át szilárd nátrium-hidroxidon szárítjuk. A szárított anyagot közvetlenül felhasználjuk a következő lépésben.

0,53 g (7 mmol) glikolsav 50 ml vízmentes dimetilformamiddal készült oldatához keverés közben hozzáadunk 0,67 g (5 mmol) 1-hidroxi-benzotriazolt és 1,91 g (10 mmol) l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidrokloridot. A keverést 15 percig folytatjuk, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 1,01 g (10 mmol) TEA-t és a fenti TFA-só 20 ml dimetilformamiddal készült oldatát. A reakcióelegyet 12 óra hosszat keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradékot 150 ml diklór-metán és 100 ml víz között megosztjuk, és diklór-metánnal extraháljuk. A szerves extraktumot 50 ml konyhasóoldattal mossuk, szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán—>aceton. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 1,35 g (92%) terméket kapunk hab formájában.

Ή-NMR (CDC1₃): 1,16 (d, 6H, IbCH₃), 1,94 (s, 3H, CH₃), 2,52 (m, 1H), 3,20 (széles s, 1H), 3,80-4,30 (m, 6H), 4,56 (m, 1H), 7,14 (d, 2H, C₆H és NH), 7,50 (t, 2H, Ph), 7,64 (t, 1H, Ph) és 7,94 (d, 2H, Ph).

28-25 képletű l-O-izobutiril-2-{[$-(4,4’-dimetoxitriiil)-O-acetil]-amino}-3-[N₃-benzoil-(timinil)]-Lpropanol

1,2 g (2,78 mmol) 28-24 képletű l-O-izobutiril-2[^-hidroxi-acetil)-amino]-3-[N₃-benzoil-(timinil)]-Lpropanolt feloldunk 50 ml vízmentes piridinben, és argonatmoszférában szobahőmérsékleten keverjük. Az oldathoz keverés közben hozzáadunk 0,35 g (3,5 mmol) TEA-t és 1,18 g (3,5 mmol) 4,4’-dimetoxi-tritil-kloridot. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 12 óra hosszat keverjük, majd 10 ml metanollal hígítjuk és szárazra pároljuk. A maradékot 150 ml etil-acetátban oldjuk és 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk. A szerves extraktumot nátrium-szulfá29

HU 218 086 Β tón szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán—>etil-acetát. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 1,7 g (83%) tiszta terméket kapunk.

Ή-NMR (CDClj): 1,16 (d, 6H, IbCH₃), 1,94 (s, 3H, CH₃), 2,52 (m, 1H), 3,74 (s, 6H, 2.OCH₃), 3,80-4,30 (m, 6H), 4,56 (m, 1H), 6,82 (d, 4H, Ph), 7,14 (d, 2H, C₆H és NH) és 7,26-8,00 (m, 14H, Ph).

28-26 képletű 2-{[$-(4,4’-dimetoxi-tritil)-Oacetil]-amino}-3-timinil-L-propanol

1,55 g (2,05 mmol) {[(4,4’-dimetoxi-tritil)-O-acetilj-amino}-3-[N₃-benzoil-(timinil)]-L-propanolt feloldunk 20 ml metanolban, és jeges fürdőn 0 °C-ra hűtjük. A hideg oldathoz keverés közben hozzáadunk 5 ml (10 mmol) 2 n nátrium-hidroxid-oldatot, és a keverést 0 °C-on 30 percig folytatjuk. Ezután az oldat pH-ját ecetsavval 7 értékre állítjuk, és az oldatot bepároljuk. A maradékot 50 ml víz és 150 ml diklór-metán között megosztjuk, és diklór-metánnal extraháljuk. A vizes fázist további 50 ml diklór-metánnal extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat 50 ml konyhasóoldattal mossuk, szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán—>aceton, így 1,0 g (99%) terméket kapunk.

Ή-NMR (CDC1₃): 1,94 (s, 3H, CH₃), 3,74 (s, 6H, 2.0CH₃), 3,80-4,30 (m, 6H), 4,56 (m, 1H), 6,82 (d, 4H, Ph), 7,14 (d, 2H, C₆H és NH) és 7,26-8,00 (m, 14H, Ph).

28-27 képletű 2-{[$-(4,4’-dimetoxi-tritil)-O-acetil]-amino/-3-timinil-L-propán-1-0-(81,N-diizopropil)$-ciano-etil-foszforamidit

1,00 g (2,09 mmol) 28-26 képletű 2-{[β-(4,4’-ΰϊmetoxi-tritil)-O-acetil]-amino}-3-timidil-L-propanolt vákuumban egy éjszakán át szilárd nátrium-hidroxidon szárítunk, majd 50 ml vízmentes diklór-metánban oldjuk. Az oldatot argonatmoszférában 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 0,54 g (4,2 mmol) N,Ndiizopropil-etil-amint, majd 1,73 g (3,1 mmol) 2-cianoetil-N,N-diizopropil-klór-foszforamiditet. A reakcióelegyet 0 °C-on 1 óra hosszat, majd szobahőmérsékleten 2 óra hosszat keverjük. Ezután 100 ml diklór-metánnal hígítjuk, a szerves fázist 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk. A diklór-metános extraktumot szárítjuk és szárazra pároljuk, így olajos maradékot kapunk, amelyet szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítunk, eluálószer: diklór-metán-»0,l térfogat% TEA-t tartalmazó etil-acetát. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, az így kapott habot vákuumban egy éjszakán át szilárd nátrium-hidroxidon szárítjuk, majd 10 ml vízmentes diklór-metánban oldjuk, és argonatmoszférában 30 perc alatt keverés közben 800 ml vízmentes hexánba csepegtetjük. Az adagolás befejezése után kapott csapadékot további 30 percig keverjük, majd szűrjük és 100 ml vízmentes hexánnal mossuk, vákuumban 4 óra hosszat szilárd nátrium-hidroxidon szárítjuk, így 1,3 g (82%) terméket kapunk.

29. példa (lásd 29. ábra)

29-28 képletű N°-terc-butil-oxi-karbonil-Obenzil-hidroxil-amin

15,9 g (100 mmol) O-benzil-hidroxil-amin-hidrokloridot szuszpendálunk 150 ml tetrahidrofurán és 50 ml víz elegyében, majd hozzáadunk 15,15 g (150 mmol) TEA-t, majd 23,98 g (110 mmol) di(terc-butil)dikarbonátot. A reakcióelegyet 12 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradékot 250 ml etil-acetát és 200 ml víz között megosztjuk, és etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumot 100 ml kálium-hidrogén-szulfát-oldattal és 100 ml konyhasóoldattal mossuk, szárítjuk és szárazra pároljuk, így 15 g (91%) tiszta olajat kapunk.

29-29 képletű l-klór-2-(tetrahidropiranil)-oxi-etán

8,06 g (100 mmol) 1-klór-etanolt feloldunk 100 ml vízmentes diklór-metánban és argonatmoszférában jeges fürdőn 0 °C-ra hűtjük. A hideg oldathoz keverés közben hozzáadunk 12,6 g (150 mmol) dihidropiránt, majd 1,25 g (5 mmol) piridinium-p-toluol-4-szulfonátot, és az elegyet egy éjszakán át keverjük. Ezután a reakcióelegyet szárazra pároljuk, és a maradékot 200 ml etilacetátban oldjuk. A kapott oldatot 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 100 ml konyhasóoldattal mossuk. A szerves extraktumot szárítjuk és szárazra pároljuk. A kapott nyerstennéket szilikagélen kromatográfiásan tisztítjuk, eluálószer: hexán—>diklór-metán. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 11 g (67%) tiszta terméket kapunk.

29-30 képletű N-terc-butil-oxi-karbonil-N-[(tetrahidropiranil)-oxi]-etil-O-benzil-hidroxil-amin

5,79 g (25,96 mmol) 29-28 képletű N-terc-butiloxi-karbonil-O-benzil-hidroxil-amin 50 ml vízmentes dimetil-formamiddal készült oldatához keverés közben argonatmoszférában 0 °C-on 15 perc alatt lassan hozzáadunk 1,2 g 60%-os nátrium-hidridet (30 mmol). A reakcióelegyet 0 °C-on 30 percig, majd szobahőmérsékleten 1 óra hosszat keverjük. Ezután hozzáadunk

4,95 g (30 mmol) 29-29 képletű l-klór-2-(tetrahidropiranil-oxi)-etánt, és a reakcióelegyet 12 óra hosszat 80 °C-on melegítjük. Ezután a reakcióelegyet lehűtjük és szárazra pároljuk. A maradékot 50 ml vízben szuszpendáljuk, pH-ját 7 értékre állítjuk, és 150 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumot vízzel és konyhasóoldattal mossuk, szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: hexán—>diklór-metán. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 6,0 g (66%) olajos terméket kapunk.

Ή-NMR (CDClj): 0=1,48 (s, 9H, Boc), 1,49-1,84 (m, 6H, 3.CH₂), 3,48-3,70 (m, 4H, 2.CH₂), 3,86 (m, 2H, CH₂), 4,60 (t, 1H, CH) 4,84 (s, 2H, CH₂Ph) és 7,32-7,42 (m, 5H, Ph).

29-31 képletű N-terc-butil-oxi-karbonil-N-[(2hidroxi)-etil]-O-benzil-hidroxil-amin

3,51 g (10 mmol) 29-30 képletű N-terc-butil-oxikarbonil-N-(tetrahidropiranil-oxi)-etil-0-benzil-hídroxil-amin tetrahidrofurán, víz és ecetsav 1:1:1 térfogatarányú elegyének 100 ml-ével készült oldatát keverés

HU 218 086 Β közben 3 óra hosszat 70 °C-on melegítjük. Ezután 0 °C-ra hűtjük, pH-ját szilárd nátrium-hidrogén-karbonáttal 7 értékre állítjuk és 2x75 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves extraktumokat 100 ml vízzel és 100 ml konyhasóoldattal mossuk, szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán—>etilacetát. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 2,5 g (94%) terméket kapunk hab formájában.

•H-NMR (CDC1₃): δ= 1,48 (s, 9H, Boc), 3,60 (t, 2H, CH,), 3,74 (m, 2H, CH₂), 4,84 (s, 2H, CH₂Ph) és 7,32-7,42 (m, 5H, Ph).

29-32 képletű N-terc-butil-oxi-karbonil-N-{[(2izobutiril)-oxi]-etil}-O-benzil-hidroxil-amin

4,2 g (16,6 mmol) 29-31 képletű N-terc-butil-oxikarbonil-N-[(2-hidroxi)-etil]-O-benzil-hidroxil-amin 50 ml vízmentes piridinnel készült oldatához argonatmoszférában szobahőmérsékleten keverés közben hozzáadunk 2,02 g (20 mmol) TEA-t, majd 3,16 g (20 mmol) izovajsavanhidridet. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 12 óra hosszat keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradékot 200 ml etil-acetátban oldjuk és 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk. A szerves extraktumot szárítjuk és szárazra pároljuk, a maradékot szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 4,5 g (80%) tiszta terméket kapunk.

Ή-NMR (CDC1₃): δ=1,04 (d, 6H, IbCH₃), 1,48 (s, 9H, Boc), 2,44 (m, 1H, IbCH), 3,60 (t, 2H, CH₂), 3,74 (m, 2H, CH₂), 4,84 (s, 2H, CH₂Ph) és 7,32-7,42 (m, 5H, Ph).

29-33 képletű N-{timinil-acetil-N-[(2-izobutiril)oxi]-etil}-O-benzil-hidroxil-amin

5,0 g (14,84 mmol) 29-32 képletű N-terc-butil-oxikarbonil-N-[(2-izobutiril-oxi)-etil]-0-benzil-hidroxilamint feloldunk 10 ml diklór-metánban, és 12 ml TFAval együtt 30 percig keverjük. Ezután a reakcióelegyet szárazra pároljuk, a maradékot 10 ml vízmentes metanolban oldjuk, újra szárazra pároljuk és vákuumban egy éjszakán át szilárd nátrium-hidroxidon szárítjuk. A száraz anyagot azonnal felhasználjuk a következő lépésben.

3,13 mg (17 mmol) 7 képletű timin-ecetsavat feloldunk 75 ml vízmentes dimetil-formamidban, és argonatmoszférában -20 °C-ra hűtjük. A hideg oldathoz keverés közben hozzáadunk 2,02 g (20 mmol) N-metil-morfolint, majd 2,72 g (20 mmol) izobutil-klór-formiátot. A keverést 15 percig folytatjuk, majd a fenti TFA-só 50 ml vízmentes dimetil-formamiddal készült, 20,2 g (20 mmol) N-metil-morfolinnal semlegesített oldatát egy részletben hozzáadjuk. A reakcióelegyet -20 °C-on 1 óra hosszat keverjük, szobahőmérsékletre melegítjük, és a keverést egy éjszakán át folytatjuk. Ezután az oldatot szárazra pároljuk, a maradékot 250 ml diklór-metánban és 100 ml vízben oldjuk és diklór-metánnal extraháljuk. A szerves extraktumot 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk, szárítjuk és szárazra pároljuk. A kapott nyersterméket szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: diklórmetán—»aceton. A kívánt frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 4,0 g (70%) tiszta terméket kapunk, amelyet diklór-metán és hexán elegyéből kristályosítunk, olvadáspont: 185-188 °C.

Ή-NMR (Me.SO-t^): δ=1,00 (d, 6H, IbCH₃), 1,74 (s, 3H, CH₃), 2,44 (m, 1H, IbCH), 3,92 (m, 2H), 4,18 (t, 2H), 4,68 (széles s, 2H), 4,98 (s, 2H), 7,34 (s, 1H, C₆H), 7,40-7,50 (m, 5H, Ph) és 11,32 (széles s, ΙΗ,ΝΗ).

30. példa (lásd 30. ábra)

30-35 képletű (2R,4R)-2-karbometoxi-4-hidroxipirrolidin

Egy 250 ml-es, mágneses keverővei és visszafolyató hűtővel felszerelt gömblombikba bemérünk 40 ml vízmentes metanolt, és argonatmoszférában jeges fürdőn lehűtjük. Keverés közben 4,32 g (55 mmol) acetilkloridot, majd 5,00 g (38,17 mmol) 30-34 képletű cisz-4-hidroxi-D-prolint adagolunk. A kapott oldatot 7-8 óra hosszat visszafolyató hűtő alatt forraljuk, majd szobahőmérsékletre hűtjük. Ezután dietil-éterrel hígítjuk, és a kapott fehér, szilárd anyagot leszűrjük, dietiléterrel mossuk és vákuumban szilárd nátrium-hidroxidon szárítjuk, így 6,9 g (100%) terméket kapunk.

‘H-NMR (CDClj): 2,09 (2dd, 1H), 2,34 (m, 2H), 3,49-3,73 (m, 3H), 3,79 (s, 3H, CH₃), 4,34 (m, 2H).

30-36 képletű (2R,4R)-l-(terc-butil-oxi-karbonil)2-karbometoxi-4-hidroxi-pirrolidin

6,9 g (38,12 mmol) 30-35 képletű (2R,4R)-2karbometoxi-4-hidroxi-pirrolidin tetrahidrofurán és víz 8:2 térfogatarányú elegyének 150 ml-ével készült oldatához keverés közben szobahőmérsékleten hozzáadunk 10.1 g (100 mmol) TEA-t, majd 10,9 g (50 mmol) di(:erc-butil)-dikarbonátot. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 6 óra hosszat keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradékot 200 ml etil-acetátban oldjuk, 50 ml 0,5 n kálium-hidrogén-szulfát-oldattal, 100 ml vízzel és 50 ml konyhasóoldattal mossuk. A szerves extraktumot nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk, így 7,8 g (84%) olajos terméket kapunk. Az olajos termék szárítás hatására színtelen, szilárd anyaggá alakul, olvadáspont: 75-77 °C.

•H-NMR (CDC1₃): 1,45 (s, 9H, Boc), 2,09 (2dd, 1H), 2,34 (m, 1H), 3,49-3,73 (m, 3H), 3,79 (s, 3H, CH₃), 4,34 (m, 2H).

30-37 képletű (2R,4R)-l-(terc-butil-oxi-karbonil)2-hidroxi-metil-4-hidroxi-pirrolidin

7,0 g (28,6 mmol) (2R,4R)-l-(terc-butil-oxi-karbonil )-2-karbometoxi-4-hidroxi-pirrolidint feloldunk 100 ml vízmentes tetrahidrofuránban, és argonatmoszférában jeges fürdőn lehűtjük. A hideg oldathoz 15 perc alatt kis részletekben hozzáadunk 1,88 g (85,8 mmol) lítium-bór-hidridet. Az adagolás befejezése után a reakcióelegyet 0 °C-on 1 óra hosszat, majd szobahőmérsékleten 15 óra hosszat argonatmoszférában keverjük. Ezután a reakcióelegyet 0 °C-ra hűtjük, 50 ml vízzel hígítjuk, és pH-ját ecetsavval 6 értékre állítjuk. Ezután szárazra pároljuk, a maradékot 200 ml etil-acetátban oldjuk, és 100 ml vízzel és 100 ml konyhasóoldattal mos31

HU 218 086 Β suk. Ezután szárazra pároljuk, a maradékot szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán->etil-acetát. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és szárazra pároljuk, így 5,00 g (81%) tiszta olajat kapunk. Az olaj állás hatására színtelen, szilárd anyaggá alakul, olvadáspont: 95-97 °C.

Ή-NMR (CDClj): 1,45 (s, 9H, Boc), 1,90 (dd, 1H), 2,34 (m, 1H), 3,40-3,62 (m, 3H), 4,00 (m, 2H),

4,28 (széles s, 1H), 4,44 (m, 1H).

30-38 képletű (2R,4R)-l-(terc-butil-oxi-karbonil)2-(4,4 ’-dimetoxi-tritil)-oxi-metil-4-hidroxi-pirrolidin

4,4 g (20,28 mmol) 30-37 képletű (2R,4R)-l-(tercbutil-oxi-karbonil)-2-hidroxi-metil-4-hidroxi-pirrolidint feloldunk 50 ml vízmentes piridinben, és argonatmoszférában keverjük. Az oldathoz keverés közben hozzáadunk 2,53 g (25 mmol) TEA-t, majd 7,45 g (22 mmol) 4,4’-dimetoxi-tritil-kloridot. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 12 óra hosszat keverjük, majd 10 ml metanollal hígítjuk. Ezután szárazra pároljuk, és a maradékot 200 ml etil-acetátban oldjuk. Az etil-acetátos oldatot 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml vízzel és konyhasóoldattal mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: hexán—>etil-acetát. A kívánt frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 8,09 g (100%) narancsszínű habot kapunk.

Ή-NMR (CDClj): 1,45 (s, 9H, Boc), 1,90 (dd, 1H), 2,34 (m, 1H), 3,40-3,62 (m, 3H), 3,74 (s, 6H, 2.OCH3), 4,00 (m, 2H), 4,28 (széles s, 1H), 4,44 (m, 1H), 6,82 (d, 4H, Ph) és 7,26-8,00 (m, 9H, Ph).

30-39 képletű (2R,4R)-l-(terc-butil-oxi-karbonil)2-(4,4'-dimetoxi-tritil)-oxi-metil-4-[(p-toluol-szulfonil)-oxi]-pirrolidin

8,09 g (20,27 mmol) 30-38 képletű (2R,4R)-l-(tercbutil-oxi-karbonil)-2-(4,4’-dimetoxi-tritil)-oxi-metil-4hidroxi-pirrolidint feloldunk vízmentes piridin és diklórmetán 2:1 térfogatarányú elegyének 200 ml-ében, majd argonatmoszférában jeges fürdőn hűtjük. A hideg oldathoz hozzáadunk 3,03 g (30 mmol) TEA-t, majd 5,7 g (30 mmol) p-toluolszulfonil-kloridot. A reakcióelegyet 0 °C-on 3 óra hosszat, majd 30 °C alatt 8 óra hosszat keverjük, ezután szárazra pároljuk és 200 ml etil-acetát és 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldat között megosztjuk, és etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumot 100 ml vízzel és 100 ml konyhasóoldattal mossuk, szárítjuk és szárazra pároljuk. A nyersterméket szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: hexán—>etil-acetát. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 12,2 g (89%) narancsszínű olajat kapunk.

Ή-NMR (CDC1₃): 1,45 (s, 9H, Boc), 1,90 (dd, 1H), 2,34 (m, 1H), 2,40 (s, 3H, CH₃), 3,40-3,62 (m, 3H), 3,74 (s, 6H, 2.OCH₃), 4,00 (m, 2H), 4,28 (széles s, 1H), 4,44 (m, 1H), 6,82 (d, 4H, Ph) és 7,26-8,00 (m, 13H, Ph).

30-40 képletű (2R,4S)-l-(terc-butil-oxi-karbonil)2-(4,4 ’-dimetoxi-tritil)-oxi-metil-4-azido-pirrolidin

5,1 g (7,58 mmol) 30-39 képletű (2R,4R)-l-(tercbutil-oxi-karbonil)-2-(4,4’-dimetoxi-tritil)-oxi-metil-4(p-toluolszulfonil-oxi)-pirrolidint feloldunk 50 ml dimetil-formamidban és 5 ml vízzel hígítjuk. Az oldathoz keverés közben hozzáadunk 0,65 g (10 mmol) nátriumazidot, és 8 óra hosszat 80 °C-on melegítjük. Ezután lehűtjük és szárazra pároljuk. A maradékot 200 ml diklórmetán és 100 ml víz között megosztjuk, és diklór-metánnal extraháljuk. A szerves extraktumot 50 ml konyhasóoldattal mossuk, nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk. A nyersterméket szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: hexán-»etil-acetát. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 3,8 g (92%) tiszta olajat kapunk.

Ή-NMR (CDC1₃): 1,45 (s, 9H, Boc), 1,90 (dd, 1H), 2,34 (m, 1H), 3,40-3,62 (m, 3H), 3,74 (s, 6H, 2.OCH₃), 4,00 (m, 2H), 4,28 (széles s, 1H), 4,44 (m, 1H), 6,82 (d, 4H, Ph) és 7,26-8,00 (m, 9H, Ph).

30-41 képletű (2R,4S)-l-(terc-butil-oxi-karbonil)2-hidroxi-metil-4-amino-pirrolidin

2,72 g (5 mmol) 30-40 képletű (2R,4S)-l-(tercbutil-oxi-karbonil)-2-(4,4’-dimetoxi-tritil)-oxi-metil-4azido-pirrolidin 75 ml metanollal készült oldatát 0,3 g 10%-os szénhordozós palládium jelenlétében szobahőmérsékleten 5 atmoszférán hidrogénezzük. 12 óra reakcióidő után a katalizátort leszűrjük, 20 ml metanollal mossuk, és az oldószert vákuumban eltávolítjuk, így 1,0 g (93%) terméket kapunk.

Ή-NMR (CDC1₃): 1,45 (s, 9H, Boc), 1,90 (dd, 1H), 2,34 (m, 1H), 3,40-3,62 (m, 3H), 4,00 (m, 2H),

4,28 (széles s, 1H) és 4,44 (m, 1H).

30-42 képletű (2R,4S)-l-(terc-butil-oxi-karbonil)2-hidroxi-metil-4-ftálimido-pirrolidin

1,00 g (4,63 mmol) 30-41 képletű (2R,4S)-l-(tercbutil-oxi-karbonil)-2-hidroxi-metil-4-amino-pirrolidint feloldunk 20 ml vízmentes metanolban, és szobahőmérsékleten 1,09 g (5 mmol) N-etoxi-karbonil-flálimiddel kezeljük. A reakcióelegyet 6 óra hosszat keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélen gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószer: diklór-metán—>etilacetát. A tiszta frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így 1,5 g (94%) tiszta terméket kapunk hab formájában.

Ή-NMR (CDC1₃): 1,45 (s, 9H, Boc), 1,90 (dd, 1H), 2,34 (m, 1H), 3,40-3,62 (m, 3H), 4,00 (m, 2H),

4,28 (széles s, 1H), 4,44 (m, 1H) és 7,3-7,6 (m, 4H, Phi.

30-43 képletű (2R,4S)-l-(terc-butil-oxi-karbonil)2-[N₃-benzoil-(timin-l-il)]-metil-4-ftálimido-pirrolidin

1,15 g (5 mmol) 28-20 képletű N₃-benzoil-timin 70 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatához argonatmoszférában keverés közben, szobahőmérsékleten hozzáadunk 1,4 g (4,05 mmol) (2R,4S)-l-(terc-butil-oxi-karbonil)-2-hidroxi-metil-4-ftálimido-pirrolidint és 2,62 g (10 mmol) trifenil-foszfint. 15 perc múlva lassan, 10 perc alatt hozzáadunk 1,74 g (10 mmol) dietilazido-karboxilátot. A reakcióelegyet alumíniumfóliával lefedjük, és szobahőmérsékleten argonatmoszférában 24 óra hosszat keverjük. Ezután szárazra pároljuk, és a maradékot 150 ml etil-acetátban oldjuk. A szerves fázist 100 ml 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal, 100 ml vízzel és 100 ml konyhasóoldattal mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk,

HU 218 086 Β majd szárazra pároljuk, így narancsszínű olajat kapunk. A nyersterméket szilikagélen kromatográfiásan tisztítjuk, eluálószer: hexán—>etil-acetát. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így halványrózsaszín olajat kapunk, hozam: 2,0 g (89%).

Ή-NMR (CDC1₃): 1,41 (s, 9H, Boc), 1,72 (s, 3H, CH₃), 1,90 (dd, 1H), 2,34 (m, 1H), 3,40-3,62 (m, 3H), 4,00 (m, 2H), 4,28 (széles s, 1H), 4,44 (m, 1H), 7,06 (s, 1H, C₆H) és 7,20-7,60 (m, 9H, Ph).

31. példa

Oligonukleotidok szintézise

Aminosavakat tartalmazó nukleinsavlánccal rendelkező oligonukleotidokat szintetizálunk automata DNSszintetizátorral (Applied Biosystems 394. számú modell) standard foszforamidit-módszerrel. A β-cianoetil-foszforamiditeket, szintézisreagenseket és CPG polisztiroloszlopokat az Applied Biosytems (Foster City, CA) cégtől vásároltuk. A foszforotioát oligonukleotidokhoz a standard oxidálóedényt tetraetil-tiuram-diszulfid/acetonitril rendszerrel helyettesítettük, és a foszfátkötés lépésenkénti tioátozására a standard ABI-foszforotioát programot használtuk. A szabályozott pórusméretű üvegoszlopról történt lehasítás után a védőcsoportokat az oligonukleotidokról koncentrált ammónium-hidroxiddal 55 °C-on 8 óra hosszat végzett kezeléssel távolítottak el. Az oligonukleotidokat (DMT-on) HPLC-vel tisztítottak reverz fázisú, félszintetikus C₈ oszlop (ABI) alkalmazásával, 5 térfogat% acetonitrilt tartalmazó, 0,1 mol/l-es trietil-ammónium-acetát (A puffer) és acetonitril (B puffer) lineáris gradiensével. A DMT-védőcsoportot 80%-os ecetsavas kezeléssel hasítottuk le, és a terméket etanollal kicsaptak. A termék tisztaságát HPLC-vel ellenőriztük, analitikai C₁₈ oszlop (Beckman) alkalmazásával. Az aminosavat tartalmazó nukleinsavmonomereket a DNS-szekvencia 3’végénél, 5’-végénél és közepénél építettük be 100%-os kapcsolási hatásfokkal. Egy olyan homopolimert, amely 16, aminosavval módosított timint tartalmazott, szintén készítettünk minden probléma nélkül.

32. példa

Hibridizációs elemzés

A találmány szerinti, aminosavval módosított oligonukleotidok komplementer RNS- és DNS-szekvenciákhoz való hibridizációs képességét termikus olvasztási kísérlettel határoztuk meg. A komplementer RNS-t a Genset cégtől (La Jolla, CA) vásároltuk, és denatarálókarbamid PAGE segítségével tisztítottuk. A természetes antiszensz oligonukleotidokat, illetve azok egyes helyeken funkciós csoportokkal helyettesített származékait a komplementer RNS-hez, illetve DNS-hez sztöchiometrikus arányban adtak a hibrid duplexek képzésére. A duplexek véletlenszerű felcsavarodásával való átmeneti hőmérsékletétől függő hiperkromicitási abszorbanciát 260 nm-nél Varian Cary IE UV látható spektrofotométerrel határoztuk meg. A méréseket 10 mmol/l-es nátrium-foszfát (pH=7,4), 0,1 mol/1 EDTA-tartalmú pufferben végeztük, amely 0,1 mol/1, illetve 1,0 mol/1 ionerősséget biztosító nátrium-kloridot is tartalmazott. Az adatokat grafikusan elemeztük az 1/Tm függvényében ábrázolt ln[Ct] alapján, ahol [Ct] a teljes oligonukleotidkoncentrációt jelenti. Az elemzésből a termodinamikus paramétereket határoztuk meg. A képződött duplex vagy heteroduplex stabilitására vonatkozó információk alapján megbecsültük a módosított pirimidin oligonukleotidokba való beépítésének hatását a hélix stabilitására. A hibrid stabilitását drasztikusan megváltoztató módosítások a szabad energia (delta G) csökkenését vagy növekedését eredményezték, amelynek alapján az antiszensz oligonukleotidokban való hasznosságuk eldönthető.

A hibridizációs vizsgálatok olyan oligonukleotidokkal végeztük, amelyek aminosavval módosított nukleinsavláncot tartalmaztak a 3’-végnél, valamint az 5’-végnél Az előzetes vizsgálatokat azt mutatták, hogy a módosított oligonukleotidok duplexet képeznek a komplementer RNS- és DNS-szekvenciákkal, a nem módosított oligonukleotidokhoz hasonlóan.

33. példa

Nukleázokkal szembeni rezisztencia

Természetes, foszforotioát és találmány szerinti módosított oligonukleotidok szérumnukleázokkal szembeni rezisztenciáját úgy határoztuk meg, hogy a nukleotidokat különböző koncentrációjú szarvasmarhaembriószérummal, illetve felnőtt humán szérummal együtt inkubáltuk. A jelzett oligonukleotidokat különböző ideig inkubáltuk, proteáz K-val kezeltük, majd 20%-os poliakrilamid-karbamid denatarálógélen gélelektroforézisnek vetettük alá, majd autoradiogramot vagy foszforleképzést készítettünk. Az autoradiogramokat lézerdenzitométerrel értékeltük ki. A módosítások helye alapján és az oligonukleotidok hosszának ismerete alapján meg lehet állapítani az illető módosítás hatását a nukleázos lebontásra. A citoplazma-nukleázokhoz egy HL60 sejtvonalat használtunk. A posztmitokondriális felüluszót differenciálócentrifugálással állítottak elő, és a jelzett oligonukleotidokat ezzel a felülúszóval különböző időkig inkubáltuk. Az inkubálás után meghatároztak az oligonukleotidok lebomlását. Az autoradiográfiás eredményeket a nem módosított, azaz foszforotioát oligonukleotidok és a módosított oligonukleotidok összehasonlítása alapján értékeltük ki.

Az előzetes vizsgálatok azt mutatták, hogy az aminosavakkal módosított oligonukleotidok rezisztensek a kíg yóméreg-foszfodiészterázzal szemben.

Claims (9)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. (I) általános képletű vegyületek, ahol a vegyületek I. csoportja esetén X jelentése CHR₂OH, ahol

   R₂ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkilamin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

   Y jelentése bázis - (CH₂)_n -, ahol a bázis különböző, nem halogénezett nukleozidbázis, n értéke 1-7,

   HU 218 086 Β

   A jelentése karbonilcsoport,

   Z jelentése hidrogénatom vagy OR₃ képletű csoport, ahol

   R₃ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

   W jelentése CHR₄OH képletű csoport, ahol

   R₄ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

   L jelentése semmi; vagy a vegyületek II. csoportja esetén

   X jelentése bázis - (CH₂)_n -, ahol a bázis különböző, nem halogénezett nukleozidbázis, n értéke 1-7,

   Y jelentése CHR₂OH, ahol

   R₂ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkilamin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

   A jelentése karbonil- vagy metiléncsoport,

   Z jelentése hidrogénatom vagy OR₃ képletű csoport, ahol

   R₃ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

   W jelentése CHR₄OH képletű csoport, ahol

   R₄ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

   L jelentése semmi; vagy a vegyületek III. csoportja esetén

   X jelentése CHR₂OH, ahol

   R₂ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkilamin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

   Y jelentése bázis - (CH₂)_n -, ahol a bázis különböző, nem halogénezett nukleozidbázis, n értéke 1-7,

   A jelentése metiléncsoport,

   Z jelentése hidroxilcsoport vagy OR₃ képletű csoport, ahol

   R₃ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

   W jelentése CHR₄OH képletű csoport, ahol

   R₄ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

   L jelentése semmi; vagy a vegyületek IV. csoportja esetén

   X jelentése bázis - (CH₂)_n -, ahol a bázis különböző, nem halogénezett nukleozidbázis, n értéke 1-7,

   Y jelentése COOH vagy CHR₂OH képletű csoport, ahol

   R₂ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkilamin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport,

   A jelentése karbonil- vagy metiléncsoport,

   Z jelentése metiléncsoport,

   W jelentése metiléncsoport,

   L jelentése CHNHR₅, ahol

   R₅ jelentése hidrogénatom, hidroxil- vagy OR₃ képletű csoport, ahol

   R₃ jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil-, rövid szénláncú alkil-amin- vagy rövid szénláncú alkil-imidazol-csoport; vagy a vegyületek V. csoportja esetén

   X jelentése CH₂OH, CH₂NH₂, CONH₂ vagy COOH képletű csoport,

   Y jelentése semmi,

   Z jelentése CH₂ vagy CHO-L^B képletű csoport,

   W jelentése oxigén- vagy kénatom, vagy metiléncsoport,

   N jelentése CH képletű csoport, és

   L és A jelentése egymástól függetlenül COOH, CHCOOH, CHCH₂COOH, NH₂, CHNH₂, L)-NH-L₂-B vagy CH-Lj-NH-l^-B képletű csoport, ahol

   B jelentése hidrogénatom vagy nukleozidbázis, és L, és L₂ jelentése egymástól függetlenül (CH₂)_n, ahol n értéke 0, 1, 2 vagy 3, vagy (CH₂)_mCO képletű csoport, ahol m értéke 0, 1 vagy 2.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti vegyületek egy oligonukleotidba beépítve, ahol intemukleotid-kötés van az I. csoporthoz tartozó vegyületek esetén W és X között, a II. csoporthoz tartozó vegyületek esetén W és Y között, a III. csoportba tartozó vegyületek esetén W és Z között, a IV. csoportba tartozó vegyületek esetén L és Y között, míg az V. csoportba tartozó vegyületek esetén L és A között.
3. 3. A 2. igénypont szerinti oligonukleotidok, ahol az intemukleotid-kötés egy foszfodiészter-kötést tartalmaz.
4. 4. A 2. igénypont szerinti oligonukleotidok, ahol az intemukleotid-kötés egy foszforotioát-kötést tartalmaz.
5. 5. A 2. igénypont szerinti oligonukleotidok, ahol az intemukleotid-kötés egy foszforamidit-kötést tartalmaz.
6. 6. A 2. igénypont szerinti oligonukleotidok, ahol az intemukleotid-kötés egy hidroxamátkötést tartalmaz.
7. 7. A 2. igénypont szerinti oligonukleotidok, amelyek monomerek sorozatából állnak, ahol a monomerek közül legalább egy 2’-dezoxi-ribóz-nukleozid, és a foszfodiészter-, foszforotioát-, foszforamidit- és hidroxamátkötések közül legalább két különböző intemukleotid-kötést tartalmaznak.
8. 8. A 7. igénypont szerinti oligonukleotidok, amelyek egy 2’-dezoxi-ribóz-nukleozid-pentafuranozil-gyűrűt tartalmaznak, ahol a gyűrűbeli oxigén kénatommal, metiléncsoporttal vagy NR₆ képletű csoporttal van kicserélve, ahol Re jelentése acetil-, rövid szénláncú alkil-, karbonil-, karbonil-(rövid szénláncú alkil)-amino- vagy karbonil-(rövid szénláncú alkilj-imidazol-csoport.
9. 9. A 2. igénypont szerinti oligonukleotidok, ahol legalább egy monomer az 1. igénypont szerinti vegyületek V. csoportjába tartozik, legfeljebb ötven monomer a 2’-dezoxiribonukleozid-, ribonukleozid- és 2’-metilribonukleozid-csoportból származik.