PL185852B1 - Oligonukleotydy oraz związki monomeryczne je tworzOligonukleotydy oraz związki monomeryczne je tworząceące - Google Patents

Abstract

1 . Zwiazek o wzorze 1 Wzór 1 w którym X oznacza grupe CH2 OH; Y oznacza grupe tymina-(CH2 ) n-, w której n oznacza 1; A oznacza grupe karbonylowa lub CH2 ; Z oznacza atom wodoru lub grupe CH2 L, gdzie: L wybiera sie z grupy skladajacej sie z COOH, CHCOOH, CHCH2 COOH, NH2 , CHNH2 , Lr NH-L2 -B lub CH-L,-NH-L2 -B, w której B oznacza atom wodoru lub zasade nukleozydowa a L1 i L2 niezaleznie oznaczaja (CH2 )n , lub (CH2 ),,CO gdzie n = 0, 1,2 lub 3 W oznacza grupe CH2 OH; N oznacza atom azotu lub grupe CH; przy czym gdy Z oznacza CH2 L, L laczy sie z W tworzac pierscien. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy oligonukleotydów oraz związków monomerycznych je tworzących.

Wynalazek należy do dziedziny analogów polinukleotydowych bez pierścieni fiiranozowych.

Oligonukleotydy wiążące sekwencje specyficzne dla komplementarnych kwasów nukleinowych (to znaczy nić sensowną) przez wiązanie wodorowe, tak by inhibitować ekspresję genu są powszechnie zwane oligonukleotydami anty sensownymi. Te syntetyczne oligonukleotydy wiążą się z celem (mRNA) i tym samym inhibitują translację matrycowego RNA. Tę zasadę antysensowności (Uhlmann, E. i in., Chem. Reviews, 1990, 90, 543-584; i Stein, C. A.

185 852 i in., Cancer Res., 1988, 48, 2659-2688) stosuje się w przyrodzie do regulowania ekspresji genu. Zasadę antysensowności stosowano w laboratorium nie tylko do inhibitowania, lecz także do aktywowania ekspresji genu. Zamecnik i Stephenson byli pierwszymi, którzy zaproponowali, w 1976, użycie syntetycznych oligonukleotydów do celów terapeutycznych (Stephenson, M. L.; i Zamecnik, P.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, 75, 280 i 285). Specyficzne inhibitowanie antysensownego polinukleotydu jest opartena specyficznym sparowaniu zasad Watsona-Cricka między heterocyklicznymi zasadami antysensownego oligonukleotydu i wirusowym kwasem nukleinowym. Proces wiązania oligonukleotydów do komplementarnego kwasu nukleinowego jest zwany hybrydyzacją. Oligomer o sekwencji zasad komplementarnej do mRNA kodującego proteinę niezbędną, do postępu choroby jest szczególnie interesujący. Przez hybrydyzowanie specyficzne dla mRNA, syntezę protein kodowanych przez mRNA można zakłócić.

Wytwarzanie niemodyfikowanych oligonukleotydów, tzn. oligonukleotydów o strukturze DNA, było w centrum zainteresowania wielu grup badawczych w ostatniej dekadzie. Synteza poprzez fosforamidyty według Caruthersa (McBride, L.J.; i Caruthers, M. H., Tetrahedron Letts., 1983, 24, 245), oryginalnie wprowadzona przez Letsingera (Letsinger, R.L.; i Lunsford, W. B., J. Amer. Chem. Soc., 1916, 98, 3655) jako metoda triestru fosfitu, jest obecnie najbardziej skuteczną metodą dla wytwarzania oligonukleotydów fosfodiestrowych. Gdy stosuje się normalne, tzn. niemodyfikowane, oligonukleotydy jako antysensowne oligonukleotydy, powstają problemy nietrwałości względem nukleaz i niewystarczającego przenikania błony. Aby oligonukleotydy antysensowne były zdolne do inhibitowania translacji muszą osiągnąć wnętrze niezmienionej komórki. Właściwości przydatne dla oligonukleotydów stosowanych do antysensownego inhibitowania obejmują:

(i) trwałość oligonukleotydów względem enzymów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych;

(ii) zdolność do przenikania przez błonę komórkową; i (iii) zdolność do hybrydyzowania docelowego DNA lub RNA (Agarwal, K. L. i in., Nucleic Acids Res., 1979, 6, 3009; A-gawal, S. i in., Proc Natl Acad Sci. USA. 1.988, 85, 7079).

Zatem, interesujące jest, by dostarczyć analogi polinukleotydów, które mają lepsze właściwości dla stosowania jako antysensowne lub dla stosowania jako primery lub sondy hybrydyzacyjne.

Modyfikowane polinukleotydy zsyntetyzowano w przeszłości, przy czym te modyfikacje polinukleotydów obejmują metylofosfoniany, fosforotioany, różne amidany i ugrupowania cukrowe kwasów nukleinowych. Te podstawienia w łańcuchu głównym nadają w pewnym stopniu większą trwałość lecz mają tę niekorzystną cechę, że dają w wyniku chiralny fosfor w wiązaniu, prowadząc zatem do tworzenia 2ⁿ diastereomerów, gdzie n oznacza liczbę modyfikowanych wiązań diestrowych w oligomerze. Obecność szeregu diastereomerów znacząco osłabia zdolność modyfikowanego oligonukleotydu do hybrydyzowania do sekwencji docelowych.

Pewne z podstawień także zachowują zdolność do wspierania ładunku ujemnego i obecność naładowanych grup obniża zdolność związków do przenikania błon komórkowych.

Istnieją liczne inne niekorzystne cechy związane z tymi modyfikowanymi wiązaniami, zaleznie od konkretnego charakteru wiązania.

Zsyntetyzowano pewne analogi oligonukleotydowe zawierające modyfikacje cukrowe. Uprzednio stosowane modyfikacje cukrowe kwasów (deoksy)rybonukleinowych obejmują aDNA, homo DNA, morfolino i tio nukleozydy i peptydowe kwasy nukleinowe (PNA) dając to co uznano za ulepszone struktury, zwłaszcza struktury o lepszym wychwycie komórkowym. Ogólny schemat syntezy dla uzyskania takich analogów pociągał za sobą użycie pierwszorzędowej grupy hydroksylowej nukleozydu lub jego nukleotydu, związanego z nośnikiem polimerowym lub z 3’-nukleotydem o wyszczególnionej sekwencji z atomem fosforu o stanie utlenienia pięciowartościowym lub trójwartościowym. Szczególne procedury sprzęgania zwano procedurami triestru fosfitu (fosforamidyt), fosforodiestru oraz wodorofosfonianu. Są dostępne handlowo monomery dla takich metod o zabezpieczonych zasadach (G, A, C, T, U i innych heterocykiach) wraz z zabezpieczonymi atomami fosforu, by umożliwić przechowywanie i zapobiec niespecyficznym reakcjom podczas procesu sprzęgania.

185 852

Kwasy nukleinowe zawierające modyfikowane cukry, niejonowe łańcuchy główne lub acykliczne poliamidy (PNA) o - w pewnym stopniu - jednej lub więcej następujących właściwościach przydatnych dla modulacji genu: zwiększenie trwałości dupleksu (skuteczność hybrydyzacji), zwiększona specyficzność względem celu, trwałość względem nukleaz, zwiększony wychwyt komórkowy oraz wspomaganie ważnych zdarzeń kończących kwasy nukleinowe (np. aktywność RNazy H, rozszczepienie katalityczne, zatrzymanie hybrydyzacji i inne). Zasugerowano także użycie diestrów węglanowych. Jednak, te związki są wysoce nietrwałe i wiązanie diestru węglanowego nie utrzymuje tetraedralnej konfiguracji wykazanej przez fosfor w fosfodiestrze. Podobnie, wiązania karbaminianowe, choć są achiralne, nadają symetrię trigonalną i wykazano, że poli dT mające to wiązanie nie hybrydyzuje silnie z poły dA (Coull, J. M. i in., Tetra-hedron Letts., 1981, 28, 745; Stirchak, E. P. i in., J. Org. Chem., 1987, 52, 4202).

Ostatnio, pojawiły się w literaturze doniesienia o acyklicznych analogach cukrowych (Augustyns, K. A. i in., Nucleic Acids Res., 1991, 19, 2587-2593). Włączenie tych acyklicznych nukleozydów w oligonukleotydy spowodowało spadek Tm, zależnie od liczby linkerów wbudowanych w oligomerach. Stwierdzono, że te oligonukleotydy są trwałe enzymatycznie i tworzą sparowanie zasad z sekwencją komplementarną. Przy danych usterkach polinukleotydów i znanych analogach polinukleotydów, interesujące jest dostarczenie nowych analogów polinukleotydów dla stosowania w antysensownym inhibitowaniu i innych technikach stosujących oligomery.

Takie próby modyfikowania składników cukrowych jak i łańcucha głównego mają pewne usterki z punktu widzenia ich stosowania jako środków terapeutycznych i w innych metodach. Zatem jest wymagane jeszcze większe ulepszenie tych modyfikacji, zanim staną się dostępne skuteczne środki terapeutyczne, diagnostyczne i narzędzia badawcze. Zgodnie z tym, istnieje od daw na odczuwana potrzeba istnienia ulepszonych oligomerowych analogów oligonukleotydów jako związków farmaceutycznych. Niniejszy wynalazek dostarcza nowe oligonukleotydy i ich strukturalny prekursor, o zwiększonej odpomościna trawienie nukleazą i zwiększonej trwałości w warunkach fizjologicznych, i które mogą być neutralne lub dodatnio naładowane, co może zwiększyć przenikanie do komórki. Ponadto, nowe oligonukleotydy według niniejszego wynalazku mają ulepszone właściwości hybrydyzacji względem celów hybrydyzacyjnych kwasu nukleinowego.

Oligomery według niniejszego wynalazku zasadniczo charakteryzuje się jako obejmujące szereg poddanych więzom linkerów lub monomerów co jest odpowiednie dla wiązania zasad heterocyklicznych do docelowego kwasu nukleinowego w sposób specyficzny dla sekwencji. Poddane więzom linkery opisane w niniejszym zgłoszeniu, gdy są włączone w oligomery, mogą mieć siłę działania większą niż pojedyncze wiązanie wodorowe, sprzyjając tym samym konfomacji odpowiedniej dla wiązania.

Nukleomonomery według niniejszego wynalazku zasadniczo charakteryzuje się jako ugrupowania lub reszty zastępujące pierścień furanozowy, występujący w naturalnie występujących nukleotydach, resztami aminokwasowymi lub modyfikowanymi aminoalkoholowymi. Przykładowe monomery i oligomery według wynalazku podanona wzorach 1 do 41. Włączenie tych monomerów opisanych w niniejszym zgłoszeniu w oligonukleotydy umożliwia syntezę związków o ulepszonych właściwościach, przy czym te ulepszone właściwości obejmują (i) zwiększoną lipofilowość co wynika z wyeliminowania ładunku związanego z wiązaniem fosfodiestrowym (Dalge, J. M. i in., Nucleic Acids Res., 1991,19,1805) i (ii) odpomośćna degradację przez enzymy takie jak nukleazy. Oligomery zawierające te monomery mogą być całkiem trwałe ze względu na hybrydyzację do sekwencji docelowych i lepsze w porów naniu z niemodyfikowanymi resztami nukleozydo-wymi w jednym lub więcej zastosowaniach.

Niniejszy wynalazek dostarcza różnych nowych analogów oligonukleotydów o jednej lub więcej właściwościach, które sprawiają, że rozpatrywane związki są lepsze w porów naniu z konwencjonalnymi oligonukleotydami dla stosowania w procedurach wykorzystujących oligonukleotydy. Związki według wynalazku są analogami oligonukleotydowymi, w których pierścień furanozowy naturalnie występującego kwasu nukleinowego jest zastąpiony przez

185 852 resztę aminokwasową lub modyfikowaną aminoalkoholową. Pewne wykonania nowych związków według wynalazku są szczególnie przydatne dla antysensownej kontroli ekspresji genu. Związki według wynalazku można także użyć jako sondy hybrydyzacyjne kwasów nukleinowych lub primery.

Innym aspektem wynalazku jest dostarczenie monomerycznych prekursorów analogów oligonukleotydowych według wynalazku.

Te monomeryczne prekursory można użyć do syntezy rozpatrywanych analogów polinukleotydów. Formulacje rozpatrywanych analogów polinukleotydów są zaprojektowane dla leczenia lub zapobiegania stanom chorobowym. Metody leczenia lub zapobiegania chorobom, szczególnie infekcjom wirusowym i zaburzeniom wzrostu komórki obejmują etap podawania skutecznej ilości rozpatrywanych analogów polinukleotydów dla stosowania jako inhibitorów antysensownych.

Związek według wynalazku reprezentuje wzór 1

w którym

X oznacza grupę CH2OH;

Y oznacza grupę tymina-(CH2)n-, w której n oznacza 1;

A oznacza grupę karbonylową lub CH2;

Z oznacza atom wodoru lub grupę CH2L, gdzie L wybiera się z grupy składającej się z COOH, CHCOOH, CHCH₂COOH, NH₂, CHNH₂, L,-NH-L₂-B lub CH-L,-NH-L₂-B, w której B oznacza atom wodoru lub zasadę nukleozydową a Li i L2 niezależnie oznaczają (CH2)_n, lub (CH2)_nCO gdzie n= 0, 1,2 lub 3

W oznacza grupę CH2OH;

N oznacza atom azotu lub grupę CH; przy czym gdy Z oznacza CH2L, L łączy się z W tworząc pierścień.

Wynalazek obejmuje także oligonukleotyd stanowiący spolimeryzowany związek o wzorze 1 jak określony wyżej w którym wewnątrznukleotydowe wiązania występują pomiędzy W i X albo W i Y albo L i A.

Poniżej wymieniono korzystne oligonukleozydy według wynalazku.

Oligonukleotyd, w którym wewnątrznukleotydowe wiązanie stanowi fosfodiester.

Oligonukleotyd, w którym wewnątrznukleotydowe wiązanie stanowi fosforotioan.

Oligonukleotyd, w którym wewnątrznukleotydowe wiązanie stanowi fosforoamidan.

Oligonukleotyd, w którym wewnątrznukleotydowe wiązanie stanowi hydroksamat.

Oligonukleotyd, w którym co najmniej jeden monomer stanowi związek o wzorze 1, w przypadku gdy L łączy się z W, a maksymalnie 50 monomerów wybiera się z 2’-dezoksyrybonukleozydu, rybonukleozydu i 2’-metylorybonukleozydu.

Krótki opis figur

Figury 1 do 25 przedstawiają sekwencje reakcji chemicznej odpowiedniej dla zsyntetyzowania monomerów i oligonukleotydów według niniejszego wynalazku. W szczególności.

Figura 1 przedstawia syntezę fosforamidytu o monomerze typu tymina sprzężona z Lserynolem z wiązaniem -CH2-CO- między tyminą i serynolem.

Figura 2 przedstawia syntezę fosforamidytu o monomerze typu tymina sprzężona z Lserynolem z wiązaniem -CH2-CH2- między tyminą i serynolem.

185 852

Figury 3 i 4 przedstawiają syntezę podstawionych fosforamidytów o monomerze typu tymina sprzężona z L-serynolem z wiązaniem -CH2-CO- między tyminąi serynolem.

Figura 5 przedstawia syntezę dimeru T-T z wiązaniem międzynukleotydowym o długości 5 atomów z hydroksyloaminą pośrodku międzynukleotydowego wiązania z wiązaniem CH2-CO- między ty-miną i serynolem.

Figura 6 przedstawia syntezę fosforamidytu o monomerze tyminowym, w którym tymina jest połączona z N-etylohydroksyloaminą przez wiązanie -CH2-CO-.

Figura 7 przedstawia syntezę fosforamidytu o monomerze typu tymina sprzężona z Lserynolem, w którym grupa NH2 L-seryny jest połączona z grupą 2-hydroksyacetylową i grupa hydroksylowa jest zablokowana grupą DMT. Ten blok konstrukcyjny stosuje się do połączenia 2’-5’. Figura ta także przedstawia syntezę monomeru tyminy, w którym grupa NH2 Lseryny jest połączona z grupą 2 ’-hydroksyetylową.

Figura 8 przedstawia syntezę T-T dimeru o łańcuchu głównym hydroksamatowym z wiązaniem 2’-5’. W tym dimerze jeden blok konstrukcyjny jest wykonany z kwasu L-asparaginowego i tyminy, a inny z L-seryny i tyminy. Dimer ten ma dwa dodatkowe wiązania amidowe w łańcuchu głównym.

Figura 9 przedstawia syntezę dimeru T-T o hydroksamatowym łańcuchu głównym z wiązaniem 2’-5’. W tym dimerze, jeden blok konstrukcyjny jest wykonany z kwasu L-asparaginowego i tyminy, a inny z L-seryny i tyminy. W tym dimerze brak pośredniego wiązania amidowego w łańcuchu głównym.

Figura 10 przedstawia syntezę fosforamidytu o monomerze typu tymina sprzężona z L-serynolem-b-alaniną, w którym [-danina wiąże się z tymina i serynolem.

Figura 11 przedstawia syntezę fosforamidytu o monomerze typu tymina sprzężona z Lserynolem-akylaminą, z wiązaniem alkyaminowym między tyminą i serynolem.

Figura 12 przedstawia syntezę dimeru T-T o hydroksamatowym łańcuchu głównym z wiązaniem 4’-5’. W tym przypadku dimer jest wykonany z dwóch jednostek kwasu Lasparaginowego i dwóch jednostek tyminy z linkerem acetylowym między tyminą i kwasem asparaginowym.

Figura 13 przedstawia syntezę dimeru T-T o hydroksamatowym łańcuchu głównym z wiązaniem 4’-5’. W tym przypadku dimer jest wykonany z dwóch jednostek kwasu Lasparaginowego i dwóch jednostek tyminy z linkerem etylowym między tyminą i kwasem asparaginowym.

Figura 14 przedstawia syntezę bloku konstrukcyjnego typu tyminy sprzężonej z Nhydroksyaminokwasem.

Figura 15 przedstawia syntezę bloku konstrukcyjnego typu tyminy sprzężonej z kwasem L-asparaginowym z N-hydroksyloaminą - linkerem między tyminą i kwasem asparaginowym.

Figura 16 przedstawia syntezę dimeru T-T o hydroksamatowym łańcuchu głównym z wiązaniem 4’-5’. W tym przypadku, grupa kwasu karboksylowego jest sprzężona z blokiem tyminy przez linker N-hydroksyloaminowy.

Figura 17 przedstawia syntezę bloku konstrukcyjnego 150 N-hydroksyaminokwasu podstawionego kwasem tymidynooctowym i jego analogu 149. Te bloki monomerowe są przydatne do utworzenia kwasu nukleinowego z hydroksamatowymi łańcuchami głównymi.

Figura 18 przedstawia syntezę bloków konstrukcyjnych 157 i 158 typu hydroksyloaminy podstawionej kwasem tymidynoctowym, zawierających aminokwasy. Te monomery są przydatne do zbudowania kwasu nukleinowego o amidowym łańcuchu głównym z ugrupowaniem hydroksyloaminy.

Figura 19 przedstawia syntezę syntezę bloku konstrukcyjnego 166 typu tymidyny sprzężonej z L-serynolem o ugrupowaniu hydroksyloaminy między tyminą i serynolem. Ten blok konstrukcyjny jest przydatny utworzenia kwasu nukleinowego o wiązaniach 4’-5’.

Figura 20 przedstawia syntezę monomeru 174 tymidyny sprzężonej z kwasem glutaminowym-glicyną. Ten blok konstrukcyjny monomeru jest przydatny do tworzenia kwasu nukleinowego z amidowymi łańcuchami bocznymi i wiązaniami 2 ’-5 ’.

185 852

Figura 21 przedstawia syntezę bloku konstrukcyjnego 181 i 182 typu tymidyny sprzężonej z glicynolem-glicyną o ugrupowaniu hydroksyloaminowym między tyminą i glicynolem. Te bloki są przydatne do wytworzenia kwasu nukleinowego o wiązaniach 2’-5’.

Figury 22 do 24 podają syntezę bloków konstrukcyjnych 191, 199 i 207 typu tymidyny sprzężonej z rybozo-aminokwasem. Te bloki są przydatne do wytworzenia oligonukleotydów o rybozowo-amidowym łańcuchu głównym.

Figura 25 przedstawia syntezę w fazie stałej oligonukleotydu 211 o rybozowoamidowym łańcuchu głównym.

Figura 26 przedstawia syntezę l-O-(4,4’-dimetoksytrytylo)-2-[amino(tyminyloacetylo)L-propano-3-()-(N.N-diizopiOpylo)-P-cyjanoetylofosf.bramidytu.

Figura 27 przedstawia syntezę l-O-(4,4’-dimetbksytrytylo)-2-[aminb(tyminylbacetylo)D-prbpano-3-00-(N,N-diiz.c>propylo)-β-cyjanoetylbf()sfbramidytu.

Figura 28 przedstawia syntezę 2-[Xp-(4,4’-dimetoksytrytylo)-0-acetylo)ammoJ-3-tyminylo-L-propan-1 -O--N,N-dπzopropylo)-β-cyjίnloetylfosforamidytu.

Figura 29 przedstawia syntezę N-(tyminylbacetylo)-N-[[(2-izobutyrylb)oksy]etylo]O-benzylohydroksylaminy

Figura 30 przedstawia syntezę (2R, 4S)-l-(tert-butyloksykarbonylb)-2-[N3-berzo-ilo (tymin-1 -ylo)]metylb-4-ftalimido-pirolidyny.

Szczegółowy opis specyficznych wykonań

A. Definicje i skróty

Przy opisie niniejszego wynalazku, będą użyte następujące określenia, które będą poniżej zdefiniowane.

W niniejszym zgłoszeniu, terapia „antysensów na” odnosi się do podawania lub tworzenia in situ oligomerów DNA lub RNA, lub ich analogów, które wiążą się specyficzne do komplementarnych sekwencji docelowego kwasu nukleinowego. To wiązanie może mieć charakter konwencjonalnej komplementamości pary zasad lub być wiązaniem poprzez inne mechanizmy, np. w przypadku wiązania dupleksów DNA, przez specyficzne oddziaływania w głównej bruździe podwójnej helisy. Zasadniczo, „antysensowny” odnosi się do wachlarza technik zasadniczo stosowanych w tym opisie według stanu techniki, i obejmuje jakąkolwiek terapię, która opiera sięna specyficznym wiązaniu do sekwencji oligonukleotydowych. Techniki antysensownej regulacji genów są dobrze znane specjaliście w dziedzinie biologii molekularnej. Opisy antysensownej regulacji genów można znaleźć np. w opisie patentowym USA 5107065, opisie patentowym USA 5166195, opisie patentowym USA 5087617 i Crooke, Annual Review Pharmacology, Toxicblbgy 1992 32; 329-376.

Określenia „oligomer” lub „oligonukleotyd” stosuje się zamiennie i obejmują one naturalnie występujące związki, takie jak RNA i DNA, oraz ich syntetyczne analogi, włączając związki- według wynalazku. O ile nie podano inaczej, określenia „oligomer” i „oligonukleotyd”' odnoszą się zarówno do DNA/RNA jak i do ich syntetycznych analogów-·. Określenie „oligomer” odnosi się do związków obejmujących dwa lub więcej nukleomonomery kowalencyjnie połączone z sobą przez wiązanie fosfodiestrowe lub jakiekolwiek inne wiązania zastępcze. O ile nie podano inaczej, określenie „oligomer” nie wiąże się z ograniczeniem długości. Zatem oligomer może mieć tylko dwa kowalencyjnie związane nuklebmorbmery (dimer) lub może być znacząco dłuzszy. Oligomery mogą być kompetentne (zdolne) co do wiązania i zatem mogą być parą zasad o sekwencjach jednoniciowego lub dwuniciowego kwasu nukleinowego. Oligomery (np. dimery - heksamery) są także przydatne jako syntony dla dłuzszych oligomerów, jak opisano w niniejszym tekście. Oligomery mogą zawierać miejsca bez zasad oraz pseudonukleozydy. Oligomery obejmują bligbruklebtydy, oligonukleozydy, polide-ok^^rybo-nukleotydy (zawierające 2’-deoksy-D-rybozę lub ich formy zmodyfikowane), tzn. DNA, polirybonukleotydy (zawierające D-rybozę lub ich modyfikowane formy), tzn. RNA, i jakikolwiek inny typ polinukleotydu, który jest N-glikozydem lub C-glikozydem zasady purynowej lub pirymidynowej, lub modyfikowanej zasady purynowej lub pirymidynowej. Oligomer, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, w zamierzeniu obejmuje także związki, w których sąsiednie nukleomonomery są związane poprzez wiązania hydroksamatowe. Elementy zwykle spotykane w oligomerach, takie jak pierścień furanozowy i/lub wiąza8

185 852 nie fosfodiestrowe można zastąpić przez jakikolwiek odpowiedni równoważny funkcjonalnie element. Określenie „oligomer” w zamierzeniu obejmuje jakąkolwiek strukturę która służy jako podstawa lub podłoże dla zasad, w którym podstawa umożliwia wiązanie do docelowych kwasów nukleinowych w sposób zależny od sekwencji.

Oligomery obecnie znane można podzielićna cztery grupy, które można scharakteryzować jako mające (i) wiązania typu fosfodiestru lub analogu fosfodiestru (fosforotioan, metylofosfonian, itd.), (ii) wiązania zastępcze, które zawierają niefosforowy izoster (ryboacetal, formacetal, karbaminian, itd.), (iii) reszty morfolinowe, reszty karbocykliczne lub inne cukry furanozowe, takie jak arabinoza, lub heksoza w miejsce rybozy lub deoksyrybozy oraz (iv) nukleomonomery związane poprzez wiązania amidowe lub acykliczne: nukleomonomery związane poprzez jakiekolwiek odpowiednie wiązanie zastępcze.

Określenie „nukleomonomer”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do ugrupowania obejmującego (1) zasadę kowalencyjnie związaną z (2) drugim ugrupowaniem. Nukleomonomery obejmują nukleozydy, nukleotydy lub zasady połączone z aminoalkoholem. Nukleomonomeiy mogą być związane tworząc oligomery, które wiążą się do docelowych lub komplementarnych sekwencji zasad kwasów nukleinowych w sposób zależny od sekwencji.

„Drugie ugrupowanie”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do związku związanego z nukleomonomerem, i obejmuje ugrupowanie aminokwas/aminoalkohol, zwykle serynol, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, glicynę i te indywidua, które zawierają modyfikacje ugrupowania aminokwasowego, np. w którym jeden lub więcej atomów wodoru jest zastąpiony inną grupą funkcyjną (patrz wzory 24-41) lub jeden kwas karboksylowy jest przeprowadzony w alkohol, aminy, tiole, hydroksyloaminy itp. Nukleomonomery jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu w zamierzeniu także obejmują zasadę związaną z aminokwasem lub aminoalkoholem i/lub analog aminokwasu/alkoholu o wolnej grupie karboksylowej/hydroksylowej i/lub wolnej grupie aminowej i/lub ich formach zabezpieczonych.

Określenie „nukleozyd”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do jego pochodnej aminokwasowej i aminoalkoholowej, jak to opisano poniżej, zawierającej purynę, pirymidynę lub ich formy analogiczne, jak określono poniżej, lecz u której brakuje ugrupowania wiążącego, takiego jak analog fosfodiestrowy lub modyfikowane wiązanie międzynukleozydowe. Przez nukleozyd „5’ ” rozumie się nukleozyd, który dostarcza miejsca wiązącegona węglu 5’ z linkerem. Koniec „5’ ” linkera wiąże się nukleozydem 5’. Koniec „3’ ”linkera wiąże się z pozycją 3’ następnego nukleozydu. Jeśli jest obecny modyfikowany nukleozyd, który nie obejmuje dokładnie atomu węgla 3’ i/lub 5’, specjalista z dziedziny techniki winien rozumieć, że ta terminologia „3’ ” i „5’ ” opisuje zastosowaną polamość nici przez analogię do DNA i RNA.

Określenie „nukleozyd” stosowane w niniejszym tekście odnosi się do zasady związanej kowalencyjnie z analogiem aminoalkoholu/aminokwasu i która zawiera linker między zasadą i aminokwasem/ aminoalkoholem. Określenie nukleozyd w normalnym przypadku obejmuje rybonukleozydy, deoksyrybonukleozydy lub jakikolwiek inny nukleozyd który jest N-glikozydem lub C-glikozydem zasady.

Określenie „nukleotyd” stosowane w niniejszym tekście odnosi się do nukleozydu o grupie fosforanowej lub analogu fosforanu (grupy z fosforem w tym samym stanie utlenienia jak w grupie fosforanowej np. tiofosforan, amidan).

Określenie „zasada”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do szerokiego zakresu zasad nukleozydowych, włączając w to purynowe i pirymidynowe związki heterocykliczne i ich heterocykliczne analogi i tautomery. Puryny obejmują adeninę, guaninę i ksantynę i przykładowe analogi purynowe obejmują 8 -okso-N6-metyloadeninę i 7-deazaksantynę. Pirymidyny obejmują uracyl i cytozynę i ich analogi, takie jak 5-metylocytozynę, 5-(l-propynylouracyl), 5-(l-^pi'opynylocyiozynę), 5-metylouracyl i 4,4-etanocytozynę. Gdy „zasady” są złączone z odpowiednim szkieletem molekularnym, np. fosfodiestrowym łańcuchem głównym, są zdolne do wchodzenia w zależność typu sparowania zasad, występującą w dwuniciowym DNA lub innych dwuniciowych kwasach nukleinowych o podobnej struktu185 852 rze. Zasady mogą także być zdolne do wchodzenia w zależność typu sparowania zasad, występującą w kwasie nukleinowym o potrójnej helisie.

Określenie „modyfikacja cukru”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do jakiegokolwiek ugrupowania aminokwasowego lub aminoalkoholowego innego niż 2 deoksyryboza.

Określenie „aminokwas/alkohol”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do jakichkolwiek naturalnych aminokwasów i alkoholi, zarówno izomerów „R” jak i „S”. Określenie „wiązanie nukleozydowe”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do wiązania, które istnieje w obrębie monomeru.

Określenie „wiązanie”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do ugrupowania, które stosuje się połączenia zasady z aminokwasem/aminoalkoholem i ich pochodnymi.

Określenie „wiązania międzynukleotydowe”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do ugrupowania fosfodiestrowego (O-P(0)(0)-0-) lub jakiegokolwiek funkcjonalnie równoważnego ugrupowania, które kowalencyjnie łączy sąsiednie nukleomonomery.

Określenie „wiązania zastępcze”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do jakiegokolwiek analogu grupy rodzimej lub jakiegokolwiek odpowiedniego ugrupowania, które kowalencyjnie łączy sąsiednie nukleomonomery. Wiązania zastępcze obejmują analogi fosfodiestrowe, np. takie jak fosforotioan i metylofosfonian, oraz wiązania zawierające niefosfor, np. takie jak amidy, hydroksamaty, hydroksylaminę. Wiązania zastępcze obejmują wiązania zawierające niefosfor (wiązania 2’,5’, wiązania 3’,5’ i wiązania 4’,5’) według wynalazku.

Określenie „ugrupowanie sieciujące”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do grupy lub ugrupowania w oligomerze, które tworzy wiązanie kowalencyjne z docelowym kwasem nukleinowym. Ugrupowania sieciujące obejmują indywidua o wiązaniu kowalencyjnym, które wiążą kowalencyjnie oligomer z docelowymi kwasami nukleinowymi spontanicznie (np. N⁴,N⁴-etanocytozyna) lub poprzez fotoaktywacje (np. Psoralen) itp. Określenie „grupy blokujące”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do podstawnika innego niż H, który jest kowalencyjnie sprzężony z oligomerami lub nukleomonomerami, jako grupa zabezpieczająca, grupa sprzęgająca w syntezie, OPO3-2, lub inny konwencjonalny koniugat, taki jak podłoże stałe, znacznik, przeciwciało, przeciwciało monoklonalne lub jego fragment itp. Jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, „grupy blokującej” nie należy wyłącznie rozumieć jako grupy zabezpieczającej, według żargonu, lecz należy rozumieć że obejmuje to także, np. grupy sprzęgające, takie jak H-fosfonian lub fosforamidyt.

Określenie „grupa zabezpieczająca”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do jakiejkolwiek grupy zdolnej do zabezpieczenia atomu O, atomu S lub atomu N, do którego jest dołączona, przed uczestniczeniem w reakcji lub wiązaniu; takie grupy zabezpieczające dla atomów Nna ugrupowaniu zasady w nukleomonomerze i ich wprowadzanie są konwencjonalnie znane według stanu techniki. Nieograniczające przykłady odpowiednich grup zabezpieczających obejmują: diizobutyloformamidynę, benzoli, silił itp. Odpowiednimi grupami zabezpieczającymi dla atomów O i S są np. DMT, MMT, FMOC lub estry. „Grupy zabezpieczające”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, obejmująjakąkolwiek grupę zdolną do zapobiegania, by atom O, atom S lub atom N, do których jest dołączona, uczestniczeniu w reakcji lub wiązaniu. Takie grupy zabezpieczające dla atomów O, S i N w nukleomonomerach są opisane i metody ich wprowadzania są konwencjonalnie znane według stanu techniki. Grupy zabezpieczające obejmują także jakąkolwiek grupę zdolną do zapobiegania reakcjom i wiązaniu do kwasów karboksylowych, tioli itp.

Określenie „grupa sprzęgająca”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do jakiejkolwiek grupy odpowiedniej dla tworzenia wiązania lub wiązania zastępczego między nukleomonomerami, takimi jak wodorofosfonian i fosforamidyt.

Określenie „koniugat” lub „ugrupowanie koniugatu”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do jakiejkolwiek grupy połączonej z oligomerem przy jego zakończeniu lub w obrębie samego oligomeru. Koniugaty obejmują stałe podłoża, takie jak żel krzemionkowy, szkło o kontrolowanych porach i polistyren; znaczniki, takie jak atomy lub

185 852 cząsteczki fluorescencyjne, chemiluminescencyjne, radioaktywne, ugrupowania enzymatyczne i grupy „reporterowe”; czynniki transportu oligomerów, takie jak polikationy, proteiny i glikoproteiny surowicy i polimery itp. Inne ugrupowania koniugatów obejmują O-cholesterol, glikol polietylenowy (PEG), aminokwasy, interkalatory, ugrupowania klarujące polinukleotydów, grupy funkcyjne sieciujące, lipidy, hydroksamaty, czynniki alkilujące itp.

Określenie „synton”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do jednostki strukturalnej w obrębie analogu oligonukleotydu według wynalazku.

Określenie „transfekcja”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do jakiejkolwiek metody odpowiedniej dla zwiększonego dostarczania oligomerów do komórek.

Określenie „osobnik”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do rośliny lub zwierzęcia, włączając w to ssaka, szczególnie człowieka.

Określenie „pochodne” i ich monomeryczne składniki ich oligomerów obejmuje te znane konwencjonalnie według stanu techniki.

Np. oligonukleotydy mogą być kowalencyjnie związane z różnymi ugrupowaniami, takimi jak interkalatory, substancje, które oddziałują zwłaszcza z mniejszą bruzdą podwójnej helisy DNA i inne dowolnie wybrane koniugaty, takie jak znaczniki (radioaktywne, fluorescencyjne, enzymowe itd.). Te dodatkowe ugrupowania mogą być (lecz nie muszą być) derywatyzowane przez modyfikowane wiązanie łańcucha głównego jako część samego wiązania itself. Np. interkalatory, takie jak akrydyna mogą być wiązane przez R-CH2- połączone przez jakikolwiek dostępne -OH lub SH, np., w pozycji 5’ końcowej RNA lub DNA, pozycji 2’ RNA, lub OH lub SH wbudowane w pozycję 5 pirymidyn, np., zamiast metylu 5 cytozyny, derywatyzowana forma, która zawiera -CH2CH2CH2OH lub -CH2CH2CH2SH w pozycji 5. Można przyłączyć szeroki zakres podstawników, włączając te związane przez konwencjonalne wiązania. Zgodnie z tym wskazane ugrupowania OH w oligomerze o wzorze (1) mogąbyć zamienione przez grupy fosfonianowe, zabezpieczone przez standardowe grupy zabezpieczające, lub aktywowane dla wytworzenia dodatkowych wiązań z innymi nukleotydami, lub mogą być związane ze sprzężonymi podstawnikami. 5’-końcowe OH jest konwencjonalnie fosforylowane; 2’-OH lub podstawniki OH przy końcu 3’ mogą także być fosforylowane. Hydroksyle mogą także być derywatyzowane do standardowych grup zabezpieczających.

Określenie „analog fosfodiestrowy”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do analogu konwencjonalnego wiązania fosfodiestrowego jak również alternatywnych grup wiążących. Te alternatywne grupy wiążące obejmują (lecz nie są ograniczone do) wykonania, w których O-P(O) jest zastąpione P(O)S, P(O)NR2, P(O)R, P(O)OR, gdzie R oznacza H lub alkil (1-7C), a R' oznacza alkil (1-7C). Nie wszystkie analogi fosfodiestrowe w tym samym oligomerze muszą być identyczne; jedynym wymaganiem jest to, że co najmniej jedno z tych wiązań jest modyfikowanym wiązaniem międzynukleotydowym jak opisano w niniejszym zgłoszeniu.

„Analogicznymi” formami puryn i pirymidyn są te zasadniczo znane według stanu techniki, z których wiele stosuje się jako środki chemoterapeutyczne. Przykładowa lecz nie wyczerpująca lista obejmuje: 4-acetylcytozyne, 8-hydroksy-N⁵-metyloadeninę, azyrydynylocytozynę, pseudoisocytozynę, 5-(karboksyhydroksymetylo)uracyl, 5-fluorouracyl, 5-bromouracyl, 5-karboksymetyloaminometylo-2-tiouracyl, 5-karboksymetyloaminometylouracyl, dihydrouracyl, inozynę, Nó-izopentenyloadeninę, 1-metyloadeninę, 1-metylopseudouracyl, 1metyloguaninę, 1-metyloinozynę, 2,2-dimetyloguaninę, 2-metyloadeninę, 2-metyloguaninę, 3-metylocytozynę, 5-metylocytozynę, Nó-metyloadeninę, 7-metyloadeninę, 7-metyloguaninę, 5-metyloaminometylouracyl, 5-metoksyaminometylo-2-tiouracyl, beta-D-mannozyloguanozynę, 5’-metoksykarbonylometylouracyl, 5-metoksy uracyl, 2-metylotio-Nó-izopentenyladeninę, ester metylowy kwasu uracylo-5-oksyoctowego, kwas uracylo-5-oksyoctowy, oksybutoksozynę, pseudouracyl, gueozynę, 2-tiouracyl, 4-tiouracyl, 5-metylouracyl, ester metylowy kwasu N-uracylo-5-oksyoctowego, kwas uracylo-5-oksyoctowy, pseudouracyl, gueozynę, 2tiocytozynę i 2,6-diaminopurynę.

Szczególnie korzystnym analogiem jest 5-metylocytozyna (skracana w niniejszym zgłoszeniu jako „Cme”)

185 852

Określenie „izosteryczny”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do właściwości przestrzennych i dotyczących orientacji wiązania międzynukleozydowego i faktu, że te właściwości są tak podobne do właściwości rodzimego wiązania fosfodiestrowego, ze modyfikowany oligonukleotyd zawierający wiązanie izosteryczne będzie ulegał zamianie, podstawieniu, naśladowaniu i/lub hybrydyzacji względem rodzimego oligonukleotydu.

Określenie „rybozoamid”, jak to jest stosowane w niniejszym zgłoszeniu, odnosi się do wiązania międzynukleotydowego, które istnieje między dwiema zasadami nukleinowymi. Wiązanie międzynukleotydowe rybozo-amidu zawiera kombinację funkcji rybozo/(2’-deoksy) i aminokwasu.

W niniejszym zgłoszeniu stosuje się różne skróty odnoszące się do grup funkcyjnych i związków. Te skróty łatwo zrozumie specjalista z dziedziny chemii organicznej, np. „Ph” odnosi się do fenylu, „Me” odnosi się do metylo, „(1-7C)” wskazuje, że dany łańcuch zawiera od 1 do 7 atomów węgla itd.

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dostarcza nowe analogi oligonukleotydowe zawierające modyfikowane wiązania aminokwas/aminoalkohol między zasadami i łańcuchami głównymi (fosfodiester, fosforotioany i inne jak podano w tablicy 1) także zwane modyfikowanymi wiązaniami nukleotydowymi. Modyfikacje lub jego funkcyjny równoważnik, zastępujące ugrupowanie cukrowe leżące między łańcuchem głównym i zasadami pochodnymi aminokwasowymi, np. jak podano we wzorach 24. Niniejszy wynalazek dostarcza także nowe nukleomonomery i sposoby ich włączenia w oligomery zawierające nukleomonomery.

Wynalazek dostarcza różne związki nukleomonomeryczne o strukturach danych wzorami 1-23.

\ Λ

N

I

X

Zasada

I

HO^OH

185 852

Zasada

Zasada

Zasada

I

I ^z> Λ N

Zasada

Zasada Zasada

Zasada

Zasada

I

Z A

S z

N ^RW

HO R₂

Zasada

I

Z \ z

185 852

Oligomery według wynalazku są polimerami obejmującymi jeden lub więcej rozpatrywanych związków monomery cznych połączonych tak, by dały strukturalny analog DNA lub RNA. Oligomery według wynalazku obejmują dwa lub więcej nukleomonomery i mogą obejmować niemal jakąkolwiek liczbę nukleomonomerów, chociaż oligomery o 200 lub mniej nukleomonomerach są zasadniczo łatwiejsze do zsyntetyzowania. Związki o wzorach 1-23, mogą być połączone z sobą przez wiązania 4’-5’, 3’-5’ i 2’-5’,jak widać z wzorów 24-41.

Wiązania nukleotydowe w związkach według wynalazku są tworzone z aminokwasów seryny i glicyny lub ich pochodnych. Oligonukleotydy według wynalazku są trwałe in vivo odpomena nukleazy endogenne i mogą hybrydyzować do docelowych sekwencji nukleotydowych. Przykładowe związki według wynalazku podanona wzorach 24 do 41 i są bardziej ograniczone konformacyjnie względem wiązań fosfodiestrowych niemodyfikowanych DNA lub RNA. To ograniczenie konformacyjne może, częściowo, przyczynić się do korzystniejszych właściwości dotyczących wiązania rozpatrywanych związków do docelowych sekwencji komplementarnego polinuklectydu; jednak, stosowanie według wynalazku nie jest zależne od tej teorii dotyczącej korzystniejszych właściwości dotyczących wiązania.

W innym wykonaniu, niniejszy wynalazek jest ukierunkowanyna modyfikowany oligonukleotyd lub jego pochodne, w którym ugrupowanie furanozy naturalnego oligonukleotydu, np. DNA lub RNA jest zamienione z ugrupowaniem aminokwasu/aminoalkoholu i inne modyfikacje, które obejmują podstawienie w pozycjach aminokwasu podanych we wzorach 25 do 41. Wiązaniem międzynukleotydowym między sąsiednimi nukleomonomerami jest wiązanie miedzy pozycją 4’, 5’ sąsiednich nukleomonomerów. Innymi słowy, fosfodiestrowe wiązanie międzynukleotydowe lub jego funkcyjny równoważnik pochodzi z pozycji 5’ jednego nukleomonomeru i łączy pozycję 4’ sąsiedniego monomeru jak wyszczególniono w związkach o wzorach 24- 33.

25B

25A

185 852

28Α

0=Ρ-0

28Β

Zasada

29Α

Zasada

29Β

29C

185 852

O X—N

O=P—O

-Zasada „Zasada

-Zasada

Zasada _A χ-rf \

B χΐ ·² X—N

30C

Zasada

Zasada

Zasada

- Zasada

R,

JCn⁰' i

N

Zasada „Zasada

32A

R

33B

33A

33C

185 852

W których każdy „R” oznacza niezależnie H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2,

ONH(CH3), Ph, -(CH₂)x-F; gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla a „F” oznacza NH2, SH,

OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH₂), SNH2, S(0)NH₂, S(0)(0)NH₂, CH3, Ph.

W których każda „zasada” jest niezależnie zasadą nukleozy dową.

W których każdy „Ri” oznacza niezależnie H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH₂, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F; gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla a „F” oznacza NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH₂), SNH2, S(0)NH2, S(0)(0)NH2, CH3, Ph.

W których każdy „R2” oznacza niezależnie H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F; gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla a „F” oznacza NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NCH, NOH(CH?), SNH2, S(0)NH2, S(0)(0)NH₂, CH3, Ph.

W których każdy „R3” oznacza niezależnie H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH₂)x-F; gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla a „F” oznacza NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH0, SNH2, S(0)NH2, S(0)(0)NH2, CH3, Ph.

W których każdy „R4” oznacza niezależnie H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F; gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla a „F” oznacza NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CHj), SNH2, S(0)NH2, S(0X0)NH₂, CH3, Ph.

W których każdy „A” oznacza niezależnie (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(O)(0), NH, NOH, NCH3, NR5 i Se, gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla.

W których każdy „B” oznacza niezależnie (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(0)(0), NH, NOH, NCH3, NR5 i Se, gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla.

W których każdy „X” oznacza niezależnie (CH2)x, CO, CS, O, S, S(O), S(0)(0), NH, NOH, NCH3, NR5 i Se, gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla.

W których każdy „Z” oznacza niezależnie (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(0)(0), NH, NOH, NCH3, NR5 i Se, gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla.

R5 oznacza H, OH, OMe, CN, NH, NOH, ONCH3, ONH2, etyl, propyl, niższy alkil (17C), Me, heteroalkil (1-7C), aryl (6-7C) i -(CH2)xF; gdzie „x” wynosi od 1 do 7C, a „F” oznacza niezależnie H, OH, SH, OCH3, CN, SCH3, ONH2, ONH(CH3), SNH2, S(0)NH2, S(0)(0)NH2, CH3 i Ph.

W których każdy „V” oznacza niezależnie analog fosfodiestrowy, fosforoditioany, metylofosfoniany, fosforoditioany, borofosfoniany, selenofosfoniany, fosforoamidany, acetamidan, oksyformamido, oksyacetamido, diizopropylosilyl, karbaminian, siarczek dimetylenu, dimetylenosulfotlenek, i/lub wiązanie wewnątrznukleozydowe o długości od dwóch do czterech atomów wybrane spośród atomów węgla, azotu, tlenu, siarki i selenu. Długość oligomeru może zmieniać się od dimeru do 200 merów lub oligomer może być jeszcze dłuższy. Korzystnie zmodyfikowane wiązania wewnątrznukleotydowe obejmują struktury „V” podane w tabeli I.

Ponadto związki o wzorach mogą być koniugowane z jednym lub więcej ugrupowaniem koniugatowym. Odpowiednio ugrupowania koniugatowe obejmują O-cholesterol, glikol polietylenowy, aminokwasy, interkalatory, ugrupowania rozszczepiające (np. imdazol), ugrupowania funkcyjne sieciujące (np.psoralen), lipidy, peptydy, czynniki alkilujące, hydroksamaty, i znaczniki fluorescencyjne. Ugrupowanie koniugatowe może niezależnie zastępować jedno lub więcej spośród R, Ri, R2, R3, R4 i R5.

W jeszcze innym wykonaniu rozpatrywany wynalazek dostarcza struktury oligomeryczne jak podano we wzorach 34-35 oraz ich pochodne:

185 852

W związkach o wzorach 34-35 wiązania pomiędzy sąsiednimi nukleomonomerami są wiązaniami 3’ do 5’.

W których każdy „R” oznacza niezależnie H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F; gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla a „F” oznacza NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(0)NH2, S(0)(0)NH2, CH3, Ph.

W których każda „zasada” jest niezależnie zasadą nukleozydową.

W których każdy „Ri” oznacza niezależnie H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH?)x-F; gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla a „F” oznacza NH2, SH, OH,COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(0)NH2, S (0)(0)NH₂, CH3, Ph.

W których każdy „R2” oznacza niezależnie H, OK, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F; gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla a „F” oznacza NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(0)NH2, S(0)(0)NH2, CH3, Ph.

W których każdy „R3” oznacza niezależnie H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F; gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla a „F” oznacza NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH0, SNH2, S(0)NH2, S(0)(0)NH₂, CH3, Ph.

W których każdy „R4” oznacza niezależnie H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F; gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla a „F” oznacza NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(0)NH2, S(0)(0)NH₂, CH3, Ph.

W których każdy „A” oznacza niezależnie (CH₂)x, CO, CS, S, S(O), S(0)(0), NH, NOH, NCH3, NR₅ i Se, gdzie „x” wynosi od 1 do 7.

185 852

W których każdy „B” oznacza niezależnie (CH₂)x, CO, CS, S, S(O), S(0)(0), NH,

NOH, NCH₃, NR5 i Se, gdzie „x” wynosi od 1 do 7.

W których każdy „X” oznacza niezależnie (CH₂)x, CO, CS, O, S, S(O), S(0)(0), NH,

NOH, NCH3, NR5 i Se, gdzie „x” wynosi od 1 do 7.

W których każdy „Y” oznacza niezależnie (CH₂)x, CO, CS, O, S, S(O), S(0)(0), NH, NOH, NCH3, NR5 i Se, gdzie „x” wynosi od 1 do 7.

W których każdy „Z” oznacza niezależnie (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(0)(0), NH, NOH, NCH3, NR5 i Se, gdzie „x” wynosi od 1 do 7.

R5 oznacza H, OH, OMe, CN, NH, NOH, ONCH3, ONH2, etyl, propyl, niższy alkil (17C), Me, heteroalkil (1-7C), aryl (6-7C) i -(CH2)xF; gdzie „x” wynosi od 1 do 7c, a „F” oznacza niezależnie H, OH, SH, OCH3, CN, SCH3, ONH₂, ONH(CH3), SNH₂, S(0)NH₂, S(0)(0)NH₂, CH3 i Ph.

W których każdy „V” oznacza niezależnie analog fosfodiestrowy, fosforoditioany, metylofosfoniany, fosforoditioany, borofosfoniany, selenofosfoniany, fosforoamidany, acetamidan, oksyformamido, oksyacetamido, diizopropylosilil, karbaminian, siarczek dimetylenu, dimetylenosulfotlenek, i/lub wiązanie wewnątrznukleozydowe o długości od dwóch do czterech atomów wybrane spośród atomów węgla, azotu, tlenu, siarki i selenu. Długość oligomeru może zmieniać się od dimeru do 200 merów lub oligomer może być dłuższy. Korzystnie zmodyfikowane wiązania wewnątrznukleotydowe obejmują struktury „V” podane w tabeli I.

W innym wykonaniu wynalazku przedmiot wynalazku dostarcza oligomery o wzorach 37 do 41 lub ich warianty, oligomery obejmujące nowe wiązania wewnątrznukleotydowe, którymi są wiązania 2’, 5’. Takie oligonukleotydy są trwałe in vivo, mają zwiększoną odpornośćna endogenne nukleazy i mogą hybrydyzować do docelowych sekwencji oligonukleotydowych.

37B

185 852

Zasada

Zasada

Χ-Ν

Χ-Ν °x° o' 'o

Zasada

Λ ς

V h—k „ Zasada

Χ-Ν

Χ-Ν

39B

39A

X -^z' ' Χ-Ν .Zasada

X—N r- Zasada

40B

X -^z' ' Χ-Ν \ V

Zasada r-Zasada

-N,

41B

W których każda „fasada” jest niezależnie zasadą nukleozydową.

W których każdy „R” oznacza niezależnie H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH₂,

ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F; gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla a „F” oznacza NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(0)NH2, S(0)(0)NH₂, CH3, Ph.

W których każda „zasada” jest niezależnie zasadą nukleozydową.

W których każdy „Ri” oznacza niezależnie H, OH, SH, Cn, CH3, OCH3, SCH3, ONH2,

ONH(CH}), Ph, -(CH2)x-F; gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla a „F” oznacza NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CHj), SNH2, S(0)NH2, S (0)(0)NH₂, CH3, Ph.

185 852

W których każdy „R2” oznacza niezależnie H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2,

ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F; gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla a „F” oznacza NH2, SH,

OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(0)NH2, S(0)(0)NH₂, CH3, Ph.

W których każdy „R3” oznacza niezaleznie H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F; gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla a „F” oznacza NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(0)NH2, S(O)(O)NH2, CH3, Ph.

W których każdy „R4” onacza niezależnie H, OH, SH, CN, CH3, OCH3, SCH3, ONH2, ONH(CH3), Ph, -(CH2)x-F; gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla a „F” oznacza NH2, SH, OH, COOH, OCH3, SCH3, SPh, NOH, NOH(CH3), SNH2, S(0)NH2, S(0)(0)NH2, CH3, Ph.

W których każdy „A” oznacza niezależnie (CTLY, CO, CS, S, S(O), S(O)(0), NH, NOH, NCH3, NR5 i Se, gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla.

W których każdy „B” oznacza niezależnie (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(0)(0), NH, NOH, NCH3, NR5 i Se, gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla.

W których każdy „X” oznacza niezależnie (CH2)x, CO, CS, O, S, S(O), S(0)(0), NH, NOH, NCH3, NR5 i Se, gdzie „x” wynosi od 1 do 7.

W których każdy „Z” oznacza niezależnie (CH2)x, CO, CS, S, S(O), S(0)(0), NH, NOH, NCH3, NR5 i Se, gdzie „x” wynosi od 1 do 7 atomów węgla.

R5 oznacza H, OH, OMe, CN, NH, NOH, ONCH3, ONH2, etyl, propyl, niższy alkil (1-7C), Me, heteroalkil (1-7C), aryl (6-7C) i -(CH2)xF; gdzie „x” wynosi od 1 do 7C, a „F” oznacza niezależnie H, OH, SH, OCH3, CN, SCH3, ONH2, ONH(CH3), SNH2, S(0)NH2, S(0)(0)NH2, CH3 i Ph.

W których każdy „V” oznacza niezależnie analog fosfodiestrowy, fosforoditioany, metylofosfoniany, fosforoditioany, borofosfomany, selenofosfoniany, fosforoamidany, acetamidan, oksyformamido, oksyacetamido, diizopropylosilil, karbaminian, siarczek dimetylenu, dimetylenosulfotlenek, i/lub wiązanie wewnątrznukleozydowe o długości od dwóch do czterech atomów wybrane spośród atomów węgla, azotu, tlenu, siarki i selenu. Długość oligomeru może zmieniać się od dimeru do 200 merów lub oligomer może być dłuższy. Korzystnie zmodyfikowane wiązania wew natrznukleotydowe obejmują struktury „V” podane w tablicy I.

W innych wykonaniach wynalazku przedmiot wynalazku jest ukierurkowanyna oligomer o następujących wzorach (wzór 42) i ich składniki monomeryczne (wzory 85-90).

42A

42D**·

R

42F*'^y'185 852 w których,

X jest wybrany z grupy obejmującej (CH2)„ gdzie n = 1-3, CO(CH2)n, gdzie n = 0-2, i (CH2)nSC2 gdzie n= 1 -2,

Y jest wybrany z grupy obejmującej CH2, CO, COOH, CS i SO2,

Y' jest wybrany z grupy obejmującej CH2, CO, COOH, CS i SO2,

Z jest wybrany z grupy obejmującej O, S, NH i CH2,

R jest wybrany z grupy obejmującej CH2OH, CH2NH2, CH2NHCHO, CONH2 i COOH, B jest zasadą nukleozydową.

w których,

X jest wybrany z grupy obejmującej (CH2)n gdzie n = 1-3, CO(CH2)n, gdzie n = 0-2, i (CH₂)_nS02 gdzie n= 1-2,

Y jest wybrany z grupy obejmującej CH2, CO, COOH, CS i SO2,

Y'jest wybrany z grupy obejmującej CH2, CO, COOH, CS i SO2,

Z jest wybrany z grupy obejmującej O, S, NH i CH2, ,

R jest wybrany z grupy obejmującej CH2OH, CH2NH2, CH2NHCHO, CONH2 i COOH,

B jest zasadą nukleozydową.

W innych wykonaniach, wynalazek dostarcza metod leczenia chorób za pośrednictwem obecności sekwencji nukleotydowej, które obejmują podawanie choremu potrzebującemu takiego leczenia pewnej ilości zmodyfikowanych, jak podano powyżej, oligonukleotydów zdolnych do specyficznego wiązania sekwencji nukleotydowej skutecznej w inaktywowaniu sekwencji nukleotydowej.

W oligonukleotydach według niniejszego wynalazku co najmniej jedna z grup fosfodiestrowych zawarta wśród „V” o wzorach 24-41 jest podstawiona przez opisane w niniejszym wynalazku zmodyfikowane wiązania wewnątrznukleozydowe. Korzystne jest, gdy wielokrotne wiązania fosfodiestrowe w niemodyfikowanym oligonukleotydzie podstawione przez zmodyfikowane wiązanie wewnątrznukleozydowe mogą być zastosowane powtórnie w tej strukturze lub, jeśli jest to pożądane, różnorodne zmodyfikowane wiązania wewnątrznukleotydowe mogą być zastosowane w indywidualnym oligonukleotydzie. W korzystnym wykonaniu oligonukleotydów będących przedmiotem wynalazku te podstawnikowe wiązania nie są chiralne, tak by zwiększyć zdolność oligonukleotydu do hybrydyzowania do żądanego celu, jednakże użyteczne związki według wynalazku obejmują te wykonania w których stosowane są formy chiralne.

Korzystne modyfikowane wiązania miedzynukleotydowe obejmują struktury „V” podane w tablicy l.

185 852

Tablica I

-0-	-S(0)(O)-CH2-	I -Se(0X0)-Se(0)-{0)-
-s-	-CH2-S(0)(0)-	-0-CH2-Se(0)(0)-
-S(0)-	-S(^))(0))-CH2-CH2-	| -Se(O)(O)-CH2-0-
-S(0)(0)-	-CH2-CH2-S(<0)(0)-	[ -S-CH2-Se-
-Se-	-CH2-S(0X0)-CH2-	1 -Se-CH2-S-
-Si-	-S(OXO)-CH2-S(O)(0)-	| -S(0)-CH2-Se(0)-
-C(0)-	-0-CH2-S(0)(0)-	-Se(0)-CH2-S(0)-
-C(S)-	-S(0X0)-CH2-0-	-S(0X0)-CH2-Se(0X0)-
-NH-	-s-s-	-Se(O) (0^^^CH2-^^^)(^>
-N0H-	-S(0)-S(0)-	-S-S-
-NCH3-	-8(0)(0)-8(0)-(0^^-	-S(0)-S(0)-
-NR5-	-Se-CH2-	-S(O) (0)-S(0)(0)-
-CH2-	-CH2-Se-	-Se-Se-
-o-cH2-	-Se-CH2-CH2-	-Se(0)-Se(0)-
-ch2-o-	-CH2-CH2-Se-	-Se(0)(0)-Se(0)(0)-
-o-ch2-ch2-	-CH2-Se-CH2-	-N(R5)-CH2-
-cH2-cH2-o-	-Se-CH2-Se-	-CH2-N(Rj)-
-cH2-o-cH2-	-0-CH2-Se-	-N(R5)-CH2-CH2-
-o-ch2-o-	-Se-CH2.0-	-CH2-CH2-N(R5)-
-s-ch2-	-Se(0)-CH2-	-CH2-N(R5)-CH2-
-cH2-s-	-CH2-Se(0)-	-N(R5)-0-
-s-cH2-CH2-	-Se(0)-CH2-CH2-	-0-N(R5)-
-ch2-ch2-s-	-CH2-CH2-Se(O)-	-N(R5)-0-CH2-
-cH2-s-cH2-	-CH2-Se(0)-CH2-	-CH2-0-N(R5)-
-s-CH2-s-	-Se(0)-CH2-Se(0)-	-CH2-N(R5)-0-
-o-cH2-s-	-0-CH2-Se-(0)	-0-N(R5)-CH2-
-s-ch2-o-	-Se(0)-CHr0-	-0-CH2-N(R5)-
S(0)-CH2-	-Se(O)(O)-CH2-	-N(R5)-CH2-0-
-CHr-S(0)-	-CH2-Se(0X0)-	-N(R5)-S-
-S(0)-CH2-CH2-	-Se(O)(O)-CH2-CH2-	-S-N(Rj)-
-CH2-CH2-S(0)-	-CR2-CH2-Se(O)(0)-	-N(R5)-S-CH2-
-CH2-S(0)-CH2-	-CH2-Se(0X0)-CH2-	-CH2-S-N(R5)-
-S(0)-CHrS(0)-	Se(0X0)-CH2-Se(0X0)-	-CH2-N(R5)-S-
-0-CH2-S(0)-	-Se-Se-	-S-N(R5)-CH2-
-S(0)-CH2-Q-	-Se(0)-Se(0)-	-S-CH2-N(R$)-

185 852

Dalszy ciąg tablicy

-N(R5)-CH2-S-	-N(R.0-C(S)-O-CH2-	I -O-C(O)-N(R3)-S-CH2-
-N(R5)-S(O)-	-O-C(O)-N(R5)-O-	-S-C(S)-N(R5)-O-CH2-
-S(O)-N(R5)	-O-C(S)-N(R5)-O-	-S-N(R5--C(O--O-CH2-
N(Rs)-S(0)-CH2-	-O-C(O)-N(R5)-CH2-	-O-N(R5)-C(S--S-CH2-
-CH2-S(O)-N(R5)-	-O-C(S)-N(R5>CH2-	-CH2-S-C(O--N(R5--O-
-CH2-N(R5)-S(O)-	-O-C(O)-CH2-N(R5)-	-CH2-O-C(S)-N(R5--S-
-S(O)-N(R5)-CH2-	-O-C(S)-CH2-N(Rs)-	-CH2-S-C(O)-N(R5)-CH2-
-S(O)-CH2-N(Rs)-	-O-C(O)-CH2-O-N(R5)-	-CH2-S·^^^,)-^-
-N(Rs)-CH2-S(O)-	-O-C(S)-CH2-O-N(R5)-	I -CH2-S-C(O)-CH2-N(R5>·
-N(R5)-S(O)(O)-	-O-C(O)-N(Rj)-O-CH2-	1 -CH2-S-C(S)-CH2-N(Rj)-
-S(O)(O)-N(R5)-	-O-C(S)-N(R5)-O-CH2-	! -CH2-S-C(^)-N(R5)-
-N(R5)-S(^)(O)-CH2-	-0-N(R$)-C(0)-0-CH2-	1 -C^-S-C^-NCR,)-
-CH2-S(O)(C^)-N(R5)-	-O-N(R5)-C(S)-O-CH2-	1 -CH2-S-C(O)-N(R5--O-
-CH2-N(R5)-S(O)(O)-	-CH2-O-C(O)-N(R5)-O-	I -^2-8-0(8^^0-
-S(^)(O^)-N(R5)-CH2-	-CH2-O-C(S)-N(Rs)-O-	-CH2-S-N(R5)-C(O--O-
-S(^)(O)-CH2-N(R5)-	-CH2-O-C(O)-N(Rs)-CH2-	-CH2-S-N(R5)-C(S)-O-
-N(R5)-CH2-^^(O)(O)-	-CH2-C-C(S)-N(R5)-CI-l2-	-CH2-O-C(O)-N(R5)-S-
-O-N(R5)-S-	-CH2-O-C(O)-CH2-N(R5)-	-CH2-O-C(S)-N(R5--S-
-S-N(R5)-O-	-cH2-O-C(S)-CH2-N(R,)-	-CH2-O-N(R5)-C(O)-S-
-O-N(R5)-S(O)-	-CH2-O-C(O)-N(R5)-	-CH2-O-N(R5--C(S)-S-
-S(O)-N(R5)-O-	-CH2-O-C(S)-N(Rs)-	-N(R5)-N(R5)-
-O-N(R5)-^^^)(O)-	-CH2-O-C(O)-N(R5)-C-	-N(R5)-N(R5)-CH2-
-S(O)(O)-N(Rj)-O-	-CH2-O-C(S)-N(R<)-O-	-CH2-N(R5)-N(R5)-
-o-s-o	-CH2-O-N(R5)-C(O)-C-	-N=C(NH2)-N(R5)-
-O-S(O)-O-	-CH2-O-N(R5)-C(:^)-C^-	-N(R5)-N=C(NH2)-
-O-S(O)(O)-O-	-CH2-N(R5)-C(O)-O-	-S(O)-CH2-O-
-N(R5)-S-N(R5)-	-CH2-N(R5)-C(S^^^-	-O-CH2-S(O)-
-N(R5)-S(O)-N(R5)- 1	-N(Rs)-C(O)-S-CH2-	-S-CH(R5)-O-
-N(R5)-S(^)(O)-N(R5)- 1	-N(R5)-C(S)-S-CH2-	-O-CH^-S-
-cH2-s-o-	-S-C(O)-N(R5)-O-	-o-cH2-cH=CH-
-CH2-S(O)-(O)-	-O-C(S)-N(R5)-S-	-s-CH2-CH=CH-
-CH2-^^O)(O)-(O)-	-S-C(O)-N(R5)-CH2- 1	-s-cH2-C=c-
-CH2-C(O)-O-	-S-C^-N^FC^-	-N(R5)-CH2-N(R5)-
-CH2-C(SKC-	-S-C(O)-CH2-N(R5)-	-N(R5)-C(O)-N(R5)-
-CH2-N(R5)-C(O)-O-	-S-C^-C^-NCR,)-	-N(R5)-C(S)-N(R5)-
-CIl2-N(Rs)-C(S)-O-	-S-C(O)-CH2-O-N(R5--	-N(R5--C(O)-S-
-N(R5)-C(O)-O-CH2-	-O-C(S--CH2-S-N(R5--	-N(R5)-C(S)-S-

185 852

Dalszy ciąg tablicy

-N(Rj)-C(S)-O-	| -0-0(0)-^5)-	I ^-^0)-^)-
-N(Rs)-C(O)-0-	I -O-C(S)-N(R5)-	l -S-C(S>N(Rj>·

R5 oznacza H, OH, OMe, CN, NH, NOH, ONCH3, ONH2, etyl, propyl, niższy alkil (1-7C), Me, heteroalkil (1-7C), aryl (6-7C), -(CH2)xF; gdzie „x” oznacza 1-7C, a „F” oznacza niezależnie H, OH, SH, OCH₃, CN, SCH_3j ONH₂, ONH(CH₃), SNH_3j S(O)NH₂. S(O)(0)NH₂,, CH₃, Ph. Ponadto, jedno lub więcej ugrupowań koniugatowych może być przyłączonych do wiązania, tak by wytworzyć koniugat oligomeryczny. Odpowiednie ugrupowania koniugatowe obejmują: O-cholesterol, glikol polietylenowy, aminokwasy, interkalatory, ugrupowania rozszczepiające (np. imdazol), sieciujące grupy funkcyjne (np. Psoralen), lipidy, peptydy, środki alkilujące, hydroksamaty i znaczniki fluorescencyjne.

Szczególnie korzystne wiązania 4’-5’ obejmują fosfodiester, fosforotiany, metylofosfoniany, karboksamid, tiokarboksamid, hydroksamat, sulfonamid, hydroksyloaminę i karbaminian. Te same modyfikacje są korzystne także dla wiązań 2’-5’ i 3’-5’. Oligomery według wynalazku nie są ograniczone do oligomerów o jednorodnym typie wiązania i są objęte wiązania zastępcze przemienne lub o rozkładzie losowym, włączając w to wiązania, 2’, 5’. Ponieważ oligomery według wynalazku mogą być syntetyzowane przy jednej reszcie nukleomonomeru na raz, każde pojedyncze wiązanie i/lub wiązanie zastępcze oraz charakter każdego pojedynczego podstawnika-„zasady” może być wybrany niezależnie, tak by wytworzyć oligonukleotydy o żądanej sekwencji.

Oligomery według wynalazku mogą zawierać dowolną żądaną liczbę wiązań zastępczych. Te wiązania zastępcze mogą być identyczne lub różne ze względu na wykonania wybrane dla „V”, włączając inne nie należące do wynalazku wiązania zastępcze. Ponieważ oligomery wytwarza się sekwencyjnie, można zastosować jakikolwiek wzorzec typów wiązania lub wiązania zastępczego, zasad i modyfikacji cukrów.

W korzystnych wykonaniach według wynalazku wiązania zastępcze według wynalazku są przemienne według regularnego wzorca. Np. po jednym wiązaniu zastępczym następują dwa wiązania fosfodiestrowe, a następnie jedno wiązanie zastępcze według wynalazku itp. Dodatkowe wykonania obejmują np. wiązania przemienne, takie jak wiązanie zastępcze, po którym następuje analog fosfodiestrowy (np. tioan itd.), po którym następuje wiązanie zastępcze według wynalazku, po którym następuje wiązanie typu analogu fosfodiestrowego itd. tzn oligomer według wynalazku może obejmować przemiennie, jeden po drugim, dwa typy wiązań zastępczych. Oligomery według wynalazku obejmujące więcej niż jeden typ wiązania mogą mieć dowolną liczbę regularnych wzorców utworzonych przez naprzemienność różnych typów wiązania obecnych między podjednostkami oligomęru. Modyfikację cukru mogą być wykonane w przypadku jednej lub więcej reszt nukleomonomerowych w oligomerach według wynalazku; jednak, wiązania nukleotydowe 4’-5’, 3’-5’ i 2’-5’ między resztami aminokwasowymi są korzystne, gdy takie modyfikacje mają być włączone. Gdy ma to miejsce, można użyć dalszego skróconego zapisu dla przedstawienia sekwencji zasad analogu oligonukleotydowego. Np. w standardowym DNA (lub RNA) sekwencje zasadniczo oznacza się przez sekwencje samych zasad tak jak np. ATG CGC TGA. Zasadniczo, z góry podaje się czy to reprezentuje sekwencję RNA lub DNA. W niniejszym zgłoszeniu stosuje się odpowiadający temu system notacji, by przedstawić analogi oligonukleotydowe o danej sekwencji zasad

Dodatkowe modyfikacje nukleomonomerów.

Oligomery według wynalazku mogą także obejmować różne modyfikacje oprócz wiązań zastępczych według wynalazku. Dodatkowe modyfikacje obejmują oligomery, w których (i) jedna lub więcej reszt nukleomonomerów jest modyfikowana w pozycjach 2’, 3’, 4’ i 5’, (ii) jest włączone jedno lub więcej z kowalencyjnych ugrupowań sieciujących, (iii) są włączone inne nie należące do wynalazku wiązania zastępcze, (iv) są włączone inne analogi zasad, takie jak 8-okso-N⁶-metyloadenina, (v) są włączone koniugaty, takie jak środki interkalujące lub polilizyny, które odpowiednio zwiększają powinowactwo wiązania do sekwencji docelowego kwasu nukleinowego lub zwiększają asocjację oligomeru z komórkami.

185 852

Specyficzne dla sekwencji polinukleotydowej właściwości wiążące oligomerów według wynalazku dla celów jednoniciowych i typu dupleks są zgodne z dalszymi modyfikacjami oligomeru. Te dalsze modyfikacje mogą także nadać inne przydatne właściwości, takie jak trwałośćna rozszczepienie przez nukleazę (np. w domenie oligomeru według wynalazku o wiązaniach fosfodiestrowych), lub zwiększyć ich zdolność do przenikania przez błony komórkowe itp.

Oligomery według wynalazku mogą obejmować jedno lub więcej wiązań zastępczych, takich jak wiązania siarczkowe lub sulfonowe (Benner, S.A., International Publication No. WO 89/12060), wiązania sulfamatowe (International Publication No. WO 91/15500), karbaminianowe lub inne wiązania zastępcze w oligomerach połączonych z morfoliną (Stirchak, E.P. i in., Nucleic. Acids Res. 1989, J7, 6129-6141; Summerton, J., i in. International Publication No.-216 860) i wiązania pokrewne. Zatem przykładowe wykonania oligomerów według wynalazku obejmują oligomery o (1) co najmniej jednym wiązaniu zastępczym i aminokwas związany z sąsiednim monomerem oraz (2) jedno lub więcej nie należących do wynalazku wiązań zastępczych wybranych z grupy obejmującej fosforotioan, metylofosfonian i tionometylofosfoniąn i/lub (3) jedno lub więcej wiązań fosfodiestrowych i/lub (4) analogi puryny lub pirymidyny zwiększające powinowactwo wiązania do komplementarnych sekwencji docelowych. Inne przykładowe oligomery obejmują (1) oligomer o wiązaniach zastępczych według wynalazku przy końcach 3’ i/lub 5’ i wiązaniach fosforotioanowych w innym miejscu w oligomerze; (2) oligomery o wiązaniach zastępczych według wynalazku i standardowych zasadach purynowych lub pirymidynowych (np. adeninie, guaninie, cytozynie, tyminie lub uracylu); (3) oligomery o wiązaniach zastępczych według wynalazku i jedna lub więcej zasad zwiększających powinowactwo wiązania lub zdolność przenikania oligomeru (np. 5metylocytozyna, 5’(l-propynylo)uracyl, 5-(l-propynylo)cytozyna. Włączone są także oligomery zawierające reszty nukleomonomerowe związane poprzez hydroksamaty.

Synteza oligomerów

Oligomery według wynalazku mogą być utworzone przy użyciu nukleomonomerów według wynalazku, samych lub w połączeniu z konwencjonalnymi nukleomonomerami i zsyntetyzowane przy użyciu standardowych technik syntezy oligomerów w fazie stałej (lub w roztworze), które obecnie są dostępne handlowo. Zasadniczo oligomery według wynalazku mogą być zsyntetyzowane według sposobu obejmującego etapy: zsyntetyzowania syntonu nukleomonomeru lub oligomeru z grupą zabezpieczającą i zasadą i grupą sprzęgającą zdolną do sprzęgania do nukleomonomeru lub oligomeru; sprzęgania syntonu nukleomonomeru lub oligomeru do nukleomonomeru akceptora lub oligomeru akceptora; usunięcia grupy zabezpieczającej; oraz powtarzania cyklu wedle potrzeby do momentu zsyntetyzowania żądanego oligomeru.

Oligomery według niniejszego wynalazku mogą być dowolnej długości włączając w to długości większe niż 40, 50, 100, 200 lub 500 nukleomonomerów. Zasadniczo, korzystne oligomery zawierają 2-30 nukleomonomerów: Długości większe lub równe około 8 do 20 nukleomonomerów mogą być przydatne dla zastosowań terapeutycznych lub diagnostycznych, pod warunkiem, że mają odpowiednią sekwencję zasad. Krótkie oligomery zawierające 2, 3, 4 lub 5 nukleomonomerów są specyficznie objęte niniejszym wynalazkiem i mogą być użyte jako syntony.

Oligomery o ulosowionej sekwencji i zawierające około 6, 7 lub 8 nukleomonomerów można użyć jako primery, które są stosowane w protokołach klonowania lub wzmacniania stosujących primery o sekwencji losowej, pod warunkiem, że oligomer zawiera około 1 lub 2 reszty przy końcu 3’, które mogą służyć jako primer polimeraz lub odwrotnych transkryptaz lub które w przeciwnym przypadku nie zakłócają aktywności polimerazy.

Oprócz wiązań opisanych po raz pierwszy w niniejszym zgłoszeniu, oligomery według wynalazku mogą obejmować konwencjonalne wiązania fosfodiestrowe lub mogą zawierać inne wiązania zastępcze, takie jak wiązania fosforamidanowe, oprócz wiązań zastępczych według wynalazku. Te wiązania zastępcze obejmują (lecz nie są ograniczone do) wykonali, w których jest ugrupowanie o wzorze -0-P(O)(S)-O-(„fofforotioan”), -O-P(O)(NR2ⁿ)-X², -0-P(0)(R ^rt)-0-? 0-P(S)(R“)-0- i tionoalkilofosfonian”), -P(0)(0R⁹)-X2-, -0-C(0)-X², lub -0-C(C^XNR2^li)χ2-, w którym R^lf oznacza H (lub sól) lub alkil (1-12C włączając metylo i etyl), a R⁹ oznacza

185 852 alkil (1-9C) i wiązanie jest dołączone do sąsiednich nukleomonomerów przez -O- lub -S- połączone z atomem węgla nukleomonomeru, a X² oznacza O lub S. Wiązania fosforotioanowe i fosfodiestrowe są dobrze znane. Szczególnie korzystne wiązania zastępcze dla stosowania w oligomerach według niniejszego wynalazku obejmują zastępcze wiązania fosfodiestrowe, fosforotioanowe, metylofosforanowe i tionometylofosfonianowe. Zastępcze wiązania fosforotioanowe i metyfosfonianowe nadają dodatkową, trwałość oligomerowi, który powinien być identyczny. Szczególnie korzystne oligomery według wynalazku zawierają jedno lub więcej wiązań zastępczych fosforotioanowych lub metylofosfonianowych.

Oligomery według wynalazku i ich fragmenty mogą być zsyntetyzowane sposobami znanymi specjaliście z dziedziny techniki. Metody syntetyczne znane w tej dziedzinie i opisane można użyć do syntezy oligomerów zawierających zastępcze wiązania według wynalazku jak też inne wiązania lub wiązania zastępcze znane według stanu techniki, stosując odpowiednio zabezpieczone nukleomonomery. Metody syntezy oligomerów o wiązaniach zawierających fosfor są zawarte np. w: Froehler, B., i in., Nucleic Acids Res., 1986, 14, 5399-5467; Nucleic Acids Res., 1988, 16, 4831-4839; Nucleosides & Nucleotides, 1987, 6, 287- 291; Froehler, B., Tetrahedron Letts., 1986, 27, 5575-5578; Caruthers, M.H. w: Oligodeoxynucleotides Antisense Inhibitions of Gene Expression, 1989, J.S. Cohen, red., CRC Press, Boca Raton, s, 7-24; Reese,C., B. i in., Tetrahedron Letts., 1985, 26, 2245-2248. Syntezę oligomerów związanych metylofosfonianem poprzez chemię metylofosfonamidytu także opisano (Agrawal S. i in., Tetrahedron Letts., 1987, 28, 3539-3542; Klem. R.E. i in. International Publication Number WO 92/07864).

Oligomery zawierające wiązania według niniejszego wynalazku są także dogodnie syntetyzowane przez wytworzenie dimerów lub trimerów metodami chemii w fazie roztworu, a następnie przemianę syntonu do pochodnej, która jest włączona w oligomery za pomocą reakcji w roztworze lub fazie stałej. Typowymi syntonami są 5’ pochodne fosfonianowe lub fosforamidatowe zablokowane DMT lub MMT, które są wytwarzane standardowymi metodami (patrz: Gait M.J. (red.), Oligonucleotide Synthesis; A Practical Approach 1984, 1RL Press, Oxford).

Syntony objęte zakresem niniejszego wynalazku obejmują dimery, trimery, tetramery, heksamery i dłuższe oligomery wykonane metodami syntezy w fazie stałej lub w roztworze. Trimery i dłuższe syntony mogą zawierać więcej niż jeden typ wiązania. Syntony mogą obejmować dowolną zasadę jak opisano powyżej lub grupy 2’, 3’, 4’ i 5’, takie jak OH, DMTO, MMTO, O-allil, fosforan, fosfonian lub amidyt, jak opisano wyżej.

Rybozo-amidowe oligonukleotydy można zsyntetyzować przy użyciu standardowych metod syntezy peptydów w fazie stałej (chemia Fmoc); warunki (patrz Fig. 26).

Grupy blokujące w syntezie związku według wynalazku

1. Grupy sprzęgające.

Odpowiednimi grupami sprzęgającymi są np.: H-fosfonian, metylofosfonomidyt lub fosforamidyt.

Fosforamidyty, które mogą być użyte obejmują: cyjanoetylofosforamidyty (korzystne). Można także użyć metylofosfonamidyty, alkilofosfonamidyty (włączając etylofosfonamidyty i propylofosfonamidyty). Przykładowe fosforamidyty podano na figurach 1 do 21.

Odpowiednie „grupy sprzęgające” w pozycji 2’, 3’, 4’ lub 5’ oligomeru przy syntezie poprzez triester fosforamidytu, zwanej tu jako chemia „amidytu”, obejmują: N,N-diizopropylamino-p-cyjanoetoksyfosfmę, N,N-diizopropylamino-metoksyfosfinę, N,N-dietyloamino-cyjanoetoksyfosfinę i (N-morfolino)-metoksyfosfinę (Moore, M.F. i in., J Org Chem., 1985, 50, 2019-2025, Uznanski, A.W., i in., Tetrahedron Letts., 1987, 28, 3401-3404; Bjergarde, K., i in., Nucl Acids Res., 1991, 19, 5843-5850; Dahl, O. Sulfur Reports, 1991,11., 167-192). Pokrewne grupy sprzęgające, takie jak N,N-diizopropylamino-metylo-fosfina lub N,N-dietyloamino-metylo-fosfma, także można użyć do wytworzenia metylofosfonianów. Oligomery metylofosfonianowe można dogodnie zsyntetyzować przy użyciu grupy sprzęgającej, takiej jak N,N-diizopropylamino-metylofosforamidyt. Syntezę amidytów nukleomonomeru według wynalazku można wykonać sposobami konwencjonalnymi (np. Gryaznov, S.M.,

185 852 et.al, Nuci. Acids Res., 1992, 20, 1879-882; Vinayak, R., i in., Nuci. Acids Res., 1992, 20,

1265-1269; Sinha, N.D., i in., Nucl Acids Res., 1984,12,4539-4557; i inne cytowane odsyłacze).

2. Grupy zabezpieczające.

Grupy zabezpieczające, takie jak diizobutyloformamidyna, benzoil, isobutyryl, FMOC, dialkilformamidyna, dialkilacetamidyna lub inne grupy znane według stanu techniki mogą być użyte, by zabezpieczyć egzocykliczny atom azotu cytozynowych, adeninowych lub guaninowych związków heterocyklicznych. Alternatywnie, cytydyna może być bezpośrednio włączona w oligomery bez grupy zabezpieczającej przy egzocyklicznym atomie azotu stosując opisane sposoby (Gryaznov, S.M. i in., J Amer Chem Soc., 1991, 113. 5876-5877; Gryaznov, S.M. i in., Nuci Acids Res., 1992, 20, 1879-1882; Kung, P.-P. i in., Tetrahedron Letts., 1992, 33, 5869-5872). Odpowiednimi grupami zabezpieczającymi są dMt (dimetoksytrytylo), Bz (benzoil), Bu (isobutyryl), fenoksyacetyl, MMT (monometoksytrytylo) lub FMOC przy końcu 5’ i/lub wodorofosfonian, metylofosforamidyt, metylofosfonamidyt, β-cyjanoetyl-fosforamidyt, TBS (t-butyldimetylosilil) lub TBDPS (t-butyldifenylsilil) przy końcu 3’.

Korzystnymi grupami zabezpieczającymi są Bz (benzoil), DMT (dimetoksytrityl), MMT (monometoksytrityl) lub FMOC przy końcu 5’ lub pozycji i/lub TBS, wodorofosfonian, metylofosforamidyt, metylofosfonamidyt, β-cyjanoetylfosforamidyt przy końcu 3. Jednak, w zamierzeniu pozycja grup blokujących może wedle potrzeby być odwrotna (np. fosforamidyt w pozycji 5’ i DMT w pozycji 3’). Zasadniczo, nukleomonomery i oligomery według wynalazku mogą być derywatyzowane do takich „grup blokujących” jak wskazano w odpowiednich wzorach sposobami znanymi według stanu techniki.

Koniugaty

Wynalazek dostarcza także „koniugaty” oligomerów według wynalazku. „Koniugaty” konwencjonalnych oligomerów są znane specjaliście z dziedziny techniki. Np. oligomery według wynalazku mogą być kowalencyjnie związane z różnymi ugrupowaniami takimi jak np. interkalatory i związki, które oddziałują specyficznie z mniejszą bruzdą podwójnej helisy DNA. Inne ugrupowania dla koniugowania z rozpatrywanymi oligomerami obejmują znaczniki (np. radioaktywne, fluorescencyjne, enzymowe) lub ugrupowania, które ułatwiają asocjację komórki stosując rozszczepialne linkery itp. Odpowiednie radioznaczniki obejmują 3 ²P, ⁵S, 3h, ⁿⁱI i ¹⁴C; a odpowiednie znaczniki fluorescencyjne obejmują fluorescencję, rezorufinę, rodaminę, BODIPY (Molecular Probes) i czerwień Texas; odpowiednie enzymy obejmują alkaliczną fosfatazę i peroksydazę (z chrzanu). Inne związki, które mogą być użyte jako kowalencyjnie związane ugrupowania obejmują biotynę, przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, asialoglikoproteinę, transferynę i proteinę HIV. Proteina Tat może również być dogodnie dołączana do oligomerów według wynalazku. '

Te dodatkowe ugrupowania mogą być derywatyzowane przez jakiekolwiek dogodne ugrupowanie. Np. interkalatory, takie jak akrydyna lub psoralen, mogą być związane z oligomerami według wynalazku przez dowolny dostępny -OH lub -SH, np., w pozycji 5’-końcowej oligomeru, pozycjach 2’ RNA, lub OH, NH2, COOH lub SH włączone w pozycję 5 piiymidyn. Dogodna jest derywatyzowana forma, która zawiera, np. -CH₂CH₂CH₂,OH lub -CH2CH2CH2SH w pozycji 5 pirymidyn. Koniugaty zawierające polilizynę lub lizynę mogą być zsyntetyzowane jak opisano i mogą jeszcze zwiększać powinowactwo wiązania oligomeru do jego docelowej sekwencji kwasu nukleinowego (Lemaitre, M. i in., Proc Natl Acad Sei. USA, 1987, 84, 648-652; Lemaitre, M. i in., Nucleosides i Nukleotides, 1987, 6, 311-315).

Można przyłączyć szeroki zakres podstawników, włączając te związane przez wiązania lub wiązania zastępcze. Ugrupowania -OH w oligomerach można zastąpić przez grupy fosforanowe, zabezpieczone przez standardowe grupy zabezpieczające, lub grupy sprzęgające, by wytworzyć dodatkowe wiązania do innych nukleomonomerów lub mogą być związane z podstawnikiem sprzężonym. 5’-końcowy Oh może być fosforylowany; 2’-OH lub podstawniki OH przy końcu 3’ mogą także być fosforylowane. Hydroksyle mogą także być derywatyzowane do standardowych grup zabezpieczających.

Oligomery według wynalazku mogą być kowalencyjnie derywatyzowane do ugrupowań, które ułatwiają asocjację komórki przy użyciu rozszczepialnych linkerów. Odpowiednie koniugaty także obejmują stałe podłoża dla syntezy oligomeru i ułatwienia detekcji sekwencji

185 852 kwasu nukleinowego. Stałe podłoża obejmują (lecz nie są ograniczone do): żel krzemionkowy, szkło o kontrolowanych porach, polistyren i magnetyczne kulki szklane.

Modyfikacje cukru:

Pochodne mogą być wykonane przez podstawienie w cukrach. Spośród korzystnych pochodnych oligomerów według wynalazku 2’-0-allil lub 3-allil zwiększa zdolność przenikania i trwałośćna degradację względem nukleazy, lecz nie wydaje się zmniejszać powinowactwa oligomeru do celów o pojedynczym łańcuchu lub typu dupleks. W szczególności, w oligonukleotydach o łańcuchu głównym rybozowo-amidowym, różne grupy funkcyjne mogłyby być wprowadzone w pozycjach 1’, 2’, 3’, 4’ i 5’ ugrupowania rybozy, by poprawić farmakokinetyczne właściwości odpowiednich oligbruk.lebtydt)w:

Wiązania zastępcze

Oligomery według wynalazku mogą także zawierać jedno lub więcej „wiązań zastępczych”, oprócz wiązań 2’-5’, 3’-5’ i 4’-5’ ujawnionych w niniejszym zgłoszeniu, które są zasadniczo rozumiane według stanu techniki. Te „wiązania zastępcze” obejmują fosforotioan, metylofosfonian, tiorometylbfbsfonian, fosforoditioan, alkilofosfoniany, morfolinosulfamid, boranofosforan (-0-P(0CH3)(BH3)-0-), siloksan (-0-Si(X⁴)(X⁴)-0-; X⁴ oznacza 1 - 6C alkil lub fenyl) i fosforamidan (metbksyetylbamira (-O-P(oCH2CH20cH3)(O)-O-) itp.), i są zsyntetyzowane jak opisano w zasadniczo dostępnej literaturze włączając następujące odsyłacze (Sood, A., i in. J. Am. Chem. Soc., 1990, U2, 9000-9001; WO 91/08213; WO 90/15065; WO 91/15500; Stirchak, E.P. i in. Nucleic Acid Res., 1989,17, 6129-6141; Opis patentowy USA 5,034,506; Opis patentowy USA 5,142,047; Hewitt, J.M. i in., Nucleosides & Nucleotides, 1992, j_l, 1661-1666; Summerton, J. i in. International Publi-cation No. 216 860). Wiązania zastępcze, które mogą być użyte w oligomerach ujawnionych w niniejszym zgłoszeniu obejmują także sulfonamid (-O-SO2-NH-), siarczek (-CH2-S-CH2-), sulfonian (-O-SO2-CH2-), karbaminian (O-C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-), dimetylohydrazyno (-CH2-NCH3-), sulfamat (-0S(O)(O)-N-; -N-S(OXO)-N-), S^amino (-NH-CHi-, N-metylohydroksyloamino (-C^-NCR0-) i wiązania 2’, 5’ (takie jak 2’, 5’ karbaminian (2’-N(]^H)-(^((0)^(0- 5’), 5’, 2' karbaminian (2’-0-C(0)-N(H)-5’), 5’, 2’ metylokarbaminian -2’-0-C(0)-N(CH3)-5’) i 5’, 2’ tioformacetal (2 ’-0-CH2-S-5 ’). Dodatkowe wiązania zastępcze, które są odpowiednie obejmują wiązania amidowe opisane w: Buchardt, O. i in., (International Publication No. WO 92/20702), i te opisane w: Cook, P.D. i in., (International Publication No. WO 92/20822), De Mesmaeker, A. i in., (Intematibral Publication No. WO 92/20823) i jak opisano w PCT/U592/04294.

Oprócz przypadków specyficznych wskazań, wiązania zastępcze, takie jak wiązanie formacetalowe, -O-CH2-O-, są związane do jednego z atomów węgla 4’, 3’, 2 ’ nukleomonomeru po lewej stronie i do atomu węgla 5’ nukleomonomeru po prawej stronie. Oznaczenia atomu węgla 4’, 3’, 2’ lub 5’ można zmodyfikować, gdy struktura inna niż ryboza, deoksyryboza lub arabinoza jest związana z sąsiednim nukleomonomerem. Takie struktury obejmują ksylozę, heksozę, pierścień morfolinowy, pierścienie karbocykliczne (np. cyklopentan) itp.

Użycie wiązań karbaminianowych, węglanowych, siarczkowych, sulfotlenkowych, sulfonowych, N-metylohydroksyloaminowych i dimetylohydrazyno w syntonach lub oligomerach zostało opisane (Vaseur, J-J. i in., J Amer Chem Soc., 1992, 114, 4006-4007; WO 89/12060; Musicki, B. i in., J Org Chęm. 1990, 55, 4231-4233; Reynolds, R.C. i in., J Org Chem., 1992, 57, 2983-2985; Mertes, M.P., i in„ J Med. Chem., 1969, 12, 154-157; Mungall, W.S. i in., J. Org. Chem., 1977, 42, 703-706; Stirchak, E.P., i in., J. Org. Chem. 1987, 52, 4202-4206; Wang, H., i in., Tetrahedron Letts., 1991, 32, 7385-7388; International Application No. PCT US91/03680), Wiązanie (Wiązania) zastępcze mogą być użyte w oligomerach z szeregu powodów, takich jak w celu dalszego ułatwienia wiązania z komplementarnymi docelowymi sekwencjami kwasu nukleinowego i/lub dla zwiększenia trwałości oligomerów względem nukleaz.

Zasady

Odpowiednie zasady dla stosowania jako zasady nukleozydowe w związkach według wynalazku obejmują nie tylko naturalnie występujące zasady purynowe i pirymidynowe, lecz także analogi tych zasad heterocyklicznych i ich tautomerów. Takie analogi obejmują alkilowane puryny lub pirymidyny, acylowane puryny lub pirymidyny, lub inne związki heterocykliczne. Takie „analogiczne puryny” i „analogiczne pirymidyny” lub analogi puryn lub piry185 852 midyn są tymi, które zasadniczo są znane według stanu techniki; niektóre z nich stosuje się jako środki chemoterapeutyczne. Przykładowa, lecz nie wyczerpująca, lista obejmuje N N etanocytozynę, 7-deazaksantozynę; 7-deazaguanozynę, 8-okso-N⁶-metyloadeninę, 4-acetylocytozynę, 5-(karboksyhydroksylmetylo)uracyl, 5-fluorouracyl, 5-bromouracyl, 5-karboksymetyloaminometylo-2-tiouracyl, 5-karboksymetyloaminometylo uracyl, inozynę, N -izopentenyloadeninę, 1-metyloadeninę, 2-metyloguaninę, 5-metylocytozynę, N-metyloadeninę, 7-metyloguaninę, 5-metyloaminometylouracyl, 5-metoksyaminometylo-2-tiouracyl, 2-tiouracyl, 4-tiouracyl, 5-(l-propynylo)-4-tiouracyl, 5-(l-propynylo)-2-tiouracyl, 5-(l-propynylo)-2-tiocytozynę, 2-tiocytozynę, i 2,6-diaminopurynę. Oprócz tych zasadowych analogów, analogi pirymidynowe włączając w to 6-azacytozynę, 6-azatymidynę i 5-trifluorometylouracyl opisano w: Cook, D.P. i in., International Publication No. WO 92/02256 (włączone do niniejszego zgłoszenia jako odsyłacz) mogąbyć dogodnie włączone do oli-gomerów według wynalazku.

Włączenie 4-tiourydyny i 2-tiotymidyny do oligomerów zostało opisane (Nikiforov T.T i in., Tetrahedron Letts., 1992, 33, 2379-2382; Clivio P., i in., Tetrahedron Letts., 1992, 33: 65-68; Nikiforov, T.T. i in., Tetrahedron Letts., 1991, 32: 2505-2508; Xu, Y.-Z. i in., Tetrahedron Letts., 1991, 32: 2817-2820; Clivio, P. i in., Tetrahedron Letts., 1992, 33: 69-72; Connolly, B.A. i in., Nuci. Acids Res., 1989 17: 4957-4974). Korzystne zasady obejmują adeninę, guaninę, tyminę, uracyl, cytozynę, 5-metylocytozynę, 5-(l-propynylo)uracyl, cytozynę, 5metylocytozynę, 5-(l-propynylo)uracyl, 5-(l-propynylo)cytozynę, 8-okso-N-metyloadeninę, 7-deaza-7-metyloguaninę, 7-deaza-7-metyloadeninę oraz 7-deazaksantozynę.

Ugrupowanie wiązania kowalencyjnego.

W pewnych z oligomerów według wynalazku jest zawarte ugrupowanie zdolne do utworzenia co najmniej jednego wiązania kowalencyjnego między oligomerem i dupleksem. Mogą także być utworzone wielokrotne wiązania kowalencyjne przez dostarczenie krotności takich ugrupowań sieciujących. Wiązanie kowalencyjne jest korzystnie utworzone do reszty zasadowej w nici docelowej, lecz może być także utworzone z innymi częściami celu, włączając w to sacharyd lub fosfodiester. Charakter reakcji ugrupowania, które powoduje usieciowanie określa charakter celu w dupleksie. Korzystne ugrupowania sieciujące obejmują czynniki acylujące i alkilujące, i, w szczególności, te umiejscowione względem części nadającej specyficzność sekwencji, tak by umożliwić reakcję z umiejscowieniem celu w nici.

Jest oczywiste, że związek heterocykliczny nie musi być puryną lub pirymidyną w istocie pseudo-zasada, do której jest dołączona reaktyw na grupa funkcyjna nie musi być związkiem heterocyklicznym. Jakikolwiek sposób przyłączania reaktywnej grupy jest zadowalaj ący, tak długo j ak poprawne j est ustawienie.

Polamość oligomerów:

W formie najbardziej ogólnej, symbol 3’-— 5’ wskazuje rozciągłość oligomeru, w którym wiązania są spójnie tworzone między 5'-hydroksylem reszty aminokwasowej nukleomonomeru w lewo i 3'-(lub 2’-dla oligomerów o wiązaniach 2’-5’, lub 4’ dla oligomerów o wiązaniach 4’-5’) hydroksylem reszty aminokwasowej nukleomonomeru na prawo (tzn. obszar o jednolitej polamości), zatem pozostawiając 5’-hydroksyl reszty aminokwasowej nukleomonomeru najbardziej z prawej strony wolny dla dodatkowego koniugowania. Analogicznie, 5’-— 3’ wskazujena rozciągłość oligomeru przy przeciwnej orientacji, w której wiązania są tworzone między 3'-hydroksylem reszty aminokwasowej lewego nukleomonomeru i 5'-hydroksylem reszty aminokwasowej prawego nukleomonomeru, zatem pozostawiając 3-hydroksyl reszty aminokwasowej nukleomonomeru najbardziej z prawej strony, wolny dla dodatkowego koniugo wania. To samo ma miejsce w przypadku rozciągnięcia oligomerów 5’-— 4’.

Farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Wynalazek także dostarcza różne sole wszystkich związków ujawnionych w niniejszym zgłoszeniu, włączając farmaceutycznie dopuszczalne sole do podawania zwierzęciu lub człowiekowi. Farmaceutycznie dopuszczalne sole i substancje tworzące takie sole są dobrze znane według stanu techniki. Farmaceutycznie dopuszczalne sole są to korzystnie sole metali lub amonowe oligomerów według wynalazku i obejmują sole metali alkalicznych lub ziem alkalicznych, np. sole sodu, potasu, magnezu lub wapnia; lub korzystnie łatwo krystalizujące sole

188 252 amonowe pochodzące od amoniaku lub amin organicznych, takich jak mono-, di- lub tri- niższe (alkilo, cykloalkilo lub hydroksyalkilo)-amidy, niższe alkilenodiaminy lub niższe zasady (hydroksyalkilo lub arylalkilo)-alkiloamoniowe, np. metyloamina, dietyloamina, trietyloamina, dicykloheksylamina, trietanolamina, etylenodiamina, tris-(hydroksymetylo)-aminometan lub wodorotlenek benzylotrimetyloamoniowy. Oligomery według wynalazku mogą tworzyć sole addycyjne z kwasami, korzystnie terapeutycznie dopuszczalnych kwasów nieorganicznych lub organicznych, takich jak mocne kwasy nieorganiczne, np. hydrofilowe, np., kwas chlorowodorowy lub bromowodorowy; siarkowy, fosforowy; alifatyczne lub aromatyczne kwasy karboksylowe lub sulfonowe, np., mrówkowy, octowy, propionowy, bursztynowy, glikolowy, mlekowy, jabłkowy, winowy, glukonowy, cytrynowy, askorbinowy, maleinowy, fumarowy, hydroksymaleinowy, pirogronowy, fenyloctowy, benzoesowy, 4-aminobenzoesowy, antranilowy, 4-hydroksybenzoesowy, salicylowy, 4-aminosalicylowy, metanosulfonowy, etanosulfonowy, hydroksyetanosulfonowy, benzenosulfonowy, sulfanilowy lub cykloheksyloamidosulfonowy itp.

Użyteczność i podawanie:

Ponieważ oligomery według wynalazku są zdolne do znaczącej aktywności wiązania jednoniciowych lub dwuniciowych docelowych kwasów nukleinowych tworząc dupleksy, tripleksy lub inne formy trwałej asocjacji z naturalnie występującymi polinukleotydami i ich strukturalnymi analogami, oligomery według wynalazku można użyć w większości procedur wykorzystujących konwencjonalne oligomery. Zatem oligomery według wynalazku można użyć jako np. polinukleotydowe sondy hybrydyzacyjne, primery dla reakcji łańcuchowej polimerazy i podobnych reakcji cyklicznego wzmacniania, primerów sekwencjonowania, itp. Oligomery według wynalazku mogą także być użyte w diagnozie i terapii chorób. Zastosowania terapeutyczne oligomerów według wynalazku obejmują specyficzne inhibitowanie ekspresji genów (lub inhibitowanie translacji sekwencji RNA kodowanych przez te geny), które są związane z ustanowieniem lub utrzymaniem stanu patologicznego, przez użycie oligomerów antysensownych. Oligomery według wynalazku można użyć do pośredniczenia w antysensownym inhibitowaniu licznych celów genetycznych. Przykładowe geny lub RNA kodowane przez te geny,na które mogą być nakierowane użyte anty sensownie oligomery obejmują te, które kodują enzymy, hormony, proteiny surowicy, proteiny transmembranowe, cząsteczki adhezyjne (LFA-1, GPIIb/IIIa, E-LAM-1, VACM-1, ICAM-1, E-selekcja itp.), cząsteczki receptorowe, włączając w to receptory cytokinowe, cytokiny (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6 itp.), onkogeny, czynniki wzrostu i interleukiny. Docelowe geny lub RNA mogą być związane z jakimkolwiek stanem patologicznym, takim jak te związane z warunkami zapalnymi, zaburzeniami naczyniowo-sercowymi, reakcjami immunologicznymi, rakiem, infekcjami wirusowymi, infekcjami bakteryjnymi, infekcjami przez drożdże, infekcjami przez pasożyty itp.

Oligomery według niniejszego wynalazku są odpowiednie dla wykorzystania w zastosowaniach terapeutycznych zarówno in vivo i ex vivo. Wskazania dla stosowania ex vivo obejmują działaniena komórki, takie jak szpik kostny lub krew obwodową w warunkach, takich jak leukemia (przewlekła leukemia mielogenna, ostra leukemia limfocytowa) lub infekcja wirusowa. Docelowe geny lub RNA kodowane przez te geny, które mogą służyć jako cele dla leczenia raka obejmują onkogeny, takie jak ras, k-ras, bcl-2, c-myb, ber, c-myc, c-abl lub nadekspresjonowane sekwencje, takie jak mdm2, onkostatyna M, IL-6 (sarcoma Kaposi), HER-2 i translokacje, takie jak bcr-abl. Wirusowe sekwencje genów lub RNA kodowane przez te geny, takie jak geny polimerazy lub odwrotnej transkryptazy wirusów herpes, takie jak CMV, HSV-1, HSV-2, retrowirusy, takie jak HTLV-1, HIV-1, HIV-2 lub inne wirusy DNA lub RNA, takie jak HBV, HPV, VZV, wirus grypy, adenowirusy, flawiwirusy, rinowirus itp. Są także odpowiednimi celami. Oligomery o specyficznym wiązaniu można także stosować w połączeniu z innym działaniem terapeutycznym. Inne zastosowania terapeutyczne oligomerów według wynalazku obejmują (1) modulację reakcji zapalnych przez modulowanie ekspresji genów, takich jak receptor IL-1, IL-1, ICAM-1 lub E-Selekcja, które odgrywają rolę w pośredniczeniu zapaleniu i (2) modulację proliferacji komórkowej w warunkach, takich jak okluzja tętnicza (restenosis) po chirurgii plastycznej naczyń przez modulowanie ekspresji (a)

185 852 czynników wzrostu lub mitogenicznych, takich jak miozyna niemięśniowa, myc, fox, PCNA, PDGF lub FGF lub ich receptory, lub (b) czynników proliferacji komórkowej, takich jak c-myb. Inne odpowiednie czynniki proliferacji lub czynniki transdukcji sygnałów, takie jak TGFx, IL-6, gINF, kinaza proteinowa C, kinazy tyrozynowe (takie jak p210, pl 90), mogą być celami w leczeniu łuszczycy lub innych stanów. Ponadto, receptor EGF, TGFa lub allele MHC mogą być celami w chorobach autoimmunizacyjnych. Dostarczanie oligomerów według wynalazku do komórek można zwiększyć jakimkolwiek odpowiednim sposobem włączając w to transfekcję fosforanem wapnia, DMSO, gliceryną lub dekstranem, elektroporację lub przez użycie kationowych, anionowych i/lub obojętnych kompozycji lipidowych lub liposomów sposobami opisanymi (International Publications nr wO 90/14074, wO 91/16024, WO 91/17424, opis patentowy USA 4897355). Oligomery można wprowadzić do komórek przez kompleksowanie z lipidami kationowymi, takimi jak DOTMA (które może lub nie tworzyć liposomy), który to kompleks jest następnie kontaktowany z komórkami. Odpowiednie lipidy kationowe obejmują (lecz nie są ograniczone do) N-(2,3-di(9-(Z)-oktadecenyloksylo))-propl-ylo-N,N,N-trietyloamonium (DOTMA) i jego sole, l-0-oleilo-2-0-olello-3-dimetvloaminopropylo-P-hydroksyetyloamonium i jego sole oraz 2,2-bis<oleiloksy)-3-<trimetylamonio)propan i jego sole.

W zwiększonym dostarczaniu oligomerów według wynalazku mogą pośredniczyć (i) wirusy, takie jak wirus Sendai (Bartzatt, R., Biotechnol Appl Biochem., 1989, 11, 133-135) lub adenowirus (Wagner E i in., Proc Natl Acad Sci. USA, 1992, 89, 6099-6013),· (ii) koniugaty poliaminowe lub polikationowe przy użyciu związków, takich jak polilizyna, protamina lub Na, Ni2-bis(etylo)spermina (Wagner, E i in., Proc. Natl Acad Sci. USA, 1991, 88, 4255-4259; Zenke, M in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 3655-3659; Chank, B.K. i in., Biochem Biophys Res Commun., 1988, 157. 264-270; opis patentowy USA 5138045);

(iii) kompleksy lipopoliaminowe przy użyciu związków, takich jak lipospermina (Behr, J.-P. i in., Proc Natl Acad Sci. USA, 1989, 86, 6982-6986; Loeffler, J.P. i in., J. Neurochem., 1990, 54, 1812-1815); (iv) lipidy anionowe, obojętne lub wrażliwena pH przy użyciu związków, włączając w to fosfolipidy anionowe, takie jak fosfatydylogliceryna, kardiolipina, kwas fosfatydowy lub fosfatydyloetanoloamina (Lee, K.-D. i in., Biochem Biophys Acta, 1992, 1103. 185-197; Cheddar, G. i in., Arch Biochem Biophys, 1992, 294. 188-192; Yoshimura, T., i in., Biochem Int., 1990, 20, 697-706);

(v) koniugaty ze związkami, takimi jak transferyna lub biotyna lub · (vi) koniugaty z proteinami (w tym albuminą lub przeciwciałami), glikoproteinami lub polimerami (w tym glikolem polietylenowym), które zwiększają właściwości farmakokinetyczne w osobniku.

Jak to jest stosowane w niniejszym tekście, transfekcja odnosi się do jakiegokolwiek sposobu, który jest odpowiedni dla dostarczania oligomerów do komórek. Jakikolwiek reagent, taki jak lipid lub jakikolwiek czynnik, taki jak wirus, który może być użyty w protokołach transfekcji jest zbiorczo określany w niniejszym tekście „czynnikiem zwiększającym przenikanie”. Dostarczanie oligomerów do komórek może się odbywać przez kotransfekcję z innymi kwasami nukleinowymi, takimi jak (i) ekspresjonowalne fragmenty DNA kodujące proteinę (proteiny) lub fragment proteiny lub (ii) translowalne RNA kodujące proteinę (proteiny) lub fragment proteiny.

Oligomery według wynalazku mogą zatem być włączone w dowolną odpowiednią formulację, która zwiększa dostarczanie oligomerów do komórek. Odpowiednie formulacje farmaceutyczne obejmują również te zwykle stosowane w zastosowaniach, gdzie związki są dostarczane do komórek lub tkanek przez podawanie miejscowe. Związki, takie jak glikol polietylenowy, glikol propylenowy, azon, nonoksonyl-9, kwas oleinowy, DMSO, poliaminy lub lipopoliaminy mogą być stosowane w preparatach miejscowych, które zawieraj ą oligomery.

Oligomery według wynalazku mogą być dogodnie stosowane jako reagenty dla celów badawczych lub produkcyjnych, gdy jest pożądane inhibitowanie ekspresji genu. Obecnie jest (85 852 dostępne bardzo mało reagentów, które skutecznie i specyficznie inhibitują ekspresję genu docelowego jakimkolwiek mechanizmem. Oligomery, o których uprzednio podawano, że inhibitują ekspresję docelowego genu, często mają niespecyficzne efekty i/lub nie zmniejszają ekspresji docelowego genu do bardzo niskiego poziomu (mniejszego niż 40% poziomu nieinhibitowanego).

Zatem oligomery opisane w niniejszym tekście tworzą reagent, który może być stosowany w metodach inhibitowania ekspresji wybranej proteiny lub protein w osobniku lub w komórkach, w których proteiny są kodowane przez sekwencje DNA i proteiny ulegają translacji z sekwencji RNA, obejmując etapy: wprowadzania oligomeru według wynalazku do komórek; umożliwiania, by oligomer tworzył tripleks z DNA lub RNA lub dupleks z DNA lub RNA, przy czym ekspresja proteiny lub protein jest inhibitowana. Sposoby i związek według niniejszego wynalazku są odpowiednie do modulowania ekspresji genu zarówno w komórkach prokariotyczny ch jak i eukariotycznych, takich jak bakteryjne, grzybów, pasożytów, drożdży i ssaków.

Oligomery Rnazo H-„kompetentne” lub Rnazo H-„niekompetentne” można łatwo zaprojektować stosując zastępcze wiązania według wynalazku. Oligomery Rnazo H-kompetentne mogą obejmować jedną lub więcej Rnazo H-rkompetentnych domen składających się z połączonych Rnazo H-kompetentnych nukleomonomerów. Oligomery o modyfikacjach, takich jak podstawienia 2’ (2’-O-allil itp.) lub pewne nienaładowane wiązania (metylofosfonian, fosforoamidan itp.) są zwykle niekompetentne jako substrat rozpoznawany przez i/lub poddawany działaniu przez Rnaze H. Kompetencja Rnazy H może ułatwić funkcję antysensowną oligomeru przez degradowanie docelowego RNA w dupleksie RNA-oligomer (Dagle, J.M. i in., Nuci Acids Res., 1990, 18, 4751-4757; Walder, J.A., i in., International Publication nr WO 89/05358). Enzym rozszczepia RNA w dupleksach RNA-DNA.

Aby zachować kompetencję Rnazy H, oligomer wymaga kompetentnej domeny Rnazy H o trzech lub więcej kompetentnych sąsiednich nukleomonomerach umieszczonych w jej obrębie (Quartin R.S. i in., Nuci Acids Res., 1989, 17, 7253-7262). Projekt oligomerów odpornychna trawienie nukleazą będzie obejmował wiązanie końcowe, modyfikacje cukru i/lub zasady, by spowodować odporność na nukłeazę. Zatem można zaprojektować oligomery, które będą mieć zmodyfikowane reszty nukleomonomeru przy jednym lub obydwu końcach 5’ i/lub 3’, przy równocześnie wewnętrznej kompetentnej domenie Rnazy H. Przykładowe oligomery, które zachowują kompetencję Rnazy będą zasadniczo mieć jednolitą polarność i będą obejmować około 2 do około 12 nukleomonomerów przy końcu 5’ i przy końcu 3’, które stabilizują oligomerna degradację nukleazą i około trzy do około 26 nukleomonomerów, które działają jako Rnazo H-kompetentna domena między Rnazo H-niekompetentnymi końcami 3’ i 5’. Odmiany w takim oligomerze objęłyby (1) krótszą RNazo H-kompetentną domenę obejmującą 1 lub 2 RNazo H-kompetentne wiązania lub wiązania zastępcze, (2) dłuższą RNazo H-niekompetentną domenę obejmującą do 15, 20 lub więcej wiązań zastępczych lub nukleomonomerów, (3) dłuższą RNazo H-kompetentną domenę obejmującą do 30,40 lub więcej wiązań, (4) oligomery z tylko jedną RNazo H-niekompetentną domeną przy końcu 3’ lub końcu 5’. Oligomery zawierające tylko około 8 nukleomonomerów mogą być użyte do spowodowania inhibitowania ekspresji docelowej proteiny (protein) przez utworzenie struktur dupleksowych lub tripleksowych z sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego. Jednak oligomery liniowe stosowane do inhibitowania ekspresji docelowej proteiny przez tworzenie dupleksu lub tripleksu będą korzystnie zawierać od około 10 do około 20 reszt nukleomonomeru.

Oligomery zawierające wiązania zastępcze według wynalazku można dogodnie cyklizować jak opisano (International Publication nr WO 92/19732; Kool, E.T. J Am Chem Soc., 1991, 113, 6265-6266; Prakash, G. et al, J Am Chem Soc., 1992, 114, 3523-3527). Takie oligomery są odpowiednie dla wiązania do celów - jednoniciowych lub dwuniciowych kwasów nukleinowych. Koliste oligomery mogą mieć różne wielkości. Takie oligomery w zakresie wielkości około 22-50 nukleomonomerów mogąbyć dogodnie wytworzone. Koliste oligomery mogą mieć od około trzech do około sześciu reszt nukleomonomeru w obszarze pętli, które rozdzielają obszary wiązania oligomeru, jak opisano (Prakash, G, ibid). Oligomery mogąbyć

185 852 cyklizowane enzymatycznie poprzez końcowy fosforan przez ligazę lub sposobem chemicznym przez wiązanie przez 5’-i 3’-końcowe cukry i/lub zasady.

Oligomery można użyć do modulowania ekspresji genu docelowego przez inhibitowanie oddziaływania protein wiążących kwas nukleinowy odpowiedzialnych za modulowanie transkrypcji (Maher, L.J., i in., Science, 1989, 245, 725-730) lub translacji. Oligomery są zatem odpowiednie jako czynniki specyficzne dla sekwencji, które współzawodniczą z proteinami wiążącymi kwas nukleinowy (w tym rybosomy, polimerazy rNA, polimerazy DNA, czynniki inicjacji translacji, czynniki transkrypcji, które zwiększają lub zmniejszają transkrypcję, czynniki transkrypcji proteina - hormon itp.). Odpowiednio zaprojektowane oligomery mogą zatem być użyte, dla zwiększenia syntezy docelowej proteiny przez mechanizmy, takie jak wiązanie do lub w pobliżu miejsca regulacyjnego, które czynniki transkrypcji wykorzystują do tłumienia ekspresji lub inhibitowania ekspresji wybranego represora samej proteiny.

Oligomery według wynalazku, obejmujące dodatkowe modyfikacje, które zwiększają powinowactwo wiązania można tak zaprojektować, by zawierały struktury drugorzędowe i trzeciorzędowe, takie jak pseudowęzły lub pseudopółwęzły (Ecker D.J. i in., Science, 1992, 257, 958-961). Takie struktury mogą mieć bardziej trwałą strukturę drugorzędową lub trzeciorzędową niz odpowiednie niezmodyfikowane oligomery. Zwiększona trwałość takich struktur polegałabyna zwiększonym powinowactwie wiązania między obszarami samokomplementarnymi w pojedynczym oligomerze lub obszarach komplementarnych między dwoma lub więcej oligomerami, które tworzą daną strukturę. Takie struktury można stosować do naśladowania struktur, takich jak struktura HlV TAR, aby zakłócać przez wiązanie z proteiną HlV Tat (proteiną która wiąże się z TAR). Podobne podejście można wykorzystać w przypadku innych czynników transkrypcji lub translacji, które rozpoznają wyzsze struktury kwasu nukleinowego, takie jak „pnie”, pętle, szpilki, węzły itp. Alternatywnie, oligomery według wynalazku można użyć do (1) rozerwania lub (2) wiązania do takich struktur jako sposobna (1) oddziaływanie z lub (2) zwiększanie wiązania protein do struktur kwasu nukleinowego.

Oprócz ich stosowania w terapiach antysensownych lub potrójnej helisy, oligomery według wynalazku można również użyć jako środki terapeutyczne lub diagnostyczne, które działają przez bezpośrednie przemieszczenie jednej nici w dupleksowym kwasie nukleinowym. Przemieszczenie nici w naturalnym dupleksie, takim jak chromosomowy DNA lub dupleksowy wirusowy DNA, RNA lub hybrydowy DNA/RNA jest możliwe dla oligomerów o wysokim powinowactwie wiązania ponieważ ich sekwencja komplementarna nie jest dostatecznie duża, by skutecznie przemieścić nić DNA lub RNA w dupleksie. Terapeutyczna skuteczność oligomerów, która działa przez zapętlenie D wynikłaby z wysokiego powinowactwa wiązania do komplementarnej sekwencji, co daje w wyniku modulację normalnej funkcji biologicznej związanej z celem - kwasem nukleinowym. Typy docelowego kwasu nukleinowego obejmują (lecz nie są ograniczone do):

(i) sekwencje genów obejmujące egzony, introny, złącza egzon/intron, obszary pro motor/enhanser oraz nietranslowane obszary 5’ i 3’, (ii) obszary kwasów nukleinowych wykorzystujące strukturę drugorzędową dla funkcjonowania (np. element pień-pętla HlV TAR lub tRNAs), (iii) kwasy nukleinowe, które służą funkcjom strukturalnym lub innym, takie jak telomery, centromery lub źródła replikacji (wirus, bakterie itp.) oraz (iv) dowolny inny obszar dupleks.

Jest oczywiste, że oligomery mogą być zsyntetyzowane z nieciągłymi domenami funkcyjnymi, w których jeden obszar oligomeru wiąże się z celem przez tworzenie pętki D, podczas gdy sąsiedni obszar wiąże cząsteczkę celu przez np. tworzenie potrójnej helisy lub jako aptamer do proteiny. Alternatywnie, oligomer tworzący pętlę D może się wiązać do każdej nici w dupleksie przez przełączanie sięna nić, do której wiąże się oligomer (tzn. przez to, że jeden obszar oligomeru wiąże się z jedną nicią a inny obszar wiąże się z nicią komplementarną). Elementami kontrolnymi, które określam. sposób wiązania (tzn. potrójna helisa lub pętla DO) są sekwencja oligomeru i dziedziczne powinowactwo wbudowane w oligomer. Zasady rozpoznawania zasad w wiązaniu dupleksu Wat^.smn^^(^a-icka różnią się od tych w kontrolowanym wiązaniu kompleksu Hoogsteena. Wskutek tego, sekwencja zasad oligomeru

185 852 może być użyta do określenia reguł typu wiązania, które wykorzysta oligomer. Struktury pętli D są tworzone w naturze przez procesy za pośrednictwem enzymów (Harris, L.D. i in., I in., J Biol Chem., 1987, 262, 9285-9292) są związane z obszarami, gdzie występuje replikacja DNA (Jacobs H.T. i in., Nuci Acids Res, 1989, 17, 8949-8966). Pętle D, które powstają z wiązania oligomerów mogą wynikać z procesu jedno- lub dwuetapowego. Bezpośrednie przemieszczenie nici celu spowoduje powstanie pętli D przez pojedyncze zdarzenie wiązania. Jednak tworzenie pętli D może także występować przez tworzenie potrójnej helisy, co ułatwia przemieszczenie nici prowadząc do pętli D.

Można zaprojektować wiązania zastępcze według wynalazku zawierające rybozymy, aby uzyskać indywidua o zmienionej charakterystyce. Rybozymy rozszczepiające jednoniciowy RNA lub DNA (Robertson D.L., i in., Nature, 1990, 344. 467-468) opisano. Sugerowano zastosowania terapeutyczne rybozymów (Sarver N i in., Science, 1990, 247, 1222-1225; International Publication nr WO 91/04319). Na drugorzędową lub trzeciorzędową strukturę niezbędną dla działania rybozymu można wpłynąć przez zaprojektowanie odpowiedniej sekwencji oligomeru. Np. rybozymy o domenach docelowych trwałychna nukleazę zawierających wiązania zastępcze według wynalazku mogą mieć wyższe powinowactwo do sekwencji docelowych przy równoczesnym zachowaniu specyficzności par zasad. Wskutek większego powinowactwa i/lub trwałości wiązań zastępczych według wynalazku na działanie nukleazy można projektować krótsze domeny rozpoznawania w rybozymie (korzyść w wytwarzaniu), co może prowadzić do bardziej korzystnego obrotu substratami (korzyść dotycząca funkcji rybozymu).

W zastosowaniach terapeutycznych, oligomery według wynalazku można użyć w sposób odpowiedni do leczenia szeregu stanów przez inhibitowanie ekspresji odpowiednich genów docelowych. W przypadku takiej terapii, oligomery można formułować^ szereg sposobów podawania, włączając w to podawanie układowe, miejscowe lub zlokalizowane. Techniki i formulacje opisano zasadniczo w Remmgton’s Pharmaceutical Sciences, Merck Publishing Co., Easton, PA, najnowsze wydanie. Oligomer - składnik aktywny jest zasadniczo łączony z nośnikiem, takim jak rozcieńczalnik lub zaróbka, która może obejmować wypełniacze, napełniacze, lepiszcza, środki zwilżające, substancje rozpadowe, środki powierzchniowo czynne lub substancje smarujące, zależnie od charakteru sposobu podawania i form dawkowania. Typowe formy dawkowania obejmują tabletki, proszki, preparaty ciekłe włączając w to zawiesiny, emulsje i roztwory, granulki, kapsułki i czopki, jak również preparaty ciekłe dla iniekcji, włączając w to preparaty liposomowe. W przypadku podawania układowego, korzystna jest iniekcja, włączając w to domięśniową, dożylną, dootrzewnową i podskórną.

W przypadku iniekcji, oligomery według wynalazku są formułowane w roztworach ciekłych, korzystnie w fizjologicznie kompatybilnych buforach, takich jak roztwór Hanka lub roztwór Ringera. Ponadto oligomery mogą być formułowane w postaci stałej i powtórnie rozpuszczane lub przeprowadzane w stan zawiesiny bezpośrednio przed użyciem. Formy liofilizowane są także ujęte. Dawki, które można stosować w podawaniu układowym korzystnie zawierają się w zakresie od około 0,01 mg/Kg do 50 mg/Kg przy podawaniu raz lub dwa razy dziennie. Można jednak stosować różne harmonogramy dawkowania w zależności od (i) mocy poszczególnego oligomeru w inhibitowaniu aktywności jego docelowego DNA lub RNA, (ii) ostrości łub stopnia stanu patologicznego choroby związanego z danym genem docelowym lub (iii) zachowania farmakokinetycznego danego oligomeru.

Podawanie systemowe może także następować przez błonę śluzową lub transdermalnie, lub związki można podawać doustnie. W przypadku podawania przez błonę śluzową lub transdermalnego, w formulacji stosuję się penetraty odpowiednie dla bariery, przez którą należy przeniknąć. Takie penetraty są zasadniczo znane według stanu techniki i obejmują np. sole żółciowe i pochodne kwasu fuzydowego w przypadku podawania przez błonę śluzową. Ponadto, w celu ułatwienia przenikania można stosować detergenty. Podawanie przez błonę śluzową może się odbywać przez stosowanie np. sprejów donosowych lub czopków. W przypadku podawania doustnego, oligomery są formułowane w postaci konwencjonalnych doustnych form podawania, takich jak kapsułki, tabletki i toniki.

185 852

W przypadku podawania miejscowego, oligomery według wynalazku są formułowane w postaci maści, żeli lub kremów, jak to jest zasadniczo znane według stanu techniki. Formulacja oligomerów według wynalazku dla wskazań ocznych, takich jak infekcje wirusowe byłaby opartana standardowych kompozycjach znanych według stanu techniki.

Oprócz stosowania w terapii, oligomery według wynalazku można stosować jako reagenty diagnostyczne do wykrywania obecności lub nieobecności docelowych sekwencji kwasu nukleinowego, do których one się specyficznie wiążą. Zwiększone powinowactwo wiązania oligomerów według wynalazku stanowi korzystną cechę w ich zastosowaniu jako primerów i sond. Testy diagnostyczne można prowadzić przez hybrydyzację przez tworzenie podwójnej lub potrójnej helisy, która jest następnie wykrywana za pomocą konwencjonalnych sposobów. Np. oligomery można znakować stosując znaczniki radioaktywne, fluorescencyjne lub chromogeniczne i wykrywać obecność znacznika związanego ze stałym podłożem. Alternatywnie, obecność podwójnej lub potrójnej helisy można wykryć przez przeciwciała, które specyficznie rozpoznają te formy. Środki dla prowadzenia prób przy użyciu takich oligomerów jako sond są zasadniczo znane.

Użycie oligomerów z wiązaniami zastępczymi według wynalazku - jako czynników diagnostycznych przez tworzenie potrójnej helisy jest korzystne ponieważ potrójne helisy tworzą się w łagodnych warunkach i próby można zatem przeprowadzać bez poddawania badanych próbek zbyt surowym warunkom. Próby diagnostyczne opartena wykryciu RNA dla identyfikacji sekwencji w bakteriach, grzybach lub pierwotniakach często wymagały wyodrębnienia RNA z próbek lub organizmów, które wyrosły w laboratorium, co jest praco- i czasochłonne, ponieważ RNA jest bardzo czułena obecne nukleazy.

Sondy oligomeryczne mogą także włączać dodatkowe modyfikacje, takie jak zmodyfikowane cukry i/lub wiązania zastępcze, które czynią oligomery szczególnie trwałymi wobec nukleaz, i to byłoby zatem przydatne w próbach prowadzonych w obecności ekstraktów z komórek lub tkanek, które normalnie cechuje aktywność nukleazy. Oligomery zawierające terminalne modyfikacje często zachowują ich zdolność do wiązania do sekwencji komplementarnych bez utraty specyficzności (Uhlmann i in., Chemical Reviews, 199C, 9C, 543-584). Jak podano powyżej, sondy według wynalazku mogą również zawierać linkery, które umożliwiają specyficzne wiązanie do przemiennych nici DNA przez włączenie linkera, który umożliwia takie wiązanie (Froehler B.C. i in., Biochemistry, 1992, 31, 1603-16C9); Home i in., J Am Chem Soc., 199C, 112, 2435-2437).

Włączenie analogów zasad według niniejszego wynalazku do sond, które również zawierają kowalencyjne czynniki sieciujące jest w stanie zwiększyć czułość i zmniejszyć tło w próbach diagnostycznych lub detekcji. Ponadto, użycie czynników sieciujących umożliwi nowe modyfikacje prób, takie jak (1) użycie sieciowania dla zwiększenia wrażliwości sondy, (2) włączenie etapu przemywania denaturowanego, by zmniejszyć tło oraz (3) przeprowadzenie hybrydyzacji i usieciowania przy lub w pobliżu temperatury topnienia hybrydy, by zmniejszyć strukturę drugorzędową w celu i zwiększyć specyficzność sondy. Modyfikacje warunków hybrydyzacji opisano uprzednio (Gamper i in., Nucleic Acids Res., 14, 9943).

Oligomery według wynalazku są odpowiednie dla stosowania w próbach diagnostycznych, które wykorzystują metody, w których wykrywany oligomer lub kwas nukleinowy są kowalencyjnie związane z podłożem stałym, jak opisano (Opis patentowy USA nr 4775619). Oligomery są również odpowiednie dla stosowania w próbach diagnostycznych polegającychna technikach reakcji łańcuchowej polimerazy, by wzmocnić docelowe sekwencje według opisanych metod (Euoopean Patent Publication Nr C393 744). Oligomery według wynalazku zawierające koniec 3’, który może służyć jako primer, są zgodne z polimerazami stosowanymi w metodach reakcji łańcuchowej polimerazy, takimi jak polimeraza Taq lub Vent™ (New England Biolabs). Oligomery według wynalazku mogą zatem być wykorzystane jako primery w protokołach PCR.

Oligomery według wynalazku są przydatne jako primery, które są nieciągłymi sekwencjami lub jako primery o sekwencji losowej. Primery o sekwencji losowej mogą zasadniczo mieć długość około 6, 7 lub 8 nukleomonomerów. Takie primery mogą być użyte w różnych protokołach wzmacniania kwasu nukleinowego (PCR, reakcja łańcuchowa ligazy itp.) lub w

185 852 protokołach klonowania. Wiązania zastępcze według wynalazku zasadniczo nie kolidują ze zdolnością oligomeru do funkcjonowania jako primer. Oligomery według wynalazku o modyfikacjach T w miejscach innych niż reszta 3’-końcowa, innych modyfikacjach, które czynią oligomer RNazo H-niekompetentny lub w inny sposób trwałym względem nukleazy, mogą być korzystnie stosowane jako sondy lub primery dla sekwencji RNA lub DNA w ekstraktach komórkowych lub innych roztworach zawierających nukleazy. Zatem oligomery można stosować w protokołach dla wzmacniania kwasu nukleinowego w próbce przez mieszanie oligomeru z próbką zawierającą docelowy kwas nukleinowy, a następnie hybrydyzację oligomeru z docelowym kwasem nukleinowym i wzmocnienie docelowego kwasu nukleinowego przez PCR, LCR lub inne odpowiednie metody.

Oligomery derywatyzowane do czynników chelatujących, takich jak EDTA, DTPA lub analogi kwasu 1,2-diamino-cykloheksanooctowego można wykorzystać w różnych próbach diagnostycznych in vitro jak to zostało opisane (Opisy patentowe USA nr 4772548, 4707440 i 4707352). Alternatywnie, oligomery według wynalazku można derywatyzować przy użyciu czynników sieciujących takich jak 5-(3-jodoacetamidopropylo)2’-deoksyurydyna lub 5-(3-(4bromobutyramido)propy-l-yl)-2 ’-deoksyurydyna i użyte w różnych metodach dla prób lub w zestawach jak opisano (International Publication nr WO 90/14353).

Oprócz wspomnianych uprzednio zastosowań, zdolność oligomerów do inhibitowania ekspresji genu można zweryfikować w układach in vitro przez pomiar poziomów ekspresji w komórkach osobnika lub w układach rekombinacyjnych, odpowiednią metodą (Graessmann, M i in. Nucleic Acids Res., 1991, 19, 53-59). Po opisaniu powyżej wynalazku, podaje się ponizsze przykłady w celu lepszego objaśnienia wynalazku. Przykłady są podane dla zilustrowania wynalazku i nie powinny być rozumiane jako ograniczające wynalazek.

Przy kłady

Przegląd syntezy syntonu nukleomonomeru i oligomerów

Oligomery według wynalazku można zsyntetyzować stosując reakcje znane według stanu techniki z dziedziny syntezy pochodnych oligonukleotydowych. Patrz np. Flandor, J. i Yam, S.Y., Tetrahedron Letts., 1990, 31, 597-600; Mattson, R.J., i in., J Org Che., 1990, 55, 2552-2554; Chung, C.K. i in., J Org Chem., 1989, 54, 2767-2769.

As można zauważyćna podstawie szeregu wiązań zastępczych podanych w tablicy 1, wiązania zastępcze według wynalazku mogą się zmieniać, tak by zawierały jeden lub więcej atom azotu, siarki i/lub tlenu w ich strukturze. Pozycje tych atomów w wiązaniu zastępczym mogą się zmieniać od końca „5’ ” do „środka” do końca „2’ ” lub „3’ ” oraz „4’ ”. W tym rozdziale, podano szereg figur reprezentatywnych reakcji syntezy, które podają drogi do różnych miejsc i kombinacji atomów azotu i tlenu w obrębie wiązań zastępczych.

Syntezy przedstawione na figurze 1 do 25 są modyfikowane, jak to jest znane specjalistom z dziedziny chemii oligonukleotydów. Np. chociaż zabezpieczenie zasad nie zawsze jest wskazanena figurach podających syntezę, może to być pożądane i wykonane stosując reagenty i techniki znane według stanu techniki. Patrz np. Protective Groups in Organie Synthesis (Theodora W. Greene, John Wiley i Sons, 1981). Podobnie, chociaż użycie grup zabezpieczających jest podane w pewnych przypadkach, nie zawsze jest niezbędne blokowanie reagentów aby zsyntetyzować wyszczególnione oligomery według wynalazku.

Przy kładł

Pierwsze pięć etapów podanych na figurze 1 dotyczy wytwarzania aminokwasoalkoholu serynolu zabezpieczonego isobutrylem.

Szósty i następne etapyna figurze 1 są ukierunkowanena syntezę bloku konstrukcyjnego: serynol substituted thymine foforamidytem tyminy podstawionym serynolem.

W etapie 1 fig. 1, grupa aminowa seryny (aminokwas) jest zabezpieczona przez reakcję lz di-tert-butylowodorowęglanem dając związek 2. Można użyć inne równoważniki grup zabezpieczających. W następnym etapie, grupa hydroksylowa związku 2 jest blokowana dihydropiranem, by uzyskać w pełni zabezpieczony, aminokwas 3. Aminokwas 3 jest następnie poddany reakcji z kompleksem diboran-dimetylo-siarczek, co daje w wyniku alkohol 4, który po wystawieniu na działanie chlorku azobutrylu dał 5. Ta reakcja redukcji może być także przeprowadzona przy użyciu chloromrówczanu izobutylu i borowodorku sodu (patrz: K. Ra185 852 masamy, R. K. Olsen i T. Emery, Synthesis, 1982, 42). Reakcja 5 z kwasem trifluorooetowym przez 30 minut, a następnie przemywanie NaHCO3 dały 6.

Kwas tyminoctowy 7 wytworzono jak opisano w literaturze (patrz: L. Kosynkiną W. Wang i T. C. Liang, Tetrahedron Letts, 1994, 35, 5173). Sprzęganie 7 z 6 w warunkach mieszanego bezwodnika dało 9. Dimetoksytrytylowanie 9 przy użyciu DMTC1 dało związek 9, który w wyniku hydrolizy zasadą dał 10. Fosfyzytylowanie 10 w standardowych warunkach dało blok konstrukcyjny 11 (tymina sprzężona z serynolem). Ten synton można następnie dodać do rosnącego oligomeru stosując konwencjonalne reakcje chemiczne. Dowolne reakcje chemiczne syntezy DNA, takie jak reakcje chemiczne fosforoamidanu lub fosfonianu można użyć do łączenia monomerów lub dimerów w sposób analogiczny do podanego wyżej.

Przykład 2

W reakcji z fig. 2. tyminoacetaldehyd 13 wytworzono przez działaniena tyminę dimetylactalem bromoacetaldehydu, a następnie przez hydrolizę 12 wodnym roztworem TFA. Aldehyd 13 i aminę 6 następnie sprzężono i odpowiedni półprodukt przekształcono w blok konstrukcyjny 17 (fosforoamidyt) w sposób analogiczny do etapów użytych na figurze 1.

Przykład 3

W reakcji z fig. 3. substancją wyjściową jest β-podstawiony aminokwas 18. Podstawiony aminokwas można przekształcić w blok konstrukcyjny 27 (fosforoamidyt) przez wykonanie etapów użytych na figurze 1 i 2.

Przykład 4

Na figurze 4. wyjściowy aminoalkohol 21 poddaje się utlenianiu mieszaniną CrOs/ pirydyna otrzymując aldehyd 28. Aldehyd w reakcji z alkilohalogenkiem w obecności zasady powinien dać związek 29; aminoalkohol 29 mógłby być następnie przekształcony w blok konstrukcyjny 35 w sposób analogiczny do etapów podanych na figurze 1 i 2.

Przykład 5

Wracając do fig. 5. pierwsze cztery etapy są zasadniczo takie same etapy jak podano na figurze 1, w tym przypadku kwas asparaginowy jest użyty zamiast seryny. Ester metylowy kwasu asparaginowego 36 dał w pełni zabezpieczony alkohol 40, który po selektywnym odbezpieczeniu kwasem octowym dał 41. Utlenienie 41 mieszaniną CrC^/pirydyna dało odpowiedni aldehyd 42. Redukujące aminowanie aldehydu 42 obenzylohydroksyloaminą w obecności triacetoksyborowodorku sodu powinno dać 43 (patrz: T. Kolasa i M. J. Miller, J. Org. Chem., 1990, 55, 1711). Alkohol 39 jest następnie przekształcany do aldehydu 46, zasadniczo stosując te same warunki reakcji jak podane wyżej, lecz z allilową grupą zabezpieczającą grupę hydroksylową 39. Sprzęganie aldehydu 46 i hydroksyloaminy 43 w obecności triacetoksyborowodorku sodu, a następnie odbezpieczenie grupy zabezpieczającej amino powinno dać bisaminą 48. Bisamina 48 mogłaby być następnie przekształcona w dimer 53 przez wykonanie etapów podanych na figurze 1.

Przykład 6

Na figurze 6. sprzęganie alkoholu 54 z O-benzylohydroksylaminą 55 w warunkach reakcji Mitsunobu (patrz: O. Mitsunobu, Synthesis 1981, 1) dało związek 56. Półprodukt 56 po uwodornieniu, a następnie acetylowaniu powinno dać 57. Wystawienie 57 na działanie TFA odblokowuje grupę zabezpieczającą „TBDMSi” i daje 58. Sprzęganie 58 z 7, a następnie dimetoksytrytylowanie mogłoby dać 60. Końcowy blok konstrukcyjny 62 można by uzyskać z 60 przez hydrolizę zasadową a następnie fosfitylowanie.

Przykład 7

Na figurze 7. serynol 4 jest przekształcany do halogenku 59 i alkilowany tyminą dając 63. Grupy zabezpieczające w 63 są usuwane, sprzęgane z kwasem hydroksyoctowym zabezpieczonym DMT i fosfitylowane dając 66.

Przykład 8

Na figurze 8. alkohol 64 jest sprzężony z kwasem N-hydroksylaminopropionowym 69 dając 70. Alkilowanie tyminy halogenkiem 73 daje 74, które po odbezpieczeniu, sprzęganiu z 76, a następnie hydrolizie mogłoby dać 79. Kondensacja 78 z 70, a następnie fosfitylowanie powinno dać dimer hydroksamatu 80.

185 852

Przykład 9

Na figurze 9. aldehyd N-hydroksylaminopropionowy 81 jest użyty do sprzęgania alkoholu 64. Dimer 88 jest wytworzony z 83 i 86 wykonując etapy podane na fig 8.

Przykład 10

Na figurze 10. alkilowanie (patrz: T. Kolasa i M. J. Miller, J. Org. Chem., 1990, 55, 4246) estru metylowego kwasu a-bromo-P-aminopropionowego 89 tyminę wytworzyłoby 90. Półprodukt 90 w wyniku hydrolizy wodorotlenku sodu daje kwas 91, który jest sprzęgany z 6 dając 92. Związek 92 jest następnie przekształcany w blok konstrukcyjny 95 (fosforoamidyt) stosując etapy podane na figurze 1.

Przykład 11

Na figurze 11. tymina jest alkilowana halogenkiem alkilaminy 96 (patrz: R. K. Olsen,

K. Ramasamy i T. Emery, J. Org. Chem., 1984, 37, 3527 i Islam i in., J. Med. Chem., 1994, 37, 293-304 co do wytwarzania halogenku aminoalkilu) dając 97. Wystawienie związku 97 na działanie TFA, a następnie alkilowanie dałoby 100. Blok konstrukcyjny 103 otrzymuję się z 1CC przez dimetoksytrytylowanie, hydrolizę, a następnie fosfitylowanie.

Przykład 12

Figura 12 jest alternatywną drogą do dimeru łańcucha głównego hydroksamatu 111 z Nhydroksyloaminy 43 i aldehydu 107, który z kolei wytworzono z kwasu asparaginowego.

Przy kład 13

Na figurze 13. dimer 115 wytworzono z półproduktu 106 i 13 wykonując te same etapy reakcji jak podano na figurze 2.

Przykład 14

Na figurze 14. N-hydroksylotymina wytworzono (patrz: Kim, C. U. i in., Tetrahedron Letts., 1992, 33, 25-28) i sprzężono z N-hydroksyftalimidem uzyskując 117, który poddany działaniu hydrazyny w etanolu powinien dać 118. Działanie na 118 epoksydem gliceryny 119 zabezpieczonym DMT dało 120. Półprodukt 120 następnie przekształcono do fosforoamidytu 121 stosując standardową procedurę. W drugiej syntezie, związek 118 sprzężono z aminokwasoaldehydem 122 w warunkach redukującego aminowania otrzymując 123. Zabezpieczenie drugorzędowej grupy aminowej przy użyciu FMOCC1, a następnie hydroliza powinny dać 125.

Przykład 15

Na figurze 15. kwas 1,2-dihydroksypropionowy 126 sprzężono z N-hydroksyloaminotyminą 116 dając 127, które następnie przekształcono w syntonfoforamidytowy 129 w warunkach standardowych. Związek 119 także sprzężono z kwasem adypinowym i przekształcono w blok konstrukcyjny 133 (kwas nukleinowy).

Przykład 16

Na figurze 16. pierwszy blok konstrukcyjny 136 zsyntetyzowano z 118 i 134 w podobny sposób jak podano na figurze 1. Sprzęganie 139 z 119 dało 140. Działanie na 137 przy użyciu 119 powinno dać 138, które po kondensacji z 140 daje dimer 141.

Przykład 17

Na figurze 17. aldehyd 142 i ester benzylowy glicyny sprzężono otrzymując 143. Działanie na 143 przy użyciu 7 powinno dać 145, które poddane działaniu kwasu octowego daje 148. Alkilowanie Mitsunobu 148 za pomocą Boc-NH-O-acetylohydroksyloaminy powinno dać 147, które po uwodornieniu mogłoby dać blok konstrukcyjny 150. Podobnie, sprzęganie 143 za pomocą 13 i wykonanie takich samych reakcji jak wyżej powinno dać synton 149.

Przy kład 18

Na figurze 18. redukujące aminowanie aldehydu 142 i Boc-NH-O-benzylohydrolamina dały 151. Uwodornienie 151, a następnie alilowanie 152 za pomocą kwasu glikolowego 153 (B.C. Borer i O.C. Balogh, Tetrahedron Letts., 1991, 32, 1039) powinny dać 154. Działanie na 154 za pomocą TFA usunie grupę zabezpieczającą Boc, co po sprzęganiu dałoby 155. Grupa zabezpieczająca hydroksyl w 155 może być selektywnie usunięta za pomocą kwasu octowego, co da 156. Związek 156 będzie następnie przekształcony w blok konstrukcyjny 157 przy użyciu standardowych warunków reakcji. Podobnie blok konstrukcyjny 158 będzie wytworzony przez sprzęganie 154 z 13 i kolejne etapy użyte do wytwarzania 157.

185 852

Przykład 19

Na figurze 19. alkikowanie tymino-N-hydroksyloaminy 160 alkoholem 162 da 163.

Związek 163 można przekształcić w blok konstrukcyjny 166 (fosforoamidyt) przez wykonanie etapów podanych na figurze 1.

Przykład 20

Na figurze 20. najpierw półprodukt 169 zsyntetyzowano z kwasu glutaminowego stosując standardowe warunki reakcji. Alkilowanie tyminy przy użyciu 169 dałoby 170, które po działaniu TFA wytworzyłoby 171. Półprodukt 171 mógłby być sprzęzony z Boc-glicyną, co dałoby 173, które po hydrolizie dałoby monomeryczny synton 174. Podobnie, 172 mógłby być wytworzony przez sprzęganie 119 i aldehydu Boc-aminooctowego, a następnie przez hydrolizę estru benzylowego.

Przykład 21

Na figurze 21. półprodukt 177 wytworzono z Boc-NH-O-benzylohydroksyloaminy i 175 stosując standardowe warunki reakcji. Uwodornienie 177, a następnie sprzęganie z Nhydroksytyminą 116 wytworzyłyby 178. Usunięcie grupy zabezpieczającej TUP, a następnie dimetoksytrytylowanie i fosfitylowanie powinny dać blok konstrukcyjny - synton 191. Podobnie 182 mógłby być wytworzony przez wykonanie wszystkich powyższych reakcji i użycie aldehydu THP-hydroksyoctowego zamiast kwasu THP-hydroksyoctowego.

Przykład 22

Na figurze 22. blok konstrukcyjny 191 mógłby być wytworzony stosując znaną substancję wyjściową 183 w warunkach reakcji podanych u dołu fig. 22.

Przykład 23

Na figurze 23. syntezę bloku konstrukcyjnego 199 można by wykonać stosując substancję wyjściową 183 w warunkach reakcji podanych u dołu fig. 23.

P z y k ł a d 24

Na figurze 24. substancja wyjściowa 200 jest przekształcana w blok konstrukcyjny 207 w warunkach reakcji podanych u dołu fig. 24.

Przykład 25

Związki użyte i wytworzone w tym przykładzie podano na figurze 1.

Seryna (1)

Tyminę (37,8 g, 300 mmol) rozpuszczono w roztworze wodorotlenku potasu (64,5 g,

1150 mmol) w 200 ml wody. Podczas ogrzewania roztworu w łaźni wodnej 40°C, roztwór kwasu bromooctowego (62,5 g, 450 mmol) w 100 ml wody dodawano przez 1 h. Mieszaninę reakcyjną mieszano jeszcze przez 1 h w tej temperaturze i pozostawiono do ochłodzenia do temperatury pokojowej i pH doprowadzono do 5,5 przy użyciu stężenia HC1. Roztwór następnie ochłodzono w chłodziarce przez 2 h. Jakikolwiek utworzony osad (nieprzereagowana tymina) usunięto przez filtrację. Roztwór następnie doprowadzono do pH 2 stosując stężenie HC1 i wstawiono do zamrażalnika 2 h. Biały osad, zebrano przez sączenie i osuszono w piecu próżniowym w 40°C przez 6 h. Wydajność wyniosła 44g (88 %).

HO-CH2-CH(NH2)-COOH

Ester metylowy N-Boc-L-seryny (2)

Ester metylowy L-seryny (15,6 g, 100 mmol) przeprowadzono w stan zawiesiny w mieszaninie THF/DMF (po 100 ml) w temperaturze pokojowej. Do tej poddawanej mieszaniu mieszaniny dodano trietyloaminę (11,13 g, 110 mmol), a następnie diwęglan di-tert-butylu (24,0 g, 110 mmol) i mieszanie kontynuowano w temperaturze pokojowej przez 30 min. Dodano wodę (20 ml) i roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 8 h. Roztwór odparowano do sucha. Pozostałość przeprowadzono w stan zawiesiny w octanie etylu (250 ml) i poddano działaniu z wodorosiarczanu potasu (0,25 N roztwór, 100 ml). Produkt wyekstrahowano bezpośrednio z roztworu octanu etylu. Ekstrakt organiczny przemyto wodą (100 ml), solanką. (100 ml) i osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu. Odparowanie rozpuszczalnika organicznego dało oleistą pozostałość 26 g (90%).

185 852

Ester metylowy N-Boc-L-seryny (OTHP) (3)

Związek (15 g, 68,49 mmol) rozpuszczono w suchym CH2CI2 (100 ml) i poddano w temperaturze pokojowej działaniu 3,4-dihydro-2H-piranu (8,4 g, 100 mmol) i katalitycznej ilości kwasu p-toluerbsulfonbwegb (100 mg). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 h i odparowano do sucha. Pozostałość rozpuszczono w octanie etylu (200 ml), przemyto 5% roztworem NaHCOa (100 ml), wodą (50 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt organiczny osuszono nad bezwodnym Na2SC>4 i odparowano do sucha. Pozostałość była wystarczająco czysta dla następnego etapu i w tej postaci ją użyto. Wydajność 15 g (72%).

N-Boc-L-seryrol(oTHP) (4)

Ester metylowy seryny(OTHP) (10 g, 33 mmol) rozpuszczono w suchym THF (100 ml) i ochłodzono do 0°C w łaźni lodowej w atmosferze argonu. Do tego zimnego, poddawanego mieszaniu roztworu dodano kompleks boran-metylosiarczek (2 M roztwór w THF, 100 ml 200 mmol) podczas 1 h w temperaturze 0°C. Po dodaniu boranu, mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej i ogrzewano w 40°C przez 6 h. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C, zobojętniono water i kwasem octowym do pH 6-7 i wyekstrahowano eterem (3x100 ml). Ekstrakt eterowy przemyto wodą (2x100 ml) i solanką (100 ml), osuszono nad bezwodnym Na2SC>4 i odparowano do sucha otrzymując surowy produkt jako olej. Olej po oczyszczaniu przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując heksan -> aceton (eluent) dał 8 g (88 %) czystego produktu.

N-Bbc-L-seryna(OTRP) Olb (5)

Do poddawanego mieszaniu roztworu związku 4 (8 g, 29,09 mmol) w suchym CH2CI2 (100 ml) w 0°C dodano TEA (3,54 g, 35 mmol), a następnie chlorek izobutyrylu (3,71 g, 35 mmol) w ciągu 30 min. Następnie, mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 h i odparowano do sucha. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc (200 ml), przemyto 5% roztworem NaHC03 (50 ml), wodą (50 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt organiczny osuszono nad bezwodnym NYSOU i odparowano do sucha otrzymując surowy produkt jako olej. Olej po oczyszczaniu przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując heksan -> aceton (eluent) dał 7,9g (79%) czystego produktu.

L-serynol(OIb) (6)

Związek 5 (10 g, 28,98 mmol) rozpuszczono w CH2CI2 (100 ml), mieszano w temperaturze pokojowej z TFA (50 ml) przez 1 h i odparowano do sucha. Pozostałość rozpuszczono w metanolu (50 ml) i odparowano ponownie. Pozostałość rozpuszczono w CH2CI2 (200 ml), przemyto nasyconym roztworem NaHCCj (2x100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt organiczny osuszono nad bezwodnym Na2S04 i odparowano do sucha otrzymując 4,5g (96%) produktu jako olej.

N-(Tymmyloacetylo)-L-serynol(OIb) (8)

Kwas tyminooctowy 7 (7,3 g, 40 mmol) i N-metylomorfolinę (4,4 ml, 40 mmol) rozpuszczono w 100 ml DMF. Roztwór pozostawiono do ochłodzenia do -20°C w atmosferze argonu. Do zimnego poddawanego mieszaniu roztworu dodano w jednej porcji chloromrówczan izobutylu (5,2 ml, 40 mmol). Po 15 minutach, dodano roztwór 6 (6,44 g, 40 mmol) w 30 ml DME (chłodzonego do tej samej temperatury). Mieszaninę reakcyjną mieszano w -20°C przez 30 minut, ogrzano do temperatury pokojowej i mieszanie kontynuowano przez 1 h. Mieszaninę reakcyjną odparowano do sucha i pozostałość rozpuszczono w CH2CI2 (200 ml). Roztwór organiczny przemyto 5% roztworem NaHCOj (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt organiczny osuszono nad bezwodnym Na2S04 i odparowano do sucha otrzymując surowy produkt jako piankę. Surowy produkt oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2Cl2-> aceton (eluent) otrzymując 12g (92%) czystego produktu.

4,4 ’(Dimetoksytrytylo-N-(Tymiryloacetylo)(L-Seryrbl(OIb) (9)

Związek 8 (10 g, 30,58 mmol) współodparowano z suchą pirydyną (3x50 ml) i rozpuszczono w suchej pirydynie (100 ml). Do roztworu dodano TEA (3,54 g, 35 mmol), a następnie DMTC1 (11,83 g, 35 mmol) w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 12 h, szybko ochłodzono metanolem (20 ml) i mieszano przez 30 minut. Roztwór odparowano do sucha i rozpuszczono w CH2CI2 (200 ml). Ekstrakt organiczny przemyto 5% roztworem NaHCOĘ, (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Warstwę

185 852

CH2CI2 osuszono nad bezwodnym Na2SC>4 i odparowano do sucha otrzymując surowy produkt jako piankę. Surowy produkt oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> aceton (eluent) otrzymując 17 g (88%) czystego produktu.

-O-<4,4’-Dimetoksytrytylo)-2-[amino(tymlnyloacetylo)]-L-propano-1,3-diol (10)

Związek 9 (10 g, 15,89 mmol) rozpuszczono w metanolu (20 ml). Do roztworu dodano IN roztwór NaOH (20 ml, 20 mmol) w temperaturze 0°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 h, szybko ochłodzono kwasem octowym do pH 7. Roztwór wyekstrahowano EtOAc (2 x 100 ml). Ekstrakt organiczny przemyto 5% roztworem NaHCCb (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Warstwę EtOAc osuszono nad bezwodnym Na2SO4 i odparowano do sucha uzyskując surowy produkt jako piankę. Surowy produkt oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> aceton (eluent) otrzymując 8,2 g 92% czystego produktu.

l-0-(4,4,-Dimetoksytrytylo)-2-[amlno<tyminyloαcetylo)-L-propan-3’-0-(N,N-dlizopropylo)-p-cyjanoetylofoforamidyt 11)

Związek 10 (8,00 g, 14,31 mmol) współodparowano z suchą pirydyną (3x50 ml) i osuszono przez noc nad stałym NaOH pod próżnią. Osuszoną substancję rozpuszczono w suchym CH2CI2 (100 ml) i ochłodzono do 0°C w atmosferze argonu. Do zimnego roztworu dodano N,N-diizopropyloetyloaminę (5,23 g, 25 mmol), a następnie 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylochlorofosforamidyt (4,72 g, 20,00 mmol) w atmosfeze argonu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 1 h i w temperaturze pokojowej przez 1 h. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH2CI2 (100 ml). Roztwór CH2CI2 przemyto 5% roztworem NaHCOs (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Warstwę CH2CI2 osuszono nad bezwodnym Na^SCT i odparowano do sucha otrzymując surowy produkt jako piankę. Surowy produkt oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> aceton zawierający 0,1% TEA (eluent) otrzymując 10 g (x%) czystego produktu. Formę osuszono przez noc nad stałym NaOH pod próżmią. Formę rozpuszczono w CH2CI2 (15 ml) i wkroplono do poddanego mieszaniu roztworu suchych heksanów (2000 ml) w atmosferze argonu w ciągu 1 h. Po dodaniu roztworu CH2CI2, utworzony osad mieszano przez dalsze 1 h i przesączono, przemyto suchymi heksanami (200 ml) i osuszono nad stałym NaOH przez noc. Wydajność: 9,5 g (87%).

Przykład 26 (patrz fig. 26)

N-(tert-Butvłoksvkarbonvlo)-0-benzylo-L-seryna (2)

O-Benzylo-L-serynę 1 (10 g, 51,28 mmol) przeprowadzono w stan zawiesiny w mieszaninie THF/H2O (8:2, 100 ml) w temperaturze pokojowej. Do poddawanej mieszaniu mieszaniny dodano trietyloaminę (6,06 g, 60 mmol), a następnie diwęglan di-tert-butylu (13,08 g, 60 mmol), i mieszanie kontynuowano w temperaturze pokojowej przez noc. Jednorodny roztwór odparowano do sucha i pozostałość rozpuszczono w octanie etylu (300 ml). Ekstrakt organiczny przemyto 0,5N roztworem wodorosiarczanu potasu (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt octanu etylu osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano do sucha otrzymując 14 g (93%) oleistej pozostałości.

N-(tert-Butyloksykarbonylo)-Ó-benzylo-L-serynol (3)

N0tert-butyloksykarbonylo)-0-benzylo-L-serynę 2 (6,0 g, 20,34 mmol) rozpuszczono w suchym THF i ochłodzono do -20°C w atmosferze argonu. Do zimnego, poddawanego mieszaniu roztworu dodano TEA (2,32 g, 23 mmol) i chloromrówczan izobutylu (3,13 g, 23 mmol). Mieszanie kontynuowano przez 30 min w -20°C w atmosferze argonu. Mieszaninę reakcyjną przesączono bezpośrednio pod warstwą argonu, osad przemyto suchym THF (50 ml). Połączony przesącz dodano powoli do zimnego (0°C) roztworu NaBHt (7,4 g, 200 mmol) w THF/woda (80:20, 200 ml) w ciągu 10 min. Po dodaniu, mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 h w 0°C i pH doprowadzono do 7 stosując kwas octowy. Roztwór odparowano do suchości, podzielono między octan etylu/wodę (300:150 ml) i wyekstrahowano octanem etylu. Ekstrakt organiczny przemyto solanką (100 ml), osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano do sucha. Surowy produkt oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> EtOAc (eluent).

Czysty produkt zebrano i odparowano do sucha otrzymując 4,7 g (82%) czystego produktu jako olej.

185 852 'HNMR(CDCl·,) : 8 1,41 (s, 9H, Boc), 3,60 - 3,70 (m, 4H), 3,82 (d, 2H), 4,53 (s, 2H,

OCH₃Ph), 5,20 (bs, 1H, NH) i 7,30-7,40 (m, 5H, Ph)

N-(tert-Butyloksykarbonylo))O-benzylo-L-serynol-O-lb (4)

Do osuszonego roztworu N-(tert-butyloksykarbonylo)-O-benzylo-L-serynolu 3 (4,3 g, 14,3 mmol) w suchej pirydynie (50 ml) dodano TEA (2,02 g, 20 mmol) w temperaturze pokojowej. Do poddawanego mieszaniu roztworu dodano bezwodnik izomasłowy (3,16 g, 20 mmol) i mieszanie kontynuowano przez noc w atmosferze argonu. Mieszaninę reakcyjną odparowano do sucha, podzielono między EtOAc (100 ml) i NaHCO₃ (5% roztwór, 100 ml), i wyekstrahowano EtOAc. Ekstrakt organiczny przemyto wodą (100 ml), solanką (50 ml) i osuszono nad bezwodnym Na2SC>4. Osuszony roztwór odparowano do sucha otrzymując surową pozostałość. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując heksan -> EtOAc (eluent). Czyste frakcje połączono i odparowano otrzymując oleisty produkt: 4,5 g (84%).

'HNMR (CDC1₃): 5 1,04 (d, 6H, IbCH₃), 1,39 (s, 9H, Boc), 2,46 (m, 1H, IbCH), 3,40 (m, 2H), 3,92 (m, 2H), 4,12 (m, 1H), 4,46 (s, 2H, OCH2Ph), 6,84 (d, 1H, NH) i 7,24-7,40 (m, 5H, Ph).

N-(Tyminyloacetylo)-O-benzylo-L-selynol-O-Ib (6)

N-(tert-Butyloksykarbonyl)-O-benzylo-L-serynol-(Ib 4 (4,3 g, 12,21 mmol) mieszano w temperaturze pokojowej w kwasie trifluorooctowym (20 ml) i CH2CI2 (20 ml) przez 30 min. Mieszaninę reakcyjną odparowano do sucha, rozpuszczono w suchym CH₃OH (10 ml) i odparowano ponownie do sucha. Pozostałość osuszono nad stałym KOH pod próżnią przez 12 h. Osuszoną użyto jiko taką w dalszej reakcji bez oznaczenia charakterystyk..

Kwas tyminooctowy 5 (2,76 g, 15 mmol) rozpuszczono w suchym DMF (75 ml) i ochłodzono do -20°C w atmosferze argonu. Do zimnego poddawanego mieszaniu roztworu dodano N-metylomorfolinę (1,72 g, 17 mmol), a następnie chloromrówczan izobutylu (2,31 g, 17 mmol). Po 15 min mieszania, roztwór powyższej soli TFA w suchym DMF (50 ml) zobojętniono N-metylomorfoliną (1,72 g, 17 mmol) i od razu dodano do zimnego poddawanego mieszaniu roztworu kwasu tyminooctowego. Mieszaninę reakcyjną mieszano w -20°C przez 1 h, ogrzano do temperatury pokojowej i mieszanie kontynuowano przez noc. Roztwór odparowano do sucha i pozostałość rozpuszczono w CH2CI2 (250 ml) i wodzie (100 ml), oraz wyekstrahowano CH2CI2. Ekstrakt organiczny przemyto 5% roztworem NaHCCL (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt Ch₂CI₂ osuszono i odparowano do sucha otrzymując surowy produkt. Surowy produkt oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH₂Cl₂ -> aceton (eluent). Niezbędne frakcje zebrano i odparowano otrzymując 4,8 g (94%) czystego produktu. Czysty produkt krystalizowano z CH2C12/ heksanu; t.topn.: 122-124°C.

‘HNMR (CDCh) 5 1,04 (d, 6H, IbCH3), 1,72 (s, 3H, CH3), 2,44 (m, 1H, IbCH), 3,42 (m, 2H), 4,06 (m, 2H), 4,18 (m, IM), 4,30 (s, 2H), 4,46 (s, 2H, OCINPh), 7,24 - 7,40 (m, 6H, C₆H i Ph), 8,22 (d, 1H, NH) i 11,22 (s, 1H, NH).

N-(Tyminyloacetylo)-L-serynoliO-Ib (7)

N-(Tyminyloacetylo)-O-benzylo-L-serynollO-Ib 6 (2,08 g, 5 mmol) rozpuszczono w etanolu (50 ml). Do roztworu dodano w temperaturze pokojowej Pd(OH)₂ (0,6 g) i cykloheksanu (5 ml). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w 70°C przez 12 h. Katalizator odsączono, przemyto metanolem (20 ml). Przesącz odparowano do sucha otrzymując biała substancję stałą. Białą substancję stalą rozpuszczono w minimalnej ilości MeOH i ochłodzono do temperatury pokojowej. Produkt wykrystalizował jako drobny proszek. T.topn: 196-198°C. Wydajność: 1,48 g (91%).

'HNMR (Me2SO-d6): δ 1,04 (d, 6H, IbCH3), 1,72 (s, 3H, CH3), 2,42 (m, 1H, IbCH),

3,40 (m, 2H), 3,94 (m, 2H), 4,06 (m, 1H), 4,23 (5, 2H), 4,90 (t, 1H, OH), 7,20 (s, 1H, C6H), 8,12 (d, lH,NH)i 11,22 (s, 1H, NH)

4, 4’ -Dimetoksytrytylo-N- (tyminyloacetylo) -L-serynol-O-Ib (8)

N-(Tyminyloacetylo)-L-serynollO-lb 7 (1,43 g, 4,5 mmol) rozpuszczono w suchej pirydynie (50 ml) w atmosferze argonu. Do poddawanego mieszaniu roztworu dodano TEA (0,51 g, 5 mmol) i Ν,Ν-dimetyloaminopirydynę (0,10g). Po 10 min dodano chhorek 4,4-dimetoksytrytylu (1,69 g, 5 mmol) i mieszanie kontynuowano przez noc w temperaturze pokojowej w at185 852 mosferze argonu. Mieszaninę reakcyjną szybko ochłodzono MeOH (10 ml), mieszano przez 10 min i odparowano do sucha. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc (200 ml), przemyto 5% roztworem NaHCO3 (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt organiczny osuszono nad bezwodnym Na₂SO4 i odparowano do sucha. Surowy produkt oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> EtOAc (eluent). Czyste frakcje połączono i odparowano otrzymując 2,5 g (88%) pianki.

'HNMR (CDCI3),: δ 1,4 (d, 6H, IbCH3), 1,72 (s, 3H, CH3), 2,40 (m, 1H, IbCH), 3,38 (m, 2H), 3,72 (s, 6H, 2.0CH3), 4,12 (m, 2H), 4,20 (m, 1H), 4,32 (d, 2H), 6,84 (m, 4H, Ph),

7,20 - 7,40 (m, 12H, CgH i Ph), 8,30 (d, 1H, NH) i 11,28 (s, 1H, NH).

l-O-(4,4’-Dimetoksytrytylo)-2-[amino (tyminy loaceIy-o)j-L-propan-l, 3-diol (9)

4,4’ -Dimetoksytrytylo-N-(tyminyloacet^lo)-^-^i^(^ir^i^(^l-^(0-Ib 8 (3,4 g, 5,41 mmol) rozpuszczono w MeOH (30 ml) i ochłodzono do 0°C w łaźni lodowej. Do zimnego poddawanego mieszaniu roztworu dodano 2N NaOH (10 ml, 20 mmol) i mieszanie kontynuowano przez 30 min w 0°C. PH roztworu doprowadzono do 7 kwasem octowym i odparowano do sucha. Pozostałość podzielono między wodę (50 ml) i CH₂C1₂ (150 ml) i wyekstrahowano CH2CI2. Warstwę wodną wyekstrahowano ponownie CH2CI2 (50 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką (50 ml), osuszono i odparowano do sucha. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> aceton (eluent). Wydajność: 3,0 g (99%).

'HNMR (CDCl·,): 1,72 (s; 3H, CH3), 3,0 (m, 2H), 3,42 (m, 2H), 3,72 (s, 6H, 2.0CH3), 3,94 (m, 1H), 4,32 (d, 2H), 4,68 (m, 1H, OH), 6,84 (m, 4H, Ph), 7,20-7,40 (m, 12H, C₆H i Ph), 8,06 (d, 1H, NH) i 11,28 (bs, 1H, NH) l-0-(4,4’-Dimetoksytrytylo)-2-[amino(tyminy-oacctylo))L-propralO-3-0-(N,N-diizopropylo)-β-cy-Σaloety-ofosforamidyt (10): 1 -0-(4,4’-Dim<^i^(^i^s^;yi^tr^i^:^i^o)^^-[amino(tyminyloacetylo)]-L-propano-l,3-diol 9 (3,1 g, 5,55 mmol) osuszono nad stałym NaOH pod próżnią przez noc i rozpuszczono w suchym CH2CI₂ (100 ml).

Roztwór ochłodzono, do 0°C w atmosferze argonu. Do zimnego poddawanego mieszaniu roztworu dodano N,N-diizopropyloetyloaminę (1,29 g, 10 mmol), a następnie 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylo-chlorofoforanidyt(l,96 d, 96 g, 8,3 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 1 h i w temperaturze pokojowej przez 2 h.

Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH₂CH₂ (100 ml) i warstwę organiczną przemyto 5% roztworem NaHCO3 (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt CH2CI2 osuszono i odparowano do sucha otrzymując oleistą pozostałość. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI₂ -> EtOAc zawierający 0,1% TEA (eluent). Czyste frakcje połączono i odparowano otrzymując piankę. Piankę osuszono przez noc nad stałym NaOH pod próżnią. Osuszoną piankę rozpuszczono w suchym CH2CI2 (20 ml) i wkroplono w ciągu 1 h do poddawanego mieszaniu roztworu suchego heksanu (2000 ml) w atmosferze argonu. Po dodaniu, utworzony osad mieszano jeszcze przez 1 h i odsączono, suchym heksanem (100 ml) i substancję stałą osuszono nad stałym

NaOH pod próżnią przez 4 h. Wydajność: 3,5 g (83%).

Przykład 27 (patrz fig. 27)

N-(tert-Butyloksykarbonylo)-0-benzylo-D-seryna (12)

O-Benzylo-D-serynę _H (5 g, 25,64 mmol) przeprowadzono w stan zawiesiny w mieszaninie THF/H₂O (8:2,70 ml) w temperaturze pokojowej. Do poddawanej mieszaniu mieszaniny dodano trietyloaminę (4,04 g, 40 mmol), a następnie diwęglan di-tert-butylu (6,54 g, 30 mmol); i mieszanie kontynuowano w temperaturze pokojowej przez noc. Jednorodny roztwór odparowano do sucha i pozostałość rozpuszczono w octanie etylu (150 ml). Ekstrakt organiczny przemyto 0,5N roztworu wodorosiarczanu potasu (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt octanu etylu osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano do sucha otrzymując 7,56 g (100%) oleistej pozostałości.

Nątert-Butydoksykarbonyloj-O-benzylo-D-serynol (13)

N-riert-ButyloksykarbonylofiO-bernyllo-D-serynol (7,56 g, 25,63 mmol) rozpuszczono w suchym THF i ochłodzono do -20°C w atmosferze argonu. Do zimnego poddawanego mieszaniu roztworu dodano TEA (3,03 g, 30 minol) i chloromrówczan izobutylu (4,08 g, 30 mi44

185 852 nol). Mieszanie kontynuowano przez 30 min w -20°C w atmosferze argonu. Mieszaninę reakcyjną przesączono bezpośrednio pod warstwą argonu, osad przemyto suchym THF (50 ml). Połączone przesącze dodano powoli do zimnego (0°C) roztworu NaBH» (7,4 g, 200 mmol) w THF/wodzie (80:20, 200 :1) w ciągu 10 min. Po dodaniu, mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 h w 0°C i pH doprowadzono do 7 kwasem octowym. Roztwór odparowano do suchości, podzielono między octan etylu/wodę (300:150 ml) i wyekstrahowano octanem etylu. Ekstrakt organiczny przemyto solanką (100 ml), osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano do sucha. Surowy produkt oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnowąn a żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> EtOAc (eluent). Czysty produkt zebrano i odparowano do sucha otrzymując 6,68 g (92%) czystego produktu jako oleju.

'HNMR (CDClj): δ 1,41 (s, 9H, Boc), 3,60 - 3,70 (m, 4H), 3,82 (d, 2H), 4,53 (s, 2H, OCH2Ph), 5,20 (bs, 1H, NH) i 7,30 - 7,40 (m, 5H, Ph).

N-(tert-BnjyloksykaabdDylo1-O-benzylo-D-setyno1 -O-lb (14).

Do osuszonego roztworu N-(tert-butvloksykarbonylo)-0-benzylo-D-serynol 13 (6,6 g, 23,5 mmol) w suchej pirydynie (50 ml) dodano TEa (3,03 g, 30 minol) w temperaturze pokojowej. Do poddawanego mieszaniu roztworu dodano bezwodnik izomasłowy (4,74 g, 30 minol) i mieszanie kontynuowano przez noc w atmosferze argonu. Mieszaninę reakcyjną odparowano do sucha, podzielono między EtOAc (200 ml) i NaHCOj (5% roztwór, 100 ml) i wyekstrahowano EtOAc. Ekstrakt organiczny przemyto wodą (100 ml), solanką (50 ml), i osuszono nad bezwodnym Na2SO4 Osuszony roztwór odparowano do sucha otrzymując nieoczyszczoną pozostałość. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując heksan -> EtOAc (eluent).

Czyste frakcje połączono i odparowano otrzymując oleisty produkt. 8,0 g (97%).

'HNMR (CDClj): 8 1,04 (d, 6H, lbCH3), 1,39 (s, 9H, Boc), 2,46 (m, 1H, IbCH), 3,40 (m, 2H), 3,92 (m, 2H), 4,12 (m, 1H), 4,46 (5, 2H, OCHjPh), 6,84 (d, 1H, NH) i 7,24-7,40 (m, 5H, Ph).

N-(Tyminyloacetylo)-O-benzylo-D-seryno 1 -O-lb (15)

N-tyert-Butyloksykiabonylo^O-benzylo-D-serynol-Ó-lb 1 (5,0 g, 14,25 mmol) mieszano przez 30 min w temperaturze pokojowej w kwasie trifluorooctowym (20 ml) i CH2CI2 (20 ml). Mieszaninę reakcyjną odparowano do sucha, rozpuszczono w suchym CH3OH (10 ml) i odparowano ponownie do sucha. Pozostałość rozpuszczono w CH2CI2 (150 ml), pH doprowadzono do 75% roztworem NaHCOj i wyekstrahowano CH2CI2. Warstwę organiczną przemyto wodą (50 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt CH2CI2 osuszono i odparowano do sucha. Otrzymaną pozostałość osuszono pod próżnią nad stałym KOH przez 12 h. Osuszoną pozostałość użyto jako taką w dalszej reakcji bez oznaczenia charakterystyki.

Kwas tyminooctowy 5 (2,57 g, 14 mmol) rozpuszczono w suchym DMF (50 ml) i ochłodzono do -20°C w atmosferze argonu. Do zimnego poddawanego mieszaniu roztworu dodano N-metylomorfolinę (1,52 g, 15 mmol), a następnie chloromrówczan izobutylu (2,04 g, 15 mmol). Po 15 min mieszania dodano za jednym razem roztwór powyższej aminy w suchym DMF (50 ml) do zimnego, poddawanego mieszaniu roztworu kwasu tyminooctowego. Mieszaninę reakcyjną mieszano w -20°C przez 1 h, ogrzano do temperatury pokojowej i mieszanie kontynuowano przez noc. Roztwór odparowano do sucha i pozostałość rozpuszczono w CH2CI2 (250 ml) i wodzie (100 ml) i wyekstrahowano CH2CI2. Ekstrakt organiczny przemyto 5% roztworem NaHCOj (1CC ml), wodą (1CC ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt CH2CI2 osuszono i odparowano do sucha uzyskując surowy produkt. Surowy produkt oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową, na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> aceton (eluent). Niezbędne frakcje zebrano i odparowano otrzymując 2,8 g (54%) czystego produktu.

'HNMR (CDClj): 5 1,04 (d, 6H, lbCHą), 1,72 (s, 3H, CH3), 2,44 (m, 1H, IbCH), 3,42 (m, 2H), 4,06 (m, 2H), 4,18 (m, 1H), 4,30 (s, 2H), 4,46 (s, 2H, OCH2Ph), 7,24 - 7,40 (m, 6H, C6H i Ph), 8,22 (d, 1H, NH) i 11,22 (s, 1H, NH).

Tytułowy związek także wytworzono stosując sposób opisany dla wytworzenia izomeru „L”. Użyte reagenty: kwas tyminooctowy (2,2 g, 12 mmol); chloromrówczan izobutylu (1,77 g, 13 mmol); N-metylomorfolina (1,52 g, 15 mmol); sól TFA (3,65 g, 10 mmol); N-metylomorfolina (1,5 g, 15 mmol) i suchy DMF (100 ml). Wydajność: 3,5 g (84%).

185 852

N-(Tyminyloacetylo)-D-seryno 1 -O-Ib (16)

N-(Tyminyloacetyyo)-O-benzylo-D-servnol-0-Ib 15 (3,5 g, 8,39 mmol) rozpuszczono w etanolu (50 ml). Do tego roztworu dodano Pd(OH)2 (1,00 g) i cykloheksen (10 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w 70°C przez 12 h. Katalizator odsączono, przemyto metanolem (20 ml). Przesącz odparowano do sucha otrzymując białą substancję stałą. Wydajność: 2,7 g (98%).

^fHNMR (Me2SO-d6): 5 1,04 (d, 6H, IbCH}), 1,72 (s, 3H, CH3), 2,42 (m, 1H, IbCH),

3,40 (m, 2H), 3,94 (m, 2H), 4,06 (m, 1H), 4,28 (s, 2H), 4,90 (t, 1H, OH), 7,20 (s, 1H, CaH), 8,12 (d, lH,NH)i 11,22 (s, 1H, NH).

4,4’-Dimei^<^]^i^^^r^^l^'^^'^(i^:^i^i^i^;^l^l^i^(^<^tt^ll^))I^-ser^r^nl-^(0-Ib (17):

N-(Tyminyloacetvlo)-D-serynol-0-Ib 16 (2,7 g, 8,26 mmol) rozpuszczono w suchej pirydynie (50 ml) w atmosferze argonu. Do poddawanego mieszaniu roztworu dodano TEA (1,01 g, 10 mmol), a następnie chlorek 4,4-dimetoksytrytylu (3,38 g, 10 mmol) i mieszanie kontynuowano przez noc w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu. Mieszaninę reakcyjną szybko ochłodzono MeOH (10 ml), mieszano przez 10 min i odparowano do sucha. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc (250 ml), przemyto 5% roztworem NaHC03 (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt organiczny osuszono nad bezwodnym Na2SC>4 i odparowano do sucha. Surowy produkt oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> EtOAc (eluent). Czyste frakcje połączono i odparowano otrzymując 5,0 g (96%) pianki.

‘HNMR (CDCI3) : 8 1,04 (d, 6H, IbCft), 1,72 (s, 3H, CH3), 2,40 (m, 1H, IbCH), 3,38 (m, 2H), 3,72 (s, 6H, 2.0CH3), 4,12 (m, 2H), 4,20 (m, 1H), 4,32 (d, 2H), 6,84 (m, 4H, Ph),

7,20 - 7,40 (m, 12H, C6H i Ph), 8,30 (d, 1H, NH) i 11,28 (s, 1H, NH).

l-O-(4,4’-Drmetok.sytyytyΊo)-2-[amino(tyminyloacetylo)]-L--propano-I,3-drol (18)

4,4’-Dimetoksytrytylo-N-(iyn^myloacetylo)-SDserynol-O-Ib 17 (5,0 g, 7,95 mmol) rozpuszczono w MeOH (30 ml) i ochłodzono do 0°C w łaźni lodowej. Do zimnego poddawanego mieszaniu roztworu dodano 2N NaOH (10 ml, 20 mmol) i mieszanie kontynuowano przez 30 min w 0°C. PH roztworu doprowadzono kwasem octowym do 7 i odparowano do sucha. Pozostałość podzielono między wodę (50 ml) i CH2CI2 (250 ml) i wyekstrahowano CH2CI2. Warstwę wodną wyekstrahowano ponownie CH₂CI₂ (50 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką. (50 ml), osuszono i odparowano do sucha. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na zelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> aceton (eluent). Wydajność: 4,0 g (90%).

‘HNMR (CDCh): 1,72 (s, 3H, CH3), 3,0 (m, 2H), 3,42 (m, 2H), 3,72 (s, 6 H, 2.0CH3), 3,94 (m, 1H), 4,32 (d, 2H), 4,68 (m, 1H, OH), 6,84 (m, 4H, Ph), 7,20 - 7,40 (m, 12H, C6H i Ph), 8,06 (d, 1H, NH) i 11,28 (bs, 1H, NH).

l-0-(4,4’sDimetoksyt:rytylo)s2s[amino(tyminyloacetylo)propίuol-3-Os(N,N-dlizopropylo) β-cyjanoctylolocforamidyt (19):

lsO-(4,4’sDimetoksytrytyΊo)-2-[amioo(tyminyloacetylo)J-D-propano-1,3-diol 18 (2,79 g, 5,0 mmoO cmusz:^ precz noc nad stałym NaOH pod próżnią i mp^i^szcczn^o w sschym CH2CI2 (100 ml). Roztwór ochłodzono do 0°C w atmosferze argonu. Do zimnego, poddawanego mieszaniu roztworu dodano N,N-dnzopropyloetyloammę (1,29 g, 10 mmol), a następnie

2-cyjanoetyloIN,N-diizcpropylocylcrcfcsforamidyt (1,96 g, 8,3 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 1 h i w temperaturze pokojowej przez 2 h. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH2CI2 (100 ml) i warstwę organiczną przemyto 5% roztworem NaHCO 3 (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt CH₂Cl₂ osuszono i odparowano do sucha otrzymując oleistą pozostałość. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na zelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> EtOAc zawierający 0,1% TEA (eluent). Czyste frakcje połączono i odparowano otrzymując piankę. Piankę osuszono przez noc nad stałym NaOH pod próżnią. Osuszoną piankę rozpuszczono w suchym CH2CI₂ (20 ml) i wkraplano w ciągu 1 h do poddawanego mieszaniu roztworu suchego heksanu (2000 ml) w atmosferze argonu. Po dodaniu, utworzony osad mieszano jeszcze przez 1 h i przesączono, przemyto suchym heksanem (100 ml) i substancję stałą osuszono pod próżnią przez 4 h nad stałym NaOH. Wydajność: 3,3 g (87%).

185 852

Przykład 28 (fig. 28)

1- 0-Benzylo-2-[(tert-butyloksykarboryl)amiro)-3-[N3-berzoilo(tyminylo)-L-propanol (21) .

Do poddawanego mieszaniu roztworu N3-berzoilbtyminy 20 (5,75 g, 23 mmol) w suchym THF (200 ml) w atmosferze argonu dodano w temperaturze pokojowej trifenylofosfinę (10,48 g, 40 mmol) N_α-tert-butyloksykarbonyl(β-berzyloksy-L-serynol 3 (5,3 g, 18,86 mmol). Po 15 min dodawano powoli w ciągu 30 min dietylazodikarboksylan (6,96 g, 40 mmol). Mieszaninę reakcyjną przykryto folią aluminiową i mieszano w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu przez 24 h, rozpuszczalnik odparowano do sucha i pozostałość rozpuszczono w EtOAc (300 ml). Ekstrakt organiczny przemyto 5% roztworem NalJCO;; (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (100 ml), i osuszono nad bezwodnym Na2SO4. Osuszony ekstrakt EtOAc odparowano do sucha otrzymując pomarańczowy olej. Surowy produkt oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując heksan -> EtOAc (eluent). Frakcje z żądanym produktem połączono i odparowano otrzymując bladoróżowy olej. Wydajność: 8,0 g (86 %).

'HNMR (CDC1₃): 1,41 (s, 9H, Boc), 1,72 (s, 3H, CH3), 3,56 (m, 2H), 4,20 (m, 2H), 4,32 (m, 1H), 4,52 (d, 2H, OCH2Ph), 5,20 (d, 1H, NH), 7,06 (s, 1H, C6H) i 7,20 - 7,60 (m, 10H, Ph).

2- [(tert-Butyloksykarbonyl)amino]-3 - [N3-benzoilb(tyminylo)-L-proparolol (22) l(O-Benzylo-2-[(tert-butylbksykarbbnyl)ammo)-3-(N3-benzoilo(tyminylb)-L-prbpanbl (4,93 g, 10 mmol) rozpuszczono w MeOH (100 ml) i poddano działaniu Pd/C (10%, lg). Mieszaninę reakcyjną uwodorniono przy ciśnieniu 50 psi wodoru przez 12 h. Katalizator odsączono, przemyto MeOH (50 ml) i przesącz odparowano do sucha. Pozostałość wykrystalizowano z mieszaniny aceton/heksan otrzymując 3,70 g (92%) czystego produktu. T.lopm: 156159°C.

'HNMR (CDCh): 1,42 (s, 9H, Boc), 1,94 (s, 3H, CH3), 3,64 (m, 4,4), 3,84 (m, 1H), 4,14 (m, 1H), 5,22 (d, 1H, NH), 7,18 (s, 1H, C_ĆH), 7,48 (t, 2H, Ph), 7,62 (t, 1H, Ph) i 7,98 (d, 2H, Ph).

-O-IzobutyrylO(2-[-tert-butylbksykarbbnyl)amino]-3-[N3-benzollo(tyminylb)-L-propanol(23)

2-[(tert-Butyloksykarbbnyl)aminb]-3-[N3-benzoilo(tyminylb)(L-propanblol 22 (1,60 g, 3,97 mmol) rozpuszczono w suchej pirydynie (30 ml) i mieszano w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu. Do poddawanego mieszaniu roztworu dodano TEA (0,51 g, 5 mmol) i bezwodnik izomasłowy (0,79 g, 5 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 h i odparowano do sucha. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc (150 ml) i przemyto 5% roztworem NaHCOa (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt organiczny osuszono i odparowano do sucha. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> EtOAc (eluent). Czyste frakcje zebrano i odparowano otrzymując 1,6 g (85%) pianki. Czysty produkt krystalizowano z mieszaniny aceton/heksan. T.topn. 165-161°C.

'HNMR (CDCb) :1,16 (d, 6 H, IbCH₃), 1,42 (s, 9H, Boc), 1,94 (s, 3H, CH3), 2,52 (m, 1H), 3,64 (m, 4H), 3,84 (m, 1H), 4,14 (m, 1H), 5,22 (d, 1H, NH), 7,18 (s, 1H, C₆H), 7,48 (t, 2H, Ph), 7,62 (t, 1H, Ph) i 7,98 (d, 2H, Ph) l-O-Izobutyrylo^-[(P-hydroksyacetylo)ammo]-3-[N3-berzoilo(tymirylo)-L-prbparol (24) l- 0-Izobutyrylo^-[(tert-butyloksykarboryl)amino]-3-[N3-benzbilo(tyminylo)-L-prbpanol 23 (1,6 g, 3,38 mmol) mieszano w mieszaninie TFA (5 ml) i CH2CI2 (10 ml) w temperaturze pokojowej przez 30 min i odparowano do sucha. Pozostałość rozpuszczono w suchym MeOH (10 ml) i odparowano ponownie. Pozostałość przez noc osuszono nad stałym NaOH pod próżnią. Osuszoną substancję użyto jako taką w następnej reakcji.

Do poddawanego mieszaniu roztworu kwasu glikolowego (0,53 g, 7 mmol) w suchym DMF (50 ml) dodano 1 -hydroksybenzotriazol (0,67 g, 5 mmol) i chlorowodorek l-etylo-3-(3dimetylaminopropylo)-karbbdiimidu (EDC) (1,91 g, 10 mmol). Po mieszaniu przez 15 min dodano w temperaturze pokojowej TEA (1,01 g, 10 mmol) i powyższą sól TFA w DMF (20 ml).

Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 12 h i odparowano do sucha. Pozostałość podzielono między CH2CI2 (150 ml) i wodę (100 ml) i wyekstrahowano CH2CI2. Ekstrakt orga185 852 niczny przemyto solanką (50 ml), osuszono i odparowano do sucha. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> aceton (eluent). Frakcje z żądanym produktem zebrano i odparowano otrzymując 1,35 g (92%) pianki.

‘HNMR (CDCh): 1,16 (d, 6H, WCH3), 1,94 (s, 3H, CH3), 2,52 (m, 1H), 3,20 (bs, 1H), 3,80 - 4,30 (m, 6H), 4,56 (m, 1H), 7,14 (d, 2H, C₆H i NH), 7,50 (t, 2H, Ph), 7,64 (t, 1H, Ph) i 7,94 (d, 2H, Ph). , .

1- 0-Izobutyrylo-2-[(β-(4,4 ’-dimetoksytrytylo)-0-acetylo)amino]-3-[N3-benzoilo(tyminylo)-L-propanol (25)

-0-IzobutyIylo-2-[(β-hydroksyacetyl)amino]-3-[N3-benzoil(tyminyl)-L-βropanol 24 (1,2 g, 2,78 mmol) rozpuszczono w suchej pirydynie (50 ml) i mieszano w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu. Do poddawanego mieszaniu roztworu dodano TEA (0,35 g, 3,5 mmol) i chlorek 4,4’-dimetoksytrytylu (1,18 g, 3,5 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 h, szybko ochłodzono MeOH (10 ml) i odparowano do sucha. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc (150 ml), przemyto 5% roztworem NałlCCĘ, (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt organiczny osuszono nad Na2SC>4 i odparowano do sucha. Pozostałość oczyszczono przez szybką chroma'tografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> EtOAc (eluent). Czyste frakcje połączono i odparowano uzyskując

1,7 g (8^3% c^stt^e^o produktu.

’HNMR (CDCl·}): 1,16 (d, 6H, IbCH}), 1,94 (s, 3H, CH3), 2,52 (m, 1H), 3,74 (s, 6H, 2 .OCH3), 3,80 - 4,30 (m, 6 H), 4,56 (m, 1H), 6,82 (d, 4H, Ph), 7,14 (d, 2H, C6H i NH) i 7,268,00 (m , 14H, Ph).

2- [(P-(4,4’-Dimetoksytrytyl)-O-acetyl)£miino]-3-tyminylo-L-propanol (26)

1- 0-Izobutyiyl-2-β-(4,4 ’-dimetoksytrytylo)-0-acetyl)amino]-3-(N3-benzoilo(tyminylo)L-propanol 25 1,55, g, 2,05 mmol) rozpuszczono w MeOH (20 ml) i ochłodzono do 0°C w łaźni lodowej. Do zimnego, poddawanego mieszaniu roztworu dodano 2N NaOH (5 ml, 10 mmol) i mieszanie kontynuowano przez 30 min w 0°C. pH roztworu doprowadzono kwasem octowym do 7 i odparowano do sucha. Pozostałość podzielono między wodę (50 ml) i CH2CI2 (50 ml) i wyekstrahowano CH2O2. Warstwę wodną wyekstrahowano ponownie CH2CI2 (50 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką (50 ml), osuszono i odparowano do sucha. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> aceton (eluent). Wydajność: 1,0 g (99%).

'HNMR (CDCl}): 1,94 (s, 3H, CH3), 3,74 (s, 6H, 2.0CH3), 3,80 - 4,30 (m, 6H), 4,56 (m, 1H), 6,82 (d, 4H, Ph), 7,14 (d, 2H, C6H i NH) i 7,26 - 8,00 (m, 14H, Ph)

2- [(β-(4,4’-Dlmetoksytrytylo)-O-acetylo)ammo]-3--yminylo-L-propβno-l-O-<N,N-dlizoproβylo)-β-cyjanoetylo-fosforamidyt (27) ’

2-[(β-(4,4’-Dimetoksytrytylo)-0-acetylo)amino]-3-tymmylo-L-proβanol 26

1,00, g, 2,09 mmol) osuszono przez noc nad stałym NaOH pod próżnią i rozpuszczono w suchym CH2CI2 (50 ml). Roztwór ochłodzono do 0°C w atmosferze argonu. Do zimnego, poddawanego mieszaniu roztworu dodano N,N-diizopropyletylaminę (0,54 g, 4,2 mmol), a następnie 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylochlorofosforamidyt (0,73 g, 3,1 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 1 h i w temperaturze pokojowej przez 2 h. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH2CI2 (100 ml) i warstwę organiczną, przemyto 5% roztworem NaHCO3 (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt CH2CI2 osuszono i odparowano do sucha otrzymując oleistą pozostałość. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> EtOAc zawierający 0,1% TEA (eluent). Czyste frakcje połączono i odparowano otrzymując piankę. Piankę przez noc osuszono nad stałym NaOH pod próżnią. Osuszoną piankę rozpuszczono w suchym CH2CI2 (10 ml) i przez 30 min wkraplano do poddawanego mieszaniu roztworu suchego heksanu (800 ml) w atmosferze argonu. Po dodaniu, utworzony osad mieszano jeszcze przez 30 min i odsączono, przemyto suchym heksanem (100 ml) i przez 4 h substancję stałą osuszono nad stałym NaOH pod próżnią. Wydajność: 1,3 g (82%).

185 852

Przykład 29 (fig. 29)

N“-tert-Butyloksykarbonylo-O-benz.ylohydroksyloamina (28)

Chlorowodorek O-benzylohydroksyloaminy (15,9 g, 1CC mmol) przeprowadzono w stan zawiesiny w mieszaninie THF (15C ml) i wody (5) ml). Do tej poddawanej mieszaniu mieszaniny dodano: TEA (15,15 g, 15) mmol), a następnie diwęglan di-tert-butylu (23,98 g, 11) mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 h i odparowano do sucha. Pozostałość podzielono między EtOAc (25) ml) i wodę (2,)C ml) i wyekstrahowano EtOAc. Ekstrakt EtOAc przemyto wodorosiarczanem potasu (1)) ml) i solanką (1)) ml), osuszono i odparowano do sucha otrzymując 15 g (91%) klarownego oleju.

l-Chloro-2-(tetrahydropiranylo) oksyetan (29)

1-Chloraetanol (8,06 g, 10) mmol) rozpuszczono w suchym CH2CI2 (10) ml) i ochłodzono do )°C w łaźni lodowej w atmosferze argonu. Do tego poddawanego mieszaniu roztworu dodano dihydropiran (12,6 g, 15) mmol), a następnie pirydynio-p-tolueno-4-sulfonian (1,25 g, 5 mmol) i mieszanie kontynuowano przez noc. Mieszaninę reakcyjną odparowano do sucha i rozpuszczono w EtOAc (2C) ml). Ekstrakt EtOAc przemyto 5% roztworem NaHCOs (1)) ml), wodą (1)) ml) i solanką (1C) ml). Ekstrakt organiczny osuszono i odparowano do sucha. Surową substancję oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując heksan -> CH2CI2 (eluent). Czyste frakcje połączono i odparowano uzyskując 11 g (67%) czystego produktu.

N-tert-Butyloksykarbonylo-N-[(tetrahydropiranyl)oksy]etylo-O-benzylohydroksylamina (30)

Do poddawanego mieszaniu roztworu N-tert-butyloksykarbonylo-O-benzylohydroksylaminy 28 (5,79 g, 25,96 mmol) w suchym DMF (5) ml) dodawano powoli przez 15 min NaH (6)%o, 1,2 g, 3) mmol) w atmosferze argonu w )°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w C°C przez 3) min i w temperaturze pokojowej przez lh. Dodano l-chloro-2-(tetrahydropiranyl) oksyetan 29 (4,95 g, 3) mmol) i mieszaninę reakcyjną ogrzewano w 8)°C przez 12 h. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono i odparowano do sucha. Pozostałość przeprowadzono w stan zawiesiny w wodzie (5) ml), pH roztworu doprowadzono do 7 i wyekstrahowano EtOAc (15) ml). Ekstrakt EtOAc przemyto wodą i solanką, osuszono i odparowano do sucha. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując heksan —> CH2CI2 (eluent). Żądane frakcje połączono i odparowano otrzymując 6,0 g (66 %) oleistego produktu.

‘HNMR (CDCI3): 5 1,48 (s, 9H, Boc), 1,49-1,84 (m, 6H, 3.CH2), 3,48 - 3,7) (m, 4H,

2.CH2), 3,86 (m, 2H, CH2); 4,60 (t, 1E, CH), 4,84 (s, 2H, CH₂Ph) i 7,32 - 7,42 (m, 5H, Ph).

N-tert-Butyloksykarbonylo-N-[(2-hydroksy)etyjo]-O-benzylohydroksylamina (31)

Poddawany mieszaniu roztwór N-tert-butyloksykarbonylo-N-[(tetrahydropiranyl)oksy] etyl-O-benzylhydroksyioaminy 30 (3,51 g, 10 mmol) w THF:woda:AcOH (1:1:1, 10) ml) ogrzewano w 7)°C przez 3 h. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do C°C i pH doprowadzono stałym NaHC03 do 7. Mieszaninę reakcyjną wyekstrahowano EtOAc (2 x 75 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto wodą (100 ml) i solanką (100 ml), osuszono i odparowano do sucha. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> EtOAc (eluent); czyste frakcje połączono i odparowano uzyskując

2,5 g (94%) pianki.

‘HNMR (CDCI3): 5 1,48 (s, 9H, Boc), 3,6) (t, 2H, CH2), 3,74 (m, 2H, CH2), 4,84 (s, 2H, CH2Ph) i 7,32 - 7,42 (m, 5H, Ph).

N-tert-Butyloksykarbony 1-N-[[(2-izobutyryl) oksy]etyl]-O-benzylhydroksylamina (32);

Do poddawanego mieszaniu roztworu N-tert-butyloksykarbonylo-N-[(2-hydroksy)etyl]O-benzylhydroksylaminy 31 (4,2 g, 16,6 mmol) w suchej pirydynie (5) ml) dodano TEA, (2,C2 g, 2) mmol), następnie bezwodnik izomasłowy (3,16 g, 2θ mmol) w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 h i odparowano do sucha. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc (2CC ml), przemyto with 5% roztworem NaHCOs (1CC ml), wodą i solanką (50 ml). Ekstrakt organiczny osuszono i odparowano do sucha. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową

185 852 na żelu krzemionkowym stosując CH2O2 (eluent); czyste frakcje połączono i odparowano uzyskując 4,5 g (80%) czystego związku.

‘HNMR(CDCl·,): 6 1,04 (d, 6H, lbCH^, 1,48 (s, 9H, Boc), 2,44 (m, 1H, lbCH), 3,60 (t,

2H, CH2), 3,74 (m, 2H, CH2), 4,84 (s, 2H, CfyPh) i 7,32 -7,42 (m, 5H, Ph).

N-(Tyminylacetylo)-N-[[(2-izobutyryl)oksy]etylo]-O-benzylohydroksylamina (33)

N-tert-Butyloksykarbony 1 -N-[[(2-izobutyrylloxχ]etyll1]O-benzylohydroksyloaminę j32 (5,0 g, 14,84 mmol) rozpuszczono w CH2G2 (10 ml) i mieszano w TFA (12 ml) przez 30 min. Mieszaninę reakcyjną odparowano do sucha i rozpuszczono w suchym metanolu (10 ml). Odparowano ponownie do sucha i osuszono przez noc pod próżnią na stałym NaOH. Osuszoną substancję użyto jako taką w następnej reakcji bez oznaczenia charakterystyki.

Kwas tyminooctowy 5 (3,13 g, 17 mmol) rozpuszczono w suchym DMF (75 ml) i ochłodzono do -20°C w atmosferze argonu, . Do tego zimnego roztworu poddawanego mieszaniu dodano N-metylomorfolinę (2,02 g, 20 mmol), a następnie chloromrówczan izobutylu (2,72 g, 20 mmol). Po 15 min mieszania, roztwór powyższej soli TEA w suchym DMF (50 mi) zobojętniono N-metylomorfoliną (2,02 g, 20 mmol) i bezpośrednio za jednym razem dodano do zimnego, poddawanego mieszaniu roztworu kwasu tyminooctowego. Mieszaninę reakcyjną mieszano w -20°C przez 1 h, ogrzano do temperatury pokojowej i mieszanie kontynuowano przez noc. Roztwór odparowano do sucha i pozostałość rozpuszczono w CH2C12 (250 ml) i wodzie (100 ml) i wyekstrahowano CH2G2. Ekstrakt organiczny przemyto 5% roztworem NaHCOj (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml). Ekstrakt CH2G2 osuszono i odparowano do sucha otrzymując surowy produkt. Surowy produkt oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnowąna żelu krzemionkowym stosując CH2G2 -> aceton (eluent). Niezbędne frakcje zebrano i odparowano otrzymując 4,0 g (70%) czystego produktu. Czysty produkt krystalizowano z CH2Cl2/heksanu. T.topn.: 185-188°C.

'HNMR (Me2SO-d6): 5 1,00 (d, 6H, lbCH3), 1,74 (s, 3H, Ctt), 2,44 (m, 1H, lbCH), 3,92 (m, 2H), 4,18 (t, 2H), 4,68 (bs, 2H), 4,98 (s, 2H), 7,34 (s, 1H, C₆H), 7,40 - 7,50 (m, 5H, Ph) i 11,32 (bs, 1H, NH).

Przykład 30 (fig. 30) (2R, 4R)-2-Karbometoksy-4-hydroksypirolidyna (35)

W kolbie okrągłodennej 250 ml wyposażonej w mieszadło magnetyczne i chłodnicę zwrotną umieszczono suchy metanol (40 ml) i ochłodzono w łaźni lodowej w atmosferze argonu. Do tego poddawanego mieszaniu roztworu dodano chlorek acetylu (4,32 g, 55 mmol), a następnie cis-4-hydroksy-D-proline 34.(5,00 g, 38,17 mmol). Otrzymany roztwór .ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 7-8 h i ochłodzono do temperatury pokojowej. Roztwór rozcieńczono eterem i uzyskaną białą substancję stałą zebrano za pomocą ssania, rozcieńczono eterem i osuszono pod próżnią nad stałym NaOH. Wydajność; 6,9 g(100%).

‘HNMR (CDCh): 2,09 (2 dd, 1H), 2,34 (m, 1H), 3,49-3,73 (m, 3H), 3,79 (s, 3H, -CH), 4,34 (m, 2H).

(2R, 4R)-1 -(tert-Butyloksykarbonylo)-2-karbometoksy-4-hydroksypirolidyna (36):

Do poddanego mieszaniu roztworu (2R, 4R)-2-karbometoksy-4-hydroksypirolidyny 35 (6,9 g, 38,12 mmol) w THF/wodzie (8:2, 150 ml) dodano w temperaturze pokojowej TEA (10,1 g, 100 mmol), a następnie diwęglan di-tert-butylu (10,9 g, 50 mmol).

Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 6 h i odparowano do sucha. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc (200 ml) i przemyto 0,5n wodorosiarczanu potasu (50 ml), wodą (100 ml) i solanką (50 ml).

Ekstrakt organiczny osuszono nad NajSO, i odparowano do sucha otrzymując 7,8 g (84%) oleistego produktu. Oleisty produkt po suszeniu dał bezbarwną substancję stałą: T.topn.: 75-77°C ^rHNMR (CDClj): 1,45 (s, 9H, Boc), 2,09 (2 dd, 1H), 2,34 (m, 1H), 3,49 - 3,73 (m, 3H), 3,79 (s, 3H, CH), 4,34 (m, 2H).

(2R,4R)-1 -(tert-Butyloksykarbonylo)-2-hydroksymetylo-4-hydroksypirolidyna (37) (2R,4R)-l-(tert-Butyloksykarbonyl)-2-karbometoksy-4-hydrOksypirolidynę 36 (7,0 g, 28,6 mmol) rozpuszczono w suchym THF (100 ml) i ochłodzono w łaźni lodowej z solą w atmosferze argonu. Do zimnego roztworu dodawano przez 15 min małymi porcjami borowodorek litu (1,88 g, 85,8 mmol). Po dodaniu borowodorku litu, mieszaninę reakcyjną mieszano w

185 852

0°C przez 1 h, a następnie 15 h w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu. Roztwór ochłodzono do °C i rozcieńczono wodą (50 ml) i doprowadzono pH do 6 za pomocą AcOH. Mieszaninę reakcyjną odparowano do sucha i rozpuszczono w EtOAc (200 ml), przemyto wodą (100 ml) i solanką (100 ml). Ekstrakt EtOAc osuszono i odparowano do sucha. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 -> EtOAc (eluent). Czyste frakcje połączono i odparowano do sucha uzyskując 5,00 g (81%) klarownego oleju. Olej po odstaniu dał bezbarwną substancję stałą. T.topn.: 95-97°C.

'HNMR (CDCI3): 1,45 (s, 9H, Boc), 1,90 (dd, 1H), 2,34 (m, 1H), 3,40 - 3,62 (m, 3H), 4.00 (m, 2H), 4,28 (bs, 1H), 4,44 (m, 1H).

(2R,4R)-1 -(tert-Butyloksykarbonylo)-2-(4,4 ’-dimetoksytrytyl)oksymetylo-4-hydroksypirolidyna, (38) (2R,4R)-l-(tert-ButyloksykarbonyIo)-2-hydroksymetylo-4-hydroksypirolidynę_37 (4,4 g, 20,28 mmol) rozpuszczono w suchej pirydynie (50 ml) i mieszano w atmosferze argonu. Do poddawanego mieszaniu roztworu dodano TEA (2,53 g, 25 mmol), a następnie chlorek 4,4-dimetoksytrytylu (7,45 g, 22 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 h i szybko ochłodzono MeOH (10 ml). Roztwór odparowano do sucha i rozpuszczono w EtOAc (200 ml). Warstwę EtOAc przemyto 5% roztworem NaHC03 (100 ml), wodą (100 ml) i solanką. Ekstrakt organiczny osuszono nad bezwodnym Na^SCj i odparowano do sucha. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową, na żelu krzemionkowym stosując heksan -> EtOAc (eluent). Żądane frakcje połączono i odparowano uzyskując 8,09 g (100%) pomarańczowej pianki.

’HNMR (CDCI3): 1,45 (s, 9H, Boc), 1,90 (dd, HH), 2,34 (m, 1H), 3,40 - 3,62 (m, 3H), 3.74 (s, 6H, 2.OCH3), 4,00 (m, 2H), 4,28 (bs, 1H), 4,44 (m, 1H), 6,82 (d, 4H, Ph) i 7,26-8,00 (m, 9H, Ph).

(2R,4R)-1 -(tert-Butyloksykarbony^^)-2-(4,4 ’-dimetoksytrytylo)oksymetylo-4- [(p-toluenosulfonyl)oxy]pirolidina (39):

(2R,4R)-l^(1^eit^-Butyloksykarbonylo)-2-(4,4’-dimetoksytry-tylo)oksymetylo-4-hydroksypirolidyna 38 (8,09 g, 20,27 mmol) rozpuszczono w suchej pirydynie CH2CI2 (2:1, 200 ml) i ochłodzono w łaźni lodowej w atmosferze argonu. Do zimnego roztworu dodano TEA (3,03 g, 30 mmol), a następnie chlorek p-toluenosulfonylu (5,7 g; 30 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 3 h i poniżej 30°C przez 8 h. Mieszaninę reakcyjną odparowano do sucha, podzielono między EtOAc (200 ml) i 5% roztwór NaHC03 (100 ml) i wyekstrahowano EtOAc. Ekstrakt EtOAc przemyto wodą (100 ml) i solanką (100 ml), osuszono i odparowano do sucha. Surowy produkt oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując heksan —> EtOAc (eluent). Czyste frakcje połączono i odparowano uzyskując 12,2 g (89%) pomarańczowego oleju.

'HNMR (CDCh): 1,45 (s, 9H, Boc), 1,90 ( dd, 1H), 2,34 (m, 1H), 3,40 - 3,62 (m, 3H), 3.74 (s, 6H, 2 .OCH3), 4,00 (m, 2H), 4,28 (bs, 1H), 4,44 (m, 1H), 6,82 (d, 4H, Ph) i 7,26 - 8,00 (m, 13H, Ph).

(2R,4S)-1 -(tert-Butyloksykarbonylo^-OM ’-dimetoksytrytyl)oksymetylo-4-azydopirolidyna (40) (2R,'^^)-l-(l^ert-Butyloksykarbonyl)-2-(4,4’-di^e-to^s^;ryt^ilo)oksymetylo-4-[(p-toluenosulfonylo)oksypirolidynę 39 (5,1 g, 7,58 mmol) rozpuszczono w dimetyloformamidzie (50 ml) i rozcieńczono wodą (5 ml). Do tego poddanego mieszaniu roztworu dodano azydek sodu (0,65 g, 10 mmol) i ogrzewano w 80°C przez 8 h; ochłodzono i odparowano do sucha. Pozostałość podzielono między CH2CI2 (200 ml) i wodę (100 ml) i wyekstrahowano CH2CI2. Ekstrakt organiczny przemyto solanką (50 ml), osuszono nad Na2Ś04 i odparowano do sucha. Surowy produkt oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując heksan —> EtOAc (eluent). Czyste frakcje połączono i odparowano uzyskując

3,8 g (928% klaaowneeg oleju.

185 852 'HNMR (CDCla): 1,45 (s, 9H, Boc), 1,90 (dd, 1H), 2,34 (m, 1H), 3,40 - 3,62 (m, 3H),

3,74 (s, 6H, 2.OCH3), 4,00 (m, 2H), 4,28 (bs, 1H), 4,44 (m, 1H), 6,82 (d, 4H, Ph) i 7,26 - 7,80 (m, 9H, Ph).

(2R,4S)-1 -(tert-Butyloksykarbonylo--2-hydroksymetylo-4-amino-pirolidyna (41) (2R,4S--l-(tert-Butyloksykarbonylo--2-(4,4’-dimetoksytrytylo-ok)ymetylo-4-azydo-pirolidyna 40 (2,72 g, 5 mmol) w metanolu (75 ml) uwodorniono w obecności 10% palladu na węglu drzewnym (0,3 g) w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem 5 atm. Po 12 h, katalizator odsączono, przemyto metanolem (20 ml) i rozpuszczalnik usunięto pod próżnią. Wydajność 1,0 g (93%).

'HNMR (CDCb): 1,45 (s, 9H, Boc), 1,90 (dd, 1H), 2,34 (m, 1H), 3,40 - 3,62 (m, 3H), 4,00 (m, 2H), 4,28 (bs, 1H) i 4,44 (m, 1H).

(2R,4S)-1 -(tert-Butyloksykarbonyl o)-2-hydfo-4-ftal imi do-pi rolidyna (42) (2R,4S)-l-(tert-Butyloksykarbonylo)-2-hydroksymetylo-4-amino-pirolidynę 41 (1,00 g, 4,63 minol) rozpuszczono w suchym metanolu (20 ml) i poddano działaniu N-etoksykarbonyloftalimidu (1,09 g, 5 mmol) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 6 h i odparowano do sucha. Pozostałość oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując CH2CI2 —> EtOAc (eluent). Czyste frakcje zebrano i odparowano otrzymując 1,5 g (94%) czystego związku jako piankę.

'HNMR (CDCI3): 1,45 (s, 9H, Boc), 1,90 ( dd, 1H), 2,34 (m, 1H), 3,40 - 3,62 (m, 3H), 4.00 (m, 2H), 4,28 (bs, 1H), 4,44 (m, 1H) i 7,3 - 7,6 (m, 4H, Ph) (2 R,4 Śbl-Oert-Butyloksykarbonylo)^-[N3-benzoilo(tymin-l-yiy|metylo-4-ftalimidopirolidyna (43):

Do poddawanego mieszaniu roztworu N3-benzoilotyminy 20 (1,15 g, 5 mmol) w suchym THF (70 ml) w atmosferze argonu dodano w temperaturze pokojowej trifenylofosfinę (2,62 g, 10 mmol) i (2R,4S--l-(tert-butyloksykarbonylo)-2-hydroksymetylo-4-ftalimidopirolidynę (1,4 g, 4,05 mmol). Po 15 min dodawano powoli przez 10 min dietylazodikarboksylan (1,74 g, 10 mmol). Mieszaninę reakcyjną przykryto folią aluminiowa i mieszano w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu przez 24 h. Rozpuszczalnik odparowano do sucha i pozostałość rozpuszczono w EtOAc (150 ml). Ekstrakt organiczny przemyto 5% roztworem NaHCO3 (100 ml), wodą (100 ml) i solanką (100 ml), i osuszono nad bezwodnym Na2S04. Osuszony ekstrakt EtOAc odparowano do sucha otrzymując pomarańczowy olej. Surowy produkt oczyszczono przez szybką chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym stosując heksan -> EtOAc (eluent). Frakcje zawierające żądany produkt zebrano i odparowano otrzymując bladoróżowy olej. Wydajność: 2,0 g (89%).

'HNMR (CDCb): 1,41 (s, 9R, Boc), 1,72 (s, 3R, CH3), 1,90 (dd, 1H), 2,34 (m, 1H),

3,40 - 3,62 (m, 3H), 4,00 (m, 2H), 4,28 (bs, 1H), 4,44 (m,lH), 7,06 (s, 1H, C_ĆH) i 7,20 - 7,60 (m, 9H, Ph).

Przy kład 31

Synteza oligonukleotydów:

Oligonukleotydy zawierające zmodyfikowane aminokwasami łańcuchy główne kwasów nukleinowych zsyntetyzowano w automatycznym syntetyzatorze DNA (Applied Biosystems model 394) stosując standardowe reakcje chemii fosforamidytów. β-Cyjanoetylofosforamidyty, reagenty syntezy i kolumny polistyrenowe CPG nabyto od Applied Biosystems (Foster City, CA). W przypadku oligonukleotydów fosforotioanowych, standardową butlę utleniającą zamieniono z disiarczkiem tetraetylotiuramu/acetonitrylem, i użyto standardowy program ABI fosforotianów dla stopniowego tiowania wiązań fosforanowych. Po odszczepieniu z kolumny ze szkłem o kontrolowanych porach, grupy zabezpieczające usunięto przez działanie na oligonukleotydy stężonym wodorotlenkiem amonowym w 55°C przez δ h. Oligonukleotydy (DMT-on) oczyszczono przez HPLC stosując semipreparatywną kolumnę Cs (ABI) z odwróconymi fazami z liniowym gradientem 5% acetonitrylu w 0,1M octanie trietyloamoniowym (bufor A) i acetonitrylu (bufor B). Grupa zabezpieczająca DMT została odszczepiona przez działanie 80% kwasem octowym i produkt wytrącono etanolem.

Czystość produktów zbadano HPLC stosując kolumnę analityczną. Cig (Beckman). Monomery aminokwasowego kwasu nukleinowego włączono przy końcu 3’-, 5’- i pośrodku se52

185 852 kwencji DNA przy wydajności sprzęgania 100%. Bez problemów wytworzono także homopolimer zawierający tyminę zmodyif kowaną 16 aminokwasami.

Przykład 32

Analiza hybrydyzacyjna:

Zdolność zmodyfikowanych aminokwasami cligonukleoaydów według wynalazku do hybrydyzowania do ich komplementarnych sekwencji RNA i DNA jest określona przez analizę za pomocą topienia cieplnego. Komplement RNA został zsyntetyzowany przez korporację Geosea (La Jolla, CA) i oczyszczony przez zdenaturowanie mocznika PAGE. Naturalne aotysenscwne cbgooukleotydy lub te zawierające grupy funkcyjne w specyficznych miejscach są dodawane do komplementu RNA lub DNa przy stężeniach ttecyiometóyczoycy tworząc dupleksy hybrydowe. Zależność hipeychóomowej abso^un^ (260 nm) od temperatury w przejściu: dupleks - makrocząsteczka statystycznie skłębiona jest monitorowana przy użyciu spektrofotometru Varian Cary 1E Pomiary są wykonywane w buforze 10 mM fosforanu wapnia, pH 7,4, 0,1 mM EDTA i NaCl dając siłę jonową 0,1 M lub 1,0 M. Dane analizuje się przez przedstawienie graficzne l/Tm względem ln[Ct], gdzie [Ct] jest całkowitym stężeniem oligonukleotydu. Z tej analizy wyznacza się parametry termodynamiczne. W oparciu o zebraną, informację dotyczącą trwałości utworzonego dupleksu lub heterodupleksu, ocenia się usytuowanie zmodyfikowanej pirymidyny w oligonukleotydach ze względu na jego wpływ na trwałość helisy. Modyfikacje, które drastycznie zmieniają trwałość hybrydy wykazują zmniejszenie lub zwiększenie energii swobodnej (delta G) i dokonuje się decyzji co do ich przydatności w antysenscwnych cligcouklecaydach.

Badania hybrydyzacji przeprowadzono w przypadku cligonukleotydów zawierających łańcuch główny aminokwascwegc kwasu nukleinowego przy końcu 3’, jak i przy końcu 5’. Wstępne badania wykazały, ze zmodyfikowane oligonuklectydy tworzą, dupleks z ich komplementarnymi sekwencjami RNA i DNA podobnie jak niezmodyfikowaoe cligcoskleotydy.

Przykład 33

Odporność na nukleazę.

Naturalne, fosforotioanowe i zmodyfikowane oligonukleotydy według wynalazku poddaje się ocenie ze względu na ich odpomośćna nukleazy surowicy przez inkubację oligonus kleotydów w pożywkach zawierających różne stężenia surowicy płodu cielęcego lub surowicy dojrzałego człowieka. Znaczone oligonukleotydy są inkubowane przez różne okresy czasu, poddawane działaniu proteazy K, a następnie analizowane za pomocą elektroforezy żelowej na żelach denaturujących poliakrylamid-mocznik i następnie autoradiografię lub zobrazowanie za pomocą fosforu. Autoradiogramy ujmuje się ilościowo za pomocą densytometrii laserowej. W oparciu o umiejscowienie modyfikacji i znaną długość obgcnukleotydu jest możliwe określenie wpływu poszczególnej modyfikacji na degradację nukleazy. W przypadku nukleaz cyaoplazmiczoycy stosuje się linię komórkową HL60. Postmitochondrialną ciecz sklarowaną wytwarza się przez odwirowanie różnicowe i znaczone oligonukleotydy są inkubowane w tej cieczy sklarowanej przez różne okresy czasu. Po inkubacji, oligonuklzoaydy poddaje się ocenie ze względu na degradację jak zaznaczono wyżej dla degradacji oskleoliayczoej z surowicy. Wyniki autoradiografii ujmuje się ilościowo dla porów nania niezmodyfikowanych tzn. fcsfooticancwycy i zmodyfikowanych oligcosιkleoaydów.

Wstępne badania cligonukleotydów zmodyfikowanych aminokwasami wykazały, ze są one odporne na fcsfodiesazrazę jadu żmiji.

Załączenie odsyłaczy

Wszystkie opisy patentowe, zgłoszenia patentowe i publikacje cytowane są załączone do oinizjtzego zgłoszenia jako odsyłacze.

Równoważniki

Powyższy pisemny opis jest wystarczający dla umożliwienia praktykowania wynalazku specjaliście z dziedziny techniki. W istocie różne modyfikacje dla wykonania wynalazku są oczywiste dla specjalisty w dziedzinie biologii molekularnej, chemii organicznej lub pokrewnych dziedzin i są włączone do zakresu ochrony następujących zastrzeżeń.

Claims (7)

1. Związek o wzorze 1 /

A

Wzór 1 w którym

X oznacza grupę CH2OH;

Y oznacza grupę tymina-(CH2) n-, w której n oznacza 1;

A oznacza grupę karbonylową lub CH2;

Z oznacza atom wodoru lub grupę CH2L, gdzie L wybiera się z grupy składającej się z COOH, CHCOOH, CHCH2COOH, NH2, CHNH2, L1-NH-L2-B lub CH-L1-NH-L2-B, w której B oznacza atom wodoru lub zasadę nukleozydową, a Lii L2 niezależnie oznaczają (CH2),,, lub (CH2)_nCO gdzie n= 0, 1, 2 lub 3

W oznacza grupę CH2OH;

N oznacza atom azotu lub grupę CH; przy czym gdy Z oznacza CH2L, L łączy się z W tworząc pierścień.

2. Oligonukleotyd stanowiący spolimeryzowany związek o wzorze 1 jak określony w zastrzeżeniu 1, w którym wewnątrznukleotydowe wiązania występują pomiędzy W i X albo W i Y albo L i A.

3. Oligonukleotyd według zastrz. 2, w którym wewnątrznukleotydowe wiązanie stanowi fosfodiester.

4. Oligonukleotyd według zastrz. 2, w którym wewnątrznukleotydowe wiązanie stanowi fosforotioan.

5. Oligonukleotyd według zastrz. 2, w którym wewnątrznukleotydowe wiązanie stanowi fosforoamidan.

6. Oligonukleotyd według zastrz. 2, w którym wewnątrznukleotydowe wiązanie stanowi hydroksamat.

7. Oligonukleotyd według zastrz. 2, w którym co najmniej jeden monomer stanowi związek o wzorze 1, w przypadku gdy L łączy się z W, a maksymalnie 50 monomerów wybiera się z T- dezoksyrybonukleozydu, rybonukleozydu i 2’- metylorybonukleozydu.