DE3650699T2

DE3650699T2 - Immunotestmittel für Polynukleotid und Verfahren

Info

Publication number: DE3650699T2
Application number: DE3650699T
Authority: DE
Inventors: James Corvallis Or 97333 Summerton
Original assignee: Antivirals Inc
Current assignee: Sarepta Therapeutics Inc
Priority date: 1985-03-15
Filing date: 1986-03-14
Publication date: 1999-04-15
Anticipated expiration: 2006-03-15
Also published as: EP0215942B1; DE3650699D1; EP0639582A2; JP2528107B2; JPH08193998A; AU5698186A; ATE81872T1; AU5661386A; CA1268404A; US5142047A; ATE124999T1; JPS62502357A; DE3650349D1; JP2670434B2; DE3650349T2; JP3022967B2; EP0216860A4; WO1986005519A1; EP0216860B1; ATE171185T1

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polynukleotidpolymer, das aus Morpholino-Untereinheiten aufgebaut ist, und dessen Herstellungsverfahren und Anwendung.

2. Hintergrund

Zwei allgemeine Typen von Polynukleotid-Diagnosesystemen, beide basierend auf der Hybridisierung zwischen komplementären Segmenten einer Polynukleotidsonde und eines einzelsträngigen Polynukleotidanalyten, sind entwickelt worden. Bei dem ersten Typ wird der Polynukleotidanalyt einzelsträngig gemacht und an einen festen Träger, wie einen Nitrozellulose-Filter, fixiert. Der Träger wird dann, unter Aneinanderlagerungs- bzw. Annealing- Bedingungen für komplementäre Stränge, mit einer Reporter-markierten Sonde reagieren gelassen, welche komplementär zu einer Zielbasen-Sequenzregion des Analyten ist. Nach mehrmaligem Waschen, um nicht gebundene Sonde zu entfernen, wird der feste Träger hinsichtlich der Gegenwart des Reporters analysiert. Dieses System ist nicht vollständig zufriedenstellend gewesen, insbesondere in klinischen Situationen, wo Einfachheit und Empfindlichkeit eines Assays erforderlich sind. Das bei der Fixierung von einzelsträngigem Polynukleotidmaterial an den festen Träger verwendete Verfahren ist einigermaßen verwickelt und zeitraubend. Die Empfindlichkeit des Systems ist beschränkt, weil im Regelfall jedes Analytmolekül mit einem einzelnen Sondenmolekül hybridisiert und jede Sonde im allgemeinen ungefähr einhundert Reporterreste enthält.
Ein zweiter Typ von Polynukleotid-Diagnosesystem beinhaltet zwei Analyt-spezifische Sonden, welche jeweils zu einer distinkten Region des Analyten-Polynukleotides komplementär sind. Die erste Sonde ist an einen festen Träger verknüpft, und die zweite Sonde befindet sich frei in Lösung und trägt mehrere Reportermoleküle. In der Praxis wird der Analyt mit den zwei Sonden unter Bedingungen gemischt, welche das Annealing von komplementären Polynukleotidsträngen zulassen, einschließlich des Annealings sowohl der immobilisierten als auch der reportertragenden Sonden an den Polynukleotidanalyten, um den Reporter vermittels des Analyten an den festen Träger anzuheften.
Obwohl das Doppel-Sonden-System das Problem, daß man das Testnukleinsäurematerial an einen festen Träger fixieren muß, vermeidet, besitzt das Verfahren nichtsdestotrotz eine Anzahl von Beschränkungen. Wenn die Testnukleinsäure aus doppelsträngiger Nukleinsäure abgeleitet ist, wie es häufig der Fall ist, kompetitiert, erstens, die Hybridisierung zwischen dem Analyten- Polynukleotid und dessen komplementären Strang mit der Hybridisierung zwischen dem Analyten und den zwei Sonden. Da das Zwei-Sonden-System auf einer Kinetik höherer Ordnung beruht, als dies der Fall für Einzel-Sonden-Systeme ist, ist es ferner inhärent langsamer als ein Einzel-Sonden-System. Auch die Notwendigkeit für zwei verschiedene Sonden steigert die Kosten des Systems. Im Bezug auf die Testempfindlichkeit, schließlich, leidet das Doppel-Sonden-System unter der gleichen Beschränkung, wie das obenstehend erwähnte Einzel-Sonden-System -- jedes Analyten-Polynukleotid bindet nur eine "Reporter"-Sonde.

3. Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein allgemeines Ziel der Erfindung, zur Verwendung beim Nachweis eines Polynukleotids, eine Morpholino-Polymeruntereinheit und ein aus der Untereinheit aufgebautes Polymer bereitzustellen, welche die obenstehend erörterten Probleme und Einschränkungen, die mit dem Stand der Technik assoziiert sind, im wesentlichen überwinden.
In spezifischer Weise, stellt die vorliegende Erfindung eine Morpholino-Untereinheit der Formel (I)
bereit, worin P ein Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest ist und T H oder eine N-Schutzgruppe ist, zur Verwendung bei der Herstellung eines Polymeren, das zur Wasserstoffbrückenbindung an komplementäre Basen in einem Polynukleotid in der Lage ist, wobei in dem Polymer (i) die Untereinheiten vornehmlich durch im wesentlichen ungeladene, achirale Verknüpfungen verbunden sind und (ii) jede Verknüpfung den Morpholino-Stickstoff einer Untereinheit an den 5'-exocyclischen Kohlenstoff einer angrenzenden Untereinheit bindet.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist der Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest P folgendes:
worin X F, Cl, Br oder I ist.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Polymer bereit, umfassend Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsreste, wobei das Polymer zur Wasserstoffbrückenbindung an komplementäre Basen in einem Polynukleotid in der Lage ist, und das Polymer Morpholino- Untereinheiten der folgenden Formel enthält:
worin P der Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest ist und die Untereinheiten vornehmlich durch im wesentlichen ungeladene, achirale Verknüpfungen verbunden sind.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist das Polymer aus Morpholino-Untereinheiten aufgebaut, wobei der Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest, P, wie obenstehend definiert beschaffen ist.
In einer anderen Ausführungsform enthält das Polymer Morpholino-Untereinheiten, in denen P ein N-geschütztes, exocyclisches Amin enthält.
In noch einer anderen Ausführungsform ist das Polymer der Erfindung aus Morpholino- Untereinheiten aufgebaut, welche durch ungeladene, achirale C(X)-Verknüpfungen verbunden sind, worin X O oder S. oder -NH-E- ist, worin die Gruppe E an dem 5'-exocyclischen Kohlenstoffatom der Untereinheit gebunden ist und C(O) oder S(O)&sub2; ist.
Alternativ dazu kann das Polymer ferner einen Rest an einem oder an beiden Enden einschließen, welcher wirksam ist, um die Löslichkeit des Polymeren in wäßrigem Medium zu steigern. In einer spezifischen Ausführungsform ist der endständige Rest Polyethylenglykol. Das Polymer der Erfindung ist typischerweise aus mindestens 3 Morpholino-Untereinheiten aufgebaut.
In einer spezifischen Ausführungsform ist mindestens einer der Polymer-Basenpaarungsreste P ein 2,6-Diaminopurin. In einer alternativen Ausführungsform ist mindestens einer der Polymer- Basenpaarungsreste P ein 5-Halogenuracil.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform sind mindestens 70% der Polymer-Basenpaarungsreste P 2-Amino-haltige Purine.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polymeren bereit, welches das Koppeln einzelner Untereinheiten in kontrollierter, sequentieller Weise an den nicht geschützten Stickstoff einer Polymerzusammensetzung, umfassend zwei oder mehr verknüpfte Morpholino-Untereinheiten, umfaßt.
Diese und andere Ziele und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden vollständiger offensichtlich werden, wenn die nachfolgende ausführliche Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den begleitenden Figuren gelesen wird.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1 zeigt bevorzugte Purin- und Pyrimidinstrukturen, welche bei der Bildung von Polymermolekülen der Erfindung verwendet werden;
Die Fig. 2 zeigt bevorzugte Purin-ähnliche und Pyrimidin-ähnliche Erkennungsreste, welche bei der Bildung der Polymermoleküle verwendet werden;
Die Fig. 3 zeigt bevorzugte cyclische Gerüstreste, welche bei der Bildung der Polymermoleküle verwendet werden,
Die Fig. 4 und 5 veranschaulichen zwei bevorzugte Untereinheit-Zusammenbauschemen zur Kopplung von N&sub1;- - -N&sub2;-Typ-Untereinheit-Gerüsten;
Die Fig. 6 zeigt die Gerüststrukturen von den Untereinheitdimeren A-A bis D-D, welche gemäß den in Fig. 5A und 5B veranschaulichten Verfahren gebildet wurden, und zwei cyclische Gerüststrukturen, welche gemäß den in Fig. 7A und 7B veranschaulichten Verfahren gebildet wurden;
Die Fig. 7A-7C veranschaulichen drei bevorzugte Untereinheit-Zusammenbauschemen zur Kopplung von N&sub1;- - -E-Typ-Untereinheit-Gerüsten; und
die Fig. 8 zeigt bevorzugte acyclische Gerüststrukturen von Untereinheit-Dimeren, welche gemäß den in den Fig. 7A-7C veranschaulichten Verfahren gebildet wurden; und
die Fig. 9 zeigt die Synthese eines Tetranukleotidanalogs mit Methylphosphonat- Gerüstverknüpfungen im Wechsel mit einer Phosphotriester-Verknüpfung;
Die Fig. 10 veranschaulicht Reaktionen zum Anheften von Abstandshalter- bzw. Spacer- Arm-Molekülen an einen festen Träger;
Die Fig. 11 zeigt ein generelles Verfahren zur Synthese von Polyaminen aus N-Methyl- Aminosäuren,
Die Fig. 12 zeigt ein Verfahren zur Synthese von Polyaminen mit einer endständigen primären Aminogruppe;
Die Fig. 13 zeigt die Herstellung des kationischen quarternären Ammonium-Schwanzes mit einer endständigen primären Aminogruppe;
Die Fig. 14 veranschaulicht eine Reaktion zur Herstellung eines mehrfach geladenen enzymatischen Reporters gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
Die Fig. 15 veranschaulicht eine Reaktion zur Herstellung eines fluoreszenten zweifach geladenen Reporters gemäß einer Ausführungsform der Erfindung; und
die Fig. 16 veranschaulicht verschiedene bei dem diagnostischen System und Verfahren der Erfindung beteiligte Komponenten.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das diagnostische System der Erfindung beinhaltet ein festes Träger-Reagenz, das aus einem festen Träger besteht, welcher eine Vielzahl von Nukleotid-bindenden Polymermolekülen trägt. Die polymere Zusammensetzung der Erfindung ist ausgelegt, um mit einer selektierten Bindungsaffinität an ein Polynukleotid, welches eine Zielsequenz von Basen enthält, zu binden. Die Zusammensetzung besteht aus nicht-homopolymeren, im wesentlichen stereoregulären Molekülen oder Spezies der Form:
worin B-Ri eine Reihe von basenspezifischen Untereinheiten sind, welche eine Gerüstgruppe B und einen Erkennungsrest Ri enthalten, der gewählt ist, um durch Watson/Crick-Basenpaarung an eine entsprechende in der Sequenz befindliche Base in der Zielsequenz spezifisch zu binden, und die Untereinheiten über ihre Gerüstreste durch vornehmlich achirale, im wesentlichen ungeladene Bindungen verknüpft sind. Der Entwurf und die Auswahl von geeigneten Untereinheiten zur Verwendung beim Konstruieren der Polymerspezies wird im nachstehenden Abschnitt I beschrieben werden. Verfahren zum Koppeln von Untereinheiten über achirale Verknüpfungen sind im Abschnitt III beschrieben, wobei die Untereinheit-Schutzgruppen- Strategien, welche bei der Untereinheitsynthese beteiligt sind, im Abschnitt II erörtert werden.
Die Polymerspezies werden durch sequenzielles Koppeln von Untereinheiten synthetisiert, um Polymermoleküle einer gewählten Länge und Sequenz zu bilden. Wie im Abschnitt IV beschrieben werden wird, wird die Länge der Zielsequenz und Polymersequenz gewählt, um eine gewünschte Bindungsspezifität zu erzielen. Die Bindungsaffinität des Polymeren für das Ziel kann selektiv durch mehrere Strategien, welche im Abschnitt IV erörtert werden, variiert werden, einschließlich der Wahl von Erkennungsresten, welche in der Lage sind, entweder drei (für größere Bindungsaffinität) oder zwei (für weniger Affinität) Basenpaarungs-Wasserstoffbrückenbindungen mit der entsprechenden Zielbase zu bilden. Die resultierende Zusammensetzung enthält Polymerspezies oder Moleküle, von denen alle im wesentlichen die gleiche Sequenz von Untereinheiten und im wesentlichen die gleiche Sequenz von Verknüpfungstypen zwischen den Untereinheiten aufweisen. In funktioneller Hinsicht haben alle der Polymerspezies im wesentlichen die gleiche Bindungsaffinität für das Zielpolynukleotid. Verfahren für den Zusammenbau des Polymeren, sobald eine gewünschte Untereinheit- Sequenz gewählt ist, sind im Abschnitt V angegeben.
Die Polymerzusammensetzung ist nützlich in einem neuen Festphasen-Diagnosesystem, welches in Abschnitt VI-VII beschrieben ist. Dieses System beruht auf der Bindung von Analyt-Polynukleotidmolekülen an trägergebundene Polymermoleküle und anschließender elektrostatischer Anheftung von mehreren polykationischen Reportermolekülen an das Polynukleotid, um ein verstärktes Reportersignal für jedes gebundene Analytmolekül zu ergeben.

I. Untereinheit-Struktur

A. Der Erkennungsrest

Der Entwurf der Untereinheiten B-Ri, welche zur Verwendung bei der Bildung der Polymerspezies der Erfindung geeignet sind, beinhaltet eine Anzahl von strukturellen und/oder stereochemischen Kriterien, welche sowohl von den Gerüst- als auch Erkennungsresten und von der Verknüpfung zwischen den zweien erfüllt werden müssen. Die Entwurfsanforderung an den Erkennungsrest wird zuerst betrachtet.
Der Erkennungsrest jeder Untereinheit muß zwei oder drei Wasserstoffbrücken-bildende Gruppen bereitstellen, welche in einer unzweideutigen Konfiguration gehalten werden, die für Wasserstoffbrückenbindung an zwei oder drei der Watson/Crick-Wasserstoflbrückenbindungs- Stellen auf einer spezifizierten in einer Sequenz befindlichen Base der genetischen Zielsequenz angepaßt ist. Um eine unerwünschte Fehlpaarung zwischen dem Erkennungsrest und seiner entsprechenden Zielbase, unter den Anwendungsbedingungen, zu vermeiden, sollte (1) der tautomere Zustand des Erkennungsrestes relativ stabil sind, und (2) sollte der Erkennungsrest eine Struktur aufweisen, welche eine verhältnismäßig starre Anordnung der Wasserstoff brückenbindungs-Gruppen vorsieht. Eine derartige Starrheit wird ani besten durch eine Ringstruktur gewährt, bei welcher die polaren Wasserstoffbrückenbindungs-Gruppen entweder einen Teil des Rings bilden oder direkt an dem Ring angeheftet sind.
Die bevorzugten Erkennungsrest-Strukturen schließen Purin-, Purin-ähnliche, Pyrimidin- und Pyrimidin-ähnliche Strukturen ein, welche ausgelegt sind, um Watson/Crick-Basenpaarung, entweder über zwei oder drei Wasserstoffbrückenbindungen, mit ausgewählten Polynukleotidbasen zu bilden. Die bei der Polymersynthese verwendete Gruppe von Untereinheiten schließt mindestens zwei Erkennungsreste ein, welche basenspezifisch für verschiedene Polynukleotidbasen sind, und bevorzugt einen oder mehrere Erkennungsreste für jede der vier Basen in einem natürlichen DNA- oder RNA-Polynukleotid. Auch ist es, wie nachstehend ersichtlich wird, wünschenswert, eine Gruppe von Erkennungsresten, Ri, welche fähig zur Basenpaarung mit Nukleotidbasen über zwei Wasserstoffbrücken sind, und eine zweite Gruppe, Rj, welche fähig zur Bindung mit denselben Basen über drei Wasserstoffbrücken ist, vorzusehen. Die Fig. 1 zeigt exemplarische Erkennungsreste vom Purin- und Pyrimidin-Typ. Die Purinstrukturen 1 und 2 sind entworfen, um an Thymin- oder Uracil-Basen zu binden, die Strukturen 3-6, an Guanin-Basen, Strukturen 7-9, an Cytosin-Basen, und die Strukturen 10-12 an Adenin-Basen. Die Strukturen 1, 4, 5, 6, 8 und 10-12 sind Reste vom Ri-Typ, welche ausgelegt sind, um an entsprechende in einer Sequenz befindliche Basen über zwei Wasserstoffbrücken zu binden, und die restlichen Strukturen sind Reste vom Rj-Typ, welche drei Wasserstoffbrücken bei der Basenpaarung bilden. Wie nachstehend ersichtlich wird, sind Purin- und Pyrimidin-Nukleoside beim Synthetisieren einer Vielzahl von anderen Untereinheiten nützlich, welche geeignet zur Verwendung bei der Polymersynthese sind. Diese Untereinheiten können, falls notwendig modifiziert mit Amin-Schutzgruppen, aus handelsüblichen Quellen erhalten oder gemäß bekannten Verfahren, wie denjenigen, welche im Beispiel 1 beschrieben oder zitiert sind, hergestellt werden.
Eine Anzahl von Purin-ähnlichen oder Pyrimidin-ähnlichen Strukturen, in welchen der Erkennungsrest über ein Ring-Kohlenstoffatom an das Grundgerüst gebunden ist, wird in der Fig. 2 gezeigt. Diese Strukturen besitzen Basenpaarungs-Spezifitäten und Wasserstoff brückenbindungs-Eigenschaften, wie jene der in Fig. 1 gezeigten analogen Strukturen. Obwohl die Bindungseigenschaften eines Polymeren, welches einen Kohlenstoff gebundenen Erkennungsrest enthält, nicht signifikant unterschiedlich von denjenigen eines Polymeren sein müssen, dessen Erkennungsreste Stickstoff gebunden sind, wie in Fig. 1, erfordern Untereinheiten, welche die Kohlenstoff gebundenen Reste beinhalten, im allgemeinen einen größeren Syntheseaufwand, als dies bei Untereinheiten der Fall ist, welche vorgeformte Purine und Pyrimidine enthalten.

B. Der Grundgerüstrest

Der Grundgerüstrest jeder Untereinheit besitzt die allgemeine Formel N&sub1;- - -E oder N&sub1;- - -N&sub2;, worin N&sub1; und N&sub2; nukleophile Gruppen sind und E eine elektrophile Gruppe ist. Basierend auf der Einfachheit des Untereinheit-Koppelns und der erforderten Stabilität der resultierenden Verknüpfung zwischen den Untereinheiten, wie nachstehend erörtert, sind die bevorzugten nukleophilen Gruppen Amino, Hydroxyl und Hydrazino; und die bevorzugten elektrophilen Gruppen, und/oder elektrophilen Verknüpfungsmittel, sind Derivate von Kohlen-, Thiokohlen-, Carbon- und Sulfonsäuren.
Grundgerustreste können entweder eine cyclische oder eine acyclische Struktur aufweisen. Während die Gesamtanzahl von möglichen Gerüstrest-Strukturen sehr groß ist, ist nichtsdestoweniger wegen einer Anzahl von Faktoren lediglich eine ziemlich beschränkte Anzahl von Strukturen von tatsächlichem praktischen Wert. Das anfängliche Verfahren, durch das vielversprechende Grundgerüstreste ausgewählt wurden, war wie folgend beschaffen.
Als eine erste Bedingung; wurden nur die cyclischen Gerüstreste in Betracht gezogen, welche aus Desoxyribose oder Ribose bestanden oder daraus leicht abgeleitet werden konnten. Dies ist eine praktische Einschränkung und reflektiert die Schwierigkeit und den entsprechend größeren Aufwand einer de novo-Synthese von Ringstrukturen mit mehreren chiralen Zentren. Im allgemeinen wurden prospektive Gerüstreste und Verknüpfungen zwischen Untereinheiten, von denen erwartet wurde, für Polymere geeignet zu sein, auf der Grundlage von einem oder mehreren der folgenden Faktoren gewählt: Durchführbarkeit der Synthese auf Grundlage von bekannten Reaktionen; Erwartete Einfachheit der Synthese aus verfügbaren Ausgangsmaterialien; Einfachkeit der Struktur; und erwartete Stabilität des letztendlichen Grundgerüsts.
Das anfängliche Screening von vielversprechenden Gerüstresten und Verknüpfungen zwischen Untereinheiten wurde wie folgend durchgeführt. Raumfüllende CPK-Molekülmodelle von doppelsträngiger DNA und RNA wurden gemäß Parametern konstruiert, welche mittels Röntgenstrahlenbeugung von Oligodesoxyribonukleotiden in der B-Form und Oligonukleotiden in der A-Form ermittelt worden waren. In jedem von diesen konstruierten Doppelsträngen wurde eines der zwei Zucker-Phosphat-Grundgerüste entfernt. Als nächstes wurde jedes prospektive Grundgerüst angebracht, falls möglich, an die Stellen auf den Basen, von denen das ursprüngliche Zucker-Phosphat-Grundgerüst entfernt worden war. Jeder resultierende Polynukleotid/Polymer-Doppelstrang wurde dann hinsichtlich der Coplanarität der Watson/- Crick-Basenpaare, Torsions- und Winkelspannung in dem prospektiven Polymergrundgerüst, dem Grad an Verdrillung, welcher auf den Nukleinsäurestrang vermittelt wird, und Nichtbindungs-Wechselwirkungen zwischen Strängen und innerhalb von Strängen untersucht. Besondere Aufmerksamkeit wurde darauf verwandt, ob jedes amidhaltige Grundgerüst ohne weiteres eine Konformation, in welcher dessen Amidreste planar waren, einnehmen konnte, oder nicht. Dies ist wichtig wegen der wesentlichen Energiekosten, die erfordert werden, um ein Amid in eine nicht-planare Konformation zu zwingen.
Diese anfänglichen Untersuchungen verifizierten, daß die erforderliche Gerüst-Einheitslänge (d. h. der N&sub1;- - -E-Abstand in einer N&sub1;- - -E- oder aktivierten N&sub1;- - -N&sub2;-E-Untereinheit) 5-7 Atome für Gerüstreste beträgt, welche Desoxyribose oder Ribose (cyclische Gerüststrukturen) aufbauen oder davon abgeleitet sind, wobei eine Länge von 6 Atomen optimal ist.
In den obenstehenden Modellbau-Untersuchungen als annehmbar beurteilte Untereinheitstrukturen wurden danach auf die Durchführbarkeit einer Synthese (auf der Grundlage von Schlüsselsynthesereaktionen, über die in der Literatur berichtet wurde, oder an Modellverbindungen durchgeführten Reaktionen und/oder über tatsächliche Synthese der Untereinheiten) und Stabilität des zusammengebauten Polymergerüsts geprüft (vorläufige Stabilitätsuntersuchungen wurden im allgemeinen mit geeignet verknüpften Modell-Verbindungen oder -Untereinheitdimeren durchgeführt). Diese Typen von Untersuchungen wurden verwendet, um die Anzahl von Kandidaten-Gerüststrukturen weiter einzuschränken. Aus diesem eingeschränkten Kandidatenpool wurden die in der Fig. 3 gezeigten cyclischen Gerüststrukturen A-G letztendlich als bevorzugte Strukturen ausgewählt.
In dieser Figur schließen die Untereinheiten A-D, die cyclische Gerüstreste vom N&sub1;- - -N&sub2;-Typ enthalten, folgendes ein:
2'-Desoxyribonukleoside (Struktur A);
2'-Desoxyribonukleoside, welche an den 5'- und 3'-Positionen mit einer Aminogruppe substituiert sind (Strukturen B bzw. C); und Morpholino-Derivate von Ribonukleosiden (Struktur D). Gerüstreste vom N&sub1;- - -E-Typ enthaltende Untereinheiten schließen 2'-Desoxy ribonukleoside, welche an ihren 5'-Positionen mit ein- und zwei Kohlenstoffe tragenden Säuren substituiert sind (Strukturen E bzw. F); und N-Aminomorpholinoderivate von Ribonukleosiden, welche an ihren 5'-Positionen mit Carbonsäure (Struktur G) oder Sulfonsäure (Struktur H) substituiert sind, ein.
Es sollte jedoch erwähnt werden, daß eine Anzahl von anderen Grundgerüstresten ebenfalls vollständig ausführbar und geeignet ist - - obwohl sie im allgemeinen nicht so einfach und/oder kostengünstig zu synthetisieren sind.

C. Grundgerüst-/Erkennungs-Rest-Verknüpfung

Wie obenstehend angegeben, muß die Verknüpfung oder der Spacer, welche(r) die Gerüst- und Erkennungsreste in der Polymeruntereinheit verbindet, gewissen Entwurfskriterien genügen, welche wirksam sind, um die Erkennungsreste für die Basenpaar-Bindung an die Polynukleotidbasen in Position zu bringen. Im Falle der in Fig. 3 gezeigten cyclischen Gerüstreste zeigen Modellbau-Untersuchungen, daß die günstigste Bindungskonformation in dem Polymer auftritt, wenn der Erkennungsrest direkt an das 1'-Kohlenstoffatom der Ribose oder Ribose-ähnlichen Strukturen, und an die analoge 1'-Position der Morpholinostrukturen, angeheftet ist. Das heißt, der Rest ist an einem normalen Anheftungspunkt und mit der normalen stereoisomeren Konfiguration von Purin- oder Pyrimidinbasen an die Ribose- oder Desoxyribosegruppen von Nukleosiden angeheftet.
Um eine stereoreguläre Polymerkonfiguration zu erzielen, welche für eine gleichmäßige Bindungsaffinität der Polymermoleküle an ein Polynukleotidziel erforderlich ist, ist es ebenfalls notwendig, daß alle der Gerüst/Erkennungsrest-Verknüpfungen entweder von einer definierten Chiralität oder achiral sind. Aus Zwecken der Definition werden hierin die Verknüpfungen als von einer definierten Chiralität angesehen, wenn jede der Verknüpfungen in jeglicher gegebenen Untereinheitposition in allen der Polymermoleküle die gleiche stereoisomere Konfiguration oder Chiralität aufweist. Das heißt, obwohl die Untereinheiten in unterschiedlichen Sequenzpositionen unterschiedliche interne stereoisomere Konfigurationen (einschließlich Achiralität an spezifischen Sequenzpositionen) aufweisen können, haben alle der Verknüpfungen an einer gegebenen Sequenzposition unter den Polymermolekülen die gleiche stereoisomere Konfiguration. Gewöhnlicherweise wird eine definierte Chiralität am leichtesten durch Verwenden der gleichen stereoisomeren Konfiguration in allen der Untereinheiten erzielt.
Für die cyclischen Gerüstreste tritt die günstigste Bindung in Nukleosidanalogen auf, welche die natürliche D-stereoisomere Konfiguration besitzen, wie gezeigt in Fig. 3. Untereinheiten dieses Typs werden, wie nachstehend erörtert wird, auch leicht unter Verwendung von natürlichem D-Nukleosidausgangsmaterial synthetisiert.

II. Schutzgruppenstrategien

Wegen der ziemlich hohen Reaktivität der zur Aktivierung und/oder Kopplung der Untereinheiten verwendeten Verbindungen ist es im allgemeinen wünschenwert, und häufig notwendig, die exocyclischen Ring-Stickstoffatome der Erkennungsreste zu schützen. Die Auswahl dieser Schutzgruppen wird hauptsächlich durch den Typ von Verknüpfung zwischen den Untereinheiten, welcher in dem aus diesen Untereinheiten zusammengebauten Polymer verwendet werden soll, bestimmt, und in zweiter Linie von der relativen Reaktivität des zu schützenden Stickstoffatoms bestimmt.
Basen-geschützte Nukleoside sind auch nützliche Startreagenzien in einer Anzahl der Untereinheit-Synthesereaktionen, welche nachstehend beschrieben werden sollen. Verfahren zum Basen-schützen einer Anzahl der gewöhnlicheren Ribo- und Desoxynukleoside aus Beispiel 1 sind im Beispiel 2 veranschaulicht. Die in dem Beispiel ausführlich angegebenen Verfahren sind allgemein für die Bildung von Nukleosiden mit Amin-Schutzgruppen anwendbar.
Wenn die zu verwendende Verknüpfung zwischen den Untereinheiten verhältnismäßig stabil gegenüber Nukleophilen, und insbesondere gegenüber Ammoniumhydroxid, ist, dann sind die fiür Nukleinsäurechemie verwendeten Standard-Basenschutzgruppen geeignet. Derartige Nukleophil-unempfindliche Zwischen-Untereinheit-Verknüpfungen schließen Carbamat-, Amid- und Sulfonamidbindungen ein. Die entsprechenden Nukleophil-empfindlichen Schutzgruppen für die Erkennungsreste schließen ein: Benzoyl für das N4 von C; Benzoyl oder p-Nitrobenzoyl für das N6 von A; Acetyl oder Isobutyryl für das N2 von G; und N2,N6-Bisisobutyryl für 2,6-Diaminopurin-Reste. Die Entfernung dieser Gruppen nach Vervollständigung des Polymerzusammenbaus wird durch Behandlung mit Ammoniumhydroxid bewirkt.
Wenn, im Gegensatz dazu, die Verknüpfung zwischen den Untereinheiten, welche verwendet werden soll, gegenüber Nukleophilen, wie Ammoniumhydroxid, empfindlich ist, sind geeignete Schutzgruppen diejenigen, welche durch starke nicht-nukleophile Basen - über einen β-Eliminierungsmechanismus - entfernt werden können. Derartige Nukleophil-empfindliche Verknüpfungen zwischen Untereinheiten schließen ein: Carbonat-, Ester- und, zu einem geringeren Ausmaß, Thiocarbamat-Bindungen. Geeignete Schutzgruppen für die Erkennungsreste, welche über eine β-Elimination entfernbar sind, schließen ein: 2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl oder 2-(Phenylsulfonyl)ethoxycarbonyl für sowohl das N4 von C als auch das N6 von A; und 9-Fluorenylmethoxycarbonyl für das N2 von G und das N2 und N6 von 2,6-Diaminopurinresten. Die Entfernung dieser Gruppen nach Vervollständigung des Polymerzusammenbaus wird durch Behandlung mit der starken nicht-nukleophilen Base 1,8-Diazabicyclo[5,4,0]- undec-7-en (DBU) unter streng wasserfreien Bedingungen bewirkt.
Im Hinblick auf das zeitweilige Schützen eines Nukleophils des Grundgerüstrestes (im allgemeinen N1 in den obenstehenden Strukturen) verwendet die allgemeine Polymeraufbaustrategie ausgewählte Gerüst-Schutzgruppen, welche ohne weiteres durch milde Säure beseitigt werden. Ein hauptsächliches Kriterium für die Wahl von Schutzgruppen besteht darin, daß sie angemessen stabil sind, aber nicht so stabil, daß die für ihre Entfernung erforderlichen Bedingungen das wachsende Polymer beschädigen würden. Ein prinzipielles Problem im Falle von aus cyclischen Gerüstresten zusammengebauten Polymeren ist die besondere Säureempfindlichkeit der glykosidischen Bindung, welche geschützte Purinreste an das C1 von ihren Gerüstresten verknüpft. Ein zweitrangiges Kriterium für die Auswahl der Gerüst-Schutzgruppe besteht darin, daß sie leicht einzuführen ist. Basierend auf dem obengenannten werden die folgenden Gerüst-Schutzgruppen bevorzugt: für primäre Hydroxyle die Di(p-methoxy)- tritylgruppe; für primäre Amine p-Methoxytrityl; und für ein sekundäres Amin (wie in Gerüstresten vom Morpholino-Typ) die Phenylisopropoxycarbonyl-Gruppe. Diese Schutzgruppen können ohne weiteres durch Behandlung mit 0,2 M Dichloressigsäure in Dichlormethan entfernt werden.

III. Untereinheitsynthese

A. Cyclische Grundgerüstreste

Die Synthese der Untereinheitderivate vom Morpholino-Typ, repräsentiert durch Struktur D in Fig. 3, ist für eine Vielzahl von verschiedenen Erkennungsresten im Beispiel 3 ausführlich angegeben. Kurz gesagt, wird ein ausgewähltes Nukleosid, basengeschützt falls notwendig, in einem Ammoniumsalz, wie Ammoniumbiborat, gelöst und danach mit Natriumperiodat umgesetzt, um vorübergehende 2',3'-Dialdehyde zu bilden, welche sich dann auf ein Ammoniumion hin schließen, um einen Morpholino-Ring mit 2'- und 4'-Hydroxylen zu bilden. Die Verbindung wird dann mit Natriumcyanoborhydrid behandelt, um die Ring-Hydroxyle zu entfernen. Das Ring-Stickstoffatom ist vorzugsweise als ein 2-Phenylisopropylcarbamat für die anschließende Untereinheiten-Kopplung geschützt. Die Stereochemie des Nukleosid-Ausgangsmaterials wird beibehalten.

III. Gerüst-Kopplungsreaktionen

Die bei der Bildung der Polymermoleküle der Erfindung verwendeten Kopplungsreaktionen sind schrittweise Reaktionen, welche eine gewählte Untereinheit oder Untereinheitsequenz an eine andere gewählte Untereinheit oder Untereinheitsequenz knüpfen. Für die Zwecke der vorliegenden Erörterung werden die Kopplungsreaktionen im allgemeinen im Hinblick auf die Kopplung einer einzelnen Untereinheit B-R&sub1;, welche einen ausgewählten Erkennungsrest R&sub1; besitzt, an eine andere einzelne Untereinheit B-R&sub2;, welche den gleichen oder einen unterschiedlichen ausgewählten Erkennungsrest R&sub2; besitzt, um ein Dimer der Form
zu bilden, worin R&sub1; und R&sub2; die gezeigte spezifische Sequenz haben, beschrieben werden.

A. Untereinheitkopplung: N&sub1;- - -N&sub2;-Gerüstkonfigurationen

Allgemeine Verfahren zur Kopplung von Untereinheiten mit einer N&sub1;- - - - - - --N&sub2;-Gerüstkonfiguration sind in den Fig. 4 und 5 veranschaulicht. Wie man sich aus dem obenstehenden Abschnitt I erinnern wird, sind N&sub1; und N&sub2; nukleophile Gerüstgruppen, wie Hydroxyl- und Amingruppen, welche mit einem Elektrophil E aktiviert werden können, um eine aktivierte N&sub1;- E- oder N&sub2;-E-Gerüstgruppe zu bilden, welche dann mit einem zweiten Gerüstrest vom N&sub1;- - - N&sub2;-Typ reagieren kann, um ein verknüpftes N&sub1;- - - -N&sub2;-E-N&sub1;- - - -N&sub2;-Gerüst-Dimer zu bilden. Die Untereinheit-Gerüste dieses Typs, welche obenstehend spezifisch beschrieben worden sind, sind die cyclischen Gerüststrukturen A-D in der Fig. 3. In den Strukturen A und B ist das aktivierte N&sub2;-Nukleophil die 3'-Hydroxylgruppe, in Struktur C das 5-Hydroxyl, und in Struktur D das Hydroxyl der 6'-Position, entsprechend zu dem Hydroxyl der 5'-Position in Struktur C.
In einem bevorzugten Kopplungsverfahren, das in Fig. 4 veranschaulicht ist, wird eine Untereinheit mit einem gewählten Erkennungsrest R&sub1; mit einem Elektrophil E aktiviert. Der Stern an dem Erkennungsrest verdeutlicht eine beliebige erforderliche Basenschützung. Wie in der Figur ersichtlich, wird die gewählte Untereinheit an ihrem N&sub1;-Nukleophil geschützt, um zu gewährleisten, daß (a) nur das N&sub2;-Nukleophil aktiviert wird und (b) die aktivierte Untereinheit nicht mit sich selbst polymerisieren kann. In den Strukturen A, C und D in Fig. 3, in welchen die Gerüstschutzgruppe an dem 5'-Hydroxyl ist, ist die Schutzgruppe vorzugsweise eine säurelabile Gruppe, wie Dimethoxytrityl (DMTO).
Das in der Fig. 4 gezeigte Aktivierungsreagenz besitzt die allgemeine Form:
worin X Sauerstoff oder Schwefel ist, und C ein aktives Elektrophil ist, das in der Lage zur Reaktion mit einem Nukleophil, wie einem Hydroxyl-Sauerstoffatom oder Amin-Stickstoffatom, unter Verdrängung von Y, ist, wodurch die aktivierte Untereinheit gebildet wird.
Aktivierungsmittel, wie Bis-p-nitrophenylcarbonat, welche die carbonylaktivierte Untereinheit (X = O) ergeben, werden bei der Bildung von Carbonat- und Carbamat-Untereinheitverknüpfungen verwendet. In ähnlicher Weise werden Aktivierungsmittel, wie Thiocarbonyldi-(1,2,4-triazol) (X = S), bei der Bildung von Thiocarbamat-Verknüpfungen verwendet.
Untereinheit-Aktivierungsreaktionen, welche Carbonyl-aktivierte Untereinheiten beteiligen, sind im Beispiel 5 ausführlich angegeben für die 5'-geschützten, 2'-Desoxynukleoside, welche bei A in Fig. 3 repräsentiert sind; in Beispiel 6 für die 5'-geschützten Aminonukleoside, welche bei B in Fig. 3 repräsentiert sind; und in Beispiel 7 für die N-geschützten Morpholino- Typ-Untereinheiten, welche bei D in Fig. 3 gezeigt sind. Die zur Aktivierung der Hydroxylgruppen in diesen Strukturen verwendeten allgemeinen Reaktionsbedingungen sind allgemein anwendbar; Untereinheit-Aktivierungsreaktionen, welche Thiocarbonyl-aktivierte Untereinheiten beteiligen, sind im Beispiel 7 für die Untereinheiten vom Morpholino-Typ, welche bei D in Fig. 3 gezeigt werden, ausführlich angegeben.
Im Anschluß an die Aktivierungsreaktion wird der aktivierte Komplex durch herkömmliche Verfahren, wie Silicagel-Chromatographie, gereinigt und danach mit einer zweiten Untereinheit zur Reaktion gebracht, deren gewählter Erkennungsrest R&sub2; den nächsten in der Sequenz befindlichen Erkennungsrest in dem vervollständigten Polymer bilden wird. Die Kopplungsreaktion wird vorzugsweise unter milden Bedingungen ausgeführt, bei denen die aktivierte Gruppe mit Gerüst-N&sub2;-Amingruppen reagieren kann, aber nicht mit N&sub1;-Hydroxylgruppen. Deshalb ist das Verfahren zur Kopplung von Untereinheiten des durch die Strukturen B-D in Fig. 3 repräsentierten Typs geeignet, aber nicht für Untereinheit-Struktur A. Ein Vorteil dieses Kopplungsverfahrens besteht darin, daß die zweite Untereinheit - - welche ein Amin-N&sub1;- Nukleophil und ein Hydroxyl-N&sub2;-Nukleophil enthält - - an die erste aktivierte Untereinheit nur über das N&sub1;-Amin gekoppelt werden wird, so daß es nicht notwendig ist, die N&sub2;-Gerüstgruppe zu schützen. Die resultierenden Dimer-Untereinheiten sind deshalb über eine N&sub2;-E-N&sub1;- Bindung, wie in der Figur angegeben, gekoppelt.
Das Oligomer kann durch Wiederholen der obenstehenden Schritte von (a) Aktivieren des freien N&sub2;-Nukleophils in der zweiten Untereinheit, Trennen der aktivierten Spezies von dem Aktivierungsmittel und Koppeln der aktivierten Verbindung mit der nächsten in der Sequenz befindlichen Untereinheit, deren Gerüst ungeschützt ist, verlängert werden. Dieses Verfahren wird insbesondere bei der Bildung von kurzen Oligomerblocks durch Lösungsverfahren verwendet, welche nachstehend beschrieben werden und welche für Festphasen-Blockzusammenbau geeignet sind.
Zur Bildung eines Polymeren durch sequentielle, auf einer Festphasen erfolgende Hinzufügung von Untereinheiten wird das zweite Kopplungsverfahren, umrissen in der Fig. 5, stark bevorzugt. Das zweite Verfahren unterscheidet sich vom ersten Verfahren dadurch, daß das Polymerwachstum durch Zugabe eines Überschußes von aktivierter Untereinheit zu einer existierenden Untereinheit oder Polymerkette erfolgt, anstatt, wie im ersten Verfahren, durch Zugabe einer unaktivierten Untereinheit zu einer aktivierten Kette. In der Fig. 5 ist die existierende Untereinheit oder Untereinheitkette durch eine Untereinheit gezeigt, deren Erkennungsrest R&sub1; ist (zweite Zeile in Fig. 5). Diese Untereinheit besitzt ein freies N&sub1;- Gerüstnukleophil und ein N&sub2;-Nukleophil, welches durch eine vorzugsweise säurestabile Verknüpfung an einen festen Träger geschützt ist oder dank der Tatsache, daß es an eine Kette von Untereinheiten, welche an einen festen Träger gebunden sind, verknüpft ist. Verfahren zum Bilden von cyclischen Gerüstuntereinheiten, welche auf diese Weise N&sub2;-geschützt sind, sind allgemein in den Beispielen 6 und 7 beschrieben. Die erste Untereinheit (die zuletzt hinzugefügte Untereinheit in einem wachsenden Polymeren) wird nun mit einer aktivierten Untereinheit reagiert, welche dadurch zur nächsten-in-der-Sequenz befindlichen Untereinheit in dem Polymeren wird. Diese aktivierte Untereinheit, welche an ihrer N&sub2;-Gerüststelle aktiviert ist und an ihrer N&sub1;-Stelle, vorzugsweise durch eine säurelabile Schutzgruppe, geschützt ist, wird durch obenstehend unter Bezugnahme auf Fig. 6 beschriebene Verfahren hergestellt.
Wie in der Fig. 5 ersichtlich, fügt die Kopplungsreaktion die N&sub2;-aktivierte zweite Untereinheit an die N&sub1;-geschützte erste Untereinheit an, um die zwei durch eine N&sub2;-E-N&sub1;-Bindung zu kopplen, und eine Verbindung zu bilden, welche an beiden freien Gerüst-Nukleophil-Stellen geschützt ist. Diese Verbindung wird nun behandelt, zum Beispiel durch Reaktion mit Säure, um die säurelabile N&sub1;-Schutzgruppe auf der zuletzt hinzugefügten Untereinheit zu entschützen, und das Vorgehen wird wiederholt, um ein gewünschtes Sequenzpolymer aufzubauen.
Aus dem obengenannten kann ersehen werden, daß die N&sub1;-aktivierte Untereinheit, welche die letzte-in-Sequenz befindliche Untereinheit bilden wird, an ihrer N&sub1;-Gerüststelle geschützt werden muß, um die selektive Aktivierung an der N&sub2;-Stelle zu gestatten und die Selbst- Polymerisierung der aktivierten Verbindung zu verhindern. Auch die N&sub1;-entschützte Untereinheit, welche an die aktivierte Untereinheit koppeln soll, sollte an ihrer N&sub2;-Stelle geschützt sein, um eine selektive Reaktion ihres N&sub1;-Restes mit der N&sub2;-aktivierten Untereinheit zu gestatten. Da die reagierenden Untereinheiten beide an einer Gerüststelle geschützt sind, ist das Verfahren deshalb zur Kopplung von Nukleosiden (Struktur A in Fig. 3) als auch Untereinheiten geeignet, deren cyclische Gerüste sowohl Amin- als auch Hydroxyl- Gerüstnukleophile enthalten, wie die Strukturen B-D in dieser Figur. Die bei der Kopplung von Struktur A-Untereinheiten über eine Carbonatbindung verwendeten Reaktionsverfahren sind im Beispiel 6 ausführlich angegeben. Kurz gesagt, wird eine Untereinheit, welche einen 5'- geschützten Gerüstrest enthält, an ihrem 3'-Hydroxyl aktiviert und mit einer anderen Untereinheit (oder wachsenden Kette), welche an ihrem 3'-Hydroxyl geschützt ist, umgesetzt. Die Kopplungsreaktion wird in Gegenwart eines Katalysators, wie N-Methylimidazol oder N,N-Dimethylaminopyridin, der zur Bildung der Carbonatbindung notwendig ist, ausgeführt. Für die Kopplung von Untereinheiten, welche cycylische Gerüste von Struktur B-D enthalten, wobei Carbamat- oder Thiocarbamatbindungen zwischen den Untereinheiten gebildet werden, sind viel mildere, unkatalysierte Kopplungsbedingungen, wie diejenigen unter Bezugnahme auf das obenstehende erste Verfahren beschriebenen, geeignet.
Der Vorteil dieses zweiten Kopplungsverfahrens zur Bildung eines Polymeren durch Festphasen-Untereinheit-Addition besteht darin, daß ein wesentlicher molarer Überschuß der aktivierten Untereinheit zu dem wachsenden Träger-gebundenen Polymer bei jedem Polymer- Additions-Schritt hinzugesetzt werden kann, um die Kopplung der Untereinheit an einen sehr hohen Prozentsatz der trägergebundenen Polymeren zu erzielen. Dies gewährleistet, daß ein großer Prozentsatz der trägergebundenen Polymere die vollständige gewünschte Sequenz von Untereinheiten enthalten wird. Im Gegensatz dazu ist beim ersten Verfahren, wo das wachsende Polymer an seiner zuletzt angefügten Untereinheit aktiviert wird, die Effizienz der Untereinheit-Addition durch die Effizienz der Aktivierungsschritte limitiert.
Die Fig. 6 zeigt die durch Koppeln der cyclischen Gerüst-Untereinheiten, angegeben bei A-A bis D-D in Fig. 3, erzeugten dimeren Strukturen. Die Nukleosiduntereinheiten in der Struktur A in der Figur sind durch ein Carbonat verknüpft (Y = O). In den verbleibenden drei Strukturen B-D sind die Untereinheiten durch Carbamat- (Y = O) oder Thiocarbamat- Bindungen (Y = S) verknüpft. Wie aus der Figur ersichtlich, sind alle der Untereinheitsverknüpfungen ungeladen und achiral, d. h. enthalten keine chiralen Zentren. Darüber hinaus sind die Verknüpfungen in wäßrigem Medium stabil, wie beurteilt durch die Fähigkeit der Polymeren, einer Hydrolyse über einen verlängerten Zeitraum in neutraler wäßriger Lösung zu widerstehen.
Gemäß einem anderen wichtigen Merkmal der Erfindung zeigen die Strukturen, bei Verknüpfung zur Bildung von Polymeren, eine annehmbare Watson/Crick-Basenpaarung mit komplementären Polynukleotiden.
Schließlich, gemäß einem weiteren wichtigen Merkmal der Erfindung, sind aus den Untereinheiten gebildete Polymere stereoregulär. Dies wird in den gezeigten Strukturen erzielt durch (a) Verwenden von natürlichen Nukleosiden oder Nukleosidderivaten oder synthetischen Nukleosiden mit der natürlichen stereoisomeren Konfiguration als Untereinheiten, und (b) Verknüpfen der Untereinheiten durch achirale Verknüpfungen zwischen den Untereinheiten. Exemplarische Kopplungsverfahren sind in den Beispielen 5-7 ausführlich angegeben.

B. Untereinheitkopplung: N&sub1;- - - -E-Gerüstkonfigurationen

Allgemeine Verfahren zur Kopplung von Untereinheiten mit einer N&sub1;- - - - -E-Gerüstkonfiguration sind in den Fig. 7A, 7B und 7C veranschaulicht. Wie man sich aus obenstehendem Abschnitt I erinnern wird, ist N&sub1; eine nukleophile Gerüstgruppe, wie eine Hydroxyl- oder Amingruppe, und E ist ein Elektrophil, wie eine Carboxyl- oder Sulfonylgruppe, welche, bei Aktivierung, mit einem zweiten N&sub1;- - - - -E-Typ-Gerüst reagieren kann, um ein verknüpftes N&sub1;- - - - -E-N&sub1;- - - - -E-Gerüstdimer zu bilden. Die Untereinheitgerüste dieser Typen, welche obenstehend spezifisch beschrieben worden sind, sind die cyclischen Gerüststrukturen E-H in Fig. 3. In den cycylischen Strukturen E und F ist das N&sub1;-Nukleophil die 3'- Hydroxylgruppe, und in den Strukturen G und H das an dem 3'-Stickstoffatom auf dem Morpholinoring gebundene Amin. Die E-Gruppe in allen der cyclischen Strukturen ist die Carboxyl- oder entsprechende Sulfonyl-Gruppe, welche an der 5'-Position des Riboserings oder an der 6'-Position des Morpholinorings gebunden ist.
Das erste Kopplungsverfahren, welches in der Fig. 7A veranschaulicht ist, ist analog zu dem obenstehend unter Bezugnahme auf Fig. 4 beschriebenen Verfahren, worin eine erste N&sub1;- geschützte Untereinheit aktiviert und dann direkt an eine Gerüst-ungeschützte Untereinheit gekoppelt wird, welche die nächste-in-der-Sequenz befindliche Untereinheit im wachsenden Polymer bildet. Die P&sub1;-Schutzgruppe auf der Untereinheit N&sub1; ist vorzugsweise eine säurelabile Schutzgruppe, wie t-Butoxycarbonyl, oder ein an einem festen Träger gebundener abspaltbarer Linker. Verfahren zum N&sub1;-Schützen von cyclischen Gerüststrukturen sind analog zu den obenstehend für die cyclische Strukturen A-D beschriebenen Verfahren. Ähnliche Verfahren sind wirksam, um die Amin-Stickstoffatome in den acyclischen Gerüststrukturen zu schützen. Alternativ dazu, wenn das Polymer auf einem Festphasenträger konstruiert werden soll, wie nachstehend beschrieben, kann die Gerüst-N&sub1;-Stelle durch ihre Anheftung an einen festen Träger geschützt werden, wobei die Untereinheit-Anftigung an das wachsende Polymer über das aktivierte E-Elektrophil der zuletzt hinzugefügten Untereinheit stattfindet.
Die Aktivierungsreaktion ist ausgelegt, um einen aktivierten oder Ketten-endständigen Rest der Form N&sub1;- - - - -E-X zu ergeben, worin X wie obenstehend unter Bezugnahme auf Fig. 6 beschrieben beschaffen ist, und die aktivierte Untereinheit in starkem Maße die gleiche Reaktivität gegenüber Gerüst-Nukleophilgruppen aufweist, wie dies bei der aktivierten Untereinheit im zuvor beschriebenen Verfahren der Fall ist. Das heißt, die Aktivierung ist ausgelegt, um in starkem Maße die gleiche aktive Kopplungsgruppe zu erzeugen, wie in den Gerüsten vom N&sub1;- - - -N&sub2;-Typ, wobei jedoch die reaktive Carbonyl- oder Sulfonylgruppe durch das Gerüst selbst anstatt durch ein Carbonyl- oder Sulfonyl-Aktivierungsreagenz, wie in den in Fig. 6 gezeigten Verfahren, bereitgestellt wird.
Die Aktivierung kann einfach durch Umsetzen der N&sub1;- - - -E-Typ-Untereinheit mit einem Carbodiimid in Gegenwart von p-Nitrophenol durchgeführt werden, wo das Grundgerüst- Elektrophil eine Carbonylgruppe ist, oder durch Reagieren mit einem Carbodiimid in Gegenwart eines Imidazols, 1,2,4-Triazols oder Tetrazols, wo das Grundgerüst ein Sulfonyl ist. Gerüst-Aktivierungsreaktionen, welche elektrophile Carbonyl-Gruppen beteiligen, sind in den Beispielen 8 und 9 ausführlich angegeben. Die zur Aktivierung der N-Amino-Morpholino- und geradkettigen Gerüst-Carbonyl-Gruppen verwendeten allgemeinen Reaktionsbedingungen sind allgemein auf die in der Fig. 3 gezeigten anderen N&sub1;- - - -E-Typ-Gerüststrukturen anwendbar.
Im Anschluß an die Aktivierungsreaktion wird der aktivierte Komplex durch herkömmliche Verfahren, wie Silica-Chromatographie, gereinigt oder, im Falle einer trägergebundenen aktivierten Kette, einfach gewaschen, und dann mit einer zweiten Untereinheit reagiert, deren gewählter Erkennungsrest R&sub2; den nächsten Erkennungsrest in der Sequenz im vervollständigten Polymer bilden wird. Die Kopplungsreaktion ergibt ein Dimer, dessen Untereinheiten deshalb über eine E-N&sub1;-Bindung gekoppelt sind, wie in der Figur angedeutet. Wie obenstehend müssen beide Untereinheiten während der Aktivierungs- und Kopplungsreaktionen in geeigneter Weise basengeschützt sein.
Das Polymer kann durch Wiederholen der obenstehenden Schritte von (a) Aktivieren des freien E-Elektrophils in der zweiten Untereinheit, (b) Abtrennen der aktivierten Spezies vom Aktivierungsmittel und (c) Koppeln der aktivierten Verbindung mit der nächsten-in-der- Sequenz befindlichen Untereinheit, deren Gerüst ungeschützt ist, verlängert werden.
Das zweite Kopplungsverfahren, das in Fig. 7B veranschaulicht ist, ist direkt analog zu dem obenstehend im Hinblick auf Fig. 5 beschriebenen Verfahren. Hier wird eine erste Untereinheit, welche ein E-geschütztes Grundgerüst enthält, umgesetzt mit einer zweiten Untereinheit mit einer aktivierten E-Gruppe und einem geschützten N&sub1;-Nukleophil, um ein Dimer zu bilden, das über eine E-N&sub1;-Bindung verknüpft und an beiden freien Gerüst-Endgruppen geschützt ist. Wo das Polymer durch Festphasensynthese gebildet wird, nimmt die P&sub2;- Schutz-"Gruppe" die Form einer säurestabilen Verknüpfung an einen festen Träger an. Die N&sub1;- geschützte Untereinheit wird hergestellt und aktiviert, wie obenstehend. Die Kopplungsbedingungen folgen im allgemeinen denjenigen, welche in den obenstehenden Kopplungsreaktionen cyclischer Untereinheiten angewandt wurden.
Im dritten Kopplungsverfahren, gezeigt bei Fig. 7C, werden die N&sub1;-geschützten und E- ungeschützten Untereinheiten (oder Polymereinheiten) miteinander in Gegenwart eines geeigneten E-Aktivierungsmittels umgesetzt, wie einem Carbodiimid, wie angegeben.
Die Fig. 6 und 8 zeigen die durch Koppeln der cyclischen Gerüstuntereinheiten, angegeben bei A-H in Fig. 3 bzw. angegeben bei A-A bis G-G, hergestellten dimeren Strukturen. Die Nukleosiduntereinheiten in Struktur F-F in der Fig. 3 sind durch eine Esterbindung verknüpft. In der verbleibenden cyclischen Gerüststruktur, G-G, sind die Untereinheiten durch eine Hydrazid- oder Sulfonylhydrazid-Bindung verknüpft. Die Untereinheit-Verknüpfungen sind ungeladen und achiral, und alle der Bindungen sind in wäßrigem Medium vernünftig stabil, wie beurteilt durch die bekannte Stabilität von Ester-, Hydrazid- und Amidverknüpfungen in Lösung.
Gemäß einem anderen wichtigen Merkmal der Erfindung zeigen die Strukturen, bei Verknüpfung zur Bildung von Polymeren, eine Watson/Crick-Basenpaarung mit komplementären Polynukleotiden.
Schließlich, wie bei den obenstehend beschriebenen N&sub1;- - - - -N&sub2;-Gerüstuntereinheiten, sind alle der gezeigten N&sub1;- - - -E-Gerüststrukturen stereoregulär. Dies beruht auf (a) der homochiralen (Strukturen E-H in Fig. 3) Natur der Erkennungsrestbindung an den Gerüstrest und (b) der achiralen Untereinheitverknüpfung.

C. Untereinheitkopplung: Alternierende geladene und ungeladene achirale Verknüpfungen

Bei manchen Anwendungen kann es wünschenwert sein, eine oder mehrere geladene achirale Untereinheit-Verknüpfungen in die Polymermoleküle einzuführen. Die Grundgerüst-Ladung kann verwendet werden, um die Löslichkeit des Polymeren in vielen Lösungs-Anwendungen zu verbessern oder Polymer-Ziel-Bindungskonstanten einzustellen, wie es nachstehend weiter beschrieben werden wird. Polymere mit geladenen achiralen Gerüst-Verknüpfungen in regelmäßigem Abstand, z. B. zwischen jeder zweiten oder dritten Untereinheit, sind für das neue diagnostische System, welches nachstehend beschrieben wird, geeignet. Für die Absichten der vorliegenden Erörterung, wird angenommen, daß polymere Einheiten, die aus zwei oder mehreren Untereinheiten aufgebaut sind, welche intern durch achirale ungeladene Verknüpfungen verbunden sind, durch eine geladene achirale Bindung verknüpft werden sollen. Diese ungeladenen Einheiten werden durch eines der in den obenstehenden Abschnitten A und B beschriebenen Verfahren gebildet.
Die Dimeruntereinheiten, welche verknüpft werden sollen, werden so ausgewählt, daß die freie N&sub2;-Gruppe eines Dimeren an die freie N&sub1;-Gruppe des anderen Dimeren über eine geeignete geladene achirale Verknüpfung gekoppelt werden kann. Die bevorzugte Verknüpfung ist eine Phosphodiesterbindung, welche erfordert, daß die freie N&sub2;-Gruppe auf einer Untereinheit und die freie N&sub1;-Gruppe auf der anderen Untereinheit beide Hydroxyle sind. Wie in der Fig. 3 ersehen werden kann, wird diese Bedingung erfüllt, wenn Diniere, welche entweder aus Struktur A- oder Struktur B-Untereinheiten gebildet sind, welche beide ein freies N&sub2;-Hydroxyl besitzen, an Dimere gebunden werden, welche aus Untereinheiten der Struktur A, C oder D gebildet sind, welche alle ein freies N&sub1;-Hydroxyl aufweisen.
In einem typischen Kopplungsverfahren wird das Dimer A, welches an seiner N&sub1;-Position, wie angegeben, geschützt ist, durch eine Reihe von Reaktionen getragen, welche zu einer reaktiven Phosphoester-Kopplungsspezies führen, die an das N&sub2;-Hydroxyl über eine Phosphoesterbindung verknüpft ist, wie in der Fig. 9 gezeigt. Das bevorzugte Kopplungsverfahren, das ausführlich in der U. S. -Patentanmeldung für "Polynukleotidassay-Reagenz und -Verfahren", Seriennummer 712 396, eingereicht am 15. März 1985, beschrieben ist, wird in den nachstehenden Beispielen 14 und 15 unter Bezug auf die Bildung eines Tetramers mit alternierenden ungeladenen stereospezifischen Methylphosphonatbindungen und geladenen achiralen Phosphodiesterbindungen ausführlich beschrieben. Kurz gesagt, beinhaltet das veranschaulichte Verfahren zuerst die Bildung von Nukleotiddimeren, welche durch Methylphosphonatbindungen verknüpft sind, das Isolieren von steroisomeren Formen der Dimere und das Aktivieren eines der stereoisomeren Dimere, um ein reaktives N&sub1;-geschütztes N&sub2;-(p-Chlorphenyl-2- cyanoethyl)-phosphat zu bilden. Das aktivierte Dimer wird dann mit dem zweiten Dimer umgesetzt, um ein Tetramer zu bilden, welches in alternierender Weise durch ungeladene stereoisomere Bindungen und geladene achirale Zwischenuntereinheit-Bindungen verknüpft ist.
Das Phosphodiesterbindungs-Verfahren kann, entweder als ein Lösungs- oder Träger-Typ- Polymersyntheseverfahren gemäß den allgemeinen Vorgehensweisen, welche in den Abschnitten A und B für Polymerkopplung unter Beteiligung von achiralen, aber ungeladenen, Verknüpfungsreaktionen dargestellt sind, eingebunden werden. Wie angegeben, können die Phosphodiesterbindungen verwendet werden, um dimere oder polymere Einheiten zu koppeln, welche selbst durch ungeladene achirale Bindungen gekoppelt sind, gebildet wie obenstehend, oder zur Kopplung von dimeren Einheiten, welche durch ungeladene, chirale aber stereoisomere Verknüpfungen verbunden sind, wie die abgetrennten steroisomeren Formen von Methylphosphonat-verknüpften Dimeren.
Für die nachstehend beschriebenen diagnostischen Anwendungen wird es im allgemeinen bevorzugt, so wenig geladene Bindungen wie zur Erzielung einer angemessenen Polymerlöslichkeit in einem wäßrigen Medium notwendig einzuführen. Die Löslichkeitsverbesserung wird im allgemeinen mit 1-3 geladenen Gerüstverknüpfungen pro Polymer von etwa 20 Untereinheiten erzielt, und vorzugsweise mit nicht mehr als etwa einer geladenen Bindung je vier Untereinheiten. Wie hierin definiert, werden achirale Gerüstbindungen als im wesentlichen ungeladen betrachtet, wenn sie weniger als etwa eine geladene Gerüstbindung pro dimerer Einheit, und vorzugsweise eine oder weniger Gerüstbindung(en) pro tetramerer Einheit, enthalten.

IV. Polymer-"Targeting"-Erwägungen

Die bei der Herstellung eines Polynukleotid-Bindungspolymern zur Verwendung in der Erfindung angewandten Entwurf Überlegungen werden durch die Natur des Zielanalyten und die Reaktionsbedingungen, unter denen der Assay auf den Analyten zu erfolgen hat, beherrscht. Als eine erste Überlegung, wird eine nicht-homopolymere Zielbasensequenz ausgewählt, gegen welche das Polymer gerichtet ist. Diese Zielsequenz ist vorzugsweise für den zu assayenden Analyten einzigartig, d. h. von ihr ist berechnet, daß sie lediglich mit einer gewissen definierten geringen Wahrscheinlichkeit (wie 1% oder weniger) in einem Assay-Gemsich vorkommt, welches eine gegebene Anzahl von Basen einmaliger Sequenzen enthält. Die Wahrscheinlichkeit des Vorkommens einer gegebenen n-basigen Zielsequenz beläuft sich auf ungefähr 1/4n - - das heißt, eine gegebene n-basige Zielsequenz würde erwartungsgemäß ungefähr einmal in einem Polymer, welches 4n Basen enthält, vorkommen. Deshalb ist die Wahrscheinlichkeit P, das eine gegebene Sequenz von n Basen in Polynukleotiden mit insgesamt N Basen einmaliger Sequenzen auftreten wird, ungefähr P - N/4n. Zur Veranschaulichung, beträgt die Wahrscheinlichkeit P, daß eine 9 Basen große Zielsequenz in einem 20 Kilobasen großen Polynukleotid anzutreffen ist, etwa 20 · 10³/2 · 10&sup5; oder 0,08, und die Wahrscheinlichkeit, daß eine 16 Basen große Zielsequenz vorhanden sein wird, beläuft sich auf ezwa 20 · 10³/4,3 · 10&sup9; oder 0,0000047. Aus diesen Berechnungen kann ersehen werden, daß ein Polymer, welches 9-16 Erkennungsreste enthält, die spezifisch für eine definierte 9-16 Basen große Zielsequenz sind, hohe Spezifität für die Zielsequenzen in einem Assay-Gemisch aufweisen sollte, welches lediglich virale Genome enthält, deren größte Komplexitäten etwa 400 K von Basen einmaliger Sequenzen entsprechen.
Ähnliche Typen von Berechnungen zeigen, daß ein Polymer von 12 bis 16 Untereinheiten eine angemessene Spezifität für eine virale oder bakterielle Zielsequenz in einem Assay-Gemisch bereitstellen kann, welches nur virales und bakterielles genomisches Material enthält (größte Genomgrößen etwa 5000 Kilobasen), und daß ein Polymer von 16 bis 22 Untereinheiten eine angemessene Spezifität für eine Zielsequenz in einem Polynukleotidgemisch zur Verfügung stellen kann, welches Säugergenom-DNA-Material enthält (Genomgrößen von etwa 5 Milliarden Basenpaaren an einmaliger Sequenz-DNA).
Die Polymer/Analyt-Bindungsaffinität, und insbesondere die Temperatur, bei welcher das Polymer gerade mit der Zielsequenz bindet (die Schmelztemperatur oder Tm) kann selektiv variiert werden gemäß (a) der Polymerlänge, (b) der Anzahl von Wasserstoffbrückenbindungen, welche zwischen den Erkennungsresten und den entsprechenden in-der-Sequenzbefindlichen Basen der Analyt-Zielsequenz gebildet werden kann, und (c) der Grundgerüst- Ladungsdichte. Aus einer Anzahl von Untersuchungen an Modell-Homopolymer-Doppelsträngen ist es bekannt, daß die Schmelztemperatur von Oligonukleotid-Doppelsträngen im 10 bis 20 bp-Bereich um grob 3ºC pro zusätzlichem Basenpaar ansteigt, wenn die komplementären Basen in der Lage zur Bildung von zwei Wasserstoffbrückenbindungen sind, und um etwa 6ºC pro zusätzlichem Basenpaar, wo die komplementären Basen in der Lage sind, drei Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden. Deshalb kann die Länge einer Zielsequenz, welche anfänglich gewählt wird, um eine hohe Bindungsspezifität mit dem Polymeren zu gewährleisten, erweitert werden, um eine gewünschte Schmelztemperatur mit dem komplementären Basen-Polymer unter den gewählten Assaybedingungen zu erzielen. Wo die beim Konstruieren des Polymeren verwendeten Erkennungsreste die Standard-Nukleinsäurebasen sind, wie obenstehend veranschaulicht, kann, außerdem, die Zielsequenz gewählt werden, um einen hohen Prozentsatz von Guanin- plus Cytosinbasen aufzuweisen, damit eine relativ hohe Polymer/Analyt-Schmelztemperatur erzielt wird, oder einen relativ hohen Prozentsatz von Adenin- plus Thymin-Basen, damit eine relativ niedrige Schmelztemperatur erzielt wird.
Die Grundgerüst-Ladungsdichte des Polymeren muß wesentlich geringer sein als diejenige des Polynukleotidanalyten, um die präferentielle Bindung von polykationischen Reportermolekülen an den Analyten, unter Bedingungen, bei welchen eine Reporter-Bindung an das Polymer nicht auftritt, wie bereits bemerkt, zu erlauben. Diese Anforderung wird erfüllt, wo der Abstand zwischen den benachbarten negativen Ladungen in dem Polymergerüst mindestens zweimal so groß ist, wie der Abstand zwischen benachbarten geladenen Phosphodiesterbindungen in dem Analyt. Die Ladungsdichte des Gerüstes hat ebenfalls einen bedeutenden Effekt auf die Polymer/Analyt-Schmelztemperatur, insbesondere unter Niedrigsalzbedingungen, wo jede Ladungs-Ladungs-Abstoßung zwischen den Analyt- und Polymer-Gerüsten dahingehend wirken kann, um die Temperatur zu senken, bei welcher die zwei sich aneinanderlagern bzw. annealen können. Deshalb wird im allgemeinen von einem Polymer mit einem weniger geladenen Grundgerüst erwartet, (1) eine höhere Analyt/Polymer-Schmelztemperatur und (2) weniger Abhängigkeit der Schmelztemperatur von der Salzkonzentration zu zeigen. Basierend auf diesen Betrachtungen wird ein ungeladenes achirales Polymer, wie die mehreren obenstehend unter Bezug auf die Fig. 6 und 8 beschriebenen Polymere, gestatten, daß die Analyt/Polymer-Annealingreaktion in dem diagnostischen Verfahren unter einem weiteren Bereich von Salzkonzentrationen ausgeführt werden kann, als ein teilweise geladenes Polymer, wie ein Polymer; das aus alternierenden geladenen achiralen Phosphodiesterbindungen und ungeladenen Bindungen, welche entweder achiral oder chiral sein können, aber stereospezifisch definiert sind, gebildet ist.

V. Verfahren für den Polymerzusammenbau

A. Geometrischer Zusammenbau

Nach Auswählen einer gewünschten Polymerlänge und Erkennungsrestsequenz, gemäß den im Abschnitt IV in Erwägung gezogenen Faktoren, wird das Polymer zusammengebaut, wobei die obenstehend ausführlich dargestellten allgemeinen Untereinheitkopplungsverfahren angewandt werden. Ein Verfahren zum Polymerzusammenbau beinhaltet die anfängliche Herstellung eines geeigneten Satzes von Dimeren, das Verknüpfen ausgewählter Dimere zur Bildung von Tetrameren, das Verknüpfen dieser zur Bildung von Octameren und so weiter. Dieses Verfahren wird in Lösung, im wesentlichen gemäß den unter Bezug auf die obenstehenden Fig. 4 und 7A beschriebenen Verfahren, ausgeführt. Es sollte angemerkt werden, daß nicht alle Kopplungen notwendigerweise zwischen Oligomeren von gleicher Größe erfolgen müssen. Zum Beispiel ist es bei der letzten Kopplung oft wünschenswert, ein Hexadecamer mit einem Tetramer zu verknüpfen, um ein 20-Mer zu erhalten, oder ein Hexadecamer mit einem Octamer zu verknüpfen, um ein 24-Mer zu erhalten.
Ein besonderer Vorzug dieses Zusammenbauverfahrens besteht darin, daß jedes Kopplungsprodukt ungefähr die zweifache Masse der Vorläufer besitzt, und die Aufreinigung des Produktes jeder Kopplung so eine vereinfachte Angelegenheit ist. Das nachstehende Beispiel 10 beschreibt ausführlich den Zusammenbau eines aus 8 Untereinheiten bestehenden Carbamatverknüpften Polymeren, welches durch dieses Verfahren (b) gebildet wurde.

B. Schrittweiser Zusammenbau auf einem festen Träger

Ein bevorzugtes Verfahren zur Polymersynthese ist der schrittweise Zusammenbau auf einem festen Träger. Hier wird die erste Untereinheit in dem Polymer über ihre N&sub2;-Gerüstgruppe an einen festen Träger angeheftet. Typischerweise wird ein fester Träger, wie Glasperlen, die derivatisiert sind mit abspaltbaren, vorzugsweise säurestabilen, langkettigen Linkem, als das Trägermaterial verwendet und für die Anheftung von N&sub2;-Nukleophil, wie einem 5'-Hydroxyl eines Nukleosids, präpariert, wie beschrieben im Beispiel 11. Die Glasperlen werden mit einer Untereinheit zur Reaktion gebracht, welche eine vorzugsweise säurelabile N&sub1;-geschützte Gruppe und eine aktivierte N&sub2;- oder E-Gerüst-Gruppe aufweist, wie obenstehend in Abschnitt III ausführlich dargestellt. Die Kopplung von verschiedenen Typen von Untereinheiten an einen Glasperlenträger wird allgemein in den Beispielen 12 und 13 beschrieben.
Nach Ankoppeln der zweiten Untereinheit (oder Polymereinheit, welche in Lösung zusammengebaut werden kann) an den Träger werden jedwede nicht-reagierten Linker- Nukleophile durch Zusetzen eines geeigneten "Capping"-Reagenz, wie p-Nitrophenylacetat, "gecappt" bzw. abgedeckt, und danach wird der Träger gewaschen und filtriert. Die Schutzgruppe auf der endständigen N&sub1;-Untereinheit wird, typischerweise durch Säurebehandlung, entfernt, und dann wird der Träger, nach Neutralisation, mit einem Überschuß der nächsten-inder-Sequenz befindlichen Untereinheit (oder Polymereinheit) umgesetzt, welche an ihrem freien N&sub2;-Gerüstrest aktiviert ist. Der Überschuß an aktivierter Untereinheit maximiert die Anzahl von trägergebundenen Untereinheiten, welche Ketten-verlängert werden. Das heißt, ein Merkmal des Festphasen-Zusammenbauverfahrens ist die Notwendigkeit nach hohen Kopplungseffizienzen bei jedem Untereinheit-Additionsschritt, und die Konzentration der hinzugefügten aktivierten Untereinheit wird ausgewählt, um diese Effizienz zu maximieren. Die Kettenelongation wird auf diese Weise fortgesetzt, unter "Capping" der Fehlsequenz nach jeder Untereinheit-Addition, bis das Polymer der gewünschten Länge und Sequenz erhalten wird. Das allgemeine Verfahren ist im Beipiel 12 für die Herstellung eines 14 Untereinheiten großen Carbonat-verknüpften Polymers und im Beispiel 13 für die Synthese eines 19 Untereinheiten großen Carbamat-verknüpften Polymers veranschaulicht.
Nach Addition der letzten-in-der-Sequenz-befindlichen Untereinheit kann das Polymer mit einer geeigneten geladenen oder ungeladenen Gruppe gecappt werden, welche an die terminale N&sub1;-Gruppe gekoppelt wird. Wenn der Grundgerüst-Zusammenbau ausschließlich mit ungeladenen achiralen Bindungen durchgeführt worden ist, ist das Capping-Reagenz vorzugsweise eine geladene Gruppe, welche dem Polymer eine end-terminale Ladung verleiht. Nach Capping des Polymeren wird das Polymer von dem Träger, zum Beispiel durch Behandlung mit einem Nukleophil, wie Ammoniumhydroxid, abgespalten, und das Polymer wird gereinigt, wie durch Anionenaustauschchromatographie. Die zusammengebauten gereinigten Polymeren werden an einen festen Träger durch Verfahren, welche nachstehend in Betracht gezogen werden, angeheftet.
Die obenstehend erörterten Polymer-Entwurfsprinzipien sind in Beispiel 10 für eine Lösungs- Synthese aus vorher zusammengebauten dimeren Einheiten, in den Beispielen 12 und 13 für die Herstellung einer Vielzahl von ungeladenen achiralen Bindungen, und in Beispiel 15 für die Herstellung eines Polymers vom Typ mit alternierenden Ladungen veranschaulicht.

VI. Diagnostisches Reagenz

A. Festes Träger-Reagenz

Das Reagenz der Erfindung wird durch Koppeln von mehreren Bindungspolymeren aus dem obengenannten an einen festen Träger gebildet. Alternativ dazu können die Polymere auf eine schrittweise oder eine Block-Weise, auf dem Träger, synthetisiert werden, wie obenstehend für die Carbamat-verknüpften Polymeren beschrieben. Die Polymere können direkt an den Träger gekoppelt werden (oder direkt darauf gebildet werden), z. B. durch eine OH-Endgruppe auf dem Polymer an eine reaktive OH-Gruppe auf einem festen Träger, wie aktivierter Agarose, Cellulose oder dergleichen. Jedoch plaziert eine direkte Kopplung die zum Träger proximalen Untereinheiten häufig zu nah an dem Träger, um eine Basen-komplementäre Bindung zwischen dem Analyten und den proximalen Untereinheits-Erkennungsresten zu gestatten. Deshalb sind die Polymermoleküle vorzugsweise über einen Spacer-Arm an den festen Träger verknüpft, welcher ausgelegt ist, um das Polymer von der Oberflächenregion des Trägers so im Abstand zu halten, daß eine im wesentlichen unbehinderte Bindung zwischen dem Polymer und der Analyt-Zielsequenz erlaubt wird.
Der Spacer-Arm ist vorzugsweise eine unverzweigte Kette mit einer Gesamtkettenlänge von mindestens 6 Atomen und weist geeignete reaktive Endgruppen zur Anheftung an den Träger, an einem Ende, und an das Polymer, am anderen Ende, auf. Eine Vielzahl von Typen von Spacer-Armen, insbesondere kohlenstoffhaltige Ketten verschiedener Längen und Hydrophilizität, sind gut bekannt, wie auch reaktive Gruppen, welche in Spacer-Arm-Kopplungsreaktionen verwendet werden. Das nachstehende Beispiel 14 beschreibt die Synthese eines Aminohexyl-Spacer-Arms, dessen Anheftung an das 5'-Ende eines gemischten Methylphosphonat/Phosphodiester-Polymeren und die Kopplung an einen festen Träger. Das nachstehende Beispiel 17 beschreibt ausführlich die Herstellung eines Polymerträgers mit mehreren oberflächengebundenen geradkettigen Spacer-Armen zur Verwendung bei der Bildung eines diagnostischen Reagenz mit carbamatverknüpften Polymeren. Das Verfahren von Beispiel 17 wird in der Fig. 10 veranschaulicht. Der in der Figur gezeigte Träger ist ein aminomethyliertes Polystyrol, das zuerst mit Bernsteinsäureanhydrid umgesetzt wird, um ein carboxyliertes Derivat zu bilden. Die Aktivierung des Trägers mit Di(succinimido)carbonat und Reaktion mit 6-Aminohexanol führt zu dem gezeigten 13-atomigen Spacer-Arm mit endständigem Hydroxyl.
Bevorzugte feste Träger schließen Agarose, Cellulose, Nitrocellulose, Latex, Polystyrol und anderes im Handel erhältliches Streifen- oder Teilchen-Perlen-Trägermaterial ein, das Oberflächen-reaktive oder aktivierbare Gruppen aufweist, die eine effiziente Kopplung von Polymermolekülen zulassen, insbesondere durch polymergebundene Spacer-Arme. Die Konzentration von an die Trägeroberfläche gekoppelten Polymeren wird vorzugsweise so ausgewählt, daß ein 10-1000-facher molarer Überschuß von Polymermolekülen zu Analytmolekülen ermöglicht wird, wenn ein geeignetes Probenvolumen von Assaymaterial mit dem Träger, in dem diagnostischen Verfahren, vermischt wird, wie es nachstehend beschrieben wird. Ein Verfahren zur Kopplung eines Ziel-bindenden Polymeren an Agaroseperlen über den Aminohexyl-Spacer-Arm aus Beispiel 16 ist in demselben Beispiel beschrieben.

B. Reporter

Der Reporter des diagnostischen Systems der Erfindung ist aus zwei Teilen aufgebaut: (1) ein polykationischer Rest oder Schwanz, der entworfen ist, um elektrostatisch an ein vollständig geladenes Polynukleotid unter Bedingungen zu binden, bei denen der Reporter nicht an das weniger geladene Bindungspolymer bindet, welches auf dem diagnostischen Reagenz getragen wird, und (2) eine oder mehreren Reportergruppen, welche an dem Schwanz angebracht sind, angepaßt, um ein Signal zu erzeugen, durch das die Gegenwart des Reporters nachgewiesen werden kann. Polykationisch, wie der Begriff hierin verwendet wird, beinhaltet Schwänze, welche zwei oder mehrere geeignet räumlich getrennte kationische Gruppen aufweisen.
Der kationische Schwanz ist vorzugsweise so aufgebaut, daß mindestens zwei positiv geladene Gruppen zur Verfügung gestellt werden, welche für die Bindung an angrenzende negative Ladungen auf dem Zucker-Phosphat-Grundgerüst des Polynukleotidanalyten räumlich getrennt angeordnet sind. Zur gleichen Zeit ist der Abstand zwischen benachbarten Ladungen auf dem kationischen Schwanz derartig, daß eine elektrostatische Bindung an das Reagenzpolymer- Grundgerüst, welche mehr als die Hälfte der Reporterladungen beteiligt, energetisch ungünstig ist. In dem obenstehend beschriebenen Polymer mit alternierenden ungeladenen Phosphonat- und geladenen Phosphatbindungen, zum Beispiel, beträgt der Abstand zwischen benachbarten negativen Ladungen in dem Polymergrundgerüst ungefähr das zweifache desjenigen in einem Polynukleotidgrundgerüst. Deshalb würde die Bindung zwischen im wesentlichen allen der geladenen Gruppen des kationischen Schwanzes und den alternierend räumlich angeordneten negativen Ladungen des Polymergerüstes eine energetisch ungünstige Verwindung des Polymergerüstes erfordern. Es kann davon ausgegangen werden, daß, wo das Polymergrundgerüst eine alternierende geladen/ungeladene Konfiguration besitzt, der Abstand zwischen benachbarten positiven Ladungen im kationischen Schwanz dem Minimalabstand nahe kommen sollte, welcher eine starke elektrostatische Bindung zwischen dem Reporterschwanz und dem Polynukleotidgerüst vorsieht. Die Anforderung an den Ladungsabstand in dem Reporter wird natürlich wesentlich weniger kritisch, wo das Reagenz-Polymer eine Dichte von negativen Ladungen von weniger als einer pro zwei Untereinheit-Verknüpfungen aufweist, oder wo das Reagenz-Polymer ein ungeladenes Grundgerüst besitzt.
Es sei ebenfalls bemerkt, daß, wenn das Polymergerüst eine alternierende geladene/ungeladene Konfiguration aufweist, wie geladene Phosphodiesterbindungen im Wechsel mit ungeladenen Methylphosphonatbindungen, der kationische Reporter am wirksamsten zwischen den vollständig geladenen Polynukleotiden und dem Polymer unterscheiden kann, wenn dessen kationische Reste nicht fähig sind, Wasserstoffbrückenbindungen an die ungeladene Bindung, wie an den Doppelbindungssauerstoff der Methylphosphonat-Verknüpfung, auszubilden. Aus diesem Grunde ist es im allgemeinen vorteilhaft, für die kationischen Gruppen in einem derartigen Reporter quarternäre Ammoniumionen zu verwenden.
Die Anzahl von kationischen Resten in dem Reporterschwanz kann von zwei bis zu etwa 8 oder mehr gemäß der gesamten elektrostatischen Anziehung, welche erforderlich ist, um den Reporter an den Polynukleotidanalyten unter Bindungsbedingungen zu binden, bei denen der Reporter nicht an das Reagenz-Polymer-Gerüst bindet, variieren. Für Reporter mit relativ großen Reportergruppen, wie Enzymen, können mehrere elektrostatische Bindung erforderlich sein, um den Reporterschwanz an das Analytengrundgerüst anzuheften. Ein Reporterschwanz mit einer Anzahl von räumlich getrennt angeordneten kationischen Resten ist besonders geeignet für die Verwendung mit einem Reagenz, dessen Polymer-Gerüst ungeladen ist und daher keine elektrostatischen Bindungen an den Schwanz ausbilden kann. Verfahren zur Konstruktion eines kationischen Schwanzes, welcher zur Verwendung in der Erfindung geeignet ist, sind in den Fig. 11-13 umrissen. Im Hinblick zuerst auf Fig. 11, wird eine N- Methylaminosäure mit Di-t-butyldicarbonat (BOC) N-geschützt, mit Carbonyldiimidazol aktiviert und danach über eine Amidbindung an Dimethylamin gekoppelt. Nach dem Entschützen wird das Amid mit einer N-geschützten, Carbonyldiimidazol-aktivierten Aminosäure, aus dem obenstehenden, umgesetzt, um eine Diamidverbindung zu bilden, welche in der Mitte in Fig. 11 gezeigt ist. Die Entschützungsreaktion und die Reaktion mit einer Ngeschützten Diimidazol-aktivierten Aminosäure werden wiederholt, bis das Polyamid der gewünschten Länge gebildet ist.
Eine Reportergruppe wird typischerweise am einfachsten an eine primäre Amingruppe in dem Polykation angebracht. Um ein primäres Amin an das sekundäre Amin-Ende der Verbindung von Fig. 11 anzuheften, wird gemäß eines geeigneten Verfahrens eine Aminosäure, z. B. 4-Aminobuttersäure, BOC-geschützt, mit Diimidazol aktiviert und mit dem entschützten Polyamin umgesetzt, wie in der Fig. 12 veranschaulicht. Die resultierende BOC-geschützte Verbindung kann dann, nach Behandlung mit Trifluoressigsäure, um die BOC-Gruppe zu entfernen, durch Reaktion mit Boran-Tetrahydrofuran reduziert werden.
Die Fig. 13 zeigt ein Reaktionsschema zum Umwandeln von Polyamin, wie obenstehend synthetisiert, zu einem polyquarternären Ammoniumsalz. Das Verfahren beinhaltet das Schützen des terminalen 1º-Amins, gefolgt von Reaktion mit Methyliodid, um das polyquarternäre Ammoniumsalz zu bilden, und das Entschützen mit Trifluoressigsäure.
Die eine oder mehreren Reportergruppen in dem Reporter sollten (1) leicht an den kationischen Schwanz angeheftet werden, und (2) fähig zur Erzeugung eines einfach nachzuweisenden Signals sein, entweder, wenn der Reporter an ein Polynuldeotidgerüst gebunden ist, oder nachdem der Reporter von dem Analyten eluiert worden ist. Kleine Reportergruppen, welche Chromophore, wie Nitroanilin oder andere stark absorbierende Farbstoffe, und Fluorophore, wie Dansyl oder Rhodamin-basierende fluoreszente Moleküle, einschließen, sind geeignet und besitzen den Vorteil, daß sie mittels photometrischer Ausrüstung ohne weiteres nachgewiesen werden können, oder im Falle von Farbstoffen, durch visuelle Betrachtung. Radioisotopen-Reportergruppen können Vorteile hinsichtlich der diagnostischen Empfindlichkeit vorsehen, aber der Reporter-Nachweis kann komplexer und kostspielig sein. Stabile paramagnetische Moleküle, wie Nitroxid-Spin-Markierungen, können ebenfalls verwendet werden, wobei die Bindung des Reporters an das nachzuweisende Polynukleotid durch eine Erweiterung von Elektronenspin-Resonanz-(esr)-Absorptionslinien, welche charakteristisch für immobilisierte paramagnetische Spezies sind, nachgewiesen wird.
Eine andere Klasse von geeigneten Reportergruppen schließt Ligandenmoleküle, und vorzugsweise kleine antigene Moleküle ein, welche fähig sind, spezifisch und mit hoher Affinität an Anti-Ligandenmoleküle zu binden. Exemplarische Ligand/Anti-Ligand-Paare schließen Antigene/Antikörper, Lectin/Kohlenhydrat und Biotin/Avidin ein. Das Anti- Ligandmolekül ist Teil eines signalerzeugenden Bindungskonjugates, welches ebenfalls eine signalerzeugende Gruppe beinhaltet, wie ein Chromophor, Fluorophor oder Enzym, durch welche die Gegenwart von Ligandengruppen nachgewiesen werden kann, wenn eine Ligand/Anti-Ligand-Bindung stattgefunden hat.
Der Reporter kann Enzym-Reporterreste aufweisen, insbesondere, wie obenstehend bemerkt, wenn der Reporterschwanz mehr als zwei kationische Gruppen besitzt. Repräsentative Klassen von Enzymen sind Oxidoreduktasen, wobei Luciferase, Glucoseoxidase, Galactoseoxidase und Katalase typische Beispiele sind; Hydrolasen, typischerweise verschiedene Arten von Phosphatasen; Glykosylhydrolasen, wie β-Galactosidase; Peptidasen und Lyasen.
Die Reportergruppe oder -gruppen werden typischerweise an ein Amin des polykationischen Schwanzes, und vorzugsweise an ein primäres Amin, gemäß bekannten Kopplungsverfahren gekoppelt. In einem, in der Fig. 15 veranschaulichten, bevorzugten Verfahren wird ein Polyamin mit einem geeigneten bifunktionalen Kopplungsmittel, wie 4-Fluor-3-nitrophenylacid, umgesetzt und danach an eine Reportergruppe, wie ein Enzym, zum Beispiel eine alkalische Phosphatase-Reportergruppe, gekoppelt. Eine Vielzahl von biftuiktionellen Reagenzien zur Kopplung von Aminen an reaktive Reportergruppen, wie Amin-, Carboxyl-, OH-, und Sulhydral-Gruppen, ist gut bekannt. In einem anderen bevorzugten, in der Fig. 15 veranschaulichten Verfahren wird ein Reporter durch Umsetzen von Bis-3,3'- aminopropylmethylamin mit einer aminreaktiven Dansylgruppe hergestellt. Das Reaktionsschema in der Figur zeigt auch, wie die Aminoreste des Reporterschwanzes, vor der oder im Anschluß an die Reporter-Kopplung an den Schwanz, vollständig alkyliert werden können. Details des Verfahrens sind im Beispiel 19 angegeben.

VII. Diagnostisches Verfahren

Dieser Abschnitt beschreibt die Anwendung des obenstehend beschriebenen diagnostischen Systems für die Bestimmung eines Polynukleotid-Analyten. Der Analyt kann ein solcher sein, welcher normalerweise in einer einzelsträngigen Form existiert, wie Botschafter-RNA (mRNA), ribosomale RNA (rRNA) oder ein einzelsträngiges virales RNA- oder DNA-Genom, oder ein solcher, welcher unter physiologischen Bedingungen in einer doppelsträngigen oder Duplex-Form existiert, wie doppelsträngige virale RNA, RNA/DNA-Virenreplikations- Zwischenstufen und Duplex-DNA, wie diejenige, welche aus einem Virus, einem Bakterium oder einer eukaryontischen Zelle abgeleitet ist. Die bei der Auswahl einer Zielsequenz in dem Analyten-Polynukleotid, gegen welche die Reagenz-Polymere zielgerichtet sind, angewandten Erwägungen und Überlegungen werden im Abschnitt I in Betracht dargelegt.
Bei der Durchführung der Diagnose wird eine Probe, welche hinsichtlich des Analyten überprüft werden soll, typischerweise durch herkömmliche klinische Probenbehandlungstechniken abgesammelt. Falls der Analyt ein aus einem Virus oder Bakterium abgeleitetes Polynukleotid ist, ist es häufig nützlich, die Probe zuerst zu verarbeiten, um größeres Nicht- Analyten-Zellmaterial zu entfernen. Beim Assay auf das Vorhandensein eines viralen Pathogens, zum Beispiel, ist es häufig nützlich, die Probe durch eine Membran mit 0,2 um bzw. Mikron Porengröße zu filtrieren, um bakterielles Material zu entfernen. Beim Assay auf das Vorhandensein eines bakteriellen Pathogens ist es häufig nützlich, die Probe durch eine Membran mit 1,0 Mikron Porengröße zu filtrieren, um eukaryontische Zellen zu entfernen, welche ebenfalls in der Probe vorhanden sein können. Typische Proben-Präparations-Verfahren sind für die Diagnose von viralen Pathogenen in den Beispielen 21 und 22 beschrieben.
Um das Probenanalyt-Material in einer für die Bindung an das Reagenz-Polymer geeigneten Form herzustellen, sollte die Probe behandelt werden, um die Nukleinsäure des Organismus freizusetzen. Für Organismen, denen Zellwände fehlen, sind Detergenzien und/oder chaotrope Salze im allgemeinen angemessen. Für Organismen mit Zellwänden können Alkali (wenn der Analyt DNA ist) oder geeignete Enzyme (z. B. Lysozym für viele Bakterien) verwendet werden. Falls gewünscht, können die freigesetzten Nukleinsäuren zweckmäßig von Proteinen und anderen Kontaminanten durch Zusetzen eines chaotropen Salzes (Natriumtrichloracetat), gefolgt von selektiver Präzipitation der Nukleinsäure mit Ethanol, abgetrennt werden.
Ein wirksames Verfahren zum Freisetzen und Isolieren von Nukleinsäurematerial aus viralen oder Zell-Komponenten ist vom Erfinder in Anal. Biochem. (1983) 133 : 79, beschrieben worden. Das Verfahren, welches im Beispiel 21 ausführlich angegeben ist, beinhaltet das Suspendieren der Probe in 4 M Trichloracetat, 100 mmol EDTA, um proteinartiges Material zu denaturieren und zu solubilisieren, und danach das Präzipitieren des freigesetzten Nukleinsäurematerials in der Salzlösung durch die Zugabe eines gleichen Volumens an kaltem Ethanol. Ein Träger-Polynukleotid, wie Polyuridylsäure, kann zugesetzt werden, um die Nukleinsäurefällung zu erleichtern. Nach einer kurzen Abkühlzeit wird die gefällte Nukleinsäure durch Zentrifugation pelletiert und mit wäßrigem Ethanol gewaschen, um Salz zu entfernen.
Die Nukleinsäurefraktion wird in Annealingpuffer mit einer ausgewählten Salzkonzentration und einem Chealtbildnermittel für zweiwertige Kationen resuspendiert. Ein Annealingpuffer, der etwa 100 mmol oder weniger an einwertigem Salz, wie NaCl, und etwa 10 mmol Chelatbildnermittel, wie EDTA, enthält, ist im allgemeinen geeignet für die Bindung eines Polynukleotids, welches normalerweise in einer Duplex-DNA-Form existiert. Eine Salzkonzentration, welche bedeutend unterhalb 100 mmol liegt, kann schwierig mit Genauigkeit zu erreichen sein. Höhere Salzkonzentrationen, insbesondere überhalb etwa 0,5 M, neigen dazu, die Doppelstrangbildung zwischen komplementären Polynukleotidstrangen zu gestatten, was zur Kompetition zwischen dem Reagenz-Polymer und dem komplementären Strang um die Bindung an das Analyt-Polynukleotid führt. Die Doppelstrangbildung zwischen komplementären Polynukleotiden wird ebenfalls durch das Chelatierungsmittel inhibiert, welches wirksam ist, um Mg&spplus;²- und Car&spplus;&spplus;-Ionen in der Annealingmischung zu sequestrieren. Falls der Analyt eine RNA ist, kann es vorteilhaft sein, die Probe mit DNase zu behandeln, um eine Kompetition zwischen dissoziierter DNA und dem RNA-Analyten um die Bindung an das Reagenz-Polymer zu verhindern.
Die Annealingreaktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur durchgeführt, welche etwa 5ºC bis 15ºC unterhalb der Schmelztemperatur der Analyt/Polymer-Duplexstruktur liegt, welche sich während der Reaktionsdauer bildet. Diese Annealingtemperatur begünstigt eine wahrheitsgetreue Basensequenzpaarung zwischen der Analyt-Zielsequenz und dem Polymer. Wie obenstehend angedeutet, ist, wo das Analyt-Polynukleotid normalerweise mit seinem komplementären Strang als eine Duplexstruktur existiert, die Reaktionstemperatur vorzugsweise höher als die Schmelztemperatur des nativen Polynukleotid-Doppelstranges, um die unerwünschte Paarung des Analyten mit seinem komplementären Polynukleotid zu vermeiden, welche mit der erwünschten Paarung des Analyten mit dem Reagenz-Polymer kompetitiert. Bei einer Annealingpuffer-Konzentration von etwa 100 mmol an einwertigem Kation sind Annealingtemperaturen im Bereich von 24ºC bis 60ºC im allgemeinen geeignet. Wie früher bemerkt, ist die tatsächliche optimale Annealing-Temperatur eine Funktion der Länge des Bindungspolymeren, dessen Verhältnis von A + T- zu C + G-Erkennungsresten, und, für teilweise geladene Polymeren, der Salzkonzentration.
In Abhängigkeit von den Strukturmerkmalen des Polymeren, wie obenstehend erörtert, kann die Schmelztemperatur der Analyt/Polymer-Duplexstruktur wesentlich höher sein als eine bevorzugte Reaktionstemperatur, wie 37ºC, in dem jeweiligen verwendeten Annealingpuffer, wie 100 mmol an einwertigem Salz. In solchen Fällen kann es zweckmäßig sein, die Schmelztemperatur der Polymer/Analyt-Duplexstruktur auf die gewünschte Temperatur durch Zusetzen eines Denaturierungsmittels, wie Formamid, zu senken. Um die zur Erreichung der gewünschten Schmelztemperatur benötigte Menge an Formamid zu bestimmen, wird die Schmelzkurve des Polymeren und der Zielsequenz, welches ein synthetisches Oligonukleotid mit der Analyt-Zielsequenz sein kann, durch herkömmliche Methoden und bei einer Anzahl von unterschiedlichen Denaturierungsmittel-Konzentrationen bestimmt, und sie liegt, im Falle von zugesetztem Formamid, typischerweise im Bereich zwischen etwa 5 Vol.% und 50 Vol.% an Denaturierungsmittel. Aus dieser Bestimmung wird die Menge an Formamid bestimmt, welche in dem Annealingpuffer benötigt wird, um eine Schmelztemperatur von etwa 5º bis 15º überhalb der gewünschten Reaktionstemperatur zu erzielen.
Die Analyt-Probe im Reaktionspuffer wird zu dem diagnostischen Reagenz vorzugsweise unter Bedingungen zugesetzt, bei welchen die Bindungspolymere des Reagenz in einem 10-1000- fachen molaren Überschuß über der molaren Konzentration von Analytmolekülen in der Assaymischung vorhanden sind. Die Polymer/Polynukleotid-Annealingreaktion wird bei der ausgewählten Reaktionstemperatur während einer Zeitdauer durchgeführt, welche ausreichend ist, um ein wesentliches Polymer/Analyt-Annealing zu gestatten, typischerweise zwischen 10 Minuten und 3 Stunden. Das feste Träger-Reagenz wird ein- oder mehrmals gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.
Der Reporter wird dann zu dem gewaschenen Reagenz unter vorher ausgewählten Bedingungen zugesetzt, um Reportermoleküle an das vollständig geladene Grundgerüst des Reagenz-gebundenen Analyten zu binden. Die Raumanordnungs/Ladungs-Charakteristika des Reporters, welche die ausgewählte Bindung des Reporters an das Polynukleouidgerüst erlauben, sind obenstehend erörtert worden. Wo das Reagenz-Polymer einige negative Gerüstladungen aufweist, ist ein wichtiger Faktor die Salzkonzentration des Bindungsmediums. Bei sehr niedrigen Salzkonzentrationen sind elektrostatische Wechselwirkungen stärker, und dies kann zur unerwünschten Bindung des Reporters an die weit auseinander angeordneten anionischen Gruppen des Reagenz-Polymers führen. Bei sehr hohen Salzkonzentrationen kann, im Gegensatz dazu, die Abschirmung von elektrostatischen Ladungen die erwünschte Bindung des Reporters an die nahe zu einander räumlich angeordneten anionischen Gruppen des Analyt- Grundgerüsts verhindern. Die optimale Salzkonzentration des Bindungsmediums ist die Maxi mum- oder beinahe Maximum-Konzentration an einwertigem Salz, welche eine angemessene elektrostatische Bindung des Reporters an das vollständig geladene Analyt-Grundgerüst erlaubt. Diese optimale Salzkonzentration kann durch Gleichgewichtsdialysetechniken ermittelt werden, in welchen die Bindung des diffundierbaren Reporters an ein nicht-diffundierbares Polynukleotid als eine Funktion von Salzkonzentration des Suspendierungsmediums gemessen wird. Optimale Ionenstärkebedingungen für die Reporterbindung an den Analyten können ebenfalls ohne weiteres durch Bindung des Reporters an immobilisiertes Polynukleotid unter Niedrigsalzbedingungen und Eluieren des Reporters mit einem Salzgradienten ermittelt werden.
Die Bindungskomponenten in dem diagnostischen System, wie sie im diagnostischen Verfahren der Erfindung funktinieren, sind nachstehend in Fig. 16 gezeigt. Hier ist "S" der feste Träger mit einer Anzahl von Bindungspolymeren, welche an dessen Oberfläche über Spacer-Arme angeheftet sind, welche durch Sägezahnlinien angezeigt sind, und die "m"- und "p"- Untereinheitverknüpfungen repräsentieren ungeladene stereoisomerisch definierte Methylphosphonat- bzw. geladene Phosphodiester-Bindungen. Der Reporter hat einen dikationischen Schwanz und eine Reportergruppe R. Aus Zwecken der Veranschaulichung besitzt jedes Polymer die Erkennungsrestsequenz, welche komplementär zu der ausgewählten 16 Basen langen Zielsequenz im Herpes simplex-Virus, Typ I und II, ist, wie beschrieben im Beispiel 21. Die Basen-komplementäre Bindung eines von diesen Polymeren an die Zielsequenz in einem Herpes simplex-Analyt-Polynukleotid ist gezeigt.
Der in der Figur gezeigte Reporter ist der dikationische Reporter aus Beispiel 19. Jeder Reporter ist ausgelegt, um durch elektrostatische Anziehung an ein Paar von benachbarten Phosphodiesterbindungen in dem Polynukleotid über elektrostatische Anziehung mit benachbarten Phosphodiesterbindungen zu binden. Die Reportermoleküle sind in ihrer erwarteten Bindungskonfiguration gezeigt, worin im wesentlichen jede Phosphodiesterbindung mit einem Reporterkation gepaart ist und die Reportermoleküle Kopf an-Kopf und Schwanzan-Schwanz angeordnet sind. Unter Annahme einer Maximaldichte von gebundenen Reportermolekülen kann davon ausgegangen werden, daß ein N-Basen großer Analyt bis zu etwa N/2 Reportermoleküle binden kann. Allgemeiner gesagt, führt das Assayverfahren, in Abhängigkeit von der Größe des Analyten und der relativen Anzahl sowohl von Reporterresten als auch kationischen Gruppen pro Reporter, ohne weiteres zur Bindung von tausenden bis mehreren hunderttausend oder mehr Reportermolekülen an jedes Reagenz-gebundene Analytmolekül. Die Empfindlichkeit des Nachweises kann deshalb zwischen 2 und 4 Größenordnungen größer als bei existierenden Typen von Polynukleotid-basierenden Diagnostika sein, in denen der Analyt-Nachweis im allgemeinen auf einem oder einigen Sondenmolekülen pro Analyt-Molekül basiert, wobei jede Sonde typischerweise grob 100 Reporterreste enthält.
Nach der Reaktion mit der Reporterlösung, typischerweise bei Raumtemperatur während 1-2 Minuten, wird das Reagenz gewaschen, um nicht-gebundenen Reporter zu entfernen und kann danach direkt hinsichtlich gebundenem Reporter untersucht werden. Bei der Bestimmung der mit dem Reagenz assoziierten Menge an Reporter kann es wünschenswert sein, insbesondere im Falle von fluoreszenten oder chromophoren Reportergruppen, den Reporter von dem Reagenz mit einer Hochsalzlösung zu eluieren und danach das Eluat hinsichtlich des Reporters zu überprüfen. Andere Typen von Reportergruppen, wie Enzyme, können ohne weiteres überprüft werden, wobei die Reporter entweder an das Reagenz gebunden oder davon eluiert vorliegen. Verfahren zur Bestimmung einer Vielzahl von unterschiedlichen Reportergruppen, wie den obenstehend erwähnten, sind gut bekannt. Die Beispiele 21 bzw. 22 veranschaulichen diagnostische Verfahren, welche auf der Bestimmung von fluoreszenten bzw. enzymatischen Reportern basieren.
Aus dem Vorstehenden kann eingeschätzt werden, wie verschiedene Ziele und Merkmale der Erfindung erreicht werden. Das Morpholino-basierende Polymer kann leicht, durch den Entwurf des Reagenz-Polymeren, für den Nachweis irgendeines Ribo- oder Desoxyribopolynukleotides, welches eine einmalige Basenpaarsequenz aufweist, maßgeschneidert werden. Ferner kann das Reagenz-Polymer maßgeschneidert werden, um eine gegebene Zielsequenz mit hoher Sequenzspezifität bei einer zweckmäßigen Temperatur zu binden.
Für den Nachweis von Duplex-Polynukleotiden kann die Basenpaarungsreaktion unter Niedrigsalz- und/oder Denaturierungsbedingungen durchgeführt werden, welche die Kompetition durch komplementäre Polynukleotidstränge gegen die Analyt-Bindung an das Reagenz zu verhindern. Dieses diagnostische System stellt deshalb den Vorteil des auf einem festen Träger erfolgenden Einzelsonden-Polynukleotid-Diagnosesystems des Stands der Technik dahingehend zur Verfügung, daß eine Kompetition zwischen komplementären Strängen eliminiert wird, aber vermeidet die ziemlich arbeitsaufwendigen Schritte, welche mit diesem System beim Anheften von einzelsträngigen Testnukleinsäuren an den festen Träger assoziiert sind. Zur gleichen Zeit vermeidet das System die Probleme, welche mit dem früher beschriebenen Doppel-Sonden-Polynukleotid-Diagnosesystem assoziiert sind, dadurch daß der Analytnachweis auf einer Kinetik von pseudo-erster Ordnung basiert und lediglich ein Sequenz-spezifisches Bindungspolymer erforderlich ist.
Gemäß einem anderen wichtigen Merkmal der Erfindung basiert die Reporterbindung an den Analyten auf Sequenz-unabhängigen elektrostatischen Wechselwirkungen anstatt Sequenzspezifischer Bindung, wie in bestehenden Typen von Polynukleotid-Diagnostika. Folglich kann der Reporter selbst verhältnismäßig kostengünstig hergestellt werden, kann mit dem Analyten schnell und unter einem weiten Bereich von Bedingungen reagieren und kann, am wichtigsten, an den Analyten bei einer Dichte binden, welche bis zu mehreren Reporterresten pro Polynukleotiduntereinheit in dem Analyt reicht. Folglich kann die Empfindlichkeit des diagnostischen Systems im Bereich von 2 bis 4 oder mehr Größenordnungen größer sein als bei existierenden Tests, welche auf dem Nachweis einer oder einiger weniger Sonden, welche eine begrenzte Anzahl von Reporterresten enthalten, pro Analytmolekül beruhen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, aber mit ihnen wird in keiner Weise beabsichtigt, den Umfang der Erfindung einzuschränken. Ferner kann auf die EP-A-639 582 Bezug genommen werden.

Beispiel 1

Herstellung von Ribonukleosiden und Desoxyribonukleosiden

Die folgenden Nukleoside werden von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erhalten: Desoxyuridin, Desoxyguanosin, Thymidin, Desoxyadenosin, Desoxycytidin, 5-Bromdesoxyuridin, Desoxyinosin, 2,6-Diamino-9-(2-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)-9H-purin (2,6- Diaminopurindesoxyribosid), Uridin, Guanosin, 5-Methyluridin, Adenosin, Cytidin, 5- Bromuridin, Inosin.
2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)-9H-purin (2,6-Diaminopurinribosid) wird von Pfaltz and Bauer, Inc., Division of Aceto Chemical Co., Inc., Waterbury, CT, erhalten.
Die folgenden Nukleoside werden durch die angegebenen Literatur-Verfahren hergestellt:
1-(2-Desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)-2-pyrimidinon (2-Hydroxypyrimidindesoxyribosid) wird durch das Verfahren P. Kohler, E. Volz, U. Sequin und C. Tamm in Nucleic Acid Chemistry (Hrsg.: L. B. Townsend und RS. Tipson), John Wiley and Sons, Inc. (1976), hergestellt.
1-(2-Desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)-4-methoxy-2-pyrimidinon wird durch das folgende Verfahren hergestellt:
1-(3',5'-Di-O-benzoyl-2-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)-4-methylthio-2-pyrimidinon (hergestellt wie in D. Cech und A. Holy, Collection of Czechoslov. Chem. Comm. (1977) 42 : 2246) wird mit 200 ml an 0,2 M Natriummethoxidlösung behandelt. Die resultierende Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Diese Lösung wird dann mit Dowex 50X8 (H&spplus;-Form) neutralisiert und gefiltert; der Rückstand wird in Wasser gelöst (100 ml), mit Ether (2,50 ml) extrahiert, und die wäßrige Phase wird eingedampft. Der Rückstand ist ein amorphes Material, welches direkt in anschließenden Reaktionen verwendet wird.
2-Amino-9-(2-desoxy-β-D-erythropentofuranosyl)-1,9-dihydro-6H-purin-6-thion (Desoxythioguanosin) wird durch das Verfahren von R H. Iwamoto, E. M. Acton, und L. Goodman, J. Med. Chem. (1963) 6 : 684, hergestellt.
1-(β-D-Ribofuranosyl)-2-pyrimidinon (2-Hydroxypyrimidinribosid) wird durch das Verfahren von U. Niedballa und H. Vorbruggen, J. Org. Chem. (1974) 39 : 3668, hergestellt.
1-(2-Desoxy-β-D-ribofuranosyl)-4-methoxy-2-pyrimidinon (2-Hydroxypyrimidindesoxyribosid) wird durch das Verfahren von R. Wightman und D. Holy, Collection of Czechoslov. Chem. Comm. (1973) 3 8 : 13 81, hergestellt.
2-Amino-9-(β-D-ribofuranosyl)-1,6-dihydro-6H-purin-6-thion (Thioguanosin) wird durch das Verfahren von J. J. Fox, I. Wempen, A. Hampton und I. L. Doerr, J. Amer. Chem. Soc. (1958) 80 : 1669, hergestellt.

Beispiel 2

Herstellung von Basen-geschützten Nukleotiden

Dimethoxytritylchlorid, N-Benzoyladenosin, N-Benzoyl-2'-desoxyadenosin, N-Benzoylcytidin, N-Benzoyl-2'-desoxycytidin und N-Isobutyryl-2'-desoxyguanosin werden von Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, erhalten. 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid (FMOC-Chlorid), Trimethylchlorsilan, Isobuttersäureanhydrid, 4-Nitrobenzoylchlorid und alle organischen Lösungsmittel für Reaktionen und Chromatographie werden von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, erhalten. Silica-Gel wird von EM Science, Cherry Hill, New Jersey, erhalten.

2.1 Guanosin

Das N-2-9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Derivat wird durch das nachstehende Verfahren hergestellt, welches für den Schutz von Nukleosid-Aminogruppen allgemein ist:
Guanosin (1 mmol) wird in Pyridin (5 ml) suspendiert und mit Trimethylchlorsilan (5 mmol) behandelt. Nachdem die Lösung 15 Minuten lang gerührt wurde, wird 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid (5 mmol) zugegeben und die Lösung 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten. Die Reaktion wird in einem Eisbad abgekühlt und Wasser (1 ml) wird zugesetzt. Nach 5 Minuten langem Rühren wird konzentrierter Ammoniak (1 ml) zugegeben und die Reaktion 15 Minuten lang gerührt. Die Lösung wird bis fast zur Trockenheit eingedampft und der Rückstand wird in Chloroform (10 ml) gelöst. Diese Lösung wird mit Natriumbicarbonat- Lösung (5 ml, 10%) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird mehrere Male mit Toluol co-evaporiert, und das Produkt wird auf Silica-Gel unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Methylenchlorid (0-50%) chromatographiert.
N-Isobutyrylguanosin wird durch das Verfahren von Letsinger und Miller, J. Amer. Chem. Soc. (1969) 91 : 3356, hergestellt.
N-2-Acetylguanosin wird durch das Verfahren von C. B. Reese und R S. Safihill, J. Chem. Soc. Perkin. Trans. (1972) 1 : 2937, erhalten.

2.2 Desoxyguanosin

Das N-2-9-Fluorenylinethoxycarbonyl-Derivat wird durch das Verfahren von J. Heikkla und J. Chattopadhyaya, Acta. Chem. Scand. (1983) B37 : 263, hergestellt.
Das N-2-Acetyl-Derivat wird von Research Plus Inc., Bayonne, N. J.,erhalten.

2.3 Desoxyadenosin

Das N-6-2-(4-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird durch das Verfahren von F. Himmelsbach und W. Pfleiderer, Tetrahedron Lett. (1983) 24 : 3583, hergestellt.
N-6-4-Nitrobenzoyl-2'-desoxyadenosin wird unter Verwendung des obenstehenden Verfahrens für FMOC-Guanosin hergestellt, außer daß 4-Nitrobenzoylchlorid anstatt FMOC-Chlorid eingesetzt wird.
Das N-6-2-(Phenylsulfonyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird durch das Verfahren für FMOC- Guanosin hergestellt, außer daß das 2-(Phenylsulfonyl)-ethylchlorformiat (erhalten von N. Balgobin, S. Josephson und B. Chattopadhyaya, Tetrahedron Lett. (1981) 22 : 3667) als das Acylierungsmittel und N-Methylimidazol oder Pyridin als das Lösungsmittel verwendet wird.

2.4 Adenosin

Das N-6-2-(4-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird durch das Verfahren von F. Himmelsbach und W. Pfleiderer, Tetrahedron Lett. (1983) 24 : 3583, hergestellt.
N-6-4-Nitrobenzoyladenosin wird unter Verwendung des obenstehenden Verfahrens für FMOC-Guanosin hergestellt, außer daß 4-Nitrobenzoylchlorid anstatt FMOC-Chlorid eingesetzt wird.
Das N-6-2-(Phenylsulfonyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird durch das Verfahren für FMOC- Guanosin hergestellt, außer daß das 2-(Phenylsulfonyl)-ethylchlorformiat (erhalten von N. Balgobin, S. Josephson und B. Chattopadhyaya, Tetrahedron Lett. (1981) 22 : 3667) als das Acylierungsmittel und N-Methylimidazol oder Pyridin als das Lösungsmittel verwendet wird.

2.5 Desoxycytidin

Das N-4-2-(4-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird durch das Verfahren von F. Himmelsbach und W. Pfleiderer, Tetrahedron Lett. (1983) 24 : 3583, hergestellt.
Das N-6-2-(Phenylsulfonyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird durch das Verfahren für FMOC- Guanosin hergestellt, außer daß 2-(Phenylsulfonyl)-ethylchlorformiat (erhalten von N. Balgobin, S. Josephson und B. Chattopadhyaya Tetrahedron Lett. (1981) 22 : 3667) als das Acylierungsmittel und N-Methylimidazol oder Pyridin als das Lösungsmittel verwendet wird.

2.6 Cytidin

Das N-4-2-(4-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird durch das Verfahren von F. Himmelsbach und W. Pfleiderer, Tetrahedron Lett. (1983) 24 : 3583, hergestellt.
Das N-6-2-(Phenylsulfonyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird durch das Verfahren für FMOC- Guanosin hergestellt, außer daß das 2-(Phenylsulfonyl)-ethylchlorformiat (erhalten von N. Balgobin, S. Josephson und B. Chattopadhyaya Tetrahedron Lett. (1981) 22 : 3667) als das Acylierungsmittel verwendet wird, und N-Methylimidazol oder Pyridin als das Lösungsmittel verwendet wird.

2.7 2,6-Diaminopurinribosid

Das N-2,N-6-Bis(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-Derivat von 2,6-Diaminopurinribosid wird durch das allgemeine Verfahren hergestellt.
Das N-2,N-6-Bis(isobutyryl)-Derivat wird durch das allgemeine Verfahren hergestellt.

2.8 2,6-Diaminopurin-2'-desozyribosid

Das Bis-N-2,N-6-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-Derivat von 2,6-Diaminopurin-2-desoxyribosid wird durch das allgemeine Verfahren hergestellt.

2.9 Thioguanosin

Das N-2-9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Derivat von Thioguanosin wird durch das allgemeine Verfahren hergestellt.

2.10 2'-Desogythioguanosin

Das N-2-9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Derivat von 2'-Desoxythioguanosin wird durch das allgemeine Verfahren hergestellt.

Beispiel 3

Herstellung von aus Ribonukleosiden abgeleiteten Untereinheiten vom Morpholino-Typ

Ammoniumbiborat, Natrium-m-periodat, Natriumcyanoborhydrid, Uridin, N4-Benzoylcytidin und N6-Benzoyladenosin werden von Sigma Chemical Co. erhalten. N2-Isobutyrylguanosin wird durch das allgemeine Verfahren von Letsinger und Miller (J. Amer. Chem. Soc. (1969) 91 : 3356) hergestellt. 2-Phenyl-2-propanol und Bis(p-nitrophenyl)carbonat werden von Aldrich Chemical Co. erhalten.
Das Morpholinoderivat von Uridin wird durch Auflösen von 1 mmol Uridin plus 2 mmol Ammoniumbiborat, (NH&sub4;)&sub2;B&sub2;O&sub7;, in 5 ml Wasser hergestellt. Während dem Rühren in einem vor direktem Licht geschützten Eisbad werden 1,2 mmol Natrium-m-periodat in 5 ml Wasser zugesetzt. Nach 90 Minuten werden 0,2 ml 1,2-Propandiol zugegeben und das Rühren wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Danach werden, während Rühren in einem gut belüfteten Abzug, 0,25 g Natriumcyanoborhydrid, gelöst in 3 ml Wasser, zugegeben und die Mischung wird 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird die Reaktionsmischung unter Vakuum in einem Warmwasserbad zu einem Öl eingeengt, in einem minimalen Volumen von Methanol resuspendiert, auf eine Silicagel-Chromatographie-Säule aufgeschichtet, und die Säule wird mit Methanol/1% Triethylamin eluiert. Das Morpholino-Produkt eluiert von der Säule als eine scharfe Bande, welche sich signifikant langsamer bewegt als das ursprüngliche Ribonukleosid und dessen Oxidationsprodukte. Das Morpholino-Produkt besitzt ein im wesentlichen zum Eltern-Ribonukleosid identisches UV-Spektrum, aber seine Masse ist um 17 Dalton geringer (ermittelt durch Massenspektralanalyse unter Verwendung von Aktivierung durch Bombardement mit schnellen Atomen).
Das Morpholino-Stickstoffatom wird als nächstes durch Umsetzen des Produktes mit 2-Phenylisopropylphenylcarbonat geschützt. Das erforderliche aktive Carbonat wird hergestellt und mit der Morpholino-Untereinheit, im wesentlichen durch die Verfahren von Sandberg und Ragmarsson (Int. J. Peptide Protein Res. (1974) 6 : 111) umgesetzt. Schließlich kann, falls gewünscht (abhängig von dem für den Zusammenbau von Untereinheiten zu Polymeren zu verwendenden Verfahren), das Hydroxyl an der Position, welche dem ursprünglichen 5' entspricht, durch Lösen der N-geschützten Untereinheit in einem minimalen Volumen an trockenem Dimethylformamid und Zusetzen von 2 Äquivalenten Bis(p-nitrophenyl)carbonat plus 0,2 Äquivalenten an Triethylamin, N-Methylimidazol oder N,N-Dimethylaminopyridin aktiviert werden. Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung hinsichtlich des Volumens unter Vakuum in einem Warmwasserbad eingeengt. Der dicke Sirup wird in einem kleinen Volumen an Dichlormethan resuspendiert und auf eine Silicagel-Säule aufgeschichtet, welche anschließend mit einer Mischung von Dichlormethan/Ether (1 : 1, bezogen auf Volumen), 0,2 Vol.-% in N,N-Dimethylanilin, eluiert wird. Mit diesem Lösungsmittelsystem bewegt sich das aktivierte Produkt wesentlich langsamer als p- Nitrophenol und Bis(p-nitrophenyl)carbonat, aber viel schneller als das nicht umgesetzte Ausgangsmaterial. Das aktivierte Produkt wird ohne weiteres auf Silicagel-Dünnschichtchromatographie- bzw. TLC-Platten, einfach durch Exponieren an Ammoniakdämpfe, woraufhin ein gelbes Nitrophenolat-Ion innerhalb von ein bis zwei Minuten erzeugt wird, sichtbar gemacht.
Andere Ribonukleoside (Basen geschützt, falls notwendig, wie in Beispiel 2) werden durch im wesentlichen die gleichen Verfahren in ihre entsprechenden Morpholino-Derivate umgewandelt - - obwohl variierende Mengen an Methanol zugegeben werden müssen, um die Auflösung der geschützten Ribonukleoside vor dem anfänglichen Periodat-Oxidationsschritt zu bewirken.
Wenn die Untereinheiten vom Morpholino-Typ über Thiocarbamat-Bindungen gekoppelt werden sollen, sind die bevorzugten Basenschutzgruppen für die gewöhnlichen Ausgangs- Ribonukleoside: der Phenylsulfonylethoxycarbonyl-Rest für Cytidin und Adenosin und der 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Rest für Guanosin.

Beispiel 4

Herstellung von Purin- und Pyrimidin-t-BOC-Aminosäuren

Das nachstehend beschriebene allgemeine Verfahren für das Cytosin-Pyrrolidon kann auf alle geeignet geschützen Pyrrolidon-Derivate angewandt werden. Das als die t-BOC-Säure bezeichnete Produkt wird durch Spaltung des Pyrrolidonringes zu einer Säure und einem t- BOC-Amin gebildet.

4.1 Herstellung der Cytosin-t-BOC-Säure

N-4-Anisoylcytosin-pyrrolidon (1 mmol) wird in Methylenchlorid (0,5 M Lösung) gelöst, welches Di-tert-butyldicarbonat (2 mmol), Triethylamin (1 mmol) und Dimethylaminopyridin (1 mmol) enthält. Die Lösung wird 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die flüchtigen Bestandteile werden entfernt und der Rückstand auf Silica unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform (0-20%) gereinigt. Der Rückstand wird in Tetrahydrofuran (0,2 M Lösung) gelöst, wozu danach Lithiumhydroxid (3 mmol, als eine Lösung von 1 M) zugesetzt wird. Nach 5 Stunden bei Raumtemperatur wird die Lösung durch die Zugabe von 10% Essigsäure (3 mmol) neutralisiert, und die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 9 N Ammoniak gelöst und 1-10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird unter vernngertem Druck entfernt und der Rückstand durch Chromatographie auf C18-Umkehrphasen-Silicagel gereinigt, wobei Wasser- und Methanol- (oder Trifluorethanol-) Mischungen verwendet werden.

4.2 Herstellung von Uracil-t-BOC-Säure

Diese wird aus der Cytosin-t-BOC-Säure durch das nachstehende Verfahren hergestellt:
Die Cytosin-t-BOC-Säure (1 mmol) wird in wäßriger Essigsäure gelöst und mit Natriumnitrit (1 mmol) bei 4ºC behandelt. Die Mischung wird 1 Stunde lang gerührt und unter verringertem Druck bis zur Trockenheit eingedampft. Das Produkt wird durch Chromatographie in C18- Umkehrphasen-Silicagel unter Verwendung von Wasser- und Methanol- (oder Trifluorethanol) Mischungen gereinigt.

4.3 Herstellung von 5-Bromuracil-t-BOC-Säure

Diese Verbindung wird aus der Uracil-t-BOC-Säure durch das folgende Verfahren erhalten:
Die Uracil-t-BOC-Säure (1 mmol) wird in DMF (3 ml) gelöst und mit N-Bromsuccinimid (1,2 mmol) behandelt. Die Lösung wird 16 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Entfernen der Lösungsmittel unter veringertem Druck wird das Produkt durch Chromatographie auf C18-Umkehrphasen-Silicagel gereinigt, wobei Mischungen aus Wasser und Methanol (oder Trifluorethanol) verwendet werden.

4.4 Herstellung von N-geschützter t-BOC-Säure

Dieses allgemeine Verfahren zum Acylieren der exocyclischen Aminoguppen des Erkennungsrestes ist ebenfalls auf die Schützung des Adenosin-Derivates anwendbar.
Die Cytosin-t-BOC-Säure (1 mmol) aus dem vorhergehenden Abschnitt wird in N- Methylimidazol oder Pyridin (5 ml) gelöst und mit Chlortrimethylsilan (5 mmol) behandelt. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Lösung mit 2-(4-Nitrophenyl)ethylchlorformiat (3 mmol erhalten von F. Himmelsbach und W. Pfleiderer, Tetrahedron Lett. (1983) 24 : 3583) behandelt. Die Reaktion wird 8 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten, danach in einem Eisbad gekühlt, und Wasser (1 ml) wurde zugegeben. Nach 5 Minuten wird 1 ml konzentrierter Ammoniak zugesetzt und die Mischung wird 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wird dann bis zur Trockenheit eingedampft und der Rückstand in Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 2 M HCl sauer gemacht und mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden über Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird durch Chromatographie auf Silica unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform (5-50%) gereinigt.
Zum Schützen der Guanin- und 2,6-Diaminopurin-Derivate, wurde das obenstehende Verfahren modifiziert, so daß die Reaktion in Pyridin ausgeführt wurde und das Acylierungsmittel 9-Fluorenylmethylchlorformiat war.

Beispiel 5

5.1 N-geschützter t-BOC-p-Nitrophenylester

Die folgenden zwei Verfahren stellen aktive Ester zur Kopplung von Untereinheiten her. Sie gelten allgemein für alle die t-BOC-Säure-Derivate.
Zu einer 0,2-0,5 M Lösung der t-BOC-Säure aus Beispiel 4.4 in Ethylacetat (oder Methylenchlorid) wird p-Nitrophenol bei einem Überschuß von etwa 20% zugesetzt. Die berechnete Menge von Dicyclohexylcarbodiimid wird bei 0ºC zu der Lösung zugegeben. Nach 0,5 Stunden wird der Mischung gestattet, auf Raumtemperatur zu kommen, und sie wurde 1 Stunde lang darauf gehalten. Der Dicyclohexylharnstoff, welcher sich abtrennte, wird filtriert und mit Lösungsmittel gewaschen. Das Filtrat und die Waschungen, vereinigt, werden unter vernngertem Druck bis zur Trockenheit eingedampft. Der Ester kann direkt für Kopplungsreaktionen verwendet oder kann durch Kurzsäulen-Chromatographie auf Silica gereinigt werden, wobei ein Isopropanol-in-Chloroform-Gradient (0-50%) verwendet wird.

5.2 N-geschützer t-BOC-N-Hydroxysuccinimidoylester

Zu einer Lösung der t-BOC-Säure aus Beispiel 4.4 (1 mmol) in Acetonitril (5 ml) wird Pyridin (1 mmol) und N,N'-Disuccinimidylcarbonat (1 mmol) zugegeben. Die Lösung wird 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel werden unter verringertem Druck entfernt und der Rückstand in Chloroform gelöst, die organische Phase mit 0,1 M HCl und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft. Die Ester sind ausreichend rein, um direkt verwendet zu werden.

Beispiel 6

Bildung einer Carbonatverknüpfung zwischen den Untereinheiten

Die Herstellung von Cytidinyl-(3'-5')-cytidin-carbonat wird in den nachstehenden Verfahren beschrieben. Dies ist ein allgemeines Verfahren für die Bildung der Carbonatverknüpfung zwischen Untereinheiten und das Entschützen des Oligocarbonates. Es ist anzumerken, daß es sich bei den Basenschutzgruppen um 2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl, 2-(Phenylsulfonyl)- ethoxycarbonyl oder FMOC handeln muß. Tert-Butyldimethylsilylchlorid wird von Aldrich erhalten.

6.1 Herstellung von 2'-Desogynukleosid-3'-O-tert-butyldimethylsilyl-Derivaten

Die Herstellung von 3'-O-tert-Butyldimethylsilyl-N-2-(4-nitrophenyl)ethoxycarbonyl-2'-desoxycytidin wird in dem folgenden Verfahren beschrieben, welches ein allgemeines Verfahren für die Herstellung von 2'-Desoxynukleosid-3'-O-tert-butyldimethylsilyl-Derivaten ist:
Zu einer gerührten Lösung von 5'-O-Dimethoxytrityl-N-4-(4-nitrophenyl)-ethoxycarbonyl-2'- desoxycytidin (1 mmol) und Imidazol (3,5 mmol) in trockenem Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran (10 ml) wird tropfenweise eine Lösung von tert-Butyldimethylsilylchlorid (3 mmol) in trockenem DMF (10 ml) zugesetzt. Die Reaktion wird 1 Stunde lang gerührt, mit Eis abgeschreckt, mit Methylenchlorid extrahiert, mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die organische Schicht wird unter verringertem Druck bis zur Trockenheit eingedampft und durch Chromatographie über Silicagel mit Methylenchlorid als Elutionsmittel gereinigt.
Zu einer Lösung des 5'-O-Dimethoxytritylderivates aus dem vorhergehenden Abschnitt (1 mmol) in Methylenchlorid (5 mmol) wird eine Lösung von Zinkbromid in Methylenchlorid (10 ml, 1 M), enthaltend Methanol (15% v/v), zugegeben. Die Reaktionsmischung wird 30 Minuten lang gerührt, mit Eis abgeschreckt und mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vernngertem Druck bis zur Trockenheit eingedampft. Das Produkt wird durch Chromatographie über Silicagel unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Methylenchlorid (0-10%) gereinigt.
5'-O-Dimethoxytrityl-N-2-(4-nitrophenyl)ethoxycarbonyl-2'-desoxycytidin-3'-O-(4-nitrophenyl)carbonat (1,5 mmol) und 3'-O-tert-Butyldimethylsilyl-N-4-(4-nitrophenyl)ethoxycarbonyl- 2'-desoxycytidin (1 mmoli werden in Dimethylformamid (5 ml) gelöst und das Lösungsmittel wird unter vernngertem Druck entfernt. Dies wird zweimal wiederholt. Der Rückstand wird erneut in Dimethylformamid (5 ml) gelöst und mit N,N-Dimethylaminopyridin (0,5 mmol) oder N-Methylimidazol (1 mmol) behandelt. Das Lösungsmittel wird durch Eindampfen unter verringertem Druck entfernt und die Reaktion wird über Nacht bei Raumtemperatur absetzen gelassen. Der Rückstand wird in Chloroform (20 ml) gelöst und mit wäßriger HCl (2 ml, 0,1 M) Wasser (2 ml), wäßrigem NaOH (2 · 2 ml, 0,2 M), Wasser (2 ml) gewaschen, und die organische Schicht wird über Natriumsulfat getrocknet und evaporiert. Der Rückstand wird auf Silicagel unter Verwendung eines Gradienten von Isopropanol in Chloroform (0-30%) gereinigt. Das isolierte Produkt ist auf TLC und bei 400 MHz-NMR homogen.
Der Rückstand wird durch Verwenden des 2 M HF/1 M tert-Butylammoniumfluorid (TBAF)- Reagenz, welches in B. L. Gaffney und R. A. Jones, Tetrahedron Lett. (1982) 23 : 2257, beschrieben worden ist, desilyliert. Zu dem 2 M HF/1 M tert-Butylammoniumfluorid in Pyridin (1 mmol an TBAF) wird das entschützte Nukleosid aus dem vorhergehenden Abschnitt zugesetzt. Nach 24 Stunden langem Rühren wird die Reaktion zwischen Methylenchlorid und wäßrigem Natriumbicarbonat geteilt. Die organische Schicht wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, und bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wird durch Chromatographie auf Silica unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Methylenchlorid (5-25%) gereinigt.
Die 3'-Hydroxydinukleosid-Carbonate werden zu den 3'-(4-Nitrophenyl)-Carbonaten durch das Verfahren im Beispiel 5 umgewandelt. Diese Derivate können mit dem 5'-Hydroxyl eines Nukleosid- oder Oligonukleosid-Carbonates umgesetzt werden, um Oligonukleosidcarbonate höherer Ordnung herzustellen.

Beispiel 7

Bildung von Carbamat- und Thiocarbamat-Zwischen-Untereinheit-Verknüpfungen zwischen Untereinheiten vom Morpholino-Typ

N-Methylimidazol wird von Aldrich Chemical Co. erwoben.
Das im obengenannten Beispiel 3 hergestellte erforderliche trockene N'-geschützte Morpholino-Typ-Nukleosid mit 5'-freiem Alkohol (unter Anwendung von Acetyl- oder Benzoylgruppen für den Basenschutz, wo notwendig) (1 mmol) wird mit Bis-(p-nitrophenyl)carbonat und Triethylamin (oder DMAP oder N-Methylimidazol) (katalytische Menge) in DMF unter wasserfreien Bedingungen behandelt. Die Lösung wird 3 Stunden lang gerührt und dann bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wird in Chloroform gelöst und die Lösung wird zweimal mit 0,01 N wäßrigem NaOH und einmal mit Wasser gewaschen und danach über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfung entfernt und der Rückstand wird auf Silica-Gel chromatographiert, wobei mit einem angemessenen Chloroform/Isopropanol/0,1% DMA-Gemisch eluiert wird. Die Fraktionen, welche das gewünschte aktivierte Nukleosid enthalten, werden vereinigt, eingedampft, und der resultierende Feststoff wird in einem Minimum an THF gelöst. Die THF-Lösung wird zu einem Überschuß von Hexanen zugesetzt und das resultierende Präzipitat wird gesammelt und getrocknet.
Das erforderte 5'-freies Hydroxyl-, N'-freies Morpholino-Typ-Nukleosid (unter Verwendung der identischen Basenschutzgruppen, wie obenstehend in diesem Beispiel aufgeführt) (1,1 mmol) wird, nach zweimaligem Eindampfen aus DMF, mit der 5'-(p-Nitrophenoxycarbonyl)morpholino-Untereinheit (1 mmol) in DMF behandelt. Das Volumen der Reaktionslösung wird unter Vakuum zu einem kleinen Volumen verringert. Falls erforderlich, wird eine katalytische Menge von N-Methylimidazol oder Triethylamin in das Reaktionsgefäß zugegeben. Die resultierende Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das verbleibende Lösungsmittel wird eingedampft und der Rückstand in Chloroform gelöst. Die Chloroform-Lösung wird zweimal mit 0,01 N wäßriger NaOH und einmal mit Wasser gewaschen und danach über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfung entfernt und der Rückstand wird auf Silica-Gel chromatographiert, wobei mit Chloroform/Methanol-Lösungsmittelgemischen eluiert wird. Die das gewünschte Dimer enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und danach bis zur Trockenheit rotationseingedampft. Der Rückstand wird in einem Minimum an THF gelöst und die Lösung wird zu einem Überschuß von Hexanen zugegeben. Der Niederschlag wird abgesammelt und unter Vakuum getrocknet.
Durch Thiocarbamatreste verknüpte Morpholino-Untereinheiten werden wie obenstehend in diesem Beispiel angesprochen mit den folgenden experimentellen Abweichungen hergestellt. Die Basenschutzgruppen sind entweder 1-(Phenylsulfonyl)ethoxycarbonyl- (für Desoxycytidin und Desoxyadenosin) oder 9-FMOC-Gruppen (für Desoxyguanosin und 2,6-Diamino-2'- desoxyribosid). Die Herstellung dieser Moleküle ist obenstehend (Beispiel 3) beschrieben. Eine Aktivierung des N-geschützten Morpholino-Nukleosides (1 mmol) wird mit p-Nitrophenylchlorthioformiat (1,2 mmol) in Gegenwart von Triethylamin (2 mmol) und DMAP oder N- Methylimidazol (katalytische Menge) in DMF erzielt. Der Kopplungsschritt verwendet dieses aktivierte Monomer (1 mmol) mit dem erforderlichen N'-freien Morpholino-Nukleosid (1,1 mmol) unter Einsatz von DMAP oder N-Methylimidazol als Katalysator und von DMF als Lösungsmittel, während die Lösung auf 35-40ºC erwärmt wird. In der wäßrigen Weiterverarbeitung dieser Stufen werden die Waschungen mit 0,01 N wäßsiger NaOH weggelassen, wobei an ihrer Stelle Waschungen mit Wasser eingesetzt werden.

Beispiel 8

Herstellung einer Ester-Untereinheitverknüpfung

N,N-Dimethylaminopyridin und N-Methylimidazol werden von Aldrich erhalten.
Die Kopplung der zwei Untereinheiten wird durch Reaktion des 5'-N,N-Acetamid-3'-hydroxy- Derivates mit dem 3'-silylierten-5'-aktiven Ester durchgeführt. Die Reagenzien (jeweils 1 mmol) werden mehrere Male mit Dimethylformamid co-evaporiert, danach in Dimethylformamid (5 ml) gelöst und mit N,N-Dimethylaminopyridin (0,2 mmol) oder N-Methylimidazol (1 mmol) behandelt. Das Lösungsmittel wird unter vernngertem Druck entfernt und die Reaktion 2 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der Rückstand wird in Chloroform gelöst und mit verdünnter HCl, und Wasser, gewaschen, und die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet und die Lösungsmittel unter verringertem Druck verdampft. Der Rückstand wird durch Chromatographie auf Silica-Gel unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform gereinigt.
Die Kette kann durch Desilylierung, wie im Beispiel 6 von EP-A-639 582, und Behandlung der resultierenden 3'-freies Hydroxyl-enthaltenden Verbindung mit dem aktiven Ester verlängert werden, wie im vorhergehenden Abschnitt.

Beispiel 9

Bildung eines t-BOC-Amid-verknüpten Dimeren

Ein vollständig geschützter t-BOC-N-Hydroxysuccinimidoylester oder p-Nitrophenylester, hergestellt wie in Beispiel 6.1 und 6.2, (1 mmol) wird durch mehrere Coevaporationen mit trockenem Dimethylformamid hergestellt. Das geschützte Aminosäure-Trifluoracetatsalz (hergestellt gemäß Beispiel 9 von EP-A-639 582) (1 mmol) wird in ähnlicher Weise behandelt. Die zwei Komponenten werden getrennt in trockenem Dimethylformamid (2 ml) gelöst, vermischt und mit Diisopropylethylamin (1,0 mmol) behandelt. Die Lösung wird 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, danach wird das Lösungsmittel durch Verdampfung unter vernngertem Druck entfernt, der Rückstand in Chloroform gelöst und mit verdünnter HCl gewaschen. Die organische Schicht wird über Natriumsulfat getrocknet, bis zur Trockenheit unter vernngertem Druck eingedampft, und der Rückstand wird durch Chromatographie auf Silica-Gel unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform (5-50%) gereinigt. Alternativ dazu, kann die t-BOC-Dimersäure durch Chromatographie auf C18- Umkehrphasen-Silica-Gel unter Verwendung von Gemischen aus Wasser und Methanol (Trifluorethanol) gereinigt werden.

9.1 Herstellung des aktiven t-BOC-Dimer-Esters

Die Säure aus dem vorstehenden Abschnitt wird in den N-Hydroxysuccinimidoylester oder p-Nitrophenylester durch Anwendung der allgemeinen Verfahren in Beispiel 6.1 und 6.2 umgewandelt.

9.2 Herstellung des t-BOC-Dimer-Aminosäure-Trifluoracetates

Die t-BOC-Dimer-Säure wird mit Trifluoracetat behandelt, wie gemäß des allgemeinen Verfahrens in Beispiel 9 von EP-A-639 582.

9.3 Herstellung einer t-BOC-Tetramer-Säure

Der aktive t-BOC-Dimer-Ester und das Dimersäure-Trifluoracetat werden durch das allgemeine Verfahren zu der t-BOC-Tetramer-Säure gekoppelt. Die Reinigung erfolgt am besten durch Chromatographie auf C18-Umkehrphasen-Silicagel unter Verwendung von Gemischen aus Wasser und Methanol (oder Trifluorethanol), welche mit Triethylammoniumacetat auf einen pH-Wert von 7,0 gepuffert sind. Auf diese Weise können Ketten von beliebiger Länge durch Koppeln eines aktiven Esters mit einer freien Amin-Komponente hergestellt werden.

Beispiel 10

Geometrischer Zusammenbau eines Carbamat-verknüpten Polymeren von 8 Untereinheiten

DEAE-Zellulose wird von Sigma Chemical Co. erworben. Präparative TLC-Platten sind ein Produkt von EM Science, erworben von VWR Scientific. HPLC-Ausrüstung, Säulen und Versorgungen bzw. Anschlüsse sind von Beckman Instruments, Inc., erhältlich.
Das erforderliche Carbamat-verknüpfte Dimer (0,2 mmol), hergestellt wie beschrieben in Beispiel 6, wird mit 4 ml einer 1/1/1-Mischung von Methanol/THF/Eisessig bei Raumtemperatur 12 Stunden lang behandelt. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum entfernt und der Rückstand wird in einem Minimum an THF aufgenommen. Die THF-Lösung wird zu einem großen Volumen von Hexanen zugesetzt, und der resultierende Niederschlag wird aufgefangen und getrocknet. Das Acetatsalz wird in einer 4/1 THF/Ethanol-Mischung gelöst und DEAE- Zellulose (0,8 mmol der Base) wird in das Gefäß gegeben. Nach 20 Minuten langem Rühren wird die heterogene Mischung filtriert und das Filtrat wird bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wird in einem Minimum von 4/1 THF/Ethanol gelöst, und diese Lösung wird zu Hexanen zugesetzt. Der Feststoff wird abgesammelt und getrocknet. Das Präzipitationsverfahren wird einmal wiederholt.
Das erforderliche N-5'-Trityl-Dimer (0,1 mmol) (wie hergestellt in Beispiel 6) wird zweimal aus DMF eingedampft und danach mit Bis(p-nitrophenyl)carbonat (2 mmol) in Gegenwart von Triethylamin (oder DMAP oder N-Methylimidazol) (katalytische Menge) unter Verwendung von DMF als Lösungsmittel behandelt. Nach 3 Stunden wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand wird in Chloroform gelöst. Diese Lösung wird zweimal mit 0,01 N wäßrigem NaOH, einmal mit Wasser gewaschen, und danach über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfung entfernt und der Rückstand wird auf Silica-Gel chromatographiert, wobei mit einem Gemisch aus Chloroform/Isopropanol oder Methanol/0,1 % DMA eluiert wird. Die&entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wird in einem Minimum an THF gelöst, und diese Lösung wird zu einem Überschuß von Hexanen zugesetzt. Das präzipitierte aktivierte Dimer wird durch Filtration abgesammelt und unter Vakuum getrocknet.
Das obenstehend hergestellte 5'-Amino-Dimernukleosid (0,11 mmol) wird zweimal aus DMF eingedampft. Das aktivierte Dimer (0,1 mmol) wird zu dem Reaktionsgefäß hinzugesetzt, und die Feststoffe werden in DMF gelöst. Die Lösung wird zu einem kleinen Volumen konzentriert und über Nacht stehen gelassen. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum vollständig entfernt und der resultierende Rückstand wird in Chloroform gelöst. Diese Lösung wird zweimal mit 0,01 N wäßrigem Natriumhydroxid und einmal mit Wasser gewaschen und dann über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfung entfernt und der Rückstand wird auf einer präparativen TLC-Platte chromatographiert, wobei mit dem passenden Methanol/Chloroform/1% Triethylamin-Lösungsmittelsystem eluiert wird. Die das tetramere Nukleosid enthaltende Bande wird eluiert und das Lösungsmittel wird verdampft. Der Rückstand wird in einem Minimum an THF gelöst und diese Lösung wird zu Hexanen zugegeben. Der Niederschlag wird abgesammelt und unter Vakuum getrocknet.
Die folgenden Umwandlungen werden unter Verwendung der obenstehend in diesem Beispiel aufgezählten Vorgehensweisen durchgeführt. Das erforderliche N-5'-Trityl-Tetramernukleosid (0,06 mmol) wird mit 1/1/1 THF/Methanol/Eisessig behandelt und danach gereinigt, um das 5'- Aminotetramernukleosid zu erhalten. Ein anderes Aliquot des N-5'-Trityl-Tetramernukleosids (0,05 mmol) wird mit Bis(p-nitrophenyl)carbonat aktiviert und anschließend gereinigt. Die zwei Tetramere werden gekoppelt, weiterverarbeitet, und eine weitere Reinigung wird entweder durch Chromatographie auf einer präparativen TLC-Platte oder durch HPLC- Chromatographie erzielt. Das chromatographierte Material wird als ein Feststoff isoliert, in einem Minimum an THF gelöst und danach aus Hexanen präzipitiert. Das Octamer-Nukleosid wird gesammelt und getrocknet.
Das Octamer wird für die fernere Verwendung wie folgend konfiguriert. Das N-5'-Trityloctamer-Nukleosid wird mit 1/1/1 THF/Methanol/Eisessig behandelt und unter Verwendung der obenstehend aufgezählten Bedingungen gereinigt. Das 5'-Amino-Octamernukleosid (0,01 mmol) wird mit Bernsteinsäureanhydrid (0,02 mmol) in Pyridin zwei Stunden lang bei Raumtemperatur behandelt. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfung entfernt und der Rückstand wird mehrere Male aus Ethanol eingedampft. Der Rückstand wird in 3/1- THF/Ethanol aufgenommen und zu einem 2 : 1-Gemisch von Hexan/Benzol zugesetzt. Der Feststoff wird abgesammelt und getrocknet. Das N-5'-succinylierte Octamernukleosid (0,01 mmol) wird mit einer 1/1-Mischung von Pyridin/konzentriertem Ammoniak (1 ml) behandelt. Nach Stehenlassen über Nacht wird das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt und der Rückstand wird mehrere Male aus Ethanol eingedampft. Der unreine Feststoff wird unter Verwendung von Umkehrphasen(RP-18)-HPLC-Chromatographie gereinigt. Die Elutionsmittel werden verdampft und der Rückstand wird in DMSO aufgenommen und aus einem 1 : 1-Hexan/Benzol-Lösungsmittelgemisch gefällt. Der Feststoff wird gesammelt und getrocknet.

Beispiel 11

Herstellung eines trägergebundenen abspaltbaren Linkers, geeignet für schrittweisen und schrittweisen/Block-Zusammenbau von Polymeren: Aktivierung des Trägers und Anheftung des Linkers

Mit langkettigem Alkylamin derivatisiertes Glas mit kontrollierten Poren (Kat.-Nr. 24875) wird von Pierce Chemical Co. erhalten. 2,2-Sulfonyldiethanol und Dicyclohexylcarbodiimid werden von Aldrich Chemical Co. erhalten.
Die Aminogruppen des Glasträgers (ungefähr 40 mmol pro Gramm Träger) werden mit Bernsteinsäureanhydrid im wesentlichen durch das Verfahren von Matteucci und Caruthers (J. Amer. Chem. Soc. (1981) 103 : 3185) umgesetzt, um freie Carbonsäure-Termini zu erhalten. Ein zehntel Mol an 2,2'-Sulfonyldiethanol (60 Gew.-% in Wasser) wird durch Mischen mit drei Volumen Dimethylformamid (DMF), Einengen zu einem dicken Sirup unter Vakuum in einem Warmwasserbad, Zugeben einer zweiten Menge von DMF, Einengen zu einem dicken Sirup und Wiederholen des Vorgangs für ein drittes Mal getrocknet. Trockenes DMF wird danach zugegeben, um eine Sulfonyldiethanol-Endkonzentration von 2 M zu ergeben. Eine Mischung von 1 ml der Sulfonyldiethanol-Lösung plus 0,2 g Dicyclohexylcarbodiimid wird zu 1 g des trockenen Glasträgers mit kontrollierten Poren, welcher Carbonsäurereste trägt, zugegeben, und die Aufschlämmung wird durch Schütteln oder Taumeln (nicht Rühren) über Nacht bei Raumtemperatur gemischt. Danach wird der Glasträger gründlich mit Methanol gewaschen und getrocknet.

Beispiel 12

Herstellung eines 14 Untereinheiten großen Carbonat-verknüpften Polymers, welches gegen eine konservierte Sequenz in dem AIDS-Virengenom zielgerichtet ist: Schrittweiser Zusammenbau auf einem festen Träger: Zugabe der ersten Untereinheit und Kettenverlängerung

N-Methylimidazol, 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin (DMAP) und 1,8-Diazabicyclo[5,4,0]- undec-7-en (DBU) werden von Aldrich Chemical Co. erhalten. Methyl-p-nitrophenylcarbonat wird aus Methylchlorformiat und p-Nitrophenol hergestellt.
Die 2'-Desoxycytidin-Untereinheit (0,1 mmol) (worin das N4 einen p-Nitrophenethoxycarbonyl-Rest trägt, das 5'-Sauerstoffatom einen Di(p-methoxy)trityl-Rest (DMT) trägt und das 3'-Sauerstoffatom einen p-Nitrophenoxycarbonyl-Rest trägt) wird in einem minimalen Volumen von trockenem Tetrahydrofuran (THF) oder Dimethylformamid gelöst und zu 0,5 g gründlich getrocknetem Glasträger mit kontrollierten Poren, welcher einen abspaltbaren Linker trägt, hergestellt wie in Beispiel 11, zugegeben. Katalysator (entweder 1 mmol N-Methylimidazol oder 0,1 mmol DMAP) wird eingebracht und die Aufschlämmung wird durch Schaukeln oder Zittern (nicht Rühren) 2 Stunden lang gemischt. Die Aufschlämmung wird als nächstes filtriert und der Feststoff wird gründlich mit THF gewaschen.
Jegliche nicht-umgesetzten Hydroxyle werden durch Zusetzen von zwei ml THF, 1 M in Methyl-p-nitrophenylcarbonat und 0,5 M in DMAP, und 20 Minuten langes Mischen bei Raumtemperatur gecappt bzw. abgedeckt. Hiernach wird der Glasträger mit THF gewaschen und filtriert.
Das Dimethoxytrityl am 5'-Terminus wird dann durch Waschen des Trägers mit Dichlormethan, gefolgt von Behandlung mit 5 ml 0,2 M Dichloressigsäure in Dichlormethan während 5 Minuten bei Raumtemperatur, entfernt. Der Glasträger wird als nächstes mit Dichlormethan gewaschen und gefiltert.
Nachfolgende Untereinheiten, hergestellt wie im Beispiel 1 und aktiviert wie im Beispiel 2, werden auf eine ähnliche Weise und in der folgenden Reihenfolge hinzugefügt: G, A, T, A, A, C, A, T, T, T, T, T, C (wobei G mit dem FMOC-Rest geschützt ist und A und C mit dem p-Nitrophenethoxycarbonyl-Rest geschützt sind).

Beispiel 13

Herstellung eines 19 Untereinheiten großen Carbamat-verknüpften Polymers, zielgerichtet gegen eine konservierte Sequenz im AIDS-Virengenom. Schrittweiser Zusammenbau von Oligomerblöcken auf einem festen Träger: Addition der ersten Untereinheit und Kettenverlängerung

Die 5'-Amino-2',5'-didesoxycytidin-Untereinheit (0,2 mmol) (worin das N4 einen Benzoylrest trägt, das 5'-Amin einen p-Methoxytritylrest trägt und das 3'-Sauerstoffatom einen p-Nitrophenoxycarbonylrest trägt) wird in einem minimalen Volumen von trockenem THF gelöst und zu 0,5 g getrocknetem Glasträger mit kontrollierten Poren, welcher einen spaltbaren Linker trägt, hergestellt wie im Beispiel 11, zugesetzt. Katalysator (entweder 1 mmol N-Methylimidazol oder 0,1 mmol DMAP) wird eingebracht und die Aufschlämmung wird durch Schaukeln oder Schütteln 2 Stunden lang gemischt. Als nächstes wird die Aufschlämmung filtriert, und der Feststoff wird gründlich mit THF gewaschen.
Das Mono-p-methoxytrityl wird durch Waschen mit Dichlormethan, gefolgt von Behandlung mit 5 ml 0,2 M Dichloressigsäure in Dichlormethan bei Raumtemperatur während 1 Minute, entfernt. Der Träger wird dann mit Dichlormethan gewaschen und filtriert. Die 5'-Amino-Termini werden durch ein kurzes Waschen mit 3 ml THF, welches 1 Vol.% Diisopropylethylamin enthält, in ihre freie Amin-Form umgewandelt, gefolgt von Waschen mit THF und Filtration.
0,1 mmol 3'-p-Nitrophenoxycarbonyl-aktiviertes Dimer mit der Sequenz 5'-A-G-3', hergestellt wie im Beispiel 13 von EP-A-639 582, (worin das Guanin-N2 mit einem Acetylrest geschützt ist und das Adenin-N6 mit einem Benzoyl- oder einem p-Nitrobenzoyl-Rest geschützt ist) wird in einem minimalen Volumen von trockenem THF gelöst und zu dem Glasträger zugegeben, und eine Vermischung wird 2 Stunden lang durchgeführt (hierfür und für die anschließenden Kopplungsschritte wird kein Katalysator zugesetzt). Als nächstes wird die Aufschlämmung mit THF gewaschen und filtriert.
Jedwede nicht umgesetzte Aminreste werden durch Zusetzen von 2 ml THF, 2 M in p-Nitrophenylacetat, und 20 Minuten langes Mischen bei Raumtemperatur gecappt. Danach wird der Glasträger mit THF gewaschen und filtriert.
Das Mono-methoxytrityl am 5'-Terminus wird mit Dichloressigsäure entfernt, wie zuvor.
Anschließend werden aktivierte dimere Untereinheiten, hergestellt wie im Beispiel 9 (worin das exocyclische Ring-Stickstoffatom von Cytosin mit einem Benzoylrest geschützt ist, und das exocyclische Ring-Stickstoffatom von A mit einem Benzoyl- oder einem p-Nitrobenzoyl-Rest geschützt ist), auf eine ähnliche Weise und in der folgenden Reihenfolge hinzugefügt: A-T, C- A, T-A, T-T, T-T, A-C, A-C, C-A (5' nach 3').
Untereinheiten, welche Basen-exocyclische Ring-Stickstoffatom-Schutzgruppen aufweisen, die durch starke nicht-nukleophile Basen entfernbar sind (z. B. p-Nitrophenethoxycarbonyl oder Phenylsulfonylethoxycarbonyl für A und C, und FMOC für G), können ebenfalls für das Zusammenbauen von Polymeren durch das obenstehende Verfahren eingesetzt werden. Allerdings werden Polymere, welche diese alternativen Schutzgruppen besitzen, im allgemeinen eher durch Behandlung mit DBU anstatt mit Ammoniumhydroxid entschützt.

Beispiel 14

Herstellung von Nukleosid-3'-O-(p-Chlorphenyl-2-cyanoethyl)-phosphaten

14.1 Herstellung von Nukleosiden mit einer 3'-Schutzgruppe

Thymidin, N-Benzoyldesoxyadenosin, N-Benzoyldesoxycytidin, N-Isobutyryldesoxyguanosin und ihre 5'-O-(Di-p-methoxytrityl)- bzw. 5'-ODMT-Nukleosid-Derivate werden von Pharmacia P-L Biochemicals (Piscataway, NJ) erhalten, β-Benzoylpropionsäure und Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD) werden aus handelsüblichen Quellen erhalten.
Ein ausgewähltes 5'-O-Dimethoxytrityl-Nukleosid (1 mmol) wird mit β-Benzoylpropionsäure (3 mmol) und DCCD (4 mmol) in 6 ml Pyridin zur Reaktion gebracht. Die Reaktionsmischung wird 3 Stunden lang bei 25ºC gerührt, wonach 1,5 ml Wasser zugegeben werden, und die Mischung 5 Stunden lang bei 25ºC gerührt wird. Die Reaktionsmischung wird filtriert, und nach Eindampfen des Filtrats, wird der Rückstand durch mehrere Coevaporationen mit Ethanol von Pyridin befreit. Der gereinigte Rückstand wird in Ethylacetat aufgenommen und auf Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat chromatographiert. Das konzentrierte Ethylacetat- Eluat wird mit Hexan behandelt, um das resultierende 3'-O-β-Benzoylpropionyl-Nukleosid (3'- OβB-Nukleosid) zu fällen.

14.2 Nukleosid-Aktivierung

p-Chlorphenylphosphordichloridat wird von Aldrich (Milwaukee, WI) erhalten. Benzolsulfonsäure, Tetrahydrofuran, Triethylamin und 3-Hydroxypropannitril werden aus handelsüblichen Quellen erhalten.
Eine Lösung von p-Chlorphenylphosphorditriazolid wird durch sequentielle Reaktion von 3 mmol Triazol in 10 ml Tetrahydrofuran mit 3 mmol Triethylamin und 1,5 mmol p-Chlorphenylphosphordichloridat hergestellt. Nach einer 10 Minuten langen Reaktion bei 25ºC wird 1 mmol eines ausgewählten 5'-ODMT-Nukleosides in 2 ml trockenem Pyridin zu der Reaktionsmischung zugesetzt. Nach bis zu 2 Stunden langem Stehenlassen bei 25ºC wird die Mischung mit einer Lösung von Benzolsulfonsäure (4 mmol) und Triethylamin (4 mmol) in 3 ml wasserfreiem Pyridin behandelt, gefolgt von Zugabe von 3-Hydroxypropannitril (2 mmol). Die Reaktionsmischung wird unter Vakuum auf 4 ml konzentriert und bis zu 2 Stunden lang bei 25ºC und danach bis zu 24 Stunden lang bei 4ºC gehalten. Die Reaktion wird durch Gießen der Mischung in 20 ml 5%iges wäßriges Natriumbicarbonat bei 0ºC, gründliches Extrahieren mit Chloroform, Trocknen der Extrakte mit Natriumsulfat und Entfernen der Lösungsmittel unter verringertem Druck beendet. Das 5'-ODMT-Nukleosid-3'-O-(p-chlorphenyl-(2-cyanoethyl))-phosphat-Produkt wird durch Chromatographie auf Silicagel erhalten, wobei sukzessive Ether-, Ethylacetat- und Tetrahydrofuran-Elutionen eingesetzt werden.

Beispiel 15

Herstellung eines Tetramers mit alternierenden geladenen und ungeladenen Bindungen

Methylphosphonodichloridat wird von Aldrich erhalten. Benzolsulfonyltetrazolid wird gemäß Stawinski et al., Nucleic Acids Research (1977) 4 : 353, hergestellt.

15.1 Dimer-Synthese

Eine Lösung von Methylphosphonoditriazolid wird durch Umsetzen von 1,2,4-Triazol (3 mmol) und Triethylamin (3 mmol) in 20 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran in Gegenwart von Methylphosphonodichloridat (1,2 mmol) während 2-10 Stunden bei 25ºC hergestellt. Im Anschluß an eine Filtration wird eine Lösung eines ausgewählten 5'-ODMT-Nukleosides (1 mmol) in 10 ml trockenem Pyridin zu dem Filtrat zugesetzt, und die Mischung wird auf 8 ml konzentriert und bis zu 2 Stunden lang bei 25ºC stehen gelassen. Zu der Lösung wird Benzolsulfonyltetrazolid (1,2 mmol) und das gewählte 3'-OβB-Nukleosid zugesetzt. Nach 2,5 Stunden langer Inkubation bei 25ºC wird die Reaktion durch Zugabe von 20 ml 50%igem Natriumbicarbonat bei -78ºC abgeschreckt und gründlich mit Chloroform extrahiert. Das Lösungsmittel wird mit Natriumsulfat getrocknet und verdampft. Die Reaktion kann auch im wesentlichen wie obenstehend durchgeführt werden, wobei mit dem 3'-O-PO-(OpCP)(OCE)- geschützten Nukleosidphosphat aus dem Beispiel 1 begonnen wird.

15.2 Trennen von stereoisomeren Methylphosphonat-Dimeren

Die im obenstehenden Abschnitt erzeugten stereoisomeren Dimere werden durch Silicagel- Säulenchromatographie getrennt, welche bei atmosphärischem Druck in Glassäulen mit gepacktem Silica-Gel 60 unter Verwendung von Ethylacetat: Tetrahydrofuran-Mischungen (0- 100% Tetrahydrofuran) oder Chloroform/Methanol-Mischungen (0-20% Methanol) durchgeführt wird. Die sich schneller bewegenden Stereoisomer-Fraktionen werden vereinigt und aus der Tetrahydrofuranlösung durch die Zugabe von Hexan präzipitiert. Das sich langsamer bewegende Steroisomer wird nicht weiter verwendet.

15.3 Phosphodiester/Methylphosphonat-verknüpftes Tetramer

Erste und zweite stereospezifische Methylphosphonat-Dimere, jedes mit einer ausgewählten 2-Basen-Kombination und 3'-OβD- und 5'-ODMT-Schutzgruppen, werden jeweils hergestellt, wie in den Beispielen 15.1 und 15.2. Mesitylensulfonyltetrazolid wird gemäß Stawinski et al., Nuc. Acids Res. (1977) 4 : 353, hergestellt.
Die 5'-ODMT-Schutzgruppe auf dem ersten Dimer wird entfernt, um die reine 5'-Hydroxy- Verbindung zu ergeben. Die Cyanoethylgruppe des zweiten Dimers wird durch Behandlung von 1 mmol des Dimeren mit einer Lösung von Pyridin (8,5 ml), Wasser (2,9 ml) und Triethylamin (2,9 ml) während 1 Stunde bei 25ºC und Evaporieren der Lösungsmittel entfernt, wodurch das 3'-Hydroxynukleotid erhalten wird.
Die Dimer-Kondensationsreaktion wird durch Lösen des 5'-OH-Dimers (1 mmol) und des 3'- Hydroxynukleotid-Dimers (1 mmol) in 8 ml Pyridin und 3,5 Stunden langes Behandeln mit Mesitylensulfonyltetrazolid (3-6 mmol) bei 25ºC durchgeführt. Die Reaktionsmischung wird mit 4 ml kaltem 50%igem wäßrigen Pyridin vereinigt und in 80 ml wäßriges Natriumbicarbonat gegossen. Das Reaktionsprodukt wird gründlich mit Chloroform extrahiert und, nach Trocknen über Natriumsulfat und Eindampfen des organischen Lösemittels, auf Silica-Gel unter Verwendung einer Methanol/Chloroform-Mischung gereinigt. Das eluierte Produkt wird mit Hexan gefällt. Tetramere, welche die 3'-O-PO-(OpCP)(OCE)-Schutzgruppe besitzen, können durch im wesentlichen das gleiche Verfahren hergestellt werden, wobei mit einem Dimer begonnen wird, welches die 3'-O-PO-(OpCP)(OCE)-Gruppe besitzt.

Beispiel 16

Anheften von Polymer an einen festen Träger über einen Linker-Arm

16.1 Herstellung eines bifunktionellen Hexan-Linkerarmes

Dowex 50X-Pyridinium-Harz wird von Bio-Rad (Richmond, CA) erhalten, und 6-Aminohexanol, Dimethylformamid und 3-Hydroxypropannitril werden aus handelsüblichen Quellen erhalten. 6-(2-Methylsulfonyl)-ethyl-p-nitrophenylcarbonat wird gemäß Eberle et al., Helvetica Chimica Acta (1975) 58 : 2106, hergestellt.
Ein bifunktionaler Hexan-Linkerarm 6-(2-(Methylsulfonyl)-ethoxycarbonylamino)-hexanol wird durch Umsetzen von 6-Aminohexanol (1 mmol) mit 2-(Methylsulfonyl)ethyl-p-nitrophenylcarbonat (1 mmol) in 1 ml Dimethylformamid während bis zu 4 Stunden bei 25ºC hergestellt. Die Reaktionsmischung wird in Wasser gegossen, gründlich mit Benzol extrahiert, das Benzol mit Wasser gewaschen, und das organische Lösungsmittel wird dann mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um den Carbamat-Alkohol zu ergeben, welcher durch Silica-Gel-Chromatographie gereinigt wird, wobei eine Methanol/Chloroform- Lösungsmittelmischung verwendet wird.

16.2 Herstellung eines Oligonukleotidanalogs mit einem 5'-O-(6-Aminohexyl)-Linkerarm

Triethylammoniumbicarbonat und Tetrabutylammoniumfluorid werden im Handel erhalten. Ein vollständig geschütztes Oligonukleotidanalog wird durch Methylphosphonat-Dimer-Kondensation hergestellt. Das Oligonukleotid (1 mmol) wird in 10 ml Chloroform: Methanol (7 : 3, v/v), enthaltend 2% Benzolsulfonsäure, gelöst und etwa 40 Minuten lang bei 0ºC gehalten. Die Reaktionsmischung wird mit einer 5%igen Natriumbicarbonat-Lösung und danach Wasser gewaschen. Die Chloroform-Schicht wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Das Material wird in Chloroform gelöst und der Rückstand auf Silica-Gel unter Verwendung von Chloroform/Methanol-Mischungen chromatographiert, um die 5'-Hydroxy-Oligonukleotidverbindung zu ergeben.
Eine Lösung von 6-(2-(Methylsulfonyl)ethoxycarbonylamino)-hexylmethylphosphonyltriazolid (5 mmol) in Pyridin (10 ml) wird durch Behandlung des Carbamatalkohols aus Beispiel 16.1 mit Methylphosphonotriazolid, hergestellt wie in Beispiel 15.1 beschrieben, hergestellt. Der Lösung werden die 5'-Hydroxy-Verbindung (1 mmol) aus dem vorhergehenden Abschnitt und Benzolsulfonyltetrazolid (4 mmol) zugegeben. Die Reaktion wird fortgesetzt und verarbeitet wie bei Beispiel 15.1.
Der Rückstand wird auf Silica-Gel chromatographiert, wobei eine Chloroform/Methanol- Lösungsmittelmischung verwendet wird. Das geschützte Oligonukleotid (1 mmol) wird mit 4 ml Hydrazinhydrat in 14 ml 20%igem Essigsäure/Pyridin 16-24 Stunden lang bei 25ºC behandelt. Nach Eindampfen wird der Rückstand 24 Stunden lang bei 25ºC mit einer Lösung behandelt, die 0,017 M Tetrabutylammoniumfluorid in 30 ml Tetrahydrofuran/Pyridin/Wasser (8 : 1 : 1, v/v/v) enthält. Die Lösung wird dann mit 60 ml 50%igem konzentrierten Ammoniumhydroxid in Pyridin 10 Stunden lang bei 4ºC behandelt. Das resultierende Oligomer wird auf einer Umkehrphasen-HPLC-Säule gereinigt, wobei eine wäßrige Acetonitril-Mischung in 0,1 M Ammoniumacetat-Puffer, pH 5,8, als das Chromatographie-Lösungsmittel verwendet wird.

16.3 Anheften eines 5'-O-(Aminohegyl)-Oligonukleotidanalogs an einen festen Träger

Affi-Gel 10 wird von Bio-Rad (Richmond, CA) erhalten. 10 ml des gepackten Gels werden mit Isopropylalkohol (3 Bettvolumen) und dann mit eiskaltem entionisiertem Wasser (3 Bettvolumen) gewaschen. Ein 5'-O-(6-Aminohexyl)-Oligonukleotid (150 mmol) wird hergestellt wie in Beispiel 26 beschrieben. Das Oligonukleotid (150 M) in 5 ml 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer, pH 8,0, wird mit dem gewaschenen Gel 1-4 Stunden lang bei 25ºC aufgeschlämmt. Die Mischung wird dann mit 1 ml 1 M Ethanolamin: HCl-Puffer, pH-Wert 8,0, behandelt, um jegliche nicht umgesetzte aktiven Ester auf dem Gel abzudecken. Das Gel wird mit Wasser gewaschen, bis der gesamte Puffer entfernt worden ist, und bei 4ºC in Gegenwart von 0,02% Natriumazid aufbewahrt.

Beispiel 17

Herstellung des Reagenz-Trägers

Aminomethyliertes Polystyrol wird hergestellt, wie von B. A. Mukhitdinova, E. E. Eighozin und G. A. Makhmudova, Izv. Akad. Nauk. Kaz. SSR Ser Khim (1980) 48, beschrieben. Disuccinimidodicarbonat und 6-Aminohexanol werden von Aldrich erhalten
Aminomethyliertes Polystyrol (1 g, 3,0 meq/g) wird in Wasser/Acetonitril (10 ml, 3 : 1 v/v) suspendiert und mit Bernsteinsäureanhydrid (20 mmol) bei 4ºC behandelt. Der pH-Wert der Lösung wird durch Zugeben von 20%igem NaOH auf 6,0 gehalten. Wenn der pH-Wert der Lösung konstant bleibt, wird die Reaktion 24 Stunden lang fortgesetzt. Die Perlen werden filtriert, mit 2 N HCl, Wasser gewaschen (bis der pH-Wert der Waschungen neutral ist) und durch wiederholtes Waschen mit Dioxan wasserfrei gemacht.
Der Träger (mit gebundenen Säuregruppen) aus dem vorstehenden Abschnitt wird mit Disuccinimidocarbonat (20 mmol) in Acetonitril (10 ml) 24 Stunden lang bei 25ºC umgesetzt. Der Träger wird durch Filtration isoliert, und der Träger mit gebundenem Succinimido-Ester wird gründlich mit Acetonitril gewaschen.
Der Träger von oben wird in Dimethylformamid (10 ml) suspendiert und mit 6-Aminohexanol (20 mmol) 24 Stunden lang bei 25ºC umgesetzt. Der Träger wird durch Filtration isoliert, und der Träger mit der gebundenen Alkoholkette wird gründlich mit Dimethylformamid gewaschen.

Beispiel 18

Verfahren zur Kopplung von Aminonukleosiden an den Träger

N-Methylimidazol, Tetrabutylammoniumchlorid, Tetrabutylammoniumfluorid und Imidazol werden von Aldrich erhalten. Bis(p-nitrophenyl)carbonat wird von Sigma (St. Louis, MO) erhalten.
Der trägergebundene Alkohol (10 mmol) wird mit einem Kopplungsreagenz, wie Carbonyldiimidazol (50 mmol) in Dimethylformamid (30 ml) 3 Stunden lang bei 25ºC umgesetzt. Der aktivierte Träger (10 mmol) wird durch Filtration isoliert und mit Dimethylformamid gründlich gewaschen. Der Träger wird in 30 ml Dimethylformamid resuspendiert und mit einem gewählten Polycarbamat-Polymer (50 mmol), hergestellt wie in Beispiel 13, behandelt. Nach 3 Stunden wird der trägergebundene Alkohol filtriert und gründlich mit Dimethylformamid gewaschen.
Ein ausgewählte Sonde, spezifisch für eine Zielsequenz, welche die Reste 8441 bis 8456 des ORF-2-Gens von ARV-2, dem ätiologischen Agenz von AaS (Sanchez-Pescador et al., Science (1985) 277 : 484), umfaßt, wird synthetisiert durch Koppeln des Gels mit den folgenden 5'-Amino-Nukleotiden (in der Reihenfolge der frühesten Einführung): C, T, G, C, T, C, C, C, A, C, C, C, C, A, T, C, worin C, G, und A für das N-(β-(Trimethylsilyl)ethoxycarbonyl)-geschützte 5'-Amino-2',5'-didesoxycytidin, -guanosin bzw. -adenosin stehen, und T für 5'-Amino-2',5'-didesoxythymidin steht.
Das auf dem Träger befindliche Polycarbamat (10 mmol) wird in Acetonitril (30 mmol) suspendiert und mit Tetrabutylammoniumchlorid (3 mmol pro meq Schutzgruppe) und Kaliumtluorid-dihydrat (4 mmol pro meq Schutzgruppe) behandelt und 12 Stunden lang bei 50ºC erwärmt. Am Ende dieser Zeit wird Wasser (30 ml) zugegeben und die auf dem Träger befindliche Sonde wird gründlich mit Wasser gewaschen. Die Schutzgruppe kann auch mit Tetrabutylammoniumtluorid in Tetrahydrofuran (3 mmol pro meq Schutzgruppe) unter denselben Bedingungen entfernt werden.

Beispiel 19

Allgemeines Verfahren zur Einführung des Fluorophors

5-Dimethylamino-1-naphthalin-sulfonylchlorid wird von Aldrich erhalten.
Zu einer Lösung eines Ausgangs-Polyamins (1 mmol) in Pyridin (5 ml) bei 0ºC wird 5-Dimethylamino-1-naphthalin-sulfonylchlorid (0,85 mmol) zugegeben, und die Mischung wird über Nacht bei 4ºC gerührt. Das Pyridin wird dann bei 25ºC unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wird in 1 N HCl (5 ml) gelöst und auf eine AG-50W-Ionenaustauschersäule aufgetragen. Nach Waschen mit Wasser (10 ml) wird das Produkt mit einem Puffer eluiert, der aus Natriumacetat (0,1-2,0 M) und Natriumchlorid (0,1-2,0 M) bei pH 5 besteht. Nach Auffangen und Konzentrieren der das Produkt enthaltenden Fraktionen wird der Rückstand in Wasser (10 ml) gelöst und auf eine Dowex 50-W (Bio-Rad)-Ionenaustauschersäule aufgetragen und mit Wasser (10 ml) und 0,5 N HCl (5 ml) gewaschen, und schließlich wird das Produkt mit 6 N HCl eluiert. Das Hydrochloridsalz des Produktes wird durch Entfernen des Lösemittels unter vermindertem Druck erhalten.

Beispiel 20

Herstellung eines diagnostischen Reagenz zum Nachweis von Herpes Simplex, Typen I und II

Die 16 Basen große Sequenz an den Positionen 462 bis 477 des 2gD-Gens von Herpes simplex-Virus, Typen I und II, 5'-GCGGGGCTGCGTTCGG-3', umfaßt die gewählte Zielsequenz (Lasky & Downbenko, DNA (1984) 3 : 23). Ein komplementäres Reagenz- Polymer, aufgebaut aus alternierenden Methylphosphonat/Phosphodiester-Bindungen wird im wesentlichen gemäß den Verfahren der Beispiele 14 und 15 konstruiert.
Das Polymer wird zum 5'-O-(6-Aminohexal)oligonukleotid-Analog umgewandelt und durch herkömmliche Kopplungsverfahren über den Aminohexyl-Spacerarm an ein festes Affi-Gel 10- Trägermaterial gekoppelt.
Die Schmelztemperatur des Polymer/Analyt-Doppelstranges wird unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotides bestimmt, das die Zielsequenz 5'-GCGGGGCTGCGTTCGG-3' besitzt. Diese Zielsequenz, die käuflich erworben oder durch herkömmliche Verfahren konstruiert wird, wird mit einer im wesentlichen äquimolaren Menge des Polymers (vor Polymeranheftung an den festen Träger) in Annealingpuffer (10 mM EDTA, 100 mM Natriumphosphat, pH 7,2) gemischt. Diese Lösung wird auf 90ºC erwärmt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um das Annealing zu bewirken. Die Temperatur wird dann langsam erhöht und die Absorption wird als Funktion der Temperatur aufgezeichnet. Die Schmelztemperatur (Tm) wird als die Temperatur angenommen, bei der die Hälfte der gesamten Absorptionänderung aufgetreten ist.

Beispiel 21

Nachweis von Herpes Simplex, Typen I und II

Eine Analytenprobe, abgenommen als eine Hautabschürfung eines infizierten Gebietes, wird in 0,1 ml EDTA-Detergenz-Lösung (10 mM EDTA, 1% w/v Natriumdodecylsulfat, pH-Wert auf 7,0) suspendiert, kurz in einem Mikro-Gewebezerkleinerer (Kontes #K-885470) homogenisiert, und das Homogenat wird per Zentrifugation in einem Mikrofilter (VWR Scientific #28151-807) filtriert. Ein halber ml an 4, 5 M Natriumtrichloracetat wird zugegeben, worauf in wenigen Sekunden 0,6 ml Ethanol folgen. Diese Präparation wird 30 Minuten lang auf Eis gestellt und dann 5 Minuten lang bei 10000 g zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig dekantiert und verworfen, und das Röhrchen wird achtsam mit wäßrigem 80%igen Ethanol gespült. Das pelletierte Material (oft nicht sichtbar) wird in 0,05 ml Annealing-Puffer (10 mM EDTA, 100 mM Natriumphosphat, pH 7,2) resuspendiert und zu einer geeigneten Menge an diagnostischem Reagenz aus Beispiel XXI zugegeben (geschätztes molares Verhältnis Reagenz-Polymer/Analyt > 100). Das Annealing wird bei einer Temperatur von 8ºC unter der Tm des Polymer/Ziel-Doppelstranges (vorherbestimmt, wie in Beispiel 20 beschrieben) 30 Minuten lang durchgeführt, und dann wird das diagnostische Reagenz dreimal mit 2 ml großen Volumina an Annealingpuffer gewaschen. Dieses Waschen wird zweckmäßigerweise durch Zentrifugieren in einem Mikrofilter durchgeführt. Nach dem Waschen wird das diagnostische Reagenz in 0,2 ml Reporterlösung, welche 1 mg des fluoreszenten diquarternären Ammonium- Reporters enthielt, dessen Synthese in Beispiel 19 beschrieben ist, suspendiert. Die Reporterlösung enthält nur NaCl bei einer geeigneten Konzentration, die vorherbestimmt wird, wie obenstehend beschrieben. Das diagnostische Reagenz wird als nächstes dreimal mit 2 ml großen Volumina an Reporterfreier Bindungslösung gewaschen. Schließlich wird der Reporter von dem diagnostischen Reagenz mit 0,1 ml 2 M NaCl eluiert, und das Elutionsmittel hinsichtlich Fluoreszenz in einem Spektrofluorometer untersucht. Die Fluoreszenz aus einer Kontrollprobe ohne Analyt wird abgezogen, um ein quantitatives Maß vorzusehen, das proportional zum in der anfänglichen Probe vorhandenen Analyten ist.

Beispiel 22

Herstellung eines diagnostischen Reagenz zum Nachweis des AIDS-Virus

Die 16 Basen große Sequenz an den Positionen 8441-8456 des ORF-2-Gens des AJDSassoziierten Retrovirus (ARV-2), 5'-GATGGGGTGGGAGCAG-3', umfaßt die gewählte Zielsequenz (Sanchez-Pescador et al., Science (1985) 227 : 484). Ein komplementäres Polymer mit Carbamat-verknüpften Untereinheiten wird im wesentlichen gemäß den in Beispiel 13 ausführlich angegebenen Verfahren konstruiert. Kurz gesagt, werden die 2'-Desoxyribonucleoside dA, dC und dG geschützt, wie bereits beschrieben. Diese geschützten Nucleoside plus Thymidin werden dann in ihre 5'-Amino-Derivate umgewandelt. Der polymere Träger wird dann hergestellt, wie in Beispiel 16 oder 17, und Untereinheit werden in sequentieller Weise an diesen Träger durch das in diesen Beispielen beschriebene Verfahren geknüpft, um ein Träger-gebundenes geschütztes Polymer zu ergeben, das die Sequenz: Träger CTGCTCCCACCCCATC-3' besitzt. Im letzten Schritt werden die Basen-Schutzgruppen entfernt, um das gewünschte Carbamat-verknüpfte diagnostische Reagenz zu ergeben.
Die Schmelztemperatur des Polymer/Analyten wird wie folgend bestimmt. Ein RNA- Transkript wird aus einzelsträngigem Polynukleotid hergestellt, welches eine zur Zielsequenz komplementäre Sequenz enthält. Diese Ziel-enthaltende RNA wird in Annealingpuffer (10 mM EDTA, 100 mM Natriumphosphat, pH 7,0) suspendiert und zu dem obengenannten diagnostischen Reagenz zugesetzt. Die Mischung wird auf 90ºC erwärmt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um das Annealing zu bewirken. Anschließend wird das diagnostische Reagenz in eine kleine wasser-ummantelte Chromatographiesäule gegeben, durch welche langsam Annealingpuffer gepumpt wird. Die Temperatur wird langsam erhöht, während der Ausfluß hinsichtlich freigesetzter RNA überwacht wird. Die Freisetzungs- Temperatur (Tr) ist die Temperatur, bei der die RNA von der Säule eluiert wird. Dieser Tr- Wert weicht oftmals um ein bis einige GradºC von der entsprechenden Tm ab, die durch das Hyperchrom-Verschiebungs-Verfahren bestimmt wird.

Beispiel 23

Nachweis des AIDS-Virus

Fünf ml Blut, das im Verdacht steht, das AIDS-Virus zu enthalten, werden zentrifugiert und 2 ml des zellfreien Serums werden zu 8 ml 4,5 M Natriumtrichloracetat, enthaltend 0,1 mg Polyadenylsäure (Sigma Chem. Co. #P9403) zugegeben. Nach einigen Sekunden werden 10 ml Ethanol zugegeben und die Präparation wird 30 Minuten lang in einem Eisbad abgekühlt und dann 5 Minuten lang bei 10 000 g zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig dekantiert und verworfen. Die pelletierte Nukleinsäure (oft nicht sichtbar) wird mit wäßrigem 80%igen Ethanol gewaschen, gut abtropfen gelassen und in 0,1 ml Annealingpuffer (10 mM EDTA, 100 mM Natriumphosphat, pH 7,2) resuspendiert und zu einer angemessenen Menge an diagnostischem Reagenz aus Beispiel 22 zugegeben (geschätztes molares Verhältnis Polymer/Ziel > 100). Das Annealing wird bei einer Temperatur von 7ºC unter der Tr des Polymer/Ziel- Doppelstranges (vorbestimmt in Beispiel 22) eine Stunde lang durchgeführt, und dann wird das diagnostische Reagenz dreimal mit 2 ml großen Volumina Annealingpuffer gewaschen. Dieses Waschen wird zweckmäßigerweise durch Zentrifugieren in einem Mikrofilter durchgeführt.
Nach dem Waschen wird das diagnostische Reagenz in 0,2 ml einer enzymatischen tetrakationischen Reporter-Lösung suspendiert. Nach 30 Sekunden wird das diagnostische Reagenz dreimal mit 2 ml großen Volumen an reporterfreier Bindungslösung gewaschen. Danach wird das diagnostische Reagenz in Entwicklungslösung (15 mM p-Nitrophenylphosphat, 0,5 mM MgCI, 1,0 M Diethanolamin, pH 9,8) suspendiert und 3 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Das vom Reporter erzeugte p-Nitrophenol wird spektrophotometrisch quantifiziert. Die entsprechende Absorption aus einer Kontrollprobe ohne Analyt wird abgezogen, um ein quantitatives Maß vorzusehen, das proportional zum in der anfänglichen Probe vorhandenen Analyten ist.
Während die Erfindung unter Bezug auf besondere ausführungsformen beschrieben worden ist, wird davon auszugehen sein, daß verschiedene Veränderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne von der Erfindung abzuweichen. Zum Beispiel kann das diagnostische Reagenz mehrere Spezies von trägergebundenen Polymeren beinhalten, wobei jede Spezies ausgelegt ist, um an eine unterschiedliche gewählte Zielsequenz in Polynukleotidsträngen aus unterschiedlichen Analyten zu binden, oder das diagnostische Reagenz kann zwei Spezies von Träger-gebundenen Polymeren beinhalten, wobei jede Spezies ausgelegt ist, um an einen unterschiedlichen komplementären Strang eines doppelsträngigen Analyten zu binden. Diese Mehrfach-Spezies-Reagenzien bieten die Möglichkeit, mehr als einen Analyten in einem diagnostischen Test nachzuweisen, oder der Verdopplung der Empfindlichkeit des Nachweises eines einzelnen doppelsträngigen Analyten.

Claims

1. Verwendung einer Morpholino-Untereinheit der Formel (I)

worin P ein Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest ist und T H oder eine N-Schutzgruppe ist, zur Herstellung eines Polymers, das zur Wasserstoffbrückenbindung an komplementären Basen in einem Polynukleotid in der Lage ist, wobei in dem Polymer (i) die Untereinheiten vornehmlich durch im wesentlichen ungeladene, achirale Verknüpfungen verbunden sind und (ii) jede Verknüpfung den Morpholino-Stickstoff einer Untereinheit an den 5'-exocyclischen Kohlenstoff einer angrenzenden Untereinheit bindet.

2. Verwendung der Untereinheit gemäß Anspruch 1, worin P folgendes ist:

worin X F, Cl, Br oder I ist.

3. Verwendung der Untereinheit gemäß Anspruch 1, worin P ein N-geschütztes exocyclisches Amin enthält.

4. Polymer, umfassend Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsreste, wobei das Polymer zur Wasserstoffbrückenbindung an komplementären Basen in einem Polynukleotid in der Lage ist, wobei das Polymer Morpholino-Untereinheiten folgender Formel umfaßt:

worin P der Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest ist und die Untereinheiten vornehmlich durch im wesentlichen ungeladene, achirale Verknüpfungen verbunden sind.

5. Polymer gemäß Anspruch 4, worin P folgendes ist:

worin X F, Cl, Br oder I ist.

6. Polymer gemäß Anspruch 4, worin P ein N-geschütztes, exocyclisches Amin enthält.

7. Polymer gemäß mindestens einem der Ansprüche 4 bis 6, worin die ungeladenen, achiralen Verknüpfungen -C(X)-, worin X O oder S ist, oder -NH-E- sind, worin die Gruppe E an dem 5'-exocyclischen Kohlenstoffatom der Untereinheit gebunden ist und C(O) oder S(O)&sub2; ist.

8. Polymer gemäß mindestens einem der Ansprüche 4 bis 7, welches ferner einen Rest an einem oder an beiden Enden einschließt, welcher wirksam ist, um die Löslichkeit des Polymeren in wäßrigem Medium zu steigern.

9. Polymer gemäß Anspruch 8, worin der endständige Rest Polyethylenglykol ist.

10. Polymer gemäß mindestens einem der Ansprüche 4 bis 9, bestehend aus mindestens 3 Morpholino-Untereinheiten.

11. Polymer gemäß mindestens einem der Ansprüche 4 bis 10, worin mindestens eine der basenpaarenden Reste P ein 2,6-Diaminopurin ist.

12. Polymer gemäß mindestens einem der Ansprüche 4 bis 11, worin mindestens einer der basenpaarenden Reste P ein 5-Halogenuracil ist.

13. Polymer gemäß mindestens einem der Ansprüche 4 bis 12, worin mindestens 70% der basenpaarenden Reste P 2-Amino-haltige Purine sind.

14. Verfahren zur Herstellung eines Polymers, wie es nach mindestens einem der Ansprüche 4 bis 13 definiert ist, welches das Koppeln einzelner Untereinheiten in kontrollierter, sequentieller Weise an den nicht geschützten Stickstoff einer Polymerzusammensetzung, umfassend zwei oder mehr verknüpfte Morpholino-Untereinheiten, wie in Anspruch 4 definiert, umfaßt.