KR20220139366A - 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 펜드리드 증후군 치료를 위한 이의 용도 - Google Patents

안티센스 올리고뉴클레오티드 및 펜드리드 증후군 치료를 위한 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 개시는 의약 분야에 관한 것이다. 특히, 본 개시는pre-mRNA 스플라이싱(splicing) 동안 SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑(skipping)을 예방하거나 감소시키는 신규한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 펜드리드 증후군 치료에의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

안티센스 올리고뉴클레오티드 및 펜드리드 증후군 치료를 위한 이의 용도
관련 출원 교차 참조
본 출원은 2020년 2월 12일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/975,337호의 우선권을 주장하며, 이의 전문이 본원에 원용된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출되고 전문이 본원에 원용되는 서열 목록을 포함한다. 2021년 2월 10일에 생성된 상기 ASCII 카피는 13365_0018-00304_SL.txt로 명명되고 16,709 바이트 크기이다.
기술분야
본 발명은 pre-mRNA 스플라이싱 동안 엑손 스키핑을 예방하거나 감소시키는 신규한 안티센스 올리고뉴클레오티드("ASOs"), 이러한 ASOs를 함유하는 약제학적 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.
펜드리드 증후군은 감각신경성 난청 장애이다. 이는 증후군성 난청의 가장 빈번한 원인들 중 하나이며, 모든 유전성 난청 사례들의 약 4-10%를 차지한다. 펜드리드 증후군 환자는 전정 수도관 확장을 포함하여, 기형 내이를 갖는다. 때때로, 와우관 및 중간 격벽이 체액이 찬 강으로 전체적으로 또는 부분적으로 대체되는 몬디니 와우관이 또한 발달될 수 있다. 증후군에 의해 야기되는 청력 손실은 통상적으로 선천성이지만, 일부 드문 경우는 나중에 아동기에 발생한다. 영양 섭취와 같은 다른 요인에 따라 달라지므로 가변적이지만, 일부 환자들(50-83%)에게는 갑상선종도 또한 존재할 것이다. Wemeau & Kopp, (2017) Best Prac. & Res. Clin. Endocrinology & Metabolism 31, 213-224.
펜드리드 증후군의 조기 치료는 선천적인 경우에 언어 습득 및 의사소통 기술을 보장하기 위해 중요하다. 펜드리드 증후군 치료에 대한 현재의 옵션은 난청 장애를 도울 수 있는 보청기와 같은 청력 보조 장치를 포함한다. 그러나, 심한 난청을 갖는 환자에게는, 인공 와우가 권장될 수 있다. 이식 과정은 몬디니 와우관을 갖는 환자에서 뇌척수액의 누출을 야기할 수 있다. Wemeau & Kopp, (2017) Best Prac. & Res. Clin. Endocrinology & Metabolism 31, 213-224. 현재, 펜드리드 증후군을 치료하는 데 이용가능한 약물은 없고, 펜드리드 증후군의 근본적인 유전적 원인에 관한 치료 옵션은 없다.
펜드리드 증후군은 펜드린을 인코딩하는 SLC26A4 유전자에서의 이중 대립 형질 돌연변이를 특징으로 하는 상염색체 열성 장애이다. 펜드린은 내이 및 갑상선에서 발현되는 다기능성 음이온 교환 단백질이다. 염화물, 요오드화물, 및 다른 음이온에 대한 친화도로, 펜드린은 내이에서 염화물 및 중탄산염의 교환을 가능하게 함으로써 내림프의 조성 및 잠재력을 유지한다. Wemeau & Kopp, (2017) Best Prac. & Res. Clin. Endocrinology & Metabolism 31, 213-224. SLC26A4 유전자에서의 돌연변이(c.919-2A>G)는 SLC26A4 pre-mRNA의 처리 동안 엑손 8 스키핑을 야기한다. IVS7-2A>G로도 알려져 있는 돌연변이는 청력이 손실된 동아시아인에게 가장 흔한 돌연변이 중 하나이다.
코딩(엑손) 및 비코딩(인트론) 서열을 함유하는 진핵 유전자에서, 비코딩 인트론이 pre-mRNA 전사체로부터 절단되고, 코딩 엑손이 함께 스플라이싱되어 mRNA를 형성한다. 인트론이 최종 mRNA 전사체에 남아 있거나 엑손이 누락된 경우, mRNA의 전사 동안 mRNA 판독 프레임이 중단될 수 있다. 이는 비-기능 폴리펩티드 서열 또는 조기 종결 코돈을 초래할 수 있다. 스플라이싱 과정은 동일한 pre-mRNA 서열이 상이한 엑손 조합들로 스플라이싱되어 다수의 mRNA 서열들을 형성할 수 있는 대안적인 스플라이싱에 의해 더욱 복잡해진다.
pre-mRNA의 스플라이싱은 스플라이소솜이라 불리는 멀티-메가달톤 리보핵산단백질 복합체를 수반하는 복잡한 과정이다. 스플라이소솜은 pre-mRNA에서 특이적 서열을 인식하여 인트론을 정확하게 절단하고 엑손을 결찰한다. 스플라이소솜은 세 개의 보존 RNA 서열들을 사용하여 두 가지 에스터교환 반응에서 인트론 절단을 촉진시킨다. 이들 RNA 서열들은 5' 스플라이스 부위, 3' 스플라이스 부위, 및 분지 부위이다. Will & Luhrmann, (2011) Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003707.
스플라이싱은 친핵성 공격을 통해 5' 스플라이스 부위에 결합한 분지 부위의 2' OH 기로 시작하여, 5' 스플라이스 부위에서 5' 엑손의 절단을 야기하고 라리아트를 형성한다. 이어서, 5' 엑손의 3' OH 기는 3' 스플라이스 부위에서 3' 엑손을 공격하고, 5' 및 3' 엑손들을 결찰시키며, 인트론 라리아트를 절단한다. Will & Luhrmann, (2011) Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003707. 스플라이싱 과정은 스플라이소솜 인식 부위들, 5' 및 3' 스플라이스 부위들, 및 분지 부위에 전적으로 의존하기 때문에, 이들 부위들 중 어느 하나에서의 돌연변이는 스플라이싱 과정을 중단시킬 수 있다.
펜드리드 증후군에서, SLC26A4에서의 (c.919-2A>G) 돌연변이는 SLC26A4 pre-mRNA의 스플라이싱 과정에 영향을 미쳐, 엑손 8 스키핑을 야기한다. 최종 mRNA 전사체로부터의 엑손 8의 부정확한 제거는 번역 동안 판독 프레임의 중단을 야기하여, 펜드린 펩티드 절단 및 기능장애를 초래한다. Wemeau & Kopp, (2017) Best Prac. & Res. Clin. Endocrinology & Metabolism 31, 213-224.
ASOs가 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합함으로써, 전사, 스플라이싱, 안정성 및/또는 번역과 같은 유전자 발현의 하나 이상의 측면에 영향을 미치도록 설계된 폴리뉴클레오티드이다. ASO는 RNA 또는 DNA에 관한 것일 수 있다. RNA에 관한 ASO는 표적 mRNA 서열들에 결합하여, 리보솜에서의 mRNA 안정성 또는 번역에 영향을 미칠 수 있다.
pre-mRNA 전사체 내의 표적 서열들에 결합하는 ASOs는 스플라이싱 과정에 영향을 미칠 수 있다. 일부 경우에, ASOs는 pre-mRNA 스플라이싱 동안 엑손 스키핑을 유도하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)은 번역 동안 디스트로핀 mRNA의 판독 프레임을 바꾸는 돌연변이에 의해 야기되어, 조기 종결 코돈 및 디스트로핀 단백질 절단을 초래한다. ASOs는 스플라이싱 동안 엑손의 스키핑을 유도함으로써 판독 프레임을 교정하는 데 이용될 수 있다. 정확한 수의 염기 쌍의 엑손을 제거하는 것은 보다 짧은 mRNA 전사체를 생성하지만, 판독 프레임이 교정될 수 있다. 디스트로핀 RNA는 79개의 엑손으로 구성되기 때문에, 스플라이싱 동안 하나 또는 수 개의 엑손을 스킵하는 것은 여전히 부분적으로 기능성인 단백질을 초래한다. Shimo et al., (2015) Duchenne Muscular Dystrophy 143-155. FDA는 2016년에 DMD의 치료를 위해 Exondys 51(eteplirsen)이라 불리는 엑손 스키핑 약물을 승인하였다. Dowling, (2016) Nature Review Neurology 12, 675-676.
다른 경우에, ASOs는 pre-mRNA 스플라이싱 동안 엑손 스키핑을 방지하거나 감소시키는 데 사용될 수 있다. 예로서, ASO 약물 뉴시너센(Spinraza®)은 척수성 근위축증을 치료하기 위해 SMN2 유전자의 스플라이싱 동안 엑손 7 스키핑을 감소시킨다. Son & Yokota, (2018) Exon Skipping & Inclusion Therapies, 57-68. 그러나, SLC26A4의 pre-mRNA 스플라이싱 동안 엑손 8 스키핑을 성공적으로 예방하거나 감소시키는 ASOs 및 관련 병태, 예를 들어, 펜드리드 증후군을 치료하는 데 있어서의 이의 용도에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명은 ASOs, 이 ASOs를 사용하여 pre-mRNA 스플라이싱 동안 엑손 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법, 이 ASOs를 포함하는 약제학적 조성물, 및 이 조성물을 사용하여 펜드리드 증후군의 청력 손실을 치료하는 방법에 관한 것이다.
구현예에서, 본 발명은 서열 ID 번호 1의 전부 또는 일부를 포함하는 10-30 뉴클레오티드 길이의 ASO를 제공한다.
구현예에서, 본 발명은 ASO를 제공하며, ASO는 다음과 같다:
a. HUA0003-1027 (5'-tagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 2);
b. HUA0003-1029 (5'-attagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 3);
c. HUA0003-1030 (5'-tattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 4);
d. HUA0003-1031 (5'-gtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 5);
e. HUA0003-1032 (5'-tgtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 6);
f. HUA0003-0930 (5'-tattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 7);
g. HUA0003-0929 (5'-attagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 8);
h. HUA0003-0928 (5'-ttagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 9); 또는
i. HUA0003-0931 (5'-gtattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 10).
구현예에서, 본 발명은 비-천연 백본을 포함하는 상술된 ASO를 제공한다.
구현예에서, 본 발명은 변형된 당 모이어티를 포함하는 상술된 ASO를 제공한다.
구현예에서, 본 발명은 2'-O-메톡시에틸 리보스 모이어티를 포함하는 상술된 ASO를 제공한다.
구현예에서, 본 발명은 변형된 포스페이트를 포함하는 상술된 ASO를 제공한다.
구현예에서, 본 발명은 포스포로티오에이트를 포함하는 상술된 ASO를 제공한다.
구현예에서, 본 발명은 질소 염기를 포함하는 상술된 ASO를 제공한다.
구현예에서, 본 발명은 5-메틸시토신 염기를 포함하는 상술된 ASO를 제공한다.
구현예에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 더 포함하는 상술된 ASO를 제공한다.
구현예에서, 본 발명은 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 pre-mRNA 스플라이싱 동안 SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법으로서, 상기 핵산 분자는 서열 ID 번호 1 (5'-tgtattagtactaagaggaacacca-3')의 전부 또는 일부를 포함하는 ASO이고, 상기 ASO는 상기 SLC26A4 유전자의 인트론 8 표적 영역에 혼성화하며, 상기 ASO는 상기 SLC26A4 유전자의 pre-mRNA 스플라이싱 동안 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 것인, 방법을 제공한다.
구현예에서, 본 발명은 상술된 pre-mRNA 스플라이싱 동안 SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법을 제공하며, ASO는 다음과 같다:
a. HUA0003-1027 (5'-tagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 2);
b. HUA0003-1029 (5'-attagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 3);
c. HUA0003-1030 (5'-tattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 4);
d. HUA0003-1031 (5'-gtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 5);
e. HUA0003-1032 (5'-tgtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 6);
f. HUA0003-0930 (5'-tattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 7);
g. HUA0003-0929 (5'-attagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 8);
h. HUA0003-0928 (5'-ttagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 9); 또는
i. HUA0003-0931 (5'-gtattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 10).
구현예에서, 본 발명은 상술된 pre-mRNA 스플라이싱 동안 SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법을 제공하며, 세포는 동물 세포이다.
구현예에서, 본 발명은 상술된 pre-mRNA 스플라이싱 동안 SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법을 제공하며, 세포는 인간 세포이다.
구현예에서, 본 발명은 상술된 pre-mRNA 스플라이싱 동안 SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법을 제공하며, 핵산 분자는 발현 벡터에 의해 세포 내로 도입된다.
구현예에서, 본 발명은 상술된 pre-mRNA 스플라이싱 동안 SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법을 제공하며, 발현 벡터는 pCI-neo 발현 벡터이다.
구현예에서, 본 발명은 서열 ID 번호 1의 전부 또는 일부를 포함하는 ASO의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 펜드리드 증후군을 갖는 대상체의 청력 손실을 치료하는 방법을 제공한다.
구현예에서, 본 발명은 상술된 펜드리드 증후군을 갖는 대상체의 청력 손실을 치료하는 방법을 제공하며, 투여되는 ASO는 다음과 같다:
a. HUA0003-1027 (5'-tagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 2);
b. HUA0003-1029 (5'-attagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 3);
c. HUA0003-1030 (5'-tattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 4);
d. HUA0003-1031 (5'-gtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 5);
e. HUA0003-1032 (5'-tgtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 6);
f. HUA0003-0930 (5'-tattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 7);
g. HUA0003-0929 (5'-attagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 8);
h. HUA0003-0928 (5'-ttagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 9); 또는
i. HUA0003-0931 (5'-gtattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 10).
구현예에서, 본 발명은 상술된 펜드리드 증후군을 갖는 대상체의 청력 손실을 치료하는 방법을 제공하며, ASO는 비경구 투여를 통해 투여된다.
구현예에서, 본 발명은 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 pre- mRNA 스플라이싱 동안 SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법에 사용하기 위한 화합물을 제공하며, 핵산 분자는 서열 ID 번호 1의 전부 또는 일부를 포함하는 ASO이다.
구현예에서, 본 발명은 상술된 pre-mRNA 스플라이싱 동안 SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법에 사용하기 위한 화합물을 제공하며, ASO는 다음과 같다:
a. HUA0003-1027 (5'-tagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 2);
b. HUA0003-1029 (5'-attagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 3);
c. HUA0003-1030 (5'-tattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 4);
d. HUA0003-1031 (5'-gtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 5);
e. HUA0003-1032 (5'-tgtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 6);
f. HUA0003-0930 (5'-tattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 7);
g. HUA0003-0929 (5'-attagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 8);
h. HUA0003-0928 (5'-ttagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 9); 또는
i. HUA0003-0931 (5'-gtattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 10).
구현예에서, 본 발명은 상술된 pre-mRNA 스플라이싱 동안 SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법에 사용하기 위한 화합물을 제공하며, 세포는 동물 세포이다.
구현예에서, 본 발명은 상술된 pre-mRNA 스플라이싱 동안 SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법에 사용하기 위한 화합물을 제공하며, 세포는 인간 세포이다.
구현예에서, 본 발명은 상술된 pre-mRNA 스플라이싱 동안 SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법에 사용하기 위한 화합물을 제공하며, 핵산 분자는 발현 벡터를 통해 세포 내로 도입된다.
구현예에서, 본 발명은 상술된 pre-mRNA 스플라이싱 동안 SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법에 사용하기 위한 화합물을 제공하며, 발현 벡터는 pCI-neo 발현 벡터이다.
구현예에서, 본 발명은 서열 ID 번호 1의 전부 또는 일부를 포함하는 ASO의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 펜드리드 증후군을 갖는 대상체의 청력 손실을 치료하는 방법에 사용하기 위한 화합물을 제공한다.
구현예에서, 본 발명은 상술된 펜드리드 증후군을 갖는 대상체의 청력 손실을 치료하는 방법에 사용하기 위한 화합물을 제공하며, ASO는 다음과 같다:
a. HUA0003-1027 (5'-tagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 2);
b. HUA0003-1029 (5'-attagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 3);
c. HUA0003-1030 (5'-tattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 4);
d. HUA0003-1031 (5'-gtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 5);
e. HUA0003-1032 (5'-tgtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 6);
f. HUA0003-0930 (5'-tattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 7);
g. HUA0003-0929 (5'-attagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 8);
h. HUA0003-0928 (5'-ttagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 9); 또는
i. HUA0003-0931 (5'-gtattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 10).
구현예에서, 본 발명은 상술된 펜드리드 증후군을 갖는 대상체의 청력 손실을 치료하는 방법에 사용하기 위한 화합물을 제공하며, ASO는 비경구 투여를 통해 투여된다.
도 1은 SLC26A4 꼬마유전자 c.919-2A>G 돌연변이체에 대한 엑손 8 내포를 촉진하는 ASOs의 식별을 보여준다. 미처리 세포(Blank) 내의 엑손 8 내포율은 -30%이다. 10 nM 대조군 ASO(Con ASO)로 처리된 세포 내의 내포율은 ~26%이다. FL: 전체 길이 전사체, *: 인트론 7-보유 전사체, Δ8: 엑손 8-스킵 전사체.
도 2는 ASO(서열번호 3)를 사용하여 환자로부터 유래된 PBMC 내의 내인성 SLC26A4 c.919-2A>G 돌연변이체의 엑손 8 내포를 보여준다. PBMC: 말초 혈액 단핵 세포, FL: 전체 길이 전사체, Δ8: 엑손 8-스킵 전사체.
도 3은 pre-mRNA의 스플라이싱에 관여하는 두 가지 에스터교환 반응을 나타낸다. 분지 부위의 2' OH 기는 친핵성 공격을 통해 5' 스플라이스 부위에 결합하여, 5' 엑손의 절단을 야기하고 5' 스플라이스 부위와 분지 부위 사이에 라리아트를 형성한다. 이어서, 5' 엑손의 3' OH 기는 3' 스플라이스 부위에서 3' 엑손에 결합하고 인트론 라리아트를 절단하며 엑손을 결찰시켜 mRNA를 얻는다. 5'SS: 5' 스플라이스 부위; 3'SS: 3' 스플라이스 부위; BS: 분지 부위.
정의
본원에서, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 적어도 10개의 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 지칭하기 위해 사용된다.
본원에서, "ASO"로 약칭되는 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 뉴클레오티드 서열과 안정한 이중 가닥 하이브리드를 형성하기 위해 표적 뉴클레오티드 서열에 충분히 상보적인 안티센스 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 지칭하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 RNA 뉴클레오티드 서열이다.
본원에서, 용어 "핵염기"는 뉴클레오시드의 성분인 질소 염기를 지칭하기 위해 사용된다. 예시적인 핵염기는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 및 우라실을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서, 용어 "뉴클레오시드"는 당에 공유 결합된 핵염기를 지칭하기 위해 사용된다. 천연 및 비-천연 뉴클레오시드의 예는 후술된다.
본원에서, 용어 "뉴클레오티드"는 포스페이트 기에 공유 결합된 뉴클레오시드를 지칭하기 위해 사용된다. 천연 및 비-천연 뉴클레오티드의 예는 후술된다.
본원에서, 용어 "비-천연"은 (i) 변형된 뉴클레오티드간 연결, 예를 들어, 천연 발생 올리고뉴클레오티드에서 발견되는 표준 포스포디에스테르 연결 이외의 뉴클레오티드내 연결, (ii) 변형된 당 모이어티, 예를 들어, 천연 발생 올리고뉴클레오티드에서 발견되는 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티 이외의 모이어티, (iii) 변형된 질소성 염기, 예를 들어, 자연 발생 올리고뉴클레오티드에서 발견되는 염기들 이외의 염기, 또는 (iv) 상기의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드 서브유닛을 지칭하기 위해 사용된다.
본원에서, 용어 "모르폴리노"는 리보스 대신에 모르폴리닐 고리를 함유하는 핵염기를 지칭하기 위해 사용된다.
본원에서, 용어 "상보성"은 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열의 상응하는 위치들이 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 때를 설명하기 위해 사용된다.
본원에서, 용어 "혼성화"는 하나의 이중 가닥 분자를 형성하는 2개의 상보성 뉴클레오티드 서열의 결합을 설명하기 위해 사용된다. 2개의 서열에서 충분한 수의 상응하는 뉴클레오티드가 순서대로 서로 수소 결합할 수 있을 때, 즉 이들이 충분히 상보적일 때, 이들은 안정한 하이브리드를 형성할 수 있다. ASO가 표적 서열과 혼성화하는 데 100% 상보성이 필요하지 않다는 것이 당업계에서 이해된다.
본원에서, 용어 "충분한 상보성"은 ASO가 이의 표적 서열에 특이적으로 결합하고 안정한 하이브리드를 형성하도록 하기에 충분한 상보성 수준을 나타내기 위해 사용된다. 일 구현예에서, ASO 및 표적 서열의 상보성은 적어도 99%, 또는 98%, 또는 97%, 또는 96%, 또는 95%, 또는 94%, 또는 93%, 또는 92%, 또는 91%, 또는 90%, 또는 89%, 또는 88%, 또는 87%, 또는 86%, 또는 85%, 또는 84%, 또는 83%, 또는 82%, 또는 81%, 또는 80%, 또는 79%, 또는 78%, 또는 77%, 또는 76%, 또는 75%, 또는 74%, 또는 73%, 또는 72%, 71%, 또는 70%이다.
본원에서, 용어 "표적 영역" 및 "표적 서열"은 ASO가 생리학적 조건 하에 혼성화될 뉴클레오티드 서열을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. ASO가 표적 서열에 혼성화하고 안정한 하이브리드를 형성하기에 충분한 상보성이 있는 한, ASO와 표적 영역이 100% 상보성일 필요는 없다. ASO는 표적 서열의 전부 또는 일부에 혼성화할 수 있다.
본원에서, 용어 "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 질환 또는 장애를 개선하는 것(즉, 질환 또는 이의 임상 증상 중 적어도 하나의 발달을 늦추거나 저지하거나 감소시키는 것)을 지칭하기 위해 사용된다. 또한, 이 용어는 환자가 분간할 수 없는 것들을 포함하여 적어도 하나의 물리적 파라미터를 완화 또는 개선하는 것을 지칭한다. 또한, 용어는 질환 또는 장애를 물리적으로(예를 들어, 분간가능한 증상의 안정화를 통해), 생리학적으로(예를 들어, 물리적 파라미터의 안정화를 통해), 또는 양자로 조절하는 것을 지칭한다. 또한, 이 용어는 질환 또는 장애의 발병 또는 발달 또는 진행을 예방하거나 지연시키는 것을 지칭한다.
본원에서, 용어 "치료 유효량"은 장애 또는 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 치료제 또는 조성물의 양을 지칭하기 위해 사용된다. 일 구현예에서, 이는 펜드리드 증후군의 예방 또는 치료에 효과적인 치료제 또는 조성물의 양을 포함한다.
본원에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 약제학적으로 유용하고 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않지 않은 분자 물질 또는 조성물을 지칭하기 위해 사용된다.
본원에서, 용어 "담체"는 화합물이 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭하기 위해 사용된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "부형제"는 활성 성분 이외의 약제학적 조성물 내의 임의의 성분을 지칭한다.
달리 정의되지 않는 한, 기타 모든 과학적 및 기술적 용어들은 당업자에 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 이러한 과학적 및 기술적 용어는 문헌, 예를 들어, 다음과 같은 문헌에 설명되어 있다: J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Eaboratory Press; Martin, 1990, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co; Glover, 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, MRL Press, Ltd.; and Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., 2002, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates/Wiley Intersciences.
안티센스 올리고뉴클레오티드
일 구현예에서, SLC26A4 pre-mRNA 내의 표적 서열에 대한 ASOs가 본원에서 개시된다. 일부 구현예는 SLC26A4 pre-mRNA 중 인트론 8의 25-뉴클레오티드 표적 서열의 전부 또는 일부에 관한 ASOs에 관한 것이다(표 1, "25-Nt 관심 서열"). 이 표적 서열은 SLC26A4 유전자에서의 인트론 8의 위치 8 내지 위치 32이다. 이 인트론 8 표적 서열은 돌연변이체 (c.919- 2A>G) SLC26A4에서 발생하는 엑손 8 스키핑 ― 이에 의해 돌연변이체를 함유하는 pre-mRNA가 부정확하게 스플라이싱되어, 최종 전사체로부터 엑손 8을 제거함 ― 에 관여한다.
또 다른 구현예에서, 25-nt 표적 서열에 관한 ASOs는 표적 서열에 충분히 상보적이어서 안정한 하이브리드를 형성하고 10-30 뉴클레오티드 길이이다. 이들 ASO는 25-nt 표적 서열의 전부 또는 일부에 충분히 상보적이다.
일부 구현예에서, ASOs는 표 3에 개시된 특정 서열을 갖는다. 이들 특정 ASOs는 또한 실시예에 예시되어 있다. 그러나, 이들 특정 ASOs는 단지 예시적인 목적으로 개시되고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
일부 구현예에서, ASOs의 적어도 일부 핵염기는 티민을 우라실로, 또는 우라실을 티민으로 대체할 것이다. 일부 구현예에서, ASOs의 적어도 일부 뉴클레오시드는 데옥시리보스를 리보스로, 또는 리보스를 데옥시리보스로 대체할 것이다.
뉴클레오티드 변형
또 다른 구현예에서, 개시된 ASOs는 당업자들에게 공지되어 있는 하나 이상의 방식으로 화학적으로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드 변형은 예를 들어, 변형된 질소성 염기, 당 모이어티, 및 포스페이트를 포함한다. 이러한 변형은 적어도 뉴클레아제 열화에 저항하는 이들의 능력에서 바람직하다.
본 발명에 유용한 화학적으로 변형된 ASOs의 구체적인 예는 변형된 포스페이트 백본 또는 비-천연 뉴클레오시드간 연결을 함유하는 ASOs를 포함한다. 변형된 백본을 갖는 ASOs는 백본에 인 원자를 보유하는 것 및 백본에 인 원자를 갖지 않는 것을 포함한다.
다른 구현예들에서, ASO 내의 뉴클레오티드 유닛의 당 및 뉴클레오시드간 연결, 즉 백본 양자는 신규한 기로 대체된다. 염기 유닛은 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 예를 들어, ASO는 펩티드 핵산(PNA)일 수 있다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-백본은 아미드 함유 백본, 예를 들어, 아미노에틸글리신 백본으로 대체된다. 뉴클레오-염기는 유지되고, 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다.
또한, 변형된 ASOs는 하나 이상의 치환된 당 모이어티, 예를 들어, -OH; -F; 하나 이상의 헤테로원자가 개재될 수 있는 치환 또는 미치환된 선형 또는 분지형 저급 (C1-C10) 알킬, 알케닐, 알키닐, 알크아릴, 알릴, 또는 아르알킬; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S-, 또는 N-알키닐; O-, S-, 또는 N- 알릴; O-알킬-O-알킬, -메톡시, -아미노프로폭시; 메톡시에톡시; 디메틸아미노옥시에톡시; 및 -디메틸아미노에톡시에톡시와 같은 2', 3' 및/또는 5' 위치에서 일치환 또는 이치환된 하나 이상의 당 모이어티를 함유할 수 있다. 당 모이어티는 피라노오스 또는 이의 유도체, 또는 데옥시피라노오스 또는 이의 유도체, 리보스 또는 이의 유도체, 또는 데옥시리보스 또는 이의 유도체일 수 있다. 일 구현예에서, 치환된 당 모이어티는 2'-O-메톡시에틸 모이어티이다.
또한, 변형된 ASO는 하나 이상의 핵염기(종종 당업계에서 간단히 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환된, 예를 들어, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예를 들어, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 함유할 수 있다. 특정 핵염기는 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키는 데 특히 유용하다. 5-메틸시토신 치환은 0.6-1.2℃ 만큼 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 나타났다.
본 발명의 ASOs의 또 다른 변형은 ASO의 활성, 세포 분포 또는 세포 활용을 향상시키는 하나 이상의 모이어티 또는 컨쥬게이트에 화학적으로 결합하는 것을 수반한다. 이러한 모이어티는 지질 모이어티, 예컨대, 콜레스테롤 모이어티, 콜산, 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테릴 모이어티를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
ASO에 대한 또 다른 변형은 모르폴리노계 ASOs를 포함한다. 모르폴리노계 올리고머는 핵염기를 지지하는 모르폴리노 서브유닛을 포함하는 올리고머를 지칭하고, 리보스 대신, 모르폴리닐 고리를 함유한다. 예시적인 뉴클레오티드간 연결은 예를 들어, 하나의 모르폴리노 서브유닛의 모르폴리닐 고리 질소를 인접한 모르폴리노 서브유닛의 4' 엑소시클릭 탄소에 결합시키는 포스포르아미데이트 또는 포스포로디아미데이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 각 모르폴리노 서브유닛은 염기 특이적 수소 결합에 의해 올리고뉴클레오티드 내의 염기에 결합하는 데 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 핵염기를 포함한다.
모폴리노계 ASO(변형된 ASOs를 포함함)는 예를 들어, 미국 특허 5,698,685; 5,217,866; 5,142,047; 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,521,063; 5,506,337을 참조하며, 이들은 그 전문이 본원에 원용된다.
ASO 구조 내에서, 포스페이트 기는 일반적으로 ASO의 "뉴클레오티드간 연결"을 형성하는 것으로 지칭된다. RNA 및 DNA의 천연 발생 뉴클레오티드간 연결은 3' 대 5' 포스포디에스테르 연결이다. 포스포르아미데이트 기는 3개의 부착된 산소 원자 및 1개의 부착된 질소 원자를 갖는 인을 포함하는 한편, "포스포로디아미데이트" 기는 2개의 부착된 수소 원자 및 2개의 부착된 질소 원자를 갖는 인을 포함한다. 포스포로트리아미데이트 기(또는 인산 트리아미드 기)는 1개의 부착된 산소 원자 및 3개의 부착된 질소 원자를 갖는 인을 포함한다. 본원에서 설명되는 모르폴리노계 ASOs의 비하전된 또는 양이온성 뉴클레오티드간 연결에서, 하나의 질소는 항상 연결 사슬에 상대가 된다. 포스포로디아미데이트 연결에서 제2 질소는 통상적으로 모르폴리노 고리 구조에서의 고리 질소이다.
주어진 ASO에서 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없고, 사실상 상술된 변형 중 하나 이상이 ASO 내의 단일 뉴클레오시드에 포함될 수 있다. ASOs는 ASO가 뉴클레아제 열화에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 활용, 및/또는 표적 핵산에 대해 증가된 결합 친화도를 위한 추가 영역을 부여하기 위해 변형된 적어도 하나의 영역을 함유할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 제조
본 발명에 따라 사용되는 안티센스 분자는 고상 합성의 주지된 기술을 통해 제조될 수 있다. 이러한 합성을 위한 장비는 예를 들어, Applied Biosystems (Foster City, Calif.)를 포함하는 몇몇 공급원으로부터 입수가능하다. 변형된 고체 지지체 상에 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한 가지 방법이 미국 특허 4,458,066에서 설명된다.
당업계에 공지되어 있는 이러한 합성을 위한 임의의 다른 수단들이 추가적으로 또는 대안적으로 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드, 예컨대, 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체를 제조하기 위해 유사한 기술을 사용하는 것이 주지되어 있다. 하나의 이러한 자동화된 구현예에서, 디에틸-포스포르아미다이트가 출발 물질로서 사용되며, Beaucage, et al., (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1862에 의해 설명된 바와 같이 합성될 수 있다.
본 발명의 ASO는 체외에서 합성되고, 생물학적 기원의 안티센스 조성물을 포함하지 않는다. 또한, 본 발명의 ASO는 다른 분자, 분자 구조물 또는 화합물의 혼합물, 예를 들어, 리포좀, 수용체 표적 분자, 경구, 직장, 국소 또는 다른 제제와 혼합, 캡슐화, 컨쥬게이션 또는 그 외 회합되어 활용, 분포 및/또는 흡수를 도울 수 있다.
pre-mRNA 스플라이싱 동안 Exon 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법
ASOs는 돌연변이 (c.919-2A>G) SLC26A4 유전자로부터 전사되는 pre-mRNA의 처리 동안 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 데 사용될 수 있다.
이에 따라, 일 구현예에서, ASOs를 사용하여, 세포 내로 ASO를 도입함으로써 pre-mRNA 스플라이싱 동안 돌연변이 (c.919-2A>G) SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법이 개시되며, ASO는 서열 번호 1의 전부 또는 일부를 포함하고, ASO는 상기 SLC26A4 유전자의 인트론 8 표적 영역에 혼성화하며, ASO는 상기 SLC26A4 유전자의 pre-mRNA 스플라이싱 동안 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, pre-mRNA 스플라이싱 동안 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키기 위해 투여되는 ASO는 서열번호 2-10 중 하나를 포함한다.
일 구현예에서, ASO는 그 자체로, 소위 "네이키드" ASO로서 투여된다. 네이키드 ASO는 체외에서 합성된다. 네이키드 ASOs는 세포 내로 도입되어 SLC26A4 유전자의 인트론 8 표적 영역에 직접 혼성화되어 pre-mRNA 스플라이싱 동안 엑손 8 스키핑을 방지하거나 감소시킬 수 있다.
또 다른 구현예에서, ASO는 발현 벡터의 형태로 투여되며, 발현 벡터는 본 발명에 따른 상기의 ASO의 서열을 포함하는 RNA 전사체를 인코딩한다. 인코딩된 ASO의 발현에 도움이 되는 조건 하에 놓일 때, 발현 벡터는 인코딩된 ASO를 발현할 수 있으며, 이는 SLC26A4 유전자의 인트론 8 표적 영역에 혼성화하여 pre-mRNA 스플라이싱 동안 엑손 8 스키핑을 방지하거나 감소시킬 수 있다. 발현 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 스플라이싱을 재지향시키기 위한 ASO의 발현 또는 전사를 유도하는 발현 카세트 또는 전사 카세트를 포함하는 플라스미드-기반 발현 벡터가 제공된다.
세포에는 사이토로메갈로바이러스-, 아데노바이러스- 또는 아데노-관련 바이러스-기반 벡터에 의해 제공되는 플라스미드-유래 ASO 발현 또는 바이러스 발현에 의해 본 발명에 따른 스플라이싱을 재지향시키기 위한 ASO가 제공될 수 있다. 발현은 RNA 폴리메라아제 II 프로모터 (Pol II), 예컨대, U7 RNA 프로모터 또는 RNA 폴리메라아제 III (Pol III) 프로모터, 예컨대, U6 RNA 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 일 구현예에서, 전달 비히클은 pCI-neo 벡터 등과 같은 벡터이다. 또한, 플라스미드 및 인공 염색체가 표적화된 상동성 재조합에 사용가능하고, 세포의 인간 게놈에서의 통합은 본 발명에 따른 스플라이싱을 재지향시키기 위한 ASO의 전달을 위해 적합하게 적용될 수 있다.
"네이키드" ASOs 또는 ASOs를 코딩하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. ASO 또는 ASO를 코딩하는 발현 벡터는 공지되어 있는 형질주입제를 사용한 형질주입에 의해 도입될 수 있다. 일 구현예에서, 부형제 또는 형질주입제의 사용은 본원에서 정의된 바와 같은 ASO 또는 ASO를 코딩하는 발현 벡터의 세포 및/또는 세포로의 전달을 돕는다. 또 다른 구현예에서, 부형제 또는 형질감염제는 세포막을 통해 소포 또는 리포솜에 복합체화되거나 포획되는 본원에서 정의된 바와 같은 각 ASO 또는 각 ASO를 인코딩하는 발현 벡터를 전달하는 복합체, 나노입자, 미셀, 소포 및/또는 리포솜을 형성할 수 있다. 이들 부형제의 다수는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 부형제 또는 형질주입제는 본원에서 정의된 바와 같은 각 ASO 또는 각 ASO를 인코딩하는 발현 벡터를 세포에 전달할 수 있는 입자로 자가 조립할 수 있는, LipofectAMINE™ 2000 (Invitrogen), 폴리에틸렌이민(PEI; ExGen500 (MBI Fermentas)), 또는 이의 유도체, 또는 폴리프로필렌이민 또는 폴리에틸렌이민 공중합체(PEC) 및 유도체를 포함하는 유사한 양이온성 중합체, 합성 양친매성 물질(SAINT-18), Lipofectin™, DOTAP 및/또는 바이러스 캡시드 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 부형제는 다양한 배양 세포에 ASOs와 같은 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 전달하는 것으로 나타났다. 이들의 높은 형질주입 잠재력은 전체 세포 생존의 관점에서 예외적으로 낮거나 중간 정도의 독성과 조합된다. 구조적 변형의 용이성을 사용하여 추가의 변형 및 이들의 추가의 (체내) 핵산 전달 특성 및 독성의 분석을 가능하게 할 수 있다.
치료 방법
상술된 ASOs는 펜드리드 증후군을 갖는 대상체의 청력 손실을 치료하는 데 사용될 수 있다.
이에 따라, 일 구현예에서, 본 발명은 또한 서열 ID 번호 1의 전부 또는 일부를 포함하는 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, ASO를 사용하여 펜드리드 증후군을 갖는 대상체의 청력 손실을 치료하는 방법을 설명한다.
또 다른 구현예에서, 펜드리드 증후군을 갖는 대상체의 청력 손실을 치료하기 위해 투여되는 ASO는 서열 번호 2-10 중 하나를 포함한다.
약제학적 조성물로 투여되는 ASO의 양은 치료를 받는 대상체, 대상체의 체중, 투여 방식 및 처방 의사의 판단에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 투여 스케줄은 약 1 μg 내지 약 1000 mg의 인지된 투여량으로 약제학적 조성물의 매일 또는 반일 투여를 수반할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물 일회분의 간헐적, 예컨대, 매월 또는 매년 투여가 채용될 수 있다. 표준 투여 요법에 따라, 의사는 최적 투여량을 용이하게 결정할 것이고, 이러한 투여량을 달성하기 위해 투여를 용이하게 변형시킬 수 있다.
본원에서 개시된 화합물 또는 조성물의 치료 유효량은 화합물의 치료 효과에 의해 측정될 수 있다. 그러나, 투여량은 환자의 요건, 치료되는 병태의 중증도, 및 사용되는 화합물에 따라 달라질 수 있다. 일 구현예에서, 개시된 화합물의 치료 유효량은 최대 혈장 농도를 확립하기에 충분하다. 예를 들어, 동물 테스트에 따라 결정된 예비 용량, 및 인간 투여를 위한 용량의 스케일링은 관련 기술분야의 관행에 따라 수행된다.
독성 및 치료 효능은 세포 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료상 유효한 용량)을 결정하기 위해, 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 간의 용량 비는 치료 지수이고, 이는 비 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다.
세포 배양 검정 또는 동물 연구로부터 얻어진 데이터가 인간에게 사용하기 위한 투여량의 범위를 형식화하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 동물 모델에서 달성된 치료 유효 투여량은 당업계에 공지되어 있는 변환 인자를 사용하여, 인간을 포함하여, 또 다른 동물에 사용하기 위해 변환될 수 있다 (예를 들어, Freireich et al., Cancer Chemother. Reports 50(4):219-244 (1966) 참조).
상술된 ASO는 치료 유효량의 ASO를 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 다양한 완충제 함량의 희석제(예를 들어, 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도, 및 첨가제, 예컨대, 세정제 및 가용화제(예를 들어, 트윈 80, 폴리소르베이트 80), 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산, 메타중아황산소륨), 보존제(예를 들어, 티머솔, 벤질 알콜) 및 벌킹 물질 (예를 들어, 락토스, 만니톨)을 포함한다. 이 물질은 폴리유산, 폴리글리콜산 등과 같은 중합성 화합물의 미립자 제제 또는 리포좀에 혼입될 수 있다. 히알루론산이 또한 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 본 발명의 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도, 및 생체내 제거 속도에 영향을 미칠 수 있다. 조성물은 액체 형태로 제조될 수 있거나, 또는 동결건조된 형태와 같은 건조된 분말로 제조될 수 있다.
투여
ASO 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물은 의약품 공업에 주지되어 있는 기술에 따라 투여를 위해 제조될 수 있다. 이러한 기술은 ASO를 담체 및/또는 부형제(들)와 함께 유닛 투여 형태로 조합하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
경구 투여에 적합한 조성물은 개별 유닛, 예컨대, 캡슐, 카세제, 로젠지, 또는 정제로 제공될 수 있으며, 각각은 분말 또는 과립으로서; 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유 또는 유중수 에멀젼으로서 본 개시의 화합물의 소정량을 함유한다. 나타낸 바와 같이, 이러한 제제는 활성 화합물 및 담체 또는 부형제 (하나 이상의 보조 성분을 구성할 수 있음)로서 본 개시의 적어도 하나의 구현예를 회합시키는 단계를 포함하는 임의의 적합한 약제학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 담체는 제제의 다른 성분과 상용성이라는 의미에서 허용가능해야 하고, 수용자에게 해롭지 않아야 한다. 담체는 고체 또는 액체, 또는 둘 다일 수 있고, 약 0.05 중량% 내지 약 95 중량%의 하나 이상의 활성 화합물을 함유할 수 있는 일회 용량 제형, 예를 들어, 정제에서 활성 화합물로서 본원에서 설명된 하나 이상의 화합물과 함께 제형화될 수 있다. 다른 화합물을 포함하는 다른 약제학적 활성 물질이 또한 존재할 수도 있다. 본 개시의 제제는 성분을 혼합하는 것으로 본질적으로 이루어진 임의의 주지된 약제학적 기술에 의해 제조될 수 있다.
고체 조성물의 경우, 통상적인 비독성 고체 담체는 예를 들어, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 스타치, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈크, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 약학적으로 투여가능한 액체 성물은 예를 들어, 본원에서 설명된 바와 같은 본 개시의 적어도 1종의 활성 화합물 및 임의적인 약제학적 보조제를 예를 들어, 물, 염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 부형제에 용해 또는 분산시켜 용액 또는 현탁액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 적합한 제형은 본 개시의 하나 이상의 활성 화합물을 액체 또는 잘게 쪼개진 담체, 또는 양자와 균일하고 친밀하게 혼합하고, 이어서, 필요한 경우, 생성물을 성형함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 정제는 임의적으로 하나 이상의 보조 성분과 조합될 수 있는 본 개시의 적어도 하나의 구현예의 분말 또는 과립을 압축 또는 성형함으로써 제조될 수 있다. 압축 정제는 본 개시의 적어도 하나의 구현예를 적합한 기계에서, 임의적으로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제 및/또는 표면 활성/분산제(들)와 혼합될 수 있는 자유 유동 형태, 예컨대, 분말 또는 과립으로 압축함으로써 제조될 수 있다. 몰딩된 정제는 본 개시의 적어도 일 구현예의 분말 형태가 불활성 액체 희석제로 습윤되는 적합한 기계에서 몰딩에 의해 제조될 수 있다.
구강 점막(설하) 투여에 적합한 제형은 향미 베이스, 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트에 본 개시의 적어도 일 구현예를 포함하는 로젠지, 및 불활성 베이스, 예컨대, 젤라틴 또는 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아에 적어도 하나의 화합물을 포함하는 파스틸을 포함한다.
비경구 투여에 적합한 제형은 의도된 수용자의 혈액과 대략 등장성인, 본 개시의 적어도 일 구현예의 멸균 수성 제제를 포함한다. 이 제제는 정맥내 투여되지만, 투여는 또한 피하, 근육내, 복강내, 뇌실내 또는 피내 주사에 의해 영향을 받을 수 있다. 이 제제는 편리하게는 본원에서 설명된 적어도 일 구현예를 물과 혼합하고 생성된 용액을 멸균시키며 혈액과 등장성이 되게 함으로써 제조될 수 있다. 본 개시에 따른 주사용 조성물은 약 0.1 내지 약 5% w/w의 활성 화합물을 함유할 수 있다.
직장 투여에 적합한 제형은 일회 용량 좌약으로서 제공된다. 이들은 본원에서 설명된 바와 같은 적어도 일 구현예를 하나 이상의 통상적인 고체 담체, 예를 들어, 코코아 버터와 혼합하고, 이어서 생성된 혼합물을 성형함으로써 제조될 수 있다.
피부에 국소 적용하기에 적합한 제형은 연고, 크림, 로션, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸 또는 오일의 형태를 취할 수 있다. 사용될 수 있는 담체 및 부형제는 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 알코올, 및 이들의 둘 이상의 조합을 포함한다. ASO는 일반적으로 조성물의 약 0.1% 내지 약 15% w/w, 예를 들어, 약 0.5 내지 약 2%의 농도로 존재한다.
실시예
이하의 구현예는 본 발명을 보다 충분히 설명하기 위한 것이다. 이는 예시적인 목적을 위한 것이며, 본 발명을 어떠한 방식으로든 제한하려는 것은 아니다.
물질 및 방법
2'-O-메톡시에틸(MOE) 리보스, 포스포로티오에이트(PS) 백본으로 변형되고, 모든 시토신 대신 5-메틸시토신을 함유하는 ASOs를 Biosyntech (Suzhou, China)로부터 구입하고, DEPC 처리된 물에 20 uM의 스톡 용액으로 용해시켰다. 153-nt 엑손 7, 100-nt 인트론 7, 83-nt 엑손 8, 단축된 701-nt 인트론 8(382+6+313), 148-nt 엑손 9, 및 인트론 9의 처음 27-nt 서열로 구성된 인간 SLC26A4 꼬마유전자 c.919-2A>G 돌열변이체(1211 bp)를 두 단계를 통해 pCI-neo 벡터에서 구성하였다. 먼저, 718-nt 게놈 DNA 단편(엑손 7로부터 인트론 8의 처음 382-bp 서열까지)을 제한 부위 Xhol 및 Xbal에서 벡터에서 복제하고, 이어서 488-bp 게놈 DNA 단편(인트론 8의 마지막 313-bp 서열로부터 인트론 9의 처음 27-nt 서열까지)을 제한 부위 Xbal 및 NotI에서 복제하였다.
각 ASO를 LipofectAMINE™ 2000을 사용하여 HEK293 세포 내로 SLC26A4 꼬마유전자 돌연변이체를 일시적으로 공동-형질주입하였다. 형질주입 48시간 후, 세포를 수집하고 전체 RNA를 분리하였다. 전사를 Cy5 컨쥬게이트 프라이머를 사용하여 반-정량적 RT-PCR로 증폭시켰다. Cy5 표지된 PCR 생성물을 6% 천연 폴리아크릴아미드 겔로 분리한 후, G:BOX Chem XL 또는 FluorChem M 시스템으로 영상화하였다. 엑손 8 내포율(% incl)을 Image J 소프트웨어로 계산하였다. % incl = 전체 길이 전사체 / (전체 길이 전사체 + 엑손 51 스킵된 전사체).
결과
2A>G 돌연변이체를 갖는 인간 SLC26A4 엑손 8
엑손 8 (대문자), 플랭킹 인트론 서열(소문자), 및 c.919-2A>G 돌연변이(g)는 다음과 같다:
Figure pct00001
엑손 8의 3' 말단의 81 뉴클레오티드 및 인트론 8의 5' 말단의 74 뉴클레오티드 내의 서열을 표적으로 하는 다수의 ASO를 설계하고, 상기한 꼬마유전자 시스템을 사용하여 스크리닝하였다. 다수의 ASOs는 배양된 세포에서 엑손 8 스플라이싱을 촉진하였다(도 1). ASO 서열 및 스플라이싱 데이터를 표 1-2에 나타낸다. 본 발명자들은 인트로 8 내의 25-nt 구간(위에 밑줄 친)을 이상적인 ASO 표적으로 확인하였다. 서열 (5'-tggtgttcctcttagtactaataca-3' (서열 번호 41))은 인트론 8의 위치 8로부터 시작해서 인트론의 위치 32까지이다.
표 1
Figure pct00002
Figure pct00003
HEK293 세포에 각 ASO(10 nM) 및 SLC26A4 꼬마유전자 돌연변이체를 공동-형질주입하였다. 미처리 세포에서의 Exon 8 내포는 -30%이다. 10 nM 대조군 ASO (5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3' (서열번호 80))로 처리된 세포 내의 엑손 8 내포는 -26%이다. 다수의 ASOs는 엑손 8 내포를 강력하게 촉진시켰다. > 58% 인치 엑손 8 내포는 10 nM ASO의 처리 후 58%를 초과였다.
표 2
Figure pct00004
ASOs가 SLC26A4 c.919-2A>G 돌연변이체의 엑손 8 스플라이싱을 교정하는 능력의 관점에서 가장 강력한 것으로부터 가장 약한 것까지 세 그룹으로 나열하였다.
도 1은 테스트 ASOs의 엑손 8 내포 효율을 나타낸다. 미처리 세포 내의 엑손 8 내포율은 약 30%이다. 음성 대조군-처리된 ASO(Con ASO)에 대한 엑손 8 내포율은 약 26%이다. 테스트 ASOs는 모두 인트론 8 내의 동일한 25-nt 서열에 관한 것이지만, 이들은 다양한 정도의 엑손 8 내포 효과를 갖는다.
예를 들어, HUA0003-1027(서열 번호 2), HUA0003-1029(서열 번호 3), 및 HUA0003-1030(서열번호 4)은 엑손 8 내포율은 거의 90% 내포에 도달하였다. 그러나, HUA0003-1231(서열 번호 39)은 단지 58% 엑손 8 내포에 도달하였다. 이러한 효과의 차이는 HUA0003-1029(서열 3) 및 HUA0003-1231(서열 39) 양자가 20 뉴클레오티드 길이이고, 단지 2 뉴클레오티드만큼 시프트되기 때문에 특히 현저하다.
표 3
Figure pct00005
표 3은 엑손 8 내포를 촉진하는 ASOs를 이의 5'-3' 서열 및 이의 엑손 8 내포율을 포함하여 나타낸다. 표 3은 또한 테스트 ASOs들과 이들이 모두 공유하는 보존 서열 간의 관계를 나타내며, 이는 HUA0003-1027(서열 번호 2)과 동일하다.
도 2는 환자로부터 유래된 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)에서 내인성 SLC26A4 c.919-2A>G의 엑손 8 내포의 촉진을 나타낸다. PBMCs를 밀도 구배 원심분리에 의해 c.919-2A>G 동형접합 환자로부터 분리하고, 이어서 세포를 (Rosewell Park Memorial Instiute (RPMI) 1640 완전 배지 (Invitrogen)에서 배양하였다. (물에 용해시킨) 콜레스테롤 컨쥬게이트 ASO를 저혈청(3% FBS) 완전 배지를 갖는 12-웰 플레이트에서 웰당 106 세포에 첨가하였다. ASO의 최종 농도는 2 pM이었다. 48시간 후, RNA 정제 및 스플라이싱 분석을 위해 세포를 수집하였다.
당업자들은 개시된 발명이 본원에서 구체적으로 설명되지 않은 방식들로 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 개시된 발명은 단지 예시적인 목적을 위한 본원에서 설명된 특정 구현예들에 의해 범위가 제한되지 않는다. 본 발명은 모든 기능적으로 동등한 생성물, 조성물 및 방법을 포함하는 임의의 변형 및 변경을 포함한다.
본원에서 인용된 모든 공보의 전체 개시 내용은 본원에 원용된다. 임의의 이러한 공보가 종래기술을 구성하거나 또는 당업자들의 일반적인 지식의 일부라는 자백은 아니다.
SEQUENCE LISTING <110> ACCUTAR BIOTECHNOLOGY INC. <120> ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES AND THEIR USE FOR TREATING PENDRED SYNDROME <130> 13365.0018-00304 <140> <141> <150> 62/975,337 <151> 2020-02-12 <160> 80 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgtattagta ctaagaggaa cacca 25 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 tagtactaag aggaacac 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 attagtacta agaggaacac 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 4 tattagtact aagaggaaca c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Synthetic oligonucleotide" <400> 80 uucuccgaac gugucacgut t 21

Claims (28)

  1. 서열 ID 번호 1 (5'-tgtattagtactaagaggaacacca-3')의 전부 또는 일부를 포함하는 10-30 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다음인 것인, 안티센스 올리고뉴클레오티드:
    a. HUA0003-1027 (5'-tagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 2);
    b. HUA0003-1029 (5'-attagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 3);
    c. HUA0003-1030 (5'-tattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 4);
    d. HUA0003-1031 (5'-gtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 5);
    e. HUA0003-1032 (5'-tgtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 6);
    f. HUA0003-0930 (5'-tattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 7);
    g. HUA0003-0929 (5'-attagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 8);
    h. HUA0003-0928 (5'-ttagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 9); 또는
    i. HUA0003-0931 (5'-gtattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 10).
  3. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-천연 백본을 포함하는 것인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 비-천연 백본은 변형된 당 모이어티를 포함하는 것인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 변형된 당 모이어티는 2'-O-메톡시에틸 리보스를 포함하는 것인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  6. 제3항에 있어서, 상기 비-천연 백본은 변형된 포스페이트를 포함하는 것인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 변형된 포스페이트는 포스포로티오에이트를 포함하는 것인, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 질소성 염기를 포함하는 것인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 변형된 질소성 염기는 5-메틸시토신 염기를 포함하는 것인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  10. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 더 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  11. 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 pre- mRNA 스플라이싱 동안 SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법으로서, 상기 핵산 분자는 서열 ID 번호 1 (5'-tgtattagtactaagaggaacacca-3')의 전부 또는 일부를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이고, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 SLC26A4 유전자의 인트론 8 표적 영역에 혼성화하며, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 SLC26A4 유전자의 pre-mRNA 스플라이싱 동안 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다음인 것인, 방법:
    a. HUA0003-1027 (5'-tagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 2);
    b. HUA0003-1029 (5'-attagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 3);
    c. HUA0003-1030 (5'-tattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 4);
    d. HUA0003-1031 (5'-gtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 5);
    e. HUA0003-1032 (5'-tgtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 6);
    f. HUA0003-0930 (5'-tattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 7);
    g. HUA0003-0929 (5'-attagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 8);
    h. HUA0003-0928 (5'-ttagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 9); 또는
    i. HUA0003-0931 (5'-gtattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 10).
  13. 제11항에 있어서, 상기 세포는 동물 세포인 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인 것인, 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 핵산 분자는 발현 벡터에 의해 세포 내로 도입되는 것인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 발현 벡터는 pCI-neo 발현 벡터인 것인, 방법.
  17. 펜드리드 증후군을 갖는 대상체의 청력 손실을 치료하는 방법으로서, 제1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다음인 것인, 방법:
    a. HUA0003-1027 (5'-tagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 2);
    b. HUA0003-1029 (5'-attagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 3);
    c. HUA0003-1030 (5'-tattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 4);
    d. HUA0003-1031 (5'-gtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 5);
    e. HUA0003-1032 (5'-tgtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 6);
    f. HUA0003-0930 (5'-tattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 7);
    g. HUA0003-0929 (5'-attagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 8);
    h. HUA0003-0928 (5'-ttagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 9); 또는
    i. HUA0003-0931 (5'-gtattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 10).
  19. 제17항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비경구 투여를 통해 투여되는 것인, 방법.
  20. 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 pre- mRNA 스플라이싱 동안 SLC26A4 유전자에서 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 방법에 사용하기 위한 제1항에 따른 화합물로서, 상기 핵산 분자는 서열 ID 번호 1 (5'-tgtattagtactaagaggaacacca-3')의 전부 또는 일부를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이고, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 SLC26A4 유전자의 인트론 8 표적 영역에 혼성화하며, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 SLC26A4 유전자의 pre-mRNA 스플라이싱 동안 엑손 8 스키핑을 예방하거나 감소시키는 것인, 화합물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다음인 것인, 화합물:
    a. HUA0003-1027 (5'-tagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 2);
    b. HUA0003-1029 (5'-attagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 3);
    c. HUA0003-1030 (5'-tattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 4);
    d. HUA0003-1031 (5'-gtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 5);
    e. HUA0003-1032 (5'-tgtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 6);
    f. HUA0003-0930 (5'-tattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 7);
    g. HUA0003-0929 (5'-attagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 8);
    h. HUA0003-0928 (5'-ttagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 9); 또는
    i. HUA0003-0931 (5'-gtattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 10).
  22. 제20항에 있어서, 상기 세포는 동물 세포인 것인, 화합물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 동물 세포는 인간 세포인 것인, 화합물.
  24. 제20항에 있어서, 상기 핵산 분자는 발현 벡터를 통해 세포 내로 도입되는 것인, 화합물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 발현 벡터는 pCI-neo 발현 벡터인 것인, 화합물.
  26. 펜드리드 증후군을 갖는 대상체의 청력 손실을 치료하는 방법으로서, 제1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 사용하기 위한 제1항에 따른 화합물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다음인 것인, 화합물:
    a. HUA0003-1027 (5'-tagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 2);
    b. HUA0003-1029 (5'-attagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 3);
    c. HUA0003-1030 (5'-tattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 4);
    d. HUA0003-1031 (5'-gtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 5);
    e. HUA0003-1032 (5'-tgtattagtactaagaggaacac-3') (서열 번호 6);
    f. HUA0003-0930 (5'-tattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 7);
    g. HUA0003-0929 (5'-attagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 8);
    h. HUA0003-0928 (5'-ttagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 9); 또는
    i. HUA0003-0931 (5'-gtattagtactaagaggaacacc-3') (서열 번호 10).
  28. 제26항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비경구 투여를 통해 투여되는 것인, 화합물.
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