JP7321614B2 - アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびペンドレッド症候群を処置するためのそれらの使用 - Google Patents

アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびペンドレッド症候群を処置するためのそれらの使用 Download PDF

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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2020年2月12日に出願された米国仮特許出願第62/975,337号の優先権を主張し、その全ての内容が援用により本明細書に取り込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ様式にて電子的に提出された配列表を含み、この配列表の全体が援用により本明細書に組み込まれる。2021年2月10日に作成されたこのＡＳＣＩＩのコピーは、ファイル名が「13365_0018-00304_SL.txt」であり、サイズが16,709バイトである。
技術分野
本発明は、ｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にエクソンスキッピングを防止または低減するための新規なアンチセンスオリゴヌクレオチド（「ＡＳＯ」）、当該ＡＳＯを含有する医薬組成物、およびそれらの使用に関する。
ペンドレッド症候群は、感音性難聴疾患の一種である。これは、症候群性難聴の最も大きな原因の１つであり、全ての遺伝性難聴の約４～１０％を占めている。ペンドレッド症候群を抱える患者は、拡大した前庭水管を含む奇形の内耳を有する。蝸牛と中間中隔の全部または一部が流体で満たされた空洞に置き換わるMandini型蝸牛を引き起こす場合もある。この症候群に起因する難聴は通常、先天性であるが、稀に小児期の後半に発症する場合もある。一部の患者（５０～８３％）はさらに甲状腺腫を併発するが、これは栄養摂取などの他の要因に依存するため、可変である。これについては、Wemeau & Kopp, (2017) Best Prac. & Res. Clin. Endocrinology & Metabolism 31, 213-224に記載されている。
ペンドレッド症候群は、先天性の場合、言語習得やコミュニケーション能力を確保するために、早期治療が重要である。現在、ペンドレッド症候群を処置する場合、軽度の聴覚障害を支援する補聴器などの聴覚支援装置を使用することができる。しかしながら、重度の難聴を抱える患者には、人工内耳の埋め込みが推奨されることがある。Mandini型蝸牛を抱える患者では、埋込みを行う時に脳脊髄液の漏れが生じるおそれがある。これについては、Wemeau & Kopp, (2017) Best Prac. & Res. Clin. Endocrinology & Metabolism 31, 213-224に記載されている。現在、ペンドレッド症候群を処置するための薬剤はなく、ペンドレッド症候群の根本的な遺伝子系病因に対して治療法の選択肢もない。
ペンドレッド症候群は、ペンドリンをコードするＳＬＣ２６Ａ４遺伝子の両アレル変異を特徴とする常染色体劣性障害である。ペンドリンは、内耳と甲状腺に発現する多機能陰イオン交換体タンパク質である。塩化物、ヨウ化物、その他の陰イオンに対する親和性を備えたペンドリンは、内耳での塩化物と重炭酸塩の交換を促進することにより、内リンパの組成と電位を維持する。これについては、Wemeau & Kopp, (2017) Best Prac. & Res. Clin. Endocrinology & Metabolism 31, 213-224に記載されている。ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子の変異（ｃ．９１９－２Ａ＞Ｇ）は、ＳＬＣ２６Ａ４ ｍＲＮＡ前駆体の処理中にエクソン８スキッピングを引き起こす。この変異はＩＶＳ７－２Ａ＞Ｇとしても知られており、難聴を抱える東アジア人において最も一般的な変異の１つである。
コード（エクソン）配列と非コード（イントロン）配列を含む真核生物の遺伝子では、非コードのイントロンはｍＲＮＡ前駆体の転写産物から切除され、コードエクソンは一緒にスプライシングされてｍＲＮＡが形成される。イントロンが最終的なｍＲＮＡ転写産物に残ったり、エクソンが欠落したりすると、ｍＲＮＡの翻訳時にｍＲＮＡリーディングフレームが破壊されるおそれがある。その結果、非機能的なポリペプチド配列や早期停止コドンが生じるおそれがある。スプライシングプロセスは、代替のスプライシングによってさらに複雑になり、同じｍＲＮＡ前駆体配列を異なるエクソンの組み合わせにスプライシングして複数のｍＲＮＡ配列を形成することができる。
ｍＲＮＡ前駆体スプライシングは、スプライソソームと呼ばれる数メガダルトンのリボ核タンパク質複合体を含む複雑なプロセスである。スプライソソームはｍＲＮＡ前駆体の特異的配列を認識し、イントロンを正確に切除し、エクソンを連結する。スプライソソームは、３つの保存されたＲＮＡ配列を用いて、２つのエステル交換反応においてイントロンの切除に触媒作用を及ぼす。これらのＲＮＡ配列は、５’スプライス部位、３’スプライス部位、および分枝部位である。これについては、Will & Luhrmann, (2011) Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003707に記載されている。
スプライシングは、求核攻撃によって５’スプライス部位に結合する分岐部位の２’ＯＨ基で開始し、５’スプライス部位で５’エクソンが切断され、ラリアートが形成される。次に、５’エクソンの３’ＯＨ基が３’スプライス部位で３’エクソンを攻撃し、５’と３’エクソンを連結してイントロンラリアットを切断する。これについては、Will & Luhrmann, (2011) Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003707に記載されている。スプライシングプロセスは、スプライソソーム認識部位、５’スプライス部位、３’スプライス部位、および分岐部位に完全に依存するため、これらの部位のいずれかに変異があると、スプライシングプロセスが中断することになる。
ペンドレッド症候群では、ＳＬＣ２６Ａ４の（ｃ．９１９－２Ａ＞Ｇ）変異がＳＬＣ２６Ａ４ ｍＲＮＡ前駆体スプライシングプロセスに影響を与え、エクソン８スキッピングを引き起こす。最終的なｍＲＮＡ転写産物からのエクソン８の不正確な除去により、翻訳中にリーディングフレームが破壊され、ペンドリンペプチドが切断されて機能不全になる。これについては、Wemeau & Kopp, (2017) Best Prac. & Res. Clin. Endocrinology & Metabolism 31, 213-224に記載されている。
ＡＳＯは、標的ヌクレオチド配列に特異的に結合することにより、転写、スプライシング、安定性および／または翻訳などの遺伝子発現の１つ以上の側面に影響を与えるように設計されたポリヌクレオチドである。ＡＳＯは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかに向けられてもよい。ＲＮＡに向けられるＡＳＯは、標的ｍＲＮＡ配列に結合し、ｍＲＮＡの安定性またはリボソームでの翻訳に影響し得る。
ｍＲＮＡ前駆体の転写産物中の標的配列に結合するＡＳＯは、スプライシングプロセスに影響し得る。場合によっては、ＡＳＯを使用してｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にエクソンスキッピングを誘発し得る。例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、翻訳中にジストロフィンｍＲＮＡのリーディングフレームを変化させる変異によって引き起こされ、その結果、早期停止コドンと切断されたジストロフィンタンパク質が生じる。ＡＳＯを使用して、スプライシング中にエクソンスキッピングを誘発することによってリーディングフレームを修正することができる。正しい数の塩基数のエクソンを除去することにより、ｍＲＮＡの転写産物は短くなるが、リーディングフレームは修正され得る。ジストロフィンＲＮＡは７９個のエクソンで構成されているため、スプライシング中に１つまたは複数のエクソンをスキップしても、部分的に機能するタンパク質が得られる。これについては、Shimo et al., (2015) Duchenne Muscular Dystrophy 143-155に記載されている。ＦＤＡは、２０１６年にＤＭＤを処置するためのExondys 51（エテプリルセン）と呼ばれるエクソンスキッピング薬を承認した。これについては、Dowling, (2016) Nature Review Neurology 12, 675-676に記載されている。
他の場合では、ＡＳＯを使用して、ｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にエクソンスキッピングを防止または低減することができる。例えば、ＡＳＯ薬剤ヌシネルセン（スピンラザ（登録商標））は、ＳＭＮ２遺伝子のスプライシング中のエクソン７スキッピングを低減し、脊髄性筋萎縮症を処置する。これについては、Son & Yokota, (2018) Exon Skipping & Inclusion Therapies, 57-68に記載されている。しかしながら、ＳＬＣ２６Ａ４のｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にエクソン８スキッピングを良好に防止または低減するＡＳＯおよびペンドレッド症候群などの関連疾患を処置するためのそれらの使用が求められている。
本発明は、ＡＳＯ、このようなＡＳＯを使用してｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にエクソンスキッピングを防止または低減する方法、このようなＡＳＯを含む医薬組成物、およびこのような組成物を使用してペンドレッド症候群の聴覚障害を処置する方法に関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号：１の全部または一部を含む、１０～３０ヌクレオチドの長さを有するＡＳＯを提供する。
一実施形態では、本発明は、ＡＳＯを提供し、当該ＡＳＯは、
ａ．ＨＵＡ０００３－１０２７（５’－ｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：２）、
ｂ．ＨＵＡ０００３－１０２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：３）、
ｃ．ＨＵＡ０００３－１０３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：４）、
ｄ．ＨＵＡ０００３－１０３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：５）、
ｅ．ＨＵＡ０００３－１０３２（５’－ｔｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：６）、
ｆ．ＨＵＡ０００３－０９３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：７）、
ｇ．ＨＵＡ０００３－０９２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：８）、
ｈ．ＨＵＡ０００３－０９２８（５’－ｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：９）、または
ｉ．ＨＵＡ０００３－０９３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：１０）である。
一実施形態では、本発明は、非天然骨格を含む上記のＡＳＯを提供する。
一実施形態では、本発明は、修飾糖部位を含む上記のＡＳＯを提供する。
一実施形態では、本発明は、2’-O-メトキシエチルリボース部分を含む上記のＡＳＯを提供する。
一実施形態では、本発明は、修飾リン酸塩を含む上記のＡＳＯを提供する。
一実施形態では、本発明は、ホスホロチオエートを含む上記のＡＳＯを提供する。
一実施形態では、本発明は、修飾窒素塩基を含む上記のＡＳＯを提供する。
一実施形態では、本発明は、5-メチルシトシン塩基を含む上記のＡＳＯを提供する。
一実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む上記のＡＳＯを提供する。
一実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法を提供し、当該方法、核酸分子を細胞に導入することを含み、前記核酸分子は、配列番号：１の全部または一部を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドは、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子のイントロン８標的領域にハイブリダイズし、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子のｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にエクソン８スキッピングを防止または低減する。
一実施形態では、本発明は、上記のｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法を提供し、前記ＡＳＯは、
ａ．ＨＵＡ０００３－１０２７（５’－ｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：２）、
ｂ．ＨＵＡ０００３－１０２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：３）、
ｃ．ＨＵＡ０００３－１０３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：４）、
ｄ．ＨＵＡ０００３－１０３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：５）、
ｅ．ＨＵＡ０００３－１０３２（５’－ｔｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：６）、
ｆ．ＨＵＡ０００３－０９３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：７）、
ｇ．ＨＵＡ０００３－０９２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：８）、
ｈ．ＨＵＡ０００３－０９２８（５’－ｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：９）、または
ｉ．ＨＵＡ０００３－０９３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：１０）である。
一実施形態では、本発明は、上記のｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法を提供し、前記細胞は動物細胞である。
一実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法を提供し、前記細胞はヒト細胞である。
一実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法を提供し、前記核酸分子は、発現ベクターによって細胞内に導入される。
一実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法を提供し、前記発現ベクターはｐＣＩ－ｎｅｏ発現ベクターである。
一実施形態では、本発明は、配列番号：１の全部または一部を含む治療上有効量のＡＳＯを投与することを含む、ペンドレッド症候群を有する対象における難聴を処置する方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、上記のペンドレッド症候群を有する対象における難聴を処置する方法を提供し、投与されるＡＳＯは、
ａ．ＨＵＡ０００３－１０２７（５’－ｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：２）、
ｂ．ＨＵＡ０００３－１０２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：３）、
ｃ．ＨＵＡ０００３－１０３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：４）、
ｄ．ＨＵＡ０００３－１０３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：５）、
ｅ．ＨＵＡ０００３－１０３２（５’－ｔｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：６）、
ｆ．ＨＵＡ０００３－０９３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：７）、
ｇ．ＨＵＡ０００３－０９２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：８）、
ｈ．ＨＵＡ０００３－０９２８（５’－ｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：９）、または
ｉ．ＨＵＡ０００３－０９３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：１０）である。
一実施形態では、本発明は、上記のペンドレッド症候群を有する対象における難聴を処置する方法を提供し、ＡＳＯは、非経口投与により投与される。
一実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法に用いる化合物を提供し、当該方法は、核酸分子を細胞に導入することを含み、前記核酸分子は配列番号：１の全部または一部を含むＡＳＯである。
一実施形態では、本発明は、上記のｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法に用いる化合物を提供し、前記ＡＳＯは、
ａ．ＨＵＡ０００３－１０２７（５’－ｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：２）、
ｂ．ＨＵＡ０００３－１０２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：３）、
ｃ．ＨＵＡ０００３－１０３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：４）、
ｄ．ＨＵＡ０００３－１０３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：５）、
ｅ．ＨＵＡ０００３－１０３２（５’－ｔｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：６）、
ｆ．ＨＵＡ０００３－０９３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：７）、
ｇ．ＨＵＡ０００３－０９２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：８）、
ｈ．ＨＵＡ０００３－０９２８（５’－ｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：９）、または
ｉ．ＨＵＡ０００３－０９３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：１０）である。
一実施形態では、本発明は、上記のｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法に用いる化合物を提供し、前記細胞は動物細胞である。
一実施形態では、本発明は、上記のｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法に用いる化合物を提供し、前記細胞はヒト細胞である。
一実施形態では、本発明は、上記のｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法に用いる化合物を提供し、前記核酸分子は、発現ベクターを介して細胞内に導入される。
一実施形態では、本発明は、上記のｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法に用いる化合物を提供し、前記発現ベクターは、ｐＣＩ－ｎｅｏ発現ベクターである。
一実施形態では、本発明は、ペンドレッド症候群を有する対象における難聴を処置する方法に用いる化合物を提供し、当該方法は、配列番号：１の全部または一部を含む、治療上有効量のＡＳＯを投与することを含む。
一実施形態では、本発明は、上記のペンドレッド症候群を有する対象における難聴を処置する方法に用いる化合物を提供し、前記ＡＳＯは、
ａ．ＨＵＡ０００３－１０２７（５’－ｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：２）、
ｂ．ＨＵＡ０００３－１０２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：３）、
ｃ．ＨＵＡ０００３－１０３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：４）、
ｄ．ＨＵＡ０００３－１０３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：５）、
ｅ．ＨＵＡ０００３－１０３２（５’－ｔｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：６）、
ｆ．ＨＵＡ０００３－０９３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：７）、
ｇ．ＨＵＡ０００３－０９２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：８）、
ｈ．ＨＵＡ０００３－０９２８（５’－ｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：９）、または
ｉ．ＨＵＡ０００３－０９３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：１０）である。
一実施形態では、本発明は、上記のペンドレッド症候群を有する対象における難聴を処置する方法に用いる化合物を提供し、前記ＡＳＯは非経口投与により投与される。
図１は、ＳＬＣ２６Ａ４ミニ遺伝子ｃ．９１９－２Ａ＞Ｇ変異体のエクソン８の包含を促すＡＳＯの同定を示す。未処理細胞（ブランク）におけるエクソン８の包含率は－３０％である。１０ｎＭのコントロールＡＳＯ（Ｃｏｎ ＡＳＯ）で処理された細胞での包含率は約２６％である。ＦＬ：全長転写産物、＊：イントロン７－保持転写産物、Ａ８：エクソン８がスキップされた転写産物。 図２は、ＡＳＯ（配列番号：３）を使用した患者由来のＰＢＭＣにおける内因性ＳＬＣ２６Ａ４ｃ．９１９－２Ａ＞Ｇ変異体のエクソン８の包含を示す。ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞、ＦＬ：全長転写産物、Ａ８：エクソン８がスキップされた転写産物。 図３は、ｍＲＮＡ前駆体スプライシングにおける２つのエステル交換反応を示す。分岐部位の２’ＯＨ基は求核攻撃によって５’スプライス部位に結合することにより、５’エクソンが切断され、５’スプライス部位と分岐部位の間にラリアットが形成される。その後、５’エクソンの３’ＯＨ基は３’スプライス部位で３’エクソンに結合し、イントロンラリアットを切断し、エクソンを連結してｍＲＮＡを形成する。５’ＳＳ：５’スプライス部位、３’ＳＳ：３’スプライス部位、ＢＳ：分岐部位。
定義
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１０個のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を指す。
本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（「ＡＳＯ」と略記）は、標的ヌクレオチド配列を有する安定な二本鎖ハイブリッドを形成するために、標的ヌクレオチド配列に十分に相補的であるアンチセンス配列を含むヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、ＲＮＡヌクレオチド配列である。
本明細書で使用される用語「ヌクレオ塩基」は、ヌクレオシドの成分である窒素塩基を指す。例示的な核酸塩基は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、およびウラシルを含むが、それらに限定されない。
本明細書で使用される用語「ヌクレオシド」は、糖に共有結合したヌクレオ塩基を指す。天然に存在するヌクレオシドおよび非天然のヌクレオシドの例は、以下に記載される。
本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」は、リン酸基に共有結合したヌクレオシドを指す。天然に存在するヌクレオチドおよび非天然のヌクレオチドの例は、以下に記載される。
本明細書で使用される用語「非天然」は、（ｉ）修飾ヌクレオチド間連結、例えば、天然に存在するオリゴヌクレオチド内に見出される、標準的なホスホジエステル連結以外のヌクレオチド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、例えば、天然に存在するオリゴヌクレオチド内に見出される、リボース部分もしくはデオキシリボース部分以外の部分、および（ｉｉｉ）修飾窒素塩基、例えば、天然に存在するオリゴヌクレオチド内に見出される塩基以外の塩基、または（ｉｖ）上記の組合せから選択される、少なくとも１つの修飾を有する、１つまたは複数のヌクレオチドサブユニットを指す。
本明細書で使用される用語「モルホリノ」は、リボースの代わりにモルホリニル環を含む核酸塩基を指す。
本明細書で使用される用語「相補的」は、少なくとも２つのヌクレオチド配列の対応する位置が、互いに水素結合できるヌクレオチドによって占有される場合を記述するために使用される。
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズ」は、１つの二本鎖分子を形成する、２つの相補的なヌクレオチド配列の結合を記述するために使用される。２つの配列中の十分な数の対応するヌクレオチドが順に互いに水素結合できる場合、すなわち、それらが十分に相補的である場合、安定なハイブリッドを形成し得る。ＡＳＯが標的配列にハイブリダイズするためには、１００％の相補性が必要ではないことは、当技術分野において理解される。
本明細書で使用される用語「十分な相補性」は、ＡＳＯがその標的配列に特異的に結合して安定したハイブリッドを形成するのに十分な相補性のレベルを示す。一実施形態では、ＡＳＯと標的配列の相補性は、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、または７０％である。
本明細書で互換的に使用される用語「標的領域」および「標的配列」は、ＡＳＯが生理学的条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を指定するために用いられる。ＡＳＯが標的配列にハイブリダイズし、安定したハイブリッドを形成するのに十分な相補性がある限り、ＡＳＯと標的領域が１００％相補的である必要はない。ＡＳＯは標的配列の全部または一部にハイブリダイズし得る。
本明細書で使用される用語「治療する」、「治療すること」または「治療」は、疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患またはその臨床症状若しくは病理学的特徴の少なくとも１つの発症を遅らせるかまたは阻止するかまたは低減すること）を指す。別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」または「治療」は、例えば、対象により識別可能でない可能性のあるものを含む少なくとも１つの身体的パラメーターまたは疾患の病理学的特徴を軽減または改善することを指す。さらに別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」または「治療」は、物理的手段（例えば、少なくとも１つの識別可能なまたは識別可能ではない症状の安定化）、生理学的手段（例えば、身体的パラメーターの安定化）のいずれか、または両方で疾患または障害を調節することを指す。さらに別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」または「治療」は、疾患若しくは障害の発症または発達または進行を予防するかまたは遅らせることを指す。
本明細書で使用される用語「治療上有効量」は、障害や疾患を予防または治療するのに有効な治療剤または組成物の量を指す。一実施形態では、「治療上有効量」は、ペンドレッド症候群を予防または治療するのに有効な治療剤または組成物の量を含む。
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される」は、薬学的に有用であり、生物学的にもそれ以外にも望ましくないものではない分子実体または組成物を指す。
本明細書で使用される用語「担体」は、化合物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。
本明細書で使用される用語「賦形剤」は、活性成分以外の医薬組成物中の任意の成分を指す。
特に定義しない限り、他のすべての科学技術用語は、当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。このような科学技術用語は、例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Martin, 1990, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co; Glover, 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, MRL Press, Ltd.；及びAusubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., 2002, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates/Wiley Intersciences等の文献で記述されている。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
一実施形態では、本明細書は、ＳＬＣ２６Ａ４ｍＲＮＡ前駆体中の標的配列に向けられるＡＳＯを開示する。いくつかの実施形態は、ＳＬＣ２６Ａ４ｍＲＮＡ前駆体中のイントロン８の２５ヌクレオチド標的配列（表１、「対象２５－Ｎｔ配列」）の全部または一部に向けられるＡＳＯに関する。この標的配列は、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子中のイントロン８の８位から３２位までの配列である。このイントロン８標的配列は、変異体（ｃ．９１９－２Ａ＞Ｇ）ＳＬＣ２６Ａ４で発生するエクソン８スキッピングに含まれることで、変異体を含むｍＲＮＡ前駆体が不正確にスプライシングされ、最終転写産物からエクソン８が除去される。
別の実施形態では、２５－ｎｔ標的配列に向けられるＡＳＯは、安定したハイブリッドを形成するために標的配列と十分に相補的であり、長さが１０～３０ヌクレオチドである。これらのＡＳＯは、２５－ｎｔ標的配列の全部または一部に十分に相補的である。
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、表３に示す特異的配列を有する。これらの特異的ＡＳＯは実施例においても例示される。しかしながら、これらの特異的ＡＳＯは、例示のみを目的として開示されており、決して本発明の範囲を限定するものではない。
いくつかの実施形態では、ＡＳＯの少なくともいくつかの核酸塩基は、チミンをウラシルに、またはウラシルをチミンに置き換える。いくつかの実施形態では、ＡＳＯの少なくともいくつかのヌクレオシドは、デオキシリボースをリボースに、またはリボースをデオキシリボースに置き換える。
ヌクレオチド修飾
別の実施形態では、開示されるＡＳＯは、当業者に知られている１つまたは複数の方法で化学的に修飾された１つまたは複数のヌクレオチドを含む。ヌクレオチド修飾は、例えば、修飾窒素塩基、糖部分、およびリン酸塩を含む。このような修飾は、少なくともヌクレアーゼ分解に耐性がある点において好ましい。
本発明において有用な化学的に修飾されたＡＳＯの具体例には、修飾リン酸塩骨格または非天然サブユニット間連結を含有するＡＳＯを含む。修飾された骨格を有するＡＳＯは、骨格においてリン原子を保持するもの、および骨格においてリン原子を有さないものを含む。
他の実施形態では、ＡＳＯにおけるヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間連結の両方、すなわち、骨格は、新規な基で置き換えられている。塩基単位は、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。例えば、ＡＳＯはペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよい。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられている。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合している。
修飾されたＡＳＯは１つ以上の置換糖部分、例えば、－ＯＨ；－Ｆ；１つ以上のヘテロ原子の割り込みがあってもよい置換または非置換、直鎖または分岐の低級（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アリル、またはアラルキル；O-、S-、またはN-アルキル；O-、S-、またはN-アルケニル；O-、S-またはN-アルキニル；O-、S-、またはN-アリル；O-アルキル-O-アルキル、メトキシ、アミノプロポキシ；メトキシエトキシ；ジメチルアミノオキシエトキシ；およびジメチルアミノエトキシエトキシにより２’、３’および／または５’位において一置換または二置換された１つ以上の糖部分を含む。糖部分は、ピラノースもしくはその誘導体、またはデオキシピラノースもしくはその誘導体、またはリボースもしくはその誘導体、またはデオキシリボースもしくはその誘導体であり得る。一実施形態では、置換された糖部分は、2’-O-メトキシエチル部分である。
修飾されたＡＳＯは、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、ならびにN-2、N-6およびO-6置換プリン（2-アミノプロピルアデニンを含めた）、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンなどの核酸塩基（当技術分野で単純に「塩基」と称されることが多い）の修飾または置換を含み得る。特定の核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を向上させるのに特に有用である。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃だけ増大させることが示されている。
本発明のＡＳＯの他の修飾は、ＡＳＯの活性、細胞分布または細胞への取り込みを増強させる１つまたは複数の部分または結合体のＡＳＯへの化学的連結を含む。このような部分は、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分を含むが、これらに限定されない。
ＡＳＯの別の改変には、モルホリノベースのＡＳＯが含まれる。モルホリノベースのオリゴマーとは、ヌクレオ塩基を支持するモルホリノサブユニットを含むオリゴマーを指し、リボースの代わりに、モルホリン環を含有する。例示的なヌクレオシド間連結は、例えば、１つのモルホリノサブユニットのモルホリン環窒素を、隣接するモルホリノサブユニットの４’環外炭素に接合する、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結またはホスホロジアミデートヌクレオシド間連結を含む。各モルホリノサブユニットは、塩基特異的水素結合により、オリゴヌクレオチド内の塩基に結合するのに有効な、プリンまたはピリミジンのヌクレオ塩基を含む。
モルホリノベースのＡＳＯ（修飾されたＡＳＯを含む）については、米国特許第5,698,685号、第5,217,866号、第5,142,047号、第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,521,063号、第5,506,337号に詳述されており、それらの全ては援用により本明細書に組み込まれる。
ＡＳＯ構造において、リン酸基は一般に、ＡＳＯの「ヌクレオシド間連結」を形成する基として言及される。ＲＮＡおよびＤＮＡの天然に存在するヌクレオシド間連結は、３’－５’ホスホジエステル連結である。「ホスホルアミデート」基が、３つの接合酸素原子と、１つの接合窒素原子とを有するリンを含むのに対し、「ホスホロジアミデート」基は、２つの接合酸素原子と、２つの接合窒素原子とを有するリンを含む。「ホスホロトリアミデート」基（またはリン酸トリアミド基）は、１つの接合酸素原子と３つの接合窒素原子を有するリンを含む。本明細書で記載されるモルホリノベースのＡＳＯの非荷電サブユニット間連結またはカチオン性サブユニット間連結では、１つの窒素は常に、結合鎖に対してペンダントであるものである。ホスホロジアミデート連結における第２の窒素は、典型的には、モルホリン環構造内の環窒素である。
所与のＡＳＯにおけるすべての位置が一様に修飾される必要はなく、実際には、ＡＳＯ内の単一のヌクレオシドに前述の修飾のうちの１つ以上が組み込まれていてもよい。これらのＡＳＯは典型的には、ＡＳＯがヌクレアーゼ分解への耐性の増大、細胞取込みの増大を付与するように修飾されている少なくとも１つの領域および／または標的核酸に対する結合親和性の増大のためのさらなる領域を含有する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造
本発明に従って使用されるアンチセンス分子は、固相合成の周知の技術によって作製され得る。このような合成のための設備は、例えば、Applied Biosystems（Foster City, Calif.）を含めたいくつかの供給業者によって販売されている。修飾された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するための１つの方法は、米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。
当技術分野において公知のこのような合成のための任意の他の手段を、追加的にまたは代わりに用い得る。オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートおよびアルキル化された誘導体を調製するのに同様の技術を使用することは周知である。１つのこのような自動化された実施形態では、ジエチル－ホスホラミダイトは出発材料として使用され、Beaucage, et al., (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1862によって記載されているように合成され得る。
本発明のＡＳＯはインビトロで合成され、生物由来のアンチセンス組成物を含まない。本発明のＡＳＯはまた、取込み、分布および／または吸収を助けるために、例えば、リポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所または他の製剤として、他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合され、カプセル化され、結合体化され、または他の方法で会合され得る。
ｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にエクソン８スキッピングを防止または低減する方法
上述したＡＳＯは、変異体（ｃ．９１９－２Ａ＞Ｇ）ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の処理中にエクソン８スキッピングを防止または低減するために使用可能である。
したがって、一実施形態では、ＡＳＯを細胞内に導入することによって、ｍＲＮＡ前駆体スプライシング中に変異体（ｃ．９１９－２Ａ＞Ｇ）ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法を開示し、前記ＡＳＯは、配列番号：１の全部または一部を含み、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子のイントロン８標的領域にハイブリダイズし、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子のスプライシング中にエクソン８スキッピングを防止または低減する。別の実施形態では、ｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にエクソン８スキッピングを防止または低減するために投与されるＡＳＯは、配列番号：２～１０のうちの１つを含む。
一実施形態では、ＡＳＯは、いわゆる「裸の」ＡＳＯとして、それ自体で投与される。裸のＡＳＯは、in vitroで合成される。裸のＡＳＯを細胞に導入してＳＬＣ２６Ａ４遺伝子のイントロン８標的領域に直接ハイブリダイズすることにより、ｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にエクソン８スキッピングを防止または低減することができる。
別の実施形態では、ＡＳＯは発現ベクターとして投与され、発現ベクターは、本発明のＡＳＯの配列を含むＲＮＡ転写産物をコードする。コードされたＡＳＯの発現を促す条件下に置かれた場合、発現ベクターは、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子のイントロン８標的領域にハイブリダイズしてｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にエクソン８スキッピングを防止または低減できる、コードされたＡＳＯを発現し得る。発現ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。一実施形態では、本発明によるスプライシングをリダイレクトするためのＡＳＯの発現または転写を駆動する発現カセットまたは転写カセットを含む、プラスミドベースの発現ベクターが提供される。
細胞は、サイトロメガロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベースのベクターによって提供されるプラスミド由来のＡＳＯ発現またはウイルス発現によって、スプライシングをリダイレクトするためのＡＳＯを備えることができる。発現は、Ｕ７ ＲＮＡプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（Ｐｏｌ ＩＩ）、またはＵ６ ＲＮＡプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターによって駆動され得る。一実施形態では、送達ビヒクルは、ｐＣＩ－ｎｅｏベクター等のベクターである。また、プラスミドや人工染色体は、標的相同組換えに使用可能であり、細胞のヒトゲノムへの組み込みは、スプライシングをリダイレクトするためのＡＳＯの送達に好適に適用することができる。
「裸の」ＡＳＯまたはＡＳＯをコードする発現ベクターを細胞に導入する方法は、当技術分野で周知である。ＡＳＯまたはＡＳＯをコードする発現ベクターは、公知のトランスフェクション剤を用いたトランスフェクションにより導入することができる。一実施形態では、賦形剤またはトランスフェクション剤の使用は、細胞および／または細胞内への本明細書に定義されるＡＳＯまたはＡＳＯをコードする発現ベクターの送達に役立つ。別の実施形態では、賦形剤またはトランスフェクション剤は、本明細書において定義されるＡＳＯまたはＡＳＯをコードする発現ベクター、またはベシクルもしくはリポソームに閉じ込められた各成分を細胞膜を通して送達する複合体、ナノ粒子、ミセル、小胞および／またはリポソームを形成することができる。こうした賦形剤の多くは、当該技術分野において知られている。適切な賦形剤またはトランスフェクション試薬は、本明細書において定義されるＡＳＯを細胞、好ましくは、網膜細胞に送達することができる粒子に自己集合することができるLipofectAMINE（登録商標）2000（Invitrogen）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ExGen500（MBI Fermentas））もしくはその誘導体、またはポリプロピレンイミンもしくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）および誘導体を含む類似のカチオン性ポリマー、合成の両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ－１８）、lipofectin(登録商標）、ＤＯＴＡＰおよび／またはウイルスカプシドタンパク質を含む。そのような賦形剤は、多種多様の培養細胞にＡＳＯなどのオリゴヌクレオチドを効率的に送達することが示された。それらの高いトランスフェクション潜在性は、全細胞生存に関して除外された低から中程度の毒性と組み合わされる。構造変更の容易さが、さらなる変更ならびにそれらのさらなる（in vivo）核酸運搬特性および毒性の分析を可能にするために使用され得る。
治療方法
上述したＡＳＯは、ペンドレッド症候群を有する対象における難聴を処置するために使用可能である。
したがって、一実施形態では、本発明は、治療上有効量の配列番号：１の全部または一部を投与することを含む、ＡＳＯを使用してペンドレッド症候群を有する対象における難聴を処置する方法についても記載する。
別の実施形態では、ペンドレッド症候群を有する対象における難聴を処置するために投与されるＡＳＯは、配列番号：２～１０のうちの１つを含む。
医薬組成物中に投与されるＡＳＯの量は、治療される対象、対象の体重、投与の方法および処方医師の判断に依存し得る。例えば、投薬計画には、約１μｇ～約１０００ｍｇの把握される投与量にて医薬組成物の毎日または１日２回の投与が関与し得る。別の実施形態では、例えば、医薬組成物の用量の毎月、または毎年を基準にしたような間欠的な投与が採用され得る。標準の投薬計画によれば、医師は最適な投与量を直ちに決定し、そのような投与量を達成するために投与を直ちに変更することができるであろう。
本明細書で開示される化合物または組成物の治療上有効量は、化合物の治療上の有効性によって測定することができる。しかしながら、投与量は、患者の要望、治療される病状の重症度、および使用される化合物に応じて変化し得る。一実施形態では、開示される化合物の治療上有効量は最大の血漿濃度を得るのに十分である。例えば、動物試験、およびヒトへの投与のための用量の上昇にしたがって決定される予備投与は、当技術分野で認められる方法によって実行される。
毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％まで致死の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％にて治療上有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準の薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比は治療指標であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指標を示す組成物が好ましい。
細胞培養アッセイまたは動物試験から得られるデータは、ヒトにおいて使用される投与量の範囲を定式化するのに使用することができる。ある動物モデルにおいて得られた治療上有効量は、ヒトなどの他の動物において用いるために、当技術分野において既知の変換係数（例えば、Freireich et al., Cancer Chemother. Reports 50(4):219 244 (1966)）を用いて変換され得る。
上記ＡＳＯは、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体とともに治療上有効量のＡＳＯを含有する医薬組成物で投与され得る。そのような組成物は、様々な緩衝剤含量、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩等）；界面活性剤および可溶化剤（例えば、ツイーン（登録商標）８０、ポリソルベー（登録商標）ト８０など）、抗酸化剤（例えば、アルコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）および充填物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加物；ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のような高分子化合物の微粒子製剤またはリポソームへの物質の組み込みを含む。ヒアルロン酸も使用できる。そのような組成物は、本発明のタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度およびインビボでのクリアランス速度に影響しうる。該組成物は、液体形態で製造されるか、または凍結乾燥形態のような乾燥粉末でありうる。
投与
ＡＳＯと薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物は、製薬業界でよく知られている技術によって投与のために調製することができる。このような技術は、ＡＳＯを担体および／または賦形剤と組み合わせて単位投与形態で会合させることを含むが、これに限定されない。
経口投与に好適な組成物は、各々が粉末もしくは顆粒として、水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または、水中油エマルションもしくは油中水エマルションとしての所定の量の本開示の化合物を含有するカプセル、カシェ剤、ロゼンジ、または錠剤等の別個の単位で提示されてもよい。示されるように、そのような製剤は、活性化合物としての本開示の少なくとも１つの実施形態と、担体または賦形剤（１つまたは複数の付属成分を構成してもよい）とを会合させるステップを含む、任意の適切な薬学的方法によって調製され得る。担体は、製剤の他の成分と適合するという意味で許容可能でなければならず、受取人にとって劇薬であってはならない。担体は、固体または液体、あるいはその両方であってもよく、単位用量製剤、例えば錠剤において活性化合物として本明細書に記載される少なくとも１つの化合物と共に製剤化されてもよく、この錠剤は少なくとも１つの活性化合物を約０．０５重量％～約９５重量％含有することができる。他の薬理学的活性物質も、他の化合物を含めて存在してもよい。本開示の製剤は、本質的に成分を混和することを含む薬学のよく知られた技術のいずれかによって調製することができる。
固体組成物については、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む。液体の薬理学的に投与可能な組成物は、例えば、本明細書に記載するような活性化合物、および賦形剤中のオプションの補助薬、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどを溶解、分散させるなどすることで、溶液または懸濁液を形成することによって、調製され得る。一般に、適切な製剤は、本開示の少なくとも１つの活性化合物を、液体もしくは微粉化した固体の担体、またはその両方と均一かつ密に混ぜて、その後、必要であれば、生成物を成形することにより、調製され得る。例えば、錠剤は、本開示の少なくとも１つの実施形態の粉末または顆粒を、オプションとして１つまたは複数の補足成分と共に、圧縮または成型することにより、調製され得る。圧縮錠剤は、自由流動形態の化合物、例えば、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤および／もしくは表面活性／分散物質とオプションとして混合された粉末または顆粒を、適切な機械において圧縮することで調製され得る。成型された錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた本開示の少なくとも１つの実施形態の粉末化合物を、適切な機械において成型することにより、製造され得る。
口腔（舌下）投与に好適な製剤には、香味づけされた基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に本開示の少なくとも１つの実施形態を含むロゼンジと、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア等の不活性基剤中に少なくとも１つの化合物を含むトローチと、が含まれる。
非経口投与に好適な製剤は、対象受容者の血液とほぼ等張である、本開示の少なくとも１つの実施形態の無菌水性製剤を含む。これらの製剤は、静脈内投与されるが、投与は、皮下、筋肉内、脳室内、または皮内注射により、実施され得る。このような製剤は、都合のよいことには、本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態を水と混和し、得られた溶液を無菌にし、かつ血液と等張にすることによって、調製され得る。本発明による注射可能な組成物は、約０．１重量％～約５重量％の活性化合物を含有し得る。
直腸投与に好適な製剤は、単位用量座剤（unit-dose suppositories）として呈示される。これらは、１つまたは複数の従来の固体担体、例えばココアバターと、本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態とを混合し、その後、得られた混合物を成形することによって、調製され得る。
皮膚への局所塗布に好適な製剤は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアゾール、またはオイルの形態をとることができる。使用され得る担体および賦形剤は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびこれらのうち２つまたは３つ以上の組み合わせを含む。ＡＳＯは、一般に、組成物の約０．１重量％～約１５重量％、例えば約０．５％～約２％の濃度で存在する。
以下の実施例により、本発明をより完全に説明するが、これは単なる例示であり、本発明をいかなる形でも限定するものではない。
材料および方法
2’-O-メトキシエチル（ＭＯＥ）リボース、ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格で修飾され、すべてのシトシンの代わりに5-メチルシトシンを含むＡＳＯを、Biosyntech（Suzhou, China）から購入して、２０ｕＭのストック溶液でＤＥＰＣ処理水に溶解した。１５３－ｎｔエクソン７、１００－ｎｔイントロン７、８３－ｎｔエクソン８、短縮７０１－ｎｔイントロン８（３８２＋６＋３１３）、１４８－ｎｔエクソン９、およびイントロン９の最初の２７－ｎｔ配列を含むヒトＳＬＣ２６Ａ４ミニ遺伝子ｃ．９１９－２Ａ＞Ｇ変異体（１２１１ｂｐ）を２段階のプロセスを経てｐＣＩ－ｎｅｏベクターで構築した。まず、７１８－ｎｔのゲノムＤＮＡ断片（エクソン７からイントロン８の最初の３８２－ｂｐ配列まで）をベクター内の制限部位ＸｈｏｌとＸｂａｌでクローニングし、次に４８８－ｂｐのゲノムＤＮＡ断片（イントロン８の最後の３１３－ｂｐ配列からイントロン９の最初の２７－ｎｔ配列まで）を制限部位ＸｂａｌとＮｏｔＩでクローニングした。
LipofectAMINE（登録商標）2000を用いて、各ＡＳＯをＳＬＣ２６Ａ４ミニ遺伝子変異体と一過性にＨＥＫ２９３細胞に共導入した。４８時間の遺伝子導入後、細胞を回収し、全ＲＮＡを単離した。Ｃｙ５結合プライマーを用いて、半定量的ＲＴ－ＰＣＲにより転写産物を増幅した。Ｃｙ５標識ＰＣＲ産物を６％ネイティブポリアクリルアミドゲルで分離した後、G:BOX Chem XLまたはFluorChem Mシステムでイメージングした。Image Jソフトウェアを用いてエクソン８の包含率（％ incl）を算出した。％ incl＝完全長転写産物／（完全長転写産物＋エクソン５１がスキップされた転写産物。
結果
２Ａ＞Ｇ変異を有するヒトＳＬＣ２６Ａ４エクソン８
エクソン８（大文字）、隣接するイントロン配列（小文字）およびｃ．９１９－２Ａ＞Ｇ変異（ｇ）は、以下のとおりである。
上記のミニ遺伝子システムを用いて、エクソン８の３’末端にある８１個のヌクレオチドとイントロン８の５’末端にある７４個のヌクレオチド内の配列を標的とする多数のＡＳＯを設計し、スクリーニングした。複数のＡＳＯは培養細胞におけるエクソン８のスプライシングを促した（図１）。ＡＳＯの配列とスプライシングデータを表１～２に示す。イントロン８の内の２５－ｎｔのストレッチ（下線部）を理想的なＡＳＯターゲットとして同定した。配列（５’－ｔｇｇｔｇｔｔｃｃｔｃｔｔａｇｔａｃｔａａｔａｃａ－３’（配列番号：４１））はイントロン８の８位からイントロンの３２位までである。
ＨＥＫ２９３細胞に各ＡＳＯ（１０ｎＭ）とＳＬＣ２６Ａ４ミニ遺伝子変異体を共導入した。未処理細胞におけるエクソン８の包含率は－３０％である。１０ｎＭのコントロールＡＳＯ（５’－ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵＴＴ－３’（配列番号：８０））で処理された細胞におけるエクソン８の包含率は約２６％である。多くのＡＳＯはエクソン８の包含を大きく促進した。＞５８％インチのエクソン８の包含率は、１０ｎＭのＡＳＯで処理後に５８％を超えた。
ＡＳＯは、ＳＬＣ２６Ａ４ｃ．９１９－２Ａ＞Ｇ変異体のエクソン８のスプライシングを修正する能力の点から、最も強力なものから最も弱いものまで３つのグループに分類された。
図１は、試験対象となるＡＳＯのエクソン８の導入効率を示す。未処理細胞（ブランク）におけるエクソン８の包含率は約３０％である。陰性対照処理したＡＳＯ（Ｃｏｎ ＡＳＯ）のエクソン８の包含率は約２６％である。試験対象となるＡＳＯはすべてイントロン８内の同じ２５－ｎｔ配列を標的としたが、エクソン８の導入効率は様々である。
例えば、ＨＵＡ０００３－１０２７（配列番号：２）、ＨＵＡ０００３－１０２９（配列番号：３）およびＨＵＡ０００３－１０３０（配列番号：４）は、ほぼ９０％のエクソン８包含率に達した。しかしながら、ＨＵＡ０００３－１２３１（配列番号：３９）は、５８％のエクソン８包含率にしか達しなかった。ＨＵＡ０００３－１０２９（配列番号：３）およびＨＵＡ０００３－１２３１（配列番号：３９）の両方の長さが２０個のヌクレオチドであり、２つのヌクレオチドだけ転移されているため、この効果の差は特に顕著である。
表３は、エクソン８包含を促すＡＳＯを示しており、ＡＳＯの５’～３’配列およびエクソン８包含率を含む。表３はまた、試験対象となるＡＳＯと、それらがすべて共有する保存配列との関係を示す。これはＨＵＡ０００３－１０２７（配列番号：２）と同じである。
図２は、患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における内因性ＳＬＣ２６Ａ４ｃ．９１９－２Ａ＞Ｇのエクソン８包含の促進を示す。ａｃ．９１９－２Ａ＞Ｇホモ接合体患者からＰＢＭＣを密度勾配遠心法により分離した後、細胞をロズウェルパーク記念研究所培地（Rosewell Park Memorial Institute、RPMI）１６４０完全培地（Invitrogen）で培養した。コレステロール結合ＡＳＯ（水に溶解）を、低血清（３％ＦＢＳ）完全培地を含む１２ウェルプレートにおけるウェルあたり１０６個の細胞に添加した。ＡＳＯの最終濃度は２μＭであった。４８時間後、ＲＮＡ精製およびスプライシング解析のために細胞を回収した。
当業者は、開示された本発明が、本明細書に具体的に記載されていない方法で変更することができることを理解するであろう。開示された本発明は、例示のみを目的とする本明細書に記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるものでない。本発明は、すべての機能的に等価なすべての製造物、組成物、および方法を含む、任意の修正および変形を含む。
本明細書に引用された全ての刊行物の開示内容全体は、援用により本明細書に組み込まれる。そのような出版物が先行技術であること、または当業者の一般的な一般知識の一部であることを認めるものではない。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］ 配列番号：１（５’－ｔｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃａ－３’）の全部または一部を含む、１０～３０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［２］ 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
ａ．ＨＵＡ０００３－１０２７（５’－ｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：２）、
ｂ．ＨＵＡ０００３－１０２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：３）、
ｃ．ＨＵＡ０００３－１０３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：４）、
ｄ．ＨＵＡ０００３－１０３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：５）、
ｅ．ＨＵＡ０００３－１０３２（５’－ｔｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：６）、
ｆ．ＨＵＡ０００３－０９３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：７）、
ｇ．ＨＵＡ０００３－０９２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：８）、
ｈ．ＨＵＡ０００３－０９２８（５’－ｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：９）、または
ｉ．ＨＵＡ０００３－０９３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：１０）である、［１］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［３］ 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは非天然骨格を含む、［１］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［４］ 前記非天然骨格は修飾糖部分を含む、［３］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［５］ 前記修飾糖部分は2’-O-メトキシエチルリボースを含む、［４］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［６］ 前記非天然骨格は修飾リン酸塩を含む、［３］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［７］ 前記修飾リン酸塩は、ホスホロチオエートを含む、［６］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［８］ 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは修飾窒素塩基を含む、［１］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［９］ 前記修飾窒素塩基は5-メチルシトシン塩基を含む、［８］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１０］ 薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、［１］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１１］ ｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法であって、核酸分子を細胞に導入することを含み、前記核酸分子は、配列番号：１（５’－ｔｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃａ－３’）の全部または一部を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドは、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子のイントロン８標的領域にハイブリダイズし、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子のｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にエクソン８スキッピングを防止または低減する、方法。
［１２］ 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
ａ．ＨＵＡ０００３－１０２７（５’－ｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：２）、
ｂ．ＨＵＡ０００３－１０２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：３）、
ｃ．ＨＵＡ０００３－１０３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：４）、
ｄ．ＨＵＡ０００３－１０３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：５）、
ｅ．ＨＵＡ０００３－１０３２（５’－ｔｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：６）、
ｆ．ＨＵＡ０００３－０９３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：７）、
ｇ．ＨＵＡ０００３－０９２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：８）、
ｈ．ＨＵＡ０００３－０９２８（５’－ｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：９）、または
ｉ．ＨＵＡ０００３－０９３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：１０）である、［１１］に記載の方法。
［１３］ 前記細胞は動物細胞である、［１１］に記載の方法。
［１４］ 前記細胞はヒト細胞である、［１３］に記載の方法。
［１５］ 前記核酸分子は、発現ベクターによって細胞内に導入される、［１１］に記載の方法。
［１６］ 前記発現ベクターはｐＣＩ－ｎｅｏ発現ベクターである、［１５］に記載の方法。
［１７］ 治療上有効量の［１］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、ペンドレッド症候群を有する対象における難聴を処置する方法。
［１８］ 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
ａ．ＨＵＡ０００３－１０２７（５’－ｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：２）、
ｂ．ＨＵＡ０００３－１０２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：３）、
ｃ．ＨＵＡ０００３－１０３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：４）、
ｄ．ＨＵＡ０００３－１０３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：５）、
ｅ．ＨＵＡ０００３－１０３２（５’－ｔｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：６）、
ｆ．ＨＵＡ０００３－０９３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：７）、
ｇ．ＨＵＡ０００３－０９２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：８）、
ｈ．ＨＵＡ０００３－０９２８（５’－ｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：９）、または
ｉ．ＨＵＡ０００３－０９３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：１０）である、［１７］に記載の方法。
［１９］ 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは非経口投与により投与される、［１７］に記載の方法。
［２０］ ｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法に用いる［１］に記載の化合物であって、核酸分子を細胞内に導入することを含み、前記核酸分子は、配列番号：１（５’－ｔｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃａ－３’）の全部または一部を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドは、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子のイントロン８標的領域にハイブリダイズし、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子のｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にエクソン８スキッピングを防止または低減する、化合物。
［２１］ 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
ａ．ＨＵＡ０００３－１０２７（５’－ｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：２）、
ｂ．ＨＵＡ０００３－１０２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：３）、
ｃ．ＨＵＡ０００３－１０３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：４）、
ｄ．ＨＵＡ０００３－１０３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：５）、
ｅ．ＨＵＡ０００３－１０３２（５’－ｔｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：６）、
ｆ．ＨＵＡ０００３－０９３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：７）、
ｇ．ＨＵＡ０００３－０９２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：８）、
ｈ．ＨＵＡ０００３－０９２８（５’－ｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：９）、または
ｉ．ＨＵＡ０００３－０９３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：１０）である、［２０］に記載の化合物。
［２２］ 前記細胞は動物細胞である、［２０］に記載の化合物。
［２３］ 前記細胞はヒト細胞である、［２２］に記載の化合物。
［２４］ 前記核酸分子は発現ベクターを介して細胞内に導入される、［２０］に記載の化合物。
［２５］ 前記発現ベクターはｐＣＩ－ｎｅｏ発現ベクターである、［２４］に記載の化合物。
［２６］ ペンドレッド症候群を有する対象における難聴を処置する方法に用いる［１］に記載の化合物であって、治療上有効量の［１］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、化合物。
［２７］ 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
ａ．ＨＵＡ０００３－１０２７（５’－ｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：２）、
ｂ．ＨＵＡ０００３－１０２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：３）、
ｃ．ＨＵＡ０００３－１０３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：４）、
ｄ．ＨＵＡ０００３－１０３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：５）、
ｅ．ＨＵＡ０００３－１０３２（５’－ｔｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：６）、
ｆ．ＨＵＡ０００３－０９３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：７）、
ｇ．ＨＵＡ０００３－０９２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：８）、
ｈ．ＨＵＡ０００３－０９２８（５’－ｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：９）、または
ｉ．ＨＵＡ０００３－０９３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：１０）である、［２６］に記載の化合物。
［２８］ 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは非経口投与により投与される、［２６］に記載の化合物。

Claims (17)

  1. ａ．ＨＵＡ０００３－１０２７（５’－ｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：２）、
    ｂ．ＨＵＡ０００３－１０２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：３）、
    ｃ．ＨＵＡ０００３－１０３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：４）、
    ｄ．ＨＵＡ０００３－１０３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：５）、
    ｅ．ＨＵＡ０００３－１０３２（５’－ｔｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃ－３’）（配列番号：６）、
    ｆ．ＨＵＡ０００３－０９３０（５’－ｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：７）、
    ｇ．ＨＵＡ０００３－０９２９（５’－ａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：８）、
    ｈ．ＨＵＡ０００３－０９２８（５’－ｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：９）、または
    ｉ．ＨＵＡ０００３－０９３１（５’－ｇｔａｔｔａｇｔａｃｔａａｇａｇｇａａｃａｃｃ－３’）（配列番号：１０）からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  2. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは非天然骨格を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  3. 前記非天然骨格は修飾糖部分を含む、請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  4. 前記修飾糖部分は2’-O-メトキシエチルリボースを含む、請求項３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  5. 前記非天然骨格は修飾リン酸塩を含む、請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  6. 前記修飾リン酸塩は、ホスホロチオエートを含む、請求項５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  7. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは修飾窒素塩基を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  8. 前記修飾窒素塩基は5-メチルシトシン塩基を含む、請求項７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  9. 核酸分子を含む、ｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にＳＬＣ２６Ａ４遺伝子におけるエクソン８スキッピングを防止または低減する方法に用いる医薬組成物であって、前記核酸分子を細胞に導入することを含み、前記核酸分子は請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドは、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子のイントロン８標的領域にハイブリダイズし、ＳＬＣ２６Ａ４遺伝子のｍＲＮＡ前駆体スプライシング中にエクソン８スキッピングを防止または低減する、医薬組成物。
  10. 前記細胞は動物細胞である、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 前記細胞はヒト細胞である、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 前記核酸分子は、発現ベクターによって細胞内に導入される、請求項９に記載の医薬組成物。
  13. 前記発現ベクターはｐＣＩ－ｎｅｏ発現ベクターである、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項９に記載の医薬組成物。
  15. 治療上有効量の請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、ペンドレッド症候群を有する対象における難聴を処置する方法に用いる医薬組成物。
  16. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは非経口投与により投与される、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
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