CN107406852B - 用于莱伯氏先天性黑蒙的寡核苷酸疗法 - Google Patents

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Abstract

反义寡核苷酸靶向CEP290基因的内含子26中的突变并减少异常外显子包含到CEP290 mRNA中。寡核苷酸不包含多于3个连续的鸟苷，具有不多于60％的鸟苷核碱基，包含至多一个CpG序列，和/或不具有形成包含3个或更多个连续互补碱基对的发夹结构的潜能。

Description

用于莱伯氏先天性黑蒙的寡核苷酸疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年2月27日提交的英国专利申请1503408.5的优先权，出于所有目的将其全部内容并入本文以供参考。
技术领域
本发明涉及寡核苷酸领域及其用于治疗疾病的用途。特别地，本发明涉及可以用于治疗莱伯氏先天性黑蒙(Leber Congenital Amaurosis)的新型反义寡核苷酸。
背景技术
莱伯氏先天性黑蒙(LCA)是先天性儿童失明的最常见形式，估计患病率为全世界每50,000名新生儿中约1例(Koenekoop等人，2007；Stone，2007)。其伴有视网膜营养不良。疾病症状的发病早在生命的最初几个月或几年(Leber，T.，1869)。遗传上，LCA是一种异质性疾病，迄今为止鉴定了15个基因，在这些基因中的突变是LCA的致病原因(den Hollander等人，2008；Estrada-Cuzcano等人，2011)。最常突变的LCA基因是CEP290，该基因位于染色体12的Q臂上，编码在中心体和纤毛发育中起重要作用的中心体蛋白质290。CEP290基因中的突变造成所有LCA病例的约15％(Stone，2007；den Hollander，2008；den Hollander，2006；Perrault等人，2007)。
与视网膜营养不良相关联的最常发生的CEP290突变，尤其是在欧洲国家和美国，是CEP290基因的内含子26的改变(c.2991+1655A＞G)(Stone，2007；den Hollander等人，2006；Perrault等人，2007；Liitink等人，2010)。该突变在内含子26中产生隐蔽剪切供体位点，这导致在突变型CEP290 mRNA中包含128bp的异常外显子，并插入提前终止密码子(p.C998X)(参见图1)。在具有这种突变的患者中，仍然产生缺乏异常外显子的野生型转录本，解释了这种突变的亚效等位基因性质(Estrada-Cuzcano等人，2011)。
WO2013/036105(奈梅亨天主教大学基金会(Stichting KatholiekeUniversiteit Nijmegen))和WO2012/168435(Inserm等人)公开了用于治疗或延缓LCA的靶向CEP290中的这种内含子突变的反义寡核苷酸。
发明内容
虽然WO2013/036105和WO2012/168435中公开的反义寡核苷酸减少与突变相关联的隐蔽剪切位点的选择，从而减少包含异常128bp外显子序列的经剪切的CEP290 mRNA的产生(也称为“外显子跳跃”)，但是从工艺性和/或免疫学的角度来说，寡核苷酸本身具有某些限制，这可能限制其在人体治疗环境中的可用性。因此，本发明的目的是提供靶向CEP290基因的内含子26中的突变的新型反义寡核苷酸，该反义寡核苷酸不受现有技术的寡核苷酸的一些缺点的影响，同时有效地减少异常外显子包含到CEP290 mRNA中。
因此，本发明提供一种寡核苷酸，其能够在人类细胞表达人类CEP290基因时减少与人类CEP290基因的内含子26中的c.2991+1655A＞G突变相关联的异常剪切位点的剪切位点选择；
其特征在于该寡核苷酸的序列具有特性(a)至(d)中的至少一种：
(a)其不包含多于3个连续的鸟苷；
(b)其具有不多于60％的鸟苷核碱基；
(c)其包含至多一个CpG序列；和/或
(d)其不具有形成包含3个或更多个连续互补碱基对的发夹结构的潜能，
其条件是寡核苷酸(i)不由SEQ ID NO：16组成，和/或(ii)由21个或更少的核苷酸组成，并且优选由20个或更少的核苷酸组成。
不希望受到理论的束缚，本发明人认为寡核苷酸对人类CEP290前体mRNA的互补性意味着其能够在生理条件下在影响异常剪切位点的选择的区域中与之结合，并且在结合到所述区域后，其通过细胞剪切机制减少该剪切位点的选择。
寡核苷酸可具有上述特征(a)至(d)中的两个、三个或甚至四个的组合。下面更详细地描述此类组合。
寡核苷酸通常短于30个核苷酸，例如≤25nt、≤21nt、≤20nt。它们可为16nt至19nt长，例如17nt长。
特定的目的寡核苷酸序列是SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：12。
当与天然RNA比较时，寡核苷酸优选地含有化学修饰，例如硫代磷酸酯骨架、2’-O-低级烷基修饰的核糖部分等。
寡核苷酸可直接提供给细胞，或者可通过原位转录(例如由病毒载体)间接提供。无论它们如何供应，它们都可用于提供体内治疗效果，用于对在其基因组中携带CEP290基因的内含子26中的(c.2991+1655A＞G)突变的人进行治疗。
附图说明
图1：人类基因组的有义链(SEQ ID NO：30)，其包含128bp隐蔽外显子(下划线；SEQID NO：1)和下游的30bp。还示出根据本发明的反义寡核苷酸(SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：12)以及现有技术的AON(SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：22)的位置。在基因组序列中以小写示出隐蔽外显子下游的c.2991+1655A＞G突变。
图2：未治疗的患者细胞(NT)、用非互补(有义)寡核苷酸(SON-3；SEQ ID NO：29)或根据本发明的互补反义寡核苷酸(AONP)(与现有技术的AON相比)治疗的患者细胞的CEP290mRNA剪切谱。野生型片段对应于迁移在约109bp处的条带，而突变片段对应于迁移在约237bp处的条带。迁移到237bp片段之上的片段被认为是其他形式的异常剪切。健康对照组仅显示野生型谱，而患者显示出存在野生型和突变的片段。指定的寡核苷酸可有效地诱导所靶向突变序列的外显子跳跃，并且因此恢复野生型mRNA谱。
图3：用在x轴上示出的AON治疗后患者样品中CEP290 mRNA的表达。使用比较Ct法计算倍数变化(y轴)。将野生型mRNA(黑色条)和突变型mRNA(灰色条)的水平与未治疗的样品进行比较。误差条代表平均值的标准偏差。使用配对t检验进行未治疗的患者样品与治疗的患者样品中的野生型转录本水平之间的差异的统计分析。结果显示在反义寡核苷酸治疗后野生型转录本水平的显著性差异(p＜0.05)，但在用相同的有义寡核苷酸治疗后无显著性差异。(SON-3 p＝0.2507，AONP4 p＝0.0002，AONP13 p＝0.0001，AONP26 p＜0.0001，AON-3p＝0.0034，ESE(+50+70)p＝0.0193)。
具体实施方式
令人惊讶地，现在已经证明可设计反义寡核苷酸(AON)，该反义寡核苷酸能够阻断或减少CEP290前体mRNA中隐蔽128bp外显子的异常剪切，并且满足人类治疗用途的要求。
因此，根据本发明的AON不仅具有功能性，而且(同样重要的是，并且与现有技术的外显子跳跃AON相反)没有易于聚集体或复合体形成的序列，比如重复的G(3个或更多个G，包括4个或更多个G，也称为G-四联体或四链体)，其在批量制造之后引起纯化问题(杂质)和分析问题、溶解度问题(例如由于G-四联体的堆叠)、生物分布问题、细胞摄取问题、免疫原性和/或功能全部丧失问题。
根据本发明的AON不含有多于60％、更优选不含有多于50％、还更优选不含有多于40％的鸟苷核苷酸。
此外，本发明的AON含有不多于一个CpG序列，优选没有CpG序列，该CpG序列已知通过TLR9介导的反应诱导人类免疫系统。
另外，与现有技术中公开的一些外显子跳跃AON相反，本发明的AON不含有长的反向重复序列(可产生发夹结构或其他双链结构的序列)，该长的反向重复序列可以产生纯化和分析问题，并且与免疫原性、细胞摄取减少和/或功能全部丧失相关联。
因此，在第一方面，本发明提供一种寡核苷酸，其能够在人类细胞表达人类CEP290基因时减少与人类CEP290基因的内含子26中的c.2991+1655A＞G突变相关联的异常剪切位点的剪切位点选择，其中该寡核苷酸与人类CEP290前体mRNA互补，并且其能够在生理条件下在影响异常剪切位点的选择的区域中与人类CEP290前体mRNA结合，并且在结合到所述区域后，通过所述细胞中的剪切机制减少所述剪切位点的选择；
其特征在于寡核苷酸的序列具有特性(a)至(d)中的至少一种：
(a)其不包含多于3个连续的鸟苷；
(b)其具有不多于60％的鸟苷核碱基；
(c)其包含至多一个CpG序列；和/或
(d)其不具有形成包含3个或更多个连续互补碱基对的发夹结构的潜能，
其条件是寡核苷酸不由SEQ ID NO：16组成。
根据特性(a)，寡核苷酸可包含GpG二核苷酸序列，但是序列中不存在多于3个连续的鸟苷核碱基。因此，鸟苷四联体不存在，更长的鸟苷重复序列段也不存在。
根据特性(b)，寡核苷酸可包含鸟苷核碱基，但是寡核苷酸中不多于60％的单个核碱基可以为鸟苷。理想地，不多于50％的核碱基为鸟苷，并且优选不多于40％。
根据特性(c)，寡核苷酸可包含一个CpG二核苷酸序列，但是没有更多。在一些实施方式中，寡核苷酸不包含CpG二核苷酸序列。
根据特性(d)，寡核苷酸删除3个或更多个核苷酸序列，该3个或更多个核苷酸序列自身互补并且因此可在寡核苷酸内彼此杂交以形成3个或更多个碱基对的发夹结构(分子内双链体)，或者可在不同的寡核苷酸中彼此杂交以形成分子间双链体。
还优选寡核苷酸的序列应具有不多于3个连续的胞苷核碱基。更一般来说，在一些实施方式中，寡核苷酸的序列不包含3个或更多个连续的相同核碱基的任何一段，例如它不包含ApApA、CpCpC、GpGpG或UpUpU三核苷酸中的任何一个。
在第二方面，本发明提供一种寡核苷酸，其能够在人类细胞表达人类CEP290基因时减少与人类CEP290基因的内含子26中的c.2991+1655A＞G突变相关联的异常剪切位点的剪切位点选择，其中该寡核苷酸与人类CEP290前体mRNA互补，并且其能够在生理条件下在影响异常剪切位点的选择的区域中与人类CEP290前体mRNA结合，并且在结合到所述序列后，通过所述细胞中的剪切机制减少所述剪切位点的选择；
其特征在于，寡核苷酸由21个或更少的核苷酸(优选20个或更少)组成，并且其序列具有特性(a)至(d)中的至少一种：
(a)其不包含多于3个连续的鸟苷；
(b)其具有不多于60％的鸟苷核碱基；
(c)其包含至多一个CpG序列；和/或
(d)其不具有形成包含3个或更多个连续互补碱基对的发夹结构的潜能。
另外，本发明的第三方面提供一种寡核苷酸，其能够在人类细胞表达人类CEP290基因时减少与人类CEP290基因的内含子26中的c.2991+1655A＞G突变相关联的异常剪切位点的剪切位点选择，其中该寡核苷酸的5’或3’末端核苷酸是胞苷，在该位置处其与c.2991+1655A＞G突变反义。该寡核苷酸也可具有特性(a)至(d)中的至少一种。
在第四方面，本发明提供一种寡核苷酸，其能够在人类细胞表达人类CEP290基因时减少与人类CEP290基因的内含子26中的c.2991+1655A＞G突变相关联的异常剪切位点的剪切位点选择，其中该寡核苷酸包含至少10个核苷酸的序列，该至少10个核苷酸的序列与序列5’-atggtgtcgatctcctgaactcgtga-3’(SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：1的核苷酸31-56)的至少一部分互补。因此，该寡核苷酸可以与SEQ ID NO：31的任何部分退火，但将总是包含与其中心8聚体、名为5’-atctcctg-3’(SEQ ID NO：32)互补的至少一个核苷酸，该中心8聚体是潜在的剪切增强子序列。AONP11、AONP 12和AONP 13是此类寡核苷酸的实例，其中每个包含来自中心8聚体5’-caggagat-3’(SEQ ID NO：36；参见图1)的至少一个核苷酸。该寡核苷酸也可具有特性(a)至(d)中的至少一种。
理想地，本发明的寡核苷酸具有所述特性(a)至(d)中的多于一种。例如，它可具有特性：(a)和(b)；(a)和(c)；(a)和(d)；(b)和(c)；(b)和(d)；(a)、(b)和(c)；(a)、(b)和(d)；(a)、(c)和(d)；或所有四种(a)、(b)、(c)和(d)。
下表提供现有技术的AON，突出(粗体)要避免的特征，以便防止制造、纯化、分析、聚集体形成、免疫原性和/或与其相关联的功能丧失的问题：
现有技术序列 现有技术中的AON名称和/或SEQ ID SEQ ID
cuggggccaggugcgguggcucacaucugua ESE(+90+120)；WO2012/168435 SEQIDNO：1 13
ccgaggcggguggaucacgag ESE(+50+70)；WO2012/168435 SEQIDNO：2 15
gggauagguaugagauacucacaau H26D(+7-18)；WO2012/168435 SEQIDNO：4 14
gguaugagauacucacaauuac H26D(+10-11)；WO2012/168435 SEQIDNO：5 16
gguaugagauacucacaauuacaacuggggc H26D(+19-11)；WO2012/168435 SEQIDNO：6 17
gggceaggtgcggtgg AON-2；WO2013/036105 SEQIDNO：10 19
aactggggccaggtgcg AON-3；WO2013/036105 SEQIDNO：11 20
tacaactggggccaggtg AON-4；WO2013/036105 SEQIDNO：12 21
下表中提供根据本发明的优选的AON：AONP2(SEQ ID NO：2)、AONP3(SEQ ID NO：3)、AONP4(SEQ ID NO：4)、AONP11(SEQ ID NO：5)、AONP12(SEQ ID NO：6)、AONP13(SEQ IDNO：7)、AONP19(SEQ ID NO：8)、AONP20(SEQ ID NO：9)、AONP23(SEQ ID NO：10)、AONP24(SEQID NO：11)和AONP26(SEQ ID NO：12)：
AON 寡核苷酸序列 SEQ ID NO：
AONP2 G<u>CG</u>GUGGCUCACAUCUG 2
AONP3 GGUGGCUCACAUCUGUA 3
AONP4 GGCUCACAUCUGUAAUC 4
AONP11 UCAGGAGAU<u>CG</u>ACACCA 5
AONP12 CA<u>CG</u>AGUUCAGGAGAUC 6
AONP13 GGUGGAUCA<u>CG</u>AGUUCA 7
AONP19 UGGCUCACAUCUGUAAU 8
AONP20 UG<u>CG</u>GUGGCUCACAUCU 9
AONP23 CUCACAAUUACAACUGG 10
AONP24 GGUA<u>UGAG</u>AUA<u>CUCA</u>CA 11
AONP26 GGAUAGGUAUGAGAUAC 12
在表中的AON中，基本上所有的核糖部分均是2’-O-甲基化的，并且基本上所有的核苷间键均是硫代磷酸酯键。
根据本发明的更优选的AON是具有AONP4、AONP13和AONP26序列的那些，还更优选的是具有基本上所有的2’-O-甲基-核糖部分和基本上所有的硫代磷酸酯核苷间键的那些。
在本发明的所有实施方式中，术语“调控剪切”和“外显子跳跃”是同义的。关于CEP290，“调控剪切”或“外显子跳跃”应解释为从CEP290 mRNA排除异常128个核苷酸外显子(SEQ ID NO：1或其等位基因形式)(参见图1)。术语外显子跳跃在本文中定义为在细胞内诱导不含有具体外显子的成熟mRNA，该具体外显子在没有外显子跳跃的情况下将存在于成熟mRNA中。外显子跳跃的实现是通过向表达所述成熟mRNA的前体mRNA的细胞提供一种分子，该分子能够干扰序列如允许剪切的生物化学过程所需的(隐蔽)剪切供体或(隐蔽)剪切受体序列，或该分子能够干扰用于识别待包含在成熟mRNA中的外显子的核苷酸段所需的外显子包含信号；此类分子在本文中称为外显子跳跃分子。
术语前体mRNA是指通过转录从细胞中的DNA模板合成的未加工或部分加工的前体mRNA。
术语“反义寡核苷酸”理解为是指与前体mRNA分子、hnRNA(异质性核RNA)或mRNA分子中靶核苷酸序列互补，使得其能够与其对应的靶序列退火的核苷酸序列。
本文所用的术语“互补”包括“完全互补”和“基本上互补”，这意味着寡核苷酸和其对应的靶序列之间的互补度通常将大于80％，优选大于85％，更优选大于90％，最优选大于95％。例如，对于其序列与其靶序列之间具有一个错配的长度为20个核苷酸的寡核苷酸，互补度为95％。
反义序列的互补度优选地使得包含反义序列的分子可以在生理条件下与RNA分子中的靶核苷酸序列退火，从而促进外显子跳跃。对于本领域技术人员熟知的是，某些错配比其他错配较容许，因为某些错配比其他错配对AON和靶序列之间结合强度(如以解链温度或Tm表示)的影响较小。某些非互补的碱基对可以形成摆动，该摆动破坏整体结合至比真正的错配更小的程度。AON的长度在结合强度方面也起作用，一般来说较长的AON比较短的AON具有更高的解链温度，并且寡核苷酸的G/C含量也是确定结合强度的因素，对于任何给定长度，G/C含量越高，则解链温度越高。如本发明所考虑的，核碱基或糖-磷酸骨架的某些化学修饰也可影响结合强度，使得在设计根据本发明的寡核苷酸时互补度仅是考虑的一个因素。
寡核苷酸中一个CpG或多个(两个或更多个)CpG的存在通常与所述寡核苷酸增加的免疫原性相关联(Dom和Kippenberger，2008)。该增加的免疫原性是不期望的，因为它可以诱导待治疗的组织(即眼睛)的损伤。
本发明允许设计具有可接受的RNA结合动力学和/或热力学特性的寡核苷酸。RNA结合动力学和/或热力学特性至少部分地由寡核苷酸解链温度(Tm；对于使用基本Tm和最近相邻模型的单链RNA，用寡核苷酸特性计算器计算(www.unc.edu/～cail/biotool/oligo/index.html))和/或AON-靶外显子复合物的自由能(使用RNA结构版本4.5)确定。如果Tm太高，则预期寡核苷酸的特异性较低。可接受的Tm和自由能取决于寡核苷酸的序列、骨架(磷酸二酯，硫代磷酸酯、磷酰胺酯、肽-核酸等)的化学性质、糖部分(核糖、脱氧核糖、取代的核糖、分子内桥)的性质和核碱基的化学修饰。因此，Tm的范围可变化很大。
本发明提供一种设计根据本发明的AON的方法，其通过用具体长度的寡核苷酸对整个隐蔽外显子进行微步行(microwalking)。本发明人选择的寡核苷酸的长度为17个核苷酸，但是不同的长度也是可以的。优选具有足够长的长度以允许与靶RNA的稳定相互作用和对靶序列的特异性，但是不超过必需的长度，因为更长的寡核苷酸制造成本更高，并且从分析的角度来看其更加复杂。随后，通过制备一系列重叠寡核苷酸(如在实施例中所例示，在体外试验中测试其外显子跳跃的效力)可以探查整个隐蔽外显子或其一部分的有效的外显子跳跃分子。在替代方法中，搜索隐蔽外显子潜在的剪切增强基序，并且针对这些基序设计一系列AON。然后基于可制造性、免疫原性和本文提供的其他可用性标准进一步选择建立令人满意的外显子跳跃效力的AON。
相反的策略也是可以的。根据该策略，首先基于可制造性、免疫原性和本发明提供的其他可用性标准设计寡核苷酸，然后测试外显子跳跃效力。所述寡核苷酸的功能活性优选诱导异常128个核苷酸CEP290外显子(SEQ ID NO：1)在一定程度上跳跃和/或至少部分降低异常CEP290 mRNA的产生，从而增加wt CEP290 mRNA的产生。在优选的实施方式中，当如通过实时定量RT-PCR分析所测量的异常128个核苷酸的CEP290外显子(SEQ ID NO：1)跳跃百分比为至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％时，据称寡核苷酸诱导异常128个核苷酸CEP290外显子(SEQ ID NO：1)的跳跃。
对于任何给定的引物组，可以通过在给定的PCR循环次数之后确定扩增的野生型条带的浓度除以扩增的突变型条带的浓度、乘以100％计算跳跃百分比(或剪切位点跳跃的效率)，其条件是循环的次数使得扩增仍处于指数期。
如通过RT-PCR分析所测量，根据本发明的优选的AON是与未治疗的细胞相比在AON治疗的细胞中显示大于70％、更优选大于80％、还更优选大于90％的跳跃百分比的那些。
优选地，根据本发明的包含与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列互补的序列的AON使得互补部分至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％，最优选100％与靶序列互补。所述寡核苷酸的所述互补部分的长度优选为至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。根据更优选的实施方式，互补部分的长度在约12个和约25个核苷酸之间，更优选地在14个和约20个核苷酸之间，最优选地为16个、17个、18个、19个或20个核苷酸。优选地，寡核苷酸的互补部分的长度与寡核苷酸的长度相同，意味着没有寡核苷酸的5’或3’末端不与靶RNA形成碱基对。因此，本发明的寡核苷酸的优选长度为30个核苷酸或更少，例如＜25、＜20或16个至19个核苷酸。
因此，不完全需要互补区域中的所有碱基能够与相对链中的碱基配对。例如，当设计寡核苷酸时，可以需要包含例如与互补链上的碱基并非碱基配对的残基。如果在细胞的环境下，核苷酸段能够充分地与互补部分杂交，则可以允许错配至一定程度。在该上下文中，“充分地”意味着根据本发明的AON能够诱导隐蔽128bp外显子的外显子跳跃。靶向的(隐蔽)外显子跳跃可以方便地由RT-PCR评定。互补区域优选地设计成使得当它们组合时，它们对前体mRNA中的外显子是特异性的。这种特异性可以由各种长度的互补区域产生，因为这取决于系统中其他(前体)mRNA分子中的实际序列。寡核苷酸也将能够与一个或多个其他前体mRNA分子杂交的风险随着寡核苷酸大小的增加而减小。显然在互补区域中包含错配但是保留与前体mRNA中靶向区域杂交和/或结合的能力的寡核苷酸可用于本发明。然而，优选至少互补部分不包含此类错配，因为这些通常比在一个或多个互补区域中具有此类错配的寡核苷酸具有更高的效率和更高的特异性。据认为，较高的杂交强度(即增加与相对链的相互作用数目)对增加干扰系统的剪切机制的过程的效率是有利的。优选地，互补度为90％至100％。通常，这在20个核苷酸的寡核苷酸中允许1个或2个错配，或在40个核苷酸的寡核苷酸中允许1个、2个、3个或4个错配，或者在60个核苷酸的寡核苷酸中允许1个、2个、3个、4个、5个或6个错配等。
本发明的外显子跳跃分子优选是与SEQ ID NO：1互补的(反义)寡核苷酸。
在其中外显子跳跃分子包含反义寡核苷酸或由反义寡核苷酸组成的本发明的那些实施方式中，该反义寡核苷酸与包含c.2991+1655A＞G突变的SEQ ID NO：1的至少部分结合或互补，所述外显子跳跃分子优选在与SEQ ID NO：1中突变的“G”核苷酸互补的位置上包含“C”核苷酸。
在某些实施方式中，本发明提供包含反义寡核苷酸或优选地由反义寡核苷酸组成的外显子跳跃分子，该反义寡核苷酸选自：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12。
在更优选的实施方式中，本发明提供包含反义寡核苷酸SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：11或优选地由反义寡核苷酸SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：11组成的外显子跳跃分子。发现这些AON在调控异常128个核苷酸CEP290外显子的剪切中非常有效，同时它们不包含G-四联体、多于60％(50％或40％)的鸟苷核碱基组成、(多于)一个CpG序列、或可以形成包含多于3个的连续碱基对的发夹结构的序列。
在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸不由SEQ ID NO：16组成。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸不包含SEQ ID NO：16。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸不是由序列gcgguggcucacaucuguaauc(SEQ ID NO：33)、gggcgcgguggcucacaucugua(SEQ ID NO：34)或cgcgguggcucacaucugu(SEQ ID NO：35)组成的RNA。
根据本发明的外显子跳跃分子可含有多个DNA残基中的一个(因此RNA“u”残基将是作为DNA对应物的“t”残基)、或一个或多个RNA残基、和/或一个或多个核苷酸类似物或等同物，如下文将进一步详细描述。SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：12是RNA序列，但本发明还涵盖这些序列的DNA形式中的每一个，以及这些序列的DNA/RNA杂交体。
本发明的外显子跳跃分子优选包含经修饰以提高核酸酶抗性、和/或以增加反义寡核苷酸对靶序列的亲和力的一个或多个残基。因此，在优选的实施方式中，反义核苷酸序列包含至少一个核苷酸类似物或等同物，其中核苷酸类似物或等同物定义为具有修饰的碱基、和/或修饰的骨架、和/或非天然的核苷间键、或这些修饰的组合的残基。
在优选的实施方式中，核苷酸类似物或等同物包含修饰的骨架。此类骨架的实例由吗啉代骨架、氨基甲酸酯骨架、硅氧烷骨架、硫化物、亚砜和砜骨架、甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架、亚甲基甲酰乙酰基骨架、核糖乙酰骨架、含烯烃骨架、氨基磺酸酯、磺酸酯和磺酰胺骨架、亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架和酰胺骨架提供。磷酰二胺吗啉代寡聚物是以前作为反义试剂研究的经修饰的骨架寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸具有不带电的骨架，其中DNA的脱氧核糖由六元环代替，并且磷酸二酯键由磷酰二胺键代替。吗啉代寡核苷酸对酶降解具有抗性，并且似乎通过阻止翻译或干扰前体mRNA剪切而不是通过激活核糖核酸酶H(RNase H)起反义试剂作用。通过物理破坏细胞膜的方法已经将吗啉代寡核苷酸成功地递送至组织培养细胞，并且比较这些方法中的若干方法的一项研究发现，刮擦负载(scrapeloading)是最有效的递送方法；然而，因为吗啉代骨架不带电，所以阳离子脂质不是细胞中吗啉代寡核苷酸摄取的有效介质。最近的一份报告证明吗啉代寡核苷酸形成三链体，并且因为非离子骨架，所以这些研究表明吗啉代寡核苷酸能够在不存在镁的情况下形成三链体。
还优选的是，骨架中的残基之间的键不包括磷原子，例如由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的键。
优选的核苷酸类似物或等同物包含具有修饰的聚酰胺骨架的肽核酸(PNA)(Nielsen等人(1991)《科学(Science)》254，1497-1500)。基于PNA的分子在碱基对识别方面是DNA分子的真实模拟物。PNA的骨架由通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成，其中核碱基通过亚甲基羰基键连接到骨架。替代骨架包含一碳延伸的吡咯烷PNA单体(Govindaraju和Kumar(2005)《化学通讯(Chem.Commun)》，495-497)。由于PNA分子的骨架不含有带电的磷酸酯基团，所以通常PNA-RNA杂交体分别比RNA-RNA或RNA-DNA杂交体更稳定(Egholm等人(1993)《自然(Nature)》365，566-568)。
还优选的骨架包含吗啉代核苷酸类似物或等同物，其中核糖或脱氧核糖由6-元吗啉代环代替。最优选的核苷酸类似物或等同物包含磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)，其中核糖或脱氧核糖由6-元吗啉代环代替，并且相邻吗啉环之间的阴离子磷酸二酯键由非离子磷酰二胺键代替。
在又一实施方式中，本发明的核苷酸类似物或等同物包含磷酸二酯键中的非桥接氧中的一个的取代。该修饰略微使碱基配对不稳定，但增加了对核酸酶降解的明显抗性。优选的核苷酸类似物或等同物包含硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、H-膦酸酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、磷酰胺酯(包括3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯)、硫代磷酰胺酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯或硼代磷酸酯。
本发明的进一步优选的核苷酸类似物或等同物包含一个或多个糖部分，该一个或多个糖部分在2’、3’和/或5’位置单取代或二取代，例如-OH；-F；可以由一个或多个杂原子中断的取代或未取代的直链或支链低级(C1-C10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；O-、S-或N-烯丙基；O-烷基-O-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基；甲氧基乙氧基；-二甲基氨氧基乙氧基；和-二甲基氨基乙氧基乙氧基。糖部分可为五环糖或其衍生物、或脱氧五环糖或其衍生物，优选核糖或其衍生物、或脱氧核糖或其衍生物。优选的衍生化糖部分包括锁核酸(LNA)，其中2’-碳原子连接到糖环的3’或4’碳原子上，从而形成双环糖部分。优选的LNA包括2’-O，4’-C-亚乙基桥接的核酸(Morita等人，2001.《核酸研究补充No.1(Nucleic Acid Res Supplement No.1)》：241-242)。这些取代使得核苷酸类似物或等同物具有核糖核酸酶H和核酸酶抗性并增加对靶RNA的亲和力。
在另一实施方式中，本发明的核苷酸类似物或等同物包含一个或多个碱基修饰或取代。修饰的碱基包括合成和天然的碱基，例如在本领域中已知或将知的肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤以及嘧啶和嘌呤碱基的其他-氮杂、脱氮、-羟基、-卤代、-硫代、硫醇、-烷基、-烯基、-炔基、硫代烷基衍生物。
本领域技术人员应当理解，不必要将反义寡核苷酸中的所有位置都均匀地修饰。另外，上述类似物或等同物中的多于一种可以包含在单个反义寡核苷酸中或甚至在反义寡核苷酸内的单个位置处。在某些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸具有至少两种不同类型的类似物或等同物。
根据另一实施方式，根据本发明的AON包括2’-O(优选低级)烷基硫代磷酸酯反义寡核苷酸，例如2’-O-甲基修饰的核糖(RNA)、2’-O-甲氧基乙基修饰的核糖、2’-O-乙基修饰的核糖、2’-O-丙基修饰的核糖和/或这些修饰物的取代衍生物，例如卤代衍生物。
根据本发明的有效和优选的反义寡核苷酸包含具有硫代磷酸酯骨架的2’-O-甲基修饰的核糖部分，优选地其中基本上所有的核糖部分均是2’-O-甲基，并且基本上所有的核苷间键均是硫代磷酸酯键。
技术人员还将理解，可以组合不同的反义寡核苷酸以有效地跳跃CEP290的异常128个核苷酸外显子。两种反义寡核苷酸的组合可以用于本发明的方法中，例如靶向隐蔽外显子的相同或不同区域的两种反义寡核苷酸、三种不同的反义寡核苷酸、四种不同的反义寡核苷酸或五种不同的反义寡核苷酸(图1)。
反义寡核苷酸可连接到增强细胞(优选视网膜细胞)中反义寡核苷酸摄取的部分。此类部分的实例为胆固醇、碳水化合物、维生素、生物素、脂质、磷脂、细胞穿透肽(包括但不限于触角足、TAT、转运子)和带正电荷的氨基酸(例如寡聚精氨酸、聚精氨酸、寡聚赖氨酸或聚赖氨酸)、比如由抗体提供的抗原结合结构域：抗体的Fab片段或单链抗原结合结构域(例如骆驼单结构域抗原结合结构域)。
可以使用本领域已知的合适方式间接施用根据本发明的外显子跳跃分子。当外显子跳跃分子是寡核苷酸时，例如可以将其以表达载体的形式提供给个体或所述个体的细胞、组织或器官，其中表达载体编码包含所述寡核苷酸的转录本。表达载体优选地经由基因递送工具引入细胞、组织、器官或个体。在优选的实施方式中，提供基于病毒的表达载体，其包含驱动如本文所鉴定的外显子跳跃分子的表达或转录的表达盒或转录盒。因此，本发明提供病毒载体，当置于有助于外显子跳跃分子表达的条件下时，该病毒载体表达根据本发明的外显子跳跃分子。可向细胞提供能够干扰基本序列的外显子跳跃分子，通过由腺病毒类或腺相关病毒类的载体提供的质粒衍生的反义寡核苷酸表达或病毒表达，导致异常128个核苷酸CEP290外显子的高效跳跃。表达可以由聚合酶III启动子(例如U1、U6或U7 RNA启动子)驱动。优选的递送工具是病毒载体比如腺相关病毒载体(AAV)、或逆转录病毒载体比如慢病毒载体等。此外，质粒、人造染色体、可用于人细胞基因组中靶向同源重组和整合的质粒可以适当地应用于递送本文所述的寡核苷酸。本发明优选的是那些其中转录由PolIII启动子驱动、和/或其中转录本为与U1或U7转录本融合的形式的载体，它们对于递送小的转录本产生良好的结果。设计合适的转录本在技术人员的技术范围内。优选的是Pol III驱动的转录本。优选地，以与U1或U7转录本的融合转录本的形式。可以如(Gorman L等人，1998或Suter D等人，1999)所述产生此类融合体。
一种优选的反义寡核苷酸表达系统是腺病毒相关病毒(AAV)类载体。已经开发了单链和双链AAV类载体，其可用于延长用于异常128个核苷酸CEP290外显子高效跳跃的小反义核苷酸序列的表达，。
例如，优选的AAV类载体包含由聚合酶III启动子(Pol III)驱动的表达盒。例如，优选的Pol III启动子是U1、U6或U7 RNA启动子。
因此，本发明还提供一种病毒类载体，其包含用于表达本发明的反义寡核苷酸的Pol III启动子驱动的表达盒，该反义寡核苷酸用于诱导异常128个核苷酸CEP290外显子的跳跃。
根据本发明的AAV载体是重组AAV载体，并且是指包含AAV基因组的部分的AAV载体，该AAV基因组包含根据本发明的编码的外显子跳跃分子，将该外显子跳跃分子在如本文其他地方所描述的衍生自AAV血清型的衣壳蛋白的蛋白质壳中衣壳化。AAV基因组的部分可含有衍生自腺相关病毒血清型(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9等)的反向末端重复序列(ITR)。由衣壳蛋白组成的蛋白质壳可衍生自AAV血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9等。蛋白质壳也可以命名为衣壳蛋白壳。AAV载体可具有缺失的一个或优选缺失的全部野生型AAV基因，但仍可包含功能性ITR核酸序列。功能性ITR序列对于AAV病毒粒子的复制、释放(rescue)和包装是必需的。ITR序列可以是野生型序列，或者可与野生型序列具有至少80％、85％、90％、95或100％的序列同一性，或者可以通过例如核苷酸的插入、突变、缺失或取代来改变，只要它们保持功能性。在该上下文中，功能性是指指导基因组包装到衣壳中、然后允许在待感染的宿主细胞或靶细胞中表达的能力。在本发明的上下文中，衣壳蛋白壳可以是与AAV载体基因组ITR不同的血清型。因此，根据本发明的AAV载体可以由一种衣壳蛋白壳(即二十面体衣壳)组成，该衣壳蛋白壳包含一种AAV血清型(例如AAV血清型2)的衣壳蛋白(VP1、VP2和/或VP3)，而在该AAV5载体中含有的ITR序列可以是上述AAV血清型中的任何一种，包括AAV2载体。因此，“AAV2载体”包含AAV血清型2的衣壳蛋白壳，同时例如“AAV5载体”包含AAV血清型5的衣壳蛋白壳，由此任一个可将根据本发明的任何AAV载体基因组ITR衣壳化。
优选地，根据本发明的重组AAV载体包含AAV血清型2、5、8或AAV血清型9的衣壳蛋白壳，其中存在于所述AAV载体中的AAV基因组或ITR衍生自AAV血清型2、5、8或AAV血清型9；此类AAV载体称为AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9、AAV5/2、AAV5/5、AAV5/8、AAV5/9、AAV8/2、AAV8/5、AAV8/8、AAV8/9、AAV9/2、AAV9/5、AAV9/8或AAV9/9载体。
更优选地，根据本发明的重组AAV载体包含AAV血清型2的衣壳蛋白壳，并且存在于所述载体中的AAV基因组或ITR衍生自AAV血清型5；此类载体称为AAV2/5载体。
更优选地，根据本发明的重组AAV载体包含AAV血清型2的衣壳蛋白壳，并且存在于所述载体中的AAV基因组或ITR衍生自AAV血清型8；此类载体称为AAV2/8载体。
更优选地，根据本发明的重组AAV载体包含AAV血清型2的衣壳蛋白壳，并且存在于所述载体中的AAV基因组或ITR衍生自AAV血清型9；此类载体称为AAV2/9载体。
更优选地，根据本发明的重组AAV载体包含AAV血清型2的衣壳蛋白壳，并且存在于所述载体中的AAV基因组或ITR衍生自AAV血清型2；此类载体称为AAV2/2载体。
将由所选择的核酸序列表示的、编码根据本发明的外显子跳跃分子的核酸分子优选地插入如上所述的AAV基因组或ITR序列之间，例如包含可操作地连接到编码序列和3’终止序列的表达调控元件的表达构建体。
“AAV辅助功能”通常是指在转载(in trans)中供应给AAV载体的AAV复制和包装所需的对应的AAV功能。AAV辅助功能补充AAV载体中缺失的AAV功能，但它们缺少AAV ITR(由AAV载体基因组提供)。AAV辅助功能包括AAV的两个主要ORF，即rep编码区域和cap编码区域，或其功能基本相同的序列。Rep和Cap区域是本领域公知的，例如参见Chiorini等人(1999，《病毒学杂志(J.of Virology)》，Vol 73(2)：1309-1319)或US 5,139,941，其并入本文以供参考。可以在可为质粒的AAV辅助构建体上供应AAV辅助功能。在引入本文所述的存在于AAV载体中的AAV基因组之前或同时，例如可通过转化、转染或转导将辅助构建体引入宿主细胞。因此，可选择本发明的AAV辅助构建体，使得它们产生期望的血清型组合，一方面用于AAV载体的衣壳蛋白壳，并且另一方面用于存在于所述AAV载体中的AAV基因组复制和包装。
“AAV辅助病毒”提供AAV复制和包装所需的附加功能。合适的AAV辅助病毒包括腺病毒、单纯疱疹病毒(例如1型和2型HSV)和痘苗病毒。辅助病毒提供的附加功能也可经由载体引入宿主细胞，如并入本文以供参考的US 6,531,456中所述。
优选地，根据本发明的重组AAV载体中存在的AAV基因组不包含编码病毒蛋白质的任何核苷酸序列，例如AAV的rep(复制)或cap(衣壳)基因。AAV基因组还可包含标志物或报告基因，例如编码抗生素抗性基因的基因、编码荧光蛋白的基因(例如gfp)或本领域已知的编码化学上、酶学上或以其他方式可检测和/或可选择的产物的基因(例如lacZ、aph等)。
根据本发明的优选的AAV载体是AAV载体，优选是AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9或AAV2/2载体，其表达包含反义寡核苷酸的根据本发明的外显子跳跃分子，其中所述反义寡核苷酸包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8以及SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO 11或SEQ ID NO：12。
考虑到迄今为止已经取得的进展，预期向个体或所述个体的细胞、组织、器官提供根据本发明的外显子跳跃分子的手段的改进。当然可以并入此类未来的改进以使用本发明的方法来实现提及的对mRNA重组的效果。根据本发明的外显子跳跃分子可按原样递送给个体、所述个体的细胞、组织或器官。当施用根据本发明的外显子跳跃分子时，优选将分子溶解在与递送方法相容的溶液中。通过在水溶液中提供质粒，可为视网膜细胞提供用于反义寡核苷酸表达的质粒。替代地，可通过使用已知的转染试剂进行转染来提供质粒。对于静脉内、皮下、肌内、鞘内和/或心室内给药，优选的溶液是生理盐水溶液。在本发明中特别优选的是赋形剂或转染试剂的使用，该赋形剂或转染试剂将有助于将本文所述的每种组分递送至细胞和/或细胞中，优选视网膜细胞。优选的是能够形成复合物、纳米颗粒、胶束、囊泡和/或脂质体的赋形剂或转染试剂，其将本文所述的每种组分复合或捕获在囊泡或脂质体中递送通过细胞膜。许多这些赋形剂是本领域已知的。合适的赋形剂或转染试剂包括聚乙烯亚胺(PEI；ExGen500(MBI Fermentas)、LipofectAMINETM 2000(Invitrogen)或其衍生物、或类似的阳离子聚合物(包括聚丙烯亚胺或聚乙烯亚胺共聚物(PEC)和衍生物)、合成两亲物(SAINT-18)、lipofectin TM、DOTAP和/或病毒衣壳蛋白，它们能够自组装成可将本文所述的每种组分递送至细胞(优选视网膜细胞)的颗粒。已经表明此类赋形剂有效地将比如反义核酸的寡核苷酸递送到多种培养的细胞，包括视网膜细胞。就总体细胞存活而言，它们的高转染潜能与略去的低至中等的毒性相结合。结构修饰的简便性可用于允许进一步修饰和其进一步(体内)核酸转移特征和毒性的分析。
Lipofectin代表脂质体转染试剂的实例。它由两种脂质组分组成，即阳离子脂质N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵氯化物(DOTMA)(cp.DOTAP，其为甲基硫酸盐)和中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。中性组分介导细胞内释放。另一组递送系统是聚合物纳米颗粒。
作为DNA转染试剂而公知的比如二乙基氨基乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖的聚阳离子可与丁基氰基丙烯酸酯(PBCA)和己基氰基丙烯酸酯(PHCA)组合以配制阳离子纳米颗粒，该阳离子纳米颗粒可递送本文所述的每种成分(优选寡核苷酸)跨细胞膜进入细胞。
除了这些常见的纳米颗粒材料，阳离子肽鱼精蛋白提供了用胶体配制寡核苷酸的替代方法。该胶体纳米颗粒系统可形成所谓的鱼精蛋白类纳米粒子(proticle)，其可通过简单的自组装工艺制备以包装和介导寡核苷酸的细胞内释放。本领域技术人员可以选择和采用任何上述或其它可商购替代赋形剂和递送系统，以包装和递送用于本发明的外显子跳跃分子，以将其递送用于预防、治疗或延缓CEP290相关疾病或病症。“预防、治疗或延缓CEP290相关疾病或病症”在本文中优选地定义为预防、停止、结束由CEP290基因中的基因缺陷引起的部分或完全的视力损害或失明的进展或使其逆转。
另外，根据本发明的外显子跳跃分子可共价地或非共价地连接到经特异性设计的靶向配体以促进摄取到细胞、细胞质和/或其核中。此类配体可包括(i)识别促进细胞摄取的细胞、组织或器官特异性元件的化合物(包括但不限于肽(样)结构)，和/或(ii)能够促进细胞摄取和/或由囊泡(例如核内体或溶酶体)的寡核苷酸的细胞内释放的化学化合物。
因此，在优选的实施方式中，将根据本发明的外显子跳跃分子配制成组合物或药物或组合物，该组合物或药物被提供有至少一种赋形剂、和/或一种用于递送的靶向配体、和/或一种将其递送至细胞和/或增强其细胞内递送的递送装置。
应当理解，如果组合物包含附加的成分比如本文后文所述的辅料化合物，则组合物的每种成分可以不以单一组合或组合物或制剂的形式配制。根据其特性，技术人员将知道哪种类型的剂型对于如本文所述的每种成分最适当。在优选的实施方式中，本发明提供组合物或制剂，其为包含根据本发明的外显子跳跃分子和本文后文所述的另外的辅料化合物的成套部分的形式。
如果需要，可通过添加药学上可接受的载体，将根据本发明的外显子跳跃分子或表达根据本发明的外显子跳跃分子的载体(优选病毒载体)并入药物活性混合物中。
因此，本发明还提供包含根据本发明的外显子跳跃分子或根据本发明的病毒载体和药学上可接受的赋形剂的组合物、优选药物组合物。此类组合物可以包含根据本发明的单一外显子跳跃分子，但也可以包含根据本发明的多种不同的外显子跳跃分子。此类药物组合物可以包含任何药学上可接受的赋形剂，包括载体、填充剂、防腐剂、佐剂、增溶剂和/或稀释剂。此类药学上可接受的载体、填充剂、防腐剂、佐剂、增溶剂和/或稀释剂可以例如在雷明顿(Remington)，2000中找到。所述组合物的每种特征已经较早在本文中定义。
如果使用根据本发明的多种不同的外显子跳跃分子，则本文所定义的浓度或剂量可以是指使用的所有寡核苷酸的总浓度或剂量，或者使用或添加的每种外显子跳跃分子的浓度或剂量。因此，在一个实施方式中，提供一种组合物，其中使用的根据本发明的外显子跳跃分子的单量或总量以在0.0001mg/kg至20mg/kg、优选地0.01mg/kg至20mg/kg的范围的量给药。
根据本发明的优选的外显子跳跃分子是用于治疗个体的CEP290相关疾病或病症。在本发明的所有实施方式中，术语“治疗”应理解为包括CEP290相关疾病或病症的预防和/或延缓。可使用根据本发明的外显子跳跃分子治疗的个体可以已经被诊断为患有CEP290相关疾病或病症。替代地，可使用根据本发明的外显子跳跃分子治疗的个体可以尚未被诊断为患有CEP290相关疾病或病症，但考虑到他或她的遗传背景，可以是在未来具有增加的CEP290相关疾病或病症发生风险的个体。优选的个体是人类。在优选的实施方式中，CEP290相关疾病或病症是莱伯氏先天性黑蒙。
因此，本发明还提供根据本发明的外显子跳跃分子或根据本发明的病毒载体或根据本发明的组合物，其用作用于治疗需要调控CEP290的剪切的CEP290相关疾病或病症的药物，并用作用于预防、治疗或延缓CEP290相关疾病或病症的药物。优选的CEP290相关疾病或病症是莱伯氏先天性黑蒙。所述用途的每种特征已经较早在本文中定义。
本发明还提供使用根据本发明的外显子跳跃分子或根据本发明的病毒载体或根据本发明的组合物，其用于治疗需要调控CEP290的剪切的CEP290相关疾病或病症。在优选的实施方式中，CEP290相关疾病或病症是莱伯氏先天性黑蒙。
本发明还提供根据本发明的外显子跳跃分子或根据本发明的病毒载体或根据本发明的组合物，其用作药物。
本发明还提供用于对在其基因组中携带CEP290基因的内含子26中的突变(c.2991+1655A＞G)的人进行治疗的方法，该方法包括向人施用本发明的AON、病毒载体或药物组合物。这些患者可以患有莱伯氏先天性黑蒙。
本发明的另一实施方式是根据本发明的AON、编码AON的病毒载体和包含AON的药物组合物，其用作对在其基因组中携带CEP290基因的内含子26中的突变(c.2991+1655A＞G)的人进行治疗的药物。
根据本发明的另一实施方式，提供体外和/或离体方法用于调控细胞中CEP290的剪切，所述方法包括使所述细胞与根据本发明的寡核苷酸、编码寡核苷酸的病毒载体或药物组合物接触。
呈(水)溶液、悬浮液、(水包油)乳剂、软膏剂、锭剂、丸剂形式的根据本发明的外显子跳跃分子，可以通过吞咽、注射、吸入、输注、喷雾而经由口服、眼内、肺内、鼻内、肌内、皮下、皮内、直肠施用来向患者全身地、局部地、表面地(topically)施用。优选的施用途径是通过玻璃体内注射水溶液或特别适用于眼内施用的配制物。例如，EP-2,425,814公开了特别适用于眼内(玻璃体内)施用肽或核酸药品的水包油乳剂。该乳剂比玻璃体液密度低，因此它漂浮在玻璃体顶部，避免注射的药品损害视力。
根据施用途径和患者的需要，给药可以每天、每周、每月、每季度、每年一次。
由于疾病的早期发病，所以患有LCA或处于形成LCA症状(包括儿童失明)风险的患者可以在症状的发病之前或之后，在子宫内、直接在出生后、从1、2、3、6月龄、从1岁、从3岁、从5岁治疗，以缓解、减缓发展、停止或逆转疾病的症状等。
根据本发明的用途或方法中的治疗为至少一周、至少一个月、至少若干月、至少一年、至少2、3、4、5、6年或在患者整个生命期间。根据本发明使用的如本文所述的每种外显子跳跃分子或外显子跳跃寡核苷酸或其等同物可以适用于直接施用于已经受感染或处于形成CEP290相关疾病或病症的风险的个体的体内细胞、组织和/或器官，并且可以直接在体内、离体或体外施用。本发明的寡核苷酸、组合物、化合物或辅料化合物的施用频率可以取决于若干参数，例如患者的年龄、外显子跳跃分子的性质(例如，裸(gymnotic)AON或载体化的AON，例如AAV或慢病毒载体表达的AON)、所述分子的剂量、剂型等。
优选地，根据本发明的外显子跳跃分子(优选寡核苷酸)的剂量范围是基于存在严格的方案要求的临床试验(体内使用)中的增加剂量研究来设计的。可以以0.0001mg/kg至20mg/kg、优选0.001mg/kg至20 mg/kg的剂量范围使用如本文所述的寡核苷酸。剂量和治疗方案可以变化很大，这取决于许多因素，包括但不限于施用途径(例如全身地与表面地，例如直接施入眼睛中)、寡核苷酸是作为裸AON还是作为载体化的AON施用、给药方案、患者的年龄和体重等。
在优选的实施方式中，根据本发明作为用于分子的递送工具的如本文较早描述的病毒载体(优选AAV载体)以每次注射1×109至1×1017个病毒颗粒、更优选每次注射1×1010至1×1014、并且最优选1×1010至1×1012个病毒颗粒的范围的剂量施用。
对于本发明所属领域的技术人员将显而易见的是，治疗细节将需要根据并取决于比如以下因素来建立：寡核苷酸的序列和化学性质、施用途径、剂型、剂量、给药方案、形式(病毒载体或裸寡核苷酸)、患者的年龄和体重、疾病阶段等，这可能需要进一步的非临床和临床研究。
本发明还提供用于调控细胞中CEP290的剪切的方法，该方法包括使细胞(优选视网膜细胞)与根据本发明的外显子跳跃分子或根据本发明的病毒载体或根据本发明的组合物接触。该方面的特征优选地为本文较早定义的那些特征。使细胞与根据本发明的外显子跳跃分子或根据本发明的病毒载体或本发明的组合物接触可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。包括使用用于递送本文所述的外显子跳跃分子、病毒载体和组合物的方法。接触可以是直接或间接的并且可以是体内、离体或体外的。
除非另有说明，否则本文所述的每个实施方式可与本文所述的另一实施方式组合。
当人类细胞表达人类CEP290基因时，寡核苷酸减少与人类CEP290基因的内含子26中的c.2991+1655A＞G突变相关联的异常剪切位点的剪切位点选择的能力、以及在生理条件下在影响异常剪切位点的选择的区域中与人类CEP290前体mRNA结合并从而通过细胞剪切机制减少异常剪切位点的选择的能力，可使用本文实验部分中公开的试验方便地进行评定。特别地，可将寡核苷酸与含有c.2991+1655A＞G突变的细胞一起培养，并且可通过例如RT-PCR评定寡核苷酸减少细胞产生包含异常外显子的mRNA的能力。
如在本文的实验部分中可观测到的，在RNA水平上，添加各种靶向异常CEP290外显子的AON确实引起异常剪切的CEP290 mRNA转变为正确剪切的CEP290 mRNA。该转变将与野生型CEP290蛋白质的合成增加一致。
在成纤维细胞(可衍生自皮肤细胞)中大量表达CEP290。因此，预期将AON添加到来自LCA患者的培养的成纤维细胞中将引起可在蛋白质印迹上检测的野生型CEP290蛋白质的量增加，并且因此将证明基于AON的疗法不仅将重引导CEP290 mRNA的正常剪切，而且也将引起CEP290蛋白质功能恢复。
术语“腺嘌呤”、“鸟嘌呤”、“胞嘧啶”、“胸腺嘧啶”、“尿嘧啶”和次黄嘌呤(肌苷中的核碱基)是指核碱基本身。
术语腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷、尿苷和肌苷是指与(脱氧)核糖连接的核碱基。
术语“核苷”是指与(脱氧)核糖连接的核碱基。
在本文及其权利要求中，动词“包括(comprise)”及其变体在其非限制性意义上用于意指包括该词后面的项目，但不排除未特定提及的项目。此外，除非上下文明确要求存在一个且唯一的要素，否则由不定冠词“一”或“一个”对要素的引用不排除存在多于一个要素的可能性。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。
当词“约”或“大约”与数值相关联地使用(例如约10)时，优选地意指该值可以是给定值(10)加上或减去该值的5％。
如本文提供的序列信息不应被如此狭义地解释为需要包含错误鉴定的碱基。本领域技术人员能够鉴定此类错误鉴定的碱基，并且知晓如何改正此类错误。在序列错误的情况下，应以通过含有编码多肽的核酸序列的SEQ ID NO：1中存在的基因的表达可获得的多肽的序列为准。
材料和方法
1：细胞
所有细胞系是由皮肤活组织检查产生的人成纤维细胞。LFB1(CL10-00008)和LFB2(CL12-00027)是野生型，并且代表对照细胞系，LFB3(CL12-00035)和LFB4(CL12-00036)均是CEP290突变(c.2991+1655A＞G)的纯合突变型。
2：AON
使用“基因步行(genewalk)”方法设计AON，其中17mer AON经设计覆盖隐蔽128bp外显子，其中AON之间的重叠区域为大约10bp。设计的RNA AON具有2’-O-甲基硫代磷酸酯化学性质，得自Integrated DNA Technologies(IDT)。
3：细胞培养和转染
所有细胞系在补充有20％FBS和1％丙酮酸钠的DMEM-AQE培养基(Sigma)中生长。在转染前一天，将细胞以2×105/孔的密度接种在6孔板上总体积为2.5 ml的培养基中。转染之日，使用maxPEI(Poliscience)作为转染试剂(全部在PBS中)，以100 nM的最终浓度将待测试的AON添加到每个孔中，其中质量比寡核苷酸：maxPEI为1∶4。24小时后，用PBS洗涤细胞，并使用供应有ReliaPrep RNA细胞微量制备系统试剂盒(ReliaPrep RNA CellMiniprep System kit)(Promega)的BL+TG缓冲液收集细胞裂解物。在-80℃下冷冻细胞裂解物直到进一步使用。
4：样品中wt和mt CEP290的图谱化
a)RNA分离：根据制造商的方案使用ReliaPrep RNA细胞微量制备系统试剂盒(Promega)从在-80℃下贮存的细胞裂解物中分离RNA。在将其储存在-80℃下之前，使用Nanodrop 2000分光光度计(Nanodrop Technologies)定量总RNA。
b)cDNA合成：根据制造商的说明书，使用具有oligodT引物的Verso cDNA合成试剂盒(Verso cDNA synthesis kit)(Thermoscientific)，使用400 ng RNA作为模板合成cDNA。包括非RT样品(不含酶)作为对照，并与其余样品一起进行分析。
c)PCR：为了可视化和定量样品中存在的CEP290的信使RNA的不同谱，使用PCR特异性地扩增涵盖外显子26至外显子27的CEP290mRNA的片段。出于该目的，使用cDNA(2μl，稀释2.5倍)作为模板，使用以下引物进行靶序列的扩增：
ex26_Fw：5′-TGCTAAGTACAGGGACATCTTGC-3′(SEQ ID NO：23)
ex27_Rv：5′-AGACTCCACTTGTTCTTTTAAGGAG-3′(SEQ ID NO：24)。
使用AmpliTaq
Figure BPA0000246392090000251
360 DNA聚合酶(Life technologies；目录号：4398833)进行反应。
Figure BPA0000246392090000252
使用生物分析仪2100(Bioanalyzer 2100)(DNA 1000试剂盒，AgilentTechnologies)分析PCR片段。使用2100 Expert软件(Agilent Technologies)分析结果。
d)RT-qPCR：为了测量CEP290信使RNA的表达水平，分别将野生型和突变型转录本扩增为93bp和117bp片段。人P0大核糖体蛋白mRNA(RPLP0)用于标准化。为此，在含有SYBR选择主混合物(Life Technologies)和400 nM的正向和反向引物(SEQ ID NO 25至SEQ ID NO2528)的qPCR缓冲液(18ul)中扩增cDNA(2ul，稀释10倍)。用于扩增的系统是CFX96实时PCR检测系统(Biorad)，并且条件如下：在50℃下进行UDG活化步骤2 min，接下来在95℃下进行第一个变性步骤2 min，之后进行50次循环的95℃下维持15秒以及在62.5℃下维持1 min。在每次运行结束时进行解链曲线分析，以确定扩增产物的特异性。使用Bio-rad软件对数据进行可视化和处理，并使用比较Ct法(也称为2(-ΔΔC(T))法)进行倍数变化计算。
使用的引物是：
wt_Fw：5′-TGACTGCTAAGTACAGGGACATCTTG-3′(SEQ ID NO：25)
wt-Rv：5′-AGGAGATGTTTTCACACTCCAGGT-3′(SEQ ID NO：26)
mt_Fw：5′-CTGGCCCCAGTTGTAATTTGTGA-3′(SEQ ID NO：27
mt_Rv：5′-CTGTTCCCAGGCTTGTTCAATAGT-3′(SEQ ID NO：28)
对于该反应，SYBR选择主混合物(Life Technologies)以及稀释10倍的cDNA用作模板。
结果和讨论
在最优化转染效率和治疗时间以及浓度(数据未示出)之后评定设计的寡核苷酸对RNA调控的影响。
使用选择性扩增的涵盖外显子26至外显子27的CEP290片段筛选由设计的2’-O-甲基-硫代磷酸酯AON诱导的外显子跳跃的效率。使用生物分析仪2100进行PCR片段的可视化和定量。我们问自己是否可以设计诱导外显子跳跃的AON，如通过确定与wt剪切的mRNA相比较对应于突变剪切的mRNA的PCR片段的水平而建立的，该AON与现有技术中描述的AON相比具有等同或更高效率，同时没有妨碍其制造或治疗用途的结构。该工作鉴定了符合这些标准的11种寡核苷酸(参见图2、表1和表2)。
通过qPCR分析CEP290信使RNA的野生型和突变型转录本的表达水平，证实了用生物分析仪2100获得的结果。倍数变化计算显示，用本发明的反义寡核苷酸进行的治疗将野生型转录本的表达恢复至等于或优于现有技术中描述的AON所实现的水平。
由于不要求本发明的AON在外显子跳跃方面比现有技术的AON进行得更好，所以足以诱导外显子跳跃的性能是足够的。在实例中公开的根据本发明的AON仅是本发明的优选实施方式。可以设计如所要求保护的满足本发明要求的其他AON，它们也涵盖在本发明中。
Figure BPA0000246392090000281
Figure IPA0000246393010000011
Figure IPA0000246393010000021
Figure IPA0000246393010000031
Figure IPA0000246393010000041
Figure IPA0000246393010000051
Figure IPA0000246393010000061
Figure IPA0000246393010000071
Figure IPA0000246393010000081
Figure IPA0000246393010000091
Figure IPA0000246393010000101

Claims (11)

1.一种寡核苷酸，其特征在于所述寡核苷酸由核苷酸序列GGUGGAUCACGAGUUCA(SEQ IDNO:7)组成。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯骨架。
3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸是包含2’-O-低级烷基、烯基、炔基或烷氧基修饰的核糖部分的寡核糖核苷酸。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其中2’-O-低级烷基是2’-O-甲基。
5.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所有的核糖部分均经2’-O-甲基化。
6.一种病毒载体，其在置于有助于人类细胞中分子表达的条件下时，表达根据权利要求1所述的寡核苷酸。
7.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的寡核苷酸或根据权利要求6所述的病毒载体。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的寡核苷酸、根据权利要求6所述的病毒载体或根据权利要求7所述的药物组合物，其用于制造对在其基因组中携带CEP290基因的内含子26中的c.2991+1655A>G突变的人进行治疗的药物。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的寡核苷酸、根据权利要求6所述的病毒载体或根据权利要求7所述的药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用于对在其基因组中携带CEP290基因的内含子26中的c.2991+1655A>G突变的人进行治疗。
10.一种用于调控细胞中CEP290的剪切的体外方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1至5中任一项所述的寡核苷酸、根据权利要求6所述的病毒载体或根据权利要求7所述的药物组合物接触。
11.根据权利要求1至5中任一项所述的寡核苷酸、根据权利要求6所述的病毒载体或根据权利要求7所述的药物组合物在制造用于调控细胞中CEP290的剪切的药物中的用途。
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