JP2018507711A - レーバー先天性黒内障のためのオリゴヌクレオチド療法 - Google Patents

Abstract

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＥＰ２９０遺伝子のイントロン２６の突然変異を標的とし、異常なエクソンがＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡに含まれるのを低減する。本オリゴヌクレオチドは、３つ以下の連続したグアノシンを含み、６０％以下のグアノシンヌクレオベースを有し、最大１つのＣｐＧ配列を含み、かつ／または３つ以上の連続した相補的な塩基対を含むヘアピンを形成する可能性がない。

Description

本出願は、２０１５年２月２７日に出願された英国特許出願第１５０３４０８．５号の優先権を主張し、その完全な内容は、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。

本発明は、オリゴヌクレオチドの分野および疾患の処置のためのそれらの使用に関する。特に、本発明は、レーバー先天性黒内障の処置に使用することができる新規のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）は、小児期の先天性失明の最も一般的な型であり、世界中の新生児のおよそ５０，０００人に１人の有病率が推定される（Koenekoop et al., 2007; Stone, 2007）。これは、網膜ジストロフィーを伴う。疾患症状の発症は、早くも生涯の最初の数ヶ月または数年に起こる（Leber, T., 1869）。遺伝学的にＬＣＡは不均一な病気であり、突然変異がＬＣＡの原因となる１５の遺伝子が今までに特定された（den Hollander et al., 2008; Estrada-Cuzcano et al., 2011）。最も高い頻度で突然変異するＬＣＡ遺伝子はＣＥＰ２９０であり、これは、中心体および繊毛の発生に重要な役割を有する中心体タンパク質２９０をコードする第１２番染色体のＱ腕に位置する遺伝子である。ＣＥＰ２９０遺伝子における突然変異が、全ＬＣＡ症例のうちの約１５％に関与している（Stone, 2007; den Hollander, 2008; den Hollander, 2006; Perrault et al., 2007）。

とりわけ、ヨーロッパ諸国および米国において網膜ジストロフィーに関連する、圧倒的に最も高い頻度で生じるＣＥＰ２９０突然変異は、ＣＥＰ２９０遺伝子のイントロン２６の変化である（ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ）（Stone, 2007; den Hollander et al., 2006; Perrault et al., 2007; Liitink et al., 2010）。この突然変異は、イントロン２６に隠れた（cryptic）スプライスドナー部位を作り出し、この結果、突然変異ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡに１２８ｂｐの異常なエクソンが含まれ、未成熟終止コドンが挿入される（ｐ．Ｃ９９８Ｘ）（図１を参照）。この突然変異をもつ患者では、異常なエクソンのない野生型転写物も依然として産生され、このことは、この突然変異の低形質の性質の説明となる（Estrada-Cuzcano et al., 2011）。

国際公開第２０１３／０３６１０５号パンフレット（Ｓｔｉｃｈｔｉｎｇ Ｋａｔｈｏｌｉｅｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｎｉｊｍｅｇｅｎ）ならびに国際公開第２０１２／１６８４３５号パンフレット（Ｉｎｓｅｒｍら）は、ＣＥＰ２９０のこのイントロン突然変異を標的とするＬＣＡの処置または遅延のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示している。

国際公開第２０１３／０３６１０５号パンフレットおよび国際公開第２０１２／１６８４３５号パンフレットに開示されているアンチセンスオリゴヌクレオチドは、突然変異と関連する隠れたスプライシング部位の選択を低減し、それにより、異常な１２８ｂｐのエクソン配列を含むスプライシングされたＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡの形成を低減する（「エクソンスキッピング」とも呼ばれる）が、製造性および／または免疫学的見地からオリゴヌクレオチド自体に一定の限界があり、それが、ヒトの治療環境におけるそれらの有用性を制限することもある。したがって、ＣＥＰ２９０遺伝子のイントロン２６の突然変異を標的とし、ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡに異常なエクソンが含まれるのを効果的に低減すると同時に先行技術のオリゴヌクレオチドの欠点のいくつかの問題がない新規のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することが本発明の目的である。

したがって、本発明は、ヒトＣＥＰ２９０遺伝子がヒト細胞において発現するときに、前記遺伝子のイントロン２６におけるｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異と関連する異常なスプライシング部位のスプライシング部位選択を低減することができるオリゴヌクレオチドであって、
オリゴヌクレオチドが（ｉ）配列番号１６からなるものではない、かつ／または（ｉｉ）２１以下のヌクレオチドからなり、好ましくは、２０以下のヌクレオチドからなるという条件で、オリゴヌクレオチドの配列が特性（ａ）から（ｄ）：
（ａ）３つ以下の連続したグアノシンを含む、
（ｂ）６０％以下のグアノシンヌクレオベースを有する、
（ｃ）最大１つのＣｐＧ配列を含む、かつ／または
（ｄ）３つ以上の連続した相補的な塩基対を含むヘアピンを形成する可能性がない
のうちの少なくとも１つを有することを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供する。

理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、オリゴヌクレオチドのヒトＣＥＰ２９０ ｐｒｅ−ｍＲＮＡとの相補性は、本オリゴヌクレオチドが、異常なスプライシング部位の選択に影響を及ぼす領域において生理的条件下でヒトＣＥＰ２９０ ｐｒｅ−ｍＲＮＡと結合することができ、前記領域との結合時に、本オリゴヌクレオチドが、細胞のスプライシング機構によるそのスプライシング部位の選択を低減することを意味すると考えている。

オリゴヌクレオチドは、上で定義された特徴（ａ）から（ｄ）の２つ、３つ、さらには４つの組合せを有してもよい。そのような組合せについては、下でさらに詳細に記載する。

本オリゴヌクレオチドは、一般に３０ヌクレオチドよりも短く、例えば、≦２５ｎｔ、≦２１ｎｔ、≦２０ｎｔである。本オリゴヌクレオチドは、１６〜１９ｎｔ長、例えば、１７ｎｔ長であってもよい。

目的とする特定のオリゴヌクレオチド配列は、配列番号２〜１２である。

本オリゴヌクレオチドは、天然のＲＮＡと比較した場合に化学修飾、例えば、ホスホロチオエート骨格、２’−Ｏ−低級アルキル修飾リボース（lower alkyl-modified ribose）部分などを含むことが好ましい。

本オリゴヌクレオチドは、細胞に直接与えられてもよく、または、例えば、ウイルスベクターのｉｎ ｓｉｔｕ転写によって間接的に与えられてもよい。どのようにそれらが供給されても、ゲノムにおいてＣＥＰ２９０遺伝子のイントロン２６に突然変異（ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ）があるヒトを処置するためにｉｎ ｖｉｖｏにおいて治療効果をもたらすよう使用することができる。

１２８ｂｐの隠れたエクソン（下線を引いた、配列番号１）プラス３０ｂｐの下流を含むヒトゲノムのセンス鎖（配列番号３０）を示す図である。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの位置（配列番号２〜１２）ならびに先行技術のＡＯＮ（配列番号１３〜２２）も示す。隠れたエクソンの下流のｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異をゲノム配列中に小文字で示す。 先行技術ＡＯＮと比較した、非処置患者細胞（ＮＴ）、非相補的（センス）オリゴヌクレオチド（ＳＯＮ−３、配列番号２９）または本発明による相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮＰ）により処置された患者細胞のＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡスプライシングプロファイルを示す図である。野生型フラグメントは、およそ１０９ｂｐに移動するバンドに対応し、突然変異フラグメントは、およそ２３７ｂｐに移動するバンドに対応する。２３７ｂｐのフラグメントの上に移動するフラグメントは、異常なスプライシングの他の形態であると考えられる。健康な対照は、野生型プロファイルのみを示す一方で、患者は、野生型フラグメントおよび突然変異フラグメントの両方の存在を示す。指定されたオリゴヌクレオチドは、効率的に標的突然変異配列のエクソンスキッピングを誘導するため、野生型ｍＲＮＡプロファイルを回復させることができる。 ｘ軸に示されるＡＯＮによる処置後の患者サンプルにおけるＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡの発現を示す図である。変化倍率（ｙ軸）を、比較Ｃｔ法を使用して算出した。野生型ｍＲＮＡ（黒いバー）および突然変異ｍＲＮＡ（灰色のバー）のレベルを非処置サンプルと比較した。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。非処置患者サンプル対処置患者サンプルにおける野生型転写物のレベル間の差の統計分析を、対応のあるｔ−検定を使用して行った。結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後に野生型転写物のレベルの有意差（ｐ＜０．０５）を示すが、同じセンスオリゴヌクレオチドによる処置後には有意差を示さない。（ＳＯＮ−３ ｐ＝０．２５０７、ＡＯＮＰ４ ｐ＝０．０００２、ＡＯＮＰ１３ ｐ＝０．０００１、ＡＯＮＰ２６ ｐ＜０．０００１、ＡＯＮ−３ ｐ＝０．００３４、ＥＳＥ（＋５０＋７０）ｐ＝０．０１９３）

驚くべきことに、ここで、ＣＥＰ２９０ ｐｒｅ−ｍＲＮＡにおける隠れた１２８ｂｐのエクソンの異常なスプライシングをブロックまたは低減することができ、ヒトにおける治療的使用のための要件を満たすアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を設計することができることが実証された。

したがって、本発明によるＡＯＮは、等しく重要ではあるが機能的なだけでなく、先行技術のエクソンスキッピングＡＯＮとは対照的に、大量製造後の精製（不純物）および分析、溶解性（例えば、Ｇ−テトラド（tetrad）のスタッキングのため）、体内分布、細胞取り込み、免疫原性および／または全般的な機能の低下に関連する問題の原因となる反復したＧ配列（Ｇ−テトラドもしくは四重鎖とも呼ばれる４つ以上のＧ配列などの３つ以上のＧ配列）などの凝集体または多重鎖（multiplex）を形成する傾向がある配列がない。

本発明によるＡＯＮは、６０％を超える、より好ましくは５０％を超える、さらにより好ましくは４０％を超えるグアノシンヌクレオチドを含まない。

さらに、本発明のＡＯＮは、１つ以下のＣｐＧ配列を含み、好ましくは、ＣｐＧ配列を含まない。ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９が関係する反応によりヒト免疫系を誘導することが知られている。

さらに、先行技術において開示されているいくつかのエクソンスキッピングＡＯＮとは対照的に、本発明のＡＯＮは、長い逆方向反復（ヘアピンまたはその他の二重鎖構造を作り出す可能性のある配列）を含まない。この長い逆方向反復は、精製および分析に問題をもたらす可能性があり、免疫原性、細胞取り込みの低下および／または全般的な機能の低下と関連づけられる。

したがって、第１の態様において、本発明は、ヒトＣＥＰ２９０遺伝子がヒト細胞において発現するときに、前記遺伝子のイントロン２６におけるｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異と関連する異常なスプライシング部位のスプライシング部位選択を低減することができるオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドは、異常なスプライシング部位の選択に影響を及ぼす領域においてヒトＣＥＰ２９０ ｐｒｅ−ｍＲＮＡと相補的であり、生理的条件下においてそれと結合することができ、前記領域との結合時に、前記細胞におけるスプライシング機構による前記スプライシング部位の選択を低減し、
オリゴヌクレオチドが配列番号１６からなるものではないという条件で、オリゴヌクレオチドの配列が特性（ａ）から（ｄ）：
（ａ）３つ以下の連続したグアノシンを含む、
（ｂ）６０％以下のグアノシンヌクレオベースを有する、
（ｃ）最大１つのＣｐＧ配列を含む、かつ／または
（ｄ）３つ以上の連続した相補的な塩基対を含むヘアピンを形成する可能性がない
のうちの少なくとも１つを有することを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供する。

特性（ａ）によると、本オリゴヌクレオチドは、ＧｐＧジヌクレオチド配列を含んでもよいが、配列に３つ以下の連続したグアノシンヌクレオベースが存在する。したがって、それより長いひと続きのグアノシンリピート（guanosine repeat）であるグアノシンテトラドが存在しない。

特性（ｂ）によると、本オリゴヌクレオチドは、グアノシンヌクレオベースを含んでもよいが、本オリゴヌクレオチドの６０％以下の個々のヌクレオベースがグアノシンであってよい。５０％以下、好ましくは４０％以下のヌクレオベースがグアノシンであるのが理想的である。

特性（ｃ）によると、本オリゴヌクレオチドは、１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含んでもよいが、それ以上は含んではならない。一部の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチド配列を含まない。

特性（ｄ）によると、本オリゴヌクレオチドは、自己相補的であり、それにより、オリゴヌクレオチド内で互いにハイブリダイズして、３塩基対以上のヘアピン（分子内二本鎖）を形成する可能性があるか、または異なるオリゴヌクレオチドにおいて互いにハイブリダイズして分子間二本鎖を形成する可能性がある３ヌクレオチド以上の配列を除外する。

また、オリゴヌクレオチドの配列は、３つを超える連続したシチジンヌクレオベースを有すべきではないことが好ましい。さらに一般に、一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドの配列は、あらゆるひと続きの３つ以上の連続した同一のヌクレオベースを含まない。例えば、それは、ＡｐＡｐＡ、ＣｐＣｐＣ、ＧｐＧｐＧ、またはＵｐＵｐＵトリヌクレオチドのいずれも含まない。

第２の態様において、本発明は、ヒトＣＥＰ２９０遺伝子がヒト細胞において発現するときに、前記遺伝子のイントロン２６のｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異と関連する異常なスプライシング部位のスプライシング部位選択を低減することができるオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドは、異常なスプライシング部位の選択に影響を及ぼす領域においてヒトＣＥＰ２９０ ｐｒｅ−ｍＲＮＡと相補的であり、生理的条件下でそれと結合することができ、前記配列との結合時に、前記細胞におけるスプライシング機構による前記スプライシング部位の選択を低減し、
オリゴヌクレオチドが２１以下（好ましくは２０以下）のヌクレオチドからなり、その配列が特性（ａ）から（ｄ）：
（ａ）３つ以下の連続したグアノシンを含む、
（ｂ）６０％以下のグアノシンヌクレオベースを有する、
（ｃ）最大１つのＣｐＧ配列を含む、かつ／または
（ｄ）３つ以上の連続した相補的な塩基対を含むヘアピンを形成する可能性がない
のうちの少なくとも１つを有することを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供する。

さらに、本発明の第３の態様は、ヒトＣＥＰ２９０遺伝子がヒト細胞において発現するときに、前記遺伝子のイントロン２６のｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異と関連する異常なスプライシング部位のスプライシング部位選択を低減することができるオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端ヌクレオチドがｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異に対してアンチセンスである位置のシチジンである、オリゴヌクレオチドを提供する。このオリゴヌクレオチドはまた、特性（ａ）から（ｄ）のうちの少なくとも１つを有してもよい。

第４の態様において、本発明は、ヒトＣＥＰ２９０遺伝子がヒト細胞において発現するときに、前記遺伝子のイントロン２６のｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異と関連する異常なスプライシング部位のスプライシング部位選択を低減することができるオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドは、配列５’−ａｔｇｇｔｇｔｃｇａｔｃｔｃｃｔｇａａｃｔｃｇｔｇａ−３’（配列番号３１、配列番号１のヌクレオチド３１〜５６）の少なくとも一部と相補的な少なくとも１０ヌクレオチドの配列を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。それにより、このオリゴヌクレオチドは、配列番号３１の任意の部分とアニールするが、潜在的なスプライシングエンハンサー配列であるその中心の８ｍｅｒ、すなわち５’−ａｔｃｔｃｃｔｇ−３’（配列番号３２）と相補的な少なくとも１つのヌクレオチドを常に含むことになる。ＡＯＮＰ１１、１２および１３がそのようなオリゴヌクレオチドの例であり、そのそれぞれが、中心の８ｍｅｒである５’−ｃａｇｇａｇａｔ−３’（配列番号３６、図１を参照）からの少なくとも１つのヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドはまた、特性（ａ）から（ｄ）のうちの少なくとも１つを有してもよい。

本発明のオリゴヌクレオチドは、前記特性（ａ）から（ｄ）のうちの１つ超を有するのが理想的である。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、特性（ａ）および（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｃ）および（ｄ）；または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のすべてを有してもよい。

以下の表は、先行技術のＡＯＮを示し、製造、精製、分析、凝集体形成、免疫原性および／またはそれらと関連づけられる機能の低下に関連する問題を防ぐために避けるべき特徴を強調（太字）する。

本発明による好ましいＡＯＮを下記表に示す：ＡＯＮＰ２（配列番号２）、ＡＯＮＰ３（配列番号３）、ＡＯＮＰ４（配列番号４）、ＡＯＮＰ１１（配列番号５）、ＡＯＮＰ１２（配列番号６）、ＡＯＮＰ１３（配列番号７）、ＡＯＮＰ１９（配列番号８）、ＡＯＮＰ２０（配列番号９）、ＡＯＮＰ２３（配列番号１０）、ＡＯＮＰ２４（配列番号１１）およびＡＯＮＰ２６（配列番号１２）：

この表のＡＯＮにおいて、実質的にすべてのリボース部分は、２’−Ｏ−メチル化されており、実質的にすべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートである。

本発明によるより好ましいＡＯＮは、ＡＯＮＰ４、ＡＯＮＰ１３およびＡＯＮＰ２６の配列を有するものであり、実質的にすべて２’−Ｏ−メチル−リボース部分および実質的にすべてホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有するものであることがさらにより好ましい。

本発明のすべての実施形態において、「スプライシングを調節すること」および「エクソンスキッピング」という用語は同義である。ＣＥＰ２９０に関して、「スプライシングを調節すること」または「エクソンスキッピング」は、ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡ（図１を参照）から異常な１２８ヌクレオチドのエクソン（配列番号１またはそのアレル型）を排除することと解釈されるべきである。エクソンスキッピングという用語は、本明細書において、エクソンスキッピングされていない成熟ｍＲＮＡに存在することになろう特定のエクソンを含まない成熟ｍＲＮＡを細胞内で誘導することと定義される。エクソンスキッピングは、スプライシングの生化学的プロセスを可能にするために必要とされる、例えば、（隠れた）スプライスドナー配列もしくは（隠れた）スプライシングアクセプター配列などの配列を妨害することができる分子を用いて、またはひと続きのヌクレオチドを成熟ｍＲＮＡに含まれるべきエクソンと認識するために必要とされるエクソン選択シグナル（exon inclusion signal）を妨害することができる分子を用いて前記成熟ｍＲＮＡのｐｒｅ−ｍＲＮＡを発現する細胞をもたらすことによって達成される。そのような分子は、本明細書においてはエクソンスキッピング分子と呼ばれる。

ｐｒｅ−ｍＲＮＡという用語は、転写によって細胞でＤＮＡ鋳型から合成されるプロセシングされていないか、または部分的にプロセシングされた前駆体ｍＲＮＡを指す。

「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子、ｈｎＲＮＡ（ヘテロ核ＲＮＡ）またはｍＲＮＡ分子中の標的ヌクレオチド配列と相補的であり、その結果、その対応する標的配列とアニーリングすることができるヌクレオチド配列を指すものと理解される。

「相補的な」という用語は、本明細書中で使用される場合、「完全に相補的な」と、通常、オリゴヌクレオチドとその対応する標的配列との間の相補性の程度が８０％超、好ましくは８５％超、さらにより好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超になることを意味する「実質的に相補的な」とを含む。例えば、その配列とその標的配列との間に１つのミスマッチを含む２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対する、相補性の程度は９５％である。

アンチセンス配列の相補性の程度は、アンチセンス配列を含む分子が生理的条件下においてＲＮＡ分子中の標的ヌクレオチド配列とアニーリングすることができ、それによりエクソンスキッピングを促進するようにされることが好ましい。特定のミスマッチは、他のものよりも融解温度すなわちＴｍを単位として表されるＡＯＮと標的配列との間の結合の強度に対する影響が小さいため、特定のミスマッチは他のものより許容されることが当業者にはよく知られている。特定の非相補的な塩基対は、真のミスマッチほどではないにせよ全体的な結合を妨げるゆらぎを生じる場合もある。ＡＯＮの長さも結合の強度に影響を与え、長いＡＯＮは、通例、短いＡＯＮよりも高い融解温度を有し、オリゴヌクレオチドのＧ／Ｃ含有量も結合の強度を決定する要素であり、Ｇ／Ｃ含有量が高いと任意の所与の長さに対する融解温度がより高くなる。本発明によって意図されるとおりのヌクレオベースまたは糖・リン酸骨格の特定の化学修飾も結合の強度に影響を与える可能性があるため、相補性の程度は、本発明によるオリゴヌクレオチドを設計するときに考慮すべき一要素に過ぎない。

オリゴヌクレオチド中の１つＣｐＧまたは多数（２つ以上）のＣｐＧの存在は、通常、前記オリゴヌクレオチドの免疫原性の増加と関連づけられる（Dorn and Kippenberger, 2008）。この免疫原性の増加は、処置される組織、すなわち、眼に損傷を引き起こす可能性もあるため望ましくない。

本発明は、許容できるＲＮＡ結合動態および／または熱力学的特性を有するオリゴヌクレオチドを設計することを可能にする。ＲＮＡ結合動態および／または熱力学的特性は、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ、基礎のＴｍおよび最隣接モデルを使用して単鎖ＲＮＡに対するオリゴヌクレオチド特性計算機（ｗｗｗ．ｕｎｃ．ｅｄｕ／〜ｃａｉｌ／ｂｉｏｔｏｏｌ／ｏｌｉｇｏ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）により算出される）および／またはＡＯＮ標的エクソン複合体の自由エネルギー（ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅバージョン４．５を使用）によって少なくとも部分的に決定される。Ｔｍが高すぎると、オリゴヌクレオチドは、あまり特異的でなくなることが予想される。許容できるＴｍおよび自由エネルギーは、オリゴヌクレオチドの配列、骨格（ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ペプチド−核酸など）の化学的性質、糖部分の性質（リボース、デオキシリボース、置換リボース、分子内架橋）およびヌクレオベースの化学修飾により決まる。したがって、Ｔｍの範囲は、広く変化する場合がある。

本発明は、特定の長さのオリゴを有する全部の隠れたエクソンのマイクロウォーキング（microwalking）によって本発明によるＡＯＮを設計するための方法を提供する。本発明者らが選択したオリゴの長さは１７ヌクレオチドであったが、別の長さも可能である。長いオリゴヌクレオチドほど、製造するために費用がかかり、分析的な観点からさらに複雑であるため、標的ＲＮＡとの安定した相互作用および標的配列に対する特異性を可能にするだけ十分に長いが、必要以上には長くない長さを有することが好ましい。その後、例に示されるとおり、全部の隠れたエクソンまたはその一部は、エクソンスキッピングのそれらの効果に関してｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて試験される一連の重複オリゴヌクレオチドを作製することによって有効なエクソンスキッピング分子に関して精査されてもよい。代替的アプローチにおいて、隠れたエクソンは、潜在的スプライシング促進モチーフ（splicing enhancing motif）に関して探索され、さまざまなＡＯＮがそうしたモチーフに対して設計される。満足のいくエクソンスキッピング効果を証明したＡＯＮは、その後、製造性、免疫原性および本明細書において示されるその他の有用性基準に基づいてさらに選択される。

逆の方策も可能である。この方策によると、製造性、免疫原性および本発明によって提供されるその他の有用性基準に基づいてまずオリゴが設計され、その後、エクソンスキッピング効果に関して試験される。前記オリゴヌクレオチドの機能活性は、好ましくは、一定の程度まで、および／または少なくとも部分的に異常なＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡの産生を低減する異常な１２８ヌクレオチドのＣＥＰ２９０エクソン（配列番号１）のスキッピングを誘導し、それにより、ｗｔ ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡの産生を増加させる。好ましい実施形態において、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定される異常な１２８ヌクレオチドのＣＥＰ２９０エクソン（配列番号１）スキッピングパーセンテージが、少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％であるとき、オリゴヌクレオチドは、異常な１２８ヌクレオチドのＣＥＰ２９０エクソン（配列番号１）のスキッピングを誘導すると考えられる。

スキッピングパーセンテージ（またはスプライシング部位スキッピングの効率）は、サイクル数が、増幅が依然として指数関数的段階にあるような条件で、任意の所与のプライマーセットに関して、所与の数のＰＣＲサイクル後の増幅された突然変異体バンドの濃度で割り、１００％を掛けた増幅された野生型バンドの濃度を求めることによって算出されてもよい。

本発明による好ましいＡＯＮは、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定される場合に、非処置細胞と比較してＡＯＮ処置した細胞において７０％超、より好ましくは８０％超、さらにより好ましくは９０％超のスキッピングパーセンテージを示すものである。

好ましくは、配列番号１に示されるとおりのヌクレオチド配列と相補的な配列を含む本発明によるＡＯＮは、相補的な部分が、標的配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最大１００％相補的であるようにされる。前記オリゴヌクレオチドの前記相補的な部分の長さは、好ましくは少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドである。さらに好ましい実施形態によると、相補的な部分の長さは、約１２から約２５ヌクレオチドの間、より好ましくは１４から約２０ヌクレオチドの間、最も好ましくは１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドである。好ましくは、オリゴヌクレオチドの相補的な部分の長さは、オリゴヌクレオチドの長さと同じであり、これは、標的ＲＮＡと塩基対を形成しないオリゴの５’末端または３’末端がないことを意味する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドに関する好ましい長さは、３０ヌクレオチド以下、例えば、＜２５、＜２０または１６〜１９ヌクレオチドである。

したがって、相補性の領域にあるすべての塩基が対向する鎖にある塩基と対形成することができることが絶対に必要とされる訳ではない。例えば、オリゴヌクレオチドを設計するとき、例えば、相補的な鎖にある塩基と塩基対にならない残基を組み込むことを望むこともできる。細胞の環境下において、ひと続きのヌクレオチドが相補的な部分と十分にハイブリダイズすることができるなら、ミスマッチは、ある程度許容される場合もある。この文脈において、「十分に」は、本発明によるＡＯＮが隠れた１２８ｂｐのエクソンのエクソンスキッピングを誘導することができることを意味する。標的とされる（隠れた）エクソンのスキッピングは、好都合にもＲＴ−ＰＣＲによって評価することができる。相補的な領域は、組み合わされる場合、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのエクソンに特異的であるよう設計されることが好ましい。そのような特異性は、この系の他の（ｐｒｅ−）ｍＲＮＡ分子にある実際の配列に依存するため、さまざまな長さの相補的な領域を用いて作り出すことができる。オリゴヌクレオチドのサイズを増加させることでオリゴヌクレオチドが１つ以上の他のｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子ともハイブリダイズすることができることになるリスクは低下する。相補性の領域にミスマッチを含むが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡの標的とされる領域（複数可）とハイブリダイズする能力および／または結合する能力を保持するオリゴヌクレオチドを本発明に使用することができることは明らかである。しかしながら、相補的な部分は、一般に１つ以上の相補的な領域にそのようなミスマッチを有するオリゴヌクレオチドよりも高い効率および高い特異性を有するため、少なくとも相補的な部分は、そのようなミスマッチを含まないことが好ましい。さらに高いハイブリダイゼーション強度（すなわち、対向する鎖との相互作用の数を増加させる）は、系のスプライシング機構を妨害するプロセスの効率を増加させる際に有利であると考えられる。好ましくは、相補性は、９０％から１００％である。一般に、これは、２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに１もしくは２つのミスマッチ、または４０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに１、２、３もしくは４つのミスマッチ、または６０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに１、２、３、４、５もしくは６つのミスマッチなどを許容する。

本発明のエクソンスキッピング分子は、好ましくは、配列番号１と相補的な（アンチセンス）オリゴヌクレオチドである。

エクソンスキッピング分子がｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異を含む配列番号１の少なくとも一部と結合するか、もしくはその配列番号１の少なくとも一部と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、またはそれからなる本発明のこれらの実施形態において、前記エクソンスキッピング分子は、配列番号１の突然変異した「Ｇ」ヌクレオチドと相補的な位置にある「Ｃ」ヌクレオチドを含むことが好ましい。

特定の実施形態において、本発明は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、または好ましくはそれからなるエクソンスキッピング分子を提供する。

さらに好ましい実施形態において、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列番号４、配列番号７もしくは配列番号１１を含むか、または好ましくはそれからなるエクソンスキッピング分子を提供する。これらのＡＯＮは、異常な１２８ヌクレオチドのＣＥＰ２９０エクソンのスプライシングを調節する際に極めて有効であると同時に、Ｇ−テトラド、６０％（５０％または４０％）を超えるグアノシンヌクレオベース組成、１つ（１つ超）のＣｐＧ配列、３つ超の連続した塩基対を含むヘアピン構造を形成する可能性がある配列を含まないことがわかった。

一部の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１６からなるものではない。一部の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１６を含まない。一部の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列ｇｃｇｇｕｇｇｃｕｃａｃａｕｃｕｇｕａａｕｃ（配列番号３３）、ｇｇｇｃｇｃｇｇｕｇｇｃｕｃａｃａｕｃｕｇｕａ（配列番号３４）、またはｃｇｃｇｇｕｇｇｃｕｃａｃａｕｃｕｇｕ（配列番号３５）からなるＲＮＡではない。

本発明によるエクソンスキッピング分子は、１つ以上のＤＮＡ残基（したがって、ＲＮＡ「ｕ」残基がＤＮＡ対応物として「ｔ」残基になる）、もしくは１つ以上のＲＮＡ残基、および／または本明細書の下でさらに詳述されることになる１つ以上のヌクレオチドアナログもしくは等価物を含んでもよい。配列番号２から１２はＲＮＡ配列であるが、本発明は、ＤＮＡ形態のこれらの各配列、およびこれらの配列のＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドも包含する。

本発明のエクソンスキッピング分子は、ヌクレアーゼ耐性を高めるため、および／または標的配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を高めるために修飾された１つ以上の残基を含むことが好ましい。ゆえに、好ましい実施形態において、本アンチセンスヌクレオチド配列は、少なくとも１つのヌクレオチドアナログまたは等価物を含み、ヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾塩基、および／または修飾骨格、および／または非天然のヌクレオシド間結合あるいはこれらの修飾の組合せを有する残基と定義される。

好ましい実施形態において、本ヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾骨格を含む。そのような骨格の例は、モルフォリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチル（formacetyl）およびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル（riboacetyl）骨格、アルケン含有骨格、スルファメート、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、およびアミド骨格によって提供される。ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーは、アンチセンス薬剤として以前に調査された修飾骨格オリゴヌクレオチドである。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのデオキシリボース糖が六員環で置換され、ホスホジエステル結合がホスホロジアミデート結合で置換された無荷電骨格を有する。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、酵素分解に耐性があり、ＲＮａｓｅ Ｈを活性化することよりむしろ翻訳を阻止すること、またはｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングを妨げることによってアンチセンス薬剤として働くようである。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、細胞膜を物理的に破壊する方法によって首尾よく組織培養細胞に送達され、こうしたいくつかの方法を比較した研究の１つは、スクレープローディング（scrape loading）が最も効率的な送達の方法であることを見出したが、モルフォリノ骨格は荷電していないため、カチオン性脂質は、細胞へのモルフォリノオリゴヌクレオチド取り込みの有効なメディエーターではない。最近の報告は、モルフォリノオリゴヌクレオチドによる三重鎖形成を実証し、非イオン性骨格のため、モルフォリノオリゴヌクレオチドがマグネシウムの非存在下において三重鎖を形成することができることをこれらの研究は示した。

骨格の残基間の結合がリン原子を含まないことがさらに好ましく、例えば、短鎖アルキルによって形成される結合またはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合したヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合または１つ以上の短鎖ヘテロ原子結合もしくは複素環式ヌクレオシド間結合である。

好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾ポリアミド骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（Nielsen, et al. (1991) Science 254, 1497-1500）。ＰＮＡベースの分子は、塩基対の認識に関してＤＮＡ分子の真の模倣物である。ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から構成され、ヌクレオベースは、メチレンカルボニル結合によって骨格と連結される。代替的な骨格は、炭素１つ伸長したピロリジンＰＮＡモノマーを含む（Govindaraju and Kumar (2005) Chem. Commun, 495-497）。ＰＮＡ分子の骨格は荷電したリン酸基を含まないため、ＰＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、通常、それぞれＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりも安定している（Egholm et al. (1993) Nature 365, 566-568）。

さらに好ましい骨格は、モルフォリノヌクレオチドアナログまたは等価物を含み、その中のリボースまたはデオキシリボース糖がモルフォリノ六員環（6-membered morpholino ring）で置換されている。最も好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含み、その中のリボースまたはデオキシリボース糖がモルフォリノ六員環で置換されており、隣接するモルフォリノ環間のアニオン性ホスホジエステル結合が非イオン性ホスホロジアミデート結合によって置換されている。

さらに別の実施形態において、本発明のヌクレオチドアナログまたは等価物は、ホスホジエステル結合にある１つの非橋架酸素の置換を含む。この修飾は、塩基対合をやや不安定にするが、ヌクレアーゼ分解に対する著しい耐性を付加する。好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネートおよび３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノリン酸またはボラノリン酸を含む。

本発明のさらに好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、例えば、−ＯＨ；−Ｆ；１つ以上のヘテロ原子の割り込みがあってもよい置換または非置換、直鎖または分岐の低級（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アリル、またはアラルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アリル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、−メトキシ、−アミノプロポキシ；メトキシエトキシ；−ジメチルアミノオキシエトキシ；および−ジメチルアミノエトキシエトキシにより２’、３’および／または５’位において一置換または二置換された１つ以上の糖部分を含む。糖部分は、フラノースもしくはその誘導体、またはデオキシフラノースもしくはその誘導体、好ましくは、リボースもしくはその誘導体またはデオキシリボースもしくはその誘導体であってもよい。好ましい誘導体化糖部分は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、その中の２’−炭素原子が糖環の３’または４’炭素原子と連結され、それにより二環式の糖部分を形成する。好ましいＬＮＡは、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン−架橋化核酸を含む（Morita et al. 2001. Nucleic Acid Res Supplement No. 1: 241-242）。これらの置換は、ヌクレオチドアナログまたは等価物をＲＮａｓｅ Ｈおよびヌクレアーゼ耐性にし、標的ＲＮＡに対する親和性を高める。

別の実施形態において、本発明のヌクレオチドアナログまたは等価物は、１つ以上の塩基修飾または置換を含む。修飾塩基は、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび当該技術分野において知られているか、または知られることになるピリミジ塩基およびプリン塩基の他の−アザ、デアザ、−ヒドロキシ、−ハロ、−チオ、チオール、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、チオアルキル誘導体などの合成および天然の塩基を含む。

アンチセンスオリゴヌクレオチドのすべての位置が均一に修飾されている必要はないことが当業者に理解される。さらに、上記のアナログまたは等価物の１つ超が、１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはさらにはアンチセンスオリゴヌクレオチド内の１つの位置に組み込まれてもよい。特定の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの異なる種類のアナログまたは等価物を有する。

別の実施形態によると、本発明によるＡＯＮは、２’−Ｏ（好ましくは、低級）アルキルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾リボース、２’−Ｏ−エチル修飾リボース、２’−Ｏ−プロピル修飾リボース、および／またはハロゲン化誘導体などのこれらの修飾の置換誘導体を含む。

本発明による有効で好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を伴う２’−Ｏ−メチル修飾リボース部分を含み、好ましくは、実質的にすべてのリボース部分が２’−Ｏ−メチルであり、実質的にすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。

ＣＥＰ２９０の異常な１２８ヌクレオチドのエクソンの効率的なスキッピングのために、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドが組み合わされてもよいことも当業者は理解するであろう。隠れたエクソンの同じ領域か、または異なる領域を標的とする２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの組合せが本発明の方法に使用されてもよく、これは例えば、２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、３つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド、４つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド、または５つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドなどである（図１）。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞、好ましくは、網膜細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みを高める部分に連結されてもよい。そのような部分の例は、コレステロール、炭水化物、ビタミン、ビオチン、脂質、リン脂質、細胞透過性ペプチドであり、以下に限定されるものではないが、アンテナペディア、ＴＡＴ、トランスポータンおよびオリゴアルギニン（oligoarginine）、ポリアルギニン、オリゴリジン（oligolysine）またはポリリジンなどの正電荷アミノ酸、抗体によってもたらされるものなどの抗原結合ドメイン、抗体のＦａｂフラグメント、またはラクダ科動物のシングルドメイン抗原結合ドメインなどの単鎖抗原結合ドメインを含む。

本発明によるエクソンスキッピング分子は、当該技術分野において既知の適した手段を使用して間接的に投与されてもよい。エクソンスキッピング分子がオリゴヌクレオチドである場合、例えば、前記オリゴヌクレオチドを含む転写物をコードする発現ベクターの形態で個体または前記個体の細胞、組織もしくは臓器に与えられてもよい。発現ベクターは、好ましくは細胞、組織、臓器または個体に遺伝子送達媒体により導入される。好ましい実施形態において、本明細書において特定されるエクソンスキッピング分子の発現または転写を駆動する発現カセットまたは転写カセット（transcription cassette）を含むウイルスベースの発現ベクターが提供される。したがって、本発明は、エクソンスキッピング分子の発現を促す条件下に置かれたときに本発明によるエクソンスキッピング分子を発現させるウイルスベクターを提供する。プラスミドによるアンチセンスオリゴヌクレオチド発現またはアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベースのベクターによってもたらされるウイルス発現によって、異常な１２８ヌクレオチドのＣＥＰ２９０エクソンの極めて効率的なスキッピングをもたらす必須の配列を妨害することができるエクソンスキッピング分子を細胞に与えてもよい。発現は、Ｕ１、Ｕ６、またはＵ７ ＲＮＡプロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって駆動されてもよい。好ましい送達媒体は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）などのウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターなどである。また、プラスミド、人工染色体、標的相同組み換えおよび細胞のヒトゲノムへの組み込みに使用可能なプラスミドが、本明細書中で定義されるオリゴヌクレオチドの送達に適切に利用されてもよい。転写がＰｏｌＩＩＩプロモーターから行われ、かつ／または転写物がＵ１またはＵ７転写物との融合物の形態であるそうしたベクターが本発明に好ましく、これが小さな転写物の送達に関して良好な結果をもたらす。適した転写物を設計することは技術のある技術者の範囲内にある。ＰｏｌＩＩＩによる転写物が好ましい。Ｕ１またはＵ７転写物との融合転写物の形態が好ましい。そのような融合物は、記載されているとおりに作り出すことができる（Gorman L et al., 1998またはSuter D et al., 1999）。

好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド発現系の１つは、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターである。異常な１２８ヌクレオチドのＣＥＰ２９０エクソンの極めて効率的なスキッピングための小さなアンチセンスヌクレオチド配列の長期の発現のために使用することができる単鎖および二重鎖ＡＡＶベースのベクターが開発された。

好ましいＡＡＶベースのベクターは、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって駆動される発現カセットを含む。好ましいＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、例えば、Ｕ１、Ｕ６、またはＵ７ ＲＮＡプロモーターである。

したがって、本発明は、異常な１２８ヌクレオチドのＣＥＰ２９０エクソンのスキッピングを誘導するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現のためのＰｏｌ ＩＩＩプロモーター駆動発現カセットを含むウイルスベースのベクターも提供する。

本発明によるＡＡＶベクターは組み換えＡＡＶベクターであり、本明細書中の別の場所で示したＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質のタンパク質の殻に包まれた本発明によるコード化エクソンスキッピング分子を含むＡＡＶゲノムの部分を含むＡＡＶベクターを指す。ＡＡＶゲノムの部分は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびその他などのアデノ随伴ウイルス血清型由来の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含んでもよい。カプシドタンパク質から構成されるタンパク質の殻は、ＡＡＶ１、２、３、４、５、８、９およびその他などのＡＡＶ血清型由来のものであってもよい。タンパク質の殻は、カプシドタンパク質の殻と呼ばれる場合もある。ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ遺伝子の１つまたは好ましくはすべてが除去されていてもよいが、依然として機能的なＩＴＲ核酸配列を含んでもよい。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキューおよびパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は、機能的なままである限り、野生型配列であってもよく、または野生型配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５、もしくは１００％の配列同一性を有してもよく、または例えば、ヌクレオチドの挿入、突然変異、欠失もしくは置換によって改変されていてもよい。この状況において、機能性とは、カプシドの殻へのゲノムのパッケージングを指示し、その結果、感染した宿主細胞または標的細胞における発現を可能にさせる能力を指す。本発明の状況において、カプシドタンパク質の殻は、ＡＡＶベクターゲノムＩＴＲと異なる血清型のものであってもよい。したがって、本発明によるＡＡＶベクターは、カプシドタンパク質の殻、すなわち、正二十面体のカプシドから構成されてもよく、それが、１つのＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３）を含み、一方、ＡＡＶ５ベクターに含まれるＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ベクターを含む任意の上記のＡＡＶ血清型であってもよい。したがって、「ＡＡＶ２ベクター」は、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、例えば、「ＡＡＶ５ベクター」は、ＡＡＶ血清型５のカプシドタンパク質の殻を含み、それにより、どちらも本発明による任意のＡＡＶベクターゲノムＩＴＲを包んでもよい。

好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２、５、８またはＡＡＶ血清型９のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２、５、８またはＡＡＶ血清型９に由来する。そのようなＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ５／２、ＡＡＶ５／５、ＡＡＶ５／８、ＡＡＶ５／９、ＡＡＶ８／２、ＡＡＶ８／５、ＡＡＶ８／８、ＡＡＶ８／９、ＡＡＶ９／２、ＡＡＶ９／５、ＡＡＶ９／８、またはＡＡＶ９／９ベクターと呼ばれる。

より好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲはＡＡＶ血清型５に由来し、そのようなベクターは、ＡＡＶ２／５ベクターと呼ばれる。

より好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲはＡＡＶ血清型８に由来し、そのようなベクターは、ＡＡＶ２／８ベクターと呼ばれる。

より好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターはＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲはＡＡＶ血清型９に由来し、そのようなベクターは、ＡＡＶ２／９ベクターと呼ばれる。

より好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲはＡＡＶ血清型２に由来し、そのようなベクターは、ＡＡＶ２／２ベクターと呼ばれる。

最適な核酸配列によって表される本発明によるエクソンスキッピング分子をコードする核酸分子は、好ましくは、上で特定したＡＡＶゲノムまたはＩＴＲ配列、例えば、コード配列と機能可能に連結された発現調節エレメントおよび３’終結配列を含む発現コンストラクトの間に挿入される。

「ＡＡＶヘルパー機能」とは、一般に途中でＡＡＶベクターに与えられるＡＡＶ複製およびパッケージングに必要とされる対応するＡＡＶの機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターに欠けているＡＡＶの機能を補完するが、（ＡＡＶベクターゲノムによってもたらされる）ＡＡＶ ＩＴＲがない。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶの２つの主要なＯＲＦ、すなわち、ｒｅｐコード領域およびｃａｐコード領域またはそれらの機能的な実質的に同一の配列を含む。Ｒｅｐ領域およびＣａｐ領域は、当該技術分野において周知であり、例えば、参照によって本明細書に組み込むＣｈｉｏｒｉｎｉら（1999, J. of Virology, Vol 73(2): 1309-1319）または米国特許第５，１３９，９４１号明細書を参照。ＡＡＶヘルパー機能が、ＡＡＶヘルパーコンストラクトに与えられてもよく、これは、プラスミドであってもよい。ヘルパーコンストラクトの宿主細胞への導入は、例えば、本明細書において特定されるＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムの導入の前またはそれと同時のトランスフォーメーション、トランスフェクション、またはトランスダクションによって行われてもよい。したがって、本発明のＡＡＶヘルパーコンストラクトは、一方でＡＡＶベクターのカプシドタンパク質の殻に関して、他方で前記ＡＡＶベクター複製およびパッケージングにおいて存在するＡＡＶゲノムに関して血清型の所望の組合せをもたらすように選択されてもよい。

「ＡＡＶヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ複製およびパッケージングに必要とされる付加的な機能を提供する。適したＡＡＶヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１型および２型など）およびワクチニアウイルスが挙げられる。参照によって本明細書に組み込む米国特許第６，５３１，４５６号明細書に記載されているとおり、ヘルパーウイルスによってもたらされる付加的な機能も、ベクターにより宿主細胞に導入することができる。

好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ（複製）遺伝子またはｃａｐ（カプシド）遺伝子などのウイルスタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列を含まない。ＡＡＶゲノムは、例えば、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ｇｆｐ）をコードする遺伝子あるいは当該技術分野において既知の化学的に、酵素的にもしくは別の方法で検知可能なおよび／または選択可能な産生物をコードする遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ａｐｈなど）などのマーカー遺伝子あるいはレポーター遺伝子をさらに含んでもよい。

本発明による好ましいＡＡＶベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む本発明によるエクソンスキッピング分子を発現させるＡＡＶベクター、好ましくは、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９またはＡＡＶ２／２ベクターであり、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。

個体または前記個体の細胞、組織、臓器に本発明によるエクソンスキッピング分子を与える手段の改善は、これまでに既に成し遂げられた進歩を考慮して予想される。そのような将来的な改善は、当然、本発明の方法を使用したｍＲＮＡの再構築に関して言及した効果を達成するために組み込まれてもよい。本発明によるエクソンスキッピング分子は、そのまま個体、前記個体の細胞、組織もしくは臓器に送達されてもよい。本発明によるエクソンスキッピング分子を投与するとき、分子を送達方法と適合した溶液に溶解させることが好ましい。水溶液にプラスミドを与えることによって網膜細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチド発現のためのプラスミドが与えられてもよい。あるいは、既知のトランスフェクション剤（transfection agent）を使用したトランスフェクションによってプラスミドが与えられてもよい。静脈内、皮下、筋肉内、くも膜下腔内および／または室内投与に対して、溶液は生理的食塩液であることが好ましい。本発明において特に好ましいのは、本明細書中で定義される各成分の細胞へおよび／または細胞、好ましくは、網膜細胞中への送達を助けることになる賦形剤またはトランスフェクション剤の使用である。本明細書中で定義される複合体を形成した各成分、またはベシクルもしくはリポソームに閉じ込められた各成分を細胞膜を通して送達する複合体、ナノ粒子、ミセル、ベシクルおよび／またはリポソームを形成することができる賦形剤またはトランスフェクション剤が好ましい。こうした賦形剤の多くは、当該技術分野において知られている。適した賦形剤またはトランスフェクション剤は、本明細書中で定義される各成分を細胞、好ましくは、網膜細胞に送達することができる粒子に自己集合することができるポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ＥｘＧｅｎ５００（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）もしくはその誘導体、またはポリプロピレンイミンもしくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）および誘導体を含む類似のカチオン性ポリマー、合成の両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ−１８）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ、ＤＯＴＡＰおよび／またはウイルスカプシドタンパク質を含む。そのような賦形剤は、網膜細胞を含む多種多様の培養細胞にアンチセンス核酸などのオリゴヌクレオチドを効率的に送達することが示された。それらの高いトランスフェクション潜在性は、全細胞生存に関して除外された低から中程度の毒性と組み合わされる。構造変更の容易さが、さらなる変更ならびにそれらのさらなる（ｉｎ ｖｉｖｏ）核酸運搬特性および毒性の分析を可能にするために使用されてもよい。

Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎは、リポソームトランスフェクション剤の例である。これは、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）（メチル硫酸塩であるＤＯＴＡＰと比較）および中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の２つの脂質構成成分からなる。中性構成成分が細胞内放出を仲介する。送達システムの別のグループは高分子ナノ粒子である。

本明細書中で定義される各成分、好ましくは、オリゴヌクレオチドを、細胞膜を越えて細胞中に送達することができるカチオン性ナノ粒子を製剤化するために、ＤＮＡトランスフェクション試薬として周知のジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランのようなポリカチオンが、シアノアクリル酸ブチル（ＰＢＣＡ）およびシアノアクリル酸ヘキシル（ＰＨＣＡ）と組み合わされてもよい。

こうした一般的なナノ粒子材料に加えて、カチオン性ペプチドプロタミンが、コロイドを用いてオリゴヌクレオチドを製剤化するための代替的なアプローチを提供する。このコロイドナノ粒子系は、いわゆる、プロティクル（proticle）を形成することができ、これは、単純な自己集合プロセスによって作製することができ、オリゴヌクレオチドをパッケージングし、オリゴヌクレオチドの細胞内放出を仲介することができる。当業者は、エクソンスキッピング分子をＣＥＰ２９０関連疾患または状態の予防、処置または遅延のために送達すべく本発明に使用するためのエクソンスキッピング分子をパッケージングおよび送達するために任意の上記またはその他の商業的に入手可能な代替的賦形剤および送達システムを選択し、適合させることができる。「ＣＥＰ２９０関連疾患または状態の予防、処置または遅延」は、本明細書において、好ましくは、ＣＥＰ２９０遺伝子の遺伝的欠陥に起因する部分的もしくは完全な視力障害もしくは失明の進行を予防する、停止させる、止めるまたは反転させることと定義される。

さらに、本発明によるエクソンスキッピング分子は、細胞、細胞質および／またはその核への取り込みを促進するよう設計された標的化リガンドと特異的に共有結合的または非共有結合的に連結されてもよいであろう。そのようなリガンドは、（ｉ）細胞、組織もしくは臓器に特異的な細胞取り込みを促進するエレメントを認識する（以下に限定されるものではないがペプチ（様）構造を含む）化合物ならびに／あるいは（ｉｉ）細胞への取り込みおよび／またはベシクル、例えば、エンドソームもしくはリソソームからのオリゴヌクレオチドの細胞内放出を促進することができる化学的化合物を含んでもよいであろう。

したがって、好ましい実施形態において、本発明によるエクソンスキッピング分子は、組成物または薬剤、あるいは少なくとも、細胞への送達および／もしくはその送達デバイスのためならびに／または細胞内送達を向上させるための賦形剤および／または標的化リガンドとともに提供される組成物として製剤化される。

組成物が本明細書の後で定義される補助的な化合物などの付加的な成分を含む場合、組成物の各成分は、１つの単一の組合せまたは組成物または調製物として製剤化されなくてもよい。それらの素性に応じて、当業者は、どの製剤のタイプが本明細書中で定義される各成分に最も適切であるかがわかるであろう。好ましい実施形態において、本発明は、本発明によるエクソンスキッピング分子、さらに本明細書の後で定義される補助的な化合物を含むキット・オブ・パーツの形態である組成物または調製物を提供する。

必要とされる場合、本発明によるエクソンスキッピング分子または本発明によるエクソンスキッピング分子を発現させるベクター、好ましくは、ウイルスベクターは、薬学的に許容される担体を添加することによって薬学的に活性な混合物に組み込まれてもよい。

したがって、本発明はまた、本発明によるエクソンスキッピング分子、または本発明によるウイルスベクターおよび薬学的に許容される賦形剤を含む組成物、好ましくは、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、１つの本発明によるエクソンスキッピング分子を含んでもよいが、複数の異なる本発明によるエクソンスキッピング分子を含んでもよい。そのような医薬組成物は、担体、増量剤、保存料、補助薬、可溶化剤および／または希釈剤を含む任意の薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。そのような薬学的に許容される担体、増量剤、保存料、補助薬、可溶化剤および／または希釈剤は、例えば、Remington, 2000において見つけることができる。前記組成物のそれぞれの特徴は、本明細書の前で定義した。

本発明による複数の異なるエクソンスキッピング分子が使用される場合、本明細書において定義される濃度または用量は、使用されたすべてのオリゴヌクレオチドの合計濃度もしくは用量または使用されたか、もしくは添加されたそれぞれのエクソンスキッピング分子の濃度もしくは用量を指してもよい。したがって、一実施形態において、使用される本発明によるエクソンスキッピング分子のそれぞれの量または合計量が、０．０００１から２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．０１から２０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与される組成物が提供される。

本発明による好ましいエクソンスキッピング分子は、個体のＣＥＰ２９０関連疾患または状態の処置のためのものである。本発明のすべての実施形態において、「処置」という用語は、ＣＥＰ２９０関連疾患または状態の予防および／または遅延を含むと理解される。本発明によるエクソンスキッピング分子を使用して処置することができる個体は、既にＣＥＰ２９０関連疾患または状態を有すると診断されていてもよい。あるいは、本発明によるエクソンスキッピング分子を使用して処置することができる個体は、まだＣＥＰ２９０関連疾患または状態を有すると診断されていなくてもよいが、固体の遺伝的背景を考慮にいれると将来的にＣＥＰ２９０関連疾患または状態を発症するリスクが高い個体であってもよい。好ましい個体はヒトである。好ましい実施形態において、ＣＥＰ２９０関連疾患または状態はレーバー先天性黒内障である。

したがって、本発明は、ＣＥＰ２９０のスプライシングを調節することを必要とするＣＥＰ２９０関連疾患もしくは状態を処置するための薬剤として使用するため、およびＣＥＰ２９０関連疾患もしくは状態の予防、処置もしくは遅延のための薬剤として使用するための本発明によるエクソンスキッピング分子、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物をさらに提供する。好ましいＣＥＰ２９０関連疾患または状態は、レーバー先天性黒内障である。前記使用のそれぞれの特徴は、本明細書の前で定義した。

本発明は、ＣＥＰ２９０のスプライシングを調節することを必要とするＣＥＰ２９０関連疾患または状態の処置のための本発明によるエクソンスキッピング分子の使用、もしくは本発明によるウイルスベクターの使用、または本発明による組成物をさらに提供する。好ましい実施形態において、ＣＥＰ２９０関連疾患または状態はレーバー先天性黒内障である。

本発明は、薬剤として使用するための本発明によるエクソンスキッピング分子、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物をさらに提供する。

本発明は、ゲノムにおいてＣＥＰ２９０遺伝子のイントロン２６に突然変異（ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ）があるヒトを処置するための方法であって、本発明のＡＯＮ、ウイルスベクター、または医薬組成物をヒトに投与することを含む方法をさらに提供する。これらの患者は、レーバー先天性黒内障を患う可能性がある。

本発明の別の実施形態は、ゲノムにおいてＣＥＰ２９０遺伝子のイントロン２６に突然変異（ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ）があるヒトを処置するための薬剤として使用するための本発明によるＡＯＮ、ＡＯＮをコードするウイルスベクター、およびＡＯＮを含む医薬組成物である。

本発明の別の実施形態によると、細胞におけるＣＥＰ２９０のスプライシングを調節するためのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏにおける方法が提供され、前記方法は、前記細胞を本発明によるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドをコードするウイルスベクター、または医薬組成物と接触させることを含む。

本発明によるエクソンスキッピング分子は、飲み込むこと、注射すること、吸入、注入、噴霧することによる経口、眼内、肺内、鼻腔内、筋肉内、皮下、皮内、直腸へ投与により（水）溶液、懸濁液、（水中油型）エマルジョン、軟膏、トローチ、丸剤などの形態で全身的に、局部的に、局所的に患者に投与されてもよい。投与の好ましい経路は、水溶液または特に、眼内投与に適合した製剤の硝子体内注射による。例えば、欧州特許第２，４２５，８１４号明細書は、とりわけペプチドまたは核酸薬物の眼内（硝子体内）投与に適合した水中油型エマルジョンについて開示している。このエマルジョンは、硝子体液よりも密度が低いため、硝子体の上部に浮かんで、注射された薬物が視野を悪くするのを回避する。

投薬は、投与経路および患者の必要性に応じて毎日、週に１回、月に１回、年に４回、年に１回であってもよい。

早くに疾患が発症するため、ＬＣＡを有する、または小児期の失明を含むＬＣＡの症状を発症するリスクのある患者は、疾患の症状を緩和する、発症を遅らせる、止める、または逆行させるなどのために、症状の発症前または後に、子宮内で、出生直後に、１、２、３、６か月齢から、１歳から、３歳から、５歳から処置されてもよい。

本発明による使用または方法における処置は、少なくとも１週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも数ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２、３、４、５、６年または患者の一生涯の間である。本発明による使用のための本明細書中で定義されるとおりのエクソンスキッピング分子またはエクソンスキッピングオリゴヌクレオチドまたはその等価物のそれぞれは、ＣＥＰ２９０関連疾患または状態に既に冒されているか、またはそれを発症するリスクがある個体の細胞、組織および／または臓器へのｉｎ ｖｉｖｏにおける直接の投与に適していてもよく、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて直接投与されてもよい。本発明のオリゴヌクレオチド、組成物、化合物または補助的な化合物の投与の頻度は、患者の年齢、エクソンスキッピング分子の性質（例えば、裸の（gymnotic）ＡＯＮまたはＡＡＶベクターもしくはレンチウイルスベクターにより発現させるＡＯＮなどの、ベクターにより運ばれる（vectored）ＡＯＮ）、用量、および前記分子の配合などのいくつかのパラメータにより左右される可能性もある。

本発明によるエクソンスキッピング分子、好ましくは、オリゴヌクレオチドの用量範囲は、好ましくは、厳しい手順要件が存在する臨床試験の用量漸増試験（ｉｎ ｖｉｖｏにおける使用）に基づいて設計される。本明細書中で定義されるとおりのオリゴヌクレオチドは、０．０００１から２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．００１から２０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で使用されてもよい。用量および処置計画は、以下に限定されるものではないが、投与経路（例えば、全身的、対眼に直接になどの局所的）、オリゴが裸のＡＯＮまたはベクターにより運ばれるＡＯＮとして投与されるのかどうか、投与計画、患者の年齢および体重などを含む多くの要素により大きく変化することもある。

好ましい実施形態において、本発明による分子のための送達媒体として、本明細書の前に記載されているウイルスベクター、好ましくは、ＡＡＶベクターは、１回の注射当たり１×１０^９〜１×１０^１７ウイルス粒子、より好ましくは、１回の注射あたり１×１０^１０〜１×１０^１４、最も好ましくは１×１０^１０〜１×１０^１２ウイルス粒子の範囲の用量で投与される。

処置の詳細は、オリゴヌクレオチド（複数可）の配列および化学的性質、投与経路、配合、用量、投与計画、様式（ウイルスベクターまたは裸のオリゴヌクレオチド）、患者の年齢および体重、疾患のステージなどのような要素に従い、それらに応じて確立される必要があり、これは、さらなる非臨床試験および臨床試験を必要とする場合もあることは、本発明が属する技術分野の当業者には明らかになろう。

本発明は、細胞におけるＣＥＰ２９０のスプライシングを調節するための方法であって、細胞、好ましくは、網膜細胞を本発明によるエクソンスキッピング分子、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物と接触させることを含む方法をさらに提供する。この態様の特徴は、好ましくは、本明細書の前で定義されたものである。細胞を本発明によるエクソンスキッピング分子、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物と接触させることは、当業者に既知の任意の方法によって行われてもよい。本明細書に記載されているエクソンスキッピング分子、ウイルスベクターおよび組成物の送達のための方法の使用が含まれる。接触させることは、直接的または間接的であってもよく、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてであってもよい。

別に指示がある場合を除いて、本明細書に記載されている各実施形態は、本明細書に記載されている別の実施形態と組み合わされてもよい。

ヒトＣＥＰ２９０遺伝子がヒト細胞において発現するときに、前記遺伝子のイントロン２６におけるｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異と関連する異常なスプライシング部位のスプライシング部位選択を低減し、異常なスプライシング部位の選択に影響を及ぼす領域において生理的条件下でヒトＣＥＰ２９０ ｐｒｅ−ｍＲＮＡと結合して、それにより、細胞のスプライシング機構による異常なスプライシング部位の選択を低減するオリゴヌクレオチドの能力は、好都合にも本明細書の実験のセクションに開示されているアッセイを使用して評価することができる。特に、オリゴは、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異を含む細胞とともにインキュベートすることができ、異常なエクソンを含むｍＲＮＡの細胞による産生を低減するその能力は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲによって評価することができる。

本明細書の実験のセクションにおいてＲＮＡレベルで確認できるとおり、異常なＣＥＰ２９０エクソンを標的とするさまざまなＡＯＮの添加により、実際に、異常にスプライシングされたＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡが、正しくスプライシングされたＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡへと変換された。この変換は、野生型ＣＥＰ２９０タンパク質の合成の増加と一致することになる。

（皮膚細胞に由来してもよい）線維芽細胞において、ＣＥＰ２９０は豊富に発現される。ゆえに、ＬＣＡ患者からの培養線維芽細胞へのＡＯＮの添加は、ウエスタンブロットにおいて検出可能な野生型ＣＥＰ２９０タンパク質量の量を増加させることになることが予想され、したがって、ＡＯＮベースの療法が、ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡの正常なスプライシングを再び指示するだけでなくＣＥＰ２９０タンパク質の機能も回復させることになることを実証することになる。

「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」およびヒポキサンチン（イノシンのヌクレオベース）という用語は、それ自体ヌクレオベースを指す。

アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジンおよびイノシンという用語は、（デスオキシ）リボシル糖と連結されたヌクレオベースを指す。

「ヌクレオシド」という用語は、（デオキシ）リボシル糖と連結されたヌクレオベースを指す。

本文書において、およびその特許請求の範囲において、「含むこと（to comprise）」という動詞およびその活用型は、その語に引き続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目も除外しないことを意味するためにその非限定的な意味で使用される。さらに、文脈が明らかに１つおよび１つだけのエレメントが存在することを必要としない限り、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素の言及は、１つ超の要素が存在する可能性を排除するものではない。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、したがって、通常は「少なくとも１つ」を意味する。

数値（例えば、約１０）と関連して使用される場合、「約」または「およそ」という語は、好ましくは、値が、所与の値（１０の）プラスまたはマイナス５％の値であってもよいことを意味する。

本明細書で提供した配列情報は、エラーを伴って特定された塩基を含める必要があるほど狭く解釈されるべきではない。当業者は、エラーを伴って特定されたそのような塩基を特定することができ、そのようなエラーの正し方を知っている。配列のエラーの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む配列番号１に存在する遺伝子の発現によって得られるポリペプチドの配列が優先されるものとする。

材料および方法
１：細胞
すべての細胞株は、皮膚生検材料から生成されたヒト線維芽細胞である。ＬＦＢ１（ＣＬ１０−００００８）およびＬＦＢ２（ＣＬ１２−０００２７）は野生型であり、対照細胞株に相当し、ＬＦＢ３（ＣＬ１２−０００３５）およびＬＦＢ４（ＣＬ１２−０００３６）は、ともにＣＥＰ２９０（ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ）の突然変異に関するホモ接合型突然変異体である。

２：ＡＯＮ
ＡＯＮを、「ジーンウォーク（genewalk）」アプローチを使用して設計し、ここでは、ＡＯＮ間のおよそ１０ｂｐの重複領域を有する１７ｍｅｒのＡＯＮを、隠れた１２８ｂｐのエクソンを含むように設計した。２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートの化学的性質を有する設計したＲＮＡ ＡＯＮを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から入手した。

３：細胞培養およびトランスフェクション
すべての細胞株を、２０％ＦＢＳおよび１％ピルビン酸ナトリウムを加えたＤＭＥＭ−ＡＱＥ培地（Ｓｉｇｍａ）において増殖させた。トランスフェクションの前日、２．５ｍｌの合計体積の培地の６ウェルプレートに２×１０^５／ウェルの密度で細胞を播いた。トランスフェクションの日に、トランスフェクション剤（すべてＰＢＳ中）として１：４のオリゴ：ｍａｘＰＥＩ質量比でｍａｘＰＥＩ（Ｐｏｌｉｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して１００ｎＭの最終濃度で試験対象のＡＯＮを各ウェルに添加した。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲｅｌｉａＰｒｅｐ ＲＮＡ Ｃｅｌｌ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに供給されるＢＬ＋ＴＧバッファーを使用して細胞ライセートを回収した。細胞ライセートを、さらなる使用まで−８０℃で凍結した。

４：サンプル中のｗｔおよびｍｔ ＣＥＰ２９０のプロファイリング
ａ）ＲＮＡ単離：ＲＮＡを、製造業者の手順に従ってＲｅｌｉａＰｒｅｐ ＲＮＡ Ｃｅｌｌ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して−８０℃に維持されていた細胞ライセートから単離した。全ＲＮＡを、−８０℃で保存する前にＮａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して定量した。

ｂ）ｃＤＮＡ合成：４００ｎｇのＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってオリゴｄＴプライマーとともにＶｅｒｓｏ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用した。対照として非ＲＴサンプル（酵素なし）を含め、それを、他のサンプルとともに分析した。

ｃ）ＰＣＲ：サンプル中に存在するＣＥＰ２９０のメッセンジャーＲＮＡのさまざまなプロファイルを視覚化し、定量化するために、エクソン２６からエクソン２７を含むＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡのフラグメントを、ＰＣＲを使用して特異的に増幅した。このために、ｃＤＮＡ（２μｌの２．５倍希釈）を鋳型として使用し、以下のプライマーを使用して標的配列の増幅を行った。

その反応を、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）３６０ＤＮＡポリメラーゼを使用して行った（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログＮｏ：４３９８８３３）。

ＰＣＲフラグメントを、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（ＤＮＡ１０００キット、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分析した。結果を、２１００Ｅｘｐｅｒｔソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分析した。

ｄ）ＲＴ−ｑＰＣＲ：ＣＥＰ２９０メッセンジャーＲＮＡの発現のレベルを測定するために、野生型転写物および突然変異転写物を、それぞれ９３ｂｐのフラグメントおよび１１７ｂｐのフラグメントとして増幅した。標準化のためにヒトＰ０巨大リボソームタンパク質ｍＲＮＡ（ＲＰＬＰ０）を使用した。このために、ｃＤＮＡ（２ｕｌの１０倍希釈）を、ＳＹＢＲ ｓｅｌｅｃｔ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ならびに４００ｎＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマー（配列番号２５〜２８）を含むｑＰＣＲバッファー（１８ｕｌ）中で増幅した。増幅のために使用したシステムは、ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステム（ＢｉｏＲａｄ）とし、条件は、以下のとおりとした：５０℃における２分間のＵＤＧ活性化ステップ、次に、９５℃における２分間の第１の変性ステップに続く、９５℃で１５秒および６２．５℃で１分間の５０サイクル。増幅産物の特異性を判定するために、各ランの終わりに融解曲線分析を行った。Ｂｉｏ−Ｒａｄソフトウェアを使用してデータを視覚化し、処理し、変化倍率計算を比較Ｃｔ法（２（−デルタデルタＣ（Ｔ））法としても知られている）を使用して行った。

使用したプライマーは以下のものである。

この反応のために、鋳型として使用した１０倍希釈したｃＤＮＡとともにＳＹＢＲ ｓｅｌｅｃｔ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。

結果および考察
設計したオリゴヌクレオチドのＲＮＡ調節に対する効果を、トランスフェクション効率ならびに処理時間および濃度（データは示していない）の最適化後に評価した。

設計した２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートＡＯＮによって誘導されたエクソンスキッピングの効率を、エクソン２６からエクソン２７を含むＣＥＰ２９０フラグメントの選択増幅を使用してスクリーニングした。ＰＣＲフラグメントの視覚化および定量化を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００を使用して行った。本発明者らは、製造または治療的使用を妨げるであろう構造を有していないと同時に、先行技術で示されているＡＯＮと同等またはそれよりも良好な効率を有するエクソンスキッピングを誘導するＡＯＮ（ｗｔのスプライシングされたｍＲＮＡと比較して、突然変異型のスプライシングされたｍＲＮＡに対応するＰＣＲフラグメントのレベルを測定することによって確かめられる）を設計することが可能であるかについて問うた。本研究は、これらの基準を満たした１１のオリゴヌクレオチドを特定した（図２、表１および表２を参照）。

ＣＥＰ２９０メッセンジャーＲＮＡの野生型転写物および突然変異転写物の発現のレベルに関するｑＰＣＲによる分析は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて得た結果を裏づけた。変化倍率計算により、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置が、野生型転写物の発現を先行技術に示されたＡＯＮによって達成されるレベルと同等か、またはそれよりも優れたレベルにレスキューすることが示される。

本発明のＡＯＮは、エクソンスキッピングに関して先行技術のＡＯＮよりも良好に機能することが要件ではないため、エクソンスキッピングを誘導するのに足りる性能であれば十分である。例に開示されている本発明によるＡＯＮは、本発明の好ましい実施形態に過ぎない。本発明によって包含される特許請求される本発明の要件を満たすその他のＡＯＮが設計されてもよい。

Claims (26)

1. ヒトＣＥＰ２９０遺伝子がヒト細胞において発現するときに、前記遺伝子のイントロン２６におけるｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ突然変異と関連する異常なスプライシング部位のスプライシング部位選択を低減することができるオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが配列番号１６からなるものではないという条件で、前記オリゴヌクレオチドの配列が特性（ａ）から（ｄ）：
   （ａ）３つ以下の連続したグアノシンを含む、
   （ｂ）６０％以下のグアノシンヌクレオベースを有する、
   （ｃ）最大１つのＣｐＧ配列を含む、かつ／または
   （ｄ）３つ以上の連続した相補的な塩基対を含むヘアピンを形成する可能性がない
   のうちの少なくとも１つを有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
2. ５０％を超えるグアノシンヌクレオベースを含まないことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
3. ４０％を超えるグアノシンヌクレオベースを含まないことを特徴とする、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
4. ３つ超の連続したグアノシンの配列、もしくはグアノシンテトラド、または６０％を超えるグアノシンを含まないことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
5. ３つ超の連続したグアノシンの配列、もしくはグアノシンテトラド、または１つ超のＣｐＧ配列を含まないことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
6. ３つ超の連続したグアノシンの配列、もしくはグアノシンテトラド、または３つ以上の連続した相補的な塩基対を含むヘアピンを形成する可能性のある配列を含まないことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
7. ３つ超の連続したグアノシンの配列、もしくはグアノシンテトラド、またはＣｐＧ配列を含まないことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
8. ６０％を超えるグアノシンヌクレオベース、または１つ超のＣｐＧ配列を含まないことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
9. ＣｐＧ配列を含まないことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
10. ６０％を超えるグアノシンヌクレオベース、または３つ以上の連続した相補的な塩基対を含むヘアピンを形成する可能性のある配列を含まないことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
11. ３つ超の連続したグアノシンの配列、もしくはグアノシンテトラド、または６０％を超えるグアノシンヌクレオベース、または１つ超のＣｐＧ配列を含まないことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
12. ３つ超の連続したグアノシンの配列、もしくはグアノシンテトラド、または６０％を超えるグアノシンヌクレオベース、または３つ以上の連続した相補的な塩基対を含むヘアピンを形成する可能性のある配列を含まないことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
13. ３つ超の連続したグアノシンの配列、もしくはグアノシンテトラド、または１つ超のＣｐＧ配列、または３つ以上の連続した相補的な塩基対を含むヘアピンを形成する可能性のある配列を含まないことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
14. ３つ超の連続したグアノシンの配列、もしくはグアノシンテトラド、または６０％を超えるグアノシンヌクレオベース、または１つ超のＣｐＧ配列、または３つ超の連続した相補的な塩基対を含む二本鎖構造を形成する可能性のある配列を含まないことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
15. ３つ超の連続したグアノシンの配列、もしくはグアノシンテトラド、または６０％を超えるグアノシンヌクレオベース、またはＣｐＧ配列、または３つ超の連続した相補的な塩基対を含む二本鎖構造を形成する可能性のある配列を含まないことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
16. ３０ヌクレオチド長より短い、例えば、２５ヌクレオチド長より短い、好ましくは２１ヌクレオチド長より短い、より好ましくは２０ヌクレオチド長より短い、最も好ましくは１６〜１９の間のヌクレオチド長であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
17. １７ヌクレオチド長であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
18. 以下の任意のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
    
19. ホスホロチオエート骨格を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
20. ２’−Ｏ−低級アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアルコキシ修飾リボース部分、好ましくは２’−Ｏ−メチルを含むオリゴリボヌクレオチドである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
21. 配列番号７または配列番号１２からなる配列を有し、任意選択ですべてのリボースが２’−Ｏ−メチル化されている、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、特に請求項１９または請求項２０に記載のオリゴリボヌクレオチド。
22. ヒト細胞において、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの発現を促す条件下に置かれたときに、前記分子を発現させるウイルスベクター。
23. 請求項１〜２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項２１に記載のウイルスベクターを含む医薬組成物。
24. 薬剤として使用するための請求項１〜２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項２１に記載のウイルスベクターまたは請求項２２に記載の医薬組成物。
25. ゲノムにおいてＣＥＰ２９０遺伝子のイントロン２６に突然変異（ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ）があるヒトを処置するための薬剤として使用するための請求項１から２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項２１に記載のウイルスベクターまたは請求項２２に記載の医薬組成物。
26. 細胞におけるＣＥＰ２９０のスプライシングを調節するためのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏにおける方法であって、前記細胞を、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項２１に記載のウイルスベクター、または請求項２２に記載の医薬組成物と接触させることを含む方法。