BR112017018335B1

BR112017018335B1 - Oligonucleotídeo, vetor viral, composição farmacêutica e uso destes

Info

Publication number: BR112017018335B1
Application number: BR112017018335-8A
Authority: BR
Inventors: Patricia Coromoto Biasutto; Hee Lam Chan
Original assignee: Proqr Therapeutics Ii B.V.
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2024-03-19

Abstract

TERAPIA COM OLIGONUCLEOTÍDEOS PARA AMAUROSE CONGÊNITA DE LEBER. Oligonucleotídeos antissenso têm como alvo a mutação no íntron 26 do gene CEP290 e reduzem a inclusão do éxon anormal no mRNA de CEP290. Os oligonucleotídeos incluem não mais do que 3 guanosinas consecutivas, não têm mais do que 60% de nucleobases guanosina, incluem no máximo uma sequência de CpG e/ou não têm o potencial para formar um hairpin compreendendo 3 ou mais pares de bases complementares consecutivos.

Description

[001] Este pedido reivindica a prioridade do pedido de patente U.K. 1503408.5 depositado no dia 27 de fevereiro de 2015, cujo conteúdo completo do qual é aqui incorporado para referência para todos os efeitos.

CAMPO DE INVENÇÃO

[002] A presente invenção se refere ao campo de oligonucleotídeos e a sua utilização para o tratamento da doença. Em particular, a invenção se refere aos novos oligonuclotídeos antissenso que podem ser utilizados no tratamento de Amaurose Congênita de Leber.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] A Amaurose Congênita de Leber (LCA) é a forma mais comum de cegueira congênita na infância com uma prevalência estimada de aproximadamente 1 a cada 50.000 recém-nascidos em todo o mundo (Koenekoop et al., 2007; Stone, 2007). É acompanhada por distrofia da retina. O início dos sintomas da doença é tão cedo quanto os primeiros meses ou anos de vida (Leber, T., 1869). Geneticamente, LCA é uma doença heterogênea, com quinze genes identificados até o momento em que as mutações são causadoras de LCA (den Hollander et al., 2008; Estrada-Cuzcano et al., 2011). O gene LCA mais frequentemente mutado é splicing, um gene localizado no braço Q do cromossomo 12, que codifica para a proteína Centrosomal 290 que tem um papel importante no desenvolvimento do centrossoma e cílios. As mutações no gene CEP290 são responsáveis por cerca de 15% de todos os casos de LCA (Stone, 2007; den Hollander, 2008; den Hollander, 2006; Perrault et al., 2007).

[004] A mutação CEP290 que, de longe, ocorre com mais frequência, associada com distrofia da retina, especialmente nos países da Europa e nos EUA, é uma mudança no íntron 26 do gene CEP290 (c.2991 + 1655A > G) (Stone, 2007; den Hollander et al., 2006; Perrault et al., 2007; Liitink et al., 2010). Esta mutação cria um sítio doador de splice críptico no íntron 26 que resulta na inclusão de um éxon anormal de 128 pb no mRNA de CEP290 mutante, e insere um códon de parada prematuro (p.C998X) (ver Figura 1). Em pacientes com esta mutação, a transcrição de tipo selvagem que é desprovida do éxon anormal ainda é produzida, explicando a natureza hipomórfica desta mutação (Estrada- Cuzcano et al., 2011).

[005] WO2013/036105 (Stichting Katholieke Universiteit Nijmegen) e WO2012/168435 (Inserm et al.) divulga os oligonuclotídeos antissenso para o tratamento ou retardo de LCA, tendo como alvo esta mutação intrônica em CEP290.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Embora os oligonuclotídeos antissenso divulgados em WO2013/036105 e WO2012/168435 reduzam a seleção do sítio de splice críptico associado com a mutação, reduzindo, desse modo, a geração de mRNAs de CEP290 spliced contendo a sequência do éxon 128bp anormal (também referida como “salto de éxon”), os próprios oligonucleotídeos têm certas limitações a partir de uma capacidade de fabricação e/ou do ponto de vista imunológico, o que pode limitar a sua utilização em um ambiente terapêutico humano. Por conseguinte, é um objeto da presente invenção proporcionar novos oligonuclotídeos antissenso que têm como alvo a mutação no íntron 26 do gene CEP290, que não sofrem de algumas das desvantagens dos oligonuclotídeos da técnica anterior, reduzindo, de forma eficaz, a inclusão do éxon anormal no mRNA de CEP290.

[007] Por conseguinte, a invenção fornece um oligonucleotídeo capaz de reduzir a seleção do sítio de splice de um sítio de splicing anormal associado com a mutação c.2991 + 1655A > G no íntron 26 do gene CEP290 humano, quando o referido gene é expresso em uma célula humana; caracterizado pelo fato de que a sequência do oligonucleotídeo tem pelo menos uma das propriedades (a) a (d): (a) este inclui não mais do que 3 guanosinas consecutivas; (b) este não tem mais do que 60% de nucleobases guanosina; (c) este inclui, no máximo, uma sequência CpG; e/ou (d) este não tem o potencial para formar um hairpin que compreende 3 ou mais pares de bases complementares consecutivos, contanto que o oligonucleotídeo (i) não consista em SEQ ID NO: 16 e/ou (ii) consista em 21 ou menos nucleotídeos, e, de preferência, seja constituído por 20 ou menos nucleotídeos.

[008] Sem pretender estar limitado pela teoria, os inventores acreditam que a complementaridade do oligonucleotídeo para pré-mRNA CEP290 humano significa que aquele é capaz de se ligar a este sob condições fisiológicas em uma região que afeta seleção do sítio de splice anormal, e após a ligação para a referida região, isso reduz a seleção do sítio de splice pelo maquinário de splicing da célula.

[009] Os oligonucleotídeos podem ter combinações de duas, três, ou até mesmo quatro características de (a) a (d) acima definidas. Tais combinações são descritas em mais detalhes abaixo.

[0010] Os oligonucleotídeos são geralmente mais curtos do que 30 nucleotídeos, por exemplo, <25 nt, <21 nt, < 20nt. Estes podem ter de 16 a 19 nt em comprimento, por exemplo, 17 nt de comprimento.

[0011] As sequências de oligonucleotídeos específicos de interesse são as SEQ ID NOs: 2-12.

[0012] Os oligonucleotídeos contêm, de preferência, modificações químicas quando comparados com RNA natural, por exemplo, uma estrutura principal de fosforotioato, as frações de ribose modificadas com 2’-O-alquil inferior, etc.

[0013] Os oligonucleotídeos podem ser fornecidos diretamente a uma célula, ou podem ser fornecidos indiretamente através da transcrição in situ, por exemplo, a partir de um vetor viral. No entanto, estes são fornecidos e podem ser utilizados para proporcionar um efeito terapêutico in vivo para o tratamento de um humano contendo em seu genoma a mutação (c. 2991 + 1655 A > G) no íntron 26 do gene CEP290.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0014] Figura 1: fita codificadora do genoma humano (SEQ ID NO: 30), incluindo o éxon críptico de 128bp (sublinhado; SEQ ID NO: 1) mais 30 pb a jusante. A localização de oligonucleotídeos antissenso, de acordo com a invenção, é também mostrada (SEQ ID NOs: 2-12), bem como AONs da técnica anterior (SEO ID NOS: 13-22). A mutação c.2991 + 1655A > G, a jusante do éxon críptico, é mostrada em minúsculo na sequência do genoma.

[0015] Figura 2: perfis de splicing de mRNA de CEP290 das células de pacientes não tratados (NT), as células de pacientes tratados com os oligonuclotídeos não complementares (senso) (SON-3; SEQ ID NO: 29) ou oligonucleotídeos antissenso complementares, de acordo com a invenção (AONP), em comparação com AONs da técnica anterior. O fragmento de tipo selvagem corresponde a uma banda que migra em aproximadamente 109 bp enquanto o fragmento mutado corresponde a uma banda que migra em aproximadamente 237 bp. Os fragmentos que migram acima do fragmento de 237 bp parecem ser outras formas de splicing anormal. O controle saudável apresenta apenas um perfil de tipo selvagem enquanto o paciente mostra a presença de ambos os fragmentos do tipo selvagem e mutados. Os oligonucleotídeos designados podem induzir de modo eficiente o éxon da sequência mutante alvo e, portanto, restaura um perfil de mRNA do tipo selvagem.

[0016] Figura 3: Expressão de mRNA de CEP290 em amostras de pacientes após o tratamento com AONs mostrados no eixo x. O fold-change (eixo y) foi calculado usando o método comparativo Ct. Os níveis de mRNA de tipo selvagem (barras pretas) e o mRNA mutante (barras cinzas) foram comparados com a amostra não tratada. As barras de erro representam o desvio padrão da média. A análise estatística da diferença entre os níveis de transcrição do tipo selvagem nas amostras de pacientes não tratados versus amostras de pacientes tratados foi realizada usando um teste t pareado. Os resultados mostram uma diferença significativa (p <0,05) de níveis de transcrição do tipo selvagem depois do tratamento com o oligonucleotídeo antissenso, mas não depois do tratamento com o mesmo oligonucleotídeo senso (SON-3 p = 0,2507, AONP4 p = 0,0002, AONP13 p = 0,0001, AONP26 p <0,0001, AON-3 p = 0,0034, ESE (+ 50 + 70), p = 0,0193).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0017] De modo surpreendente, foi agora demonstrado que oligonucleotídeos antissenso (AONs) podem ser concebidos, que são capazes de bloquear ou reduzir o splicing anormal do éxon críptico de 128bp no pré-mRNA de CEP290 e que satisfazem os requisitos para utilização terapêutica em seres humanos.

[0018] Assim, os AONs de acordo com a invenção não são apenas funcionais, mas - de modo igualmente importante, e contrariamente aos AONs com salto de éxon da técnica anterior - são desprovidos de sequências que são propensas para a formação de agregado ou multiplex, tais como G’s repetitivas (3 ou mais G’s, incluindo quatro ou mais G’s, também referido como G- tétrades ou quadruplexos) que causam problemas com a purificação (impurezas) e analíticas após a fabricação do granel, a solubilidade (por exemplo, devido ao empilhamento das G-tétrades), biodistribuição, absorção celular, imunogenicidade e/ou a perda total da função.

[0019] Os AONs, de acordo com a invenção, não contêm mais do que 60%, mais preferencialmente não mais do que 50%, ainda mais preferencialmente não mais do que 40% de nucleotídeos de guanosina.

[0020] Além disso, os AONs da invenção não contêm mais do que uma sequência CpG, de preferência, nenhuma sequência CpG, conhecidas para induzir o sistema imunológico humano por meio de uma reação mediada por TLR9.

[0021] Além disso, ao contrário de alguns AONs que saltam éxon divulgados na técnica anterior, os AONs da invenção não contêm longas repetições invertidas (sequências que podem criar hairpins ou outras estruturas de fita dupla), que podem causar problemas com a purificação e analíticos e são associadas com a imunogenicidade, absorção celular reduzida e/ou a perda total de função.

[0022] Por conseguinte, em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um oligonucleotídeo capaz de reduzir a seleção do sítio de splice de um sítio de splice anormal associado com a mutação c.2991 + 1655A > G no íntron 26 do gene humano CEP290, quando o referido gene é expresso em uma célula humana, em que o oligonucleotídeo é complementar a, e capaz de se ligar, em condições fisiológicas, ao pré-mRNA de CEP290 humano em uma região que afeta a seleção do sítio de splice anormal e após a ligação à referida região reduz a seleção do referido sítio de splice pelo maquinário de splicing na referida célula; caracterizado pelo fato de que a sequência de oligonucleotídeo tem pelo menos uma das propriedades (a) a (d): (e) esta inclui não mais do que 3 guanosinas consecutivas; (f) esta não tem mais do que 60% de nucleobases guanosina; (g) esta inclui no máximo uma sequência CpG; e/ou (h) esta não tem o potencial para formar um hairpin que compreende 3 ou mais pares de bases complementares consecutivos, contanto que o oligonucleotídeo não consista em SEQ ID NO: 16.

[0023] De acordo com a propriedade (a), o oligonucleotídeo pode incluir uma sequência de dinucleotídeo GpG, mas não há mais do que 3 nucleobases de guanosina consecutivas na sequência. Assim tétrades de guanosina são ausentes, uma vez que são extensões mais longas de repetições de guanosina.

[0024] De acordo com a propriedade (b), o oligonucleotídeo pode incluir nucleobases de guanosina, mas não mais do que 60% das nucleobases individuais no oligonucleotídeo podem ser guanosina. Idealmente, não mais do que 50% das nucleobases são guanosina, e de preferência, não mais do que 40%.

[0025] De acordo com a propriedade (c), o oligonucleotídeo pode incluir uma sequência de dinucleotídeo CpG, mas não mais. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo não inclui nenhuma sequência dinucleotídeo CpG.

[0026] De acordo com a propriedade (d), o oligonucleotídeo omite as sequências de 3 nucleotídeos ou mais, que são auto complementares e que podem, assim, hibridizar um com o outro dentro do oligonucleotídeo para formar hairpins de 3 pares de bases ou mais (duplexes intramoleculares), ou podem hibridizar uns aos outros em diferentes oligonucleotídeos para formar duplexes intermoleculares.

[0027] É ainda preferencial que uma sequência de oligonucleotídeo não deva ter mais do que 3 nucleobases de citidina consecutivas. Mais geralmente, em algumas modalidades, uma sequência de oligonucleotídeo não inclui qualquer trecho de 3 ou mais nucleobases idênticas consecutivas, por exemplo, esta não inclui qualquer um de trinucleotídeos ApApAp, CpCpC, GpGpG, ou UpUpU.

[0028] Em um segundo aspecto, a invenção proporciona um oligonucleotídeo capaz de reduzir a seleção do sítio de splice de um sítio de splice anormal associado com a mutação c.2991 + 1655A > G no íntron 26 do gene humano CEP290, quando o referido gene é expresso em uma célula humana, em que o oligonucleotídeo é complementar a e capaz de se ligar, em condições fisiológicas, ao pré-mRNA de CEP290 humano em uma região que afeta a seleção de sítio de splice anormal e após a ligação à referida sequência reduz a seleção do referido sítio de splice pelo maquinário de splicing na referida célula; caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo consiste em 21 ou menos nucleotídeos (de um modo preferido 20 ou menos) e a sua sequência tem pelo menos uma das propriedades (a) a (d): (a) esta inclui não mais do que 3 guanosinas consecutivas; (b) esta não tem mais do que 60% de nucleobases guanosina; (c) esta inclui no máximo uma sequência CpG; e/ou (d) esta não tem o potencial para formar um hairpin compreendendo 3 ou mais pares de bases complementares consecutivos.

[0029] Além disso, um terceiro aspecto da invenção fornece um oligonucleotídeo capaz de reduzir a seleção do sítio de splice de um sítio de splice anormal associado com a mutação c.2991 + 1655A> G no íntron 26 do gene CEP290 humano, quando o referido gene é expresso em uma célula humana, em que o nucleotídeo 5’ ou 3’ terminal do oligonucleotídeo é uma citidina na posição que é antissenso para a mutação c.2991 + 1655A > G. Este oligonucleotídeo também pode ter, pelo menos, uma das propriedades (a) a (d).

[0030] Em um quarto aspecto, a invenção proporciona um oligonucleotídeo capaz de reduzir a seleção do sítio de splice de um sítio de splice anormal associado com a mutação c.2991 + 1655A > G no íntron 26 do gene CEP290 humano, quando o referido gene é expresso em uma célula humana, em que o oligonucleotídeo inclui uma sequência de pelo menos 10 nucleotídeos que é complementar a pelo menos uma porção da sequência 5’-atggtgtcgatctcctgaactcgtga-3’ (SEQ ID NO: 31; nucleotídeos 31-56 da SEQ ID NO: 1). Este oligonucleotídeo pode, assim, hibridizar com qualquer porção da SEQ ID NO: 31, mas irá sempre incluir, pelo menos, um nucleotídeo que é complementar ao 8-mer central do mesmo, nomeadamente 5’- atctcctg-3’ (SEQ ID NO: 32) que é uma sequência melhoradora de splicing potencial. AONP11, 12 e 13 são exemplos de tais oligonucleotídeos, cada um dos quais inclui, pelo menos, um nucleotídeo a partir do 8-mer central 5’-caggagat-3’ (SEQ ID NO: 36; ver Figura 1). Este oligonucleotídeo também pode ter, pelo menos, uma das propriedades (a) a (d).

[0031] Idealmente, um oligonucleotídeo da invenção tem mais do que uma das referidas propriedades (a) a (d). Por exemplo, este pode ter propriedades: (a) e (b); (a) e (c); (a) e (d); (b) e (c); (b) e (d); (a), (b) e (c); (a), (b) e (d); (a), (c) e (d); ou todos os quatro de (a), (b), (c) e (d).

[0032] A tabela seguinte fornece os AONs da técnica anterior, evidenciando (em negrito) as características que devem ser evitadas, a fim de evitar problemas com a produção, purificação, análise, formação de agregados, imunogenicidade e/ou a perda de função associada com estes;

[0033] AONs preferidos, de acordo com a invenção, são fornecidos na tabela abaixo: AONP2 (SEQ ID NO 2), AONP3 (SEQ ID NO: 3), AONP4 (SEQ ID NO: 4), AONP11 (SEQ ID NO: 5), AONP12 (SEQ ID NO 6), AONP13 (SEQ ID NO: 7), AONP19 (SEQ ID NO: 8), AONP20 (SEQ ID NO: 9), AONP23 (SEQ ID NO: 10), AONP24 (SEQ ID NO: 11) e AONP26 (SEQ ID NO: 12):

[0034] Nos AONs na tabela, substancialmente todas as frações de ribose são 2’-O-metilado e, substancialmente todas as ligações internucleosídicas são fosforotioatos.

[0035] AONs mais preferidos, de acordo com a invenção, são os que têm a sequência de AONP4, AONP13 e AONP26, ainda mais preferidos possuindo substancialmente todas as frações de 2’-O-metil-ribose, e substancialmente, todas as ligações internucleosídicas fosforotioato.

[0036] Em todas as modalidades da presente invenção, os termos “modulação splicing” e “saltar éxon” são sinônimos. Com relação ao CEP290, “modulação splicing” ou “saltar éxon” devem ser interpretados como a exclusão do éxon nucleotídico 128 anormal (SEO ID NO: 1, ou formas alélicas dos mesmos) do mRNA de CEP290 (ver figura 1). O termo saltar éxon é aqui definido como a indução dentro de uma célula de um mRNA maduro que não contém um éxon particular, que estaria presente no mRNA maduro sem saltar éxon. Saltar éxon é obtido ao fornecer uma célula que expressa o pré-mRNA do referido mRNA maduro com uma molécula capaz de interferir com sequências, tais como, por exemplo, o doador de splice (críptico) ou sequência de aceitador de splice (críptica) necessária para permitir o processo bioquímico de splicing, ou com uma molécula que é capaz de interferir com um sinal de inclusão de éxon necessário para o reconhecimento de um trecho de nucleotídeos, como um éxon para ser incluído no mRNA maduro; tais moléculas são aqui referidas como moléculas de saltar éxon.

[0037] O termo pré-mRNA se refere a um mRNA não processado ou mRNA precursor parcialmente processado que é sintetizado a partir de um molde de DNA em células através de transcrição.

[0038] O termo “oligonucleotídeo antissenso” é entendido por se referir a uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência nucleotídica alvo em uma molécula de pré-mRNA, hnRNA (RNA nuclear heterogêneo) ou molécula de mRNA, de modo que seja capaz de hibridizar com a sua sequência alvo correspondente.

[0039] O termo “complementar”, tal como aqui utilizado, inclui “totalmente complementar” e “substancialmente complementar”, o que significa que será normalmente um grau de complementaridade entre o oligonucleotídeo e a sua sequência alvo correspondente de mais do que 80%, de preferência mais do que 85%, ainda mais preferencialmente de mais do que 90%, mais preferencialmente mais do que 95%. Por exemplo, para um oligonucleotídeo de 20 nucleotídeos de comprimento, com um erro de emparelhamento entre a sua sequência e a sua sequência alvo, o grau de complementaridade é de 95%.

[0040] O grau de complementaridade entre a sequência antissenso é de preferência tal que uma molécula compreendendo a sequência antissenso possa hibridizar com a sequência de nucleotídeos alvo na molécula de RNA sob condições fisiológicas, desse modo, facilitando saltar o éxon. É bem conhecido para um técnico especialista no assunto que determinados emparelhamentos errados são mais admissíveis do que outros, porque certos emparelhamentos errados têm menos efeito sobre a força de ligação, tal como expresso em termos de temperatura de fusão ou Tm, entre AON e a sequência alvo, do que outros. Alguns pares de bases não complementares podem formar oscilações que rompem a ligação geral, em menor grau, do que erros de emparelhamento verdadeiros. O comprimento do AON também desempenha um papel na resistência de ligação, AONs mais longos com temperaturas de fusão mais elevadas como uma regra do que AONs mais curtos, e o teor de G/C de um oligonucleotídeo é também um fator que determina a força de ligação, quanto maior o teor de G/C, mais elevada a temperatura de fusão para um determinado comprimento. Certas modificações químicas das nucleobases ou a estrutura principal de açúcar-fosfato, como contemplado pela presente invenção, também podem influenciar a força de ligação, de tal modo que o grau de complementaridade é apenas um fator a ser considerado na concepção de um oligonucleotídeo, de acordo com a invenção.

[0041] A presença de um CpG ou múltiplos (dois ou mais) CpGs em um oligonucleotídeo é geralmente associada com um aumento da imunogenicidade do referido oligonucleotídeo (Dorn and Kippenberger, 2008). Esta imunogenicidade aumentada é indesejável, uma vez que esta pode induzir o dano do tecido a ser tratado, ou seja, o olho.

[0042] A invenção permite conceber um oligonucleotídeo com cinética de ligação ao RNA aceitável e/ou propriedades termodinâmicas. A cinética de ligação ao RNA e/ou propriedades termodinâmicas são, pelo menos em parte, determinadas pela temperatura de fusão de um oligonucleotídeo (Tm; calculada com o calculador propriedades de oligonucleotídeos (www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html) para RNA de fita simples usando a Tm básica e os modelos de vizinhos mais próximos), e/ou a energia livre do complexo AON- éxon alvo (utilizando a estrutura de RNA versão 4.5). Se uma Tm é muito alta, espera-se que o oligonucleotídeo seja menos específico. Uma Tm e energia livre aceitáveis dependem da sequência do oligonucleotídeo, a química da estrutura principal (fosfodiéster, fosforotioato, fosforamidato, peptídeo-ácido nucleico, etc.), a natureza da fração de açúcar (ribose, desoxirribose, ribose substituída, ponte intramolecular) e modificação química da nucleobase. Portanto, a faixa de Tm pode variar amplamente.

[0043] A presente invenção fornece um método para a concepção de um AON de acordo com a invenção por microwalking por todo o éxon críptico com oligos de um determinado comprimento. O comprimento do oligo selecionado pelos presentes inventores tinha 17 nucleotídeos, mas um comprimento diferente também é possível. É preferido ter um comprimento longo o suficiente para permitir uma interação estável com o RNA alvo e a especificidade para a sequência alvo, mas não mais comprido do que o necessário, uma vez que oligonucleotídeos mais longos são mais caros para serem fabricados e são mais complexos do ponto de vista analítico. Subsequentemente, todo o éxon críptico ou uma parte do mesmo pode ser sondado por moléculas que saltam éxon eficientes, gerando uma série de oligonucleotídeos sobrepostos que são testados em um ensaio in vitro quanto à sua eficácia de saltar éxon - tal como ilustrado nos exemplos. Em uma abordagem alternativa, o éxon críptico é pesquisado para potenciais motivos de melhora do splicing e uma faixa de AONs é concebida de forma direcionada para esses motivos. Os AONs que estabelecem uma eficácia satisfatória de salto de éxon são, então, selecionados com base na capacidade de fabricação, na imunogenicidade e outros critérios de usabilidade aqui fornecidos.

[0044] A estratégia oposta também é possível. De acordo com esta estratégia, os oligos são em primeiro lugar concebidos com base na capacidade de fabricação, a imunogenicidade e outros critérios de usabilidade fornecidos pela presente invenção, e são então testados quanto à eficácia de saltar éxon. A atividade funcional do referido oligonucleotídeo é, preferencialmente, induzir o salto do éxon CEP290 de nucleotídeo 128 anormal (SEQ ID NO: 1), em certa extensão e/ou pelo menos em parte, reduzir a produção de um mRNA de CEP290 anormal, aumentando assim a produção de mRNA de CEP290 em peso. Em uma modalidade preferencial, um oligonucleotídeo é referido para induzir o salto do éxon nucleotídico 128 anormal de CEP290(SEQ ID NO: 1), quando o percentual de salto de éxon nucleotídico 128 anormal de CEP290 (SEQ ID NO: 1), como medido pela análise por RT-PCR quantitativo em tempo real é, pelo menos, 30%, ou pelo menos 35%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 45%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 55%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 65%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 75%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou, pelo menos, 99%.

[0045] O percentual de salto (ou eficiência de salto do sítio de splice) pode ser calculado por determinação da concentração da banda de tipo selvagem amplificada, dividido pela concentração da banda mutante amplificada, depois de um determinado número de ciclos de PCR, vezes 100%, para qualquer determinado conjunto de iniciadores, contanto que o número de ciclos seja tal que a amplificação esteja ainda na fase exponencial.

[0046] AONs preferidos, de acordo com a invenção, são os que mostram um percentual de salto de mais do que 70% em células tratadas com AON em comparação com as células não tratadas, mais preferencialmente mais do que 80%, ainda mais preferencialmente mais do que 90%, tal como medido por análise de RT-PCR.

[0047] De um modo preferencial, um AON de acordo com a invenção, que compreende uma sequência que é complementar a uma sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 1 é tal que a parte complementar é pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, mais do que 100% complementar à sequência alvo. O comprimento da referida parte complementar do referido oligonucleotídeo é de preferência, pelo menos, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos. De acordo com uma modalidade mais preferida, o comprimento da parte complementar está entre cerca de 12 e cerca de 25 nucleotídeos, mais preferencialmente, entre 14 e cerca de 20 nucleotídeos, mais preferencialmente, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos. De preferência, o comprimento da parte complementar do oligonucleotídeo é o mesmo que o comprimento do oligonucleotídeo, significando que nenhuma das 5’ ou 3’ extremidades do oligo que não formam um par de bases com o RNA alvo. Assim um comprimento preferencial para um oligonucleotídeo da invenção é de 30 nucleotídeos ou menos por exemplo, < 25, < 20, ou 16-19 nucleotídeos.

[0048] Assim, não é absolutamente necessário que todas as bases da região de complementaridade sejam capazes de emparelhamento com as bases na fita oposta. Por exemplo, ao conceber o oligonucleotídeo pode-se querer incorporar, por exemplo, um resíduo que não faz par de bases com a base na fita complementar. Emparelhamentos errados podem, em certa medida, ser permitidos, se de acordo com as circunstâncias na célula, o trecho de nucleotídeos é suficientemente capaz de hibridizar com a parte complementar. Neste contexto, “de modo suficiente” significa que os AONs, de acordo com a invenção, são capazes de induzir o salto de éxon do éxon críptico de 128bp. Saltar o éxon tido como alvo (críptico) pode ser convenientemente avaliado por RT-PCR. As regiões complementares são preferencialmente concebidas de tal modo que, quando combinadas, estas são específicas para o éxon no pré-mRNA. Tal especificidade pode ser criada com vários comprimentos de regiões complementares, uma vez que isto depende das sequências reais em outras moléculas (pré-) mRNA no sistema. O risco de que o oligonucleotídeo também seja capaz de hibridizar com uma ou mais outras moléculas de pré-mRNA decresce com o aumento de tamanho do oligonucleotídeo. É claro que os oligonucleotídeos, compreendendo emparelhamentos errados na região de complementaridade, mas que retêm a capacidade para hibridizar e/ou se ligar às regiões alvos no pré-mRNA, podem ser utilizados na presente invenção. No entanto, de um modo preferencial, pelo menos as partes complementares não compreendem tais emparelhamentos errados, uma vez que estes possuem tipicamente uma maior eficiência e uma maior especificidade do que os oligonucleotídeos tendo tais emparelhamentos errados em uma ou mais regiões complementares. Pensa-se que as forças de hibridização mais elevadas (ou seja, o aumento do número de interações com a fita oposta) são favoráveis para o aumento da eficiência do processo de interferir com o maquinário de splicing do sistema. De modo preferencial, a complementaridade é de 90% a 100%. Em geral, isto permite 1 a 2 emparelhamentos errados em um oligonucleotídeo de 20 nucleotídeos ou 1, 2, 3 ou 4 emparelhamentos errados em um oligonucleotídeo de 40 nucleotídeos, ou 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 emparelhamentos errados em uma oligonucleotídeo de 60 nucleotídeos, etc.

[0049] Uma molécula de salto de éxon da invenção é de preferência um oligonucleotídeo (antissenso), que é complementar com a SEQ ID NO: 1.

[0050] Nessas modalidades da presente invenção, em que uma molécula de salto de éxon compreende ou consiste em um oligonucleotídeo antissenso que se liga a, ou é complementar a, pelo menos, a parte da SEQ ID NO: 1 que compreende a mutação c.2991 + 1655A > G, a referida molécula de salto de éxon compreende, preferencialmente, um nucleotídeo “C” na posição complementar ao nucleotídeo mutado “G” na SEQ ID NO: 1.

[0051] Em certas modalidades, a invenção proporciona uma molécula de salto de éxon que compreende ou que consiste preferencialmente em um oligonucleotídeo antissenso selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.

[0052] Em uma modalidade mais preferencial, a invenção fornece uma molécula de salto de éxon que compreende ou preferencialmente consiste no oligonucleotídeo antissenso SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 11. Verificou-se que estes AONs são muito eficientes na modulação de splicing do éxon nucleotídico 128 anormal de CEP290, enquanto eles não contêm G-tétrades, uma composição de guanosina nucleobase de mais do que 60% (50% ou 40%), (mais do que) uma sequência CpG, ou sequências que podem formar estruturas em hairpin que compreendem mais do que 3 pares de bases consecutivos.

[0053] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo da presente invenção não é constituído por SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades um oligonucleotídeo da presente invenção não inclui a SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades um oligonucleotídeo da invenção não é um RNA que consiste na sequência gcgguggcucacaucuguaauc (SEQ ID NO: 33), gggcgcgguggcucacaucugua (SEQ ID NO: 34), ou cgcgguggcucacaucugu (SEQ ID NO: 35).

[0054] Uma molécula de salto de éxon de acordo com a invenção pode conter um ou mais dos resíduos de DNA (por conseguinte, um resíduo “u” de RNA será um resíduo de “t” como homólogo de DNA), ou um ou mais resíduos de RNA e/ou um ou mais análogos de nucleotídeos ou equivalentes, tal como será ainda mais detalhado aqui a seguir. As SEQ ID NOs: 2 a 12 são sequências de RNA, mas a invenção também contempla cada uma destas sequências na forma de DNA, e também os híbridos de DNA/RNA destas sequências.

[0055] É preferencial que uma molécula de salto de éxon da invenção compreenda um ou mais resíduos que são modificados para aumentar a resistência a nucleases e/ou para aumentar a afinidade do oligonucleotídeo antissenso para a sequência alvo. Portanto, em uma modalidade preferencial, a sequência de nucleotídeo antissenso compreende pelo menos um análogo de nucleotídeos ou equivalente, em que um análogo de nucleotídeo ou equivalente é definido como um resíduo tendo uma base modificada e/ou uma estrutura modificada e/ou uma ligação de internucleosídeo não natural, ou uma combinação destas modificações.

[0056] Em uma modalidade preferencial, o análogo de nucleotídeo ou equivalente compreende uma estrutura principal modificada. Exemplos de tais estruturas principais são fornecidos por estruturas principais de morfolino, estruturas principais de carbamato, estruturas principais de siloxano, estruturas principais sulfeto, sulfóxido e sulfona, estruturas principais de formacetil e de tioformacetil, estruturas principais de metilenoformacetil, estruturas principais de riboacetil, estruturas principais contendo alqueno, estruturas principais de sulfamato, sulfonato e sulfonamida, estruturas principais de metilenoimino e de metilenohidrazino, e estruturas principais de amida. Oligômeros de fosforodiamidato morfolino são estruturas principais de oligonucleotídeos modificados que foram anteriormente investigados como agentes antissenso. Oligonuclotídeos morfolino têm uma estrutura principal não carregada em que o açúcar desoxirribose de DNA é substituído por um anel de seis membros e a ligação fosfodiéster é substituída por uma ligação de fosforodiamidato. Oligonucleotídeos morfolino são resistentes a degradação enzimática e parecem funcionar como agentes antissenso pelo impedimento da tradução ou interferindo com o splicing de pré-mRNA, em vez de através da ativação de RNase H. Oligonuclotídeos morfolino foram liberados de modo bem sucedido às células de cultura de tecido por métodos que rompem fisicamente a membrana celular, e um estudo comparando vários destes métodos descobriu que o carregamento de esfregaço foi o método mais eficiente de liberação; no entanto, devido ao fato de que a estrutura principal de morfolino é não carregada, os lipídeos catiônicos não são mediadores eficazes de absorção de oligonucleotídeo morfolino nas células. Um relatório recente demonstrou a formação de tríplexes por um oligonucleotídeo morfolino e, por causa da estrutura principal não iônica, estes estudos demonstraram que o oligonucleotídeo morfolino foi capaz de formação de tríplex na ausência de magnésio.

[0057] É ainda preferido que a ligação entre os resíduos em uma estrutura principal não inclua um átomo de fósforo, tal como uma ligação que é formada por ligações internucleosídicas de alquil de cadeia curta ou cicloalquil, ligações internucleosídicas, misturas de heteroátomo e alquil ou cicloalquil, ou uma ou mais ligações internucleosídicas heteroatômicas de cadeia curta ou heterocíclicas.

[0058] Um análogo de nucleotídeo preferencial ou equivalente compreende um ácido nucleico peptídeo (PNA), que tem uma estrutura principal de poliamida modificada (Nielsen, et al. (1991) Science 254, 1497-1500). Moléculas à base de PNA são verdadeiros miméticos das moléculas de DNA em termos de reconhecimento de pares de bases. A estrutura principal do PNA é composta de unidades N-(2-aminoetil)- glicina ligadas por ligações peptídicas, em que as nucleobases estão ligadas à estrutura principal por ligações de metileno carbonil. Uma estrutura principal alternativa compreende um monômero de pirrolidina PNA estendida por um carbono (Govindaraju and Kumar (2005) Chem. Commun, 495497). Uma vez que a estrutura principal de uma molécula de PNA não contém grupos fosfato carregados, os híbridos de PNA-RNA são geralmente mais estáveis que os híbridos de RNA- RNA ou DNA-RNA, respectivamente (Egholm et al. (1993) Nature 365, 566-568).

[0059] Uma outra estrutura preferencial compreende um nucleotídeo análogo de morfolino ou equivalente, em que o açúcar ribose ou desoxirribose é substituído por um anel morfolino de 6 membros. Um análogo de nucleotídeo mais preferido ou equivalente compreende um oligómero fosforodiamidato morfolino (PMO), em que o açúcar ribose ou desoxirribose é substituído por um anel de morfolino de 6 membros, e a ligação fosfodiéster aniônica entre os anéis morfolino adjacentes é substituída por uma ligação fosforodiamidato não iônica.

[0060] Ainda em uma outra modalidade, um análogo de nucleotídeo ou equivalente da invenção compreende uma substituição de um dos oxigênios não-ponte na ligação fosfodiéster. Esta modificação desestabiliza ligeiramente o emparelhamento de bases, mas acrescenta resistência significativa à degradação por nuclease. Um análogo preferencial de nucleotídeo ou equivalente compreende fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, H-fosfonato, metil e outro alquil fosfonato incluindo 3’-alquileno fosfonato, 5’-alquileno fosfonato e fosfonato quiral, fosfinato, fosforamidato incluindo 3’-amino fosforamidato e aminoalquilfosforamidato, tionofisforamidato, tionoalquilfosfonato, tionoalquilfosfotriéster, selenofosfato ou boranofosfato.

[0061] Um outro análogo de nucleotídeo ou equivalente preferencial da invenção compreende uma ou mais unidades de açúcar que são mono- ou dissubstituídos na posição 2’, 3’ e/ou 5’ tal como um -OH; -F; (C1-C10) alquil, alquenil, alquinil, alcaril, alil, ou aralquil substituído ou não substituído, linear ou ramificado inferior, que pode ser interrompido por um ou mais heteroátomos; O-, S-, ou N- alquil; O-, S-, ou N-alquenil; O-, S- ou N-alquinil; O-, S, ou N-alil; O-alquil-O-alquil, -metoxi, -aminopropoxi; metoxietoxi; -dimetilaminooxietoxi; e - dimetilaminoetoxietoxi. A fração de açúcar pode ser uma furanose ou um derivado da mesma, ou uma deoxifuranose ou um derivado da mesma, de um modo preferencial, ribose ou um derivado da mesma, ou desoxirribose ou um derivado da mesma. Uma fração de açúcar derivada preferencial compreende um ácido nucleico bloqueado (LNA), em que o átomo de 2’- carbono está ligado ao átomo 3’ ou 4’ carbono do anel de açúcar formando, deste modo, uma fração de açúcar bicíclica. Um LNA preferencial compreende ácido nucleico em ponte de 2’-O,4’-C-etileno (Morita et al., 2001. Nucleic Acid Res Supplement No. 1: 241-242). Estas substituições geram o análogo de nucleotídeo ou RNase H equivalente resistente a nuclease e aumentam a afinidade para o RNA alvo.

[0062] Em outra modalidade, um análogo de nucleotídeo ou equivalente da invenção compreende uma ou mais modificações de bases ou substituições. As bases modificadas compreendem bases sintéticas e naturais, tais como inosina, xantina, hipoxantina e outro -aza, deaza, hidroxi, -halo, -tio, tiol, -alquil, -alquenil, -alquinil, tioalquil derivados de bases de pirimidina e purina que são ou serão conhecidos na técnica.

[0063] É entendido por um técnico especialista no assunto que não é necessário para todas as posições em um oligonucleotídeo antissenso serem modificadas de modo uniforme. Além disso, mais do que um dos análogos ou equivalentes acima mencionados podem ser incorporados em um único oligonucleotídeo antissenso ou mesmo em uma posição única dentro de um oligonucleotídeo antissenso. Em certas modalidades, um oligonucleotídeo antissenso da invenção tem, pelo menos, dois tipos diferentes de análogos ou equivalentes.

[0064] De acordo com outra modalidade, AONs de acordo com a invenção compreendem um oligonucleotídeo antissenso 2’-O alquil (de preferência inferior) fosforotioato, tais como ribose modificada com 2’-O-metil (RNA), ribose modificada com 2’-O-metoxietil, ribose modificada com 2’-O- etil, ribose modificada com 2’-O-propil e/ou derivados substituídos destas modificações tais como derivados halogenados.

[0065] Um oligonucleotídeo antissenso eficaz e preferencial de acordo com a invenção compreende frações de ribose modificadas com 2’-O-metil com uma estrutura principal de fosforotioato, de preferência, em que substancialmente todas as frações de ribose são 2’-O-metil e substancialmente todas as ligações internucleosídicas são ligações fosforotioato.

[0066] Será também entendido por um técnico especialista no assunto que diferentes oligonucleotídeos antissenso podem ser combinados para eficientemente pular o éxon nucleotídico 128 anormal de CEP290. Uma combinação de dois oligonucleotídeos antissenso pode ser utilizada em um método da invenção, tal como dois oligonucleotídeos antissenso, três oligonucleotídeos antissenso diferentes, quatro oligonucleotídeos antissenso diferentes, ou cinco oligonucleotídeos antissenso diferentes sendo direcionados para as mesmas ou diferentes regiões do éxon críptico (fig. 1).

[0067] Um oligonucleotídeo antissenso pode ser ligado a uma fração que aumenta a absorção do oligonucleotídeo antissenso nas células, preferencialmente células de retina. Exemplos de tais frações são colesteróis, carboidratos, vitaminas, biotina, lipídeos, fosfolipídeos, peptídeos de penetração nas células, incluindo, mas não se limitando a antenapedia, TAT, transportan e aminoácidos carregados positivamente, tais como oligoarginina, poli- arginina, oligolisina ou polilisina, domínios de ligação ao antígeno tais como fornecidos por um anticorpo, um fragmento Fab de um anticorpo, ou um domínio de ligação ao antígeno de cadeia simples, tais como um domínio de ligação ao antígeno de domínio de camelídeo único.

[0068] Uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, pode ser administrada indiretamente, através de meios adequados conhecidos na técnica. Quando a molécula de salto de éxon é um oligonucleotídeo, esta pode, por exemplo, ser fornecida a um indivíduo ou uma célula, tecido ou órgão do referido indivíduo, sob a forma de um vetor de expressão em que o vetor de expressão codifica uma transcrição que compreende o referido oligonucleotídeo. O vetor de expressão é preferencialmente introduzido em uma célula, tecido, órgão ou indivíduo por meio de um veículo de liberação de genes. Em uma modalidade preferencial é fornecido um vetor de expressão de base viral que compreende um cassete de expressão ou um cassete de transcrição que dirige a expressão ou a transcrição de uma molécula de salto de éxon, tal como aqui identificado. Por conseguinte, a presente invenção fornece um vetor viral que expressa uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, quando colocada sob condições que conduzem à expressão da molécula de salto de éxon. Uma célula pode ser fornecida com uma molécula de salto de éxon capaz de interferir com as sequências essenciais que resultam em salto altamente eficiente do éxon nucleotídico 128 anormal de CEP290 por expressão de oligonucleotídeo antissenso derivado do plasmídeo ou expressão viral fornecida por vetores baseados em adenovírus ou baseados em vírus adeno- associados. A expressão pode ser dirigida por um promotor de polimerase III, tal como um promotor U1, um U6, ou U7 RNA. Um veículo de liberação preferencial é um vetor viral tal como um vetor de vírus adeno-associado (AAV), ou um vetor retroviral tal como um vetor de lentivírus e semelhantes. Além disso, plasmídeos, cromossomos artificiais, plasmídeos utilizáveis para a recombinação homóloga direcionada e integração no genoma humano de células podem ser adequadamente aplicados para a liberação de um oligonucleotídeo, tal como aqui definido. Preferencial para a presente invenção são os vetores em que a transcrição é conduzida a partir de promotores PolIII e/ou em que as transcrições estão na forma de fusões com transcrições U1 ou U7, que produzem bons resultados para a liberação de pequenas transcrições. Está dentro do conhecimento do técnico especialista no assunto projetar transcrições adequadas. São preferenciais as transcrições direcionadas para PolIII. De um modo preferencial, sob a forma de uma transcrição de fusão com uma transcrição de U1 ou U7. Tais fusões podem ser geradas como descrito (Gorman L et al., 1998 ou Suter D et al., 1999).

[0069] Um sistema de expressão de oligonucleotídeo antissenso preferencial é um vetor baseado em vírus associado a adenovírus (AAV). Vetores baseados em AAV de fita simples e de fita dupla foram desenvolvidos que podem ser usados para a expressão prolongada de sequências de nucleotídeos antissenso pequenas para saltar de forma altamente eficiente o éxon nucleotídico 128 anormal de CEP290.

[0070] Um vetor baseado em AAV preferencial, por exemplo, compreende um cassete de expressão que é acionado por um promotor de polimerase III (Pol III). Um promotor Pol III preferencial é, por exemplo, um promotor de RNA U1, um U6, ou um U7.

[0071] A invenção, portanto, também fornece um vetor baseado em vírus, que compreende um cassete de expressão direcionado por promotor Pol III para a expressão de um oligonucleotídeo antissenso da invenção para induzir o salto do éxon nucleotídico 128 anormal de CEP290.

[0072] Um vetor de AAV, de acordo com a presente invenção, é um vetor de AAV recombinante e se refere a um vetor de AAV compreendendo parte de um genoma de AAV incluindo uma molécula de salto de éxon codificado, de acordo com a invenção, encapsulada em uma casca de proteínas de proteína da capsídeo derivado de um sorotipo de AAV tal como representado aqui em outro local. Parte de um genoma de AAV pode conter as repetições terminais invertidas (ITR) derivadas de um sorotipo de vírus adeno-associado, tal como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9 e outros. A casca de proteína constituída por proteína da capsídeo pode ser derivada de um sorotipo de AAV, tais como AAV1, 2, 3, 4, 5, 8, 9 e outros. Uma casca de proteína pode também ser chamada de casca de proteína de capsídeo. O vetor AAV pode ter um ou, de preferência, todos os genes de AAV de tipo selvagem eliminados, mas ainda pode compreender sequências de ácido nucleico ITR funcionais. As sequências de ITR funcionais são necessárias para a replicação, resgate e empacotamento de vírions de AAV. As sequências ITR podem ser sequências de tipo selvagem ou podem ter, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95, ou 100% de identidade de sequência com sequências de tipo selvagem ou podem ser alteradas por, por exemplo, na inserção, mutação, deleção ou substituição de nucleotídeos, contanto que estes permaneçam funcionais. Neste contexto, a funcionalidade se refere à capacidade para direcionar o empacotamento do genoma para a casca do capsídeo e, em seguida, permitir a expressão na célula hospedeira sendo infectada ou a célula alvo. No contexto da presente invenção, uma casca de proteína de capsídeo pode ser de um sorotipo diferente do que a ITR do genoma de vetor de AAV. Um vetor de AAV, de acordo com a presente invenção, pode, assim, ser constituído por uma casca de proteína da capsídeo, ou seja, o capsídeo icosaédrico, que compreende proteínas de capsídeo (VP1, VP2 e/ou VP3) de um sorotipo de AAV, por exemplo, o sorotipo AAV 2, enquanto que as sequências de ITRs contidas naquele vetor AAV5 podem ser qualquer um dos sorotipos do AAV acima descritos, incluindo um vetor AAV2. Um “vetor AAV2” compreende, assim, uma casca da proteína de capsídeo de AAV sorotipo 2, enquanto, por exemplo, um “vetor de AAV5” compreende uma casca de proteína da capsídeo de AAV sorotipo 5, em que qualquer um pode encapsular qualquer ITR do genoma de vetor AAV, de acordo com a invenção.

[0073] De um modo preferencial, um vetor de AAV recombinante, de acordo com a presente invenção, compreende uma casca de proteína da capsídeo de AAV sorotipos 2, 5, 8 ou AAV sorotipo 9, em que o genoma de AAV ou ITRs presentes no referido vetor de AAV é derivado de AAV sorotipo 2, 5, 8 ou AAV sorotipo 9; tal vetor de AAV é referido como um vetor AAV2/2, AAV 2/5, AAV2/8, AAV2/9, AAV5/2, AAV5/5, AAV5/8, AAV5/5, AAV8/2, AAV 8/5, AAV8/8, AAV8/9, AAV9/2, AAV9/5, AAV9/8, ou um AAV9/9.

[0074] Mais preferencialmente, um vetor de AAV recombinante, de acordo com a presente invenção, compreende uma casca de proteína do capsídeo de AAV sorotipo 2 e o genoma AAV ou as ITRs presentes no referido vetor são derivados de AAV sorotipo 5; tal vetor é referido como um vetor AAV 2/5.

[0075] Mais preferencialmente, um vetor de AAV recombinante, de acordo com a presente invenção, compreende uma casca de proteína da capsídeo de AAV sorotipo 2 e o genoma do AAV ou as ITRs presentes no referido vetor são derivados de AAV sorotipo 8; tal vetor é referido como um vetor de AAV 2/8.

[0076] Mais preferencialmente, um vetor de AAV recombinante, de acordo com a presente invenção, compreende uma casca de proteína da capsídeo de AAV sorotipo 2 e o genoma do AAV ou as ITRs presentes no referido vetor são derivados de AAV sorotipo 9; tal vetor é referido como um vetor de AAV 2/9.

[0077] Mais preferencialmente, um vetor de AAV recombinante, de acordo com a presente invenção, compreende uma casca de proteína da capsídeo de AAV sorotipo 2 e o genoma do AAV ou as ITRs presentes no referido vetor são derivados de AAV sorotipo 2; tal vetor é referido como um vetor de AAV 2/2.

[0078] Uma molécula de ácido nucleico que codifica uma molécula de salto de éxon, de acordo com a presente invenção, representada por uma sequência de ácido nucleico de escolha é preferencialmente inserida entre o genoma de AAV ou sequências de ITR, como identificado acima, por exemplo, uma construção de expressão que compreende um elemento regulador da expressão operacionalmente ligado a uma sequência de codificação e uma sequência de terminação 3’.

[0079] “Funções auxiliares de AAV” se refere geralmente para as funções de AAV correspondentes necessárias para a replicação de AAV e o empacotamento fornecido para o vetor de AAV in trans. As funções auxiliares de AAV complementam as funções de AAV que são desprovidas no vetor de AAV, mas carecem de AAV ITRs (que são fornecidas pelo vetor de genoma de AAV). As funções auxiliares de AAV incluem os dois principais ORFs de AAV, ou seja, a região de codificação rep e a região de codificação cap ou sequências funcionais substancialmente idênticas dos mesmos. As regiões Rep e Cap são bem conhecidas na técnica, ver por exemplo, Chiorini et al. (1999, J. of Virology, Vol 73 (2): 13091319) ou US 5.139.941, aqui incorporadas por referência. As funções auxiliares de AAV podem ser fornecidas em uma construção auxiliar de AAV, o que pode ser um plasmídeo. A introdução da construção auxiliar na célula hospedeira pode ocorrer, por exemplo pela transformação, transfecção, ou transdução antes de, ou simultaneamente com a introdução do genoma de AAV presentes no vetor de AAV, tal como aqui identificado. As construções auxiliares de AAV da invenção podem, assim, ser escolhidas de tal modo que estas produzem a combinação desejada de sorotipos para casca de proteína da capsídeo do vetor de AAV, por um lado, e para o genoma de AAV presente na referida replicação do vetor AAV e empacotamento, por outro lado.

[0080] “Vírus auxiliar AAV” fornece funções adicionais necessárias para a replicação de AAV e empacotamento. Os vírus auxiliares de AAV adequados incluem adenovírus, vírus do herpes simples (HSV, tais como os tipos 1 e 2) e vírus vaccínia. As funções adicionais fornecidas pelo vírus auxiliar podem igualmente ser introduzidas na célula hospedeira por meio de vetores, tal como descrito em US 6.531.456 aqui incorporado por referência.

[0081] De um modo preferencial, um genoma de AAV, como presente em um vetor de AAV recombinante, de acordo com a presente invenção, não compreende quaisquer sequências de nucleotídeos que codificam proteínas virais, tais como os genes rep (replicação) ou cap (capsídeo) de AAV. Um genoma de AAV pode ainda compreender um gene marcador ou repórter, tal como um gene, por exemplo, que codifica um gene de resistência ao antibiótico, uma proteína fluorescente (por exemplo, gfp) ou um gene que codifica um produto quimicamente, enzimaticamente ou de outra forma detectável e/ou selecionável (por exemplo, lacZ, aph, etc.) conhecido na técnica.

[0082] Um vetor de AAV preferencial, de acordo com a presente invenção, é um vetor de AAV, de um modo preferencial um vetor AAV2/5, AAV2/8, AAV2/9 ou AAV2/2, expressando uma molécula de salto de éxon, de acordo com a presente invenção, que compreende um oligonucleotídeo antissenso, em que o referido oligonucleotídeo antissenso compreende ou consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, e SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 12.

[0083] Melhorias nos meios para fornecer um indivíduo ou uma célula, tecido, órgão do referido indivíduo com uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, estão previstas considerando o progresso que já foram até agora conseguidos. Tais melhorias futuras podem, evidentemente, ser incorporadas para obter o efeito mencionado na reestruturação do mRNA utilizando um método da invenção. Uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, pode ser liberada como é para um indivíduo, uma célula, tecido ou órgão do referido indivíduo. Quando se administra uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, é preferencial que a molécula seja dissolvida em uma solução que é compatível com o método de liberação. As células da retina podem ser fornecidas com um plasmídeo para a expressão de oligonucleotídeo antissenso fornecendo o plasmídeo em uma solução aquosa. Alternativamente, um plasmídeo pode ser fornecido através de transfecção utilizando agentes de transfecção conhecidos. Para administração intravenosa, subcutânea, intramuscular, intratecal e/ou intraventricular, é preferencial que a solução seja uma solução salina fisiológica. Particularmente preferencial na presente invenção é o uso de um excipiente ou agentes de transfecção que irão auxiliar na liberação de cada um dos componentes, tal como aqui definido a uma célula e/ou dentro de uma célula, de preferência, uma célula da retina. São preferenciais os excipientes ou agentes de transfecção capazes de formar complexos, nanopartículas, micelas, vesículas e/ou lipossomas que liberam cada um dos componentes, tal como aqui definido, complexados ou aprisionados em uma vesícula ou lipossoma através de uma membrana celular. Muitos destes excipientes são conhecidos na técnica. Os excipientes ou agentes de transfecção adequados compreendem polietilenimina (PEI; ExGen500 (MBI Fermentas)), LipofectAMINE™ 2000 (Invitrogen) ou derivados dos mesmos, ou polímeros catiônicos semelhantes, incluindo copolímeros de polipropilenimina ou polietilenoimina (PECs) e derivados, amfifilas sintéticas (SAINT-18), lipofectinTM, DOTAP e/ou proteínas de capsídeo viral, que são capazes de se auto montarem em partículas que podem liberar cada um dos constituintes, tal como aqui definido a uma célula, de preferência, uma célula da retina. Tais excipientes demonstraram liberar de modo eficiente um oligonucleotídeo tal como ácidos nucleicos antissenso para uma ampla variedade de células em cultura, incluindo as células da retina. O seu elevado potencial de transfecção é combinado com uma excetuada baixa a moderada toxicidade em termos de sobrevivência celular global. A facilidade de modificação estrutural pode ser usada para permitir que outras modificações e a análise de suas demais características de transferência de ácido nucleico (in vivo) e toxicidade.

[0084] Lipofectina representa um exemplo de um agente de transfecção lipossomal. Esta consiste em dois componentes lipídicos, um lipídeo catiônico N-[1-(2,3- dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio cloreto (DOTMA) (cp. DOTAP que é o sal de metilsulfato) e um lipídeo neutro de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). O componente neutro medeia a liberação intracelular. Um outro grupo de sistemas de liberação é o de nanopartículas poliméricas.

[0085] Os policátions, tais como dietilaminoetilaminoetil (DEAE)-dextrano, os quais são bem conhecidos como reagente de transfecção de DNA podem ser combinados com butilcianoacrilato (PBCA) e hexilcianoacrilato (PHCA) para formular nanopartículas catiônicas que podem liberar cada um dos constituintes, tal como aqui definido, de um modo preferencial, um oligonucleotídeo, através das membranas celulares em células.

[0086] Além destes materiais de nanopartículas comuns, a protamina de peptídeo catiônico oferece uma abordagem alternativa para formular um oligonucleotídeo com coloides. Este sistema de nanopartículas coloidal pode formar as chamadas protículas, que podem ser preparadas por um processo de automontagem simples para embalar e mediar a liberação intracelular de um oligonucleotídeo. O técnico especialista no assunto pode selecionar e adaptar qualquer um dos excipientes alternativos acima referidos ou outros comercialmente disponíveis e sistemas de liberação para embalar e distribuir uma molécula de salto de éxon para utilização na presente invenção para liberar para a prevenção, tratamento ou retardamento de uma doença ou condição relacionada com CEP290. “Prevenção, tratamento ou retardamento de uma doença ou condição relacionada com CEP290” é aqui definido, de preferência, como a prevenção, interrupção, cessação da progressão de, ou inversão da deficiência visual parcial ou completa ou cegueira que é causada por um defeito genético no gene CEP290.

[0087] Além disso, uma molécula de salto de éxon de acordo com a invenção pode ser covalentemente ou não covalentemente ligada a um ligante de direcionamento especificamente concebido para facilitar a absorção para dentro da célula, citoplasma e/ou o seu núcleo. Tal ligante pode compreender (i) um composto (incluindo, mas não limitado às estruturas (tipo) peptídeo) que reconhece células, tecido ou elementos específicos de órgãos para facilitar a absorção celular e/ou (ii) um composto químico capaz de facilitar a absorção para as células e/ou a liberação intracelular de um oligonucleotídeo a partir de vesículas, por exemplo, os endossomas ou lisossomas.

[0088] Portanto, em uma modalidade preferencial, uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, é formulada em uma composição ou um medicamento ou uma composição, que é fornecido com pelo menos um excipiente e/ou um ligante de direcionamento para liberação e/ou um dispositivo de liberação dos mesmos a uma célula e/ou melhorar a sua liberação intracelular.

[0089] Deve ser entendido que se uma composição compreende um componente adicional tal como um composto adjuvante, como aqui definido posteriormente, cada um dos componentes da composição pode não ser formulado em uma única combinação ou composição ou preparação. Dependendo da sua identidade, o técnico especialista no assunto saberá qual tipo de formulação é o mais apropriado para cada constituinte, tal como aqui definido. Em uma modalidade preferencial, a invenção proporciona uma composição ou uma preparação que está na forma de um kit de partes compreendendo uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, e um outro composto adjuvante como aqui posteriormente definido.

[0090] Se necessário, uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, ou um vetor, de preferência, um vetor viral, que expressa uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, pode ser incorporada em uma mistura farmaceuticamente ativa através da adição de um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0091] Por conseguinte, a invenção também fornece uma composição, preferencialmente uma composição farmacêutica, compreendendo uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, ou um vetor viral, de acordo com a invenção, e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Tal composição pode compreender uma única molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, mas também pode compreender múltiplas moléculas distintas de salto de éxon, de acordo com a invenção. Uma tal composição farmacêutica pode compreender qualquer excipiente farmaceuticamente aceitável, incluindo um carreador, agente de enchimento, conservante, adjuvante, solubilizante e/ou diluente. Tal carreador, agente de enchimento, conservante, adjuvante, solubilizante e/ou diluente farmaceuticamente aceitável pode, por exemplo, ser encontrado em Remington, 2000. Cada característica da referida composição foi anteriormente aqui definida.

[0092] Se forem utilizadas múltiplas moléculas de salto de éxons distintas, de acordo com a invenção, a concentração ou dose aqui definida, pode se referir à concentração total ou dose de todos os oligonucleotídeos utilizados ou a concentração ou a dose de cada molécula de salto de éxon usada ou adicionada. Por conseguinte, em uma modalidade, é fornecida uma composição em que cada uma ou a quantidade total de moléculas de salto de éxon, de acordo com a invenção, é utilizada em uma quantidade doseada que varia desde 0,0001 a 20 mg/kg, de preferência, a partir de 0,01 a 20 mg/kg.

[0093] Uma molécula de salto de éxon preferencial, de acordo com a invenção, é para o tratamento de uma doença ou condição relacionada com CEP290 de um indivíduo. Em todas as modalidades da presente invenção, o termo “tratamento” é entendido para incluir a prevenção e/ou atraso da doença ou condição relacionada com CEP290. Um indivíduo que pode ser tratado utilizando uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, pode já ter sido diagnosticado como tendo uma doença ou condição relacionada com CEP290. Alternativamente, um indivíduo que pode ser tratado utilizando uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, pode não ter sido ainda diagnosticado como tendo uma doença ou condição relacionada com CEP290, mas pode ser um indivíduo com um risco aumentado de desenvolver uma doença ou condição relacionada com CEP290 no futuro dado o seu fundo genético. Um indivíduo preferencial é um ser humano. Em uma modalidade preferencial, a doença ou condição relacionada com CEP290 é Amaurose Congênita de Leber.

[0094] Por conseguinte, a presente invenção proporciona ainda uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, ou um vetor viral, de acordo com a invenção, ou uma composição, de acordo com a invenção, para utilização como um medicamento, para o tratamento de uma doença ou condição relacionada com CEP290 que requer a modulação de splicing de CEP290 e para a utilização como um medicamento para a prevenção, tratamento ou retardamento de uma doença ou condição relacionada com CEP290. Uma doença ou condição relacionada com CEP290 preferencial é Amaurose Congênita de Leber. Cada característica da referida utilização foi anteriormente aqui definida.

[0095] A invenção proporciona ainda a utilização de uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, ou de um vetor viral, de acordo com a invenção, ou uma composição, de acordo com a invenção, para o tratamento de uma doença ou condição relacionada com CEP290 que requer modulação de splicing de CEP290. Em uma modalidade preferencial, a doença ou condição relacionada com CEP290 é Amaurose Congênita de Leber.

[0096] A presente invenção proporciona ainda uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, ou de um vetor viral, de acordo com a invenção, ou uma composição, de acordo com a invenção, para a utilização como um medicamento.

[0097] A invenção fornece ainda um método para o tratamento de um humano contendo no seu genoma uma mutação no íntron 26 do gene CEP290 (c. 2991 + 1655A > G), que compreende a administração de um AON ao humano, um vetor viral, ou uma composição farmacêutica da invenção. Estes pacientes podem sofrer de Amaurose Congênita de Leber.

[0098] Outras modalidades da invenção são AONs, vetores virais que codificam AONs, e as composições farmacêuticas compreendendo AONs, de acordo com a invenção, para a utilização como um medicamento para tratar um ser humano contendo no seu genoma uma mutação no íntron 26 do gene CEP290 (c.2991 + 1655A > G).

[0099] De acordo com uma outra modalidade da invenção, um método in vitro e/ou ex vivo é fornecido para a modulação de splicing de CEP290 em uma célula, o referido método compreendendo o contato da referida célula com um oligonucleotídeo, um vetor viral que codifica para um oligonucleotídeo, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a invenção.

[00100] As moléculas de salto de éxon, de acordo com a invenção, podem ser administradas a um paciente de modo sistêmico, local, tópico, através da administração por via oral, ou seja, por via intraocular, intrapulmonar, intranasal, intramuscular, subcutânea, intradérmica, por via retal, por ingestão, injeção, inalação, infusão, pulverização, sob a forma de soluções (aquosas), suspensões, emulsões (óleo em água), pomadas, pastilhas, pílulas etc. Uma via de administração preferencial é através da injeção intravítrea de uma solução aquosa ou formulação especialmente adaptada para a administração intraocular. Por exemplo, EP-2.425.814 divulga uma emulsão de óleo em água especialmente adaptada para a administração intra-ocular (intravítrea) de drogas de peptídeo ou ácido nucleico. Esta emulsão é menos densa do que o fluido vítreo de modo que flutua no topo do corpo vítreo, evitando que o medicamento injetado prejudique a visão.

[00101] A dosagem pode ser diária, semanal, mensal, trimestral, uma vez por ano, dependendo da via de administração e a necessidade do paciente.

[00102] Devido ao início precoce da doença, os pacientes com LCA ou em risco de desenvolver os sintomas da LCA, incluindo cegueira infantil, podem ser tratados no útero, imediatamente após o nascimento, a partir de 1, 2, 3, 6 meses de idade, a partir de um ano de idade, a partir de 3 anos de idade, a partir de 5 anos de idade, antes ou depois do aparecimento dos sintomas, para aliviar, retardar o desenvolvimento, parar ou reverter os sintomas de doenças e semelhantes.

[00103] Um tratamento em um uso ou em um método, de acordo com a invenção, é, pelo menos, uma semana, pelo menos um mês, pelo menos vários meses, pelo menos um ano, pelo menos, 2, 3, 4, 5, 6 anos ou durante a vida inteira dos pacientes. Cada molécula de salto de éxon ou oligonucleotídeo de salto de éxon ou um equivalente dos mesmos, tal como aqui definido para a utilização, de acordo com a invenção, pode ser adequada para administração direta a uma célula, tecido e/ou um órgão in vivo de indivíduos já afetados ou em risco de desenvolver doença ou condição relacionada com CEP290, e pode ser administrada diretamente in vivo, ex vivo ou in vitro. A frequência de administração de um oligonucleotídeo, composição, composto ou composto adjuvante da invenção pode depender de vários parâmetros, tais como a idade do paciente, a natureza da molécula de salto de éxon (por exemplo AON gimnótico ou AON vetorizado, tais como AONs expressos em AAV ou vetor lentiviral), a dose, a formulação da referida molécula e semelhantes.

[00104] As faixas de dose de uma molécula de salto de éxon, de preferência um oligonucleotídeo, de acordo com a invenção, são, de preferência concebidas com base em estudos de dose crescente em ensaios clínicos (utilização in vivo) para os quais existem requisitos protocolares rigorosos. Um oligonucleotídeo, tal como aqui definido, pode ser utilizado em uma faixa de dose de 0,0001 a 20 mg/kg, de preferência, de 0,001 a 20 mg/kg. O regime de dose e o de tratamento podem variar amplamente, dependendo de muitos fatores, incluindo, mas não se limitando à via de administração (por exemplo, sistêmica versus tópica, tal como diretamente no interior do olho), se o oligo é administrado como um AON gimnótico ou como AON vetorizado, o regime de dosagem, a idade e o peso do paciente, e assim por diante.

[00105] Em uma modalidade preferencial, um vetor viral, de modo preferencial, um vetor de AAV, como descrito anteriormente neste documento, como veículo de liberação para uma molécula, de acordo com a invenção, é administrado em uma dose que varia de 1 x 109 - 1 x 1017 partículas de vírus por injeção, de modo mais preferencial, de 1 x 1010 - 1 x 1014 , e de modo ainda mais preferencial, 1 x 1010 - 1 x 1012 partículas de vírus por injeção.

[00106] Será claro para um técnico especialista no assunto à qual esta invenção pertence, que os detalhes de tratamento deverão ser estabelecidos, de acordo e dependendo de fatores tais como, a sequência e a química dos oligonucleotídeos, a via de administração, a formulação, a dose, o regime de dosagem, o formato (oligonucleotídeo em vetor viral ou gimnótico), a idade e o peso do paciente, o estágio da doença, e assim por diante, o que pode exigir uma investigação mais aprofundada não clínica e clínica.

[00107] A invenção fornece ainda um método para a modulação de splicing de CEP290 em uma célula compreendendo o contato da célula, de modo preferencial, uma célula da retina com uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, ou um vetor viral, de acordo com a invenção, ou uma composição, de acordo com a invenção. As características deste aspecto são de preferência aquelas definidas anteriormente no presente documento. O contato da célula com uma molécula de salto de éxon, de acordo com a invenção, ou um vetor viral, de acordo com a invenção, ou uma composição, de acordo com a invenção, pode ser realizado por qualquer modo conhecido pelo técnico especialista no assunto. A utilização dos métodos para a liberação de moléculas de salto de éxon, vetores virais e composições aqui descritos está incluída. O contato pode ser diretamente ou indiretamente e pode ser in vivo, ex vivo ou in vitro.

[00108] Salvo se indicado de outra forma, cada modalidade, tal como aqui descrito, pode ser combinada com outra modalidade, tal como aqui descrito.

[00109] A capacidade de um oligonucleotídeo para reduzir a seleção do sítio de splice de um sítio de splice anormal associada com a mutação c.2991 + 1655A > G no íntron 26 do gene CEP290 humano, quando o referido gene é expresso em uma célula humana, e para se ligar ao pré-mRNA de CEP290 humano em condições fisiológicas em uma região que afeta a seleção de sítio de splice anormal e, deste modo, reduzir a seleção do sítio de splice anormal pelo maquinário de splicing da célula, pode ser convenientemente avaliada utilizando os ensaios divulgados na seção experimental deste documento. Em particular, o oligo pode ser incubado com uma célula que contém a mutação c.2991 + 1655A > G e a sua capacidade para reduzir a produção de mRNA pela célula que inclui o éxon anormal pode ser avaliada, por exemplo, por RT-PCR.

[00110] Como pode ser observado na seção experimental aqui, ao nível do RNA, a adição de vários AONs tendo como alvo o éxon CEP290 anormal, de fato, resultou em uma conversão de mRNA de CEP290 spliced de modo anormal para mRNA de CEP290 spliced corretamente. Esta conversão irá coincidir com um aumento da síntese da proteína CEP290 de tipo selvagem.

[00111] Em fibroblastos (que podem ser derivados a partir de células da pele), CEP290 é expresso abundantemente. Portanto, deve-se esperar que a adição de AONs para fibroblastos cultivados de pacientes com LCA irá resultar em um aumento da quantidade de proteína CEP290 de tipo selvagem que é detectável no Western blot, e como tal irá demonstrar que a terapia baseada em AON não apenas irá redirecionar splicing normal do mRNA CEP290, mas também resultará na restauração da função da proteína CEP290.

[00112] Os termos “adenina”, “guanina”, “citosina”, “timina”, “uracila” e hipoxantina (a nucleobase em inosina) se referem às nucleobases como tal.

[00113] Os termos adenosina, guanosina, citidina, timidina, uridina e inosina, se referem às nucleobases ligadas ao açúcar (desoxi) ribosil.

[00114] O termo “nucleosídeo” se refere à nucleobase ligada ao açúcar (desoxi) ribosil.

[00115] Neste documento e nas suas reivindicações, o verbo “compreender” e as suas conjugações são usadas no seu sentido não limitativo para significar que os itens após a palavra estão incluídos, mas itens não especificamente mencionados não são excluídos. Além disso, a referência a um elemento pelo artigo indefinido “um” ou “uma” não exclui a possibilidade de que mais do que um elemento esteja presente, salvo se o contexto claramente requeira que haja um e apenas um dos elementos. O artigo indefinido “um” ou “uma”, portanto, geralmente significa “pelo menos um”.

[00116] A palavra “cerca de” ou “aproximadamente”, quando utilizada em associação com um valor numérico (por exemplo, cerca de 10), de preferência, significa que o valor pode ser o valor dado (de 10) mais ou menos 5% do valor.

[00117] A informação de sequência, tal como aqui fornecida, não deve ser interpretada estritamente de modo a exigir a inclusão de bases erroneamente identificadas. O técnico especialista no assunto é capaz de identificar essas bases erroneamente identificadas e sabe como corrigir tais erros. No caso de erros de sequência, a sequência do polipeptídeo pode ser obtida pela expressão do gene presente na SEQ ID NO: 1 contendo a sequência de ácido nucleico que codifica para o polipeptídeo deve prevalecer.

MATERIAIS E MÉTODOS 1: Células

[00118] Todas as linhagens de células são fibroblastos humanos, gerados a partir de biopsias de pele. LFB1 (CL10-00008) e LFB2 (CL12-00027) são do tipo selvagem e representam as linhagens de células de controle, LFB3 (CL12-00035) e LFB4 (CL12-00036) são ambos mutantes homozigóticos para uma mutação no CEP290 (c.2991 + 1655A > G).

2: AONs

[00119] AONs foram concebidos utilizando uma abordagem “genewalk”, onde AONs 17mer foram desenhados para cobrir o éxon críptico de 128bp, com uma região de sobreposição entre AONs de aproximadamente 10bp. O RNA de AONs concebidos com a química de 2’-O-metilfosforotioato foram obtidos a partir de Tecnologias de DNA Integrado (IDT).

3: Cultura de Células e Transfecção

[00120] Todas as linhagens celulares foram cultivadas em meio DMEM-AOE (Sigma) suplementado com 20% de FBS, 1% de piruvato de sódio. Um dia antes da transfecção, as células foram semeadas em uma densidade de 2 x 105/poço em uma placa de 6 poços, em um volume total de 2,5 ml de meio. No dia da transfecção, o AON a ser testado foi adicionado a cada poço em uma concentração final de 100 nM usando maxPEI (Poliscience) como um agente de transfecção (todos em PBS), com uma proporção de massa de oligo: maxPEI de 1: 4. Depois de 24h, as células são lavadas com PBS e o lisado celular foi coletado utilizando o tampão de BL + TG fornecido com o Kit ReliaPrep RNA Cell Miniprep Systema (Promega). Os lisados celulares foram congelados a -80°C até a sua utilização.

4: Perfis de CEP290 wt e mt em amostras

[00121] Isolamento de RNA: O RNA foi isolado, a partir dos lisados de células que haviam sido guardados a -80°C, utilizando o kit ReliaPrep RNA Cell Miniprep System (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante. O RNA total foi quantificado utilizando um espectrofotômetro Nanodrop 2000 (NanoDrop Technologies) antes de ser armazenada a -80°C.

[00122] Síntese de cDNA: 400 ng de RNA foram usados como molde para a síntese de cDNA utilizando o kit de síntese Verso cDNA (Thermoscientific) com iniciadores oligodT de acordo com as instruções do fabricante. Uma amostra não RT (sem enzima) foi incluída como o controle e foi analisada juntamente com o resto das amostras.

[00123] PCR: para visualizar e quantificar os diferentes perfis de RNA mensageiro de CEP290 presente nas amostras, um fragmento de mRNA de CEP290, englobando éxon 26 a éxon 27, foi especificamente amplificado utilizando a PCR. Para esta finalidade, o cDNA (2 μl de uma diluição de 2,5 vezes) foi utilizado como molde e a amplificação da sequência alvo foi efetuada utilizando os seguintes iniciadores:ex26_Fw: 5’-TGCTAAGTACAGGGACATCTTGC-3’ (SEQ ID NO: 23) ex27_Rv: 5’- AGACTCCACTTGTTCTTTTAAGGAG-3’ (SEQ ID NO: 24).

[00124] A reação foi realizada usando AmpliTaq Gold® 360 DNA polimerase (Life Technologies; Cat. No:

[00125] Os fragmentos de PCR foram analisados utilizando o Bioanalyzer 2100 (DNA 1000 kit, Agilent Technologies). Os resultados foram analisados usando o software Expert 2100 (Agilent Technologies).

[00126] d) RT-qPCR: para medir o nível de expressão de RNA mensageiro CEP290, transcrições de tipo selvagem e mutantes foram amplificadas como fragmentos de 93bp e 117bp, respectivamente. O mRNA de proteína de ribossomo grande P0 humano (RPLP0) foi utilizado para normalização. Para isto, cDNAs (2 uL de uma diluição 10 x) foram amplificados em um tampão de qPCR (18 ul) contendo máster mix de seleção SYBR (Life Technologies) e 400 nM de iniciadores direto e reverso (SEQ ID NOs 25 - 28). O sistema utilizado para a amplificação foi um sistema de detecção de PCR em Tempo real CFX96 (Biorad) e as condições foram as seguintes: uma etapa de ativação de UDG a 50 °C durante 2 min, em seguida uma primeira etapa de desnaturação a 95 °C durante 2 min, seguido por 50 ciclos de 95 °C durante 15 segundos e 62,5 °C durante 1 min. Uma análise da curva de fusão foi realizada no final de cada ensaio para determinar a especificidade dos produtos de amplificação. Os dados foram visualizados e processados utilizando o software de Bio-Rad e os cálculos de fold change foram realizados usando o método comparativo Ct (também conhecido como o método 2 (-Delta Delta C (T))).

[00127] Os iniciadores utilizados são os seguintes: wt_Fw: 5’-TGACTGCTAAGTACAGGGACATCTTG-3’ (SEQ ID NO: 25) wt-Rv: 5’-AGGAGATGTTTTCACACTCCAGGT-3’ (SEQ ID NO: 26) mt_Fw: 5’-CTGGCCCCAGTTGTAATTTGTGA-3’ (SEQ ID NO: 27) mt_Rv: 5’-CTGTTCCCAGGCTTGTTCAATAGT-3’ (SEQ ID NO: 28)

[00128] Para esta reação, máster mix de seleção SYBR (Life Technologies), juntamente com o cDNA diluído 10 x foi usado como molde.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

[00129] Efeitos sobre a modulação de RNA dos oligonucleotídeos concebidos foram avaliados após a otimização da eficiência de transfecção e o tempo de tratamento e a concentração (dados não mostrados).

[00130] Eficiência do salto de éxon induzido por AONs 2’-O-metil-fosforotioato concebidos foi triada usando a amplificação selecionada de um fragmento de CEP290, englobando éxon 26 ao éxon 27. A visualização e a quantificação dos fragmentos de PCR foram realizadas utilizando um Bioanalyzer 2100. Nós nos perguntamos se seria possível conceber AONs que induzissem salto de éxon - como estabelecido através da determinação dos níveis do fragmento de PCR correspondentes ao mRNA spliced mutado em comparação com o mRNA spliced wt - com eficiência equivalente ou melhor do que os AONs descritos na técnica anterior, ao serem desprovidos de estruturas que iriam prejudicar a sua fabricação ou utilização terapêutica. Este trabalho identificou 11 oligonucleotídeos que satisfazem estes critérios (ver Figura 2, Tabela 1 e Tabela 2).

[00131] Análise do nível de expressão das transcrições de tipo selvagem e mutantes de RNA mensageiro de CEP290 através de qPCR confirmou os resultados obtidos com o Bioanalyzer 2100. Os cálculos de fold change mostram que o tratamento com oligonucleotídeos antissenso da invenção resgata a expressão de transcrições de tipo selvagem para níveis iguais a ou superiores do que os alcançados pelos AONs descritos na técnica anterior.

[00132] Uma vez que não é um requisito que os AONs da invenção tenham um melhor desempenho em termos de salto de éxon do que aqueles da técnica anterior, um desempenho suficiente para induzir o salto de éxon é satisfatório. Os AONs, de acordo com a invenção, descritos nos exemplos são modalidades simplesmente preferenciais da invenção. Outros AONs que preenchem os requisitos da invenção, como reivindicado, podem ser concebidos que são englobados pela presente invenção.

Claims

1. Oligonucleotídeo caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 5, 6 ou 7, em que o oligonucleotídeo compreende uma ribose modificada que é substituída na posição 2' com um substituinte selecionado do grupo consistindo em: (i) OH; (ii) F; (iii) (C1-C10) alquil, alquenil, alquinil, alcaril, alil, ou aralquil substituído ou não substituído, linear ou ramificado inferior, que pode ser interrompido por um ou mais heteroátomos; (iv) O-, S- ou N-alquil; (v) O-, S- ou N-alquenil; (vi) O-, S- ou N-alquinil; (vii) O-, S- ou N-alil; (viii) O-alquil-O-alquil, -metoxi ou aminopropoxi; (ix) metoxietoxi; (x) dimetilaminooxietoxi; e (xi) dimetilaminoetoxietoxi.

2. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma estrutura principal de fosforotioato.

3. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma ribose modificada com um 2’-O-metil.

4. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que cada ribose no oligonucleotídeo é uma ribose modificada com um 2’-O-metil.

5. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma ribose modificada com um 2’-O-metoxietil.

6. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que cada ribose no oligonucleotídeo é uma ribose modificada com um 2’-O- metoxietil.

7. Vetor viral caracterizado pelo fato de que expressa um oligonucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 quando colocado sob condições que conduzam à expressão do oligonucleotídeo em uma célula humana.

8. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou um vetor viral conforme definido na reivindicação 7.

9. Uso de um oligonucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, um vetor viral conforme definido na reivindicação 7, ou uma composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para tratar um humano contendo no seu genoma a mutação c.2991 + 1655A > G no íntron 26 do gene CEP290.