JP7188804B2 - ジストロフィー型表皮水疱症を処置するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents
ジストロフィー型表皮水疱症を処置するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド Download PDFInfo
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Description
本発明は、ヒトの疾患を処置する際に使用するのに適したオリゴヌクレオチドに関する
。特に、本発明は、ジストロフィー型表皮水疱症の処置に適したアンチセンスオリゴヌク
レオチド(AON)に関する。
脆弱性および水疱形成を特徴とする。亜型によりEBの症状の範囲は非常に広く、極わず
かな皮膚の脆弱性から全身的合併症を伴う極めて重篤な症状にまで及ぶ。世界中で約35
0,000人の患者が冒されている。EBの一部の型では、爪、髪および歯も関連する場
合もある。EBの主な型としては、EB単純型(EBS)、接合部型EB(JEB)、ジ
ストロフィー型EB(DEB)およびキンドラー症候群(KS)が挙げられる(Fine et
al. 2014)。
性があり、VII型コラーゲン(COL7A1、OMIM 120120)の欠損を伴う
。COL7A1は、VII型コラーゲンのアルファ-1鎖をコードする。VII型コラー
ゲンは、真皮の上側部分の緻密層(基底膜の一部)との係留線維として働く。翻訳後修飾
後に、3つの同一のアルファ-1鎖がコラーゲンの三重らせんドメインと一緒に折り畳ま
れる。その後、整列し係留線維を形成する逆平行二量体が形成される。VII型コラーゲ
ンは、皮膚でケラチノサイトおよび皮膚線維芽細胞によって合成される。DEB疾患の重
症度は、基底膜領域におけるVII型コラーゲン発現の量とおおむね相関する。
るか、または全身性である場合もある水疱形成が挙げられる。一般的な所見としては、瘢
痕化、稗粒腫、粘膜合併症、および異常な爪または爪がないことが挙げられる。劣性ジス
トロフィー型EB(RDEB、DEB患者の約50%)は、一般にDDEBよりも全身性
で重篤である。DDEBの症状に加えて、その他のRDEBの一般的な症状としては、栄
養不良、貧血、骨粗鬆症、食道狭窄、発育遅延、ミトン状変形(mitten deformity)(偽
合指症(pseudosyndactyly))の原因となる水かき(webbing)、または手足の指の癒着
、筋拘縮の発症、歯の形成異常、小口症および眼の瘢痕化が挙げられる。このグループで
は扁平上皮がんならびに転移性扁平上皮がんによる死亡のリスクが大幅に増加する。
的な影響を及ぼすエクソンの1つ(RDEBの7%)は、3を超える異なる突然変異、ミ
スセンス突然変異、または未成熟終止コドン(PTC)に至る突然変異を有するエクソン
80である。COL7A1遺伝子のエクソンの大多数はインフレームであるという事実の
ために、エクソンスキッピングは、タンパク質機能を保持したままで、PTC変異を有す
るエクソンを排除するための潜在的に実行可能な戦略である(Goto et al. 2006)。
型は社会の医療のための予算に高いコストを課し、被覆材および薬剤の平均コストは、年
間患者一人当たり約200,000ユーロである。DEB患者について予想される寿命は
、30から40歳の間のいずれかの年齢である。
Recherche Medicale(INSERM)の国際公開第2013/053
819号パンフレットは、エクソン80に相補的な22ヌクレオチドおよび上流イントロ
ンに相補的な2ヌクレオチドを有し、このエクソン全体をmRNAからスキップさせる、
以下の2つの24merのアンチセンスオリゴヌクレオチドについて開示している(図1
も参照):
ESE80.3 GGCC UCUU GGAC CCUG CAGA
CCCU(配列番号2)
ESE80.3-Q2I70X GGCC UCUU GGAC CCUA CAGA
CCCU(配列番号3)
ゲンと似た挙動をとる機能的なポリペプチドに翻訳される可能性が最も高い。本発明の発
明者らは、国際公開第2013/053819号パンフレットに開示されているオリゴヌ
クレオチドをヒト初代線維芽細胞(HPF)およびHeLa細胞において試験して、それ
らのスキッピング効率を評価した。両方のAONは、試験した条件下で、50%未満のス
キッピング効率を示すが、ESE80.3は、ESE80.3-Q2170Xよりもわず
かにより良く機能するようである。これらのエクソンスキッピングオリゴヌクレオチドは
この恐ろしい疾患に対処する上で有望な第1のステップを提供するが、エクソン80スキ
ッピングの効率を改良するためのさらなる代替のオリゴヌクレオチドの必要性は依然とし
て明らかにある。
e-mRNAからのスプライシングによってヒトCOL7A1 mRNAが生成されると
きに、エクソン80が前記mRNAに含まれるのを妨げるか、または低減することができ
るさまざまなAONを提供する。第1の態様では、オリゴヌクレオチドは、(a)エクソ
ン80の部分と相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ(b)24ヌクレオチド長未満で
ある。したがって、これらのオリゴヌクレオチドは、従来技術において開示されているも
のよりも短いので有利である。
ンの5’部分と相補的なヌクレオチド配列を含む。エクソン80とその下流イントロンと
の間の境界にかかるAONはこれまでに記載されていないが、それらがエクソンスキッピ
ングの促進に有効であることを本明細書において示している。例えば、これらのAONは
、5’-UCACCACU-3’、5’-ACCACUGG-3’、および/または5’
-ACUCACCA-3’を含んでもよい。
ダイズしない。例えば、オリゴヌクレオチドは、エクソン80(の部分)と相補的であり
うるが、その上流イントロンと相補的でない、すなわち、ハイブリダイゼーションは下流
イントロン内でのみ生じるはずである。同様に、オリゴヌクレオチドは、エクソン80(
の部分)と相補性の領域を含んでもよいが、相補性は、上流イントロン内に及ばない(か
つ、一部の実施形態では、それは、エクソン80に隣接するいずれのイントロン内にも及
ばない)。したがって、(例えば、図1に示されているような)塩基対合によってエクソ
ン80とアライメントされたときに、オリゴヌクレオチドは、上流イントロンとのいずれ
の塩基対も含まないことになる(かつ、一部の実施形態では、上流イントロンとの塩基対
も下流イントロンとの塩基対も含まない)。対照的に、従来技術のAONは、エクソン8
0およびその上流イントロンにかかっている(図1にある「ESE」オリゴヌクレオチド
を参照)。
、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド;例えば
、最大11~17など)である、エクソン80と相補性の領域を含む。対照的に、当技術
分野の既知のAONは、エクソン内に22merの配列を含む。エクソン80と相補的な
11~14ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドがきわめて有効であることを本明細
書において示している。
チド長などの最大20ヌクレオチド長である、エクソン80と相補性の領域、および(b
)エクソン80の上流または下流のイントロンにおける(好ましくは下流イントロンにお
ける)RNA転写産物と相補的な領域を含んでもよい。
であることが有利である。本発明のAONは、好ましくは、RNA AONである。天然
の核酸と比較して、それらは、化学的に修飾されたヌクレオシド間結合(例えば、ホスホ
ロチオエート結合)を有してもよく、(例えば、2’-O-アルキル置換で)修飾された
糖を有してもよい。
、かつエクソン80が哺乳動物、好ましくはヒトのCOL7A1 mRNAに含まれるの
を妨げるか、または低減するための方法において使用することができる。
示されているものと比較して、同様のまたはより良好なエクソンスキッピング特性を有す
るアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)が得られた。本発明のこれらのAONは、
ヒトの疾患、より詳細には、表皮水疱症(EB)、さらにより詳細には、COL7A1エ
クソン80内の突然変異と関連したEBを処置するための治療において活性医薬物質とし
て使用することができる。これらのAONは、単独の活性医薬物質として、COL7A1
エクソン80を標的とする他のAON(本明細書中に開示されているものを含む)と組み
合わせて、かつ/またはEB疾患を処置するための他の活性医薬物質と組み合わせて使用
されてもよい。そのような他の医薬物質は、他のAON、例えば、他のエクソン(エクソ
ン73、74または3を含む)内の突然変異を標的とするもの、または非AON活性医薬
物質であってもよい。組合せ治療は、同時または連続に投与される、単一の組成物または
複数の組成物の形態であってもよい。
A1 mRNAが生成されるときに、エクソン80が前記mRNAに含まれるのを妨げる
か、または低減することができるAONであって、COL7A1遺伝子のエクソン80の
少なくとも一部と相補的であり、かつエクソン80の上流イントロンと相補的でないヌク
レオチド配列、またはエクソン80の少なくとも一部と相補的であり、かつ24ヌクレオ
チド長未満であるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするAONに関する。好ましい実
施形態では、本発明によるAONは、エクソン80と相補性の領域を含み、ここで、相補
性の前記領域は、最大20ヌクレオチド長、好ましくは11、12、13、14、15、
16または17ヌクレオチドである。より好ましくは、前記AONは、エクソン80の3
’部分および下流イントロンの5’部分と相補的なヌクレオチド配列を含む。さらにより
好ましくは、AONは、ヌクレオチド配列5’-UCACCACU-3’、5’-ACC
ACUGG-3’、または5’-ACUCACCA-3’を含む。最も好ましくは、本発
明によるAONは、配列番号7、8、25、26、28、31および32からなる群から
選択されるヌクレオチド配列を含む。
、22、または23ヌクレオチドを含む、本発明によるAONに関する。好ましくは、前
記AONは配列番号4もしくは5のヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記AO
Nは配列番号6のヌクレオチド配列を含み、またはAONは配列番号30のヌクレオチド
配列を含む。
いて開示されているものよりも短いことが好ましいという点で、商品の製造容易性、分出
記録および/またはコストに関して、従来技術において開示されているものを超える特定
の利点を有する。
ド長である。AONがエクソン80のみと相補的であり、かつ(本明細書中に示している
ような)その隣接イントロンのいずれとも相補的でない場合、それは、全エクソンの36
nt長(例えば、AON80.13)までの任意の長さであってもよい。
Aは、短いが機能的なCOL VIIタンパク質に翻訳されることになる。しかし、一部
の例では、本発明の特定のAONを使用すると、より長い転写産物も形成され(例えば、
イントロン82からの配列)、これは、より短い(機能的)タンパク質と並んで(非機能
的かつ容易に分解可能な)タンパク質の発現をもたらしうる。
てヒトCOL7A1 mRNAが生成されるときに、エクソン80が前記mRNAに含ま
れるのを妨げるか、または低減することができるAONであって、前記オリゴヌクレオチ
ドの配列が、エクソン80の3’部分および下流イントロンの5’部分と相補的である(
例えば、12エクソンヌクレオチドおよび12イントロンヌクレオチドを有する24me
rの5’-CCTGGCCCAGTGgtgagtacccaa-3’(配列番号21)
と(部分的に)相補的である)ことを特徴とするAONが特定された。これまでに、エク
ソン80とその下流イントロンとの間の境界をカバーするAONは、記載されていない。
そのようなAONは、例えば、以下を含んでもよい:(i)配列5’-UCACCACU
-3’(配列番号22)、したがって、エクソン/イントロン境界の両側からの少なくと
も4ヌクレオチドを含む;(ii)配列5’-ACCACUGG-3’(配列番号23)
、したがって、境界のイントロン側からの少なくとも2ヌクレオチドおよびエクソン側か
らの少なくとも6ヌクレオチドを含む;ならびに/または(iii)配列5’-ACUC
ACCA-3’(配列番号24)、したがって、境界のイントロン側からの少なくとも6
ヌクレオチドおよびエクソン側からの少なくとも2ヌクレオチドを含む。AON80.4
、AON80.5、AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、A
ON80.5.4、AON80.5.5、AON80.5.7およびAON80.5.8
、(下記を参照)は、そのようなAONの例である。この型のAONは、理想的には、境
界のそれぞれの側から少なくとも2ヌクレオチド(例えば、それぞれの側から少なくとも
4または6ヌクレオチド)を含むが、それぞれの側から同数のヌクレオチドを含む必要は
ない(例えば、奇数のヌクレオチドを有していてもよい、例えば、AON80.5系列な
ど)。
び下流イントロンの5’部分と相補的であり、かつ哺乳動物細胞においてpre-mRN
AからのスプライシングによってヒトCOL7A1 mRNAが生成されるときにエクソ
ン80が前記mRNAに含まれるのを妨げるか、または低減することができることが初め
て記載される。これらのAONは、このように有用であると同時に、哺乳動物細胞におい
てpre-mRNAからのスプライシングによってヒトCOL7A1 mRNAが生成さ
れるときに、エクソン80が前記mRNAに含まれるのを妨げるか、または低減すること
ができる他のAONと組み合わせるため、特に、エクソン80の内側の部分などのエクソ
ン80の異なる部分、またはエクソン80の5’部分および/もしくはエクソン80とそ
の上流イントロンとの5’境界と相補的なAONと組み合わせるための良好な候補である
と考えられている。そのような組合せは、有利であると考えられており、エクソン80が
スキップされる効率を高めるために必要なはずである。
てもよく、したがって、エクソン80の上流および下流のイントロンにハイブリダイズす
る領域を含まない。AON80.3はそのようなAONの一例であり、AON80.13
も同様である(下記を参照)。
上流イントロンにハイブリダイズしない。AON80.3、AON80.4、AON80
.5、AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.5
.4、AON80.5.5、AON80.5.7、AON80.5.8およびAON80
.13は、そのようなAONの例である(ここで、AON80.4、AON80.5、A
ON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.5.4、A
ON80.5.5、AON80.5.7およびAON80.5.8は、エクソン80の直
接下流のイントロンにもハイブリダイズするAONの例である)。
補性の領域を含む(一方、従来技術のAONのエクソン相補的領域は、22ヌクレオチド
長である)。AON80.1、AON80.2、AON80.3、AON80.4、およ
びAON80.5(下記の表1を参照)のそれぞれは、そのようなAONの例であり、そ
れぞれ10、17、20、12、および12エクソン相補的ヌクレオチドのストレッチを
有する。AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.
5.4、AON80.5.5、AON80.5.7およびAON80.5.8系列は、さ
らなる例である(9から14ヌクレオチドのエクソン重複を有する)。したがって、エク
ソン80と相補性の領域は、11、12、13、14、15、16または17ヌクレオチ
ドなどの11から17ヌクレオチドの間などの8から20の間(例えば、10から20ヌ
クレオチドの間)の長さであってもよい。
クソン80の上流または下流のイントロンと相補的な領域があってもよい。したがって、
そのようなAONは、新生RNA転写産物との、単一の、基本的に連続した、一続きの相
補性を含み、これは、エクソン80とその隣接イントロンのうちの1つとの間の境界にか
かる。
、AON80.2、AON80.3、AON80.4、およびAON80.5である。本
発明のさらに好ましいAONは、表1および2に開示されているAON80.5.1、A
ON80.5.2、AON80.5.4、AON80.5.7、AON80.5.8およ
びAON80.13である。本発明によるきわめて好ましいAONは、AON80.2(
配列番号5)、AON80.5(配列番号8)、AON80.5.1(配列番号25)、
AON80.5.2(配列番号26)、AON80.5.7(配列番号31)、AON8
0.5.8(配列番号32)およびAON80.13(配列番号30)である。別の好ま
しい実施形態では、すべてのリボース部分が2’-O-メチル化されており、実質的にす
べてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである。
くとも低減すること」および「エクソンスキッピング」という用語は同義である。COL
7A1に関して、「エクソンが含まれるのを妨げるか、または少なくとも低減すること」
または「エクソンスキッピング」は、エクソン80(配列番号18またはそのアレル型)
のヒトCOL7A1 mRNA(図1を参照)からの排除と解釈されるべきである。エク
ソンスキッピングという用語は、本明細書において、エクソンスキッピングされていない
成熟mRNAに存在することになろう特定のエクソンを含まない成熟mRNAを細胞内で
誘導することと定義される。エクソンスキッピングは、スプライシングの生化学的プロセ
スを可能にするために必要とされる、例えば、スプライスドナー配列もしくはスプライシ
ングアクセプター配列などの配列を妨害することができる分子を用いて、またはひと続き
のヌクレオチドを成熟mRNAに含まれるべきエクソンと認識するために必要とされるエ
クソン選択シグナル(exon inclusion signal)を妨害することができる分子を用いて前
記成熟mRNAのpre-mRNAを発現する細胞をもたらすことによって達成される。
そのような分子は、本明細書においてはエクソンスキッピング分子と呼ばれる。
シングされていないか、または部分的にプロセシングされた前駆体mRNAを指す。
A(ヘテロ核RNA)またはmRNA分子中の標的ヌクレオチド配列と相補的であり、そ
の結果、その対応する標的配列とアニーリングすることができるヌクレオチド配列を指す
ものと理解される。
常、オリゴヌクレオチドとその対応する標的配列との間の相補性の程度が80%超、好ま
しくは85%超、さらにより好ましくは90%超、最も好ましくは95%超になることを
意味する「実質的に相補的な」とを含む。例えば、その配列とその標的配列との間に1つ
のミスマッチを含む20ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対する、相補性の程度は
95%である。
いてRNA分子中の標的ヌクレオチド配列とアニーリングすることができ、それによりエ
クソンスキッピングを促進するようにされることが好ましい。特定のミスマッチは、他の
ものよりも融解温度すなわちTmを単位として表されるAONと標的配列との間の結合の
強度に対する影響が小さいため、特定のミスマッチは他のものより許容されることが当業
者にはよく知られている。特定の非相補的な塩基対は、真のミスマッチほどではないにせ
よ全体的な結合を妨げる、いわゆる「ゆらぎ」を生じる場合もある。AONの長さも結合
の強度に影響を与え、長いAONは、通例、短いAONよりも高い融解温度を有し、オリ
ゴヌクレオチドのG/C含有量も結合の強度を決定する要素であり、G/C含有量が高い
と任意の所与の長さに対する融解温度がより高くなる。本発明によって意図されるとおり
のヌクレオベースまたは糖・リン酸骨格の特定の化学修飾も結合の強度に影響を与える可
能性があるため、相補性の程度は、本発明によるオリゴヌクレオチドを設計するときに考
慮すべき一要素に過ぎない。
前記オリゴヌクレオチドの免疫原性の増加と関連づけられる(Dorn and Kippenberger, 2
008)。この免疫原性の増加は、処置される組織、すなわち、皮膚(真皮および/または
表皮)に損傷を引き起こす可能性もあるため望ましくない。したがって、本発明のAON
は、1または2以下のCpGジヌクレオチド配列(好ましくは1つだけ)を含むことが好
ましい。
レオチドを設計することを可能にする。RNA結合動態および/または熱力学的特性は、
オリゴヌクレオチドの融解温度(Tm、基礎のTmおよび最隣接モデルを使用して単鎖R
NAに対するオリゴヌクレオチド特性計算機(www.unc.edu/~cail/b
iotool/oligo/index.html)により算出される)および/または
AON標的エクソン複合体の自由エネルギー(RNA structureバージョン4
.5を使用)によって少なくとも部分的に決定される。Tmが高すぎると、オリゴヌクレ
オチドは、あまり特異的でなくなることが予想される。許容できるTmおよび自由エネル
ギーは、オリゴヌクレオチドの配列、骨格(ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホ
スホルアミデート、ペプチド-核酸など)の化学的性質、糖部分の性質(リボース、デオ
キシリボース、置換リボース、分子内架橋)およびヌクレオベースの化学修飾により決ま
る。したがって、Tmの範囲は、広く変化する場合がある。
指数関数的段階にあるような条件で、任意の所与のプライマーセットに関して、所与の数
のPCRサイクル後の増幅された短縮型(エクソン80を含まない)バンドの濃度で割り
、100%を掛けた増幅された野生型バンドの濃度を求めることによって算出されてもよ
い。定量化は、Agilent 2100 BioanalyzerをDNA1000キ
ットと組み合わせて使用して行ってもよい。
発明によるAONは、相補的な部分が、標的配列と少なくとも約80%、より好ましくは
少なくとも約90%、さらにより好ましくは少なくとも約95%、最も好ましくは約10
0%相補的であるようにされる。したがって、相補性の領域にあるすべての塩基が対向す
る鎖にある塩基と対形成することができることが絶対に必要とされる訳ではない。例えば
、オリゴヌクレオチドを設計するとき、例えば、相補的な鎖にある塩基と塩基対にならな
い残基を組み込むことを望むこともできる。細胞の環境下において、ひと続きのヌクレオ
チドが相補的な部分と十分にハイブリダイズすることができるなら、ミスマッチは、ある
程度許容される場合もある。この文脈において、「十分に」は、本発明によるAONがエ
クソン80のエクソンスキッピングを誘導することができることを意味する。標的とされ
るエクソンのスキッピングは、好都合にも、PCR/Bioanalyzer、任意選択
でddPCRによって評価することができる。相補的な領域は、組み合わされる場合、p
re-mRNAのエクソンに特異的であるよう設計されることが好ましい。そのような特
異性は、この系の他の(pre-)mRNA分子にある実際の配列に依存するため、さま
ざまな長さの相補的な領域を用いて作り出すことができる。オリゴヌクレオチドのサイズ
を増加させることでオリゴヌクレオチドが1つ以上の他のpre-mRNA分子ともハイ
ブリダイズすることができてしまうリスクは低下するが、長さは製造性、精製および/ま
たは分析に関する問題の原因となるほど長過ぎてはならない。
とハイブリダイズする能力および/または結合する能力を保持するオリゴヌクレオチドを
本発明に使用することができることは明らかである。しかしながら、相補的な部分は、一
般に1つ以上の相補的な領域にそのようなミスマッチを有するオリゴヌクレオチドよりも
高い効率および高い特異性を有するため、少なくとも相補的な部分は、そのようなミスマ
ッチを含まないことが好ましい。さらに高いハイブリダイゼーション強度(すなわち、対
向する鎖との相互作用の数を増加させる)は、系のスプライシング機構を妨害するプロセ
スの効率を増加させる際に有利であると考えられる。好ましくは、相補性は、90%から
100%である。一般に、これは、20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに1もしくは
2つのミスマッチを許容する。
(配列番号18)と相補的な(アンチセンス)オリゴヌクレオチドである。
と同じであり、これは、標的RNAと塩基対を形成しないオリゴの5’末端または3’末
端がないことを意味する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドに関する好ましい長
さは、23ヌクレオチド以下、例えば、11、12、13、14、15、16、17、1
8、19、20、21、22または23ヌクレオチドである。
得られた。
的でない場合、それは、任意の長さ、例えば、12~36ヌクレオチド長、例えば、20
mer(例えば、AON80.3)または36mer(例えば、AON80.13)であ
ってもよい。
A「u」残基がDNA対応物として「t」残基になる)、もしくは1つ以上のRNA残基
、および/または本明細書の下でさらに詳述されることになる1つ以上のヌクレオチドア
ナログもしくは等価物を含んでもよい。配列番号4~15および25~32はRNA配列
であるが、本発明は、DNA形態のこれらの各配列、およびこれらの配列のキメラなDN
A/RNAのAONも包含する。
は標的配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を高めるために修飾された
1つ以上の残基を含むことが好ましい。ゆえに、好ましい実施形態において、本アンチセ
ンスヌクレオチド配列は、少なくとも1つのヌクレオチドアナログまたは等価物を含み、
ヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾塩基、および/または修飾骨格、および/ま
たは非天然のヌクレオシド間結合あるいはこれらの修飾の組合せを有する残基と定義され
る。
。そのような骨格の例は、モルフォリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スル
フィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチル(formacetyl)およびチオホ
ルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル(riboacetyl)骨格、ア
ルケン含有骨格、スルファメート、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、メチレンイ
ミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、およびアミド骨格によって提供される。ホスホロジ
アミデートモルフォリノオリゴマーは、アンチセンス薬剤として以前に調査された修飾骨
格オリゴヌクレオチドである。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、DNAのデオキシリ
ボース糖が六員環で置換され、ホスホジエステル結合がホスホロジアミデート結合で置換
された無荷電骨格を有する。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、酵素分解に耐性があり
、RNase Hを活性化することよりむしろ翻訳を阻止すること、またはpre-mR
NAスプライシングを妨げることによってアンチセンス薬剤として働くようである。モル
フォリノオリゴヌクレオチドは、細胞膜を物理的に破壊する方法によって首尾よく組織培
養細胞に送達され、こうしたいくつかの方法を比較した研究の1つは、スクレープローデ
ィング(scrape loading)が最も効率的な送達の方法であることを見出したが、モルフォ
リノ骨格は荷電していないため、カチオン性脂質は、細胞へのモルフォリノオリゴヌクレ
オチド取り込みの有効なメディエーターではない。
ば、短鎖アルキルによって形成される結合またはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混
合したヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1つ以
上の短鎖ヘテロ原子結合もしくは複素環式ヌクレオシド間結合である。
ド骨格を有するペプチド核酸(PNA)を含む(Nielsen, et al. 1991)。PNAベース
の分子は、塩基対の認識に関してDNA分子の真の模倣物である。PNAの骨格は、ペプ
チド結合によって連結されたN-(2-アミノエチル)-グリシン単位から構成され、ヌ
クレオベースは、メチレンカルボニル結合によって骨格と連結される。代替的な骨格は、
炭素1つ伸長したピロリジンPNAモノマーを含む(Govindaraju and Kumar. 2005)。
PNA分子の骨格は荷電したリン酸基を含まないため、PNA-RNAハイブリッドは、
通常、それぞれRNA-RNAハイブリッドまたはRNA-DNAハイブリッドよりも安
定している(Egholm et al. 1993)。
価物を含み、その中のリボースまたはデオキシリボース糖がモルフォリノ六員環(6-memb
ered morpholino ring)で置換されている。最も好ましいヌクレオチドアナログまたは等
価物は、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー(PMO)を含み、その中のリボ
ースまたはデオキシリボース糖がモルフォリノ六員環で置換されており、隣接するモルフ
ォリノ環間のアニオン性ホスホジエステル結合が非イオン性ホスホロジアミデート結合に
よって置換されている。
ジエステル結合にある1つの非橋架酸素の置換を含む。この修飾は、塩基対合をやや不安
定にするが、ヌクレアーゼ分解に対する著しい耐性を付加する。好ましいヌクレオチドア
ナログまたは等価物は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチ
オエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、H-ホスホネート
、メチルホスホネートおよび3’-アルキレンホスホネート、5’-アルキレンホスホネ
ートおよびキラルホスホネートを含むその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、
3’-アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホ
ロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキ
ルリン酸トリエステル、セレノリン酸またはボラノリン酸を含む。
;1つ以上のヘテロ原子の割り込みがあってもよい置換または非置換、直鎖または分岐の
低級(C1~C10)アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アリル、また
はアラルキル;O-、S-、またはN-アルキル;O-、S-、またはN-アルケニル;
O-、S-またはN-アルキニル;O-、S-、またはN-アリル;O-アルキル-O-
アルキル、-メトキシ、-アミノプロポキシ;メトキシエトキシ;-ジメチルアミノオキ
シエトキシ;および-ジメチルアミノエトキシエトキシにより2’、3’および/または
5’位において一置換または二置換された1つ以上の糖部分を含む。糖部分は、フラノー
スもしくはその誘導体、またはデオキシフラノースもしくはその誘導体、好ましくは、リ
ボースもしくはその誘導体またはデオキシリボースもしくはその誘導体であってもよい。
好ましい誘導体化糖部分は、ロックド核酸(LNA)を含み、その中の2’-炭素原子が
糖環の3’または4’炭素原子と連結され、それにより二環式の糖部分を形成する。好ま
しいLNAは、2’-O、4’-C-エチレン-架橋化核酸を含む(Morita et al. 2001
. Nucleic Acid Res Supplement No. 1: 241-242)。これらの置換は、ヌクレオチドアナ
ログまたは等価物をRNase Hおよびヌクレアーゼ耐性にし、標的RNAに対する親
和性を高める。
いる必要がないことは当業者に理解される。例えば、一部のヌクレオシド間結合が無修飾
であってもよいのに対し、その他のヌクレオシド間結合が修飾されている。一形態の(修
飾)ヌクレオシド間結合、AONの長さ方向に沿って均一または不均一に分散した複数の
形態の(修飾)ヌクレオシド間結合からなる骨格を含むAONはすべて本発明によって包
含される。さらに、骨格修飾(均一、不均一、一形態もしくは複数形態およびそれらのす
べての変形)の任意の様式を、下で言及される糖もしくはヌクレオシド修飾またはアナロ
グの任意の形態と組み合わされてもよい。
S)骨格である。
基修飾または置換を含む。修飾塩基は、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび当
該技術分野において知られているか、または知られることになるピリミジン塩基およびプ
リン塩基の他の-アザ、デアザ、-ヒドロキシ、-ハロ、-チオ、チオール、-アルキル
、-アルケニル、-アルキニル、チオアルキル誘導体などの合成および天然の塩基を含む
。
とが当業者に理解される。さらに、上記のアナログまたは等価物の1つ超が、1つのアン
チセンスオリゴヌクレオチドまたはさらにはアンチセンスオリゴヌクレオチド内の1つの
位置に組み込まれてもよい。特定の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌク
レオチドは、少なくとも2つの異なる種類のアナログまたは等価物を有する。
ルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、2’-O-メチル修飾
リボース(RNA)、2’-O-メトキシエチル修飾リボース、2’-O-エチル修飾リ
ボース、2’-O-プロピル修飾リボース、および/またはハロゲン化誘導体などのこれ
らの修飾の置換誘導体を含む。
ート骨格を伴う2’-O-メチル修飾リボース部分を含み、好ましくは、実質的にすべて
のリボース部分が2’-O-メチルであり、実質的にすべてのヌクレオシド間結合がホス
ホロチオエート結合である。
を組み合わせることができることも当業者には理解されるであろう。少なくとも1つのA
ONが本発明によるAONである限り、エクソン80(図1)の同じ領域または異なる領
域を標的とする2つのAON、例えば、2つのAON、3つの異なるAON、4つの異な
るAON、または5つの異なるAONの組合せが本発明の方法に使用されてもよい。
てもよい。そのような部分の例は、コレステロール、炭水化物、ビタミン、ビオチン、脂
質、リン脂質、細胞透過性ペプチドであり、以下に限定されるものではないが、アンテナ
ペディア、TAT、トランスポータンおよびオリゴアルギニン(oligoarginine)、ポリ
アルギニン、オリゴリジン(oligolysine)またはポリリジンなどの正電荷アミノ酸、抗
体によってもたらされるものなどの抗原結合ドメイン、抗体のFabフラグメント、また
はラクダ科動物のシングルドメイン抗原結合ドメインなどの単鎖抗原結合ドメインを含む
。
)AONもしくは複合体の形態であってもよく、またはベクターから発現されてもよい(
ベクターにより運ばれる(vectored)AON)。本エクソンスキッピング分子は、当該技
術分野において既知の適した手段を使用して投与することができる。エクソンスキッピン
グ分子がベクターにより運ばれるAONである場合、AONは、例えば、前記オリゴヌク
レオチドを含む転写物をコードする発現ベクターの形態で個体または前記個体の細胞、組
織もしくは臓器に与えられてもよい。発現ベクターは、好ましくは細胞、組織、臓器また
は個体にウイルスベクターなどの遺伝子送達媒体により導入される。好ましい実施形態に
おいて、本明細書において特定されるエクソンスキッピング分子の発現または転写を駆動
する発現カセットまたは転写カセット(transcription cassette)を含むウイルスベース
の発現ベクターが提供される。したがって、本発明は、エクソンスキッピング分子の発現
を促す条件下に置かれたときに本発明によるエクソンスキッピング分子を発現させるウイ
ルスベクターを提供する。細胞は、例えば、プラスミドによるAON発現またはアデノウ
イルスもしくはアデノ随伴ウイルスベースのベクターによってもたらされるウイルス発現
によって、エクソン80が含まれるために必須の、または少なくともそれを促す配列を妨
害することができるエクソンスキッピング分子が与えられてもよく、その結果、そのよう
な妨害が、エクソン80がCOL7A1 mRNAに含まれるのを妨げるか、少なくとも
低減する。発現は、U1、U6、またはU7 RNAプロモーターなどのポリメラーゼI
IIプロモーターによって駆動されてもよい。好ましい送達媒体は、アデノ随伴ウイルス
ベクター(AAV)などのウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターなどのレト
ロウイルスベクターなどである。また、プラスミド、人工染色体、標的相同組換えおよび
細胞の哺乳動物(好ましくは、ヒト)ゲノムへの組み込みに使用可能なプラスミドが、本
明細書中で定義されるオリゴヌクレオチドの送達に適切に利用されてもよい。転写がPo
l-IIIプロモーターから行われ、かつ/または転写物がU1またはU7転写物との融
合物の形態であるそうしたベクターが本発明に好ましく、これが小さな転写物の送達に関
して良好な結果をもたらす。適した転写物を設計することは技術のある技術者の範囲内に
ある。Pol-IIIによる転写物が好ましい。U1またはU7転写物との融合転写物の
形態が好ましい。そのような融合物は、当該技術分野において記載されているとおりに作
り出すことができる(例えばGorman L et al., 1998またはSuter D et al., 1999を参照
)。
ターである。COL7A1エクソン80の極めて効率的なスキッピングためのAON配列
の長期の発現のために使用することができる単鎖および二重鎖AAVベースのベクターが
開発された。好ましいAAVベースのベクターは、例えば、ポリメラーゼIIIプロモー
ター(Pol III)によって駆動される発現カセットを含む。好ましいPol II
Iプロモーターは、例えば、U1、U6、またはU7 RNAプロモーターである。した
がって、本発明は、COL7A1エクソン80のスキッピングを誘導するための本発明の
AONの発現のためのPol IIIプロモーター駆動発現カセットを含むウイルスベー
スのベクターも提供する。本発明によるAAVベクターは組換えAAVベクターであり、
本明細書中の別の場所で示したAAV血清型由来のカプシドタンパク質のタンパク質の殻
に包まれた本発明によるコード化エクソンスキッピング分子を含むAAVゲノムの部分を
含むAAVベクターを指す。AAVゲノムの部分は、AAV1、AAV2、AAV3、A
AV4、AAV5、AAV8、AAV9およびその他などのアデノ随伴ウイルス血清型由
来の末端逆位配列(ITR)を含んでもよい。カプシドタンパク質から構成されるタンパ
ク質の殻は、AAV1、2、3、4、5、8、9およびその他などのAAV血清型由来の
ものであってもよい。タンパク質の殻は、カプシドタンパク質の殻と呼ばれる場合もある
。AAVベクターは、野生型AAV遺伝子の1つまたは好ましくはすべてが除去されてい
てもよいが、依然として機能的なITR核酸配列を含んでもよい。機能的なITR配列は
、AAVビリオンの複製、レスキューおよびパッケージングに必要である。ITR配列は
、機能的なままである限り、野生型配列であってもよく、または野生型配列と少なくとも
80%、85%、90%、95、もしくは100%の配列同一性を有してもよく、または
例えば、ヌクレオチドの挿入、突然変異、欠失もしくは置換によって改変されていてもよ
い。この状況において、機能性とは、カプシドの殻へのゲノムのパッケージングを指示し
、その結果、感染した宿主細胞または標的細胞における発現を可能にさせる能力を指す。
本発明の状況において、カプシドタンパク質の殻は、AAVベクターゲノムITRと異な
る血清型のものであってもよい。したがって、本発明によるAAVベクターは、カプシド
タンパク質の殻、すなわち、正二十面体のカプシドから構成されてもよく、それが、1つ
のAAV血清型、例えば、AAV血清型2のカプシドタンパク質(VP1、VP2、およ
び/またはVP3)を含み、一方、AAV5ベクターに含まれるITR配列は、AAV2
ベクターを含む任意の上記のAAV血清型であってもよい。したがって、「AAV2ベク
ター」は、AAV血清型2のカプシドタンパク質の殻を含み、例えば、「AAV5ベクタ
ー」は、AAV血清型5のカプシドタンパク質の殻を含み、それにより、どちらも本発明
による任意のAAVベクターゲノムITRを包んでもよい。好ましくは、本発明による組
換えAAVベクターは、AAV血清型2、5、8またはAAV血清型9のカプシドタンパ
ク質の殻を含み、前記AAVベクターに存在するAAVゲノムまたはITRは、AAV血
清型2、5、8またはAAV血清型9に由来する。そのようなAAVベクターは、それぞ
れAAV2/2、AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9、AAV5/2、AAV5
/5、AAV5/8、AAV5/9、AAV8/2、AAV8/5、AAV8/8、AA
V8/9、AAV9/2、AAV9/5、AAV9/8、またはAAV9/9ベクターと
呼ばれる。本発明による組換えAAVベクターは、真皮細胞および上皮細胞に対する指向
性を有し、AAV血清型5または8のカプシドタンパク質の殻を含むことがより好ましい
。前記ベクターに存在するAAVゲノムまたはITRは、同じ血清型またはAAV血清型
2などの異なる血清型由来のものであってもよく、そのようなベクターは、AAV2/5
ベクターまたはAAV2/8ベクターと呼ばれる。血清型5のカプシドを有するAAVは
、基底角化細胞およびそれより上の角化細胞(basilar and suprabasilar keratinocyte
)ならびに皮膚線維芽細胞などの真皮細胞および上皮細胞に対して指向性を有する。5型
カプシドを有するAAVベクターは、2型カプシドを有するAAVよりもはるかに高いト
ランスダクション効率を示す(Keswani et al. 2012)。同様に、血清型8のカプシドを
有するAAVは、皮膚線維芽細胞および(主に)基底角化細胞よりも上の角化細胞に対し
て指向性を示す。さらに、AAV2/8は、哺乳動物、好ましくは、ヒトの真皮細胞およ
び上皮細胞に形質導入する際、AAV2/5よりも効率的な傾向がある。ただし、トラン
スダクション効率は、創傷の治癒過程の投与のタイミングによって左右されるようであり
、後の時点ではAAV2/2がAAV2/5およびAAV2/8よりも高いトランスダク
ション効率を示す(Keswani et al. 2012)。したがって、AAV2/2、AAVx/5
およびAAVx/8が本発明によるAONを送達するために好ましいAAVであり、それ
らの選択は、投与の時期および標的となる細胞タイプを考慮して決定することができる。
これらの詳細は、当業者によって前臨床的試験または臨床試験において容易に決めること
ができる。
核酸分子は、好ましくは、上で特定したAAVゲノムまたはITR配列、例えば、コード
配列と機能可能に連結された発現調節エレメントおよび3’終結配列を含む発現コンスト
ラクトの間に挿入される。
よびパッケージングに必要とされる対応するAAVの機能を指す。AAVヘルパー機能は
、AAVベクターに欠けているAAVの機能を補完するが、(AAVベクターゲノムによ
ってもたらされる)AAV ITRがない。AAVヘルパー機能は、AAVの2つの主要
なORF、すなわち、repコード領域およびcapコード領域またはそれらの機能的な
実質的に同一の配列を含む。Rep領域およびCap領域は、当該技術分野において周知
であり、例えば、参照によって本明細書に組み込むChioriniら(1999)または米国特許第
5,139,941号明細書を参照。AAVヘルパー機能が、AAVヘルパーコンストラ
クトに与えられてもよく、これは、プラスミドであってもよい。ヘルパーコンストラクト
の宿主細胞への導入は、例えば、本明細書において特定されるAAVベクターに存在する
AAVゲノムの導入の前またはそれと同時のトランスフォーメーション、トランスフェク
ション、またはトランスダクションによって行われてもよい。したがって、本発明のAA
Vヘルパーコンストラクトは、一方でAAVベクターのカプシドタンパク質の殻に関して
、他方で前記AAVベクター複製およびパッケージングにおいて存在するAAVゲノムに
関して血清型の所望の組合せをもたらすように選択されてもよい。
的な機能を提供する。適したAAVヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、単純ヘ
ルペスウイルス(HSV1型および2型など)およびワクチニアウイルスが挙げられる。
参照によって本明細書に組み込む米国特許第6,531,456号明細書に記載されてい
るとおり、ヘルパーウイルスによってもたらされる付加的な機能も、ベクターにより宿主
細胞に導入することができる。好ましくは、本発明による組換えAAVベクターに存在す
るAAVゲノムは、AAVのrep(複製)遺伝子またはcap(カプシド)遺伝子など
のウイルスタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列を含まない。AAVゲノムは
、例えば、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質(例えば、gfp)をコードする遺伝子
あるいは当該技術分野において既知の化学的に、酵素的にもしくは別の方法で検知可能な
および/または選択可能な産生物をコードする遺伝子(例えば、lacZ、aphなど)
などのマーカー遺伝子あるいはレポーター遺伝子をさらに含んでもよい。本発明による好
ましいAAVベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む本発明によるエクソン
スキッピング分子を発現させるAAVベクター、好ましくは、AAV2/5、AAV2/
8、AAV2/9またはAAV2/2ベクターであり、前記アンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、下記表1に開示されているAON80.1、AON80.2、AON80.3、
AON80.4およびAON80.5からなる群から選択される配列を含むか、またはそ
れからなる。個体または前記個体の細胞、組織、臓器に本発明によるエクソンスキッピン
グ分子を与える手段の改善は、これまでに既に成し遂げられた進歩を考慮して予想される
。そのような将来的な改善は、当然、本発明の方法を使用したmRNAの再構築に関して
言及した効果を達成するために組み込まれてもよい。本発明によるエクソンスキッピング
分子は、そのまま個体、前記個体の細胞、組織もしくは臓器に送達されてもよい。本発明
によるエクソンスキッピング分子を投与するとき、分子を送達方法と適合した溶液に溶解
させることが好ましい。
によるAONの等張(生理的食塩水)溶液への溶解で皮膚(真皮および表皮)細胞などの
標的細胞に達するのに十分であろう。あるいは、本発明の裸のAONは、薬学的に許容さ
れる賦形剤、添加物、安定剤、溶媒、着色料などを使用して製剤化されてもよい。それに
加えて、またはそれの代わりに、裸のAONは、下で言及される任意のトランスフェクシ
ョン補助剤(transfection aid)を用いて製剤化されてもよい。
を与えることによってアンチセンスオリゴヌクレオチド発現のためのプラスミドを与えら
れてもよい。あるいは、既知のトランスフェクション剤(transfection agent)を使用し
たトランスフェクションによってプラスミドが与えられてもよい。
(生理的食塩水)溶液であることが好ましい。本発明において特に好ましいのは、本明細
書中で定義される各成分の細胞へおよび/または細胞、好ましくは、皮膚(真皮および表
皮)細胞中への送達を助けることになる賦形剤またはトランスフェクション剤の使用であ
る。本明細書中で定義される複合体を形成した各成分、またはベシクルもしくはリポソー
ムに閉じ込められた各成分を細胞膜を通して送達する複合体、ナノ粒子、ミセル、ベシク
ルおよび/またはリポソームを形成することができる賦形剤またはトランスフェクション
剤が好ましい。こうした賦形剤の多くは、当該技術分野において知られている。適した賦
形剤またはトランスフェクション剤は、本明細書中で定義される各成分を細胞、好ましく
は、皮膚(真皮または表皮)細胞に送達することができる粒子に自己集合することができ
るポリエチレンイミン(PEI;ExGen500(MBI Fermentas))、
LipofectAMINE(商標)2000(Invitrogen)もしくはその誘
導体、またはポリプロピレンイミンもしくはポリエチレンイミンコポリマー(PEC)お
よび誘導体を含む類似のカチオン性ポリマー、合成の両親媒性物質(SAINT-18)
、lipofectin(商標)、DOTAPおよび/またはウイルスカプシドタンパク
質を含む。そのような賦形剤は、皮膚(真皮および表皮)細胞を含む多種多様の培養細胞
にアンチセンス核酸などのオリゴヌクレオチドを効率的に送達することが示された。それ
らの高いトランスフェクション潜在性は、全細胞生存に関して低から中程度の許容できる
毒性と組み合わされる。構造変更の容易さが、さらなる変更ならびにそれらのさらなる(
in vivo)核酸運搬特性および毒性の分析を可能にするために使用されてもよい。
チオン性脂質N-[1-(2,3ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメ
チルアンモニウムクロリド(DOTMA)(メチル硫酸塩であるDOTAPと比較)およ
び中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)の2つの脂質構成
成分からなる。中性構成成分が細胞内放出を仲介する。送達システムの別のグループは高
分子ナノ粒子である。
細胞中に送達することができるカチオン性ナノ粒子を製剤化するために、DNAトランス
フェクション試薬として周知のジエチルアミノエチルアミノエチル(DEAE)デキスト
ランのようなポリカチオンが、シアノアクリル酸ブチル(PBCA)およびシアノアクリ
ル酸ヘキシル(PHCA)と組み合わされてもよい。
を用いてオリゴヌクレオチドを製剤化するための代替的なアプローチを提供する。このコ
ロイドナノ粒子系は、いわゆる、プロティクル(proticle)を形成することができ、これ
は、単純な自己集合プロセスによって作製することができ、オリゴヌクレオチドをパッケ
ージングし、オリゴヌクレオチドの細胞内放出を仲介することができる。当業者は、エク
ソンスキッピング分子をCOL7A1遺伝子の突然変異したエクソン80と関連した疾患
または状態の予防、処置または遅延のために送達すべく本発明に使用するためのエクソン
スキッピング分子をパッケージングおよび送達するために任意の上記またはその他の商業
的に入手可能な代替的賦形剤および送達システムを選択し、適合させることができる。
胞質および/またはその核への取り込みを促進するよう設計された標的リガンドと特異的
に共有結合的または非共有結合的に連結されてもよいであろう。そのようなリガンドは、
(i)細胞取り込みを促進する、細胞、組織もしくは臓器に特異的なエレメントを認識す
る化合物(それに限定されるものではないがペプチド(様)構造を含む)ならびに/ある
いは(ii)細胞への取り込みおよび/またはベシクル、例えば、エンドソームもしくは
リソソームからのオリゴヌクレオチドの細胞内放出を促進することができる化学的化合物
を含んでもよいであろう。
組成物または薬剤、あるいは少なくとも、細胞への送達および/もしくはその送達デバイ
スのためならびに/または細胞内送達を向上させるための賦形剤および/または標的化リ
ガンドとともに提供される組成物として製剤化される。
成物の各成分は、1つの単一の組合せまたは組成物または調製物として製剤化されてもよ
い。それらの素性に応じて、当業者は、どの製剤のタイプが本明細書中で定義される各成
分に最も適切であるかがわかるであろう。一実施形態によると、本発明は、本発明による
エクソンスキッピング分子、さらに本明細書で後に定義される補助的な化合物を含むキッ
ト・オブ・パーツの形態である組成物または調製物を提供する。
ンスキッピング分子を発現させるベクター、好ましくは、ウイルスベクターは、薬学的に
許容される担体を添加することによって薬学的に活性な混合物に組み込まれてもよい。
、または本発明によるウイルスベクターおよび薬学的に許容される賦形剤を含む組成物、
好ましくは、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、1つの本発明によるエクソン
スキッピング分子を含んでもよいが、複数の異なる本発明によるエクソンスキッピング分
子を含んでもよい。そのような医薬組成物は、担体、賦形剤、安定剤、トランスフェクシ
ョン剤、ゲル化剤、緩衝液、増量剤、保存料、補助薬、可溶化剤および/または希釈剤を
含む任意の薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。そのような薬学的に許容される成
分は、例えば、Remington, 2000において見つけることができる。前記組成物のそれぞれ
の特徴は、本明細書の前で定義した。
いて定義される濃度または用量は、使用されたすべてのオリゴヌクレオチドの合計濃度も
しくは用量または使用されたか、もしくは添加されたそれぞれのエクソンスキッピング分
子の濃度もしくは用量を指してもよい。したがって、一実施形態において、使用される本
発明によるエクソンスキッピング分子のそれぞれの量または合計量が、0.0001から
100mg/kg、好ましくは、0.001から50mg/kg、さらにより好ましくは
、0.01から20mg/kgの間の範囲の量で投与される組成物が提供される。
突然変異したCOL7A1エクソン80関連疾患または状態の処置のためのものである。
本発明のすべての実施形態において、「処置」という用語は、疾患または状態の予防およ
び/または遅延を含むものと理解される。本発明によるエクソンスキッピング分子を使用
して処置することができる個体は、既にDEBまたはCOL7A1エクソン80関連疾患
または状態を有すると診断されていてもよい。あるいは、本発明によるエクソンスキッピ
ング分子を使用して処置することができる個体は、まだ診断されていなくてもよいが、固
体の遺伝的背景を考慮にいれると将来的にDEBまたはCOL7A1エクソン80関連疾
患または状態を発症するリスクが高い個体であってもよい。好ましい個体はヒトである。
好ましい実施形態において、突然変異したCOL7A1エクソン80関連疾患または状態
は、ジストロフィー型表皮水疱症(DEB)である。
したCOL7A1エクソン80関連疾患もしくは状態を処置する際に使用するための医薬
として使用するための、AONなどの本発明によるエクソンスキッピング分子、または本
発明によるAONをコードするウイルスベクターなどのベクター、または本発明によるA
ON、もしくはAONをコードするベクターを含む組成物をさらに提供する。
OL7A1エクソン80関連疾患もしくは状態を処置するための薬剤の製造へのAONな
どの本発明によるエクソンスキッピング分子、または本発明によるAONをコードするウ
イルスベクターなどのベクター、または本発明によるAON、もしくはAONをコードす
るベクターを含む組成物の使用をさらに提供する。
は障害の原因となる突然変異がある哺乳動物(好ましくは、ヒト)を処置するための方法
であって、哺乳動物(ヒト)に本発明のAON、(ウイルス)ベクター、または医薬組成
物を投与することを含む方法をさらに提供する。これらの患者は、DEBもしくは関連障
害を患っていてもよく、または発症するリスクがあってもよい。関連障害、疾患または状
態は、例えば、COL7A1遺伝子のエクソン80における突然変異が原因となるか、ま
たはそれと関連するVII型コラーゲン欠損または個体の皮膚もしくはその他の臓器の異
常の結果として生じる可能性のある皮膚がん(黒色腫)、またはその他の癌腫も包含する
。
異がある哺乳動物(好ましくは、ヒト)を処置するための医薬として使用するための本発
明によるAON、AONをコードするウイルスベクター、およびAONを含む医薬組成物
である。
、噴霧することによる経口、眼内、肺内、鼻腔内、筋肉内、皮下、皮内、直腸へ投与によ
り(水)溶液、懸濁液、(水中油型)エマルジョン、軟膏、トローチ、丸剤などの形態で
全身的に、局部的に、局所的に患者に投与されてもよい。
ィング付き被覆材の装具によるものである。特に有益なのは、国際公開第2014/15
0074号パンフレットに開示されているもののように多層(交互積層、LbL(Lay
er-by-Layer))コーティングされた被覆材である。MITの名称で出願され
た国際特許出願は、前記siRNAを含む多層フィルムでコーティングされた接着性の被
覆材からの、創傷治癒を促進するsiRNAの長期のかつ有効な放出を開示している。本
発明によるAONと組み合わせて好適に使用することができる被覆材は、Tegader
m(登録商標)である。本発明によるAONと組み合わせてさらに使用することができる
、siRNAの送達に好適な多層コーティングは、交互積層構造を含むLaponite
(登録商標)を含む。核酸治療薬を放出することができるTegaderm(登録商標)
とは別の被覆材を使用することもできる。非接着性の被覆材も、それらは患者の痛みを少
なくする可能性が高いので、被覆材が皮膚または創傷部位と密に接触している限り、使用
することができる。被覆材と組み合わせての本発明によるAONの送達のためのAON含
有LBLフィルムは、国際公開第2014/150074号パンフレットに記載されてい
る。
年に1回であってもよい。
80が原因となるか、またはそれと関連した疾患、障害もしくは状態を有するか、または
それを発症するリスクのある患者は、疾患の症状を緩和する、発症を遅らせる、止める、
または逆行させるなどのために、症状の発症前または後に、子宮内で、出生直後に、1、
2、3、6か月齢から、1歳から、3歳から、5歳から処置されてもよい。
少なくとも数カ月、少なくとも1年、少なくとも2、3、4、5、6年または長期的にさ
らに患者の一生涯の間である。本発明による使用のための本明細書中で定義されるとおり
のエクソンスキッピング分子またはエクソンスキッピングオリゴヌクレオチドまたはその
等価物のそれぞれは、突然変異したCOL7A1エクソン80関連障害、疾患または状態
に既に冒されているか、またはそれを発症するリスクがある個体の細胞、組織および/ま
たは臓器へのin vivoにおける直接投与に適していてもよく、in vivo、e
x vivoまたはin vitroにおいて直接投与されてもよい。本発明のAON、
組成物、化合物または補助的な化合物の投与の頻度は、患者の年齢、エクソンスキッピン
グ分子の性質(例えば、裸の(gymnotic)AONまたはAAVベクターもしくはレンチウ
イルスベクターにより発現させるAONなどの、ベクターにより運ばれる(vectored)A
ON)、用量、および前記分子の配合などのいくつかのパラメータにより左右される可能
性もある。
は、好ましくは、厳しい手順要件が存在する臨床試験の用量漸増試験(in vivoに
おける使用)に基づいて設計される。本明細書中で定義されるとおりのオリゴヌクレオチ
ドは、0.0001から100mg/kg、好ましくは、0.01から20mg/kgの
用量範囲で使用されてもよい。用量および処置計画は、以下に限定されるものではないが
、投与経路(例えば、全身的対局所的)、オリゴが裸のAONまたはベクターにより運ば
れるAONとして投与されるのかどうか、投与計画、患者の年齢および体重などを含む多
くの要素により大きく変化することもある。
に記載されているウイルスベクター、好ましくは、AAVベクターは、1回の注射当たり
1×109~1×1017ウイルス粒子、より好ましくは、1回の注射あたり1×101
0~1×1014ウイルス粒子、最も好ましくは1×1010~1×1012ウイルス粒
子の範囲の用量で投与される。
合、用量、投与計画、様式(ウイルスベクターまたは裸のオリゴヌクレオチド)、患者の
年齢および体重、疾患のステージなどのような要素に従い、それらに応じて確立される必
要があり、これは、さらなる非臨床試験および臨床試験を必要とする場合もあることは、
本発明が属する技術分野の当業者には明らかになろう。
なくとも低減することための方法であって、細胞、好ましくは、皮膚(真皮)細胞を裸の
AONなどの本発明によるエクソンスキッピング分子または本発明によるAONをコード
する(ウイルス)ベクターまたは本発明による組成物と接触させることを含む方法をさら
に提供する。この態様の特徴は、好ましくは、本明細書の前で定義されたものである。
載されている別の実施形態と組み合わされてもよい。
COL7A1 mRNAが生成されるときに、エクソン80が前記mRNAに含まれるの
を妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、(
a)エクソン80の部分と相補的なヌクレオチド配列を含むことおよび(b)24ヌクレ
オチド長未満であることを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
グによってヒトCOL7A1 mRNAが生成されるときに、エクソン80が前記mRN
Aに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドであって、エクソン80の3’部分および下流イントロンの5’部分と相補的なヌクレ
オチド配列を含むことを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。好ましく
は、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号21と相補的なヌクレオチド配列を含む。例え
ば、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号22(5’-UCACCACU-3’)、配列
番号23(5’-ACCACUGG-3’)、および/または配列番号24(5’-AC
UCACCA-3’)を含む。
グによってヒトCOL7A1 mRNAが生成されるときに、エクソン80が前記mRN
Aに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドであって、配列番号22(5’-UCACCACU-3’)、配列番号23(5’-A
CCACUGG-3’)、および/または配列番号24(5’-ACUCACCA-3’
)を含むことを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
の実施形態では、好ましくは、長さが、20から23ヌクレオチドの間である。したがっ
て、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、20、21、22または23ヌクレオチド
長である。
80.3、AON80.5、AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5
.3、AON80.5.4、AON80.5.5、AON80.5.7およびAON80
.5.8からなる群から選択される。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、
(i) AON80.2およびAON80.5;
(ii) AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON8
0.5.4、およびAON80.5.5;または
(iii) AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON
80.5.4、AON80.5.5、AON80.5.7およびAON80.5.8
からなる群から選択される。
0.5、AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.
5.4、AON80.5.5、AON80.5.7およびAON80.5.8からなる群
から選択される。
OL7A1 mRNAが生成されるときに、エクソン80が前記mRNAに含まれるのを
妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、エク
ソン80の上流のイントロンにハイブリダイズしないことを特徴とするアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドにも関する。好ましくは、前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。好まし
くは、前記オリゴヌクレオチドの配列は、AON80.3、AON80.4、AON80
.5、AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.5
.4、AON80.5.5、AON80.5.7、AON80.5.8およびAON80
.13からなる群のオリゴヌクレオチドの配列を含む。
ングによってヒトCOL7A1 mRNAが生成されるときに、エクソン80が前記mR
NAに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオ
チドであって、エクソン80と相補的であるが、その上流または下流のイントロンと相補
的でないことを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。さらに別の実施形
態では、本発明は、哺乳動物細胞においてpre-mRNAからのスプライシングによっ
てヒトCOL7A1 mRNAが生成されるときに、エクソン80が前記mRNAに含ま
れるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し
、ここで、オリゴヌクレオチドは、エクソン80と相補性の領域を含み、その相補性の領
域は、エクソン80に隣接するいずれのイントロン内にも及ばない。そのような実施形態
では、オリゴヌクレオチドは、AON80.3またはAON80.13であることが好ま
しい。
OL7A1 mRNAが生成されるときに、エクソン80がmRNAに含まれるのを妨げ
るか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、最大20
ヌクレオチド長であるエクソン80と相補性の領域を含むことを特徴とするアンチセンス
オリゴヌクレオチドにも関する。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、AON80.
1、AON80.2、AON80.3、AON80.4、AON80.5、AON80.
5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.5.4、AON80.
5.5、AON80.5.7およびAON80.5.8からなる群からの一連のオリゴヌ
クレオチドを含む。好ましくは、エクソン80と相補性の前記領域は、9、10、11、
12、13、14、15、16または17ヌクレオチドなどの最大9から17ヌクレオチ
ドの間である。より好ましくは、オリゴヌクレオチドがエクソン80の直接下流のイント
ロンと相補性の領域を有するとき、エクソン80と相補的な領域は、9、10、11、1
2、13または14ヌクレオチドなどの9から14ヌクレオチドである。エクソン80と
相補的な部分が最大12ヌクレオチドであるときには、オリゴヌクレオチドは、AON8
0.1、AON80.4、AON80.5、AON80.5.3、AON80.5.4、
AON80.5.5、AON80.5.7およびAON80.5.8からなる群から選択
されることが好ましい。別の好ましい態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、(
a)最大20ヌクレオチド長である、エクソン80と相補性の領域および(b)エクソン
80の上流または下流のイントロンにおけるRNA転写産物と相補的な領域を含む。さら
により好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン80の下流のイントロ
ンにおけるRNA転写産物と相補的な部分を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、配列番号18の最も3’の10ヌクレオチド(すなわち、配列番号18
のヌクレオチド27~36)からなるエクソン80の一部と相補的な部分を含む。さらに
別の実施形態では、エクソン80に相補性の部分は、配列番号18の最も3’のnヌクレ
オチドからなり、ここで、nは、9から20の間である;例えば、配列番号18の最も3
’の19、18、17、16、15、14、13、12、11、10または9ヌクレオチ
ドからなる。より好ましい実施形態では、エクソン80の部分は、エクソン80の最も3
’の12ヌクレオチド(すなわち、配列番号18のヌクレオチド25~36)からなる。
オリゴヌクレオチドがエクソン80の部分と相補的なときには、その配列は、24ヌクレ
オチド以下の長さを有することが好ましい。
センスオリゴヌクレオチドがオリゴリボヌクレオチドであり、より好ましくは、ヌクレオ
シド間結合が、化学的に修飾されており、好ましくは、ホスホロチオエート結合である。
さらに別の好ましい態様では、オリゴヌクレオチドの糖部分は、低級2’-O-アルキル
、好ましくは2’-O-メチル置換糖部分である。
オチド配列、(ii)配列番号4~15および25~32からなる群から選択されるRN
Aヌクレオチド配列、または(iii)配列番号4~15および25~32からなる群か
ら選択され、その中のいずれのUもTで置換されているDNAヌクレオチド配列を含むか
、またはからなるオリゴヌクレオチドにも関する。
緩衝液のうちの1つまたは複数を任意選択で含む、本発明によるオリゴヌクレオチドを含
む組成物にも関する。好ましくは前記組成物は、ヒトの治療に使用するための医薬組成物
であり、より好ましくは、ジストロフィー型表皮水疱症(DEB)の処置に使用するため
の、さらにより好ましくは、COL7A1遺伝子のエクソン80における突然変異によっ
て引き起こされるDEBを患っているヒト対象の処置に使用するための医薬組成物である
。別の実施形態では、本発明は、COL7A1遺伝子内に突然変異したエクソン80が含
まれることによって引き起こされる疾患を患うヒト対象の処置に使用するための本発明に
よるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
ングによって哺乳動物、好ましくはヒトのCOL7A1 mRNAが生成されるときに、
エクソン80が前記mRNAに含まれるのを妨げるか、または低減するための方法であっ
て、細胞に、組織に、in vitroもしくはex vivoで、または、そのような
細胞を含む、ヒトを含む、生きている動物に、請求項1から27のいずれか一項に記載の
アンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項29もしくは30に記載の組成物を、そ
のような細胞によるそのようなオリゴヌクレオチドの取り込みを促す条件下で、提供する
ことと、スプライシングが起こるのを可能にすることとを含む方法にも関する。
ドする(ウイルス)ベクターの、COL7A1遺伝子が哺乳動物(好ましくは、ヒト)の
細胞において発現するときに、突然変異したCOL7A1エクソン80が含まれるのを妨
げるか、または少なくとも低減する能力、および5’スプライシングアクセプターの選択
に影響を及ぼす領域において生理的条件下で哺乳動物(ヒト)のCOL7A1 pre-
mRNAと結合して、それによりCOL7A1 mRNAに突然変異したエクソン80が
含まれるのを低減する能力は、好都合にも本明細書の実験のセクションに開示されている
アッセイを使用して評価することができる。特に、本エクソンスキッピング分子は、CO
L7A1遺伝子のエクソン80(必ずしも突然変異している訳ではない)を含む細胞とイ
ンキュベートして、エクソン80を含むmRNAの細胞による産生を低減するその能力を
例えば、実験のセクションおよび実施例において本明細書に記載されるとおり(Bioa
nalyzer装置を使用して定量することができる)RT-PCRによって評価するこ
とができる。
COL7A1遺伝子のエクソン80を標的とする本発明によるさまざまなAONの添加は
、実際に、エクソン80のないmRNAをもたらし、これが、短いが機能的なVII型コ
ラーゲンタンパク質の産生につながる。
れ。ゆえに、DEB患者からの培養線維芽細胞へのAONの添加は、ウエスタンブロット
において検出可能な短縮されているが機能的なVII型コラーゲンタンパク質の量を増加
させることになることが予想され、したがって、AONに基づく療法が、COL7A1
mRNAのスプライシングを再指示するだけでなくVII型コラーゲンの機能性も回復さ
せることになることを実証することになる。
サンチン(イノシンのヌクレオベース)という用語は、それ自体ヌクレオベースを指す。
、(デオキシ)リボシル糖と連結されたヌクレオベースを指す。
を指す。
という動詞およびその活用型は、その語に引き続く項目が含まれるが、具体的に言及され
ていない項目も除外しないことを意味するためにその非限定的な意味で使用される。さら
に、文脈が明らかに1つおよび1つだけのエレメントが存在することを必要としない限り
、不定冠詞「a」または「an」による要素の言及は、1つ超の要素が存在する可能性を
排除するものではない。不定冠詞「a」または「an」は、したがって、通常は「少なく
とも1つ」を意味する。
以下に限定されるものではない」と解釈されるべきである。
を発現させることができるウイルスベクターを含むベクターにより運ばれるAONを含む
ことが意図される。
は、好ましくは、値が、所与の値(10の)プラスまたはマイナス5%の値であってもよ
いことを意味する。
ど狭く解釈されるべきではない。当業者は、エラーを伴って特定されたそのような塩基を
特定することができ、そのようなエラーの正し方を知っている。配列のエラーの場合、ポ
リペプチドをコードする核酸配列を含む配列番号1に存在する配列の発現によって得られ
るポリペプチドの配列が優先されるものとする。
COL7A1のmRNAにあるエクソン80のmRNAの存在を検出するために、He
La細胞および初代ヒト線維芽細胞(HPF)の両方の細胞の抽出全RNAを使用した。
(a)HeLaについては10%ウシ胎仔血清(FBS)を加えたダルベッコ変法イーグ
ル培地(DMEM)において、または(b)HPF細胞については20%FBSおよび1
%ピルビン酸ナトリウムを加えたDMEM AQEにおいて細胞の培養を行った。すべて
の細胞を37℃、5%CO2で増殖させた。AONのエクソンスキッピング効率を求める
ために、細胞を60,000細胞/ウェル(HeLa)で12ウェルプレートに、または
150,000細胞/ウェル(LFB1)で6ウェルプレートに播いた。細胞を増殖させ
た24時間後、細胞に100nmのAON-maxPei複合体をトランスフェクション
した。ReliaPrep(商標)RNA Cell Miniprep System
(Promega)を用いてRNA単離を行った。次いで、Thermo Scient
ific Versoキットを使用してcDNAを作製した。エクソン77に位置するF
Wプライマー(5’-CAAGGTCCCAAAGGAGACAG-3’;配列番号16
)およびRVプライマーを用いてエクソン80に対するPCRを行った。RVプライマー
は、エクソン84内に位置する配列5’-AGTCCCACAGCTCCAGTAGG-
3’(配列番号17)を有するRVプライマー、またはエクソン82/83の境界に位置
する配列5’-GAAGGGGGAGCCTGGAGA-3’(配列番号33)を有する
RVプライマーのいずれかである。PCR産物を、DNA1000チップを使用したBi
oanalyzerを用いて視覚化し、産物の長さの分析のためにソフトウェアExpe
rt 2100を使用した。最初のオリゴヌクレオチド設計からは、AON80.1から
AON80.12までの12のオリゴヌクレオチドが得られ、表1は、これらのAONの
それぞれについてヒト初代線維芽細胞(HPF)およびHeLa細胞におけるエクソン8
0の半定量的なスキッピング効率を示す。AON80.5の21merに基づいてさらに
設計した研究からは、AON80.5.1からAON80.5.5と呼ばれる(すべて2
1merの)5つの誘導体が得られた。さらに、36merのオリゴヌクレオチド(AO
N80.13)を全エクソン80にわたって設計した。これらのさらなるAONについて
のデータは、本発明による好ましいAON(AON80.1~AON80.5、およびA
ON80.5.n系列、ならびにAON80.13)のヌクレオチド配列および配列番号
と共に、表1にも含まれている。2つの20merのオリゴヌクレオチド(AON80.
5.7およびAON80.5.8)を3回の実験において試験した。結果を表2に示して
おり、比較可能な結果が示されている。
.1からAON80.5と呼ばれる本発明によるAONは、良好な効率を有し、AON8
0.2、AON80.4およびAON80.5は、より良好に機能する。さらに設計した
研究から、AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.7、AON80
.5.8およびAON80.13は、試験したAONのうち最高のスプライシング効率を
有するようである。本発明による最も好ましいAONは、AON80.5、AON80.
5.1、AON80.5.2、AON80.5.7およびAON80.5.8である。
nalyzerで解析後に可視の余分な産物は、mRNA内にイントロン82を含んでい
た(シークエンス解析で観察された)。しかし、このイントロンがタンパク質に翻訳され
ると、分解されることになる可能性がきわめて高いトランケート型コラーゲンタンパク質
をもたらす停止コドンが含まれるはずである。
を使用して、in vitroにおけるその後の実験手順を行うことができる。これらの
RAW-Blue細胞は、マウスのRAW 264.7マクロファージ由来であり、NF
-κBおよびAP-1により誘導可能な、組み込まれた分泌型胎盤アルカリホスファター
ゼ(SEAP)レポーターコンストラクトを有する。すべてのTLR(TLR5を除く)
、NOD1、NOD2、RIG-I、MDAまたはDECTIN-1のアゴニストの存在
は、NF-κBおよびAP-1の活性化ならびにその後のSEAPの産生を導くシグナル
伝達経路を誘導する。SEAPのレベルは、検出することができ、したがって、免疫原性
活性化を示す。図6は、in vitroにおける刺激の24時間後のそのような試験の
結果を示す。陽性対照CpG-DNA、LPSおよびR848は、NF-κBおよび/ま
たはAP-1を活性化した。対照的に、試験したAONでは、AON80.5.1がSE
APにおいて1μMの最終濃度でNF-κBおよび/またはAP-1の活性化を示唆する
可能性がある少しの増加を誘導したことを除き、生理的食塩水処理したRAW-blue
細胞と比較してNF-κBおよび/またはAP-1の活性化は認められなかった。検出さ
れた値を、SEAP(OD)測定値についての多重比較のためにHolm-Sidak検
定を用いて一元配置ANOVAを使用して生理的食塩水と比較した。
e細胞を使用して試験し、レゾルフィンレベルにおける上昇が観察された(これは、細胞
数の増加をもたらす増殖の増加によって、かつ/またはPPR活性化による細胞代謝の促
進によって説明することができた)。細胞生存率に対する影響は、いずれのAONでの刺
激後にも観察されなかった(図7)。陽性対照のCpG-DNAのみが、合成されたレゾ
ルフィンのレベルを著しく上昇させた(しかし、LPSおよびR848では効果がなかっ
たのは古いバッチの使用が原因の可能性があった)。検出された値を、レゾルフィン測定
値についての多重比較のためにHolm-Sidak検定を用いて一元配置ANOVAを
使用して生理的食塩水と比較した。
ンカーフィブリル形成は、以下の文献に記載されているいくつかのin vitroにお
ける方法を使用して対処することができる。
1.ウエスタンブロッティングを使用したα1-コラーゲン鎖のサイズおよび正確な構
築の両方のタンパク質分析(Titeux et al 2010)。留意すべきことには、スキッピング
されたエクソンのタンパク質の小さなサイズおよび野生型タンパク質の大きなサイズによ
る、タンパク質サイズの明らかな差は見つからない可能性がある。
2.非還元条件でのウエスタンブロッティングを使用することによるVII型コラーゲ
ンホモ三量体の熱安定性分析。野生型のVII型コラーゲンは、3つのα1-コラーゲン
鎖から構成され、41℃のTmを有する(Mecklenbeck et al. 2002)。
3.コロイド金またはスクラッチRadius(商標) 24-Well Cell
Migration Assayを使用した細胞移動分析。エクソン80を含まないトラ
ンケート型タンパク質に対して、野生型のVII型コラーゲンを発現する線維芽細胞およ
び/または角化細胞の運動性を比較する(Chen et al. 2002)。または、処理していない
ものに対して、処理した変異体のヒト線維芽細胞培養培地の存在下における角化細胞の運
動性を比較する。
4.さまざまな細胞外基質構成要素、例えば、IV型コラーゲン、ラミニン-332、
ラミニン-1またはフィブロネクチンとの細胞接着を評価することができる(Chen et al
. 2002)。
mRNAに含まれるのを妨げるか、または少なくとも低減することに関して最も良く機能
することを示すAONがVII型コラーゲンの機能性に関して十分な結果をもたらすこと
になると仮定し、これは、先行技術の上記の方法を使用して容易に評価することができる
。
および趣旨内にありながら改変がなされてもよい。
本願は以下の態様にも関する。
(1) 細胞においてpre-mRNAからのスプライシングによってヒトCOL7A1 mRNAが生成されるときに、エクソン80が前記mRNAに含まれるのを妨げるか、
または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)であって、
- 前記COL7A1遺伝子のエクソン80の少なくとも一部と相補的であり、かつエクソン80の上流イントロンと相補的でないヌクレオチド配列、または
- エクソン80の少なくとも一部と相補的であり、かつ24ヌクレオチド長未満であるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするAON。
(2) エクソン80と相補性の領域を含み、前記相補性の領域が、最大20ヌクレオチド長、好ましくは11、12、13、14、15、16または17ヌクレオチドである、上記(1)に記載のAON。
(3) エクソン80の3’部分および下流イントロンの5’部分と相補的なヌクレオチド配列を含む、上記(1)または(2)に記載のAON。
(4) ヌクレオチド配列5’-UCACCACU-3’、5’-ACCACUGG-3’、または5’-ACUCACCA-3’を含む、上記(1)から(3)のいずれか一項に記載のAON。
(5) 配列番号7、8、25、26、28、31および32からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、上記(4)に記載のAON。
(6) 24ヌクレオチド長未満であり、好ましくは20、21、22、または23ヌクレオチドを含む、上記(1)から(5)のいずれか一項に記載のAON。
(7) 配列番号4または5のヌクレオチド配列を含む、上記(1)または(2)に記載のAON。
(8) 配列番号6のヌクレオチド配列を含む、上記(1)または(2)に記載のAON。
(9) 配列番号30のヌクレオチド配列を含む、上記(1)に記載のAON。
(10) オリゴリボヌクレオチドである、上記(1)から(9)のいずれか一項に記載のAON。
(11) ヌクレオシド間結合が、化学的に修飾されており、好ましくは、ホスホロチオエート結合である、上記(1)から(10)のいずれか一項に記載のAON。
(12) 前記AONの糖部分が低級2’-O-アルキル、好ましくは2’-O-メチル置換糖部分である、上記(1)から(11)のいずれか一項に記載のAON。
(13) (i)配列番号4~15および25~32からなる群から選択されるヌクレオチド配列、(ii)配列番号4~15および25~32からなる群から選択されるRNAヌクレオチド配列、または
(iii)配列番号4~15および25~32からなる群から選択され、その中のいずれのUもTで置換されているDNAヌクレオチド配列を含むか、またはからなるオリゴヌクレオチド。
(14) 上記(1)から(13)のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと、担体、賦形剤、安定剤、トランスフェクション剤、希釈剤、ゲル化剤または緩衝液のうちの1つまたは複数とを含む組成物。
(15) ヒトの治療に使用するための医薬組成物である、上記(14)に記載の組成物。
(16) ヒト、細胞においてRNA転写産物からのスプライシングによってヒトCOL7A1 mRNAが生成されるときに、エクソン80が前記mRNAに含まれるのを妨げるか、または低減するための方法であって、細胞に、組織に、in vitroもしくはex vivoで、または、そのような細胞を含む、生きているヒトに、上記(1)から(13)のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または上記(14)もしくは(15)に記載の組成物を、そのような細胞によるそのようなオリゴヌクレオチドの取り込みを促す条件下で、提供するステップと、スプライシングが起こるのを可能にするステップとを含む方法。
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Claims (15)
- 細胞においてpre-mRNAからのスプライシングによってヒトCOL7A1 mRNAが生成されるときに、エクソン80が前記mRNAに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)であって、
COL7A1 pre-mRNA中の標的ヌクレオチド配列と少なくとも95%相補的であり、
前記標的ヌクレオチド配列は配列番号8、25、26、31または32と完全に相補的であり、前記AONが24ヌクレオチド長未満であるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするAON。 - 前記AONが、最大20ヌクレオチド長、好ましくは11、12、13、14、15、16または17ヌクレオチドである相補性の領域を含む、請求項1に記載のAON。
- 前記AONが20、21、22、または23ヌクレオチド長である、請求項1または2に記載のAON。
- 前記AONがオリゴリボヌクレオチドである、請求項1から3のいずれか一項に記載のAON。
- 前記AONが、化学的に修飾されており、好ましくは、ホスホロチオエート結合であるヌクレオシド間結合を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のAON。
- 前記AONが1つまたはそれ以上の低級2’-O-アルキル置換糖部分を含み、好ましくは2’-O-メチル置換糖部分である、請求項1から5のいずれか一項に記載のAON。
- 前記AONが標的ヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列からなる、請求項1から6のいずれか一項に記載のAON。
- 前記標的ヌクレオチド配列が配列番号8と完全に相補的である、請求項1から7のいずれか一項に記載のAON。
- 前記標的ヌクレオチド配列が配列番号25と完全に相補的である、請求項1から7のいずれか一項に記載のAON。
- 前記標的ヌクレオチド配列が配列番号26と完全に相補的である、請求項1から7のいずれか一項に記載のAON。
- 前記標的ヌクレオチド配列が配列番号31と完全に相補的である、請求項1から7のいずれか一項に記載のAON。
- 前記標的ヌクレオチド配列が配列番号32と完全に相補的である、請求項1から7のいずれか一項に記載のAON。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと、担体、賦形剤、安定剤、トランスフェクション剤、希釈剤、ゲル化剤または緩衝液のうちの1つまたは複数とを含む組成物。
- ヒトの治療に使用するための医薬組成物である、請求項13に記載の組成物。
- ヒト、細胞においてRNA転写産物からのスプライシングによってヒトCOL7A1 mRNAが生成されるときに、エクソン80が前記mRNAに含まれるのを妨げるか、または低減するための方法であって、
細胞に、請求項1から12のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項13もしくは14に記載の組成物を、そのような細胞によるそのようなオリゴヌクレオチドの取り込みを促す条件下で、提供するステップと、
スプライシングが起こるのを可能にするステップと
を含む、in vitro方法。
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