JP2018515122A - ジストロフィー型表皮水疱症を処置するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

エクソン８０がヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびエクソン８０がヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減するための方法。

Description

発明の分野
本発明は、ヒトの疾患を処置する際に使用するのに適したオリゴヌクレオチドに関する。特に、本発明は、ジストロフィー型表皮水疱症の処置に適したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関する。

表皮水疱症（ＥＢ）は、遺伝性皮膚疾患のグループであり、皮膚および粘膜の慢性的な脆弱性および水疱形成を特徴とする。亜型によりＥＢの症状の範囲は非常に広く、極わずかな皮膚の脆弱性から全身的合併症を伴う極めて重篤な症状にまで及ぶ。世界中で約３５０，０００人の患者が冒されている。ＥＢの一部の型では、爪、髪および歯も関連する場合もある。ＥＢの主な型としては、ＥＢ単純型（ＥＢＳ）、接合部型ＥＢ（ＪＥＢ）、ジストロフィー型ＥＢ（ＤＥＢ）およびキンドラー症候群（ＫＳ）が挙げられる（Fine et al. 2014）。

ＤＥＢは、ＥＢ患者の約２５％を冒し、優性遺伝性または劣性遺伝性のいずれかの可能性があり、ＶＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ７Ａ１、ＯＭＩＭ １２０１２０）の欠損を伴う。ＣＯＬ７Ａ１は、ＶＩＩ型コラーゲンのアルファ−１鎖をコードする。ＶＩＩ型コラーゲンは、真皮の上側部分の緻密層（基底膜の一部）との係留線維として働く。翻訳後修飾後に、３つの同一のアルファ−１鎖がコラーゲンの三重らせんドメインと一緒に折り畳まれる。その後、整列し係留線維を形成する逆平行二量体が形成される。ＶＩＩ型コラーゲンは、皮膚でケラチノサイトおよび皮膚線維芽細胞によって合成される。ＤＥＢ疾患の重症度は、基底膜領域におけるＶＩＩ型コラーゲン発現の量とおおむね相関する。

優性ジストロフィー型ＥＢ（ＤＤＥＢ）の特徴としては、手、足、肘および膝に局在するか、または全身性である場合もある水疱形成が挙げられる。一般的な所見としては、瘢痕化、稗粒腫、粘膜合併症、および異常な爪または爪がないことが挙げられる。劣性ジストロフィー型ＥＢ（ＲＤＥＢ、ＤＥＢ患者の約５０％）は、一般にＤＤＥＢよりも全身性で重篤である。ＤＤＥＢの症状に加えて、その他のＲＤＥＢの一般的な症状としては、栄養不良、貧血、骨粗鬆症、食道狭窄、発育遅延、ミトン状変形（mitten deformity）（偽合指症（pseudosyndactyly））の原因となる水かき（webbing）、または手足の指の癒着、筋拘縮の発症、歯の形成異常、小口症および眼の瘢痕化が挙げられる。このグループでは扁平上皮がんならびに転移性扁平上皮がんによる死亡のリスクが大幅に増加する。

遺伝子ＣＯＬ７Ａ１内に４００を超えるさまざまな突然変異が知られている。最も一般的な影響を及ぼすエクソンの１つ（ＲＤＥＢの７％）は、３を超える異なる突然変異、ミスセンス突然変異、または未成熟終止コドン（ＰＴＣ）に至る突然変異を有するエクソン８０である。ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソンの大多数はインフレームであるという事実のために、エクソンスキッピングは、タンパク質機能を保持したままで、ＰＴＣ変異を有するエクソンを排除するための潜在的に実行可能な戦略である（Goto et al. 2006）。

現在ＤＥＢに対する治療法はなく、緩和ケアが行われるだけである。ＲＤＥＢの重度の型は社会の医療のための予算に高いコストを課し、被覆材および薬剤の平均コストは、年間患者一人当たり約２００，０００ユーロである。ＤＥＢ患者について予想される寿命は、３０から４０歳の間のいずれかの年齢である。

Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌｅ（ＩＮＳＥＲＭ）の国際公開第２０１３／０５３８１９号パンフレットは、エクソン８０に相補的な２２ヌクレオチドおよび上流イントロンに相補的な２ヌクレオチドを有し、このエクソン全体をｍＲＮＡからスキップさせる、以下の２つの２４ｍｅｒのアンチセンスオリゴヌクレオチドについて開示している（図１も参照）：
ＥＳＥ８０．３ ＧＧＣＣ ＵＣＵＵ ＧＧＡＣ ＣＣＵＧ ＣＡＧＡ ＣＣＣＵ（配列番号２）
ＥＳＥ８０．３−Ｑ２Ｉ７０Ｘ ＧＧＣＣ ＵＣＵＵ ＧＧＡＣ ＣＣＵＡ ＣＡＧＡ ＣＣＣＵ（配列番号３）

エクソン８０欠損ｍＲＮＡは、野生型タンパク質よりも短いが、野生型ＶＩＩ型コラーゲンと似た挙動をとる機能的なポリペプチドに翻訳される可能性が最も高い。本発明の発明者らは、国際公開第２０１３／０５３８１９号パンフレットに開示されているオリゴヌクレオチドをヒト初代線維芽細胞（ＨＰＦ）およびＨｅＬａ細胞において試験して、それらのスキッピング効率を評価した。両方のＡＯＮは、試験した条件下で、５０％未満のスキッピング効率を示すが、ＥＳＥ８０．３は、ＥＳＥ８０．３−Ｑ２１７０Ｘよりもわずかにより良く機能するようである。これらのエクソンスキッピングオリゴヌクレオチドはこの恐ろしい疾患に対処する上で有望な第１のステップを提供するが、エクソン８０スキッピングの効率を改良するためのさらなる代替のオリゴヌクレオチドの必要性は依然として明らかにある。

本発明は、哺乳動物細胞において（例えば、ヒト細胞においてｉｎ ｖｉｖｏで）ｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン８０が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるさまざまなＡＯＮを提供する。第１の態様では、オリゴヌクレオチドは、（ａ）エクソン８０の部分と相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ（ｂ）２４ヌクレオチド長未満である。したがって、これらのオリゴヌクレオチドは、従来技術において開示されているものよりも短いので有利である。

第２の態様では、オリゴヌクレオチドは、エクソン８０の３’部分および下流イントロンの５’部分と相補的なヌクレオチド配列を含む。エクソン８０とその下流イントロンとの間の境界にかかるＡＯＮはこれまでに記載されていないが、それらがエクソンスキッピングの促進に有効であることを本明細書において示している。例えば、これらのＡＯＮは、５’−ＵＣＡＣＣＡＣＵ−３’、５’−ＡＣＣＡＣＵＧＧ−３’、および／または５’−ＡＣＵＣＡＣＣＡ−３’を含んでもよい。

第３の態様では、オリゴヌクレオチドは、エクソン８０の上流のイントロンにハイブリダイズしない。例えば、オリゴヌクレオチドは、エクソン８０（の部分）と相補的でありうるが、その上流イントロンと相補的でない、すなわち、ハイブリダイゼーションは下流イントロン内でのみ生じるはずである。同様に、オリゴヌクレオチドは、エクソン８０（の部分）と相補性の領域を含んでもよいが、相補性は、上流イントロン内に及ばない（かつ、一部の実施形態では、それは、エクソン８０に隣接するいずれのイントロン内にも及ばない）。したがって、（例えば、図１に示されているような）塩基対合によってエクソン８０とアライメントされたときに、オリゴヌクレオチドは、上流イントロンとのいずれの塩基対も含まないことになる（かつ、一部の実施形態では、上流イントロンとの塩基対も下流イントロンとの塩基対も含まない）。対照的に、従来技術のＡＯＮは、エクソン８０およびその上流イントロンにかかっている（図１にある「ＥＳＥ」オリゴヌクレオチドを参照）。

第４の態様では、オリゴヌクレオチドは、最大２０ヌクレオチド長（例えば、最大１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド；例えば、最大１１〜１７など）である、エクソン８０と相補性の領域を含む。対照的に、当技術分野の既知のＡＯＮは、エクソン内に２２ｍｅｒの配列を含む。エクソン８０と相補的な１１〜１４ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドがきわめて有効であることを本明細書において示している。

したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、（ａ）１１〜１７ヌクレオチド長などの最大２０ヌクレオチド長である、エクソン８０と相補性の領域、および（ｂ）エクソン８０の上流または下流のイントロンにおける（好ましくは下流イントロンにおける）ＲＮＡ転写産物と相補的な領域を含んでもよい。

本発明のＡＯＮは、２４ヌクレオチド長以下、例えば、２０〜２３ヌクレオチド長の間であることが有利である。本発明のＡＯＮは、好ましくは、ＲＮＡ ＡＯＮである。天然の核酸と比較して、それらは、化学的に修飾されたヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオエート結合）を有してもよく、（例えば、２’−Ｏ−アルキル置換で）修飾された糖を有してもよい。

本発明のＡＯＮは、ヒトの治療に使用するための医薬組成物中に製剤化することができ、かつエクソン８０が哺乳動物、好ましくはヒトのＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減するための方法において使用することができる。

エクソン８０（太字の大文字；配列番号１８）をその５’および３’の隣接しているイントロン境界（小文字；配列番号１９上流、および配列番号２０下流）と共に含むヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子の断片（配列番号１）を示す図であり、本明細書において試験したさまざまなアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を下に示している（３’から５’の方向で示している）。ＥＳＥ８０．３およびＥＳＥ８０．３＿Ｑ２１７０Ｘは、国際公開第２０１３／０５３８１９号パンフレットに開示されている；他のＡＯＮは、本発明によるものである。ＲＮＡ転写産物エクソン８０内の下線付きのヌクレオチドは、ＥＢ患者において見出される最も高頻度のエクソン８０突然変異を示している。小文字および大文字の使用は、エクソン（大文字）およびイントロン（小文字）の配列および境界の認識を促進するため、ならびにオリゴヌクレオチドをそれらの相補的な標的配列とアライメントするのを容易にするためだけのものである。配列番号２２、２３および２４は、本発明のさまざまなＡＯＮ内の配列またはそれらと部分的に重複している配列である。 本明細書に記載のＡＯＮで処理したヒト初代線維芽細胞（ＨＰＦ）におけるエクソンスキッピングについてのラボオンチップ結果を示す図である。完全長型バンドおよびエクソン８０をスキップしたバンドを矢印で示している。レーン１〜１６は、左から右に：空の対照；ｍａｘＰｅｉ対照；ＥＳＥ８０．３；ＥＳＥ８０．３＿Ｑ２Ｉ７０Ｘ；ＡＯＮ８０．１；ＡＯＮ８０．２；ＡＯＮ８０．３；ＡＯＮ８０．４；ＡＯＮ８０．５；ＡＯＮ８０．６；ＡＯＮ８０．７；ＡＯＮ８０．８；ＡＯＮ８０．９；ＡＯＮ８０．１０；ＡＯＮ８０．１１；およびＡＯＮ８０．１２である。上の矢印は、完全長型ｍＲＮＡ産物を示し、下の矢印は、エクソン８０が排除されたｍＲＮＡ産物を示す。 ＡＯＮで処理したＨｅＬａ細胞におけるエクソンスキッピングについてのラボオンチップ結果を示す図である。完全長型バンドおよびエクソン８０をスキップしたバンドの位置は、図２にあるのと同様であり、レーン１〜１６についても同様である。 ＡＯＮ８０．５から最適化してＨＰＦにおいて試験した、ＡＯＮのラボオンチップ結果を示す図である。ＡＯＮ８０．５．１、ＡＯＮ８０．５．２およびＡＯＮ８０．１３は、ＡＯＮ８０．５．３、ＡＯＮ８０．５．４およびＡＯＮ８０．５．５よりも高いスプライシング効率を有する。形成されたすべての産物の正確な配列を評価するために、配列解析を行った。ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析後に可視の余分な産物（上の２つの矢印）は、ｍＲＮＡ内に含まれるイントロン８２を有するものである（シークエンス解析で検出された）。イントロン８２の存在は、停止コドンの存在をもたらし、タンパク質の分解へとつながる可能性が高くなる。ＦＬ＝完全長型。 ＡＯＮ８０．５と比較した、最適化されたＡＯＮで処理したＨＰＦにおけるエクソンスキッピングについてのラボオンチップ結果を示す図である。上の矢印は、完全長型ｍＲＮＡを示し、下の矢印は、エクソン８０が排除されたｍＲＮＡを示している。レーン１〜７は、ＡＯＮ８０．５、ＡＯＮ８０．５．１、ＡＯＮ８０．５．２、ＡＯＮ８０．５．３、ＡＯＮ８０．５．７、ＡＯＮ８０．５．８およびＡＯＮ８０．１３である。 ＡＯＮ８０．５およびＡＯＮ８０．５．１のそれぞれについての３つの用量を含む、表示した処理に応答した免疫原性（ＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−１活性化）を示す図である。ｙ軸は、ＳＥＡＰ活性（任意単位でＯＤ_{６５５ｎｍ}）を示し、生理的食塩水に対して相対的な変化倍率を示している。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊Ｐ＜０．０５。 ＡＯＮ８０．５およびＡＯＮ８０．５．１のそれぞれについての３つの用量を含む、表示した処理の後のＲＡＷ−ｂｌｕｅマクロファージの細胞生存率を示す図である。ｙ軸は、レゾルフィンレベル（λ_{Ｅｘ５６０ｎｍ}／λ_{Ｅｍ５９０ｎｍ}）を示し、生理的食塩水に対して相対的な変化倍率を示している。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊Ｐ＜０．０５。

驚くべきことに、本明細書中に開示されているアッセイにおいて、従来技術において開示されているものと比較して、同様のまたはより良好なエクソンスキッピング特性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）が得られた。本発明のこれらのＡＯＮは、ヒトの疾患、より詳細には、表皮水疱症（ＥＢ）、さらにより詳細には、ＣＯＬ７Ａ１エクソン８０内の突然変異と関連したＥＢを処置するための治療において活性医薬物質として使用することができる。これらのＡＯＮは、単独の活性医薬物質として、ＣＯＬ７Ａ１エクソン８０を標的とする他のＡＯＮ（本明細書中に開示されているものを含む）と組み合わせて、かつ／またはＥＢ疾患を処置するための他の活性医薬物質と組み合わせて使用されてもよい。そのような他の医薬物質は、他のＡＯＮ、例えば、他のエクソン（エクソン７３、７４または３を含む）内の突然変異を標的とするもの、または非ＡＯＮ活性医薬物質であってもよい。組合せ治療は、同時または連続に投与される、単一の組成物または複数の組成物の形態であってもよい。

本発明は、細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン８０が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるＡＯＮであって、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン８０の少なくとも一部と相補的であり、かつエクソン８０の上流イントロンと相補的でないヌクレオチド配列、またはエクソン８０の少なくとも一部と相補的であり、かつ２４ヌクレオチド長未満であるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＡＯＮに関する。好ましい実施形態では、本発明によるＡＯＮは、エクソン８０と相補性の領域を含み、ここで、相補性の前記領域は、最大２０ヌクレオチド長、好ましくは１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７ヌクレオチドである。より好ましくは、前記ＡＯＮは、エクソン８０の３’部分および下流イントロンの５’部分と相補的なヌクレオチド配列を含む。さらにより好ましくは、ＡＯＮは、ヌクレオチド配列５’−ＵＣＡＣＣＡＣＵ−３’、５’−ＡＣＣＡＣＵＧＧ−３’、または５’−ＡＣＵＣＡＣＣＡ−３’を含む。最も好ましくは、本発明によるＡＯＮは、配列番号７、８、２５、２６、２８、３１および３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

別の実施形態では、本発明は、２４ヌクレオチド長未満であり、好ましくは２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドを含む、本発明によるＡＯＮに関する。好ましくは、前記ＡＯＮは配列番号４もしくは５のヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記ＡＯＮは配列番号６のヌクレオチド配列を含み、またはＡＯＮは配列番号３０のヌクレオチド配列を含む。

本発明によるＡＯＮは−それらの有効性とは別に−、本発明のＡＯＮが、従来技術において開示されているものよりも短いことが好ましいという点で、商品の製造容易性、分出記録および／またはコストに関して、従来技術において開示されているものを超える特定の利点を有する。

本発明の好ましいＡＯＮは、２０、２１、２２または２３などの２４未満のヌクレオチド長である。ＡＯＮがエクソン８０のみと相補的であり、かつ（本明細書中に示しているような）その隣接イントロンのいずれとも相補的でない場合、それは、全エクソンの３６ｎｔ長（例えば、ＡＯＮ８０．１３）までの任意の長さであってもよい。

本発明のＡＯＮを使用した処置の結果としてエクソン８０全体がない短縮されたｍＲＮＡは、短いが機能的なＣＯＬ ＶＩＩタンパク質に翻訳されることになる。しかし、一部の例では、本発明の特定のＡＯＮを使用すると、より長い転写産物も形成され（例えば、イントロン８２からの配列）、これは、より短い（機能的）タンパク質と並んで（非機能的かつ容易に分解可能な）タンパク質の発現をもたらしうる。

驚くべきことに、哺乳動物細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン８０が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるＡＯＮであって、前記オリゴヌクレオチドの配列が、エクソン８０の３’部分および下流イントロンの５’部分と相補的である（例えば、１２エクソンヌクレオチドおよび１２イントロンヌクレオチドを有する２４ｍｅｒの５’−ＣＣＴＧＧＣＣＣＡＧＴＧｇｔｇａｇｔａｃｃｃａａ−３’（配列番号２１）と（部分的に）相補的である）ことを特徴とするＡＯＮが特定された。これまでに、エクソン８０とその下流イントロンとの間の境界をカバーするＡＯＮは、記載されていない。そのようなＡＯＮは、例えば、以下を含んでもよい：（ｉ）配列５’−ＵＣＡＣＣＡＣＵ−３’（配列番号２２）、したがって、エクソン／イントロン境界の両側からの少なくとも４ヌクレオチドを含む；（ｉｉ）配列５’−ＡＣＣＡＣＵＧＧ−３’（配列番号２３）、したがって、境界のイントロン側からの少なくとも２ヌクレオチドおよびエクソン側からの少なくとも６ヌクレオチドを含む；ならびに／または（ｉｉｉ）配列５’−ＡＣＵＣＡＣＣＡ−３’（配列番号２４）、したがって、境界のイントロン側からの少なくとも６ヌクレオチドおよびエクソン側からの少なくとも２ヌクレオチドを含む。ＡＯＮ８０．４、ＡＯＮ８０．５、ＡＯＮ８０．５．１、ＡＯＮ８０．５．２、ＡＯＮ８０．５．３、ＡＯＮ８０．５．４、ＡＯＮ８０．５．５、ＡＯＮ８０．５．７およびＡＯＮ８０．５．８、（下記を参照）は、そのようなＡＯＮの例である。この型のＡＯＮは、理想的には、境界のそれぞれの側から少なくとも２ヌクレオチド（例えば、それぞれの側から少なくとも４または６ヌクレオチド）を含むが、それぞれの側から同数のヌクレオチドを含む必要はない（例えば、奇数のヌクレオチドを有していてもよい、例えば、ＡＯＮ８０．５系列など）。

言い換えると、ＡＯＮは、３’スプライス部位を含む、エクソン８０の３’部分、および下流イントロンの５’部分と相補的であり、かつ哺乳動物細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときにエクソン８０が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができることが初めて記載される。これらのＡＯＮは、このように有用であると同時に、哺乳動物細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン８０が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができる他のＡＯＮと組み合わせるため、特に、エクソン８０の内側の部分などのエクソン８０の異なる部分、またはエクソン８０の５’部分および／もしくはエクソン８０とその上流イントロンとの５’境界と相補的なＡＯＮと組み合わせるための良好な候補であると考えられている。そのような組合せは、有利であると考えられており、エクソン８０がスキップされる効率を高めるために必要なはずである。

しかし、他の実施形態では、本発明のＡＯＮは、エクソン８０のみにハイブリダイズしてもよく、したがって、エクソン８０の上流および下流のイントロンにハイブリダイズする領域を含まない。ＡＯＮ８０．３はそのようなＡＯＮの一例であり、ＡＯＮ８０．１３も同様である（下記を参照）。

さらなる実施形態では、ＡＯＮは、エクソン８０にハイブリダイズしてもよいが、その上流イントロンにハイブリダイズしない。ＡＯＮ８０．３、ＡＯＮ８０．４、ＡＯＮ８０．５、ＡＯＮ８０．５．１、ＡＯＮ８０．５．２、ＡＯＮ８０．５．３、ＡＯＮ８０．５．４、ＡＯＮ８０．５．５、ＡＯＮ８０．５．７、ＡＯＮ８０．５．８およびＡＯＮ８０．１３は、そのようなＡＯＮの例である（ここで、ＡＯＮ８０．４、ＡＯＮ８０．５、ＡＯＮ８０．５．１、ＡＯＮ８０．５．２、ＡＯＮ８０．５．３、ＡＯＮ８０．５．４、ＡＯＮ８０．５．５、ＡＯＮ８０．５．７およびＡＯＮ８０．５．８は、エクソン８０の直接下流のイントロンにもハイブリダイズするＡＯＮの例である）。

さらなる実施形態では、ＡＯＮは、最大２０ヌクレオチド長である、エクソン８０と相補性の領域を含む（一方、従来技術のＡＯＮのエクソン相補的領域は、２２ヌクレオチド長である）。ＡＯＮ８０．１、ＡＯＮ８０．２、ＡＯＮ８０．３、ＡＯＮ８０．４、およびＡＯＮ８０．５（下記の表１を参照）のそれぞれは、そのようなＡＯＮの例であり、それぞれ１０、１７、２０、１２、および１２エクソン相補的ヌクレオチドのストレッチを有する。ＡＯＮ８０．５．１、ＡＯＮ８０．５．２、ＡＯＮ８０．５．３、ＡＯＮ８０．５．４、ＡＯＮ８０．５．５、ＡＯＮ８０．５．７およびＡＯＮ８０．５．８系列は、さらなる例である（９から１４ヌクレオチドのエクソン重複を有する）。したがって、エクソン８０と相補性の領域は、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７ヌクレオチドなどの１１から１７ヌクレオチドの間などの８から２０の間（例えば、１０から２０ヌクレオチドの間）の長さであってもよい。

そのようなＡＯＮでは、＜２０ヌクレオチド長であるエクソン相補的領域に加えて、エクソン８０の上流または下流のイントロンと相補的な領域があってもよい。したがって、そのようなＡＯＮは、新生ＲＮＡ転写産物との、単一の、基本的に連続した、一続きの相補性を含み、これは、エクソン８０とその隣接イントロンのうちの１つとの間の境界にかかる。

本発明の特定の好ましいＡＯＮは、下記表１および２に開示されているＡＯＮ８０．１、ＡＯＮ８０．２、ＡＯＮ８０．３、ＡＯＮ８０．４、およびＡＯＮ８０．５である。本発明のさらに好ましいＡＯＮは、表１および２に開示されているＡＯＮ８０．５．１、ＡＯＮ８０．５．２、ＡＯＮ８０．５．４、ＡＯＮ８０．５．７、ＡＯＮ８０．５．８およびＡＯＮ８０．１３である。本発明によるきわめて好ましいＡＯＮは、ＡＯＮ８０．２（配列番号５）、ＡＯＮ８０．５（配列番号８）、ＡＯＮ８０．５．１（配列番号２５）、ＡＯＮ８０．５．２（配列番号２６）、ＡＯＮ８０．５．７（配列番号３１）、ＡＯＮ８０．５．８（配列番号３２）およびＡＯＮ８０．１３（配列番号３０）である。別の好ましい実施形態では、すべてのリボース部分が２’−Ｏ−メチル化されており、実質的にすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである。

本発明のすべての実施形態において、「エクソンが含まれるのを妨げるか、または少なくとも低減すること」および「エクソンスキッピング」という用語は同義である。ＣＯＬ７Ａ１に関して、「エクソンが含まれるのを妨げるか、または少なくとも低減すること」または「エクソンスキッピング」は、エクソン８０（配列番号１８またはそのアレル型）のヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡ（図１を参照）からの排除と解釈されるべきである。エクソンスキッピングという用語は、本明細書において、エクソンスキッピングされていない成熟ｍＲＮＡに存在することになろう特定のエクソンを含まない成熟ｍＲＮＡを細胞内で誘導することと定義される。エクソンスキッピングは、スプライシングの生化学的プロセスを可能にするために必要とされる、例えば、スプライスドナー配列もしくはスプライシングアクセプター配列などの配列を妨害することができる分子を用いて、またはひと続きのヌクレオチドを成熟ｍＲＮＡに含まれるべきエクソンと認識するために必要とされるエクソン選択シグナル（exon inclusion signal）を妨害することができる分子を用いて前記成熟ｍＲＮＡのｐｒｅ−ｍＲＮＡを発現する細胞をもたらすことによって達成される。そのような分子は、本明細書においてはエクソンスキッピング分子と呼ばれる。

ｐｒｅ−ｍＲＮＡという用語は、転写によって細胞でＤＮＡ鋳型から合成されるプロセシングされていないか、または部分的にプロセシングされた前駆体ｍＲＮＡを指す。

「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子、ｈｎＲＮＡ（ヘテロ核ＲＮＡ）またはｍＲＮＡ分子中の標的ヌクレオチド配列と相補的であり、その結果、その対応する標的配列とアニーリングすることができるヌクレオチド配列を指すものと理解される。

「相補的な」という用語は、本明細書中で使用される場合、「完全に相補的な」と、通常、オリゴヌクレオチドとその対応する標的配列との間の相補性の程度が８０％超、好ましくは８５％超、さらにより好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超になることを意味する「実質的に相補的な」とを含む。例えば、その配列とその標的配列との間に１つのミスマッチを含む２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対する、相補性の程度は９５％である。

アンチセンス配列の相補性の程度は、アンチセンス配列を含む分子が生理的条件下においてＲＮＡ分子中の標的ヌクレオチド配列とアニーリングすることができ、それによりエクソンスキッピングを促進するようにされることが好ましい。特定のミスマッチは、他のものよりも融解温度すなわちＴｍを単位として表されるＡＯＮと標的配列との間の結合の強度に対する影響が小さいため、特定のミスマッチは他のものより許容されることが当業者にはよく知られている。特定の非相補的な塩基対は、真のミスマッチほどではないにせよ全体的な結合を妨げる、いわゆる「ゆらぎ」を生じる場合もある。ＡＯＮの長さも結合の強度に影響を与え、長いＡＯＮは、通例、短いＡＯＮよりも高い融解温度を有し、オリゴヌクレオチドのＧ／Ｃ含有量も結合の強度を決定する要素であり、Ｇ／Ｃ含有量が高いと任意の所与の長さに対する融解温度がより高くなる。本発明によって意図されるとおりのヌクレオベースまたは糖・リン酸骨格の特定の化学修飾も結合の強度に影響を与える可能性があるため、相補性の程度は、本発明によるオリゴヌクレオチドを設計するときに考慮すべき一要素に過ぎない。

オリゴヌクレオチド中の１つＣｐＧまたは多数（２つ以上）のＣｐＧの存在は、通常、前記オリゴヌクレオチドの免疫原性の増加と関連づけられる（Dorn and Kippenberger, 2008）。この免疫原性の増加は、処置される組織、すなわち、皮膚（真皮および／または表皮）に損傷を引き起こす可能性もあるため望ましくない。したがって、本発明のＡＯＮは、１または２以下のＣｐＧジヌクレオチド配列（好ましくは１つだけ）を含むことが好ましい。

本発明は、許容できるＲＮＡ結合動態および／または熱力学的特性を有するオリゴヌクレオチドを設計することを可能にする。ＲＮＡ結合動態および／または熱力学的特性は、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ、基礎のＴｍおよび最隣接モデルを使用して単鎖ＲＮＡに対するオリゴヌクレオチド特性計算機（ｗｗｗ．ｕｎｃ．ｅｄｕ／〜ｃａｉｌ／ｂｉｏｔｏｏｌ／ｏｌｉｇｏ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）により算出される）および／またはＡＯＮ標的エクソン複合体の自由エネルギー（ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅバージョン４．５を使用）によって少なくとも部分的に決定される。Ｔｍが高すぎると、オリゴヌクレオチドは、あまり特異的でなくなることが予想される。許容できるＴｍおよび自由エネルギーは、オリゴヌクレオチドの配列、骨格（ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ペプチド−核酸など）の化学的性質、糖部分の性質（リボース、デオキシリボース、置換リボース、分子内架橋）およびヌクレオベースの化学修飾により決まる。したがって、Ｔｍの範囲は、広く変化する場合がある。

エクソンスキッピングパーセンテージまたは効率は、サイクル数が、増幅が依然として指数関数的段階にあるような条件で、任意の所与のプライマーセットに関して、所与の数のＰＣＲサイクル後の増幅された短縮型（エクソン８０を含まない）バンドの濃度で割り、１００％を掛けた増幅された野生型バンドの濃度を求めることによって算出されてもよい。定量化は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒをＤＮＡ１０００キットと組み合わせて使用して行ってもよい。

好ましくは、配列番号１に示されるとおりのヌクレオチド配列と相補的な配列を含む本発明によるＡＯＮは、相補的な部分が、標的配列と少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは約１００％相補的であるようにされる。したがって、相補性の領域にあるすべての塩基が対向する鎖にある塩基と対形成することができることが絶対に必要とされる訳ではない。例えば、オリゴヌクレオチドを設計するとき、例えば、相補的な鎖にある塩基と塩基対にならない残基を組み込むことを望むこともできる。細胞の環境下において、ひと続きのヌクレオチドが相補的な部分と十分にハイブリダイズすることができるなら、ミスマッチは、ある程度許容される場合もある。この文脈において、「十分に」は、本発明によるＡＯＮがエクソン８０のエクソンスキッピングを誘導することができることを意味する。標的とされるエクソンのスキッピングは、好都合にも、ＰＣＲ／Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、任意選択でｄｄＰＣＲによって評価することができる。相補的な領域は、組み合わされる場合、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのエクソンに特異的であるよう設計されることが好ましい。そのような特異性は、この系の他の（ｐｒｅ−）ｍＲＮＡ分子にある実際の配列に依存するため、さまざまな長さの相補的な領域を用いて作り出すことができる。オリゴヌクレオチドのサイズを増加させることでオリゴヌクレオチドが１つ以上の他のｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子ともハイブリダイズすることができてしまうリスクは低下するが、長さは製造性、精製および／または分析に関する問題の原因となるほど長過ぎてはならない。

相補性の領域にミスマッチを含むが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡの標的とされる領域（複数可）とハイブリダイズする能力および／または結合する能力を保持するオリゴヌクレオチドを本発明に使用することができることは明らかである。しかしながら、相補的な部分は、一般に１つ以上の相補的な領域にそのようなミスマッチを有するオリゴヌクレオチドよりも高い効率および高い特異性を有するため、少なくとも相補的な部分は、そのようなミスマッチを含まないことが好ましい。さらに高いハイブリダイゼーション強度（すなわち、対向する鎖との相互作用の数を増加させる）は、系のスプライシング機構を妨害するプロセスの効率を増加させる際に有利であると考えられる。好ましくは、相補性は、９０％から１００％である。一般に、これは、２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに１もしくは２つのミスマッチを許容する。

本発明のエクソンスキッピング分子は、好ましくは、配列番号１内のエクソン８０配列（配列番号１８）と相補的な（アンチセンス）オリゴヌクレオチドである。

好ましくは、オリゴヌクレオチドの相補的な部分の長さは、オリゴヌクレオチドの長さと同じであり、これは、標的ＲＮＡと塩基対を形成しないオリゴの５’末端または３’末端がないことを意味する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドに関する好ましい長さは、２３ヌクレオチド以下、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチドである。

２０、２１または２３ヌクレオチドの長さを有するＡＯＮを用いると特に良好な結果が得られた。

ＡＯＮがエクソン８０のみと相補的であり、かつその隣接イントロンのいずれとも相補的でない場合、それは、任意の長さ、例えば、１２〜３６ヌクレオチド長、例えば、２０ｍｅｒ（例えば、ＡＯＮ８０．３）または３６ｍｅｒ（例えば、ＡＯＮ８０．１３）であってもよい。

本発明によるエクソンスキッピング分子は、１つ以上のＤＮＡ残基（したがって、ＲＮＡ「ｕ」残基がＤＮＡ対応物として「ｔ」残基になる）、もしくは１つ以上のＲＮＡ残基、および／または本明細書の下でさらに詳述されることになる１つ以上のヌクレオチドアナログもしくは等価物を含んでもよい。配列番号４〜１５および２５〜３２はＲＮＡ配列であるが、本発明は、ＤＮＡ形態のこれらの各配列、およびこれらの配列のキメラなＤＮＡ／ＲＮＡのＡＯＮも包含する。

本発明のエクソンスキッピング分子は、ヌクレアーゼ耐性を高めるため、および／または標的配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を高めるために修飾された１つ以上の残基を含むことが好ましい。ゆえに、好ましい実施形態において、本アンチセンスヌクレオチド配列は、少なくとも１つのヌクレオチドアナログまたは等価物を含み、ヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾塩基、および／または修飾骨格、および／または非天然のヌクレオシド間結合あるいはこれらの修飾の組合せを有する残基と定義される。

好ましい実施形態において、本ヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾骨格を含む。そのような骨格の例は、モルフォリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチル（formacetyl）およびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル（riboacetyl）骨格、アルケン含有骨格、スルファメート、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、およびアミド骨格によって提供される。ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーは、アンチセンス薬剤として以前に調査された修飾骨格オリゴヌクレオチドである。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのデオキシリボース糖が六員環で置換され、ホスホジエステル結合がホスホロジアミデート結合で置換された無荷電骨格を有する。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、酵素分解に耐性があり、ＲＮａｓｅ Ｈを活性化することよりむしろ翻訳を阻止すること、またはｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングを妨げることによってアンチセンス薬剤として働くようである。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、細胞膜を物理的に破壊する方法によって首尾よく組織培養細胞に送達され、こうしたいくつかの方法を比較した研究の１つは、スクレープローディング（scrape loading）が最も効率的な送達の方法であることを見出したが、モルフォリノ骨格は荷電していないため、カチオン性脂質は、細胞へのモルフォリノオリゴヌクレオチド取り込みの有効なメディエーターではない。

本発明の一実施形態によると、骨格の残基間の結合は、リン原子を含まず、これは例えば、短鎖アルキルによって形成される結合またはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合したヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子結合もしくは複素環式ヌクレオシド間結合である。

この実施形態によると、好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾ポリアミド骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（Nielsen, et al. 1991)。ＰＮＡベースの分子は、塩基対の認識に関してＤＮＡ分子の真の模倣物である。ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から構成され、ヌクレオベースは、メチレンカルボニル結合によって骨格と連結される。代替的な骨格は、炭素１つ伸長したピロリジンＰＮＡモノマーを含む（Govindaraju and Kumar. 2005）。ＰＮＡ分子の骨格は荷電したリン酸基を含まないため、ＰＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、通常、それぞれＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりも安定している（Egholm et al. 1993）。

本発明の別の実施形態によると、骨格は、モルフォリノヌクレオチドアナログまたは等価物を含み、その中のリボースまたはデオキシリボース糖がモルフォリノ六員環（6-membered morpholino ring）で置換されている。最も好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含み、その中のリボースまたはデオキシリボース糖がモルフォリノ六員環で置換されており、隣接するモルフォリノ環間のアニオン性ホスホジエステル結合が非イオン性ホスホロジアミデート結合によって置換されている。

さらに別の実施形態において、本発明のヌクレオチドアナログまたは等価物は、ホスホジエステル結合にある１つの非橋架酸素の置換を含む。この修飾は、塩基対合をやや不安定にするが、ヌクレアーゼ分解に対する著しい耐性を付加する。好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネートおよび３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノリン酸またはボラノリン酸を含む。

本発明のさらに好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、例えば、−ＯＨ；−Ｆ；１つ以上のヘテロ原子の割り込みがあってもよい置換または非置換、直鎖または分岐の低級（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アリル、またはアラルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アリル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、−メトキシ、−アミノプロポキシ；メトキシエトキシ；−ジメチルアミノオキシエトキシ；および−ジメチルアミノエトキシエトキシにより２’、３’および／または５’位において一置換または二置換された１つ以上の糖部分を含む。糖部分は、フラノースもしくはその誘導体、またはデオキシフラノースもしくはその誘導体、好ましくは、リボースもしくはその誘導体またはデオキシリボースもしくはその誘導体であってもよい。好ましい誘導体化糖部分は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、その中の２’−炭素原子が糖環の３’または４’炭素原子と連結され、それにより二環式の糖部分を形成する。好ましいＬＮＡは、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン−架橋化核酸を含む（Morita et al. 2001. Nucleic Acid Res Supplement No. 1: 241-242）。これらの置換は、ヌクレオチドアナログまたは等価物をＲＮａｓｅ Ｈおよびヌクレアーゼ耐性にし、標的ＲＮＡに対する親和性を高める。

アンチセンスオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシド間結合が必ずしも修飾されている必要がないことは当業者に理解される。例えば、一部のヌクレオシド間結合が無修飾であってもよいのに対し、その他のヌクレオシド間結合が修飾されている。一形態の（修飾）ヌクレオシド間結合、ＡＯＮの長さ方向に沿って均一または不均一に分散した複数の形態の（修飾）ヌクレオシド間結合からなる骨格を含むＡＯＮはすべて本発明によって包含される。さらに、骨格修飾（均一、不均一、一形態もしくは複数形態およびそれらのすべての変形）の任意の様式を、下で言及される糖もしくはヌクレオシド修飾またはアナログの任意の形態と組み合わされてもよい。

本発明によるＡＯＮに特に好ましい骨格は、均一な（すべて）ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格である。

別の実施形態において、本発明のヌクレオチドアナログまたは等価物は、１つ以上の塩基修飾または置換を含む。修飾塩基は、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび当該技術分野において知られているか、または知られることになるピリミジン塩基およびプリン塩基の他の−アザ、デアザ、−ヒドロキシ、−ハロ、−チオ、チオール、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、チオアルキル誘導体などの合成および天然の塩基を含む。

アンチセンスオリゴヌクレオチドのすべての位置が均一に修飾されている必要はないことが当業者に理解される。さらに、上記のアナログまたは等価物の１つ超が、１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはさらにはアンチセンスオリゴヌクレオチド内の１つの位置に組み込まれてもよい。特定の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの異なる種類のアナログまたは等価物を有する。

別の実施形態によると、本発明によるＡＯＮは、２’−Ｏ（好ましくは、低級）アルキルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾リボース、２’−Ｏ−エチル修飾リボース、２’−Ｏ−プロピル修飾リボース、および／またはハロゲン化誘導体などのこれらの修飾の置換誘導体を含む。

本発明による有効で好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド様式は、ホスホロチオエート骨格を伴う２’−Ｏ−メチル修飾リボース部分を含み、好ましくは、実質的にすべてのリボース部分が２’−Ｏ−メチルであり、実質的にすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。

ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン８０の効率的なスキッピングのためにさまざまなＡＯＮを組み合わせることができることも当業者には理解されるであろう。少なくとも１つのＡＯＮが本発明によるＡＯＮである限り、エクソン８０（図１）の同じ領域または異なる領域を標的とする２つのＡＯＮ、例えば、２つのＡＯＮ、３つの異なるＡＯＮ、４つの異なるＡＯＮ、または５つの異なるＡＯＮの組合せが本発明の方法に使用されてもよい。

ＡＯＮは、細胞、好ましくは、皮膚細胞へのＡＯＮの取り込みを高める部分に連結されてもよい。そのような部分の例は、コレステロール、炭水化物、ビタミン、ビオチン、脂質、リン脂質、細胞透過性ペプチドであり、以下に限定されるものではないが、アンテナペディア、ＴＡＴ、トランスポータンおよびオリゴアルギニン（oligoarginine）、ポリアルギニン、オリゴリジン（oligolysine）またはポリリジンなどの正電荷アミノ酸、抗体によってもたらされるものなどの抗原結合ドメイン、抗体のＦａｂフラグメント、またはラクダ科動物のシングルドメイン抗原結合ドメインなどの単鎖抗原結合ドメインを含む。

本発明によるエクソンスキッピング分子は、ネイキッド（naked）（裸の（gymnotic））ＡＯＮもしくは複合体の形態であってもよく、またはベクターから発現されてもよい（ベクターにより運ばれる（vectored）ＡＯＮ）。本エクソンスキッピング分子は、当該技術分野において既知の適した手段を使用して投与することができる。エクソンスキッピング分子がベクターにより運ばれるＡＯＮである場合、ＡＯＮは、例えば、前記オリゴヌクレオチドを含む転写物をコードする発現ベクターの形態で個体または前記個体の細胞、組織もしくは臓器に与えられてもよい。発現ベクターは、好ましくは細胞、組織、臓器または個体にウイルスベクターなどの遺伝子送達媒体により導入される。好ましい実施形態において、本明細書において特定されるエクソンスキッピング分子の発現または転写を駆動する発現カセットまたは転写カセット（transcription cassette）を含むウイルスベースの発現ベクターが提供される。したがって、本発明は、エクソンスキッピング分子の発現を促す条件下に置かれたときに本発明によるエクソンスキッピング分子を発現させるウイルスベクターを提供する。細胞は、例えば、プラスミドによるＡＯＮ発現またはアデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスベースのベクターによってもたらされるウイルス発現によって、エクソン８０が含まれるために必須の、または少なくともそれを促す配列を妨害することができるエクソンスキッピング分子が与えられてもよく、その結果、そのような妨害が、エクソン８０がＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、少なくとも低減する。発現は、Ｕ１、Ｕ６、またはＵ７ ＲＮＡプロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって駆動されてもよい。好ましい送達媒体は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）などのウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターなどである。また、プラスミド、人工染色体、標的相同組換えおよび細胞の哺乳動物（好ましくは、ヒト）ゲノムへの組み込みに使用可能なプラスミドが、本明細書中で定義されるオリゴヌクレオチドの送達に適切に利用されてもよい。転写がＰｏｌ−ＩＩＩプロモーターから行われ、かつ／または転写物がＵ１またはＵ７転写物との融合物の形態であるそうしたベクターが本発明に好ましく、これが小さな転写物の送達に関して良好な結果をもたらす。適した転写物を設計することは技術のある技術者の範囲内にある。Ｐｏｌ−ＩＩＩによる転写物が好ましい。Ｕ１またはＵ７転写物との融合転写物の形態が好ましい。そのような融合物は、当該技術分野において記載されているとおりに作り出すことができる（例えばGorman L et al., 1998またはSuter D et al., 1999を参照）。

好ましいＡＯＮ発現系の１つは、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターである。ＣＯＬ７Ａ１エクソン８０の極めて効率的なスキッピングためのＡＯＮ配列の長期の発現のために使用することができる単鎖および二重鎖ＡＡＶベースのベクターが開発された。好ましいＡＡＶベースのベクターは、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって駆動される発現カセットを含む。好ましいＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、例えば、Ｕ１、Ｕ６、またはＵ７ ＲＮＡプロモーターである。したがって、本発明は、ＣＯＬ７Ａ１エクソン８０のスキッピングを誘導するための本発明のＡＯＮの発現のためのＰｏｌ ＩＩＩプロモーター駆動発現カセットを含むウイルスベースのベクターも提供する。本発明によるＡＡＶベクターは組換えＡＡＶベクターであり、本明細書中の別の場所で示したＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質のタンパク質の殻に包まれた本発明によるコード化エクソンスキッピング分子を含むＡＡＶゲノムの部分を含むＡＡＶベクターを指す。ＡＡＶゲノムの部分は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびその他などのアデノ随伴ウイルス血清型由来の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含んでもよい。カプシドタンパク質から構成されるタンパク質の殻は、ＡＡＶ１、２、３、４、５、８、９およびその他などのＡＡＶ血清型由来のものであってもよい。タンパク質の殻は、カプシドタンパク質の殻と呼ばれる場合もある。ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ遺伝子の１つまたは好ましくはすべてが除去されていてもよいが、依然として機能的なＩＴＲ核酸配列を含んでもよい。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキューおよびパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は、機能的なままである限り、野生型配列であってもよく、または野生型配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５、もしくは１００％の配列同一性を有してもよく、または例えば、ヌクレオチドの挿入、突然変異、欠失もしくは置換によって改変されていてもよい。この状況において、機能性とは、カプシドの殻へのゲノムのパッケージングを指示し、その結果、感染した宿主細胞または標的細胞における発現を可能にさせる能力を指す。本発明の状況において、カプシドタンパク質の殻は、ＡＡＶベクターゲノムＩＴＲと異なる血清型のものであってもよい。したがって、本発明によるＡＡＶベクターは、カプシドタンパク質の殻、すなわち、正二十面体のカプシドから構成されてもよく、それが、１つのＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３）を含み、一方、ＡＡＶ５ベクターに含まれるＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ベクターを含む任意の上記のＡＡＶ血清型であってもよい。したがって、「ＡＡＶ２ベクター」は、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、例えば、「ＡＡＶ５ベクター」は、ＡＡＶ血清型５のカプシドタンパク質の殻を含み、それにより、どちらも本発明による任意のＡＡＶベクターゲノムＩＴＲを包んでもよい。好ましくは、本発明による組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２、５、８またはＡＡＶ血清型９のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２、５、８またはＡＡＶ血清型９に由来する。そのようなＡＡＶベクターは、それぞれＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ５／２、ＡＡＶ５／５、ＡＡＶ５／８、ＡＡＶ５／９、ＡＡＶ８／２、ＡＡＶ８／５、ＡＡＶ８／８、ＡＡＶ８／９、ＡＡＶ９／２、ＡＡＶ９／５、ＡＡＶ９／８、またはＡＡＶ９／９ベクターと呼ばれる。本発明による組換えＡＡＶベクターは、真皮細胞および上皮細胞に対する指向性を有し、ＡＡＶ血清型５または８のカプシドタンパク質の殻を含むことがより好ましい。前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、同じ血清型またはＡＡＶ血清型２などの異なる血清型由来のものであってもよく、そのようなベクターは、ＡＡＶ２／５ベクターまたはＡＡＶ２／８ベクターと呼ばれる。血清型５のカプシドを有するＡＡＶは、基底角化細胞およびそれより上の角化細胞（basilar and suprabasilar keratinocyte）ならびに皮膚線維芽細胞などの真皮細胞および上皮細胞に対して指向性を有する。５型カプシドを有するＡＡＶベクターは、２型カプシドを有するＡＡＶよりもはるかに高いトランスダクション効率を示す（Keswani et al. 2012）。同様に、血清型８のカプシドを有するＡＡＶは、皮膚線維芽細胞および（主に）基底角化細胞よりも上の角化細胞に対して指向性を示す。さらに、ＡＡＶ２／８は、哺乳動物、好ましくは、ヒトの真皮細胞および上皮細胞に形質導入する際、ＡＡＶ２／５よりも効率的な傾向がある。ただし、トランスダクション効率は、創傷の治癒過程の投与のタイミングによって左右されるようであり、後の時点ではＡＡＶ２／２がＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／８よりも高いトランスダクション効率を示す（Keswani et al. 2012）。したがって、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶｘ／５およびＡＡＶｘ／８が本発明によるＡＯＮを送達するために好ましいＡＡＶであり、それらの選択は、投与の時期および標的となる細胞タイプを考慮して決定することができる。これらの詳細は、当業者によって前臨床的試験または臨床試験において容易に決めることができる。

最適な核酸配列によって表される本発明によるエクソンスキッピング分子をコードする核酸分子は、好ましくは、上で特定したＡＡＶゲノムまたはＩＴＲ配列、例えば、コード配列と機能可能に連結された発現調節エレメントおよび３’終結配列を含む発現コンストラクトの間に挿入される。

「ＡＡＶヘルパー機能」とは、一般に途中でＡＡＶベクターに与えられるＡＡＶ複製およびパッケージングに必要とされる対応するＡＡＶの機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターに欠けているＡＡＶの機能を補完するが、（ＡＡＶベクターゲノムによってもたらされる）ＡＡＶ ＩＴＲがない。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶの２つの主要なＯＲＦ、すなわち、ｒｅｐコード領域およびｃａｐコード領域またはそれらの機能的な実質的に同一の配列を含む。Ｒｅｐ領域およびＣａｐ領域は、当該技術分野において周知であり、例えば、参照によって本明細書に組み込むChioriniら（1999）または米国特許第５，１３９，９４１号明細書を参照。ＡＡＶヘルパー機能が、ＡＡＶヘルパーコンストラクトに与えられてもよく、これは、プラスミドであってもよい。ヘルパーコンストラクトの宿主細胞への導入は、例えば、本明細書において特定されるＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムの導入の前またはそれと同時のトランスフォーメーション、トランスフェクション、またはトランスダクションによって行われてもよい。したがって、本発明のＡＡＶヘルパーコンストラクトは、一方でＡＡＶベクターのカプシドタンパク質の殻に関して、他方で前記ＡＡＶベクター複製およびパッケージングにおいて存在するＡＡＶゲノムに関して血清型の所望の組合せをもたらすように選択されてもよい。

「ＡＡＶヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ複製およびパッケージングに必要とされる付加的な機能を提供する。適したＡＡＶヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１型および２型など）およびワクチニアウイルスが挙げられる。参照によって本明細書に組み込む米国特許第６，５３１，４５６号明細書に記載されているとおり、ヘルパーウイルスによってもたらされる付加的な機能も、ベクターにより宿主細胞に導入することができる。好ましくは、本発明による組換えＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ（複製）遺伝子またはｃａｐ（カプシド）遺伝子などのウイルスタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列を含まない。ＡＡＶゲノムは、例えば、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ｇｆｐ）をコードする遺伝子あるいは当該技術分野において既知の化学的に、酵素的にもしくは別の方法で検知可能なおよび／または選択可能な産生物をコードする遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ａｐｈなど）などのマーカー遺伝子あるいはレポーター遺伝子をさらに含んでもよい。本発明による好ましいＡＡＶベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む本発明によるエクソンスキッピング分子を発現させるＡＡＶベクター、好ましくは、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９またはＡＡＶ２／２ベクターであり、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、下記表１に開示されているＡＯＮ８０．１、ＡＯＮ８０．２、ＡＯＮ８０．３、ＡＯＮ８０．４およびＡＯＮ８０．５からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。個体または前記個体の細胞、組織、臓器に本発明によるエクソンスキッピング分子を与える手段の改善は、これまでに既に成し遂げられた進歩を考慮して予想される。そのような将来的な改善は、当然、本発明の方法を使用したｍＲＮＡの再構築に関して言及した効果を達成するために組み込まれてもよい。本発明によるエクソンスキッピング分子は、そのまま個体、前記個体の細胞、組織もしくは臓器に送達されてもよい。本発明によるエクソンスキッピング分子を投与するとき、分子を送達方法と適合した溶液に溶解させることが好ましい。

裸のＡＯＮは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて大半の細胞に容易に取り込まれ、通常、本発明によるＡＯＮの等張（生理的食塩水）溶液への溶解で皮膚（真皮および表皮）細胞などの標的細胞に達するのに十分であろう。あるいは、本発明の裸のＡＯＮは、薬学的に許容される賦形剤、添加物、安定剤、溶媒、着色料などを使用して製剤化されてもよい。それに加えて、またはそれの代わりに、裸のＡＯＮは、下で言及される任意のトランスフェクション補助剤（transfection aid）を用いて製剤化されてもよい。

皮膚（真皮および表皮）細胞は、等張（生理的食塩水）溶液などの水溶液にプラスミドを与えることによってアンチセンスオリゴヌクレオチド発現のためのプラスミドを与えられてもよい。あるいは、既知のトランスフェクション剤（transfection agent）を使用したトランスフェクションによってプラスミドが与えられてもよい。

静脈内、皮下、筋肉内、くも膜下腔内および／または心室内投与に対して、溶液は等張（生理的食塩水）溶液であることが好ましい。本発明において特に好ましいのは、本明細書中で定義される各成分の細胞へおよび／または細胞、好ましくは、皮膚（真皮および表皮）細胞中への送達を助けることになる賦形剤またはトランスフェクション剤の使用である。本明細書中で定義される複合体を形成した各成分、またはベシクルもしくはリポソームに閉じ込められた各成分を細胞膜を通して送達する複合体、ナノ粒子、ミセル、ベシクルおよび／またはリポソームを形成することができる賦形剤またはトランスフェクション剤が好ましい。こうした賦形剤の多くは、当該技術分野において知られている。適した賦形剤またはトランスフェクション剤は、本明細書中で定義される各成分を細胞、好ましくは、皮膚（真皮または表皮）細胞に送達することができる粒子に自己集合することができるポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ＥｘＧｅｎ５００（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）もしくはその誘導体、またはポリプロピレンイミンもしくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）および誘導体を含む類似のカチオン性ポリマー、合成の両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ−１８）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、ＤＯＴＡＰおよび／またはウイルスカプシドタンパク質を含む。そのような賦形剤は、皮膚（真皮および表皮）細胞を含む多種多様の培養細胞にアンチセンス核酸などのオリゴヌクレオチドを効率的に送達することが示された。それらの高いトランスフェクション潜在性は、全細胞生存に関して低から中程度の許容できる毒性と組み合わされる。構造変更の容易さが、さらなる変更ならびにそれらのさらなる（ｉｎ ｖｉｖｏ）核酸運搬特性および毒性の分析を可能にするために使用されてもよい。

Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎは、リポソームトランスフェクション剤の例である。これは、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）（メチル硫酸塩であるＤＯＴＡＰと比較）および中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の２つの脂質構成成分からなる。中性構成成分が細胞内放出を仲介する。送達システムの別のグループは高分子ナノ粒子である。

本明細書中で定義される各成分、好ましくは、オリゴヌクレオチドを、細胞膜を越えて細胞中に送達することができるカチオン性ナノ粒子を製剤化するために、ＤＮＡトランスフェクション試薬として周知のジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランのようなポリカチオンが、シアノアクリル酸ブチル（ＰＢＣＡ）およびシアノアクリル酸ヘキシル（ＰＨＣＡ）と組み合わされてもよい。

こうした一般的なナノ粒子材料に加えて、カチオン性ペプチドプロタミンが、コロイドを用いてオリゴヌクレオチドを製剤化するための代替的なアプローチを提供する。このコロイドナノ粒子系は、いわゆる、プロティクル（proticle）を形成することができ、これは、単純な自己集合プロセスによって作製することができ、オリゴヌクレオチドをパッケージングし、オリゴヌクレオチドの細胞内放出を仲介することができる。当業者は、エクソンスキッピング分子をＣＯＬ７Ａ１遺伝子の突然変異したエクソン８０と関連した疾患または状態の予防、処置または遅延のために送達すべく本発明に使用するためのエクソンスキッピング分子をパッケージングおよび送達するために任意の上記またはその他の商業的に入手可能な代替的賦形剤および送達システムを選択し、適合させることができる。

本発明によるエクソンスキッピング分子は、細胞（とりわけ、皮膚（真皮）細胞）、細胞質および／またはその核への取り込みを促進するよう設計された標的リガンドと特異的に共有結合的または非共有結合的に連結されてもよいであろう。そのようなリガンドは、（ｉ）細胞取り込みを促進する、細胞、組織もしくは臓器に特異的なエレメントを認識する化合物（それに限定されるものではないがペプチド（様）構造を含む）ならびに／あるいは（ｉｉ）細胞への取り込みおよび／またはベシクル、例えば、エンドソームもしくはリソソームからのオリゴヌクレオチドの細胞内放出を促進することができる化学的化合物を含んでもよいであろう。

したがって、好ましい実施形態において、本発明によるエクソンスキッピング分子は、組成物または薬剤、あるいは少なくとも、細胞への送達および／もしくはその送達デバイスのためならびに／または細胞内送達を向上させるための賦形剤および／または標的化リガンドとともに提供される組成物として製剤化される。

組成物が本明細書で後に定義される補助的な化合物などの付加的な成分を含む場合、組成物の各成分は、１つの単一の組合せまたは組成物または調製物として製剤化されてもよい。それらの素性に応じて、当業者は、どの製剤のタイプが本明細書中で定義される各成分に最も適切であるかがわかるであろう。一実施形態によると、本発明は、本発明によるエクソンスキッピング分子、さらに本明細書で後に定義される補助的な化合物を含むキット・オブ・パーツの形態である組成物または調製物を提供する。

必要とされる場合、本発明によるエクソンスキッピング分子または本発明によるエクソンスキッピング分子を発現させるベクター、好ましくは、ウイルスベクターは、薬学的に許容される担体を添加することによって薬学的に活性な混合物に組み込まれてもよい。

したがって、本発明はまた、裸のＡＯＮなどの本発明によるエクソンスキッピング分子、または本発明によるウイルスベクターおよび薬学的に許容される賦形剤を含む組成物、好ましくは、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、１つの本発明によるエクソンスキッピング分子を含んでもよいが、複数の異なる本発明によるエクソンスキッピング分子を含んでもよい。そのような医薬組成物は、担体、賦形剤、安定剤、トランスフェクション剤、ゲル化剤、緩衝液、増量剤、保存料、補助薬、可溶化剤および／または希釈剤を含む任意の薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。そのような薬学的に許容される成分は、例えば、Remington, 2000において見つけることができる。前記組成物のそれぞれの特徴は、本明細書の前で定義した。

本発明による複数の異なるエクソンスキッピング分子が使用される場合、本明細書において定義される濃度または用量は、使用されたすべてのオリゴヌクレオチドの合計濃度もしくは用量または使用されたか、もしくは添加されたそれぞれのエクソンスキッピング分子の濃度もしくは用量を指してもよい。したがって、一実施形態において、使用される本発明によるエクソンスキッピング分子のそれぞれの量または合計量が、０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．００１から５０ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは、０．０１から２０ｍｇ／ｋｇの間の範囲の量で投与される組成物が提供される。

本発明による好ましいエクソンスキッピング分子は、個体のＤＥＢ、さらに一般には、突然変異したＣＯＬ７Ａ１エクソン８０関連疾患または状態の処置のためのものである。本発明のすべての実施形態において、「処置」という用語は、疾患または状態の予防および／または遅延を含むものと理解される。本発明によるエクソンスキッピング分子を使用して処置することができる個体は、既にＤＥＢまたはＣＯＬ７Ａ１エクソン８０関連疾患または状態を有すると診断されていてもよい。あるいは、本発明によるエクソンスキッピング分子を使用して処置することができる個体は、まだ診断されていなくてもよいが、固体の遺伝的背景を考慮にいれると将来的にＤＥＢまたはＣＯＬ７Ａ１エクソン８０関連疾患または状態を発症するリスクが高い個体であってもよい。好ましい個体はヒトである。好ましい実施形態において、突然変異したＣＯＬ７Ａ１エクソン８０関連疾患または状態は、ジストロフィー型表皮水疱症（ＤＥＢ）である。

本発明は、例えば、（上記のとおり）個体のＤＥＢ、またはさらに一般には、突然変異したＣＯＬ７Ａ１エクソン８０関連疾患もしくは状態を処置する際に使用するための医薬として使用するための、ＡＯＮなどの本発明によるエクソンスキッピング分子、または本発明によるＡＯＮをコードするウイルスベクターなどのベクター、または本発明によるＡＯＮ、もしくはＡＯＮをコードするベクターを含む組成物をさらに提供する。

本発明は、（上記のとおり）個体のＤＥＢ、もしくはさらに一般には、突然変異したＣＯＬ７Ａ１エクソン８０関連疾患もしくは状態を処置するための薬剤の製造へのＡＯＮなどの本発明によるエクソンスキッピング分子、または本発明によるＡＯＮをコードするウイルスベクターなどのベクター、または本発明によるＡＯＮ、もしくはＡＯＮをコードするベクターを含む組成物の使用をさらに提供する。

本発明は、ゲノムにおいてＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン８０にＤＥＢを含む疾患または障害の原因となる突然変異がある哺乳動物（好ましくは、ヒト）を処置するための方法であって、哺乳動物（ヒト）に本発明のＡＯＮ、（ウイルス）ベクター、または医薬組成物を投与することを含む方法をさらに提供する。これらの患者は、ＤＥＢもしくは関連障害を患っていてもよく、または発症するリスクがあってもよい。関連障害、疾患または状態は、例えば、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン８０における突然変異が原因となるか、またはそれと関連するＶＩＩ型コラーゲン欠損または個体の皮膚もしくはその他の臓器の異常の結果として生じる可能性のある皮膚がん（黒色腫）、またはその他の癌腫も包含する。

本発明の別の実施形態は、ゲノムにおいてＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン８０に突然変異がある哺乳動物（好ましくは、ヒト）を処置するための医薬として使用するための本発明によるＡＯＮ、ＡＯＮをコードするウイルスベクター、およびＡＯＮを含む医薬組成物である。

本発明によるエクソンスキッピング分子は、飲み込むこと、注射すること、吸入、注入、噴霧することによる経口、眼内、肺内、鼻腔内、筋肉内、皮下、皮内、直腸へ投与により（水）溶液、懸濁液、（水中油型）エマルジョン、軟膏、トローチ、丸剤などの形態で全身的に、局部的に、局所的に患者に投与されてもよい。

本発明によるＡＯＮの好ましい投与法は、ＡＯＮを放出することができるＡＯＮコーティング付き被覆材の装具によるものである。特に有益なのは、国際公開第２０１４／１５００７４号パンフレットに開示されているもののように多層（交互積層、ＬｂＬ（Ｌａｙｅｒ−ｂｙ−Ｌａｙｅｒ））コーティングされた被覆材である。ＭＩＴの名称で出願された国際特許出願は、前記ｓｉＲＮＡを含む多層フィルムでコーティングされた接着性の被覆材からの、創傷治癒を促進するｓｉＲＮＡの長期のかつ有効な放出を開示している。本発明によるＡＯＮと組み合わせて好適に使用することができる被覆材は、Ｔｅｇａｄｅｒｍ（登録商標）である。本発明によるＡＯＮと組み合わせてさらに使用することができる、ｓｉＲＮＡの送達に好適な多層コーティングは、交互積層構造を含むＬａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）を含む。核酸治療薬を放出することができるＴｅｇａｄｅｒｍ（登録商標）とは別の被覆材を使用することもできる。非接着性の被覆材も、それらは患者の痛みを少なくする可能性が高いので、被覆材が皮膚または創傷部位と密に接触している限り、使用することができる。被覆材と組み合わせての本発明によるＡＯＮの送達のためのＡＯＮ含有ＬＢＬフィルムは、国際公開第２０１４／１５００７４号パンフレットに記載されている。

投薬は、投与経路および患者の必要性に応じて毎日、週に１回、月に１回、年に４回、年に１回であってもよい。

早くに疾患が発症するため、ＤＥＢを含むＣＯＬ７Ａ１遺伝子の突然変異したエクソン８０が原因となるか、またはそれと関連した疾患、障害もしくは状態を有するか、またはそれを発症するリスクのある患者は、疾患の症状を緩和する、発症を遅らせる、止める、または逆行させるなどのために、症状の発症前または後に、子宮内で、出生直後に、１、２、３、６か月齢から、１歳から、３歳から、５歳から処置されてもよい。

本発明による使用または方法における処置は、少なくとも１週間、少なくとも１カ月、少なくとも数カ月、少なくとも１年、少なくとも２、３、４、５、６年または長期的にさらに患者の一生涯の間である。本発明による使用のための本明細書中で定義されるとおりのエクソンスキッピング分子またはエクソンスキッピングオリゴヌクレオチドまたはその等価物のそれぞれは、突然変異したＣＯＬ７Ａ１エクソン８０関連障害、疾患または状態に既に冒されているか、またはそれを発症するリスクがある個体の細胞、組織および／または臓器へのｉｎ ｖｉｖｏにおける直接投与に適していてもよく、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて直接投与されてもよい。本発明のＡＯＮ、組成物、化合物または補助的な化合物の投与の頻度は、患者の年齢、エクソンスキッピング分子の性質（例えば、裸の（gymnotic）ＡＯＮまたはＡＡＶベクターもしくはレンチウイルスベクターにより発現させるＡＯＮなどの、ベクターにより運ばれる（vectored）ＡＯＮ）、用量、および前記分子の配合などのいくつかのパラメータにより左右される可能性もある。

本発明によるエクソンスキッピング分子、好ましくは、オリゴヌクレオチドの用量範囲は、好ましくは、厳しい手順要件が存在する臨床試験の用量漸増試験（ｉｎ ｖｉｖｏにおける使用）に基づいて設計される。本明細書中で定義されるとおりのオリゴヌクレオチドは、０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．０１から２０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で使用されてもよい。用量および処置計画は、以下に限定されるものではないが、投与経路（例えば、全身的対局所的）、オリゴが裸のＡＯＮまたはベクターにより運ばれるＡＯＮとして投与されるのかどうか、投与計画、患者の年齢および体重などを含む多くの要素により大きく変化することもある。

好ましい実施形態において、本発明による分子のための送達媒体として、本明細書の前に記載されているウイルスベクター、好ましくは、ＡＡＶベクターは、１回の注射当たり１×１０^９〜１×１０^１７ウイルス粒子、より好ましくは、１回の注射あたり１×１０^１０〜１×１０^１４ウイルス粒子、最も好ましくは１×１０^１０〜１×１０^１２ウイルス粒子の範囲の用量で投与される。

処置の詳細は、オリゴヌクレオチド（複数可）の配列および化学的性質、投与経路、配合、用量、投与計画、様式（ウイルスベクターまたは裸のオリゴヌクレオチド）、患者の年齢および体重、疾患のステージなどのような要素に従い、それらに応じて確立される必要があり、これは、さらなる非臨床試験および臨床試験を必要とする場合もあることは、本発明が属する技術分野の当業者には明らかになろう。

本発明は、細胞においてＣＯＬ７Ａ１エクソン８０が含まれるのを妨げるか、または少なくとも低減することための方法であって、細胞、好ましくは、皮膚（真皮）細胞を裸のＡＯＮなどの本発明によるエクソンスキッピング分子または本発明によるＡＯＮをコードする（ウイルス）ベクターまたは本発明による組成物と接触させることを含む方法をさらに提供する。この態様の特徴は、好ましくは、本明細書の前で定義されたものである。

別に指示がある場合を除いて、本明細書に記載されている各実施形態は、本明細書に記載されている別の実施形態と組み合わされてもよい。

本発明は、哺乳動物細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン８０が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、（ａ）エクソン８０の部分と相補的なヌクレオチド配列を含むことおよび（ｂ）２４ヌクレオチド長未満であることを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

別の態様では、本発明は、哺乳動物細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン８０が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、エクソン８０の３’部分および下流イントロンの５’部分と相補的なヌクレオチド配列を含むことを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号２１と相補的なヌクレオチド配列を含む。例えば、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号２２（５’−ＵＣＡＣＣＡＣＵ−３’）、配列番号２３（５’−ＡＣＣＡＣＵＧＧ−３’）、および／または配列番号２４（５’−ＡＣＵＣＡＣＣＡ−３’）を含む。

別の態様では、本発明は、哺乳動物細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン８０が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号２２（５’−ＵＣＡＣＣＡＣＵ−３’）、配列番号２３（５’−ＡＣＣＡＣＵＧＧ−３’）、および／または配列番号２４（５’−ＡＣＵＣＡＣＣＡ−３’）を含むことを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

好ましくは、本発明によるオリゴヌクレオチドは、２４ヌクレオチド未満であり、特定の実施形態では、好ましくは、長さが、２０から２３ヌクレオチドの間である。したがって、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド長である。

好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、ＡＯＮ８０．１、ＡＯＮ８０．２、ＡＯＮ８０．３、ＡＯＮ８０．５、ＡＯＮ８０．５．１、ＡＯＮ８０．５．２、ＡＯＮ８０．５．３、ＡＯＮ８０．５．４、ＡＯＮ８０．５．５、ＡＯＮ８０．５．７およびＡＯＮ８０．５．８からなる群から選択される。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、
（ｉ） ＡＯＮ８０．２およびＡＯＮ８０．５；
（ｉｉ） ＡＯＮ８０．５．１、ＡＯＮ８０．５．２、ＡＯＮ８０．５．３、ＡＯＮ８０．５．４、およびＡＯＮ８０．５．５；または
（ｉｉｉ） ＡＯＮ８０．５．１、ＡＯＮ８０．５．２、ＡＯＮ８０．５．３、ＡＯＮ８０．５．４、ＡＯＮ８０．５．５、ＡＯＮ８０．５．７およびＡＯＮ８０．５．８
からなる群から選択される。

さらに別の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＡＯＮ８０．４、ＡＯＮ８０．５、ＡＯＮ８０．５．１、ＡＯＮ８０．５．２、ＡＯＮ８０．５．３、ＡＯＮ８０．５．４、ＡＯＮ８０．５．５、ＡＯＮ８０．５．７およびＡＯＮ８０．５．８からなる群から選択される。

本発明は、哺乳動物細胞においてＲＮＡ転写産物からのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン８０が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、エクソン８０の上流のイントロンにハイブリダイズしないことを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにも関する。好ましくは、前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドの配列は、ＡＯＮ８０．３、ＡＯＮ８０．４、ＡＯＮ８０．５、ＡＯＮ８０．５．１、ＡＯＮ８０．５．２、ＡＯＮ８０．５．３、ＡＯＮ８０．５．４、ＡＯＮ８０．５．５、ＡＯＮ８０．５．７、ＡＯＮ８０．５．８およびＡＯＮ８０．１３からなる群のオリゴヌクレオチドの配列を含む。

別の実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞においてＲＮＡ転写産物からのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン８０が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、エクソン８０と相補的であるが、その上流または下流のイントロンと相補的でないことを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。さらに別の実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン８０が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、ここで、オリゴヌクレオチドは、エクソン８０と相補性の領域を含み、その相補性の領域は、エクソン８０に隣接するいずれのイントロン内にも及ばない。そのような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＡＯＮ８０．３またはＡＯＮ８０．１３であることが好ましい。

本発明は、哺乳動物細胞においてＲＮＡ転写産物からのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン８０がｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、最大２０ヌクレオチド長であるエクソン８０と相補性の領域を含むことを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにも関する。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、ＡＯＮ８０．１、ＡＯＮ８０．２、ＡＯＮ８０．３、ＡＯＮ８０．４、ＡＯＮ８０．５、ＡＯＮ８０．５．１、ＡＯＮ８０．５．２、ＡＯＮ８０．５．３、ＡＯＮ８０．５．４、ＡＯＮ８０．５．５、ＡＯＮ８０．５．７およびＡＯＮ８０．５．８からなる群からの一連のオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、エクソン８０と相補性の前記領域は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７ヌクレオチドなどの最大９から１７ヌクレオチドの間である。より好ましくは、オリゴヌクレオチドがエクソン８０の直接下流のイントロンと相補性の領域を有するとき、エクソン８０と相補的な領域は、９、１０、１１、１２、１３または１４ヌクレオチドなどの９から１４ヌクレオチドである。エクソン８０と相補的な部分が最大１２ヌクレオチドであるときには、オリゴヌクレオチドは、ＡＯＮ８０．１、ＡＯＮ８０．４、ＡＯＮ８０．５、ＡＯＮ８０．５．３、ＡＯＮ８０．５．４、ＡＯＮ８０．５．５、ＡＯＮ８０．５．７およびＡＯＮ８０．５．８からなる群から選択されることが好ましい。別の好ましい態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、（ａ）最大２０ヌクレオチド長である、エクソン８０と相補性の領域および（ｂ）エクソン８０の上流または下流のイントロンにおけるＲＮＡ転写産物と相補的な領域を含む。さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン８０の下流のイントロンにおけるＲＮＡ転写産物と相補的な部分を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１８の最も３’の１０ヌクレオチド（すなわち、配列番号１８のヌクレオチド２７〜３６）からなるエクソン８０の一部と相補的な部分を含む。さらに別の実施形態では、エクソン８０に相補性の部分は、配列番号１８の最も３’のｎヌクレオチドからなり、ここで、ｎは、９から２０の間である；例えば、配列番号１８の最も３’の１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０または９ヌクレオチドからなる。より好ましい実施形態では、エクソン８０の部分は、エクソン８０の最も３’の１２ヌクレオチド（すなわち、配列番号１８のヌクレオチド２５〜３６）からなる。オリゴヌクレオチドがエクソン８０の部分と相補的なときには、その配列は、２４ヌクレオチド以下の長さを有することが好ましい。

本発明によるすべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドに関して、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドがオリゴリボヌクレオチドであり、より好ましくは、ヌクレオシド間結合が、化学的に修飾されており、好ましくは、ホスホロチオエート結合である。さらに別の好ましい態様では、オリゴヌクレオチドの糖部分は、低級２’−Ｏ−アルキル、好ましくは２’−Ｏ−メチル置換糖部分である。

本発明は、（ｉ）配列番号４〜１７および２５〜３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号４〜１５および２５〜３２からなる群から選択されるＲＮＡヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号４〜１５および２５〜３２からなる群から選択され、その中のいずれのＵもＴで置換されているＤＮＡヌクレオチド配列を含むか、またはからなるオリゴヌクレオチドにも関する。

本発明は、担体、賦形剤、安定剤、トランスフェクション剤、希釈剤、ゲル化剤または緩衝液のうちの１つまたは複数を任意選択で含む、本発明によるオリゴヌクレオチドを含む組成物にも関する。好ましくは前記組成物は、ヒトの治療に使用するための医薬組成物であり、より好ましくは、ジストロフィー型表皮水疱症（ＤＥＢ）の処置に使用するための、さらにより好ましくは、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン８０における突然変異によって引き起こされるＤＥＢを患っているヒト対象の処置に使用するための医薬組成物である。別の実施形態では、本発明は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子内に突然変異したエクソン８０が含まれることによって引き起こされる疾患を患うヒト対象の処置に使用するための本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞においてＲＮＡ転写産物からのスプライシングによって哺乳動物、好ましくはヒトのＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン８０が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減するための方法であって、細胞に、組織に、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏで、または、そのような細胞を含む、ヒトを含む、生きている動物に、請求項１から２７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項２９もしくは３０に記載の組成物を、そのような細胞によるそのようなオリゴヌクレオチドの取り込みを促す条件下で、提供することと、スプライシングが起こるのを可能にすることとを含む方法にも関する。

本発明によるＡＯＮなどのエクソンスキッピング分子、またはそのようなＡＯＮをコードする（ウイルス）ベクターの、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子が哺乳動物（好ましくは、ヒト）の細胞において発現するときに、突然変異したＣＯＬ７Ａ１エクソン８０が含まれるのを妨げるか、または少なくとも低減する能力、および５’スプライシングアクセプターの選択に影響を及ぼす領域において生理的条件下で哺乳動物（ヒト）のＣＯＬ７Ａ１ ｐｒｅ−ｍＲＮＡと結合して、それによりＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに突然変異したエクソン８０が含まれるのを低減する能力は、好都合にも本明細書の実験のセクションに開示されているアッセイを使用して評価することができる。特に、本エクソンスキッピング分子は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン８０（必ずしも突然変異している訳ではない）を含む細胞とインキュベートして、エクソン８０を含むｍＲＮＡの細胞による産生を低減するその能力を例えば、実験のセクションおよび実施例において本明細書に記載されるとおり（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ装置を使用して定量することができる）ＲＴ−ＰＣＲによって評価することができる。

本明細書の実験のセクションおよび実施例においてＲＮＡレベルで確認できるとおり、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン８０を標的とする本発明によるさまざまなＡＯＮの添加は、実際に、エクソン８０のないｍＲＮＡをもたらし、これが、短いが機能的なＶＩＩ型コラーゲンタンパク質の産生につながる。

（皮膚細胞由来であってもよい）線維芽細胞では、ＶＩＩ型コラーゲンが豊富に発現され。ゆえに、ＤＥＢ患者からの培養線維芽細胞へのＡＯＮの添加は、ウエスタンブロットにおいて検出可能な短縮されているが機能的なＶＩＩ型コラーゲンタンパク質の量を増加させることになることが予想され、したがって、ＡＯＮに基づく療法が、ＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡのスプライシングを再指示するだけでなくＶＩＩ型コラーゲンの機能性も回復させることになることを実証することになる。

「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」およびヒポキサンチン（イノシンのヌクレオベース）という用語は、それ自体ヌクレオベースを指す。

アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジンおよびイノシンという用語は、（デオキシ）リボシル糖と連結されたヌクレオベースを指す。

「ヌクレオシド」という用語は、（デオキシ）リボシル糖と連結されたヌクレオベースを指す。

本文書において、およびその特許請求の範囲において、「含むこと（to comprise）」という動詞およびその活用型は、その語に引き続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目も除外しないことを意味するためにその非限定的な意味で使用される。さらに、文脈が明らかに１つおよび１つだけのエレメントが存在することを必要としない限り、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素の言及は、１つ超の要素が存在する可能性を排除するものではない。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、したがって、通常は「少なくとも１つ」を意味する。

「含む（include）」という語ならびにその時制および活用型のすべては、「含むが、以下に限定されるものではない」と解釈されるべきである。

「エクソンスキッピング分子」という語は、裸のＡＯＮ、および適合した細胞でＡＯＮを発現させることができるウイルスベクターを含むベクターにより運ばれるＡＯＮを含むことが意図される。

数値（例えば、約１０）と関連して使用される場合、「約」または「およそ」という語は、好ましくは、値が、所与の値（１０の）プラスまたはマイナス５％の値であってもよいことを意味する。

本明細書で提供した配列情報は、エラーを伴って特定された塩基を含める必要があるほど狭く解釈されるべきではない。当業者は、エラーを伴って特定されたそのような塩基を特定することができ、そのようなエラーの正し方を知っている。配列のエラーの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む配列番号１に存在する配列の発現によって得られるポリペプチドの配列が優先されるものとする。

エクソン８０のｍＲＮＡ分析
ＣＯＬ７Ａ１のｍＲＮＡにあるエクソン８０のｍＲＮＡの存在を検出するために、ＨｅＬａ細胞および初代ヒト線維芽細胞（ＨＰＦ）の両方の細胞の抽出全ＲＮＡを使用した。（ａ）ＨｅＬａについては１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、または（ｂ）ＨＰＦ細胞については２０％ＦＢＳおよび１％ピルビン酸ナトリウムを加えたＤＭＥＭ ＡＱＥにおいて細胞の培養を行った。すべての細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で増殖させた。ＡＯＮのエクソンスキッピング効率を求めるために、細胞を６０，０００細胞／ウェル（ＨｅＬａ）で１２ウェルプレートに、または１５０，０００細胞／ウェル（ＬＦＢ１）で６ウェルプレートに播いた。細胞を増殖させた２４時間後、細胞に１００ｎｍのＡＯＮ−ｍａｘＰｅｉ複合体をトランスフェクションした。ＲｅｌｉａＰｒｅｐ（商標）ＲＮＡ Ｃｅｌｌ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＲＮＡ単離を行った。次いで、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｖｅｒｓｏキットを使用してｃＤＮＡを作製した。エクソン７７に位置するＦＷプライマー（５’−ＣＡＡＧＧＴＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧ−３’；配列番号１６）およびＲＶプライマーを用いてエクソン８０に対するＰＣＲを行った。ＲＶプライマーは、エクソン８４内に位置する配列５’−ＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＡＧＧ−３’（配列番号１７）を有するＲＶプライマー、またはエクソン８２／８３の境界に位置する配列５’−ＧＡＡＧＧＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡ−３’（配列番号３３）を有するＲＶプライマーのいずれかである。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡ１０００チップを使用したＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて視覚化し、産物の長さの分析のためにソフトウェアＥｘｐｅｒｔ ２１００を使用した。最初のオリゴヌクレオチド設計からは、ＡＯＮ８０．１からＡＯＮ８０．１２までの１２のオリゴヌクレオチドが得られ、表１は、これらのＡＯＮのそれぞれについてヒト初代線維芽細胞（ＨＰＦ）およびＨｅＬａ細胞におけるエクソン８０の半定量的なスキッピング効率を示す。ＡＯＮ８０．５の２１ｍｅｒに基づいてさらに設計した研究からは、ＡＯＮ８０．５．１からＡＯＮ８０．５．５と呼ばれる（すべて２１ｍｅｒの）５つの誘導体が得られた。さらに、３６ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ８０．１３）を全エクソン８０にわたって設計した。これらのさらなるＡＯＮについてのデータは、本発明による好ましいＡＯＮ（ＡＯＮ８０．１〜ＡＯＮ８０．５、およびＡＯＮ８０．５．ｎ系列、ならびにＡＯＮ８０．１３）のヌクレオチド配列および配列番号と共に、表１にも含まれている。２つの２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ８０．５．７およびＡＯＮ８０．５．８）を３回の実験において試験した。結果を表２に示しており、比較可能な結果が示されている。

図２〜５は、表１および２のＡＯＮについてのラボオンチップ結果を示す。ＡＯＮ８０．１からＡＯＮ８０．５と呼ばれる本発明によるＡＯＮは、良好な効率を有し、ＡＯＮ８０．２、ＡＯＮ８０．４およびＡＯＮ８０．５は、より良好に機能する。さらに設計した研究から、ＡＯＮ８０．５．１、ＡＯＮ８０．５．２、ＡＯＮ８０．５．７、ＡＯＮ８０．５．８およびＡＯＮ８０．１３は、試験したＡＯＮのうち最高のスプライシング効率を有するようである。本発明による最も好ましいＡＯＮは、ＡＯＮ８０．５、ＡＯＮ８０．５．１、ＡＯＮ８０．５．２、ＡＯＮ８０．５．７およびＡＯＮ８０．５．８である。

形成されたすべての産物の正確な配列を評価するために、配列解析を行った。ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析後に可視の余分な産物は、ｍＲＮＡ内にイントロン８２を含んでいた（シークエンス解析で観察された）。しかし、このイントロンがタンパク質に翻訳されると、分解されることになる可能性がきわめて高いトランケート型コラーゲンタンパク質をもたらす停止コドンが含まれるはずである。

ＡＯＮの免疫原性効果を評価するために、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるその後の実験手順を行うことができる。これらのＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞は、マウスのＲＡＷ ２６４．７マクロファージ由来であり、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１により誘導可能な、組み込まれた分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーターコンストラクトを有する。すべてのＴＬＲ（ＴＬＲ５を除く）、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡまたはＤＥＣＴＩＮ−１のアゴニストの存在は、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１の活性化ならびにその後のＳＥＡＰの産生を導くシグナル伝達経路を誘導する。ＳＥＡＰのレベルは、検出することができ、したがって、免疫原性活性化を示す。図６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける刺激の２４時間後のそのような試験の結果を示す。陽性対照ＣｐＧ−ＤＮＡ、ＬＰＳおよびＲ８４８は、ＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−１を活性化した。対照的に、試験したＡＯＮでは、ＡＯＮ８０．５．１がＳＥＡＰにおいて１μＭの最終濃度でＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−１の活性化を示唆する可能性がある少しの増加を誘導したことを除き、生理的食塩水処理したＲＡＷ−ｂｌｕｅ細胞と比較してＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−１の活性化は認められなかった。検出された値を、ＳＥＡＰ（ＯＤ）測定値についての多重比較のためにＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ検定を用いて一元配置ＡＮＯＶＡを使用して生理的食塩水と比較した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける刺激の２４時間の間のＡＯＮの免疫毒性も、ＲＡＷ−Ｂｌｕｅ細胞を使用して試験し、レゾルフィンレベルにおける上昇が観察された（これは、細胞数の増加をもたらす増殖の増加によって、かつ／またはＰＰＲ活性化による細胞代謝の促進によって説明することができた）。細胞生存率に対する影響は、いずれのＡＯＮでの刺激後にも観察されなかった（図７）。陽性対照のＣｐＧ−ＤＮＡのみが、合成されたレゾルフィンのレベルを著しく上昇させた（しかし、ＬＰＳおよびＲ８４８では効果がなかったのは古いバッチの使用が原因の可能性があった）。検出された値を、レゾルフィン測定値についての多重比較のためにＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ検定を用いて一元配置ＡＮＯＶＡを使用して生理的食塩水と比較した。

エクソン８０のないＶＩＩ型コラーゲンの機能性、例えば、タンパク質安定性およびアンカーフィブリル形成は、以下の文献に記載されているいくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法を使用して対処することができる。
１．ウエスタンブロッティングを使用したα１−コラーゲン鎖のサイズおよび正確な構築の両方のタンパク質分析（Titeux et al 2010）。留意すべきことには、スキッピングされたエクソンのタンパク質の小さなサイズおよび野生型タンパク質の大きなサイズによる、タンパク質サイズの明らかな差は見つからない可能性がある。
２．非還元条件でのウエスタンブロッティングを使用することによるＶＩＩ型コラーゲンホモ三量体の熱安定性分析。野生型のＶＩＩ型コラーゲンは、３つのα１−コラーゲン鎖から構成され、４１℃のＴｍを有する（Mecklenbeck et al. 2002）。
３．コロイド金またはスクラッチＲａｄｉｕｓ（商標） ２４−Ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを使用した細胞移動分析。エクソン８０を含まないトランケート型タンパク質に対して、野生型のＶＩＩ型コラーゲンを発現する線維芽細胞および／または角化細胞の運動性を比較する（Chen et al. 2002）。または、処理していないものに対して、処理した変異体のヒト線維芽細胞培養培地の存在下における角化細胞の運動性を比較する。
４．さまざまな細胞外基質構成要素、例えば、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン−３３２、ラミニン−１またはフィブロネクチンとの細胞接着を評価することができる（Chen et al. 2002）。

本発明の発明者らは、エクソン８０が哺乳動物（好ましくは、ヒト）のＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または少なくとも低減することに関して最も良く機能することを示すＡＯＮがＶＩＩ型コラーゲンの機能性に関して十分な結果をもたらすことになると仮定し、これは、先行技術の上記の方法を使用して容易に評価することができる。

当然のことながら、本発明は、例の目的としてのみ上で記載されており、本発明の範囲および趣旨内にありながら改変がなされてもよい。

参考文献表
Chen et al. Nat Genet. 2002, Dec; 32(4): 670-5. Restoration of type VII collagen expression and function in dystrophic epidermolysis bullosa.
Chiorini JA, Kim F, Yang L and Koting RM. J. of Virology 1999 Feb;73(2):1309-19. Cloning and characterization of adeno-associated virus type 5.
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Egholm M et al. Nature 1993. Oct 7; 365(6446): 566-8.PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules.
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Titeux M. et al. Mol. Ther. 2010. Aug;18(8):1509-18SIN retroviral vectors expressing COL7A1 under human promoters for ex vivo gene therapy of recessive dystrophic epidermolysis bullosa.

Claims (16)

1. 細胞においてｐｒｅ−ｍＲＮＡからのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン８０が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、
   − 前記ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン８０の少なくとも一部と相補的であり、かつエクソン８０の上流イントロンと相補的でないヌクレオチド配列、または
   − エクソン８０の少なくとも一部と相補的であり、かつ２４ヌクレオチド長未満である
   ヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＡＯＮ。
2. エクソン８０と相補性の領域を含み、前記相補性の領域が、最大２０ヌクレオチド長、好ましくは１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７ヌクレオチドである、請求項１に記載のＡＯＮ。
3. エクソン８０の３’部分および下流イントロンの５’部分と相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載のＡＯＮ。
4. ヌクレオチド配列５’−ＵＣＡＣＣＡＣＵ−３’、５’−ＡＣＣＡＣＵＧＧ−３’、または５’−ＡＣＵＣＡＣＣＡ−３’を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
5. 配列番号７、８、２５、２６、２８、３１および３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載のＡＯＮ。
6. ２４ヌクレオチド長未満であり、好ましくは２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
7. 配列番号４または５のヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載のＡＯＮ。
8. 配列番号６のヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載のＡＯＮ。
9. 配列番号３０のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＡＯＮ。
10. オリゴリボヌクレオチドである、請求項１から９のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
11. ヌクレオシド間結合が、化学的に修飾されており、好ましくは、ホスホロチオエート結合である、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
12. 前記ＡＯＮの糖部分が低級２’−Ｏ−アルキル、好ましくは２’−Ｏ−メチル置換糖部分である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
13. （ｉ）配列番号４〜１５および２５〜３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号４〜１５および２５〜３２からなる群から選択されるＲＮＡヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号４〜１５および２５〜３２からなる群から選択され、その中のいずれのＵもＴで置換されているＤＮＡヌクレオチド配列を含むか、またはからなるオリゴヌクレオチド。
14. 請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと、担体、賦形剤、安定剤、トランスフェクション剤、希釈剤、ゲル化剤または緩衝液のうちの１つまたは複数とを含む組成物。
15. ヒトの治療に使用するための医薬組成物である、請求項１４に記載の組成物。
16. ヒト、細胞においてＲＮＡ転写産物からのスプライシングによってヒトＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡが生成されるときに、エクソン８０が前記ｍＲＮＡに含まれるのを妨げるか、または低減するための方法であって、細胞に、組織に、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏで、または、そのような細胞を含む、生きているヒトに、請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物を、そのような細胞によるそのようなオリゴヌクレオチドの取り込みを促す条件下で、提供するステップと、スプライシングが起こるのを可能にするステップとを含む方法。