CN107667174A - 治疗营养不良型大疱性表皮松解症的反义寡核苷酸 - Google Patents

治疗营养不良型大疱性表皮松解症的反义寡核苷酸 Download PDF

Info

Publication number
CN107667174A
CN107667174A CN201680029306.7A CN201680029306A CN107667174A CN 107667174 A CN107667174 A CN 107667174A CN 201680029306 A CN201680029306 A CN 201680029306A CN 107667174 A CN107667174 A CN 107667174A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aon
extron
oligonucleotides
cell
nucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201680029306.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107667174B (zh
Inventor
E·M·海斯马
M·波特曼
G·J·普拉特恩伯格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wings Therapeutics Inc
Original Assignee
ProQR Therapeutics II BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1508733.1A external-priority patent/GB201508733D0/en
Priority claimed from GBGB1516505.3A external-priority patent/GB201516505D0/en
Application filed by ProQR Therapeutics II BV filed Critical ProQR Therapeutics II BV
Publication of CN107667174A publication Critical patent/CN107667174A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107667174B publication Critical patent/CN107667174B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Abstract

一种能够防止或减少外显子80包含到人COL7A1 mRNA中的反义寡核苷酸，以及用于防止或减少外显子80包含到人COLA1 mRNA中的方法。

Description

治疗营养不良型大疱性表皮松解症的反义寡核苷酸
技术领域
本发明涉及适用于治疗人类疾病的寡核苷酸。更具体地，本发明涉及适用于治疗营养不良型大疱性表皮松解症的反义寡核苷酸(AON)。
背景技术
大疱性表皮松解症(EB)是一组可遗传的皮肤疾病，其特征在于皮肤和黏膜的慢性脆性和起疱。根据亚型，EB的症状范围非常广，从最小的皮肤脆性到具有全身并发症的非常严重的症状。全球约35万患者受影响。在某些形式的EB中，还可以涉及指甲、头发和牙齿。EB的主要类型包括单纯型EB(EBS)、交界型EB(JEB)、营养不良型EB(DEB)和金德乐综合征(KS)(Fine等人，2014)。
DEB影响约25％的EB患者，可显性或隐性遗传，并涉及VII型胶原蛋白(COL7A1，联机孟德尔人类遗传数据库(OMIM)120120)缺陷。COL7A1编码胶原蛋白VII的α-1链。胶原蛋白VII用作真皮上部到致密板(基底膜的部分)的锚原纤维。在翻译后修饰之后，三个相同的α-1链借助它们的胶原三螺旋结构域折叠在一起。随后，形成反向平行二聚体，其排列以形成锚原纤维。胶原蛋白VII由角质形成细胞和真皮成纤维细胞在皮肤中合成。DEB疾病严重程度与在基底膜区域的VII型胶原蛋白表达量大体相关。
显性营养不良型EB(DDEB)的特点包括可局限于手、脚、肘和膝盖或可以是全身性的起疱。常见的发现包括瘢痕、粟粒疹、黏膜受累、和异常或缺失指甲。隐性营养不良型EB(RDEB，约50％的DEB患者)通常比DDEB更具全身性且更严重。除了DDEB的症状之外，RDEB的其它常见表现包括营养失调、贫血、骨质疏松、食管狭窄、生长迟缓、蹼化或引起连指手套状并指(并指(趾)畸形(pseudosyndactyly))的手指和脚趾的融合、形成肌肉挛缩、牙齿畸形、小口畸形和眼睛瘢痕化。在该组中，鳞状细胞癌的风险以及来自转移性鳞状细胞癌的死亡大大增加。
在基因COL7A1内已知有多于400种不同的突变。最普遍受影响的外显子中的一个(7％的RDEB)是具有超过3种不同的突变的外显子80，这些突变是错义突变或导致提前终止密码子(PTC)的突变。由于COL7A1基因的大部分外显子都在框架(frame)中这一事实，所以外显子跳跃可能是在保留蛋白质功能的同时消除具有PTC突变的外显子的可行策略(Goto等，2006)。
目前不存在对DEB的治疗，只能进行缓和疗护。严重形式的RDEB对社会医疗保健预算造成高昂的费用：每名患者每年的敷料和药物的平均费用约为20万欧元。DEB患者的预期寿命在30至40岁之间。
法国国家健康与医学研究院(Institut National de la Santé et de laRecherche Médicale)(INSERM)的WO2013/053819公开了两种具有与外显子80互补的22个核苷酸和与上游内含子互补的2个核苷酸的24聚(24mer)反义寡核苷酸，其导致整个外显子从mRNA跳跃(也参见图1)：
ESE80.3 GGCC UCUU GGAC CCUG CAGA CCCU(SEQ ID NO：2)
ESEg0.3-Q2I70X GGCC UCUU GGAC CCUA CAGA CCCU(SEQ ID NO：3)
外显子80缺失的mRNA最有可能翻译为功能性多肽，尽管该多肽比野生型蛋白质短，但其表现与野生型胶原VII类似。本发明的发明人在人原代成纤维细胞(HPF)和HeLa细胞中测试WO2013/053819中公开的寡核苷酸，以评估其跳跃效率。似乎在所测试的条件下，两种AON都显示出小于50％的跳跃效率，同时ESE80.3表现得略好于ESE80.3-Q2170X。尽管这些外显子跳跃的寡核苷酸提供了解决这种可怕疾病的有希望的第一步，但显然，仍然需要进一步的替代寡核苷酸来提高外显子80跳跃的效率。
发明内容
本发明提供各种AON，当通过从哺乳动物细胞中(例如在体内在人类细胞中)的前体mRNA剪接而产生人COL7A1 mRNA时，该AON能够防止或减少外显子80包含到人COL7A1mRNA中。在第一方面，寡核苷酸(a)包含与外显子80的一部分互补的核苷酸序列，并且(b)长度小于24个核苷酸。因此，这些寡核苷酸有利地比现有技术中公开的寡核苷酸短。
在第二方面，寡核苷酸包含与外显子80的3’部分和下游内含子的5’部分互补的核苷酸序列。跨越外显子80与其下游内含子之间的边界的AON以前没有过描述，但是它们在本文中显示出有效促进外显子跳跃。例如，这些AON能够包含5’-UCACCACU-3’、5’-ACCACUGG-3’和/或5’-ACUCACCA-3’。
在第三方面，寡核苷酸不与外显子80的上游内含子杂交。例如，寡核苷酸可以与外显子80(的一部分)互补，但不与其上游内含子互补，即杂交将仅发生在下游内含子内。类似地，寡核苷酸能够包含与外显子80(的一部分)互补的区域，但是互补不延伸到上游内含子中(并且在一些实施方式中，互补甚至不延伸到外显子80侧翼的任何一个内含子中)。因此，当根据碱基配对与外显子80进行对齐时(例如，如图1所示)，寡核苷酸将不包含与上游内含子(并且在一些实施方式中，既不与上游内含子也不与下游内含子)的任何碱基对。相反地，现有技术的AON跨越外显子80及其上游内含子(参见图1中的“ESE”寡核苷酸)。
在第四方面，寡核苷酸包含与外显子80互补的区域，其长度至多为20个核苷酸(例如至多11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸；如至多11-17个)。相比之下，本领域已知的AON包含外显子内的22聚体序列。与外显子80互补的具有11-14个核苷酸的寡核苷酸在本文中显示非常有效。
因此，本发明的反义寡核苷酸能够包含(a)与外显子80互补的长度至多为20个核苷酸(例如长度为11-17个核苷酸)的互补区，和(b)与外显子80的上游或下游内含子中(优选下游内含子中)的RNA转录物(transcript)互补的区域。
本发明的AON有利地长度不超过24个核苷酸，例如长度为20-23个核苷酸。本发明的AON优选为RNA AON。与天然核酸相比，它们可具有化学修饰的核苷间键(例如硫代磷酸酯键)，并且它们可具有修饰的糖(例如具有2’-O-烷基取代基)。
本发明的AON能够配制成用在人类治疗中的药物组合物，并且能够用在防止或减少外显子80包含到哺乳动物、优选人COL7A1 mRNA的方法中。
附图说明
图1示出人COL7A1基因的片段(SEQ ID NO：1)，其包含外显子80(粗体大写字母；SEQ ID NO：18)及其5’和3’侧翼内含子边界(小写；SEQ ID NO：19上游和SEQ ID NO：20下游)，下面描绘本文测试的各种反义寡核苷酸(AON)(以3’至5’取向显示)。ESE80.3和ESE80.3_Q2170X公开于WO2013/053819；其它AON是根据本发明的那些。RNA转录物外显子80中带下划线的核苷酸代表EB患者中发现的最常见的外显子80突变。使用小写和大写仅仅是为了便于识别外显子(大写)和内含子(小写)序列和边界，以及易于使寡核苷酸与其互补靶标序列对齐。SEQ ID NO：22、23和24是本发明的不同AON之内或与之部分重叠的序列。
图2示出用本文所述的AON处理的人原代成纤维细胞(HPF)上外显子跳跃的芯片实验室(lab-on-a-chip)的结果。全长条带和外显子80跳跃条带用箭头指示。从左到右泳道1-16为：空白对照；maxPei对照；ESE80.3；ESE80.3_Q2I70X；AON80.1；AON80.2；AON80.3；AON80.4；AON80.5；AON80.6；AON80.7；AON80.8；AON80.9；AON80.10；AON80.11和AON80.12。上方箭头表示全长mRNA产物，下方箭头表示不包含外显子80的mRNA产物。
图3示出用AON处理的HeLa细胞上外显子跳跃的芯片实验室的结果。全长条带和外显子80跳跃条带的位置与图2中相同，泳道1-16也是。
图4示出从AON80.5优化并在HPF上测试的AON的芯片实验室结果。AON80.5.1、AON80.5.2和AON80.13具有比AON80.5.3、AON80.5.4和AON80.5.5更高的剪接效率。为了评估所有形成产物的确切序列，进行序列分析。使用生物分析仪分析后可见的额外产物(上方两个箭头)是具有包含在mRNA中的内含子82的那些(如用测序分析所检测)。内含子82的存在导致终止密码子的存在，这将可能导致蛋白质的降解。FL＝全长。
图5示出与AON80.5相比，用优化的AON处理的HPF上的外显子跳跃的芯片实验室结果。上方箭头表示全长mRNA，并且下方箭头表示不包含外显子80的mRNA。泳道1-7是：AON80.5、AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.5.7、AON80.5.8和AON80.13。
图6示出对所述治疗做出应答的免疫原性(NF-κB和/或AP-1激活)，AON80.5和AON80.5.1中的每一个包括三个剂量。y轴显示SEAP活性(任意单位的OD655nm)，表明相对于盐水的倍数变化。****P＜0.0001，**P＜0.01，*P＜0.05。
图7示出所述治疗后的RAW-blue巨噬细胞的细胞活力，AON80.5和AON80.5.1中的每一个包括三个剂量。y轴显示试卤灵(resorufin)水平(λEX560nm/λEX590nm)，表明了相对于盐水的倍数变化。****P＜0.0001，**P＜0.01，*P＜0.05。
具体实施方式
令人惊讶的是，已经获得了与现有技术中公开的那些相比在本文公开的试验中具有相似或更好的外显子跳跃特征的反义寡核苷酸(AON)。本发明的这些AON能够在治疗人类疾病、更特别是大疱性表皮松解症(EB)、还更特别是与COL7A1外显子80中的突变相关的EB的疗法中用作药物活性物质。这些AON可作为单独的药物活性物质使用、与靶向COL7A1外显子80的其它AON(包括本文公开的那些)组合使用和/或与用于治疗EB疾病的其它药物活性物质组合使用。这些其它药物物质可以是其它AON，例如那些靶向其它外显子(包括外显子73、74或3)中的突变的那些，或者非AON药物活性物质。组合疗法可以是单一组合物或多种组合物的形式，同时或连续施用。
本发明涉及当通过从细胞中的前体mRNA剪接而产生人COL7A1mRNA时，能够防止或减少外显子80包含到人COL7A1 mRNA中的AON，其特征在于该AON包含以下核苷酸序列：其与外显子80的至少一部分互补，并且其不与COL7A1基因的外显子80的上游内含子互补；或者其与外显子80的至少一部分互补并且长度小于24个核苷酸。在优选的实施方式中，根据本发明的AON包含与外显子80互补的区域，其中所述互补的区域的长度最多为20个核苷酸，优选11、12、13、14、15、16或17个核苷酸。更优选地，所述AON包含与外显子80的3’部分和下游内含子的5’部分互补的核苷酸序列。甚至更优选地，AON包含核苷酸序列5’-UCACCACU-3’、5’-ACCACUGG-3’或5’-ACUCACCA-3’。最优选地，根据本发明的AON包含选自SEQ ID NO：7、8、25、26、28、31和32的核苷酸序列。
在另一个实施方式中，本发明涉及根据本发明的AON，其长度小于24个核苷酸，优选包含20、21、22、23或23个核苷酸。优选地，所述AON包含SEQ ID NO：4或5的核苷酸序列，更优选地所述AON包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列，或其中AON包含SEQ ID NO：30的核苷酸序列。
根据本发明的AON除了它们的有效性之外，在可制造性、分析和/或商品成本方面而言比现有技术中公开的那些具有某些优点，就意义而言本发明的AON优选比现有技术中公开的那些更短。
本发明优选的AON的长度小于24，如20、21、22或23个核苷酸。如果AON仅与外显子80互补，并且不与其侧翼内含子的任何一个(如本文所示)互补，则其能够是至多整个外显子的36个核苷酸(36nt)长度的任何长度(例如AON80.13)。
作为使用本发明的AON处理的结果，缺少整个外显子80的缩短的mRNA将翻译成更短但功能性的COL VII蛋白。然而，在一些情况下，本发明的某些AON的使用确实也导致形成更长的转录物(例如来自内含子82的序列)，这可能导致与较短的(功能性)蛋白质一起表达(非功能性且易于降解)的蛋白质。
令人惊讶的是，已经鉴定出AON，当通过从哺乳动物细胞中的前体mRNA剪接而产生人COL7A1 mRNA时，能够防止或减少外显子80包含到人COL7A1 mRNA中，其特征在于所述寡核苷酸的序列与外显子80的3’部分和下游内含子的5’部分互补(例如(部分地)与具有12个外显子核苷酸和12个内含子核苷酸的24聚体5’-CCTGGCCCAGTGgtgagtacccaa-3’(SEQ IDNO：21)互补)。以前，没有描述过涵盖外显子80和其下游内含子之间边界的AON。这样的AON可包含例如：(i)序列5’-UCACCACU-3’(SEQ ID NO：22)，因此包含至少4个来自外显子/内含子边界的任一侧的核苷酸；(ii)序列5’-ACCACUGG-3’(SEQ ID NO：23)，因此包含至少2个来自边界的内含子侧的核苷酸和至少6个来自外显子侧的核苷酸；和/或(iii)序列5’-ACUCACCA-3’(SEQ ID NO：24)，因此包含至少6个来自边界的内含子侧的核苷酸和至少2个来自外显子侧的核苷酸。AON80.4、AON80.5、AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.5.4、AON80.5.5、AON80.5.7和AON80.5.8(见下文)是这种AON的实例。这种类型的AON理想地包含至少2个来自边界的每侧的核苷酸(例如至少4或6个来自每侧的核苷酸)，但不需要包含来自每侧的核苷酸的数目相同(例如它可以具有奇数个核苷酸，如AON80.5系列)。
换言之，首次描述与外显子80的3’部分互补的AON，其包含外显子80的3’剪接位点和下游内含子的5’部分，并且当通过从哺乳动物细胞中的前体mRNA剪接而产生人COL7A1mRNA时，能够防止或减少外显子80包含到人COL7A1 mRNA中。当通过从哺乳动物细胞中的前体mRNA剪接而产生人COL7A1 mRNA时，这些AON虽然本身有用，但认为与能够防止或减少外显子80包含到人COL7A1 mRNA中的其它AON组合是良好的候选物，尤其是与外显子80的不同部分(如外显子80的内部部分、或外显子80的5’部分和/或外显子80和其上游内含子的5’边界)互补的那些AON组合。必要的话，认为这样的组合是有利的以增加外显子80跳跃的效率。
然而，在其它实施方式中，本发明的AON可仅与外显子80杂交，因此不包含与外显子80上游和下游的内含子杂交的区域。AON80.3是这样的AON的实例，如AON80.13(见下文)。
在另外的实施方式中，AON可与外显子80杂交，但不与其上游内含子杂交。AON80.3、AON80.4、AON80.5、AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.5.4、AON80.5.5、AON80.5.7、AON80.5.8和AON80.13是这样的AON的实例(其中AON80.4、AON80.5、AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.5.4、AON80.5.5、AON80.5.7和AON80.5.8是也与外显子80直接下游的内含子杂交的AON的实例)。
在另外的实施方式中，AON包含与外显子80互补的区域，其长度最多为20个核苷酸(而现有技术的AON的外显子互补区为22个核苷酸长)。AON80.1、AON80.2、AON80.3、AON80.4和AON80.5的每个(见下表1)是这样的AON的实例，其分别具有一段10、17、20、12和12个外显子互补的核苷酸。AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.5.4、AON80.5.5、AON80.5.7和AON80.5.8系列是进一步的实例(与外显子具有9到14个核苷酸的重叠)。因此，与外显子80互补的区域长度可以在8至20(例如10至20个核苷酸)之间，例如11至17个核苷酸，例如为11、12、13、14、15、16或17个核苷酸。
对于这样的AON，除了≤20个核苷酸长度的外显子互补区之外，可能存在与外显子80上游或下游的内含子互补的区域。因此，这样的AON包含单个的、基本上不间断的与新生RNA转录物的互补段，其跨越外显子80和其相邻内含子之一的边界。
本发明特别优选的AON是下面表1和表2中所公开的AON80.1、AON80.2、AON80.3、AON80.4和AON80.5。本发明更优选的AON是表1和2所公开的AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.4、AON80.5.7、AON80.5.8和AON80.13。根据本发明的高度优选的AON是AON80.2(SEQ ID NO：5)、AON80.5(SEQ ID NO：8)、AON80.5.1(SEQ ID NO：25)、AON80.5.2(SEQ IDNO：26)、AON80.5.7(SEQ ID NO：31)、AON80.5.8(SEQ ID NO：32)和AON80.13(SEQ ID NO：30)。在另一个优选的实施方式中，所有的核糖部分是2’-O-甲基化的并且基本上所有的核苷间键都是硫代磷酸酯。
在本发明的所有实施方式中，术语“防止或至少减少外显子包含”和“外显子跳跃”是同义的。关于COL7A1，“防止或至少减少外显子包含”或“外显子跳跃”应解释为使人COL7A1 mRNA中不包含外显子80(SEQ ID NO：18或其等位基因形式)(参见图1)。术语外显子跳跃在本文中定义为在细胞内诱导不含有具体外显子的成熟mRNA，该具体外显子在没有外显子跳跃的情况下将存在于成熟mRNA中。外显子跳跃通过向表达所述成熟mRNA的前体mRNA的细胞提供一种分子来实现，该分子能够干扰序列、例如允许剪切的生物化学过程所需的剪切供体或剪切受体序列，或该分子能够干扰用于识别作为待包含到成熟mRNA中的外显子的核苷酸段所需的外显子包含信号；这样的分子在本文中称为外显子跳跃分子。
术语前体mRNA是指通过转录从细胞中的DNA模板合成的未加工或部分加工的前体mRNA。
术语“反义寡核苷酸”应理解为是指与前体mRNA分子、hnRNA(异质性核RNA)或mRNA分子中靶核苷酸序列互补，使得其能够与其对应的靶序列退火的核苷酸序列。
本文所用的术语“互补”包括“完全互补”和“基本上互补”，这意味着寡核苷酸和其对应的靶序列之间的互补度通常将大于80％、优选地大于85％、还更优选地大于90％、最优选地大于95％。例如，对于长度为20个核苷酸的寡核苷酸，其序列与其靶序列之间具有一个错配，互补度为95％。
反义序列的互补度优选地使得包含反义序列的分子可以在生理条件下与RNA分子中的靶核苷酸序列退火，从而促进外显子跳跃。对于本领域技术人员熟知的是，某些错配比其他错配较容许，因为某些错配比其他错配对AON和靶序列之间结合强度(如以解链温度或Tm表示)的影响较小。某些非互补的碱基对可以形成所谓的“摆动”，该摆动破坏整体结合至比真正的错配更小的程度。AON的长度在结合强度方面也起作用，一般来说较长的AON比较短的AON具有更高的解链温度，并且寡核苷酸的G/C含量也是确定结合强度的因素，对于任何给定长度，G/C含量越高，则解链温度越高。如本发明所考虑的，核碱基或糖-磷酸骨架的某些化学修饰也可影响结合强度，使得在设计根据本发明的寡核苷酸时互补度仅是考虑的一个因素。
寡核苷酸中一个CpG或多个(两个或更多个)CpG的存在通常与所述寡核苷酸增加的免疫原性相关联(Dom和Kippenberger，2008)。该增加的免疫原性是不期望的，因为它可以诱导待治疗的组织、即皮肤(真皮和/或表皮)的损伤。因此，优选本发明的AON包含不超过1或2个CpG二核苷酸序列(优选仅1个)。
本发明允许设计具有可接受的RNA结合动力学和/或热力学特性的寡核苷酸。RNA结合动力学和/或热力学特性至少部分地由寡核苷酸解链温度(Tm；对于使用基本Tm和最近相邻模型的单链RNA，用寡核苷酸特性计算器计算(www.unc.edu/～cail/biotool/oligo/index.html))和/或AON-靶外显子复合物的自由能(使用RNA结构型式4.5)确定。如果Tm太高，则预期寡核苷酸的特异性较低。可接受的Tm和自由能取决于寡核苷酸的序列、骨架(磷酸二酯，硫代磷酸酯、磷酰胺酯、肽-核酸等)的化学性质、糖部分(核糖、脱氧核糖、取代的核糖、分子内桥)的性质和核碱基的化学修饰。因此，Tm的范围可变化很大。
在给定的PCR循环次数之后，对于任何给定的引物组，假如循环的次数使得扩增仍处于指数期，可以通过确定扩增的野生型条带的浓度除以扩增的缩短(不含外显子80)的条带的浓度乘以100％计算外显子跳跃百分比或效率。能够使用Agilent 2100生物分析仪与DNA1000试剂盒组合进行定量。
优选地，根据本发明的包含与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列互补的序列的AON使得互补部分为至少约80％、更优选地至少约90％、还更优选地至少约95％、最优选地约100％与靶序列互补。因此，不完全需要互补区域中的所有碱基能够与相对链中的碱基配对。例如，当设计寡核苷酸时，可能需要包含例如与互补链上的碱基并非碱基配对的残基。如果在细胞的环境下，核苷酸段能够充分地与互补部分杂交，则在某种程度上可以允许错配。在该上下文中，“充分地”意味着根据本发明的AON能够诱导外显子80的外显子跳跃。所靶向外显子的跳跃可以方便地由PCR/生物分析仪、任选ddPCR进行评估。互补区域优选地设计成使得当它们组合时，它们对前体mRNA中的外显子是特异性的。这种特异性可以由各种长度的互补区域产生，因为这取决于系统中其他(前体)mRNA分子中的实际序列。寡核苷酸也将能够与一个或多个其他前体mRNA分子杂交的风险随着寡核苷酸大小的增加而减小，而长度不应当太长以致产生可制造性、纯化和/或分析问题。
显然在互补区域中包含错配但是保留与前体mRNA中靶向区域杂交和/或结合的能力的寡核苷酸可用于本发明。然而，优选至少互补部分不包含此类错配，因为这些通常比在一个或多个互补区域中具有此类错配的寡核苷酸具有更高的效率和更高的特异性。据认为，较高的杂交强度(即增加与相对链的相互作用数目)对增加干扰系统的剪切机制的过程的效率是有利的。优选地，互补度为90％至100％。通常，这在20个核苷酸的寡核苷酸中允许1个或2个错配。
本发明的外显子跳跃分子优选为与SEQ ID NO：1内的外显子80序列(SEQ ID NO：18)互补的(反义)寡核苷酸。
优选地，寡核苷酸互补部分的长度与寡核苷酸的长度相同，这意味着不存在不与靶RNA形成碱基对的寡核苷酸的5’或3’末端。因此，本发明的寡核苷酸的优选长度为23个核苷酸或更少，例如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个。
已经用长度为20、21或23个核苷酸的AON得到了特别好的结果。
如果AON仅与外显子80互补，并且不与其侧翼内含子之一互补，则其可以是例如12-36个核苷酸长的任何长度，例如20聚体(例如AON80.3)或36聚体(例如AON80.13)。
根据本发明的外显子跳跃分子可含有多个DNA残基中的一个(因此RNA“u”残基将是作为DNA对应物的“t”残基)、或一个或多个RNA残基、和/或一个或多个核苷酸类似物或等同物，如下文将进一步详细描述。SEQ ID NO：4-15和25-32是RNA序列，但是本发明还包括这些序列中每一个的DNA形式，以及这些序列的嵌合DNA/RNA AON。
优选本发明的外显子跳跃分子包含经修饰以提高核酸酶抗性、和/或以增加反义寡核苷酸对靶序列的亲和力的一个或多个残基。因此，在优选的实施方式中，反义核苷酸序列包含至少一个核苷酸类似物或等同物，其中核苷酸类似物或等同物定义为具有修饰的碱基、和/或修饰的骨架、和/或非天然的核苷间键、或这些修饰的组合的残基。
在优选的实施方式中，核苷酸类似物或等同物包含修饰的骨架。此类骨架的实例由吗啉代骨架、氨基甲酸酯骨架、硅氧烷骨架、硫化物、亚砜和砜骨架、甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架、亚甲基甲酰乙酰基骨架、核糖乙酰骨架、含烯烃骨架、氨基磺酸酯、磺酸酯和磺酰胺骨架、亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架和酰胺骨架提供。磷酰二胺吗啉代寡聚物是以前作为反义试剂研究的经修饰的骨架寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸具有不带电的骨架，其中DNA的脱氧核糖由六元环代替，并且磷酸二酯键由磷酰二胺键代替。吗啉代寡核苷酸对酶降解具有抗性，并且似乎通过阻止翻译或干扰前体mRNA剪切而不是通过激活核糖核酸酶H(RNase H)起反义试剂作用。通过物理破坏细胞膜的方法已经将吗啉代寡核苷酸成功地递送至组织培养细胞，并且比较这些方法中的若干方法的一项研究发现，刮擦负载(scrapeloading)是最有效的递送方法；然而，因为吗啉代骨架不带电，所以阳离子脂质不是细胞中吗啉代寡核苷酸摄取的有效介质。
根据本发明的一个实施方式，骨架中的残基之间的键不包括磷原子，例如由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的键。
根据该实施方式，优选的核苷酸类似物或等同物包含具有修饰的聚酰胺骨架的肽核酸(PNA)(Nielsen等人(1991))。基于PNA的分子在碱基对识别方面是DNA分子的真实模拟物。PNA的骨架由通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成，其中核碱基通过亚甲基羰基键连接到骨架。替代骨架包含一碳延伸的吡咯烷PNA单体(Govindaraju和Kumar(2005))。由于PNA分子的骨架不含有带电的磷酸酯基团，所以通常PNA-RNA杂交体分别比RNA-RNA或RNA-DNA杂交体更稳定(Egholm等人(1993))。
根据本发明的另一个实施方式，骨架包含吗啉代核苷酸类似物或等同物，其中核糖或脱氧核糖由6-元吗啉代环代替。最优选的核苷酸类似物或等同物包含磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)，其中核糖或脱氧核糖由6-元吗啉代环代替，并且相邻吗啉环之间的阴离子磷酸二酯键由非离子磷酰二胺键代替。
在又一个实施方式中，本发明的核苷酸类似物或等同物包含磷酸二酯键中的非桥接氧中的一个的取代。该修饰略微使碱基配对不稳定，但增加了对核酸酶降解的明显抗性。优选的核苷酸类似物或等同物包含硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、H-膦酸酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、磷酰胺酯(包括3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯)、硫代磷酰胺酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯或硼代磷酸酯。
本发明的另一个优选的核苷酸类似物或等同物包含一个或多个糖部分，该一个或多个糖部分在2’、3’和/或5’位置单取代或二取代，例如-OH；-F；可以由一个或多个杂原子中断的取代或未取代的直链或支链低级(C1-C10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；O-、S-或N-烯丙基；O-烷基-O-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基；甲氧基乙氧基；-二甲基氨氧基乙氧基；和-二甲基氨基乙氧基乙氧基。糖部分可为五环糖或其衍生物、或脱氧五环糖或其衍生物，优选核糖或其衍生物、或脱氧核糖或其衍生物。优选的衍生化糖部分包括锁核酸(LNA)，其中2’-碳原子连接到糖环的3’或4’碳原子上，从而形成双环糖部分。优选的LNA包括2’-O，4’-C-亚乙基桥接的核酸(Morita等人，2001.Nucleic Acid Res Supplement No.1：241-242)。这些取代使得核苷酸类似物或等同物具有核糖核酸酶H和核酸酶抗性并增加对靶RNA的亲和力。
本领域技术人员应当理解，不必要对反义寡核苷酸中的所有核苷间键都进行修饰。例如，一些核苷间键可以是未修饰的，而其它核苷间键是修饰的。本发明涵盖所有包含骨架的AON，该骨架由沿着AON的长度均匀或不均匀分布的(修饰的)核苷间键中的一种形式、(修饰的)核苷间键中的多种形式构成。另外，骨架修饰的任何方式(均匀、不均匀、单一形式或多种形式及其全部组合)可以与任何形式或下文提及的糖或核苷修饰或类似物的任何形式组合。
用于根据本发明的AON的尤其优选的骨架是均匀(全部)硫代磷酸酯(PS)骨架。
在另一个实施方式中，本发明的核苷酸类似物或等同物包含一个或多个碱基修饰或取代。修饰的碱基包括合成和天然的碱基，例如在本领域中已知或将知的肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤以及嘧啶和嘌呤碱基的其他-氮杂、脱氮、-羟基、-卤代、-硫代、硫醇、-烷基、-烯基、-炔基、硫代烷基衍生物。
本领域技术人员应当理解，不必要对反义寡核苷酸中的所有位置都均匀地修饰。另外，上述类似物或等同物中的多于一种可以包含在单个反义寡核苷酸中或甚至在反义寡核苷酸内的单个位置处。在某些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸具有至少两种不同类型的类似物或等同物。
根据另一个实施方式，根据本发明的AON包括2’-O(优选低级)烷基硫代磷酸酯反义寡核苷酸，例如2’-O-甲基修饰的核糖(RNA)、2’-O-甲氧基乙基修饰的核糖、2’-O-乙基修饰的核糖、2’-O-丙基修饰的核糖和/或这些修饰物的取代衍生物，例如卤代衍生物。
根据本发明的有效和优选的反义寡核苷酸形式包含具有硫代磷酸酯骨架的2’-O-甲基修饰的核糖部分，优选其中基本上所有的核糖部分均是2’-O-甲基，并且基本上所有的核苷间键均是硫代磷酸酯键。
技术人员还将理解，可组合不同的AON以有效地跳跃COL7A1基因的外显子80。两种AON的组合可以用于本发明的方法中，比如靶向外显子80(图1)的相同或不同区域的两种AON、三种不同的AON、四种不同的AON或五种不同的AON，只要至少一个AON是根据本发明的一个AON。
AON可连接到增强细胞(优选皮肤细胞)中AON摄取的部分。这样的部分的实例为胆固醇、碳水化合物、维生素、生物素、脂质、磷脂、细胞穿透肽(包括但不限于触角足、TAT、转运子)和带正电荷的氨基酸(比如寡聚精氨酸、聚精氨酸、寡聚赖氨酸或聚赖氨酸)、比如由抗体、抗体的Fab片段提供的抗原结合结构域或单链抗原结合结构域(比如骆驼单结构域抗原结合结构域)。
根据本发明的外显子跳跃分子可以是裸露(裸(gymnotic))AON或呈偶联物的形式或从载体表达(载体化的AON)。可以使用本领域已知的合适方式施用外显子跳跃分子。当外显子跳跃分子是载体化的AON时，例如可以将其以表达载体的形式提供给个体或所述个体的细胞、组织或器官，其中表达载体编码包含所述寡核苷酸的转录本。表达载体优选地经由比如病毒载体的基因递送工具引入细胞、组织、器官或个体。在优选的实施方式中，提供基于病毒的表达载体，其包含驱动如本文所鉴定的外显子跳跃分子的表达或转录的表达盒或转录盒。因此，本发明提供病毒载体，当置于有助于外显子跳跃分子表达的条件下时，该病毒载体表达根据本发明的外显子跳跃分子。可向细胞提供能够干扰对包含外显子80是必要的或至少有助于包含外显子80的序列的外显子跳跃分子，使得这样的干扰例如通过由腺病毒类或腺相关病毒类的载体提供的质粒衍生的AON表达或病毒表达，防止或至少减少外显子80包含到COL7A1 mRNA中。表达可以由聚合酶III启动子(例如U1、U6或U7 RNA启动子)驱动。优选的递送工具是病毒载体比如腺相关病毒载体(AAV)、或逆转录病毒载体比如慢病毒载体等。此外，质粒、人造染色体、可用于哺乳动物(优选人类)细胞基因组中靶向同源重组和整合的质粒可以适当地应用于递送本文所述的寡核苷酸。本发明优选的是那些其中转录由Pol-III启动子驱动、和/或其中转录本为与U1或U7转录本融合的形式的载体，它们对于递送小的转录本产生良好的结果。设计合适的转录本在技术人员的技术范围内。优选的是Pol-III驱动的转录本。优选地，以与U1或U7转录本的融合转录本的形式。可以如本领域中(例如参见Gorman L等人，1998或Suter D等人，1999)所述产生此类融合体。
一种优选的AON表达系统是腺病毒相关病毒(AAV)类载体。已经开发了单链和双链AAV类载体，其可用于延长AON的表达，用于高效跳跃COL7A1外显子80。例如，优选的AAV类载体包含由聚合酶III启动子(Pol III)驱动的表达盒。例如，优选的Pol III启动子是U1、U6或U7 RNA启动子。因此，本发明还提供一种病毒类载体，其包含用于表达本发明的AON的PolIII启动子驱动的表达盒，该反义寡核苷酸用于诱导COL7A1外显子80的跳跃。根据本发明的AAV载体是重组AAV载体，并且是指包含AAV基因组的部分的AAV载体，该AAV基因组包含根据本发明的编码的外显子跳跃分子，将该外显子跳跃分子在如本文其他地方所描述的衍生自AAV血清型的衣壳蛋白的蛋白质壳中衣壳化。AAV基因组的部分可含有衍生自腺相关病毒血清型(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9等)的反向末端重复序列(ITR)。由衣壳蛋白组成的蛋白质壳可衍生自AAV血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9等。蛋白质壳也可以命名为衣壳蛋白壳。AAV载体可具有缺失的一个或优选缺失的全部野生型AAV基因，但仍可包含功能性ITR核酸序列。功能性ITR序列对于AAV病毒粒子的复制、释放(rescue)和包装是必需的。ITR序列可以是野生型序列，或者可与野生型序列具有至少80％、85％、90％、95或100％的序列同一性，或者可以通过例如核苷酸的插入、突变、缺失或取代来改变，只要它们保持功能性。在该上下文中，功能性是指指导基因组包装到衣壳中、然后允许在待感染的宿主细胞或靶细胞中表达的能力。在本发明的上下文中，衣壳蛋白壳可以是与AAV载体基因组ITR不同的血清型。因此，根据本发明的AAV载体可以由一种衣壳蛋白壳(即二十面体衣壳)组成，该衣壳蛋白壳包含一种AAV血清型(例如AAV血清型2)的衣壳蛋白(VP1、VP2和/或VP3)，而在该AAV5载体中含有的ITR序列可以是上述AAV血清型中的任何一种，包括AAV2载体。因此，“AAV2载体”包含AAV血清型2的衣壳蛋白壳，同时例如“AAV5载体”包含AAV血清型5的衣壳蛋白壳，由此任一个可将根据本发明的任何AAV载体基因组ITR衣壳化。优选地，根据本发明的重组AAV载体包含AAV血清型2、5、8或AAV血清型9的衣壳蛋白壳，其中存在于所述AAV载体中的AAV基因组或ITR衍生自AAV血清型2、5、8或AAV血清型9；此类AAV载体分别称为AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9、AAV5/2、AAV5/5、AAV5/8、AAV5/9、AAV8/2、AAV8/5、AAV8/8、AAV8/9、AAV9/2、AAV9/5、AAV9/8或AAV9/9载体。更优选地，根据本发明的重组AAV载体具有对真皮和表皮细胞的趋向性，并且包含AAV血清型5或8的衣壳蛋白壳。存在于所述载体中的AAV基因组或ITR可以衍生自相同或不同的血清型，比如AAV血清型2；这样的载体称为AAV2/5或AAV2/8载体。具有血清型5衣壳的AAV具有对真皮和表皮细胞(比如基部和上基部角质形成细胞以及真皮成纤维细胞)的趋向性。与具有血清型2衣壳的AAV相比，具有血清型5衣壳的AAV载体显示出更高的转导效率(Keswani等人，2012)。类似地，具有血清型8的衣壳的AAV示出对真皮成纤维细胞和(主要)上基部角质形成细胞的趋向性。此外，AAV2/8在转导哺乳动物、优选人类真皮和表皮细胞方面比AAV2/5更有效。然而，转导效率似乎取决于伤口愈合期间施用的时间，在较晚时间点，AAV2/2示出比AAV2/5和AAV2/8更高的转导效率(Keswani等人，2012)。因此，AAV2/2，AAVx/5和AAVx/8是递送根据本发明的AON的优选AAV，并且可以考虑施用时间和待靶向的细胞类型来确定它们的选择。在临床前或临床研究中，本领域技术人员可以容易地制定这些细节。
将由所选择的核酸序列表示的、编码根据本发明的外显子跳跃分子的核酸分子优选地插入如上所述的AAV基因组或ITR序列之间，例如包含可操作地连接到编码序列和3’终止序列的表达调控元件的表达构建体。
“AAV辅助功能”通常是指在转载(in trans)中供应给AAV载体的AAV复制和包装所需的对应的AAV功能。AAV辅助功能补充AAV载体中缺失的AAV功能，但它们缺少AAV ITR(由AAV载体基因组提供)。AAV辅助功能包括AAV的两个主要ORF，即rep编码区域和cap编码区域，或其功能基本相同的序列。Rep和Cap区域是本领域公知的，例如参见Chiorini等人(1999)或US 5,139,941，其并入本文以供参考。可以在可为质粒的AAV辅助构建体上供应AAV辅助功能。在引入本文所述的存在于AAV载体中的AAV基因组之前或同时，例如可通过转化、转染或转导将辅助构建体引入宿主细胞。因此，可选择本发明的AAV辅助构建体，使得它们产生期望的血清型组合，一方面用于AAV载体的衣壳蛋白壳，并且另一方面用于存在于所述AAV载体中的AAV基因组复制和包装。
“AAV辅助病毒”提供AAV复制和包装所需的附加功能。合适的AAV辅助病毒包括腺病毒、单纯疱疹病毒(例如1型和2型HSV)和痘苗病毒。辅助病毒提供的附加功能也可经由载体引入宿主细胞，如并入本文以供参考的US 6,531,456中所述。优选地，根据本发明的重组AAV载体中存在的AAV基因组不包含编码病毒蛋白质的任何核苷酸序列，例如AAV的rep(复制)或cap(衣壳)基因。AAV基因组还可包含标志物或报告基因，例如编码抗生素抗性基因的基因、编码荧光蛋白的基因(例如gfp)或本领域已知的编码化学上、酶学上或以其他方式可检测和/或可选择的产物的基因(例如lacZ、aph等)。根据本发明的优选的AAV载体是AAV载体，优选是AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9或AAV2/2载体，其表达包含反义寡核苷酸的根据本发明的外显子跳跃分子，其中所述反义寡核苷酸包含选自如上表1所公开的以下序列或由以下序列组成：AON80.1、AON80.2、AON80.3、AON80.4和AON80.5。考虑到迄今为止已经取得的进展，预期向个体或所述个体的细胞、组织、器官提供根据本发明的外显子跳跃分子的手段的改进。当然可以并入此类未来的改进以使用本发明的方法来实现提及的对mRNA重组的效果。根据本发明的外显子跳跃分子可按原样递送给个体、所述个体的细胞、组织或器官。当施用根据本发明的外显子跳跃分子时，优选将分子溶解在与递送方法相适应的溶液中。
体内的大多数细胞容易吸收裸AON，并且通常将根据本发明的AON溶解在等渗(盐水)溶液中将足以到达靶细胞，比如皮肤(真皮和表皮)细胞。替代地，可以使用药学上可接受的赋形剂、添加剂，稳定剂、溶剂、着色剂等来配制本发明的裸AON。另外或替代地，可以用下文提及的任何转染辅助剂配制裸AON。
通过在比如等渗(盐水)溶液的水溶液中提供质粒，可向皮肤(真皮和表皮)细胞提供用于反义寡核苷酸表达的质粒。替代地，可通过使用已知的转染试剂转染提供质粒。
对于静脉内、皮下、肌内、鞘内和/或心室内施用，优选的溶液是等渗(盐水)溶液。在本发明中特别优选的是赋形剂或转染试剂的使用，该赋形剂或转染试剂将有助于将本文定义的每种成分递送至细胞和/或细胞中，优选皮肤(真皮和表皮)细胞。优选的是能够形成复合物、纳米颗粒、胶束、囊泡和/或脂质体的赋形剂或转染试剂，其将本文所述的每种组分复合或捕获在囊泡或脂质体中递送通过细胞膜。许多这些赋形剂是本领域已知的。合适的赋形剂或转染试剂包括能够自组装成可将本文所定义的每种成分递送至细胞(优选皮肤(真皮或表皮)细胞)的颗粒的聚乙烯亚胺(PEI；ExGen500(MBI Fermentas)、LipofectAMINETM 2000(Invitrogen)或其衍生物、或类似的阳离子聚合物(包括聚丙烯亚胺或聚乙烯亚胺共聚物(PEC)和衍生物)、合成两亲物(SAINT-18)、lipofectinTM、DOTAP和/或病毒衣壳蛋白。已经表明这样的赋形剂有效地将比如反义核酸的寡核苷酸递送到多种培养的细胞，包括皮肤(真皮和表皮)细胞。就总体细胞存活而言，它们的高转染潜能与可接受的低至中等的毒性相结合。结构修饰的简便性可用于允许进一步修饰和分析其进一步(体内)核酸转移特点和毒性。
Lipofectin代表脂质体转染试剂的实例。它由两种脂质组分组成，即阳离子脂质N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵氯化物(DOTMA)(cp.DOTAP，其为甲基硫酸盐)和中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。中性组分介导细胞内释放。另一组递送系统是聚合物纳米颗粒。
作为DNA转染试剂而公知的比如二乙基氨基乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖的聚阳离子可与丁基氰基丙烯酸酯(PBCA)和己基氰基丙烯酸酯(PHCA)组合以配制阳离子纳米颗粒，该阳离子纳米颗粒可递送本文所述的每种成分(优选寡核苷酸)跨细胞膜进入细胞。
除了这些常见的纳米颗粒材料，阳离子肽鱼精蛋白提供了用胶体配制寡核苷酸的替代方法。该胶体纳米颗粒系统可形成所谓的鱼精蛋白类纳米粒子(proticle)，其可通过简单的自组装工艺制备以包装和介导寡核苷酸的细胞内释放。本领域技术人员可以选择和采用任何上述或其它可商购替代赋形剂和递送系统，以包装和递送用于本发明的外显子跳跃分子，以将其用于预防、治疗或延缓与COL7A1基因中突变的外显子80相关联的疾病或病症。
另外，根据本发明的外显子跳跃分子可共价地或非共价地连接到经特异性设计的靶向配体以促进摄取到细胞(尤其是皮肤(真皮)细胞)、细胞质和/或其核中。此类配体可包括(i)识别促进细胞摄取的细胞、组织或器官特异性元件的化合物(包括但不限于肽(样)结构)，和/或(ii)能够促进细胞摄取和/或由囊泡(例如核内体或溶酶体)的寡核苷酸的细胞内释放的化学化合物。
因此，在优选的实施方式中，将根据本发明的外显子跳跃分子配制成组合物或药物或组合物，该组合物或药物被提供有至少一种赋形剂、和/或一种用于递送的靶向配体、和/或一种将其递送至细胞和/或增强其细胞内递送的递送装置。
应当理解，如果组合物包含附加的成分比如本文后面所述的辅料化合物，则组合物的每种成分可以配制成单一组合或组合物或制剂。根据其特性，技术人员将知道哪种类型的剂型对于如本文所述的每种成分最适当。根据一个实施方式，本发明提供组合物或制剂，其为包含根据本发明的外显子跳跃分子和本文后面所述的另外的辅料化合物的成套部分的形式。
如果需要，可通过添加药学上可接受的载体，将根据本发明的外显子跳跃分子或表达根据本发明的外显子跳跃分子的载体(优选病毒载体)并入药物活性混合物中。
因此，本发明还提供包含根据本发明的外显子跳跃分子(比如裸AON)或根据本发明的病毒载体和药学上可接受的赋形剂的组合物、优选药物组合物。此类组合物可以包含根据本发明的单一外显子跳跃分子，但也可以包含根据本发明的多种不同的外显子跳跃分子。此类药物组合物可以包含任何药学上可接受的赋形剂，包括载体、赋形剂、稳定剂、转染剂、胶凝剂、缓冲剂、填充剂、防腐剂、佐剂、增溶剂和/或稀释剂。这样的药学上可接受的组分可在例如Remington，2000中找到。所述组合物的每个特征在本文中已经在先定义。
如果使用根据本发明的多种不同的外显子跳跃分子，则本文所定义的浓度或剂量可以是指使用的所有寡核苷酸的总浓度或剂量，或者使用或添加的每种外显子跳跃分子的浓度或剂量。因此，在一个实施方式中，提供一种组合物，其中使用的根据本发明的外显子跳跃分子的单量或总量以在0.0001-100mg/kg，优选地0.001-50mg/kg，还更优选地在0.01-20mg/kg之间的范围的量给药。
根据本发明的优选的外显子跳跃分子是用于治疗DEB，或更普遍地，治疗个体的与突变的COL7A1外显子80相关的疾病或病症。在本发明的所有实施方式中，术语“治疗”应理解为包括疾病或病症的预防和/或延缓。可使用根据本发明的外显子跳跃分子治疗的个体可以已经被诊断为患有DEB或与COL7A1外显子80相关的疾病或病症。替代地，可使用根据本发明的外显子跳跃分子治疗的个体可以尚未被诊断，但考虑到他或她的遗传背景，该个体可以是在未来具有增加的DEB或与COL7A1外显子80相关的疾病或病症发生风险的个体。优选的个体是人类。在优选的实施方式中，与突变的COL7A1外显子80相关的疾病或病症是营养不良型大疱性表皮松解症(DEB)。
本发明还提供根据本发明的外显子跳跃分子(比如AON)、或根据本发明的编码AON的载体(比如病毒载体)、或根据本发明的包含AON或编码AON的载体的组合物，其用作例如用于治疗DEB或更普遍的个体的与突变的COL7A1外显子80相关的疾病或病症(如上所述)的药物。
本发明还提供根据本发明的外显子跳跃分子(比如AON)、或根据本发明的编码AON的载体(比如病毒载体)、或根据本发明的包含AON或编码AON的载体的组合物用于制造药物的用途，该药物用于治疗DEB或更普遍的个体的与突变的COL7A1外显子80相关的疾病或病症(如上所述)。
本发明还提供用于对在其基因组中携带引起疾病或病症(包括DEB)的COL7A1基因的外显子80中的突变的哺乳动物(优选人类)进行治疗的方法，该方法包括向哺乳动物(人类)施用本发明的AON、(病毒)载体或药物组合物。这些患者可患有DEB或相关病症，或有发生DEB或相关病症的风险。相关病症、疾病或症况还涵盖例如皮肤癌(黑素瘤)或其他癌症，其可以作为由COL7A1基因外显子80的突变引起的或与之相关联的个体皮肤或其它器官中的胶原蛋白VII缺乏或异常的结果而出现。
本发明另外的实施方式是AON、编码AON的病毒载体和包含根据本发明的AON的药物组合物作为治疗在其基因组中携带COL7A1基因的外显子80中的突变的哺乳动物(优选人)的药物的用途。
通过口服、眼内、肺内、鼻内、肌肉内、皮下、皮内、直肠，通过吞咽、注射、吸入、输注、喷雾给药，可将本发明的外显子跳跃分子以(水性)溶液、悬浮液、(水包油)乳液、软膏、锭剂、丸剂等形式对患者进行全身、局部的给药。
根据本发明的一种优选的AON施用方法是通过能够释放AON的AON涂布的绷带的装置。尤其有利的是如WO2014/150074中公开的多层(逐层，LbL)涂布的绷带。以名称为MIT提交的国际专利申请公开了从用含有所述siRNA的多层膜涂布的粘性绷带中长时间有效地释放伤口愈合促进剂siRNA。可以与根据本发明的AON组合使用的合适的绷带是用于递送siRNA的合适的多层涂层也可与根据本发明的AON组合使用，包括含有逐层结构的可以使用除之外的其它能够释放核酸治疗剂的绷带。也可使用非粘性绷带，因为它们可能对患者而言疼痛更小，只要绷带与皮肤或伤口部位紧密接触即可。在WO2014/150074中描述了用于递送根据本发明的AON的含AON的LBL膜与绷带的组合。
根据施用途径和患者的需要，给药可以每天、每周、每月、每季度、每年一次。
由于疾病的早期发病，所以患有由COL7A1基因的突变的外显子80引起的或与之相关联的疾病、病症或病况(包括DEB)，或处于形成该疾病、病症或病况(包括DEB)风险的患者，可以在症状的发病之前或之后，在子宫内、直接在出生后、从1、2、3、6月龄、从1岁、从3岁、从5岁治疗，以缓解、减缓发展、停止或逆转疾病的症状等。
在根据本发明的用途或方法中的治疗是至少一周、至少一个月、至少若干月、至少一年、至少2、3、4、5、6年或长期地、甚至在患者整个生命期间。根据本发明使用的如本文所述的每种外显子跳跃分子或外显子跳跃寡核苷酸或其等同物可以适用于直接施用于已经受感染或处于形成与突变的COL7A1外显子80相关的病症、疾病或病况的风险的个体的体内细胞、组织和/或器官，并且可以直接在体内、离体或体外施用。本发明的AON、组合物、化合物或辅料化合物的施用频率可以取决于若干参数，比如患者的年龄、外显子跳跃分子的性质(例如，裸AON或载体化的AON，比如AAV或慢病毒载体表达的AON)、所述分子的剂量、剂型等。
优选地，根据本发明的外显子跳跃分子(优选寡核苷酸)的剂量范围是基于存在严格的方案要求的临床试验(体内使用)中的增加剂量研究来设计的。可以以0.0001mg/kg至100mg/kg，优选地0.01mg/kg至20mg/kg的剂量范围使用如本文所述的寡核苷酸。剂量和治疗方案可以变化很大，这取决于许多因素，包括但不限于施用途径(例如全身地与表面地)、寡核苷酸是作为裸AON还是作为载体化的AON施用、给药方案、患者的年龄和体重等。
在优选的实施方式中，根据本发明作为用于分子的递送工具的如本文较早描述的病毒载体(优选AAV载体)以每次注射1×109至1×1017个病毒颗粒、更优选每次注射1×1010至1×1014、并且最优选1×1010至1×1012个病毒颗粒的范围的剂量施用。
对于本发明所属领域的技术人员将显而易见的是，治疗细节将需要根据并取决于比如以下因素来建立：寡核苷酸的序列和化学性质、施用途径、剂型、剂量、给药方案、形式(病毒载体或裸寡核苷酸)、患者的年龄和体重、疾病阶段等，这可能需要进一步的非临床和临床研究。
本发明还提供用于防止或至少减少COL7A1外显子80包含到细胞中的方法，该方法包括使细胞(优选皮肤(真皮)细胞)与根据本发明的外显子跳跃分子比如裸AON或编码根据本发明的AON的(病毒)载体或根据本发明的组合物接触。优选地，该方面的特征是本文中较早定义的那些。
除非另有说明，否则本文所述的每个实施方式可与本文所述的另一个实施方式组合。
本发明涉及一种反义寡核苷酸，当通过从哺乳动物细胞中的前体mRNA剪接而产生人COL7A1 mRNA时，该反义寡核苷酸能够防止或减少外显子80包含到人COL7A1 mRNA中；其特征在于该寡核苷酸(a)包含与外显子80的一部分互补的核苷酸序列，以及(b)长度小于24个核苷酸。
在另一方面，本发明涉及一种反义寡核苷酸，当通过从哺乳动物细胞中的前体mRNA剪接而产生人COL7A1 mRNA时，该反义寡核苷酸能够防止或减少外显子80包含到人COL7A1 mRNA中；其特征在于该寡核苷酸包含与外显子80的3’部分和下游内含子的5’部分互补的核苷酸序列。优选地，所述寡核苷酸包含与SEQ ID NO：21互补的核苷酸序列。例如，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO：22(5’-UCACCACU-3’)、SEQ ID NO：23(5’-ACCACUGG-3’)和/或SEQ ID NO：24(5’-ACUCACCA-3’)。
在另一方面，本发明涉及一种反义寡核苷酸，当通过从哺乳动物细胞中的前体mRNA剪接而产生人COL7A1 mRNA时，该反义寡核苷酸能够防止或减少外显子80包含到人COL7A1 mRNA中；其特征在于该寡核苷酸包含SEQ ID NO：22(5’-UCACCACU-3’)、SEQ ID NO：23(5’-ACCACUGG-3’)和/或SEQ ID NO：24(5’-ACUCACCA-3’)。
优选地，根据本发明的寡核苷酸的长度小于24个核苷酸，在某些实施方式中，长度优选为20-23个核苷酸。因此，优选地，所述寡核苷酸的长度为20、21、22或23个核苷酸。
在优选的方面，该寡核苷酸选自AON80.1、AON80.2、AON80.3、AON80.5、AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.5.4、AON80.5.5、AON80.5.7和AON80.5.8。优选地，所述寡核苷酸选自：
(i)AON80.2和AON80.5；
(ii)AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.5.4和AON80.5.5；或者
(iii)AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.5.4、AON80.5.5、AON80.5.7和AON80.5.8。
在又一个优选的实施方式中，该寡核苷酸选自AON80.4、AON80.5、AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.5.4、AON80.5.5、AON80.5.7和AON80.5.8。
本发明还涉及一种反义寡核苷酸，当通过从哺乳动物细胞中的RNA转录物剪接而产生人COL7A1 mRNA时，该反义寡核苷酸能够防止或减少外显子80包含到人COL7A1 mRNA中，其特征在于所述反义寡核苷酸不与外显子80上游的内含子杂交。优选地，所述哺乳动物细胞是人类细胞。优选地，所述寡核苷酸的序列包含由AON80.3、AON80.4、AON80.5、AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.5.4、AON80.5.5、AON80.5.7、AON80.5.8和AON80.13组成的寡核苷酸序列。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种反义寡核苷酸，当通过从哺乳动物细胞中的RNA转录物剪接而产生人COL7A1 mRNA时，该反义寡核苷酸能够防止或减少外显子80包含到人COL7A1 mRNA中，其特征在于所述反义寡核苷酸与外显子80互补而不与其上游或下游内含子互补。在又一个实施方式中，本发明涉及一种反义寡核苷酸，当通过从哺乳动物细胞中的前体RNA剪接而产生人COL7A1 mRNA时，该反义寡核苷酸能够防止或减少外显子80包含到人COL7A1 mRNA中；其中该寡核苷酸包含与外显子80互补的区域，该互补的区域不延伸到外显子80侧翼的任何一个内含子中。在这样的实施方式中，该寡核苷酸优选为AON80.3或AON80.13。
本发明还涉及一种反义寡核苷酸，当通过从哺乳动物细胞中的RNA转录物剪接而产生人COL7A1 mRNA时，该反义寡核苷酸能够防止或减少外显子80包含到人COL7A1 mRNA中，其特征在于所述反义寡核苷酸包含与外显子80互补的区域且长度最多为20个核苷酸。优选地，所述寡核苷酸包含来自AON80.1、AON80.2、AON80.3、AON80.4、AON80.5、AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.3、AON80.5.4、AON80.5.5、AON80.5.7和AON80.5.8的寡核苷酸的序列。优选地，所述与外显子80互补的区域最多在9至17个核苷酸之间，如9、10、11、12、13、14、15、16或17个核苷酸。更优选地，当寡核苷酸具有与外显子80的直接下游的内含子互补的区域时，与外显子80互补的区域为9至14个核苷酸，如9、10、11、12、13或14个核苷酸。当与外显子80互补的部分最多为12个核苷酸时，则寡核苷酸优选选自AON80.1、AON80.4、AON80.5、AON80.5.3、AON80.5.4、AON80.5.5、AON80.5.7和AON80.5.8。在另一个优选的方面，该反义寡核苷酸包含(a)长度为至多20个核苷酸的与外显子80互补的区域和(b)与外显子80的上游或下游内含子中的RNA转录物互补的区域。甚至更优选地，该反义寡核苷酸包含与外显子80的下游内含子中的RNA转录物互补的部分。在一个实施方式中，该反义寡核苷酸包含与外显子80的一部分互补的部分，其由10个SEQ ID NO：18的3’一最末(most)核苷酸(即SEQ IDNO：18的核苷酸27-36)组成。在又一个实施方式中，与外显子80互补的部分由n个SEQ IDNO：18的3’最末核苷酸组成，其中n在9和20之间；如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或9个SEQ ID NO：18的3’-最末端核苷酸。在更优选的实施方式中，外显子80的部分由12个外显子80的3’-最末核苷酸(即SEQ ID NO：18的核苷酸25-36)组成。当寡核苷酸与外显子80的部分互补时，其序列的长度优选不超过24个核苷酸。
关于根据本发明的所有反义寡核苷酸，优选反义寡核苷酸是寡核糖核苷酸，更优选其中核苷间键经化学修饰，优选为硫代磷酸酯键。在又一个优选的方面，寡核苷酸的糖部分是低级2’-O-烷基取代的糖部分、优选2’-O-甲基取代的糖部分。
本发明还涉及一种寡核苷酸，其包含以下或由以下组成：(i)选自SEQ ID NO：4-17和25-32的核苷酸序列；(ii)选自SEQ ID NO：4-15和25-32的RNA核苷酸序列；或(iii)选自SEQ ID NO：4-15和25-32的DNA核苷酸序列，其中任意U由T替代。
本发明还涉及一种组合物，其包含根据本发明的寡核苷酸，任选地包含一种或多种载体、赋形剂、稳定剂、转染剂、稀释剂、胶凝剂或缓冲剂。优选地，所述组合物是用在人类治疗中、更优选用在营养不良型大疱性表皮松解症(DEB)的治疗中、甚至更优选用在患有由COL7A1基因的外显子80中的突变引起的DEB的人受试者的治疗中的药物组合物。在另一个实施方式中，本发明涉及用在患有由COL7A1基因中包含突变的外显子80引起的疾病的人受试者的治疗中的根据本发明的反义寡核苷酸。
本发明还涉及用于当通过从哺乳动物细胞、优选人类细胞中的RNA转录物剪接而产生人COL7A1 mRNA时，防止或减少外显子80包含到哺乳动物COL7A1 mRNA、优选人COL7A1mRNA中的方法；该方法包括以下步骤：在有利于细胞摄取寡核苷酸的条件下，向体外或离体的细胞、组织，或者向包含这种细胞的活的动物、包括人类提供根据权利要求1至27中任一项所述的反义寡核苷酸，或者根据权利要求29或权利要求30所述的组合物，并允许剪接发生。
当COL7A1基因在哺乳动物(优选人类)细胞中表达时，外显子跳跃分子比如根据本发明的AON或编码这样的AON的(病毒)载体防止或至少减少突变的COL7A1外显子80包含的能力，以及在生理条件下在影响5’剪切受体选择的区域中与哺乳动物(人类)COL7A1前体mRNA结合、并且从而减少突变的外显子80包含到COL7A1 mRNA中的能力，能够使用本文实验部分中公开的试验方便地进行评估。具体地，可将外显子跳跃分子与含有COL7A1基因的外显子80(不一定是突变的)的细胞一起温育，以例如通过RT-PCR评估其减少细胞形成包含外显子80的mRNA的能力(其能够使用生物分析仪设备进行量化)，如本文实验部分和实施例中所述。
如在本文的实验部分和实施例中可观察到的，在RNA水平，添加根据本发明的靶向COL7A1基因的外显子80的各种AON确实产生缺少外显子80的mRNA，导致产生较短但具功能性的胶原VII蛋白质。
在成纤维细胞(其可衍生自皮肤细胞)中大量表达胶原蛋白VII。因此，预期将AON添加到来自DEB患者的培养的成纤维细胞中将导致在蛋白质印迹上可检测到的缩短但具功能性的胶原VII蛋白质的量增加，并且因此将证明基于AON的疗法将不仅重定向COL7A1mRNA的剪切，而且也将导致恢复胶原蛋白VII功能性。
术语“腺嘌呤”、“鸟嘌呤”、“胞嘧啶”、“胸腺嘧啶”、“尿嘧啶”和次黄嘌呤(肌苷中的核碱基)是指核碱基本身。
术语腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷、尿苷和肌苷是指与(脱氧)核糖连接的核碱基。
术语“核苷”是指与(脱氧)核糖连接的核碱基。
在本文及其权利要求中，动词“包括(comprise)”及其变体在其非限制性意义上用于意指包括该词后面的项目，但不排除未特定提及的项目。此外，除非上下文明确要求存在一个且唯一的要素，否则由不定冠词“一”或“一个”对要素的引用不排除存在多于一个要素的可能性。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。
词“包括(include)”及其所有时态和变体应被看作“包括但不限于”。
词“外显子跳跃分子”旨在包括裸AON和能够在相容细胞中表达AON的载体化(包括病毒载体)的AON。
当词“约”或“大约”与数值相关联地使用(例如约10)时，优选地意指该值可以是给定值(10)加上或减去该值的5％。
如本文提供的序列信息不应被如此狭义地解释为需要包含错误鉴定的碱基。本领域技术人员能够鉴定此类错误鉴定的碱基，并且知晓如何改正此类错误。在序列错误的情况下，应以通过含有编码多肽的核酸序列的SEQ ID NO：1中存在的序列的表达可获得的多肽的序列为准。
实施例
实施例1：外显子80的mRNA分析
为了检测COL7A1 mRNA中外显子80的mRNA的存在，使用提取的HeLa细胞和原代人成纤维(HPF)细胞的总RNA。在(a)对HeLa而言补充有10％胎牛血清(FBS)的杜氏改良Eagle培养基(DMEM)中、或(b)对HPF细胞而言补充有20％FBS和1％丙酮酸钠的DMEM AQE中进行细胞培养。所有细胞在37℃5％的CO2下生长。为了测定AON的外显子跳跃效率，将细胞以60,000个细胞/孔(HeLa)接种到12孔板或以150.000个细胞/孔(LFB1)接种到6孔板中。在允许细胞生长24小时后，用100nm AON-maxPei复合物转染细胞。用ReliaPrepTM RNA细胞小量制备系统(Promega)进行RNA分离。随后使用Thermo Scientific Verso试剂盒制备cDNA。外显子80的PCR使用位于外显子77的FW引物(5’-CAAGGTCCCAAAGGAGACAG-3’；SEQ ID NO：16)和具有位于外显子84之内的序列5’-AGTCCCACAGCTCCAGTAGG-3’(SEQ ID NO：17)的RV引物、或具有位于外显子82/83边界处的序列5’-GAAGGGGGAGCCTGGAGA-3’(SEQ ID NO：33)的RV引物进行。使用DNA1000芯片借助生物分析仪对PCR产物进行可视化，并使用软件Expert 2100进行产物长度分析。初始寡核苷酸设计产生十二个寡核苷酸AON80.1至AON80.12，并且表1示出在人原代成纤维细胞(HPF)和HeLa细胞中这些AON中的每一个对外显子80的半定量跳跃效率。基于AON80.5 21聚体的进一步设计工作产生五种衍生物，分别命名为AON80.5.1至AON80.5.5(均为21聚体)。此外，在整个外显子80上设计36聚体寡核苷酸(AON80.13)。这些另外的AON的数据、以及本发明的优选AON(AON80.1-AON80.5和AON80.5.n系列，以及AON80.13)的核苷酸序列和SEQ ID NO也包括在表1中。在3个实验中测试两种20聚体寡核苷酸(AON80.5.7和AON80.5.8)。结果显示在表2中并显示可比较的结果。
表1：外显子80从mRNA排除的效率。细胞用100nM AON处理24小时。为了比较，使用来自WO2013/053819的ESE-80.3和ESE-80.3_Q2170X。数据表示为：-(无外显子80排除)，+(1-10％外显子排除)，++(11-20％外显子80排除)，+++(21-30％外显子80排除)等。
表2：外显子80从mRNA排除的效率。对于表1进行的三个独立实验显示平均结果，具有两个新的AON(AON80.5.7和AON80.5.8)，并与之前测试的AON进行比较(见上文)。数据如表1所示。
图2-5示出表1和2的AON的芯片实验室结果。根据本发明的命名为AON80.1至AON80.5的AON具有良好的效率，AON80.2、AON80.4和AON80.5表现更好。从进一步的设计工作来看，AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.7、AON80.5.8和AON80.13似乎具有所测试AON的最好的剪接效率。根据本发明的最优选的AON是AON80.5、AON80.5.1、AON80.5.2、AON80.5.7和AON80.5.8。
为了评估所有形成的产物的确切序列，进行序列分析。用生物分析仪分析后可见的额外产物包括mRNA中的内含子82(如测序分析所观察到的)。然而，如果将这个内含子翻译成蛋白质，那么将包含终止密码子，导致一个最有可能将被降解的截短的胶原蛋白。
为了评估AON的免疫原性效应，可以使用Invivogen的RAW-Blue细胞进行以下体外实验程序。这些RAW-Blue细胞源自鼠RAW 264.7巨噬细胞，并具有可由NF-κB和AP-1诱导的整合分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因构建体。所有TLR(除了TLR5)、NODI、NOD2、RIG-1、MDA或DECTIN-1激动剂的存在均诱导信号传导通路，导致NF-κB和AP-1活化并随后产生SEAP。可以检测SEAP的水平，从而表明免疫原性激活。图6示出体外刺激24小时后的这种测试的结果。阳性对照CpG-DNA、LPS和R848激活的NF-κB和/或AP-1。相比之下，与盐水处理的RAW-blue细胞相比，未观察到测试的AON的NF-κB和/或AP-1的活化，除了AON80.5.1以1μM的最终浓度诱导SEAP的微小增加之外，这可能暗示NF-κB和/或AP-1的活化。使用具有对SEAP(OD)测量进行多重比较的Holm-Sidak测试的单因素方差分析(One-Way ANOVA)，检测值与盐水进行比较。
使用RAW-Blue细胞测试24小时体外刺激期间的AON免疫毒性，寻找试卤灵水平的增加(这可以通过增加的增殖导致细胞数目增加和/或由于PPR激活而加速的细胞代谢来解释)。在用任何AON刺激后，没有观察到对细胞活力的影响(图7)。只有阳性对照CpG-DNA使合成的试卤灵的水平显著升高(但是使用LPS和R848不存在作用可能是由于使用旧批次)。使用具有对试卤灵测量进行多重比较的Holm-Sidak测试的单因素方差分析，将检测值与盐水进行比较。
功能性，例如不含外显子80的胶原蛋白VII的蛋白质稳定性和锚定纤维形成能够使用文献中描述的几种体外方法处理：
1.使用蛋白质印迹法的α1-胶原蛋白链的大小和正确组装的蛋白质分析(Titeux等人2010)。值得注意的是，由于跳跃的外显子的大小较小并且野生型蛋白质的大小很大，可能得不到蛋白质大小方面的明显差异。
2.通过在非还原条件下使用蛋白质印迹法的胶原蛋白VII同型三聚体的热稳定性分析。野生型胶原蛋白VII由三个α1-胶原蛋白链构成，并且Tm为41℃(Mecklenbeck，2002)。
3.使用胶体金或划痕RadiusTM 24孔细胞迁移试验的细胞迁移分析。比较表达野生型胶原蛋白VII相比于不含外显子80的截短蛋白的的成纤维细胞和/或角质形成细胞的运动性(Chen等人，2002)。或者比较在处理的突变人成纤维细胞培养基与未处理的突变人成纤维细胞培养基的存在下的角质形成细胞的运动性。
4.可评估对各种细胞外基质组分的细胞粘附性，例如对胶原蛋白IV、层粘连蛋白-332、层粘连蛋白-1或纤连蛋白的细胞粘附性(Chen等人2002)。
本发明的发明人假定在防止或至少减少外显子80包含到哺乳动物(优选人类)COL7A1 mRNA中的方面表现出最佳效果的AON将在如可容易地使用现有技术的上述方法评估的胶原蛋白VII功能性方面提供令人满意的结果。
应该理解的是，以上仅以举例的方式描述本发明，并且可以在保持本发明的范围和精神内做出修改。
参考文献列表
Chen et al.Nat Genet.2002，Dec；32(4)：670-5.Restoration of type VIIcollagen expression and function in dystrophic epidermolysis bullosa.
Chiorini JA，Kim F，Yang L and Koting RM.J.of Virology 1999 Feb；73(2)：1309-19.Cloning and characterization of adeno-associated virus type 5.
Dom A and Kippenberger.Mol Ther 2008.Feb；10(1)：10-20.Clinicalapplication of CpG-，non-CpG-，and antisense oligodeoxynucleotides asimmunomodulators.Curr opin.
Egholm M et al.Nature 1993.Oct 7；365(6446)：566-8.PNA hybridizes tocomplementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bondingrules.
Fine et al.，J.Am Acad Dermatol.2014.Jun；70(6)：1103-26.Inheritedepidermolysis bullosa：Updated recommendations on diagnosis andclassification.
Goto M et al.J.Invest Dermatol.2006.Dec；126(12)：2614-20.TargetedSkipping of a Single Exon Harboring a Premature Termination Codon Mutation：Implications and Potential for Gene Correction Therapy for SelectiveDystrophic Epidermolysis Bullosa Patients.
Govindaraju T and Kumar VA.Chem Commun(Camb)2005.Jan 28；(4)：495-7.Backbone-extended pyrrolidine peptide nucleic acids(bepPNA)：design，synthesis and DNA/RNA binding studies.
Keswani SG et al Wound Repair Regen.2012.Jul-Aug；20(4)：592-600.Pseudotyped adeno-associated viral vector tropism and transductionefficiencies in murine wound healing.
Mecklenbeck Hum Gen Ther.2002Sep 1；13(13)：1655-62.A microinjectedCOL7A1-PAC vector restores synthesis of intact procollagen VII in adystrophic epidermolysis bullosa keratinocyte cell line.
Nielsen PE et al.Science 1991.Dec 6；254(5037)：1497-500.Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide.
Titeux M.et al.Mol.Ther.2010.Aug；18(8)：1509-18SIN retroviral vectorsexpressing COL7A1 under human promoters for ex vivo gene therapy of recessivedystrophic epidermolysis bullosa.

Claims (16)

1.一种反义寡核苷酸(AON)，当通过从细胞中的前体mRNA剪接而产生人COL7A1 mRNA时，所述反义寡核苷酸(AON)能够防止或减少外显子80包含到所述人COL7A1 mRNA中，其特征在于所述AON包含以下核苷酸序列：
-其与外显子80的至少一部分互补，并且其不与COL7A1基因的外显子80的上游内含子互补；或者
-其与外显子80的至少一部分互补，并且长度小于24个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的AON，其中所述AON包含与外显子80互补的区域，其中所述互补的区域的长度至多为20个核苷酸，优选为11、12、13、14、15、16或17个核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的AON，其中所述AON包含与外显子80的3’部分和下游内含子的5’部分互补的核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的AON，其中所述AON包含核苷酸序列5’-UCACCACU-3’、5’-ACCACUGG-3’、或5’-ACUCACCA-3’。
5.根据权利要求4所述的AON，其中所述AON包含选自SEQ ID NO：7、8、25、26、28、31和32的核苷酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的AON，其中所述AON的长度小于24个核苷酸，优选包含20、21、22或23个核苷酸。
7.根据权利要求1或2所述的AON，其中所述AON包含SEQ ID NO：4或5的核苷酸序列。
8.根据权利要求1或2所述的AON，其中所述AON包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列。
9.根据权利要求1所述的AON，其中所述AON包含SEQ ID NO：30的核苷酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的AON，其中所述AON为寡核糖核苷酸。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的AON，其中核苷间键经化学修饰，优选为硫代磷酸酯键。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的AON，其中所述AON的糖部分为低级2’-O-烷基取代的糖部分，优选为2’-O-甲基取代的糖部分。
13.一种寡核苷酸，其包含以下或由以下组成：(i)选自SEQ ID NO：4-15和25-32的核苷酸序列；(ii)选自SEQ ID NO：4-15和25-32的RNA核苷酸序列；或者(iii)选自SEQ ID NO：4-15和25-32的DNA核苷酸序列，其中任何U由T所替代。
14.一种组合物，其包含根据权利要求1-13中任一项所述的寡核苷酸，以及一种或多种载体、赋形剂、稳定剂、转染剂、稀释剂、胶凝剂或缓冲剂。
15.根据权利要求14所述的组合物，其是用在人类治疗中的药物组合物。
16.一种用于当通过从人类细胞中的RNA转录物剪接而产生人COL7A1 mRNA时，防止或减少外显子80包含到所述人COL7A1 mRNA中的方法；所述方法包括以下步骤：在有利于细胞摄取寡核苷酸的条件下，向体外或离体的细胞、组织，或者向包含这种细胞的活的人类提供根据权利要求1-13中任一项所述的寡核苷酸、或者根据权利要求14或15所述的组合物，并允许剪接发生。
CN201680029306.7A 2015-05-21 2016-05-20 治疗营养不良型大疱性表皮松解症的反义寡核苷酸 Active CN107667174B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1508733.1A GB201508733D0 (en) 2015-05-21 2015-05-21 Antisense oligonucleotides
GB1508733.1 2015-05-21
GB1516505.3 2015-09-17
GBGB1516505.3A GB201516505D0 (en) 2015-09-17 2015-09-17 Antisense oligonucleotides
PCT/EP2016/061495 WO2016185041A1 (en) 2015-05-21 2016-05-20 Antisense oligonucleotides to treat dystrophic epidermolysis bullosa

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107667174A true CN107667174A (zh) 2018-02-06
CN107667174B CN107667174B (zh) 2021-10-26

Family

ID=56026883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680029306.7A Active CN107667174B (zh) 2015-05-21 2016-05-20 治疗营养不良型大疱性表皮松解症的反义寡核苷酸

Country Status (12)

Country Link
US (2) US10370660B2 (zh)
EP (1) EP3298144A1 (zh)
JP (2) JP6871175B2 (zh)
KR (1) KR20180012255A (zh)
CN (1) CN107667174B (zh)
AU (1) AU2016265457B2 (zh)
CA (1) CA2986642A1 (zh)
EA (1) EA036393B1 (zh)
HK (1) HK1245826A1 (zh)
IL (1) IL255180B2 (zh)
MX (1) MX2017014855A (zh)
WO (1) WO2016185041A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6871175B2 (ja) 2015-05-21 2021-05-12 ウィングス セラピューティクス，インコーポレイテッド ジストロフィー型表皮水疱症を処置するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド
WO2016196670A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense-induced exon exclusion in type vii collagen
GB201902735D0 (en) 2019-02-28 2019-04-17 Proqr Therapeutics Ii Bv Oligonucleotides for use in the treatment of dystrophic epidermolysis bullosa

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101448945A (zh) * 2006-05-19 2009-06-03 莱顿教学医院 用于诱导外显子跳跃的手段和方法
CN102256606A (zh) * 2007-10-26 2011-11-23 莱顿教学医院 有效跳跃人杜兴肌营养不良基因外显子43、46、50-53中至少一个的方法和手段
CN102695797A (zh) * 2009-06-16 2012-09-26 欧科库尔纳有限责任公司 通过抑制针对胶原基因的天然反义转录物来治疗胶原基因相关的疾病
WO2013053819A1 (en) * 2011-10-11 2013-04-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Exon skipping therapy for dystrophic epidermolysis bullosa

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5801154A (en) * 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5952221A (en) 1996-03-06 1999-09-14 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a first and second nucleic acid sequence
US20040023378A1 (en) * 2002-07-31 2004-02-05 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of KIAA1531 protein expression
US9463244B2 (en) 2013-03-15 2016-10-11 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for nucleic acid delivery
JP6871175B2 (ja) 2015-05-21 2021-05-12 ウィングス セラピューティクス，インコーポレイテッド ジストロフィー型表皮水疱症を処置するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド
WO2016196670A1 (en) * 2015-06-01 2016-12-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense-induced exon exclusion in type vii collagen
CA2989371C (en) 2015-06-15 2024-02-06 Anna-Lena SPETZ HOLMGREN Single-stranded oligonucleotides for use in the medical treatment of skin disorders

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101448945A (zh) * 2006-05-19 2009-06-03 莱顿教学医院 用于诱导外显子跳跃的手段和方法
CN102256606A (zh) * 2007-10-26 2011-11-23 莱顿教学医院 有效跳跃人杜兴肌营养不良基因外显子43、46、50-53中至少一个的方法和手段
CN102695797A (zh) * 2009-06-16 2012-09-26 欧科库尔纳有限责任公司 通过抑制针对胶原基因的天然反义转录物来治疗胶原基因相关的疾病
WO2013053819A1 (en) * 2011-10-11 2013-04-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Exon skipping therapy for dystrophic epidermolysis bullosa

Also Published As

Publication number Publication date
CA2986642A1 (en) 2016-11-24
US11104900B2 (en) 2021-08-31
HK1245826A1 (zh) 2018-08-31
EA201792406A1 (ru) 2018-04-30
AU2016265457B2 (en) 2022-06-09
US20200024601A1 (en) 2020-01-23
US20180245078A1 (en) 2018-08-30
IL255180B2 (en) 2023-11-01
EP3298144A1 (en) 2018-03-28
JP2021112197A (ja) 2021-08-05
IL255180B1 (en) 2023-07-01
NZ737592A (en) 2021-08-27
AU2016265457A1 (en) 2017-12-07
JP2018515122A (ja) 2018-06-14
CN107667174B (zh) 2021-10-26
US10370660B2 (en) 2019-08-06
MX2017014855A (es) 2018-04-20
KR20180012255A (ko) 2018-02-05
IL255180A0 (en) 2017-12-31
JP7188804B2 (ja) 2022-12-13
JP6871175B2 (ja) 2021-05-12
EA036393B1 (ru) 2020-11-05
WO2016185041A1 (en) 2016-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11920132B2 (en) Oligonucleotide therapy for Leber congenital amaurosis
JP7188810B2 (ja) 表皮水疱症治療のためのｃｏｌ７ａ１エクソン７３とマッチするオリゴヌクレオチド
CN109804069A (zh) 治疗眼部疾病的反义寡核苷酸
JP7188804B2 (ja) ジストロフィー型表皮水疱症を処置するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド
US20220127610A1 (en) Oligonucleotides for use in the treatment of dystrophic epidermolysis bullosa
NZ737592B2 (en) Antisense oligonucleotides to treat dystrophic epidermolysis bullosa
NZ736083B2 (en) Oligonucleotides matching col7a1 exon 73 for epidermolysis bullosa therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20190930

Address after: California, USA

Applicant after: Wing therapy Co., Ltd.

Address before: Leiden

Applicant before: ProQR Therapy for Listed Companies II

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant