CN109804069A - 治疗眼部疾病的反义寡核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学和免疫学领域。具体而言，本发明涉及可用于治疗、预防和/或延缓II型乌谢尔综合征和/或USH2A相关的非综合征性视网膜变性的新型反义寡核苷酸(AON)。
Description
发明领域
本发明涉及医学和免疫学领域。具体而言，本发明涉及用于治疗、预防和/或延缓眼部疾病、优选II型乌谢尔综合征(Usher syndrome)和/或USH2A相关的视网膜变性的单链反义寡核苷酸(AON)。
背景技术
乌谢尔综合征(USH或仅称“乌谢尔病”)和非综合征性视网膜色素变性(NSRP)是视网膜变性疾病。乌谢尔病在临床上和遗传学上有很多种类，迄今是人中最常见的遗传性盲聋的类型(6,000人中有1人；Kimberling等人.2010.Frequency of Usher syndrome intwo pediatric populations：implications for genetic screening of deaf and hardof hearing children(乌谢尔综合征在两种儿童群体中的频率：耳聋和弱听儿童遗传筛查的意义).Genet Med 12：512-516))。乌谢尔病患者的听觉障碍大多是稳定的、先天性的，可以通过助听器或人工耳蜗得到部分补偿。NSRP比乌谢尔病更加普遍，每4,000人中发生1例(Hartong等人.2006.Retinitis pigmentosa(视网膜色素变性).Lancet 368(9549)：1795-1809)。乌谢尔病和NSRP中感光细胞的退化是进行性的，常常在30-40岁之间导致完全失明，因此留有治疗干预的时间。
USH2A基因的突变是乌谢尔病最普遍的原因，其解释了多达50％的全球所有乌谢尔病患者(荷兰±1300名患者)，如McGee等人所指出(2010.Novel mutations in the longisoform of the USH2A gene in patients with Usher syndrome type II or non-syndromic retinitis pigmentosa(II型乌谢尔综合征或非综合征性视网膜色素变性患者中USH2A基因的长同种型中的新型突变).J Med Genet 47(7)：499-506)，也是美国最普遍的NSRP的原因，类似地解释了12-25％的全部视网膜色素变性病例(荷兰±600名患者)。突变遍及72个USH2A外显子及其侧翼的内含子(intronic)序列分布，由无义和错义突变、缺失、重复、大的重排和剪接变体组成。外显子13是迄今最频繁突变的外显子，其包括2个基础突变(USH2患者中的c.2299delG(p.E767SfsX21)和NSRP患者中的c.2276G＞T(p.C759F))。对于外显子50，已报道了15个致病性突变，其中至少8明显是蛋白质截短的。最近，报道了USH2A的内含子40中的首个深部内含子突变(c.7595-2144A＞G)(Vache等人.2012.Ushersyndrome type 2 caused by activation of an USH2A pseudo exon：implications fordiagnosis and therapy(USH2A伪外显子的激活导致的2型乌谢尔综合征：诊断和治疗意义).Human Mutation 33(1)：104-108)。该突变在内含子40中产生隐蔽的高质量剪接供体位点，导致在突变USH2A mRNA中包括152bp的异常外显子(伪外显子40或PE40)，并造成翻译的提前终止。
外显子13中发现的c.2299delG突变导致造成提前终止密码子的移码，并推测其导致无义介导的衰变。Lenassi等人(2014.The effect of the common c.2299delGmutation in USH2A on RNA splicing(USH2A中常见的突变对RNA剪接的影响).Exp EyeRes 122：9-12)表明，在乌谢尔病患者中，突变导致剪接过程中外显子12+外显子13的双跳读，而在一些患者中，发现外显子13单一跳读和外显子12/外显子13双跳读的组合。外显子序列的改变造成异常剪接并不常见。生物信息学工具已经预测c.2299delG变化会破坏外显子剪接增强子，并在外显子13内产生外显子剪接沉默基因。序列分析表明，仅使异常外显子13跳读，携带突变，导致移码突变的去除，但也导致外显子12和外显子14之间的框内连接。当外显子11与外显子14连接时，外显子12和外显子13的双跳读导致框外缺失。因此，尽管(在携带c.2299delG突变时)要求使外显子13跳读，优选外显子12得以保留。
很久以来乌谢尔病和其他视网膜营养性萎缩症被认为是无法治愈的疾病。若干使用基因增强疗法的I/II期临床试验在RPE65(Bainbridge等人.2008.Effect of genetherapy on visual function in Leber′s congenital amaurosis(基因疗法对莱伯氏先天性黑蒙症中视功能的影响).N Engl J Med 358，2231-2239)和MYO7A(Hashimoto等人.2007.Lentiviral gene replacement therapy of retinas in a mouse model forUsher syndrome type 1B(1B型乌谢尔综合征小鼠模型中视网膜的慢病毒基因替代疗法).Gene Ther 14(7)：584-594)基因中具有突变的LCA/RP/USH患者的选择组中已经取得富有前景的结果。不幸的是，由于目前许多可用载体(例如，腺相关病毒(AAV)和慢病毒载体)的货物大小有限，基因增强疗法受限于USH2A基因和mRNA的编码序列的大小(15,606bp)以及可变剪接。
尽管基于反义寡核苷酸(AON)的疗法具有广阔的临床前景，其并不常用于脊椎动物眼部。AON通常是能够干扰剪接的小多核苷酸分子(16-至25-聚体)，因为其序列与目标前mRNA分子互补。预期的机制是，当AON和与其互补的目标序列结合时，前mRNA内的目标区不再可用于剪接因子，这反过来导致目标外显子的跳读。在治疗上，该方法学可以以两种方式应用：a)再引导突变激活隐蔽剪接位点的基因的正常剪接；和b)以mRNA的读框保持完整并产生(部分)功能蛋白质的方式使携带突变的外显子跳读。两种方法均已成功应用于具有严重遗传病的患者(Scaffidi和Misteli.2005.Reversal of the cellular phenotype inthe premature aging disease Hutchinson-Gilford progeria syndrome(过早衰老的疾病Hutchinson-Gilford早衰综合征中细胞表型的逆转).Nat.Med 11(4)：440-445；Cirak等人.2011.Restoration of the Dystrophin-associated Glycoprotein Complex afterExon Skipping Therapy in Duchenne Muscular Dystrophy(杜氏肌营养不良症中外显子跳读疗法之后肌营养不良相关的糖蛋白复合物的恢复).Mol Ther 20：462-467；Cirak等人.2011.Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchennemuscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomertreatment：an open-label，phase 2，dose-escalation study(全身磷酸二酰胺吗啉代寡聚物治疗之后杜氏肌营养不良症患者中的外显子跳读和肌营养不良蛋白的恢复：公开标记试验，2阶段，剂量递增研究).Lancet 378(9791)：595-605；Goemans等人.2011.Systemicadministration of PRO051 in Duchenne′s muscular dystrophy(杜氏肌营养不良症中PRO051的全身给药).N Engl J Med 364(16)：1513-1522)。对于USH2A基因，72个所描述的外显子中有28个可以潜在地在不妨碍转录物整体读框的情况下得以跳读，包括外显子13的跳读(而外显子12得以保留)。
WO 2016/005514公开了用于USH2A前mRNA的外显子跳读AON，其用于外显子13、外显子50和PE40的跳读和/或保留外显子12。如其中所公开的，若干AON可以用于使外显子13跳读。因此，本发明的目的是提供可用于预防、治疗或延缓人USH2A基因外显子13中的突变导致的乌谢尔病和/或NSRP的方便的治疗策略的更加有效的替代AON。
发明内容
本发明涉及一种用于使人USH2A前mRNA中的外显子13跳读的反义寡核苷酸(AON)，其中AON在生理条件下与序列SEQ ID NO：12、13或14或其一部分结合和/或互补。本发明的AON对于外显子13跳读具有积极效果，而与表现出相对高水平外显子12/13双跳读的已知AON相比较，其产生较低量的其中外显子12和13共跳读(双跳读)的产物。优选地，本发明的AON包括序列SEQ ID NO：5、6或7或者由其组成。
本发明进一步涉及药物组合物，其包括根据本发明的AON，还包括药学可接受的载体。本发明还涉及用作药物、优选用于治疗、预防或延缓要求调节USH2A前mRNA的剪接的USH2A相关疾病或病状例如II型乌谢尔综合征的根据本发明的AON、根据本发明的药物组合物或者根据本发明的病毒载体。在再另一实施方式中，本发明涉及用于治疗对其有需求的个体的要求调节USH2A前mRNA剪接的USH2A相关疾病和病状的方法，所述方法包括使所述个体的细胞与根据本发明的AON、根据本发明的药物组合物或者根据本发明的病毒载体接触。
附图说明
图1显示外显子13的RNA序列加上其侧翼序列(黑体；方向是5′到3′)的一部分。上下游内含子序列为小写；外显子13编码序列为大写。在此显示的具有其侧翼序列的外显子的DNA序列提供为SEQ ID NO：1，而对应的前mRNA序列提供为SEQ ID NO：20。不带侧翼序列的外显子13的编码序列提供为SEQ ID NO：2，而对应的mRNA序列提供为SEQ ID NO：21。在此还显示了本文所述的AON的序列以及其相对于目标RNA序列的位置。在此均从3′到5′显示的AON1(SEQ ID NO：3)和AON2(SEQ ID NO：4)是从WO 2016/005514中已知的。另外在此从3′到5′显示的Ex13-1(SEQ ID NO：5)、Ex13-2(SEQ ID NO：6)、Ex13-3(SEQ ID NO：7)、Ex13-4(SEQ ID NO：8)和Ex13-5(SEQ ID NO：9)是本文公开的新的AON。
图2显示在Weri-Rb1细胞中使用AON1、AON2和Ex13-1至5的转染之后的外显子跳读结果。NT是指未转染。RT-PCR产物显示于右侧，其中每个框表示外显子的存在。
图3显示对于获自用5种不同的Ex13-3寡核苷酸裸处理(gymnotically treated)(无转染试剂)的Weri-Rb1细胞的RNA的ddPCR结果，上述寡核苷酸携带5个不同的对糖部分的化学修饰。表示出(在野生型未跳读的背景中)外显子13跳读的mRNA的百分比。
图4显示对于获自用不同浓度的Ex13-3寡核苷酸转染的Weri-Rb1细胞的RNA的ddPCR结果，上述寡核苷酸在糖部分上完全用2′-O-甲基修饰(Ex13-3 2′OMe；左侧)，或者在糖部分上完全用2′-O-甲氧基乙基修饰(Ex13-3 2′MOE；右侧)。
图5显示用Ex13-3寡核苷酸处理的视杯(optic cups)中的外显子跳读结果，上述寡核苷酸是完全2′-O-甲基修饰的，并含有完全硫代磷酸化的骨架。对照是从来自健康供体的成纤维细胞产生的视杯、以及来自未接受AON治疗的USH2A患者成纤维细胞的视杯。左侧和中间的小图中6个独立的条带显示的是分化2或3个月的未经处理的视杯(重复3次)的结果，如所示，右侧的小图中每个AON浓度3个独立的条带显示的是分化3个月、并与两种不同浓度Ex13-3 AON一起孵育1个月的经处理的视杯(重复3次)的结果。
图6显示产生自USH2患者的视杯中的外显子13跳读结果，其中视杯用4种不同浓度的Ex13-3 2′MOE寡核苷酸处理。对照是未经处理(NT)的视杯、或者用序列不相关、但在每个糖部分上都携带2′-O-甲氧基乙基修饰的对照寡核苷酸处理(ctrl)的视杯。
具体实施方式
本发明涉及能够阻止USH2A前mRNA中包括异常外显子13的特定反义寡核苷酸(AON)。更具体而言，本发明涉及用于使人USH2A前mRNA中的外显子13跳读的AON，其中AON在生理条件下与序列SEQ ID NO：12、13或14或其一部分结合和/或互补。本发明的发明人出人意料地发现，与现有技术中公开的已知单链AON相比较，当使用本发明的单链AON时，不希望发生的外显子12和13的双跳读(其导致异读框缺失)与外显子13单跳读(框内)相比较水平降低。本发明的目的是提供改善的替代单链AON，其与现有技术的AON所观察到的相反，给出显著的外显子13跳读，同时给予该AON导致外显子12/13双跳读降低。如本文所公开，本发明的发明人能够鉴别这些AON。
在一实施方式中，本发明涉及用于使人USH2A前mRNA中的外显子13跳读的反义寡核苷酸(AON)，其中AON包括序列SEQ ID NO：5、6或7或者由其组成。在优选的方面，所述AON是寡核糖核苷酸。在进一步优选的方面，根据本发明的AON包括2′-O烷基修饰，例如2′-O-甲基修饰的糖。在更优选的实施方式中，所述AON中的所有核苷酸均为2′-O-甲基修饰的。在另一优选的方面，本发明涉及包括2′-O-甲氧基乙基修饰的AON。在更优选的实施方式中，所述AON的所有核苷酸均携带2′-O-甲氧基乙基修饰。在再另一方面，本发明涉及AON，其中AON包括至少一个2′-O-甲基和至少一个2′-O-甲氧基乙基修饰。在另一优选实施方式中，根据本发明的AON具有至少一个硫代磷酸酯键。在另一优选方面，所有的顺次核苷酸(sequentialnucleotides)均通过硫代磷酸酯键互连。
在再另一方面，本发明涉及药物组合物，其包括根据本发明的AON和药学可接受的载体。优选地，所述药物组合物用于玻璃体内给药，并且以0.05mg-5mg总AON/眼的剂量范围给药。更优选地，药物组合物用于玻璃体内给药，并且以0.1-1mg总AON/眼的剂量范围给药，例如，大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mg总AON/眼。
在再另一实施方式中，本发明涉及表达根据本发明的AON的病毒载体。在再另一方面，本发明涉及用作药物的根据本发明的AON、根据本发明的药物组合物或者根据本发明的病毒载体。在再另一实施方式中，本发明涉及用于治疗、预防或延缓要求调节USH2A前mRNA的剪接的USH2A相关的疾病或病状、例如II型乌谢尔综合征的、根据本发明的AON、根据本发明的药物组合物或者根据本发明的病毒载体。
本发明还涉及根据本发明的AON、根据本发明的药物组合物或者根据本发明的病毒载体用于制备药物的用途。优选地，所述药物用于治疗、预防或延缓要求调节USH2A前mRNA的剪接的USH2A相关的疾病或病状，例如用于治疗、预防或延缓II型乌谢尔综合征。在再另一方面，本发明涉及根据本发明的AON、根据本发明的药物组合物或者根据本发明的病毒载体用于治疗、预防或延缓要求调节USH2A前mRNA的剪接的USH2A相关的疾病或病状的用途，例如用于治疗、预防或延缓II型乌谢尔综合征的用途。
本发明还涉及调节细胞中USH2A前mRNA的剪接的方法，所述方法包括使所述细胞与根据本发明的AON、根据本发明的药物组合物或者根据本发明的病毒载体接触。在优选的实施方式中，本发明涉及治疗对其有需求的个体的要求调节USH2A前mRNA的剪接的USH2A相关的疾病或病状的方法，所述方法包括使所述个体的细胞与根据本发明的AON、根据本发明的药物组合物或者根据本发明的病毒载体接触。
在本发明所有实施方式中，术语“调节剪接”和“外显子跳读”是同义词。就USH2A而言，“调节剪接”或“外显子跳读”应当理解成异常外显子13的排除。此外，优选当外显子13跳读时，提供有外显子12的保留。出于本发明的目的，术语“异常外显子13”或“异常USH2A外显子13”视为是同义词，并且视为是指在USH2A基因的外显子13中存在突变，其中突变导致疾病。
术语“外显子跳读”在本文中定义为诱导、产生或增加细胞内成熟mRNA的产生，上述成熟mRNA不包含在没有外显子跳读的情况下本可以存在于成熟mRNA中的特定外显子(在当前的情形中为USH2A基因的外显子13)。通过将表达所述成熟mRNA的前mRNA的细胞与能够干扰使剪接的酶过程得以进行所要求的序列例如(隐蔽)剪接供体或(隐蔽)剪接受体序列的分子一起提供，或者与能够干扰将一段核苷酸识别成包括在成熟mRNA中的外显子所要求的外显子包含信号(exon inclusion signal)的分子一起提供，实现外显子跳读；这些分子在本文中称作“外显子跳读分子”、“外显子13跳读分子”或“外显子跳读AON”。术语“前mRNA”是指通过例如细胞核中的转录由细胞的DNA模板合成的未加工或部分加工的前体mRNA。
术语“外显子保留”在本文中定义为诱导、产生或增加细胞内成熟mRNA的产生，上述成熟mRNA保留有应当优选地存在于成熟mRNA中的特定外显子。在当前的情形中应当保留的外显子是USH2A基因的外显子12。通过将表达所述成熟mRNA的前mRNA的细胞与能够干扰例如内含子12中的内含子剪接沉默基因位点的序列的AON一起提供，实现外显子保留；这些AON也可以称作是外显子保留AON。最优选的AON是强烈诱导外显子13跳读(已在乌谢尔病中观察到的现象)、而同时不产生过多外显子12共跳读的寡核苷酸。外显子13应当尽可能地跳读，而外显子12应当尽可能地保留。
术语“反义寡核苷酸”(AON)应理解成是指基本上与前mRNA分子、hnRNA(异源核RNA)或mRNA分子中的目标核苷酸序列互补的核苷酸序列。反义序列互补(或基本上互补)的程度优选地使得包括反义序列的分子可以在生理条件下与RNA分子中的目标核苷酸序列形成稳定的双链杂交物。术语“反义寡核苷酸”、“寡核苷酸”和“寡聚物”在本文中可互换使用，应理解成是指包括相对于目标序列的反义序列的寡核苷酸。
在本文件及其权利要求中，动词“包括”及其连词以其非限定性的意义使用，是指该措辞后的条目包括在内，但也不排除未具体提及的条目。此外，除非上下文明确要求有且只有一个元素(element)，用不定冠词“一”(“a”或“an”)表示的元素并不排除存在有一个以上元素的可能性。因此不定冠词“一”通常是指“至少一个”。与数值(例如，约10)结合使用时，措辞“大约”或“约”优选地是指数值可以比指定数值(10)大或小该数值的0.1％。
在一实施方式中，在此定义的外显子13跳读分子是与指定序列结合和/或互补的AON。优选在异常USH2A外显子13的情形中，与指定目标序列之一的结合可以经由技术人员已知的技术来评价。优选的技术是EP1619249中所述的凝胶迁移率变动分析。在优选的实施方式中，只要在凝胶迁移率变动分析中检测到所述分子与标记目标序列的结合，则称外显子13跳读AON与指定序列之一结合。
在本发明所有实施方式中，外显子13跳读分子优选为AON。优选地，根据本发明的外显子13跳读AON是与SEQ ID NO：12、13或14所示的核苷酸序列互补或基本上互补的AON。
在本发明的上下文中使用的术语“基本上互补”表示在反义序列中允许有一些错配，只要功能性即诱导异常USH2A外显子13的跳读和外显子12的保留仍可接受即可。优选地，互补性为90％至100％。通常，在20个核苷酸的AON中允许有1或2个错配，在40个核苷酸的AON中允许有1、2、3或4个错配，或者在60个核苷酸的AON中允许有1、2、3、4、5或6个错配，等等。
本发明提供了设计能够诱导异常USH2A外显子13跳读的外显子13跳读AON的方法。首先，选择所述AON，使其与外显子13结合和/或互补，其有可能具有侧翼的内含子序列段，如SEQ ID NO：1所示(对于RNA，参见SEQ ID NO：20)。随后，在优选的方法中，为了设计和进一步改进所述的外显子跳读AON，要考虑到以下方面中的至少一个：外显子跳读AON优选地不含有CpG或一段CpG；外显子跳读AON具有可接受的RNA结合动力学和/或热力学性质。在AON中存在CpG或一段CpG通常与所述AON的免疫原性增加有关(Dorn和Kippenberger(2008)Curr Opin Mol Ther 10(1)10-20)。这种免疫原性的增加是不希望发生的，因为它可以诱导要治疗的组织即眼的损伤。免疫原性可以在动物模型中通过评价CD4+和/或CD8+细胞和/或炎性单核细胞浸润的存在来评价。通过使用技术人员已知的标准免疫检验来检测中和抗体和/或识别所述AON的抗体的存在，也可以在正在用本发明的AON治疗的动物或人的血液中评价免疫原性。通过使用标准免疫检验来检测中和抗体或识别所述AON的抗体的存在或量的增加，可以对炎症反应、I型样干扰素的产生、IL-12的产生和/或免疫原性的增加进行评价。
本发明允许设计RNA结合动力学和/或热力学性质可接受的AON。RNA结合动力学和/或热力学性质至少部分地通过AON的熔点(Tm；对于单链RNA，使用基本Tm和最邻近的模型，用寡核苷酸性质计算器计算(www.unc.edu/-cail/biotool/oligo/index))和/或AON-目标外显子复合物的自由能(使用RNA structure 4.5版本)加以确定。如果Tm太高，预期AON特异性较低。可接受的Tm和自由能取决于AON的序列。因此，对于每个这些参数，难以给出优选的范围。可接受的Tm范围可以为35-70℃，可接受的自由能范围可以为15-45kcal/mol。
本发明的AON优选是能够表现出可接受的功能活性水平的AON。所述AON的功能活性优选在某一可接受的水平上诱导异常USH2A外显子13的跳读加上外显子12的保留，以提供给个体功能性USH2A蛋白质和/或mRNA和/或至少部分地降低异常USH2A蛋白质和/或mRNA的产生。在优选的实施方式中，与未用AON或用阴性对照AON处理过的对照RNA产物相比较，当通过实时定量RT-PCR分析测量的异常USH2A外显子13跳读百分比为至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％时，AON被称为诱导异常USH2A外显子13的跳读。本发明的目的是提供诱导外显子13跳读而外显子12和13共跳读(双跳读)的产物量降低的AON。因此，AON应当使得双跳读尽可能地受限制，同时诱导外显子13单跳读。与直至本发明在本领域观察到的相比较，本发明的AON表现出外显子13单跳读的增加和外显子12/13双跳读的降低。测定外显子跳读和/或外显子保留的检验在本文实施例中加以说明，并可以补充以本领域技术人员已知的技术，以判断与已知AON相比较时，是否在确定外显子12/13双跳读降低的同时发现外显子13单跳读的增加。
优选地，包括与USH2A的SEQ ID NO：1(或作为RNA的SEQ ID NO：20)所示核苷酸序列互补或基本上互补的序列的AON，使得(基本上)互补的部分是根据本发明的AON的长度的至少50％，更优选至少60％、再更优选至少70％、再更优选至少80％、再更优选至少90％、或再更优选至少95％、或再更优选98％或再更优选至少99％、或再更优选100％。优选地，根据本发明的AON包括与SEQ ID NO：2(或实际上其RNA等同物，如SEQ ID NO：21所示)的一部分、更优选与SEQ ID NO：12、13或14互补的序列或者由其组成。
在另一优选实施方式中，所述AON的所述互补部分的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、115、120、125、130、135、140、141、142或143个核苷酸。可以使用额外的侧翼序列，以修饰蛋白质与AON的结合，或者修饰AON的热力学性质，更优选地，修饰目标RNA结合亲和力。
因此，并不绝对要求互补区中的所有碱基都能够与相对链中的碱基配对。例如，当设计AON时，可以想要并入例如与互补链上的碱基并不碱基配对的残基。如果在细胞的情形中核苷酸段足以能够与互补部分杂交，可以允许在一定程度上的错配。在该背景下，“足以”优选是指使用EP1619249的实施例1中所述的凝胶迁移率变动分析，能检测到AON的结合。
任选地，所述AON可以通过转染到患者的视网膜细胞中加以进一步测试。可以通过RT-PCR(例如，如EP1619249和WO 2016/005514中所述)来评价目标外显子13的跳读和/或外显子12的保留。互补区优选地设计成在组合时它们对前mRNA中的外显子具有特异性。这种特异性可以用不同长度的互补区产生，其取决于系统中其他(前)mRNA分子中实际序列。随着AON大小的增加，AON还能够与一种或多种其他前mRNA分子杂交的风险降低。在本发明中可以使用在互补区中包括错配、但保留与前mRNA中的目标区杂交和/或结合的能力的AON，这一点是清楚的。但是，优选地，至少互补部分不包括这种错配，因为比起在一个或多个互补区中具有这种错配的AON，在互补部分缺乏错配的AON通常具有更高的效率和更高的特异性。据信，较高的杂交强度(即，增加与相对链的相互作用的数量)有利于增加干扰系统剪接机制的过程的效率。优选地，互补性为90％至100％。通常，在20个核苷酸的AON中允许有1或2个错配，在40个核苷酸的AON中允许有1、2、3或4个错配，或者在60个核苷酸的AON中允许有1、2、3、4、5或6个错配，等等。
本发明的外显子跳读AON优选在不存在其(目标)配对序列的情况下是分离的单链分子。本发明的外显子跳读AON优选地与选自SEQ ID NO：12、13或14的序列互补或者在生理条件下结合，最优选地，与序列SEQ ID NO：14互补或者在生理条件下结合。
本发明的优选外显子13跳读AON包括8-143个核苷酸、更优选10-40个核苷酸、更优选12-30个核苷酸、更优选20-30个核苷酸或者由其组成，并优选地包括11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、115、120、125、130、135、140、141、142或143个核苷酸或者由其组成。
在某些实施方式中，本发明提供选自SEQ ID NO：5、6或7的外显子13跳读AON。在优选的实施方式中，本发明提供包括SEQ ID NO：7中提供的序列或者优选地由其组成的外显子13跳读AON。经发现，该分子在异常USH2A外显子13的剪接的调节中非常有效，而同时，其表现出比现有技术的AON更好地非常有效地导致外显子12的保留。也可以说，本发明的AON在导致外显子12/13双跳读中不太有效，但在导致“外显子13单”跳读中非常有效。本发明的这种优选的外显子13跳读AON(不导致太多、或水平大为降低的外显子12/13双跳读)、例如SEQ ID NO：7所示的外显子13跳读AON优选地包括21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、115、120、125、130、135、140、141、142或143个核苷酸。
根据本发明的外显子13跳读AON可以含有一个或多个RNA残基或者一个或多个DNA残基和/或一个或多个核苷酸类似物或等同物，如下文中所进一步详述。优选地，本发明的外显子13跳读AON包括一个或多个修饰成增加核酸酶抗性和/或增加AON对于目标序列的亲和力的残基。因此，在优选的实施方式中，AON序列包括至少一个核苷酸类似物或等同物，其中核苷酸类似物或等同物定义为具有修饰的碱基和/或修饰的骨架和/或非天然核苷间键或这些修饰的组合的残基。
在优选的实施方式中，核苷酸类似物或等同物包括修饰的骨架。这些骨架的例子提供有吗啉骨架、氨基甲酸酯骨架、硅氧烷骨架、硫化物、亚砜和砜骨架、甲酰基和硫代甲酰基骨架、亚甲基甲酰基骨架、核糖酰基(riboacetyl)骨架、含有亚烷基的骨架、氨基磺酸、磺酸和磺酰胺骨架、亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架以及酰胺骨架。二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(phosphorodiamidate morpholino oligomers)是之前作为反义药剂考察的修饰骨架寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸具有不带电的骨架，其中DNA的脱氧核糖被六元环取代，磷酸二酯键被二氨基磷酸酯(phosphorodiamidate)键取代。吗啉代寡核苷酸耐受酶分解，似乎通过阻止翻译或干扰前mRNA剪接而不是通过激活RNA酶H作为反义药剂发挥作用。吗啉代寡核苷酸已通过物理破坏细胞膜的方法成功递送至组织培养细胞，一项对若干这些方法进行比较的研究发现，划痕负载(scrape loading)是最有效的递送方法；但是，由于吗啉代骨架不带电，阳离子脂质不是细胞中吗啉代寡核苷酸摄取的有效介导物。最近的报道说明了吗啉代寡核苷酸的三联体(triplex)形成，由于非离子型骨架，这些研究表明，吗啉代寡核苷酸能够在不存在镁的情况下形成三联体。
进一步优选地，骨架中残基之间的连接部分(linkage)不包括磷原子，例如，通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的连接部分。
优选的核苷酸类似物或等同物包括肽核酸(PNA)，其具有修饰的聚酰胺骨架(Nielsen等人.(1991)Science 254，1497-1500)。就碱基对识别而言，基于PNA的分子是DNA分子的真实模拟物。PNA的骨架由通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成，其中核酸碱基通过亚甲基羰基键连接在骨架上。另外可选的骨架包括一碳(one-carbon)延长的吡咯烷PNA单体(Govindaraju和Kumar(2005)Chem Commun 495-497)。由于PNA分子的骨架不含带电的磷酸基团，PNA-RNA杂化物通常分别比RNA-RNA或RNA-DNA杂化物更加稳定(Egholm等人.(1993)Nature 365：566-568)。进一步优选的骨架包括吗啉代核苷酸类似物或等同物，其中核糖或脱氧核糖被6元吗啉代环取代。最优选的核苷酸类似物或等同物包括二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)，其中核糖或脱氧核糖被6-元吗啉代环取代，相邻吗啉代环之间的阴离子磷酸二酯键被非离子型二氨基磷酸酯键取代。
在再进一步的实施方式中，本发明的核苷酸类似物或等同物包括磷酸二酯键中非桥接氧中的一个的取代。这种修饰使碱基配对稍不稳定，但增加了对核酸酶分解的显著抗性。优选的核苷酸类似物或等同物包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、H-膦酸酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3′-亚烷基磷酸酯、5′-亚烷基磷酸和手性磷酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)(包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基磷酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯或硼代磷酸酯(boranophosphate)。
本发明进一步优选的核苷酸类似物或等同物包括一个或多个例如在2′、3′和/或5′位上被以下基团单取代或二取代的糖部分：-OH；-F；取代或未取代的线性或支链低级(C1-C10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基，其可以被一个或多个杂原子中断；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；O-、S-或N-烯丙基；O-烷基-O-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基；甲氧基乙氧基；二甲基氨基氧代乙氧基；和-二甲基氨基乙氧基乙氧基。糖部分可以是吡喃糖或其衍生物或者脱氧吡喃糖或其衍生物，优选核糖或其衍生物或者脱氧核糖或其衍生物。优选的衍生化糖部分包括锁核酸(LNA)，其中2′-碳原子与糖环的3′或4′碳原子连接，从而形成二环糖部分。优选的LNA包括2′-O，4′-C-亚乙基-桥接核酸(Morita等人.2001.Nucleic Acid Res Supplement No.1：241-242)。这些取代使核苷酸类似物或等同物具有RNA酶H和核酸酶抗性，并增加了对于目标RNA的亲和力。
在另一实施方式中，本发明的核苷酸类似物或等同物包括一个或多个碱基修饰或取代。修饰的碱基包括合成的和天然的碱基，例如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤和其他本领域已知或将会已知的嘧啶和嘌呤碱基的-氮杂、去氮杂、-羟基、-卤代、-硫代、硫醇、-烷基、-烯烃、-炔基、-硫代烷基衍生物。
技术人员应当理解到，AON中的所有位置没有必要被均匀地修饰。此外，一个以上的前述类似物或等同物包含于单一AON中，甚至包含于AON内的单一位置上。在某些实施方式中，本发明的AON具有至少两种不同类型的类似物或等同物。根据本发明优选的外显子跳读AON包括2′-O烷基硫代磷酸化反义寡核苷酸，例如2′-O-甲基修饰核糖(RNA)、2′-O-乙基修饰核糖、2′-O-丙基修饰核糖和/或这些修饰物的取代衍生物例如卤代衍生物。根据本发明的有效AON包括具有(优选地全部)硫代磷酸化骨架的2′-O-甲基核糖。
本领域技术人员还应当理解到，可以将不同的AON组合，以有效地使异常USH2A外显子13跳读。在优选的实施方式中，本发明的方法中使用至少两种AON的组合，例如2、3、4或5种不同AON。因此，本发明还涉及AON组，其包括至少一种根据本发明的AON，任选地还包括本文公开的或现有技术中公开的AON，例如WO 2016/005514中公开的AON4a，其看来是在外显子12保留方面性能更佳者之一。
如上文详述，外显子13中突变的存在会诱导外显子13的跳读和外显子12的共跳读。现有技术表明，使用导致外显子13跳读的AON(在某一水平上)伴随着不希望发生的外显子12跳读。因此，优选地，使用在保留外显子12的同时产生有效外显子13跳读的AON。最优选地，单一AON一方面提供适当的外显子13跳读，另一方面保留外显子12。如图2中可以看出，使用现有技术的AON时，比起外显子13单跳读，产生水平显著更高的外显子12/13双跳读(参见谱带强度)。优选地，使用与外显子12/13双跳读相比较至少产生同样多外显子13单跳读的AON，其为大约50/50。图2说明，本发明的AON能够给出至少50/50的比例，而相对于外显子12/13双跳读，Ex13-3在给出单一的外显子13的跳读中甚至更加有效。本领域技术人员可以使用常见的定量PCR技术测定该比例，本发明提供了至少一种比例测定方法，如本文实施例中所示。在此指出，本文称作Ex13-1(SEQ ID NO：5)、Ex13-2(SEQ ID NO：6)和Ex13-3(SEQID NO：7)的AON，或者至少一种与SEQ ID NO：12、13或14结合和/或互补的AON，满足具有至少50/50的比例的要求(外显子13单跳读/外显子12/13双跳读)。本发明的AON优于现有技术的AON。
AON可以与提高AON在细胞、优选视网膜细胞中摄取的部分连接。这些部分的例子为胆固醇、碳水化合物、维生素、生物素、脂质、磷脂、细胞穿透肽(包括但不限于触角足肽(antennapedia)、TAT、转运素(transportan))和带正电的氨基酸(例如寡精氨酸、聚精氨酸、寡赖氨酸或聚赖氨酸)、例如抗体所提供的抗原结合结构域、抗体Fab片段或者单链抗原结合结构域例如骆驼样(cameloid)单结构域抗原结合结构域。
根据本发明的外显子13跳读AON可以使用本领域已知的任何适当的方式间接给药。例如，可以将其以表达载体的形式提供给个体或者所述个体的细胞、组织或器官，其中表达载体编码包括所述寡核苷酸的转录物。优选地将表达载体经由基因递送载体引入到细胞、组织、器官或个体中。在优选的实施方式中，提供基于病毒的表达载体，其包括驱动本文所识别AON的表达或转录的表达组件(cassette)或转录组件。因此，本发明提供当置于表达外显子跳读AON的诱导性条件下时表达根据本发明的外显子13跳读AON的病毒载体。通过源自质粒的AON表达或者由基于腺病毒或腺相关病毒的载体提供的病毒表达，可以提供给细胞能够干扰导致USH2A异常外显子13高效跳读的基本序列的外显子跳读分子。表达可以由聚合酶II-启动子(Pol II)例如U7启动子或聚合物III(Pol III)启动子例如U6RNA启动子驱动。优选的递送载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体(AAV)，或者逆转录病毒载体，例如慢病毒载体等。另外，可以适当地应用可用于人细胞基因组中的目标同源重组和整合的质粒、人工染色体、质粒，用于递送本文定义的寡核苷酸。本发明优选那些转录由Pol III启动子驱动和/或转录物是与U1或U7转录物的融合物的形式的载体，其对于递送小转录物产生良好的结果。设计合适的转录物是本领域技术人员能力范围内的。优选Pol III驱动的转录物，优选为与U1或U7转录物的融合转录物的形式。这样的融合物可以如所述来产生(Gorman等人.1998.Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7small nuclear RNAs(前mRNA剪接模式通过修饰的U7小分子核RNA的稳定变更).Proc NatlAcad Sci U S A 95(9)：4929-34；Suter等人.1999.Double-target antisense U7 snRNAspromote efficient skipping of an aberrant exon in three human beta-thalassemic mutations(双靶标反义U7snRNA在3种人β-地中海贫血突变中促进异常外显子的有效跳读).Hum Mol Genet 8(13)：2415-23)。
外显子13跳读AON可以同样地加以递送。但是，外显子13跳读AON也可以通过病毒载体编码。典型地，这是以RNA转录物的形式，该转录物在转录物的一部分中包括根据本发明的寡核苷酸序列。根据本发明的AAV载体是重组AAV载体，其是指包括AAV基因组一部分的AAV载体，上述基因组包括壳体化在如本文别处所述的源自AAV血清型的衣壳蛋白的蛋白质壳中的根据本发明的编码的外显子13跳读AON。AAV基因组的一部分可以含有源自腺相关病毒血清型的反向末端重复序列(ITR)，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9等。由衣壳蛋白构成的蛋白质壳可以源自AAV血清型，例如AAV1、2、3、4、5、8、9等。蛋白质壳也可以称作是衣壳蛋白壳。AAV载体可以缺失一个或优选地全部的野生型AAV基因，但可以仍包括功能性ITR核酸序列。功能性ITR序列是AAV病毒粒子的复制、补救和包装所必需的。ITR序列可以是野生型序列，或者与野生型序列的序列同一性可以为至少80％、85％、90％、95或100％，或者可以通过例如核苷酸的插入、突变、缺失或置换而变更，只要其保留功能性即可。在该背景下，功能性是指引导基因组包装到衣壳的壳中、然后允许在要转染的宿主细胞或目标细胞中表达的能力。在本发明的背景下，衣壳蛋白的壳可以具有与AAV载体基因组ITR不同的血清型。因此，根据本发明的AAV载体可以由包括一种AAV血清型例如AAV血清型2的衣壳蛋白(VP1、VP2和/或VP3)的衣壳蛋白壳、例如二十面体衣壳组成，而该AAV5中含有的ITR序列可以是上述的任意AAV血清型，包括AAV2载体。因此“AAV2载体”包括AAV血清型2的衣壳蛋白壳，同时，例如，“AAV5”包括AAV血清型5衣壳蛋白壳，从而任一者均可以将根据本发明的任意AAV载体基因组ITR衣壳化。优选地，根据本发明的重组AAV载体包括AAV血清型2、5、8或AAV血清型9的衣壳蛋白壳，其中所述AAV载体中存在的AAV基因组或ITR源自AAV血清型2、5、8或AAV血清型9；这样的AAV载体被称作是AAV2/2、AAV 2/5、AAV2/8、AAV2/9、AAV5/2、AAV5/5、AAV5/8、AAV 5/9、AAV8/2、AAV 8/5、AAV8/8、AAV8/9、AAV9/2、AAV9/5、AAV9/8或AAV9/9载体。
更优选地，根据本发明的重组AAV载体包括AAV血清型2的衣壳蛋白壳，所述载体中存在的AAV基因组或ITR源自AAV血清型5；这样的载体称作是AAV 2/5载体。更优选地，根据本发明的重组AAV载体包括AAV血清型2的衣壳蛋白壳，所述载体中存在的AAV基因组或ITR源自AAV血清型8；这样的载体称作是AAV 2/8载体。更优选地，根据本发明的重组AAV载体包括AAV血清型2的衣壳蛋白壳，所述载体中存在的AAV基因组或ITR源自AAV血清型9；这样的载体称作是AAV 2/9载体。更优选地，根据本发明的重组AAV载体包括AAV血清型2的衣壳蛋白壳，所述载体中存在的AAV基因组或ITR源自AAV血清型2；这样的载体称作是AAV 2/2载体。所选择的的核酸序列表示的编码根据本发明的外显子13跳读AON的核酸分子优选地插入在上文识别的AAV基因组或ITR序列之间，例如，包括与编码序列和3′端序列可操作连接的表达调节元件的表达构建物。“AAV辅助功能”通常是指AAV复制和反过来提供至AAV载体的包装所要求的相应AAV功能。AAV载体功能补充AAV载体中缺少的AAV功能，但其缺少AAVITR(其由AAV载体基因组提供)。AAV辅助功能包括AAV的2种主要ORF，即，rep编码区和cap编码区或其功能上基本上等同的序列。Rep和Cap区是本领域公知的。AAV辅助功能可以在AAV辅助构建物(其可以是质粒)上提供。
将辅助构建物引入到宿主细胞中可以在引入本文识别的AAV载体中存在的AAV基因组之前或与其同时，通过例如转化、转染或转导来进行。因此，本发明的AAV辅助构建物可以选择成其产生所需的以下组合：一方面是AAV载体的衣壳蛋白的血清型，另一方面是所述AAV载体复制和包装中存在的AAV基因组的血清型。“AAV辅助病毒”提供AAV复制和包装所要求的额外功能。
合适的AAV辅助病毒包括腺病毒、单纯疱疹病毒(例如1型和2型HSV)和牛痘病毒。辅助病毒提供的额外功能也可以经由载体引入到宿主细胞中，如US 6,531,456中所述，在此将其并入作为参考。优选地，根据本发明的重组AAV载体中存在的AAV基因组并不包括任何编码病毒蛋白质的核苷酸序列，例如AAV的rep(复制)或cap(衣壳)基因。AAV基因组还可以包括标记基因或报告基因，例如，本领域已知的例如编码抗生素抗性基因、荧光蛋白(例如，gfp)的基因或编码化学、酶法或其他方式可检测和/或可选择的产物(例如，lacZ、aph等)的基因。优选地，根据本发明的AAV载体根据本文实施例中的方法构建并产生。根据本发明优选的AAV载体是表达根据本发明的USH2A外显子13跳读AON的AAV载体，优选AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9或AAV2/2载体，上述根据本发明的USH2A外显子13跳读AON包括与SEQ IDNO：12、13或14所示的核苷酸序列互补或基本上互补的序列，或者优选地由其组成。根据本发明进一步优选的AAV载体是表达包括SEQ ID NO：5、6或7或者优选由其组成的根据本发明的外显子13跳读AON的AAV载体，优选AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9或AAV2/2载体。
考虑到迄今已经取得的进展，预期有提供给个体或所述个体的细胞、组织、器官根据本发明的外显子13跳读AON的方法改进。这种未来的改进当然可以结合起来，以实现使用本发明的方法重构(restructuring)mRNA的所述效果。根据本发明的外显子13跳读AON可以原样递送至个体或所述给体的细胞、组织或器官。当给予根据本发明的外显子13跳读AON时，优选地，将AON溶解在与递送方法相容的溶液中。通过提供水溶液中的质粒，可以提供给视网膜或内耳细胞用于AON表达的质粒。另外可选地，优选地用于AON或用于AON表达的质粒的递送方法是病毒载体或纳米颗粒。优选地，将病毒载体或纳米颗粒递送至视网膜或内耳细胞。递送至视网膜或内耳细胞或其他相关细胞的这种递送可以是体内的、体外的或离体的。可以用于体内AON递送的纳米颗粒或微颗粒是本领域公知的。另外可选地，通过使用已知的转染试剂进行转染，可以提供质粒。对于静脉内、皮下、肌内、鞘内和/或心室内(intraventricular)给药，优选地，溶液是生理盐水溶液。在本发明中，特别优选使用将有助于将本文定义的各个组分递送至细胞和/或细胞内(优选视网膜细胞)的赋形剂或转染试剂。优选能够形成复合物、纳米颗粒、胶束、囊泡和/或脂质体的赋形剂或转染试剂，其递送通过细胞膜复合或捕获在囊泡或脂质体中的本文定义的各个组分。这些赋形剂中有许多都是本领域已知的。合适的赋形剂或转染试剂包括聚乙烯亚胺(PEI；ExGen500(MBIFermentas))，LipofectAMINETM 2000(Invitrogen)或其衍生物或者类似的阳离子聚合物，其包括聚丙烯亚胺或聚乙烯亚胺共聚物(PEC)及其衍生物，合成的两亲分子(SAINT-18)，lipofectinTM、DOTAP和/或病毒衣壳蛋白，其能够自组装到可以将本文定义的各个组分递送至细胞、优选视网膜细胞的颗粒中。这些赋形剂已经显示出有效地将AON递送至许多种培养的细胞，包括视网膜细胞。其高转染潜力得以与就整体细胞存活率而言预期为低到中等的毒性相结合。易于结构修饰可以用来允许其进一步的修饰和对其进一步(体内)核酸转移特性和毒性的分析。Lipofectin代表着脂质体转染剂的例子。它由两种脂质组分——阳离子脂质N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)(cp.DOTAP，其为硫酸甲酯盐)和中性脂质二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)组成。中性组分介导细胞内释放。另一类递送系统是聚合纳米颗粒。可以将公知为DNA转染试剂的聚阳离子例如二乙基氨基乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖与氰基丙烯酸丁酯(PBCA)和氰基丙烯酸己酯(PHCA)组合，以配制可以将AON跨细胞膜递送到细胞中的阳离子纳米颗粒。除这些常用的纳米颗粒材料以外，阳离子肽精蛋白也提供了配制具有胶体的寡核苷酸的可选方法。这种胶体纳米颗粒系统可以形成所谓的proticles，其可以通过简单的自组装过程制备，以包装AON并介导其细胞内释放。技术人员可以选择并调整任何上述或其他市售的可选赋形剂和递送系统，以包装并递送用于本发明的外显子跳读分子，将其释放用于预防、治疗或延缓USH2A相关的疾病或病状。“预防、治疗或延缓USH2A相关的疾病或病状”在本文中优选地定义为预防、延缓、终止视力损害或失明的发展或者部分或完全地逆转视力损害或失明，以及预防、延缓、终止基因中的遗传缺陷造成的听觉障碍或耳聋的发展或者部分或完全地逆转听觉障碍或耳聋。
此外，根据本发明的外显子13跳读AON可以与特异性设计成有助于摄取到细胞、细胞质和/或其核内的靶向配体共价或非共价连接。这些配体可以包括(i)识别有助于细胞摄取的细胞、组织或器官特异性元件的化合物(包括但不限于肽(样)结构)和/或(ii)有助于摄取到细胞中和/或寡核苷酸从囊泡例如核内体或溶酶体的细胞内释放的化合物。因此，在优选的实施方式中，将根据本发明的外显子13跳读AON配制在组合物或药物或组合物中，其至少提供有赋形剂和/或用于递送的靶向配体和/或将其递送至细胞和/或提高其细胞内释放的递送装置。
应当理解到，如果组合物包括额外的组分，例如本文中稍后定义的辅助化合物，组合物的各个组分可以不配制在一个单一的组合或组合物或制剂中。取决于其特性，本领域技术人员将会知晓，对于本文定义的各个组分，哪种类型的制剂是最适当的。在优选的实施方式中，本发明提供形式为包括根据本发明的外显子13跳读AON和本文稍后定义的其他辅助化合物的多个部件的套装(kit)的组合物或制剂。如果要求，可以通过加入药学可接受的递送载体(carrier)，将根据本发明的外显子13跳读AON或者表达根据本发明的外显子13跳读AON的载体、优选病毒载体合并成药物活性组合物。因此，本发明还提供组合物，优选药物组合物，其包括根据本发明的外显子13跳读AON或根据本发明的病毒载体以及药学可接受的赋形剂。这些组合物可以包括单一的根据本发明的外显子13跳读AON或病毒载体，但也可以包括多种不同的根据本发明的外显子13跳读AON或病毒载体。这些药物组合物可以包括任何要学可接受的赋形剂，其包括递送载体、填料、防腐剂、佐剂、增溶剂和/或稀释剂。例如，这些药学可接受的递送载体、填料、防腐剂、佐剂、增溶剂和/或稀释剂可见于Remington(Remington.2000.The Science and Practice Of Pharmacy，20th Edition.Baltimore，MD：Lippincott Williams Wilkins)。所述组合物的各个特征之前已在此加以定义。
优选的给药路径是通过水溶液或用于眼内给药的专门调整的制剂的玻璃体内注射。EP2425814公开了肽或核酸药物的专门调整用于眼内(玻璃体内)给药的水包油乳液。这种乳液不如玻璃体液致密，使得乳液浮在玻璃体顶部上，避免注射的药物损伤视力。
如果使用多种不同的根据本发明的外显子13跳读AON，本文定义的浓度或剂量可以是指所用所有AON的总的浓度或剂量，或者使用或加入的各个外显子13跳读AON的浓度或剂量。因此，在一实施方式中，提供组合物，其中使用的根据本发明的外显子13跳读AON各自或总的量的剂量为范围0.01-20mg/kg、优选0.05-20mg/kg的量。合适的玻璃体内剂量可以为0.05mg-5mg、优选0.1-1mg/眼，例如每眼：0.1、0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9或1.0mg。
根据本发明优选的USH2A外显子13跳读AON用于治疗个体的USH2A相关的疾病或病状。在本发明所有实施方式中，术语“治疗”应理解成也包括预防和/或延缓USH2A相关的疾病或病状。可以使用根据本发明的外显子13跳读AON治疗的个体可以已经诊断为具有USH2A相关的疾病或病状。另外可选地，可以使用根据本发明的外显子13跳读AON治疗的个体可以尚未诊断为具有USH2A相关的疾病或病状，但可以是鉴于其遗传背景未来发展USH2A相关疾病或病状的风险增加的个体。优选的个体是人的个体。在优选的实施方式中，USH2A相关的疾病或病状是II型乌谢尔综合征。因此，本发明进一步提供用作用于治疗要求调节USH2A的剪接的USH2A相关疾病或病状的药物以及用作用于预防、治疗或延缓USH2A相关疾病或病状的药物的根据本发明的外显子13跳读AON或者根据本发明的病毒载体或者根据本发明的组合物。优选的USH2A相关的疾病或病状是II型乌谢尔综合征。所述用途的各个特征之前已在此加以定义。
本发明进一步提供根据本发明的外显子13跳读AON或根据本发明的病毒载体或根据本发明的组合物用于治疗要求调节USH2A的剪接的USH2A相关疾病或病状的用途。在优选的实施方式中，优选的USH2A相关的疾病或病状是II型乌谢尔综合征。
本发明进一步提供根据本发明的外显子13跳读AON或根据本发明的病毒载体或根据本发明的组合物用于制备药物的用途，其用于制备用于治疗要求调节USH2A的剪接的USH2A相关疾病或病状的药物，以及用于制备用于预防、治疗或延缓USH2A相关疾病或病状的药物。优选的USH2A相关的疾病或病状是II型乌谢尔综合征。因此，在进一步的方面，提供在此定义的外显子13跳读AON、病毒载体或组合物用于制备药物的用途，其用于制备用于治疗要求调节USH2A的剪接的病状的药物以及用于制备用于预防、治疗或延缓USH2A相关疾病或病状的药物。优选的USH2A相关的疾病或病状是II型乌谢尔综合征。所述用途的各个特征之前已在此加以定义。
在根据本发明的用途或方法中的治疗为至少一次、持续1周、一个月、数月、1、2、3、4、5、6年或更久例如终身。用于根据本发明的用途的本文定义的每个外显子13跳读AON或其等同物可以适合于直接在体内给予已经受USH2A相关疾病或病状侵袭或者处于发展该疾病或病状的风险中的个体的细胞、组织和/或器官，并且可以在体内、离体或在体外直接给药。根据本发明的AON、组合物、化合物或辅助化合物的给药频率可以取决于若干因素，例如疾病的严重程度、患者年龄、患者的突变、外显子130跳读AON的数量(即剂量)、所述AON的剂型、给药路径等。频率可以在每日、每周、2周或3周或4周或5周或更长时间至少一次之间变化。根据本发明的外显子13跳读AON的剂量范围优选地基于存在严格方案要求的临床试验(体内使用)中的剂量增加研究而设计。本文定义的外显子13跳读AON可以以0.01-20mg/kg、优选0.05-20mg/kg的剂量范围使用。适当的玻璃体内剂量可以为0.05mg-5mg、优选0.1-1mg/眼，例如，大约每眼：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mg。在优选的实施方式中，使用0.1nM至1μM的本文定义的AON的浓度范围。优选地，该范围用于在细胞模型例如视网膜细胞或视网膜组织中的体外使用。更优选地，使用的浓度范围为1-400nM，再更优选10-200nM，再更优选50-100nM。若果使用若干种AON，该浓度或剂量可以是指AON的总浓度或剂量或者各种所加入的AON的浓度或剂量。在优选的实施方式中，作为根据本发明的分子的递送载体(delivery vehicle)的上文所述的病毒载体、优选AAV载体以1x109至1x1017病毒颗粒/注射、更优选1x1010至1x1012病毒颗粒/注射的剂量范围给予。以上给出的AON的浓度或剂量范围是用于体内、体外或离体使用的优选浓度或剂量。本领域技术人员将会理解到，取决于使用的AON、要治疗的目标细胞、基因靶标及其表达水平、使用的培养基及转染和孵育条件，使用的AON的浓度或剂量可以进一步变化，并可以需要加以任意的进一步优化。
用于根据本发明的用途的根据本发明的外显子13跳读AON或者根据本发明的病毒载体或者根据本发明的组合物可以适合于对已经受USH2A相关疾病或病状侵袭或者处于发展该疾病或病状的风险中的个体的体内的细胞、组织和/或器官给予，并且可以在体内、离体或在体外给予。根据本发明的所述外显子13跳读AON或者根据本发明的病毒载体或者根据本发明的组合物可以直接或间接地对已经受USH2A相关疾病或病状侵袭或者处于发展该疾病或病状的风险中的个体的体内的细胞、组织和/或器官给予，并且可以直接或间接地在体内、离体或在体外给予。由于II型乌谢尔综合征在视网膜和内耳细胞中具有明显的表型，优选地，所述细胞是视网膜或内耳细胞，进一步优选地，所述组织是视网膜或内耳，和/或进一步优选地，所述器官是眼睛或耳朵。
本发明进一步提供调节细胞中USH2A的剪接的方法，其包括使细胞、优选视网膜细胞与根据本发明的外显子13跳读AON或者根据本发明的病毒载体或者根据本发明的组合物接触。该方面的特征优选地是本文中之前所定义者。使细胞与根据本发明的外显子13跳读AON或者根据本发明的病毒载体或者根据本发明的组合物接触可以使用本领域技术人员已知的方法进行。包括使用本文所述的递送外显子13跳读AON、病毒载体和组合物的方法。接触可以直接或间接进行，可以在体内、离体或在体外进行。
本发明进一步提供用于治疗对其有需求的个体要求调节USH2A的剪接的USH2A相关疾病或病状的方法，所述方法包括使所述个体的细胞、优选视网膜细胞与根据本发明的外显子13跳读AON或者根据本发明的病毒载体或者根据本发明的组合物接触。该方面的特征优选地是本文中之前所定义者。使细胞、优选视网膜细胞与根据本发明的外显子13跳读AON或者根据本发明的病毒载体或者根据本发明的组合物接触可以使用本领域技术人员已知的方法进行。包括使用本文所述的递送AON、病毒载体和组合物的方法。接触可以直接或间接进行，可以在体内、离体或在体外进行。除非另外指出，本文所述的各个实施方式可以与本文所述的另一实施方式相组合。
本文提供的序列信息不应当严格地理解成要求包括错误识别的碱基。技术人员能够识别这些错误识别的碱基，并知晓如何改正这些错误。本说明书中引用的所有专利和文献参考文献均全文并入作为参考。
实施例
实施例1.提供和测试用于在人USH2A前mRNA中使外显子13有效跳读的可选的反义寡核苷酸(AON)
进一步分析人USH2A基因的外显子13的序列中外显子间接增强基序的存在。最初确定多个位点(参见图1)，随后自IDT购入5种RNA AON(Ex13-1至Ex13-5)，并设计成Tm 58℃。最初，将所有AON在糖链上用2′-O-甲基修饰，所有均具有完全硫代磷酸化的骨架。AON保持溶解在磷酸盐缓冲盐水中。
培养条件、转染、RT-PCR和分析方案如WO 2016/005514中所述，并使用本领域技术人员已知的通常方法。将人视网膜母细胞瘤细胞(Weri-Rb1)在含有10％(v/v)胎牛血清(Sigma)、1％10U/μl青霉素、10μg/μl链霉素(Gibco)和1％GlutaMAX(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中以0.5x106细胞/ml的密度培养。细胞一周传代2次。
首先，测试AON1、AON2和Ex13-1至Ex13-5反义寡核苷酸使外显子13从USH2A前mRNA跳读的能力。在转染之前，将1.0x106Weri-Rb1细胞在总体积0.9ml的Optimem中接种在6孔板的每孔中。通过将以所需浓度补充有1μl AON的50μl Optimem与补充有1.25μlLipofectamine 2000(Invitrogen)的50μl Optimem合并，制备转染混合物。将两种混合物均在RT下孵育5分钟，该孵育步骤之后，将两种混合物彻底混合在一起，并在RT下再孵育20分钟，然后加入到细胞中。转染之后48小时，收集细胞，并用1 x PBS洗涤，然后直接进行RNA分离。使用Nucleospin RNA II分离试剂盒(Machery Nagel)根据制造商的方案从转染的细胞中分离总RNA。随后，使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)将1μg总RNA用于cDNA合成。每个PCR反应均使用5％的cDNA。一部分USH2A cDNA在标准PCR条件下使用正向引物(在本文中提供为SEQ ID NO：10)和反向引物(在本文中提供为SEQ ID NO：11)扩增，上述引物分别位于人USH2A基因的外显子11和外显子15中。将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上分离。从凝胶上切下推测表示正确和异常剪接的USH2A的条带，使用Nucleospin Extract II分离试剂盒提纯，并用ABIPRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing V2.0 Ready Reaction试剂盒和ABIPRISM 3730 DNA分析仪(Applied Biosystems)对两个链进行测序确认。
RT-PCR分析显示了Weri-Rb1细胞中USH2A mRNA的表达，并表明AON1的转染导致单一外显子13的跳读以及外显子12/13的双跳读(WO 2016/005514中的图5)。本文公开的新的AON的目的是考察寡核苷酸是否可以更加有效地保留外显子12，同时外显子13单跳读产物增加。使用位于外显子11中的正向引物和位于外显子15中的反向引物，对RT产物进行分析，并表明这样确实是可能的。图2显示了使用AON1和AON2作为对照并使用Ex13-1至Ex13-5作为新识别的AON的结果。清楚地，AON2主要诱导外显子12和外显子13的双跳读，几乎没有任何外显子13单跳读的信号。出人意料地，比起AON1和Ex13-4，Ex13-1、Ex13-2和Ex13-3似乎给出更强的单(外显子13)跳读的信号，而该信号在Ex13-5的情况下几乎不存在。用Ex13-3转染之后，非剪接产物(凝胶中更高处)似乎几乎不存在。另外，比起单(外显子13)跳读，使用Ex13-3之后双外显子12/13跳读的信号强度更低，表明相对于已知的AON有着强烈的改善。
实施例2.使用具有不同化学修饰的AON的Weri-Rb1细胞中的外显子13跳读
培养条件、转染、RT-PCR和分析方案如WO 2016/005514中所述，并如上文实施例1中所述。孵育之前，将1.0x106Weri-Rb1细胞接种在6孔板的每孔中。将细胞用合成和分离的寡核苷酸裸(gymnotically)孵育(因此，没有转染试剂)，上述寡核苷酸具有Ex13-3序列(SEQ ID NO：7)，但携带5中不同类型的化学修饰方式(购自LGD Biosearch)：
Ex13-3 2′OMe(或Ex13-3 OMe)＝所有糖实体中的2′-O-甲基修饰，用“m”(小写)表示，完全硫代磷酸化的骨架用星号(*)表示：
5′-mA*mG*mC*mU*mU*mC*mG*mG*mA*mG*mA*mA*mA*mU*mU*mU*mA*mA*mA*mU*mC-3′
Ex13-3 2′MOE(或Ex13-3 MOE)＝所有糖实体中的2′-O-甲氧基乙基修饰，用“M”(大写)表示，完全硫代磷酸化的骨架用星号(*)表示；所有2′-O-甲氧基乙基修饰的U′实际上是5-甲基尿苷(＝m5U或胸苷)，所有2′-O-甲氧基乙基修饰的C实际上是5-甲基胞嘧啶(m5C)：
5′-MA*MG*MC*MU*MU*MC*MG*MG*MA*MG*MA*MA*MA*MU*MU*MU*MA*MA*MA*MU*MC-3′
Ex13-3 MOE OMe＝糖实体中的2′-O-甲氧基乙基修饰或2′-O-甲基修饰，分别用“M”(大写)和“m”(小写)表示，完全硫代磷酸化的骨架用星号(*)表示；所有2′-O-甲氧基乙基修饰的U′实际上是5-甲基尿苷(＝m5U或胸苷)，所有2′-O-甲氧基乙基修饰的C′实际上是5-甲基胞嘧啶(m5C)：
5′-MA*MG*MC*MU*MU*mC*mG*mG*mA*mG*mA*mA*mA*mU*mU*mU*MA*MA*MA*MU*MC-3′
Ex13-3 8PS＝所有糖实体中的2′-O-甲基修饰用“m”(小写)表示，骨架中的8个硫代磷酸键(每个末端4个)用星号(*)表示：
5′-mA*mG*mC*mU*mUmCmGmGmAmGmAmAmAmUmUmUmA*mA*mA*mU*mC-3′
Ex13-3 11 PS＝所有糖实体中的2′-O-甲基修饰用“m”(小写)表示，分布在骨架中的11个硫代磷酸键用星号(*)表示：
5′-mA*mG*mC*mUmU*mCmG*mGmAmGmAmA*mAmU*mUmU*mAmA*mA*mU*mC-3′
将AON在两种不同的浓度下与细胞一起孵育48h：5和10μM。对照AON含有完全硫代磷酸化的骨架，并在每个糖实体上均含有2′-O-甲基修饰。对照AON具有以下序列：5′-GGAUAGGUAUGAGAUAC-3′(SEQ ID NO：22)，并以10μM的浓度使用。孵育之后，收集细胞，用1 xPBS洗涤，然后直接进行RNA分离。总RNA如实施例1中所述分离。多重液滴数字PCR(ddPCR)反应用两种Taqman基因表达检验进行，以对总USH2A表达进行定量(Applied Biosystems，#Hs01071797_m1)，并用对USH2A(Applied Biosystems，#Hs01071800_m1)mRNA中的百分比外显子13跳读进行定量的检验进行。使用正向引物(在文本中提供为SEQ ID NO：17)、反向引物(在文本中提供为SEQ ID NO：18)和位于人USH2A基因的外显子13和14中的6-fiuorescein amidite(6-FAM)标记探针(在文本中提供为SEQ ID NO：19)测定USH2A mRNA中的外显子13跳读。使用制造商的方案使用探针用supermix(无dUTP；Bio-Rad，#186-3025)制备ddPCR混合物。ddPCR检验在Qx2000液滴数字PCR系统(Bio-Rad)上进行。分析用QuantaLife软件(Bio-Rad)和Microsoft Excel进行。使用总USH2A mRNA水平校正野生型和外显子13跳读的USH2A mRNA的水平。图3显示了用携带上文概述的不同化学修饰的Ex13-3寡核苷酸得到的结果。很明显地看到，在不使用转染试剂的这些条件下，单独使用或者与2′-O-甲基(2′-OMe)修饰结合使用的2′-O-甲氧基乙基(2′-O-MOE；或2′-MOE＝2′-甲氧基乙氧基)修饰要优于单独的2′-OMe修饰，或者优于8PS或11PS修饰。因此，根据本发明的AON优选地在糖实体中携带至少一个具有2′-O-MOE修饰的核苷酸，或者是完全2′-O-MOE修饰的。在这些裸条件下，实现了多达5％的外显子跳读。
然后将完全2′-O-甲基和完全2′-O-甲氧基乙基Ex13-3形式在剂量反应实验中进行测试，但现在使用转染试剂，并再次在Weri-Rb1细胞上进行。实验如实施例1中所述进行，使用乱序(scrambled)(Scr)形式的Ex13-3 AON作为对照，ddPCR分析如上所述，并再次用于测定外显子13跳读的mRNA的百分比。测试10、25、50、100和200nM转染的AON的浓度。仅在200nM的最高浓度下使用对照AON。结果显示于图4，其清楚地表明当使用浓度增加的AON时外显子跳读效果增加，而且清楚地显示了2′-O-甲氧基乙基修饰相对于在糖实体上仅携带2′-O-甲基修饰的AON的优异效果。
实施例3.AON在由USH2A患者成纤维细胞产生的视杯中诱导外显子13跳读
来自复合杂合地携带USH2A c.7595-2144A＞G(p.Lys2532Thrfs*56)和c.2299delG(p.Glu767Serfs)两种突变的USH2患者的成纤维细胞和来自健康供体的成纤维细胞用于视杯的生成。使用表达Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的慢病毒通过Radboud UMC干细胞技术中心对来自这些个体的成纤维细胞重组(reprogrammed)(Okita等人.2011.A moreefficient method to generate integration-free human iPS cells(更有效的产生无整合人iPS细胞的方法).Nat Methods 8：409-412)。简言之，在饲养细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)上产生诱导的多能干细胞(iPSC)系，随后在Essential 8培养基(LifeTechnologies；cat#A1517001)中保持。将3个克隆在传代～6代时冷冻保存，并通过免疫细胞化学进一步分析以下多能干细胞标记物的表达：SSEA-4、NANOG、TRA1-81和OCT3/4。此外，在如实施例1中所述地进行总RNA分离之后，对于多能标记物LIN28、NANOG、OCT3/4和SOX2进行qPCR分析。然后，挑取iPSC克隆，并用mTeSR1培养基在悬浮液中培养，以诱导团聚体的形成。将团聚体逐渐转换成神经诱导培养基。7天之后，将团聚体接种在覆盖Matrigel的培养皿上，每日更换培养基。在4周的分化中，将马蹄形NR区域用尖头钨针手动分离，并在悬浮液中培养2或3个月，其逐渐形成三维视杯(具体参见Zhong等人.2014.Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptor from human iPSCs(用来自人iPSC的功能性光受体产生三维视网膜组织).Nat Comm 5：4047)。
成功产生源自iPSC的视杯之后(3个月分化之后)，将其用完全2′-O-甲基修饰并含有完全硫代磷酸化骨架的Ex13-3寡核苷酸处理。处理以两种不同的浓度持续1个月：2μM和10μM，其通过每隔一天更新含有AON的培养基进行。进行USH2A转录物的分析，以用位于侧翼外显子11和15中的引物确定成熟mRNA中的野生型与外显子13-跳读水平。图5显示这些分析的结果(视杯的产生重复3次，每个条带表示1个视杯)。未经处理的视杯展示1239bp的野生型条带。将视杯用2μM或10μM Ex13-3处理产生597bp的没有外显子13的条带。在来自健康供体的视杯以及来自患者的视杯中偶尔产生401bp的条带(表示外显子12和外显子13的双跳读)。
在随后的实验中，如上文所述，由以纯合性具有USH2A c.2299delG(p.Glu767Serfs)突变的USH2患者的成纤维细胞产生视杯，不同之处在于挑取iPSC克隆，并培养，形成胚状体(如Sangermano等人.2016.Ophthalmology 123(6)：1375-85所述)。简言之，将胚状体逐渐转换成分化培养基。7天之后，将胚状体接种在覆盖Matrigel的培养皿上，每日更换培养基，以形成视杯。
成功产生视杯以后，通过每隔一天更新含有AON的培养基，将上述视杯用Ex13-32′MOE反义寡核苷酸(参见实施例2)以1μM、2μM、5μM和10μM的浓度处理。作为对照，使用具有完全硫代磷酸化、并且还确实在每个糖部分上携带2′-O-甲氧基乙基修饰的AON，其具有以下序列：5′-CCUCUUACCUCAGUUACA-3′(SEQ ID NO：23)。在该对照AON中，所有2′-O-甲氧基乙基修饰的U′实际上是5-甲基尿苷(＝m5U或胸苷)，所有2′-O-甲氧基乙基修饰的C′实际上是5-甲基胞嘧啶(m5C)。
然后使用USH2A转录物分析测定mRNA中的野生型与外显子-13跳读水平。如实施例2中所示进行多重ddPCR反应。使用总USH2A mRNA水平校正野生型和外显子13 USH2A mRNA的水平。图6显示在视杯上用Ex13-3 2′MOE寡核苷酸得到的ddPCR结果。可以清楚地看到，在不使用转染试剂的这些裸条件下，单独使用的2′-O-甲氧基乙基修饰在USH2A mRNA中有效地诱导外显子13跳读。因此，根据本发明的AON优选地在糖部分中携带至少一个具有2′-O-MOE修饰的核苷酸，或者，在另一优选实施方式中，是完全2′-O-MOE修饰的。
这些数据令人信服地说明，在体外眼模型中在不使用转染试剂的情况下用外显子跳读诱导AON处理，导致USH2A-患者材料中USH2A前mRNA中显著的外显子13的跳读。
Claims (20)
1.一种用于使人USH2A前mRNA中的外显子13跳读的反义寡核苷酸(AON)，其中所述AON在生理条件下与序列SEQ ID NO：12、13或14或其一部分结合和/或互补。
2.一种用于使人USH2A前mRNA中的外显子13跳读的AON，其中所述AON包括序列SEQ IDNO：5、6或7或者由其组成。
3.根据权利要求1或2所述的AON，其中所述AON是寡核糖核苷酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的AON，其中所述AON包括2′-O烷基修饰，例如2′-O-甲基修饰的糖。
5.根据权利要求4所述的AON，其中所述AON中的所有核苷酸均为2′-O-甲基修饰的。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的AON，其中所述AON包括2′-O-甲氧基乙基修饰。
7.根据权利要求6所述的AON，其中所述AON的所有核苷酸均携带2′-O-甲氧基乙基修饰。
8.根据权利要求4或6所述的AON，其中所述AON是包括2′-O-甲基和2′-O-甲氧基乙基修饰的寡核糖核苷酸。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的AON，其中所述AON具有至少一个硫代磷酸酯键。
10.根据权利要求9所述的AON，其中所有的顺次核苷酸均通过硫代磷酸酯键互连。
11.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-10中任一项所述的AON和药学可接受的载体。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于玻璃体内给药，并且以0.05mg-5mg总AON/眼的剂量范围给药。
13.根据权利要求11或12所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于玻璃体内给药，并且以0.1-1mg总AON/眼的剂量范围给药，例如，大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mg总AON/眼。
14.一种病毒载体，其表达根据权利要求1或2所述的AON。
15.根据权利要求1-10中任一项所述的AON、根据权利要求11-13中任一项所述的药物组合物或者根据权利要求14所述的病毒载体，其用作药物。
16.根据权利要求1-10中任一项所述的AON、根据权利要求11-13中任一项所述的药物组合物或者根据权利要求14所述的病毒载体，其用于治疗、预防或延缓要求调节USH2A前mRNA的剪接的USH2A相关的疾病或病状，例如II型乌谢尔综合征。
17.根据权利要求1-10中任一项所述的AON、根据权利要求11-13中任一项所述的药物组合物或者根据权利要求14所述的病毒载体用于制备药物的用途。
18.根据权利要求1-10中任一项所述的AON、根据权利要求11-13中任一项所述的药物组合物或者根据权利要求14所述的病毒载体用于治疗、预防或延缓要求调节USH2A前mRNA的剪接的USH2A相关的疾病或病状的用途，例如用于治疗、预防或延缓II型乌谢尔综合征的用途。
19.一种调节细胞中USH2A前mRNA的剪接的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1-10中任一项所述的AON、根据权利要求11-13中任一项所述的药物组合物或者根据权利要求14所述的病毒载体接触。
20.一种治疗对其有需求的个体的要求调节USH2A前mRNA的剪接的USH2A相关的疾病或病状的方法，所述方法包括使所述个体的细胞与根据权利要求1-10中任一项所述的AON、根据权利要求11-13中任一项所述的药物组合物或者根据权利要求14所述的病毒载体接触。
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