KR20190051020A - 안 질환 치료용 안티센스 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 의학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 특히 어셔 증후군 Ⅱ 형 및/또는 USH2A 관련 비증후성 망막 변성의 치료, 예방 및/또는 지연에 사용될 수 있는 신규한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (AON)에 관한 것이다.
Description
본 발명은 의학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 특히 안 질환, 바람직하게는 어셔(Usher) 증후군 Ⅱ 형 및/또는 USH2A 관련 망막 변성의 치료, 예방 및/또는 지연에 사용하기 위한 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)에 관한 것이다.
어셔 증후군(USH)과 비-증후성 망막색소변성증(NSRP)은 망막의 퇴행성 질환이다. 어셔 (Usher)는 임상적으로나 유전적으로 이질적이며 인간에서 가장 보편적인 유형의 유전성 청력 시력 상실증으로 6,000 명 중 1 명 빈도이며 Kimberling 등의 2 개의 소아 집단에서 어셔 증후군의 빈도 : 청력 장애 아동의 유전 스크리닝에 대한 적용(Genet Med 12 : 512-516, 2010)에 개시되어 있다.
어셔 환자의 청력 손상은 대부분 안정적이며 선천적이며 보청기 또는 달팽이관 보형물을 통해 부분적으로 보완될 수 있다. NSRP는 Usher보다 4,000 명당 1 명으로 빈도가 높다(Hartong 등, Retinitis pigmentosa, Lancet 368 (9549) : 1795-1809, 2006). 어셔와 NSRP에서 광 수용체 세포의 변성은 진행성으로 종종 30년 내지 40년 후에 완전한 실명을 야기시켜 치료를 위한 시간적 여유를 남겨둔다.
USH2A 유전자의 변이는 McGee 등에 개시된 바와 같이 전 세계에 있는 모든 어셔 환자의 50%(네덜란드에서는 ㅁ1300 명)가 실명되는 가장 흔한 원인이며 (어셔 증후군 Ⅱ 형 또는 비증후성 망막색소변성증 환자에서 USH2A 유전자의 긴 이소폼의 신규한 변이, J Med Genet 47 (7) : 499-506, 2010), 또한 미국에서 NSRP의 가장 흔한 병인이며 망막색소변성증의 모든 사례의 12~25 %(네덜란드에서는 ± 600 명)를 차지하는 것으로 알려져 있다.
변이는 72 USH2A 엑손과 그 인접한 인트론닉 서열 전체에 퍼져 있으며 넌센스 및 미스센스 변이, 결실, 복제, 큰 재배열 및 스플라이싱 변이로 구성된다. 엑손 13은 두 개의 근본적 변이(USH2 환자에서 c.2299delG(p.E767SfsX21) 및 NSRP 환자에서 c.2276G>T (p.C759F))를 포함하여 가장 흔한 변이 엑손이다. 엑손 50의 경우 15개의 병원성 변이가 보고되었는데 그 중 적어도 8개는 명확한 단백질 트렁크 절단이다.
최근 USH2A의 인트론 40에서 최초의 딥-인트론 변이(c.7595-2144A>G)가 보고되었다(Vache 등, USH2A 슈도 엑손의 활성화에 의한 어셔 증후군 2형: 진단 및 치료에 대한 적용, Mutation 33 (1) : 104-108, 2012). 이 변이는 변이 USH2A mRNA에 152bp의 비정상 엑손(슈도 엑손 40 또는 PE40)이 포함되도록 인트론 40에서 크립틱(cryptic) 고품질 스플라이스 공여 부위를 생성하고 번역의 조기 종료를 초래한다.
엑손 13에서 발견된 c.2299delG 변이는 조기 종결 코돈을 유도하는 프레임 이동(frameshift)을 초래하고 넌센스 매개 디케이를 야기하는 것으로 추정된다. Lenassi 등은 어셔 환자에서 변이가 스플라이싱 중에 엑손 12와 엑손 13의 이중 스킵핑을 유도한다는 것을 나타내었으나(RNA 스플라이싱에 대한 USH2A에서의 공통적인 c.2299delG 변이의 효과, Exp Eye Res 122 : 9-12) 일부 환자에게서 엑손 13만의 스킵핑과 엑손 12/엑손 13 이중 스킵핑 간의 조합이 발견되었다.
엑손 서열 변경이 비정상 스플라이싱을 야기하는 것은 드문 일이 아니다. 생물정보학 기구는 엑손 스플라이싱 인핸서를 파괴하고 엑손 13 내에서 엑손 스플라이싱 침묵자를 생성하기 위한 c.2299delG 변경을 예측하였다. 서열분석은 변이를 지니고 있는 비정상 엑손 13만의 스킵핑을 나타내었으며 프레임 이동 변이의 제거 및 엑손 12와 엑손 14 사이에 인-프레임 연결을 유발한다.
엑손 12와 엑손 13의 이중 스킵핑은 엑손 11이 엑손 14에 연결될 때 프레임 외부의 결실을 초래한다. 따라서 엑손 13을 스킵핑하는 것이 바람직하지만 (c.2299delG 변이를 지닐 때) 엑손 12가 보유되는 것도 바람직하다.
어셔 및 다른 망막 근이영양증은 오랫동안 난치병으로 간주되어 왔다. 유전자 보강 요법을 사용하는 여러 단계 Ⅰ/Ⅱ 임상 시험은 RPE65 (Bainbridge 등. 2008. 레베르 선천성 흑암시에서의 시각 기능에 대한 유전자 요법의 효과. N Engl J Med 358, 2231-2239) 및 MYO7A 유전자 (하시모토 등, 2007; 어셔 증후군 1B 형을 위한 마우스 모델에서의 망막의 렌티 바이러스 유전자 대체 요법. Gene Ther 14 (7) : 584-594) 내에서 변이를 지닌 LCA/RP/USH 환자의 선택된 그룹에서 유망한 결과를 나타내었다.
그러나 암호화 서열(15,606 bp)의 크기와 USH2A 유전자와 mRNA의 선택적인 스플라이싱은 다수의 사용 가능한 벡터(예를 들면 아데노-관련 바이러스 (AAV) 및 렌티 바이러스 벡터)의 운반 크기 제한으로 인해 유전자 보강 요법은 그 한계가 있었다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드 (AON) 기반 치료의 광범위한 임상 잠재력에도 불구하고 척추 동물의 눈에는 빈번하게 적용될 수 없었다. AON은 일반적으로 스플라이싱을 방해할 수 있는 작은 폴리뉴클레오타이드 분자 (16 ~ 25-머)로서 이들의 서열은 표적 프리-mRNA 분자 서열과 상보적인 것이다.
희망하는 메커니즘은 상보적인 표적 서열에 AON의 결합시, 프리-mRNA 내의 표적화된 영역이 더 이상 표적화된 엑손의 스킵핑을 초래하는 스플라이싱 인자에 대해 더 이상 영향 받지 않도록 하는 것이다.
치료학적으로 이 방법론은 두 가지 방법으로 사용할 수 있다 : a) 변이가 크립틱 스플라이스 부위를 활성화시키는 유전자의 정상적인 스플라이싱을 리디렉트하거나 및 b) 변이를 갖는 엑손을 스킵핑하여 mRNA의 판독 프레임이 손상되지 않고 (부분적으로) 기능성 단백질을 생성시키는 것이다.
두 가지 방법 모두 이미 심각한 유전적 장애가 있는 환자에서 성공적으로 적용되고 있다(Scaffidi and Misteli, 2005. 조기 노화 질환 허치슨-길포드 progeria 증후군에서 세포 표현형의 역전. Nat.Med 11 (4) : 440- 445, Cirak 등 2011. Duchenne 근이영양증에서 엑손 스킵핑 치료 후 Dystrophin 관련 당 단백질 복합체의 복원 Mol Ther 20 : 462-467; Cirak 등. 전신성 포스포로디아미데이트 모르포리노 올리고머 치료 후 Duchenne 근이영양증 환자에서의 엑손 스킵핑 및 디스트로핀 재생 : 개방-라벨, 제 2 상 투여량 증가 연구. Lancet 378 (9791) : 595-605; Goemans 등. 2011. Duchenne의 근 위축증에서 PRO051의 시스템적 투여. N Engl J Med, 364 (16) : 1513-1522).
USH2A 유전자의 경우 72 개의 엑손 중 28 개는 엑손 13의 스킵핑(반면 엑손 12는 보유됨)을 포함하여 전사체의 전체 판독 프레임을 교란시키지 않고 스킵핑할 수 있다. WO 2016/005514 에서는 엑손 13, 엑손 50 및 PE40의 스킵핑 및/또는 엑손 12의 보유시 USH2A 프리-mRNA를 위한 AON의 엑손 스킵핑을 개시하고 있다.
본 명세서 내에서 개시된 바와 같이 몇몇 AON을 엑손 13 스킵핑하는데 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 목적은 어셔 및/또는 인간 USH2A 유전자의 엑손 13 내의 변이에 의해 야기되는 NSRP의 예방, 치료 또는 지연을 위한 편리한 치료 전략을 수립하기 위한 대안적이고 보다 효율적인 AON을 제공하는 것이다.
본 발명은 인간 USH2A 프리-mRNA내에서 엑손 13을 스킵핑하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (AON)에 관한 것으로, 이때 상기 AON은 생리학적 조건 하에서 서열번호: 12, 서열번호: 13 또는 서열번호: 14 서열 또는 그의 일부에 결합 및/또는 상보적인 것이다. 본 발명의 AON은 엑손 13 스킵핑에 긍정적인 효과를 나타내나 비교적 높은 수준의 엑손12/엑손13의 이중 스킵핑을 나타내는 공지된 AON과 비교시 엑손 12 및 엑손 13의 이중 스킵핑의 생성물은 상대적으로 더 낮은 함량을 지니는 것이다. 바람직하게는 본 발명의 AON은 서열번호: 5, 서열번호: 6 또는 서열번호: 7의 서열을 포함하거나 서열로 구성된 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 AON과 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 USH2A관련 질환 또는 어셔 증후군 Ⅱ 형과 같은 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱 조절을 필요로 하는 상태의 치료, 예방 또는 지연을 위한 의약으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 AON, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 관한 것이다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 USH2A 관련 질환 또는 요구되는 개체 내에서USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱의 조절을 요구하는 상태의 치료 방법, 본 발명에 따른 AON을 상기 개체의 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 방법, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 관한 것이다.
도 1은 엑손 13의 RNA 서열 일부와 그 인접 서열(굵은체로, 방향은 5'에서 3')을 나타낸 것이다. 업스트림 및 다운스트림 인트론 서열은 소문자이며; 엑손 13 코딩 서열은 대문자로 나타낸다. 도면에 나타낸 바와 같이 인접 서열을 포함한 엑손 13의 DNA 서열은 서열번호: 1로 제공되고 상응하는 프리-mRNA 서열은 서열번호: 20으로 제공된다. 인접 서열을 지니지 않은 엑손 13의 코딩 서열은 서열번호: 2로서 제공되고 상응하는 mRNA 서열은 서열번호: 21로서 제공된다.
본 명세서 내에 나타난 AON의 서열 및 표적 RNA 서열에 관련된 위치는 다음과 같다. AON1(서열번호: 3) 및 AON2(서열번호: 4)는 모두 3' 에서 5' 방향으로 나타내었으며 WO 2016/005514에 공지되어있다. 또한 본 명세서 내의 개시된 신규한 AON인 Ex13-1(서열번호: 5), Ex13-2(서열번호: 6), Ex13-3(서열번호: 7), Ex13-4(서열번호: 8) 및 Ex13-5(서열번호: 9) 도 모두 3' 에서 5' 방향으로 나타낸다.
도 2는 Weri-Rb1 세포 내에서 형질 감염시킨 후 AON1, AON2 및 Ex13-1 내지 5를 사용한 엑손 스킵핑 결과를 나타낸 것이다. NT는 형질 감염되지 않은 것을 의미한다. 그 오른 편에는 RT-PCR 생성물을 나타내고 이때 각각의 박스는 엑손의 존재를 나타낸 것이다.
도 3은 당 모이어티에 서로 다른 5 종의 화학적 변형을 지닌 5 개의 서로 다른 Ex13-3 올리고뉴클레오타이드로 처리된(형질 감염 시약 없이) Weri-Rb1 세포로부터 수득된 RNA에 대한 ddPCR 결과를 나타낸 것이다. 엑손 13 스킵핑된 mRNA (야생형 스킵핑되지 않은 배경에서)의 백분율을 나타낸다.
도 4는 당 엔티티 내에서 2'-O-메틸로 완전히 변형된 (Ex13-3 2'OMe; 좌측) 또는 당 엔티티 내에서 2'-O-메톡시에틸로 완전히 변형된 (Ex13-3 2'MOE; 우측) 것인 Ex13-3 올리고뉴클레오타이드의 다양한 농도 내에서 형질 감염시킨 Weri-Rb1 세포로부터 수득된 RNA에 대한 ddPCR 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 2'-O-메틸로 완전히 변형되고 모든 포스포로티오에이트화된 골격을 지닌 Ex13-3 올리고뉴클레오타이드로 처리된 옵틱 컵 내에서의 엑손 스킵핑 결과를 나타낸 것이다. 대조군은 건강한 공여자의 섬유아세포로부터 발생된 옵틱 컵을 나타내며 아무런 AON 처치를 받지 않은 USH2A 환자 섬유아세포로부터 발생된 옵틱 컵이다.
왼쪽과 가운데 패널의 6 개 레인은 표시한 바와 같이 2∼3 개월 동안 분화시킨 처치되지 않은 옵틱 컵(삼중)으로부터 결과를 나타낸 것이다. 또한 우측 패널 내의 AON 농도에 따른 3 개의 별개 레인은 3 개월 동안 분화시키고 1 개월 동안 2 종의 서로 다른 농도의 Ex13-3 AON으로 인큐베이션시킨 처치된 옵틱 컵(삼중)으로부터 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 USH2 환자로부터 생성된 옵틱 컵 내의 엑손 13 스킵핑 결과를 나타낸 것이다. 이때 4 종의 서로 다른 농도의 Ex13-3 2'MOE 올리고뉴클레오타이드로 옵틱 컵을 처리하였다. 대조군은 처리되지 않거나 (NT) 또는 관련이 없는 서열을 지닌 그러나 각각의 당 모이어티는 2'-O-메톡시에틸 변형을 지닌 대조군 올리고뉴클레오타이드 (ctrl)로 처리한 것이다.
본 명세서 내에 나타난 AON의 서열 및 표적 RNA 서열에 관련된 위치는 다음과 같다. AON1(서열번호: 3) 및 AON2(서열번호: 4)는 모두 3' 에서 5' 방향으로 나타내었으며 WO 2016/005514에 공지되어있다. 또한 본 명세서 내의 개시된 신규한 AON인 Ex13-1(서열번호: 5), Ex13-2(서열번호: 6), Ex13-3(서열번호: 7), Ex13-4(서열번호: 8) 및 Ex13-5(서열번호: 9) 도 모두 3' 에서 5' 방향으로 나타낸다.
도 2는 Weri-Rb1 세포 내에서 형질 감염시킨 후 AON1, AON2 및 Ex13-1 내지 5를 사용한 엑손 스킵핑 결과를 나타낸 것이다. NT는 형질 감염되지 않은 것을 의미한다. 그 오른 편에는 RT-PCR 생성물을 나타내고 이때 각각의 박스는 엑손의 존재를 나타낸 것이다.
도 3은 당 모이어티에 서로 다른 5 종의 화학적 변형을 지닌 5 개의 서로 다른 Ex13-3 올리고뉴클레오타이드로 처리된(형질 감염 시약 없이) Weri-Rb1 세포로부터 수득된 RNA에 대한 ddPCR 결과를 나타낸 것이다. 엑손 13 스킵핑된 mRNA (야생형 스킵핑되지 않은 배경에서)의 백분율을 나타낸다.
도 4는 당 엔티티 내에서 2'-O-메틸로 완전히 변형된 (Ex13-3 2'OMe; 좌측) 또는 당 엔티티 내에서 2'-O-메톡시에틸로 완전히 변형된 (Ex13-3 2'MOE; 우측) 것인 Ex13-3 올리고뉴클레오타이드의 다양한 농도 내에서 형질 감염시킨 Weri-Rb1 세포로부터 수득된 RNA에 대한 ddPCR 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 2'-O-메틸로 완전히 변형되고 모든 포스포로티오에이트화된 골격을 지닌 Ex13-3 올리고뉴클레오타이드로 처리된 옵틱 컵 내에서의 엑손 스킵핑 결과를 나타낸 것이다. 대조군은 건강한 공여자의 섬유아세포로부터 발생된 옵틱 컵을 나타내며 아무런 AON 처치를 받지 않은 USH2A 환자 섬유아세포로부터 발생된 옵틱 컵이다.
왼쪽과 가운데 패널의 6 개 레인은 표시한 바와 같이 2∼3 개월 동안 분화시킨 처치되지 않은 옵틱 컵(삼중)으로부터 결과를 나타낸 것이다. 또한 우측 패널 내의 AON 농도에 따른 3 개의 별개 레인은 3 개월 동안 분화시키고 1 개월 동안 2 종의 서로 다른 농도의 Ex13-3 AON으로 인큐베이션시킨 처치된 옵틱 컵(삼중)으로부터 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 USH2 환자로부터 생성된 옵틱 컵 내의 엑손 13 스킵핑 결과를 나타낸 것이다. 이때 4 종의 서로 다른 농도의 Ex13-3 2'MOE 올리고뉴클레오타이드로 옵틱 컵을 처리하였다. 대조군은 처리되지 않거나 (NT) 또는 관련이 없는 서열을 지닌 그러나 각각의 당 모이어티는 2'-O-메톡시에틸 변형을 지닌 대조군 올리고뉴클레오타이드 (ctrl)로 처리한 것이다.
본 발명은 USH2A 프리-mRNA에서 비정상적인 엑손 13의 포함을 차단할 수 있는 특정 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (AON)에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 생리학적 조건 하에서 AON이 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14의 서열 또는 그것의 일부에 결합 및/또는 상보적인 인간 USH2A 프리-mRNA에서 엑손 13을 스킵핑하기 위한 AON에 관한 것이다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 단일 가닥 AON은 선행 기술에 개시된 공지된 단일 가닥 AON과 비교시, 엑손 13 및 엑손12의 원치 않는 이중 스킵핑(즉, 프레임 외부의 결실을 초래하는)이 엑손 13만의 스킵핑(프레임 내에서)과 비교하여 그 수준이 감소하는 것을 발견하였다.
본 발명의 목적은 AON의 투여로 인해 엑손 12/엑손13 이중 스킵핑이 감소하는 반면, 유의미한 엑손 13 스킵핑을 제공할 수 있는 대체 가능하고 개선된 단일 가닥 AON을 제공하는 것으로, 이를 종래 기술로부터의 AON과 대조하여 관찰하는 것이다. 본 발명의 발명자들은 본 명세서 내에 개시된 바와 같은 AON을 확인할 수 있었다.
하나의 실시형태에서 본 발명은 인간 USH2A 프리-mRNA에서 엑손 13을 스킵핑하기 위한 AON에 관한 것으로, AON은 서열번호: 5, 서열번호: 6 또는 서열번호: 7의 서열을 포함하거나 서열로 구성된다. 바람직한 실시형태에서 상기 AON은 올리고리보뉴클레오타이드이고, 더욱 바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 AON은 2'-O-메틸 변형된 당과 같은 2'-O 알킬 변형을 포함한다. 보다 바람직한 실시형태에서 상기 AON 내의 모든 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형된 것이다.
또 다른 바람직한 측면에서 본 발명은 2'-O-메톡시에틸 변형을 포함하는 AON에 관한 것이다. 보다 바람직한 실시형태에서 상기 AON의 모든 뉴클레오타이드는 2'-O-메톡시에틸 변형을 포함한다. 또 다른 실시형태에서 본 발명은 AON이 하나 이상의 2'-O-메틸 및 하나 이상의 2'-O-메톡시에틸 변형을 포함하는 AON에 관한 것이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 AON은 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 지닌다. 또 다른 바람직한 측면에서 모든 순차적인 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 결합으로 상호 연결된다.
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 AON 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는 약제학적 조성물은 유리체 내 투여용이고 안구 당 총 AON 0.05 mg 및 5 mg 범위의 양으로 투여된다. 보다 바람직하게는 약제학적 조성물은 유리체 내 투여용이고, 안구 당 총 AON은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 mg 과 같이 안구 당 총 AON의 0.1 내지 1 mg 범위의 양으로 투여된다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 본 발명에 따른 AON을 발현하는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 또 다른 실시형태에서 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 AON, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 관한 것이다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 어셔 증후군 Ⅱ형과 같은 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱 조절을 필요로 하는 USH2A관련 질환 또는 상태의 치료, 예방 또는 지연을 위한 본 발명에 따른 AON, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 의약의 제조를 위한 본 발명에 따른 AON, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 약제는 어셔 증후군 Ⅱ형과 같은 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱 조절을 필요로 하는 USH2A 관련 질환 또는 상태의 치료, 예방 또는 지연을 위한 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 어셔 증후군 Ⅱ형과 같은 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱 조절을 필요로 하는USH2A관련 질환 또는 상태의 치료, 예방 또는 지연을 위한 본 발명에 따른 AON, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 세포 내에서 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱을 조절하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 세포를 본 발명에 따른 AON, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다.
바람직한 실시형태에서 본 발명은 USH2A 관련 질환 또는 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱 조절을 필요로 하는 개체의 USH2A 관련 질환 또는 상태를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 개체의 세포를 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 접촉하는 단계를 포함하는 것이다.
본 발명의 모든 실시형태에서 '스플라이싱 조절'및 '엑손 스킵핑'이라는 용어는 동의어이다. USH2A와 관련하여 '스플라이싱 조절 '또는 '엑손 스킵핑'은 비정상 엑손 13의 배제로 해석된다. 또한 엑손 13이 바람직하게 스킵핑 되었을 때 엑손 12는 보유되는 것이다.
본 발명의 목적을 위해 '비정상 엑손 13' 또는 '비정상적인 USH2A 엑손 13'이라는 용어는 동의어로 간주되며 질환을 유발하는 변이가 USH2A 유전자 엑손 13 내에 변이 존재하는 것을 의미하는 것으로 간주된다.
본 명세서 내에서 '엑손 스킵핑'이란 용어는 엑손 스킵핑 없이 성숙한 mRNA에 존재하는 특정 엑손(USH2A 유전자의 엑손 13)을 함유하지 않는 성숙한 mRNA를 세포 내에서 생산을 유도, 생성 또는 증가시키는 것을 의미한다.
엑손 스킵핑은 예를 들면 스플라이싱의 효소 프로세스를 허용하기 위한 (크립틱) 스플라이스 도너 또는 (크립틱) 스플라이스 억셉터 서열과 같은 서열을 간섭할 수 있는 분자를 지니거나, 성숙한 mRNA 내에 포함되는 엑손으로서 뉴클레오타이드의 스트레치 인식에 요구되는 엑손 내포 시그널과 간섭할 수 있는 분자를 지닌 성숙한 mRNA 내의 프리-mRNA 를 발현하는 세포를 제공함으로써 달성되는 것이며 이때 상기 분자는 본 명세서 내에 '엑손 스킵핑 분자', '엑손 13 스킵핑 분자' 또는 '엑손 스킵핑 AON'으로 언급되는 것이다.
'프리-mRNA'라는 용어는 핵 내에서 전사에 의한 세포의 DNA 주형으로부터 합성되는 비처리된 또는 부분 처리된 전구체 mRNA를 의미한다. 본 명세서 내에서 '엑손 보유(retention)'라는 용어는 성숙한 mRNA에 바람직하게 존재해야 하는 특정 엑손을 보유하는 성숙한 mRNA의 세포 내에서 생산을 유도, 생성 또는 증가시키는 것으로 정의된다. 본 발명의 경우 보유되어야 하는 엑손은 USH2A 유전자 엑손 12이다.
엑손 보유는 예를 들면 인트론 12내에서 인트론 스플라이싱 침묵 부위와 같은 서열을 간섭할 수 있는 AON을 지닌 성숙한 mRNA의 프리-mRNA를 발현하는 세포를 제공함으로써 달성되며; 그러한 AON은 또한 엑손 보유 AON으로 언급될 수 있다.
가장 바람직한 AON은 엑손 13 스킵핑(어셔 환자에서 이미 관찰된 현상)을 강하게 유도하는 동시에 엑손12를 함께 너무 많이 스킵핑하지 않는 올리고뉴클레오타이드이다. 엑손 13은 가능한 한 많이 스킵핑하고 엑손 12는 가능한 한 유지되어야 한다.
용어 '안티센스 올리고뉴클레오타이드'(AON)는 프리-mRNA 분자, hnRNA (이종 핵상 RNA) 또는 mRNA 분자 내에서 표적 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 안티센스 서열의 상보성 (또는 실질적인 상보성)의 정도는 바람직하게는 안티센스 서열을 포함하는 분자가 생리학적 조건 하에서 RNA 분자 내의 표적 뉴클레오타이드 서열과 안정한 이중 가닥 하이브리드를 형성할 수 있는 정도이다.
용어 '안티센스 올리고뉴클레오타이드', '올리고뉴클레오타이드' 및 '올리고'는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며, 표적 서열에 대한 안티센스 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 이해된다. 본 명세서와 그 청구항에 있어서 "포함하다(to comprise)" 라는 동사의 사용은 그 단어 뒤에 오는 항목이 포함되지만 특별히 언급되지 않은 항목은 제외되지 않는다는 것을 의미하는 비제한적 의미로 사용된다.
또한 부정관사 "a" 또는 "an"에 의한 요소에 대한 언급은 문맥상 하나의 요소만이 분명히 요구되는 경우를 제외하고는 하나 이상의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서 부정관사 "a" 또는 "an"은 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다. 수치 (예를 들어, 약 10)와 관련하여 사용될 때 "약" 또는 "대략"이라는 단어는 바람직하게는 그 주어진 수치 (10의) 대략 0.1 % 내외 수치임을 의미한다.
하나의 실시형태에서 본 명세서에서 정의된 엑손 13 스킵핑 분자는 특정 서열에 결합하고 및/또는 상보적인 AON이다. 바람직하게는 비정상적인 USH2A 엑손 13과 관련된 특정 표적 서열들 중 하나에 결합시키는 것은 당업자에게 공지된 기술을 통해 접근할 수 있다.
바람직한 기술은 EP1619249에 기술된 바와 같은 겔 유동성 이동 에세이이다. 바람직한 실시형태에서 엑손 13을 스킵핑하는 AON은 겔 유동성 이동 에세이에서 표지된 표적 서열에 대한 상기 분자의 결합이 검출되자마자 특정 서열 중 하나에 결합하는 것으로 여겨진다.
본 발명의 모든 실시형태에서 엑손 13 스킵핑 분자는 바람직하게는 AON이다. 바람직하게는 본 발명에 따른 엑손 13을 스킵핑하는 AON은 서열번호: 12, 서열번호: 13 또는 서열번호: 14에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 AON이다.
본 발명의 명세서에서 사용된 용어 '실질적으로 상보적인'은 기능, 즉 비정상적인 USH2A 엑손 13의 스킵핑 및 엑손 12의 보유를 유도할 수 있는 한, 안티센스 서열의 일부 미스매치가 허용될 수 있다는 것을 의미한다. 바람직하게는 상보성은 90 % 내지 100 %이다. 일반적으로 이는 20개의 뉴클레오타이드로 구성된AON의 경우 1 개 또는 2개의 미스매치가 허용되고, 40 개의 뉴클레오타이드로 구성된AON의 경우 1, 2, 3 또는 4개의 미스매치가 허용되고, 60 개의 뉴클레오타이드로 구성된AON의 경우 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 미스매치가 허용되는 것이다.
본 발명은 비정상상적인 USH2A 엑손 13의 스킵핑을 유도할 수 있는 엑손 13 스킵핑 AON 을 설계하는 방법을 제공한다. 먼저 엑손 13에 결합 및/또는 상보적인 AON을 선별하고 서열번호: 1에 나타난 바와 같이 인접 인트론 서열까지 가능한 한 연장시키는 것이다(RNA에 대해서는 서열번호: 20 참조).
결과적으로 바람직한 방법에서 다음 측면 중 적어도 하나를 엑손 스킵핑 AON을 향상시키기 위해 설계시 고려해야 하며, 이는 엑손 스킵핑 AON이 바람직하게는 CpG 또는 CpG의 스트레치를 함유하지 않는 것이고, 엑손 스킵핑 AON은 RNA 결합 동역학 및/또는 열역학 특성을 인정하는 것이다.
AON에서의 CpG 또는 CpG스트레치의 존재는 일반적으로 상기 AON의 증가된 면역원성과 관련된다 (Dorn 및 Kippenberger (2008) Curr Opin Mol Ther 10 (1) 10-20). 이러한 증가된 면역원성은 치료될 조직, 즉 눈의 손상을 유도할 수 있기 때문에 바람직하지 않다. 면역원성은 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포 및/또는 염증성 단핵 세포 침윤의 존재를 평가함으로써 동물 모델에서 평가할 수 있다.
면역원성은 당업자에게 공지된 표준 면역 측정법을 사용하여 상기 AON을 인식하는 중화 항체 및/또는 항체의 존재를 검출함으로써 본 발명의 AON으로 치료되는 동물 또는 사람의 혈액에서 평가될 수 있다. 염증 반응, I 형 인터페론 생산, IL-12 생산 및/또는 면역원성의 증가는 표준 면역 측정법을 사용하여 중화 항체 또는 상기 AON을 인식하는 항체의 존재 또는 증가 양을 검출함으로써 평가할 수 있다.
본 발명은 허용 가능한 RNA 결합 동역학 및/또는 열역학 특성을 갖는 AON을 설계할 수 있게 한다. RNA 결합 동역학 및/또는 열역학 특성은 적어도 부분적으로 용융 온도 (Tm) 에 의해 결정될 수 있으며 이때 Tm은 기본 Tm과 가장 가까운 이웃 모델을 사용하여 단일 가닥 RNA를 위한 올리고뉴클레오타이드 특성 계산기(www.unc.edu/-cail/biotool/oligo/index)로 계산될 수 있고 AON 표적 엑손 복합체의 자유에너지도 (RNA 구조 버전 4.5 사용하여) 계산될 수 있다.
Tm이 너무 높으면 AON은 더 낮은 특이성으로 예측된다. 수용 가능한 Tm 및 자유 에너지는 AON의 서열에 의존한다. 따라서 이들 파라미터 각각에 바람직한 범위를 부여하는 것은 어렵다. 수용할 수 있는 Tm은 35 ~ 70 ℃ 범위이며 허용 가능한 자유 에너지는 15 ~ 45 kcal/mol 범위일 수 있다.
본 발명의 AON은 바람직하게는 수용 가능한 수준의 기능적 활성을 나타낼 수 있는 것이다. 상기 AON의 기능적 활성은 특정 허용 수준으로 비정상적인 USH2A 엑손 13 스킵핑과 엑손 12의 보유를 바람직하게 유도하며 이는 개체에게 기능적 USH2A 단백질 및/또는 mRNA 및/또는 적어도 그의 일부를 제공하여 비정상적 USH2A 단백질 및/또는 mRNA 의 생성을 감소시키는 것이다.
바람직한 실시형태에서 AON을 처리하지 않은 RNA 생성물의 대조군 또는 AON의 음성 대조군과 비교시 AON이 비정상적인 USH2A 엑손 13의 스킵핑을 유도하여 스킵핑된 비정상적인 USH2A 엑손 13의 백분율을 실시간 정량적 RT-PCR 분석에 의해 측정시 그 수치는 적어도 30 %, 또는 적어도 35 %, 또는 적어도 40 %, 또는 적어도 45 %, 또는 적어도 50 %, 또는 적어도 55 %, 또는 적어도 60 %, 또는 적어도 65 %, 또는 적어도 70 %, 또는 적어도 75 %, 또는 적어도 80 %, 또는 적어도 85 %, 또는 적어도 90 %, 또는 적어도 95 % 또는 100 %이다.
본 발명의 목적은 엑손 13의 스킵핑을 유도하는 AON을 제공하는 한편 엑손 12 및 엑손13을 동시 스킵핑하는 (이중 스킵핑) 생성물의 함량을 저하시키는 것이다. 그러므로 AON은 가능한 한 제한된 범위에서 이중 스킵핑을 야기함과 동시에 엑손 13 만 스킵핑하도록 유도해야 한다. 본 발명의 AON은 오직 증가된 엑손 13 스킵핑만을 나타내고 현재까지 알려진 기술에 비해 더욱 감소된 엑손 12/엑손13 이중 스킵핑을 나타내는 것이다.
엑손 스킵핑 및/또는 엑손 보유를 결정하기 위한 분석은 본 명세서 내의 실시예에 기재되어 있다. 공지된 AON과 비교시 엑손 13스킵핑만이 증가되고 엑손12/엑손13 이중 스킵핑이 감소되었는지를 당업자가 판단할 수 있는 기술을 보충한다.
바람직하게는 USH2A의 서열번호: 1 (또는 RNA로서 서열번호: 20)로 표시되는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 AON은 (실질적으로) 상보적인 부분이 본 발명에 따른 AON 길이의 50 % 이상, 바람직하게는 60 % 이상, 바람직하게는 70 % 이상, 보다 바람직하게는 80 % 이상, 보다 바람직하게는 90 % 이상, 또는 더욱 바람직하게는 95 %, 더욱 바람직하게는 98 % 또는 더욱 더 바람직하게는 99 % 이상, 또는 최고로 바람직하게는 100 %이다.
바람직하게는 본 발명에 따른 AON은 서열번호: 2의 부분 (또는 실제로 서열번호: 21에 나타낸 RNA 균등물), 보다 바람직하게는 서열번호: 12, 서열번호: 13 또는 서열번호: 14에 상보적인 서열을 포함하거나 이로부터 구성된다.
또 다른 바람직한 실시형태에서 상기 AON의 상보적인 부분의 길이는 적어도 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개, 26 개, 27 개, 28 개, 29 개, 30 개, 31 개, 32 개, 33 개, 34 개, 35 개, 36 개, 37 개, 38 개, 39 개, 40 개, 41 개, 42 개, 43 개, 44 개, 45 개, 46 개, 47 개, 48 개, 49개, 50 개, 51 개, 52 개, 53 개, 54 개, 55 개, 56 개, 57 개, 58 개, 59 개, 60 개, 65 개, 70 개, 75 개, 80 개, 85 개, 90 개, 95개, 100개, 110개, 115개, 120개, 125개, 130개, 135 개, 140 개, 141 개, 142 개 또는 143 개의 뉴클레오타이드로 이루어진다.
추가적 인접 서열은 AON과 단백질의 결합을 변형시키기 위해, AON의 열역학적 특성을 변형시키기 위해, 보다 바람직하게는 표적 RNA 결합 친화력을 변형시키기 위해 사용될 수 있다.
따라서 상보성 영역의 모든 염기가 대향하는 가닥의 염기와 짝 지음되는 것이 절대적으로 요구되지는 않는다. 예를 들면 AON을 디자인할 때 상보적 가닥상의 염기와 염기쌍을 이루지 않는 잔기를 혼입 통합시킬 수 있다.
세포의 상황에 따라 뉴클레오타이드의 스트레치가 상보적인 부분에 충분히 혼성화될 수 있다면 미스매치는 어느 정도 허용될 수 있다. 이러한 문장에서 '충분하게'는 바람직하게는 EP1619249의 실시예 1에 기재된 바와 같은 겔 유동성 이동 에세이를 사용시 AON의 결합이 검출되는 정도를 의미한다.
선택적으로 상기 AON은 환자의 망막 세포로의 형질 감염을 통해 추가로 시험될 수 있다. 표적화된 엑손 13의 스킵핑 및/또는 엑손 12의 보유는 RT-PCR(예를 들어 EP1619249 및 WO2016/00514에 기술되어 있음)에 의해 평가될 수 있다.
상보적 영역은 결합시 그 영역이 프리-mRNA 내의 엑손에 특이적인 것으로 설계하는 것이 바람직하다. 이러한 특이성은 이것이 시스템 내의 다른 프리-mRNA 내에서 활성 서열에 의존하는 것처럼 상보적 영역의 다양한 길이에 따라 생성되는 것이다.
AON이 하나 이상의 다른 프리-mRNA 분자와 혼성화될 수 있는 위험성은 AON의 크기가 증가함에 따라 감소한다. 상보성 영역에서 미스매치를 포함하지만 프리-mRNA에서 표적 부위에 혼성화 및/또는 결합하는 능력을 보유하는 AON을 본 발명에서 사용할 수 있음은 명백한 것이다.
그러나 바람직하게는 적어도 상보적 부분은 하나 이상의 상보적 영역에서 이러한 미스매치를 지니는 AON보다 상보적인 부분에서의 미스매치가 없는 AON이 전형적으로 더 높은 효율 및 보다 높은 특이성을 지닌 상보적인 부분으로 선호된다.
높은 하이브리드화 강도(즉, 대향하는 가닥과 상호 작용의 수의 증가)는 시스템의 스플라이싱 기구에 간섭하는 프로세스의 효율성을 증가시키는데 유리하다고 여겨진다. 바람직하게는 상보성은 90 % 내지 100 %이다. 일반적으로 이는 AON이 20 개인 경우1 개 또는 2 개의 미스매치를 허용하고, AON이 40 개인 경우 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 미스매치를 허용하고, AON이 60 개인 경우 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6 개의 미스매치를 허용하는 것이다.
본 발명의 엑손 스킵핑AON은 바람직하게는 그 (표적) 대응 서열의 부재시 분리된 단일 가닥 분자이다. 본 발명의 엑손 스킵핑AON은 바람직하게는 생리적 조건 하에서 서열번호: 12, 서열번호: 13 또는 서열번호: 14로부터 선택되는 서열에 결합하거나 상보적인 것 또는 생리적 조건 하에서 서열번호: 14의 서열에 결합하는 것이다.
본 발명의 엑손 13스킵핑AON은 8 개 내지 143 개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 10개 내지 40 개의 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 12 내지 30 개의 뉴클레오타이드, 최적으로 바람직하게는 20 내지 30 개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 뉴클레오타이드로 구성된 것이다. 바람직하게는 11개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개, 26 개, 27 개, 28 개, 29 개, 30 개, 31 개, 32 개, 33 개, 34 개, 35 개, 36 개, 37 개, 38 개, 39 개, 40 개, 41 개, 42 개, 43 개, 44 개, 45 개, 46 개, 47 개, 48 개, 49 개, 50 개, 51 개, 52 개, 53 개, 54 개, 55 개, 56 개, 57 개, 58 개, 59 개, 60 개, 65 개, 70 개, 75 개, 80 개, 85 개, 90 개, 95 개, 100 개, 110 개, 115 개, 120 개, 125 개, 130 개, 135 개, 140 개, 141 개, 142 개 또는 143 개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 뉴클레오타이드로 구성된 것이다.
특정 실시형태에서 본 발명은 서열번호: 5, 서열번호: 6 또는 서열번호: 7 로 이루어진 군으로부터 선택된 엑손 13스킵핑 AON을 제공한다. 바람직한 실시형태에서 본 발명은 엑손 13스킵핑 AON을 제공하며, 이 분자는 비정상적인 USH2A 엑손 13의 스플라이싱을 조절하는데 매우 효율적이며, 동시에 엑손 12를 종래의 AON보다 양호하게 보유시키는 것에 매우 효율적임이 밝혀졌다.
또한 본 발명의 AON은 엑손 12/엑손13 이중 스킵핑을 유발하는데는 비효율적이지만, "오직 엑손 13" 만을 스킵핑 시키는데는 매우 효율적이라고 여겨진다.
본 발명의 바람직한 엑손 13 스킵핑 AON은 (엑손12/엑손13 이중 스킵핑을 너무 많이 유도하지 않고 매우 낮은 수준으로 유도) 서열번호: 7로 제공되고 있으며 바람직하게는 21개, 22개, 23 개, 24 개, 25 개, 26 개, 27 개, 28 개, 29 개, 30 개, 31 개, 32 개, 33 개, 34 개, 35 개, 36 개, 37 개, 38 개, 39 개, 40 개, 41 개, 42 개, 43 개, 44 개, 45 개, 46 개, 47 개, 48 개, 49 개, 50 개, 51 개, 52 개, 53 개, 54 개, 55 개, 56 개, 57 개, 58 개, 59 개, 60 개, 65 개, 70 개, 75 개, 80 개, 85 개, 90 개, 95 개, 100 개, 110 개, 115 개, 120 개, 125 개, 130 개, 135 개, 140 개, 141 개, 142 개 또는 143 개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것이다.
본 발명에 따라 엑손 13 스킵핑 AON은 후술하는 바와 같이 하나 이상의 RNA 잔기 또는 하나 이상의 DNA 잔기 및/또는 하나 이상의 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물을 함유할 수 있다. 본 발명의 엑손 13스킵핑AON 은 뉴클레아제 내성의 증가 및/또는 표적 서열에 대한 AON의 친화성을 증가시키기 위해 변형된 하나 이상의 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.
따라서 바람직한 실시형태에서 AON 서열은 하나 이상의 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물을 포함하며 여기서 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 변형된 염기 및/또는 변형된 골격 및/또는 비천연 뉴클레오사이드 간의 결합 또는 이들의 조합을 지닌 잔기로 정의된다.
바람직한 실시형태에서 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 변형된 골격을 포함한다. 이러한 골격의 예는 모르폴리노 골격, 카바메이트 골격, 실록산 골격, 설파이드, 설폭시드 및 설폰 골격, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격, 메틸렌포름아세틸 골격, 리보아세틸 골격, 알켄 함유 골격, 설파메이트, 설포네이트 및 설폰아미드 골격, 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격 및 아미드 골격 등이다. 포스포로디아미네이트 모르폴리노 올리고머는 종래에 안티센스 제제로서 연구된 변형된 골격 올리고뉴클레오타이드이다.
모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 DNA내의 데옥시리보스 당이 6 원 고리로 대체되고 포스포디에스테르 결합이 포스포로디아미데이트 결합으로 대체된 전하를 지니지 않은 골격을 지닌다. 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 효소성 분해에 대한 내성을 지니며 RNase H를 활성화보다 번역을 정지시키거나 프리-mRNA 스플라이싱의 간섭에 의해 안티센스 작용제로 작용하는 것으로 판단된다.
모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 세포막을 물리적으로 파괴하는 방법으로 조직 배양 세포에 성공적으로 전달되었으며 스크랩 로딩이 가장 효과적인 전달 방법이라는 것을 몇 가지 비교 연구를 통해 확인한 바 있다. 그러나 모르폴리노 골격은 전하를 지니지 않기 때문에 양이온성 지질은 세포에서 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드 흡수의 효과적인 매개체가 될 수 없다.
최근 보고서는 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드에 의한 삼중체 형성을 보고하였고 비이온성 골격으로 인해 이 연구에서 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 마그네슘의 부재시 삼중체 형성이 가능하다는 것을 나타내었다.
골격 내의 잔기 사이의 결합은 인 원자를 포함하지 않는다. 예를 들면 짧은 사슬 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오사이드 간의 결합, 혼합된 헤테로 원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오사이드 간의 결합 또는 하나 이상의 짧은 사슬 헤테로 원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오타이드 사이 결합 등이다.
바람직한 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 변형된 폴리아미드 골격 (Nielsen, 등 (1991) Science 254, 1497-1500)을 지닌 펩타이드 핵산 (PNA)을 포함한다. PNA 기반 분자는 염기쌍 인식의 관점에서 DNA 분자의 진정한 모방체이다.
PNA의 골격은 펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로 구성되며 핵 염기는 메틸렌 카르보닐 결합에 의해 골격에 연결되어 있다. 대안적인 골격은 1-탄소 연장된 피롤리딘 PNA 단량체를 포함한다 (Govindaraju 및 Kumar (2005) Chem Commun 495-497).
PNA 분자의 골격은 하전된 인산염 그룹을 포함하지 않기 때문에, PNA-RNA 하이브리드는 대개 RNA-RNA 또는 RNA-DNA 하이브리드보다 안정하다 (Egholm et al. (1993) Nature 365 : 566-568). 추가로 바람직한 골격은 리보오스 또는 데옥시리보스 당이 6 원의 모르폴리노 고리로 치환된 모르폴리노 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물을 포함한다.
가장 바람직한 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 리보스 또는 데옥시리보스 당이 6-원 모르폴리노 고리에 의해 대체되고 인접한 모르폴리노 고리 사이의 음이온성 포스포디에스테르 결합이 비이온성 포스포로디아미데이트로 대체된 포스포로디아미다네이트 모르폴리노 올리고머(PMO)를 포함하는 것이다.
또 다른 실시형태에서 본 발명의 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 포스포디에스테르 결합에서 비-가교 산소 중 하나의 치환을 포함한다. 이 변형은 염기쌍을 약간 불안정하게 만들지만 핵산 분해에 대한 상당한 저항성을 부여한다.
바람직한 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, H-포스포네이트, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 예를 들면 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노스포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 셀레노포스페이트 또는 보라노포스페이트 등이다.
본 발명의 추가의 바람직한 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 2', 3' 및/또는 5' 위치에서 일 치환 또는 이치환된 1 개 이상의 당 잔기, 예를 들면 -OH; -F; 하나 이상의 헤테로 원자에 의해 교환될 수 있는 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 저급 (C1-C10) 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 알릴 또는 아르알킬; O-, S- 또는 N-알킬이고; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; O-, S- 또는 N-알릴; O-알킬-O-알킬, -메톡시, -아미노프로폭시; 메톡시에톡시; 디메틸아미노옥시에톡시; 및 -디메틸아미노에톡시에톡시 등이다.
당 잔기는 피라노스 또는 이의 유도체, 또는 데옥시피라노오스 또는 이의 유도체, 바람직하게는 리보스 또는 이의 유도체 또는 데옥시리보스 또는 이의 유도체일 수 있다. 바람직한 유도체화 당 잔기는 2'-탄소 원자가 당 고리의 3' 또는 4' 탄소 원자에 연결되어 바이사이클릭 당 잔기를 형성하는 잠금 핵산(Locked Nucleic Acid, LNA)을 포함한다.
바람직한 LNA는 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산을 포함한다(Morita 등. 2001. Nucleic Acid Res Supplement No.1 : 241-242). 이러한 치환은 뉴클레오타이드 동족체 또는 동등한 RNase H 및 뉴클레아제 내성을 부여하고 표적 RNA에 대한 친화성을 증가시킨다.
또 다른 실시형태에서 본 발명의 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 하나 이상의 염기 변형 또는 치환을 포함한다. 변형된 염기는 이노신, 크산틴, 하이포크산틴 및 다른 -아자, 데아자, -하이드록시, -할로, -티오, 티올, -알킬, -알케닐, -알키닐, 피리미딘의 티오알킬 유도체 및 퓨린 염기와 같은 합성 및 천연 염기를 포함하며 당업계에 공지될 것이다.
당업자는 AON의 모든 위치가 균일하게 수정될 필요는 없다고 이해한다. 또한 전술한 동족체 또는 균등물 중 하나 이상이 단일 AON 또는 AON 내의 단일 위치에 통합될 수 있다. 특정 실시형태에서 본 발명의 AON은 2 가지 이상의 상이한 유형의 동족체 또는 균등물을 지닌다.
본 발명에 따른 바람직한 엑손 스킵핑 AON은 2'-O-메틸 변형 리보스(RNA), 2'-O-에틸 변형 리보스, 2'-O-프로필 변형 리보스 및/또는 할로겐화 유도체와 같은 이들 변형체의 치환 유도체를 포함한다. 본 발명에 따른 효과적인 AON은 바람직하게는 완전한 포스포로티오에이트화된 골격을 지닌 2'-O-메틸 리보스를 포함한다.
당업자는 비정상적인 USH2A 엑손 13을 효율적으로 스킵핑하기 위해 상이한 AON이 병용될 수 있음을 이해할 것이다. 바람직한 실시형태에서 2 이상의 AON의 병용이 본 발명의 방법으로 사용되며 2개, 3개, 4개 또는 5 개의 서로 다른 AON을 병용할 수 있다. 따라서 본 발명은 본 명세서 내에 개시된 바와 같이 선행 기술에 개시된 AON을 선택적으로 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 적어도 하나의 AON을 포함하는 AON 세트일 수 있다. 이는 WO 2016/005514에 개시된 엑손 12의 보유에 관련된AON4a보다 개선된 방법일 수 있다.
이미 본 명세서에서 상세히 나타낸 바와 같이 엑손 13에서의 변이의 존재는 엑손 13의 스킵핑 및 엑손 12의 동시-스킵핑을 유도한다. 본 기술은 엑손 13의 스킵핑을 (특정 수준으로) 유도하는 AON을 사용하는 것에 의해 원하지 않는 엑손 12가 스킵핑될 수 있다. 따라서 엑손 12를 보유하면서 효율적으로 엑손 13을 스킵핑시키는 AON을 사용하는 것이 바람직하다.
단일 AON으로 엑손 13을 적절히 스킵핑하고 반면 다른 엑손 12를 보유하는 것이 가장 바람직하다. 도 2에 나타난 바와 같이 종래 기술의 AON의 사용은 엑손 13 단일 스킵핑 (밴드의 강도 참조)보다 높은 정도로 엑손 12/엑손 13 이중 스킵핑을 초래한다. 따라서 대략 50/50 정도인 엑손 12/엑손13 이중 스킵핑과 비교하여 더 많은 엑손 13 단일 스킵핑을 초래하는 AON의 사용이 바람직하다.
도 2는 본 발명의 AON이 적어도 50/50의 비율을 제공할 수 있는 반면 Ex13-3은 엑손 12/엑손13 이중 스킵핑을 넘어 더 효율적으로 엑손 13 단일 스킵핑을 제공하는 것이다. 비율은 통상적인 정량적 PCR 기술을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 본 발명은 본 명세서 내의 실시예에 의해 나타낸 바와 같이 비율을 결정하기 위한 하나 이상의 방법을 제공한다.
본 명세서 내에서 Ex13-1 (서열번호: 5), Ex13-2 (서열번호: 6) 및 Ex13-3 (서열번호: 7)로 언급된 AON 또는 적어도 서열번호: 12, 서열번호: 13 또는 서열번호: 14에 결합 및/또는 상보적인 AON 은 적어도 50/50 비율(엑손 13 단일 스킵핑 / 엑손 12/엑손13 이중 스킵핑)의 요건을 충족시킨다. 본 발명의 AON은 종래 기술의 AON을 능가하는 것이다.
AON은 세포, 바람직하게는 망막 세포에서 AON의 업테이크를 증가시키는 모이어티에 연결될 수 있다. 이러한 모이어티의 예는 콜레스테롤, 탄수화물, 비타민, 비오틴, 지질, 인지질, 안테나 내피를 포함하는 세포 투과 펩타이드, TAT, 트랜스포손 및 올리고아르기닌, 폴리-아르기닌, 올리고리신 또는 폴리라이신과 같은 양전하를 띤 아미노산, 항원-의존성 펩타이드 및 항원-결합 펩타이드를 포함하고, Fab 항체 단편, 또는 카펠로이드 단일 도메인 항원-결합 도메인과 같은 단일 사슬 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON 은 당업계에 공지된 적절한 수단을 사용하여 간접적으로 투여될 수 있다. 예를 들면 발현 벡터가 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 전사체를 암호화하는 발현 벡터의 형태로 개체 또는 개체의 세포, 조직 또는 기관에 제공될 수 있다. 발현 벡터는 바람직하게는 유전자 전달 비히클을 통해 세포, 조직, 기관 또는 개체 내로 도입된다.
바람직한 실시형태에서 본 명세서에서 확인된 바와 같이 AON의 발현 또는 전사를 유도하는 발현 카세트 또는 전사 카세트를 포함하는 바이러스성 발현 벡터가 제공된다. 따라서 본 발명은 엑손 스킵핑 AON의 발현 수행 조건 하에서 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑AON 을 발현하는 바이러스 벡터를 제공한다.
세포에 플라스미드-유도 AON 발현 또는 아데노바이러스- 또는 아데노-관련 바이러스-기반 벡터에 의해 제공되는 바이러스성 발현을 통해 비정상적인 USH2A 엑손 13을 매우 효율적으로 스킵핑할 수 있는 필수 서열에 간섭하는 엑손 스킵핑 분자를 제공할 수 있다. 발현은 U7 프로모터와 같은 폴리메라이제 Ⅱ-프로모터 (Pol Ⅱ) 또는 U6 RNA 프로모터와 같은 폴리메라이제 Ⅲ(Pol Ⅲ) 프로모터에 의해 유도될 수 있다.
바람직한 전달 비히클은 아데노 부속 바이러스 벡터(AAV)와 같은 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터와 같은 레트로 바이러스 벡터 등이다. 또한 플라스미드, 인공 염색체, 표적 상동성 재조합 및 세포의 인간 게놈에서의 통합에 이용 가능한 플라스미드는 본 명세서에서 정의된 올리고뉴클레오타이드의 전달에 적합하게 적용될 수 있다.
본 발명에서 바람직한 것은 전사가 Pol Ⅲ 프로모터로부터 유도된 벡터이고, 및/또는 전사체가 U1 또는 U7 전사체와의 융합 형태로 존재하며 작은 전사체를 전달하기 위한 우수한 결과를 나타내는 벡터이다. 적당한 전사체를 설계하는 것은 당업자의 기술 범위에서 가능하다.
Pol Ⅲ에 의해 유도된 전사체가 바람직하며 U1 또는 U7 전사체를 지니는 융합 전사체의 형태가 바람직하다. 이러한 융합은 기술된 바와 같이 생성될 수 있다(Gorman 등, 1998. 변형된 U7 작은 핵 RNA에 의한 프리-mRNA 스플라이싱 패턴의 안정적인 변경. Proc Natl Acad Sci USA 95 (9): 4929-34, Suter 등, 3종 인간 베타-탈라세미아 변이에서 비정상적 엑손 스킵핑을 효율적으로 촉진하는 이중-표적 안티센스 U7 snRNA. Hum Mol Genet 8 (13): 2415-23).
엑손 13 스킵핑 AON은 그 자체로 전달될 수 있다. 그러나 엑손 13 스킵핑 AON은 또한 바이러스 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 전형적으로 이것은 전사체의 일부 내에 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 RNA 전사체의 형태이다.
본 발명에 따른 AAV 벡터는 재조합 AAV 벡터이며 본 명세서 내에 도시된 바와 같이 AAV 혈청형으로부터 유래된 캡시드 단백질의 단백질 껍질 내에 캡슐화된 본 발명에 따른 암호화된 엑손 13 스킵핑 AON을 포함하는 AAV 게놈의 일부를 포함하는 AAV 벡터를 지칭한다.
AAV 게놈의 일부는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9 및 또 다른 아데노 관련 바이러스 혈청형으로부터 유래된 역 말단 반복부위(ITR)를 포함할 수 있다. 캡시드 단백질로 구성된 단백질 껍질은 AAV1, 2, 3, 4, 5, 8, 9 및 또 다른 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 단백질 껍질은 또한 캡시드 단백질 껍질로 명명될 수 있다. AAV 벡터는 바람직하게는 하나 또는 모든 야생형 AAV 유전자가 결실될 수 있으나 기능적 ITR 핵산 서열은 여전히 포함되어야 한다.
기능적 ITR 서열은 AAV 비리온의 복제, 복구 및 패키지에 필요하다. ITR 서열은 야생형 서열이거나 야생형 서열과 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 또는 100 % 서열 동일성을 지닌 것으로, 기능을 유지하는 한 예를 들면 뉴클레오타이드의 삽입, 변이, 결실 또는 치환에 의해 변형될 수 있다, 이러한 맥락에서 기능성은 게놈을 캡시드 껍질로 직접 패키지한 후 감염된 또는 표적 세포인 숙주 세포 내에서 발현을 허용하는 능력을 의미한다.
본 발명의 맥락에서 캡시드 단백질 껍질은 AAV 벡터 게놈 ITR과 상이한 혈청형일 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 AAV 벡터는 캡시드 단백질 껍질, 즉 AAV 혈청형 2와 같은 하나의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질(VP1, VP2 및/또는 VP3)을 포함하는 즉 20면체 캡시드와 같은 캡시드 단백질 껍질로 구성될 수 있으나 반면 AAV5 벡터 내에 포함된 ITR 서열은 AAV2 벡터를 포함하는 상기 개시된 AAV 혈청형 중 임의의 것일 수 있다.
따라서 "AAV2 벡터"는 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 껍질을 포함하나, "AAV5 벡터"는 AAV 혈청형 5의 캡시드 단백질 껍질을 포함하고, 이를 통해 본 발명에 따른 임의의 AAV 벡터 게놈 ITR을 캡시드화할 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2, 5, 8 또는 AAV 혈청형 9의 캡시드 단백질 껍질을 포함하며, 상기 AAV 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 2, 5, 8 또는 AAV 혈청형 9로부터 유래함을 특징으로 하며; 상기 AAV 벡터는 AAV2/2, AAV 2/5, AAV2/8, AAV2/9, AAV5/2, AAV5/5, AAV5/8, AAV 5/9, AAV8/2, AAV 8/5, AAV8/8, AAV8/9, AAV9/2, AAV9/5, AAV9/8 또는 AAV9/9로 언급된다
더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 껍질을 포함하고 상기 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 5로부터 유래되며; 이러한 벡터를 AAV 2/5 벡터라고 칭한다. 더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 껍질을 포함하고 상기 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 8로부터 유래되며; 이러한 벡터를 AAV 2/8 벡터라고 칭한다.
더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 껍질을 포함하고 상기 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 9로부터 유래되며; 이러한 벡터를 AAV 2/9 벡터라고 칭한다. 더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 껍질을 포함하고 상기 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 2로부터 유래되며; 이러한 벡터를 AAV 2/2 벡터라고 칭한다.
선택된 핵산 서열에 의해 표시되는 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON을 암호화하는 핵산 분자는 바람직하게는 AAV 게놈 또는 ITR 서열 사이에 삽입시킬 수 있으며 예를 들면 코딩 서열 및 3' 종결 서열을 작동 가능하게 연결시킨 발현 조절 엘레멘트를 포함하는 발현 컨스트럭트일 수 있다.
"AAV 헬퍼 기능"은 일반적으로 AAV 벡터에 공급되는 AAV 복제 및 패키징에 요구되는 대응하는 AAV 기능을 나타낸다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 벡터에서 누락된 AAV 기능을 보완하지만, AAV ITR(AAV 벡터 게놈에 의해 제공됨)은 결여되어 있다. AAV 헬퍼 기능은 AAV의 두 가지 주요 오픈 리딩 프레임, 즉 rep 코딩 영역 및 cap 코딩 영역 또는 그의 기능적으로 실질적으로 균등한 서열을 포함한다. Rep 및 Cap 영역은 당업계에 잘 알려져 있다. AAV 헬퍼 기능은 플라스미드일 수 있는 AAV 헬퍼 컨스트럭트를 통해 공급될 수 있다.
헬퍼 컨스트럭트의 숙주 세포로의 도입은 본 명세서에서 확인된 AAV 벡터 내에 존재하는 AAV 게놈의 도입으로 예를 들면 트랜스포메이션, 트랜스펙션 또는 트랜스덕션의 이전에 또는 동시에 진행할 수 있다.
따라서 본 발명의 AAV 헬퍼 컨스트럭트는 한편으로는 AAV 벡터의 캡시드 단백질 껍질 및 AAV 벡터 복제 및 패키징에 존재하는 AAV 게놈을 위해 AAV 벡터 캡시드 단백질 껍질을 위한 바람직한 혈청형의 조합을 생성하도록 선택될 수 있다. "AAV 헬퍼 바이러스"는 AAV 복제 및 패키징에 필요한 추가 기능을 제공한다.
적합한 AAV 헬퍼 바이러스는 아데노 바이러스, 단순 포진 바이러스(예: HSV 유형 1 및 2) 및 백시니아 바이러스를 포함한다. 헬퍼 바이러스에 의해 제공되는 추가 기능은 또한 본 명세서에 참고로 인용된 미국 특허 제6,531,456 호에 기술된 바와 같이 벡터를 통해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터에 존재하는 AAV 게놈은 AAV의 rep(복제) 또는 cap(캡시드) 유전자와 같은 바이러스 단백질을 암호화하는 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다.
AAV 게놈은 예를 들면 항생제 내성 유전자, 형광 단백질을 암호화하는 유전자(예를 들면 gfp) 또는 화학적, 효소적 또는 다른 방법으로 검출 가능한 및/또는 선택 가능한 생성물을 암호화하는 유전자(예를 들면 lacZ, aph 등)와 같은 당업계에 알려진 마커 또는 리포터 유전자를 더욱 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 AAV 벡터는 본 명세서 내의 실시예에 따른 방법에 의해 제조 및 생산된다.
본 발명에 따른 바람직한 AAV 벡터는 본 발명에 따른 USH21 엑손 13 스킵핑 AON을 발현하는 AAV 벡터, 바람직하게는 AAV2/5, AAV2/8, AAV2/9 또는 AAV2/2 벡터이고, 본 발명에 따른 또 다른 바람직한 AAV 벡터는 AAV 벡터, 바람직하게는 AAV2/5, AAV2/8 또는 서열번호: 12, 서열번호: 13 또는 서열번호: 14에 나타난 바와 같은 뉴클레오타이드 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 서열이다. 본 발명에 따른 더욱 바람직한 AAV 벡터는 AAV 벡터, 바람직하게는 AAV2/5, AAV2/8, AAV2/9 또는 AAV2/2 벡터이며, 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON은 서열번호: 5, 서열번호: 6 또는 서열번호: 7을 포함하거나 바람직하게는 구성된다.
본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON을 개체 또는 개체의 세포, 조직, 기관에 제공하는 수단의 개선은 이미 지금까지 달성된 진전을 고려함으로써 예측할 수 있다. 이러한 미래의 개선은 물론 본 발명의 방법을 사용하여 mRNA의 재구조화에 대한 언급된 효과를 달성하도록 통합될 수 있다.
본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON은 개체 또는 개체의 세포, 조직 또는 기관에 그대로 전달될 수 있다. 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON을 투여할 때, AON은 전달 방법과 양립될 수 있는 용액에 용해되는 것이 바람직하다. 망막 또는 내이 세포는 수용액 내에서 플라스미드 제공을 통해 AON 발현 플라스미드를 제공할 수 있다. 대안적으로 AON 발현을 위한 AON 또는 플라스미드의 바람직한 전달 방법은 바이러스 벡터 또는 나노 입자이다.
바람직하게는 바이러스 벡터 또는 나노 입자가 망막 또는 내이 세포에 전달되는 것이다. 망막 또는 내이 세포 또는 다른 관련 세포로의 이러한 전달은 생체 내, 시험관 내 또는 생체 내 일 수 있다. 생체 내 AON 전달에 사용될 수 있는 나노 입자 및 미세 입자는 당업계에 잘 알려져 있다. 대안적으로 플라스미드는 공지된 형질 감염 시약을 사용하여 형질 감염시킴으로써 제공될 수 있다. 정맥 내, 피하, 근육 내, 경막 내 및/또는 뇌척수강 내 투여를 위해 용액은 생리 식염수인 것이 바람직하다.
본 발명에서 특히 바람직한 것은 세포로 및/또는 세포(바람직하게는 망막 세포) 내로 본 명세서 내에서 정의된 바와 같은 각 구성 성분의 전달을 돕는 부형제 또는 형질 감염 시약의 사용이다. 세포막을 통해 비시클 또는 리포솜에 복합화된 또는 포획된 본 명세서 내에서 정의된 바와 같은 각각의 성분을 전달하는 복합체, 나노 입자, 마이셀, 비시클 및/또는 리포솜을 형성할 수 있는 부형제 또는 형질 감염 시약이 바람직하다. 이들 부형제 중 많은 것은 당업계에 공지되어 있다.
적합한 부형제 또는 형질 감염 시약은 폴리프로필렌이민(PEI; ExGen500 (MBI Fermentas)), LipofectAMINETM 2000(Invitrogen) 또는 그의 유도체, 폴리프로필렌이민 또는 폴리에틸렌이민 공중합체(PEC) 및 유도체를 포함하는 유사한 양이온성 중합체, 합성 양친매성 화합물(SAINT-18), lipofectinTM, DOTAP 및/또는 본 명세서 내에서 정의된 바와 같은 각각의 성분을 세포, 바람직하게는 망막 세포로 전달할 수 있는 입자로 자가 조립될 수 있는 바이러스 캡시드 단백질을 포함한다. 이러한 부형제는 AON을 망막 세포를 비롯한 다양한 배양 세포에 효율적으로 전달하는 것으로 나타났다.
이들의 높은 형질 감염 가능성은 전반적인 세포 생존의 측면에서 예외적으로 저급 내지 중급의 독성도와 결합된다. 구조 변형의 용이성은 추가의 변형 및 이들의 추가 (생체 내) 핵산 전달 특성 및 독성 분석을 가능하게 하는데 사용될 수 있다.
리포펙틴은 리포좀성 형질 감염 제제의 예를 나타낸다. 이것은 양이온성 지질 성분인 N-[1-(2,3 디올레일옥시)프로필] -N, N, N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)(메틸 황산염인 DOTAP)와 중성 지질 디올레일포스파티딜 에탄올아민(DOPE)으로 구성된다. 중성 성분은 세포 내 분비를 중재한다.
전달 시스템의 다른 그룹은 중합체성 나노 입자이다. DNA 형질 전환 시약으로 잘 알려진 디에틸아미노 에틸아미노에틸(DEAE)-덱스트란 같은 다중 양이온은 부틸시아노아크릴레이트(PBCA)와 헥실시아노아크릴레이트(PHCA)와 결합하여 AON을 세포막을 통해 세포로 전달할 수 있는 양이온성 나노 입자를 제형화할 수 있다.
이러한 일반적인 나노입자 물질 이외에 양이온 펩타이드 프로타민은 콜로이드와 올리고뉴클레오타이드를 제형화하는 대안적 접근 방식을 제공한다. 이 콜로이드성 나노 입자 시스템은 AON의 세포 내 방출을 패키징하고 중재하는 간단한 자가 조립 프로세스로 제조될 수 있는 소위 프로티클을 형성할 수 있다.
당업자는 USH2A 관련 질환 또는 상태의 예방, 치료 또는 지연을 위해 이를 전달하기 위해 본 발명에서 사용하기 위한 엑손 스킵핑 분자를 패키징하고 전달하기 위한 상업적으로 이용 가능한 다른 부형제 및 전달 시스템 중 임의의 것을 선택하고 적합화시킬 수 있다.
"USH2A 관련 질환 또는 상태의 예방, 치료 또는 지연"은 본 명세서 내에서 바람직하게는 부분적 또는 전체적인 시각 장애 또는 실명의 예방, 중단, 중지 또는 역전, 또는 장애의 진행을 예방, 중단, 중지시키는 것으로 정의된다. USH2A 유전자의 유전적 결함으로 인한 부분적으로 또는 완전한 청각 손상 또는 청각 장애를 역전시킨다.
또한 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON은 세포, 세포질 및/또는 그의 핵으로의 흡수를 촉진시키도록 특별히 설계된 표적화 리간드에 공유 결합 또는 비공유 결합될 수 있다. 이러한 리간드는 (ⅰ) 세포 흡수를 촉진시키는 세포, 조직 또는 기관 특이적 엘레멘트를 인식하는 화합물(펩티드 (유사) 구조를 포함하지만 이에 한정되지 않음) 및/또는 (ⅱ) 엔도좀 또는 라이소좀과 같은 비시클로부터의 올리고뉴클레오타이드의 세포 내 분비 및/또는 세포 내로 흡수를 용이하게 할 수 있는 화학적 화합물을 포함할 수 있다.
따라서 바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON은 적어도 부형체 및/또는 전달을 위한 표적화 리간드 및/또는 세포에 전달하기 위한 기구 및/또는 세포 내 전달을 증강시키기 위해 제공되는 조성물 또는 약제로 제형화될 수 있다.
조성물이 본 명세서 내에서 후술하는 보조제 화합물과 같은 부가적인 성분을 포함하는 경우 조성물의 각 성분은 하나의 단일 병용 또는 조성물 또는 제제로 제형화될 수 없음을 이해해야 한다. 그 성분에 따라 당업자는 본 명세서 내에서 정의된 바와 같이 각각의 성분에 대해 가장 적합한 제제의 유형을 판단하게 될 것이다.
바람직한 실시형태에서 본 발명은 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON 및 본 명세서 내에서 후술하는 추가의 보조제 화합물을 포함하는 부분 키트 형태인 조성물 또는 제형을 제공한다. 필요한 경우 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON 또는 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON을 발현하는 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 첨가함으로써 약제학적으로 활성적인 혼합물로 통합될 수 있다.
따라서 본 발명은 또한 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON, 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본 발명에 따른 단일 엑손 13 스킵핑 AON 또는 바이러스 벡터를 포함할 수 있으나 본 발명에 따른 다수 또는 별개의 엑손 13 스킵핑 AON 또는 바이러스 벡터를 포함할 수도 있다.
이러한 약제학적 조성물은 담체, 충전제, 방부제, 보조제, 용해제 및/또는 희석제를 포함하는 임의의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 충전제, 보존제, 보조제, 용해제 및/또는 희석제는 Remington(Remington, 2000. The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Baltimore, MD: Lippincott Williams Wilkins)에 예시되어 있다. 상기 조성물 각각의 특징은 앞서 본 명세서 내에서 정의되었다.
바람직한 투여 경로는 수용액의 유리체 내 주입 또는 안구 내 투여용으로 특별히 적합화된 제형이다. EP 2425814호에는 펩타이드 또는 핵산 약물의 안구 내(유리체 내) 투여에 특히 적합한 수중유 에멀젼이 개시되어 있다. 이 에멀젼은 유리체 내 유체보다 밀도가 낮기 때문에 유리체 상부에 유제가 부유되어 주입된 약물이 시력을 손상시키는 것을 방지한다.
본 발명에 따른 다수의 개별 엑손 13 스킵핑 AON이 사용되는 경우, 본 명세서 내에서 정의된 농도 또는 투여량은 사용된 모든 AON의 총 농도 또는 총 투여량이거나 사용 또는 첨가된 각각의 엑손 13 스킵핑 AON의 농도 또는 투여량을 지칭할 수 있다.
따라서 하나의 실시형태에서 사용된 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON의 개별 또는 전체 함량은 0.01 및 20 mg/kg 범위이고 바람직하게는 0.05 내지 20 mg/kg 범위의 함량으로 투여되는 조성물이다. 적절한 유리체 내 투여량은 안구 당 약 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg 또는 1.0 mg과 같이 안구 당 0.05 내지 5 mg, 바람직하게는 0.1 내지 1 mg일 것이다.
본 발명에 따른 바람직한 USH2A 엑손 13 스킵핑 AON은 개체의 USH2A 관련 질환 또는 상태의 치료를 위한 것이다. 본 발명의 모든 실시형태에서 용어 '치료'는 USH2A 관련 질환 또는 상태의 예방 및/또는 지연을 또한 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON을 사용하여 치료할 수 있는 개체는 이미 USH2A 관련 질환 또는 상태를 지니는 것으로 이미 진단된 경우이다.
대안적으로 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON을 사용하여 치료될 수 있는 개체는 USH2A 관련 질환 또는 상태를 지니는 것으로 아직 진단되지 않았으나 유전적 배경으로 USH2A 관련 질환 또는 상태가 장래에 발병할 위험성이 증가된 개체일 수 있다. 선호하는 개체는 인간 개체이다. 바람직한 실시형태에서 USH2A 관련 질환 또는 상태는 어셔 증후군 Ⅱ형이다.
따라서 본 발명은 추가로 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON, 본 발명에 따른 바이러스 벡터, 또는 USH2A의 스플라이싱 조절을 필요로 하는 USH2A 관련 질환 또는 상태의 치료에 사용하기 위한 의약 용도로 사용하기 위한 본 발명의 조성물 및 USH2A 관련 질환 또는 상태의 예방, 치료 또는 지연을 위한 의약으로서의 용도를 제공한다. 바람직한 USH2A 관련 질환 또는 상태는 어셔 증후군 Ⅱ형이다. 상기 용도의 각각의 특징은 앞서 본 명세서에서 정의되었다.
본 발명은 추가적으로 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON의 용도, 본 발명에 따른 바이러스 벡터의 용도 또는 USH2A의 스플라이싱 조절을 필요로 하는 USH2A 관련 질환 또는 상태의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물을 제공하는 것이다. 바람직한 실시형태에서 USH2A 관련 질환 또는 상태는 어셔 증후군 Ⅱ형이다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON의 용도, 본 발명에 따른 바이러스 벡터의 용도, 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 조성물, USH2A의 스플라이싱 조절을 요하는 USH2A 관련 질환 또는 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 조성물 및 USH2A 관련 질환 또는 상태의 예방, 치료 또는 지연을 위한 약제의 제조를 위한 조성물을 더욱 제공하는 것이다. 바람직한 USH2A 관련 질환 또는 상태는 어셔 증후군 Ⅱ형이다.
본 발명은 추가로 본 명세서 내에서 정의된 약제의 제조를 위한 엑손 13 스킵핑 AON의 용도, 바이러스 벡터의 용도, 약제의 제조를 위한 조성물의 용도, USH2A의 스플라이싱 조절을 요하는 USH2A 관련 질환 또는 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 조성물의 용도 및 USH2A 관련 질환 또는 상태의 예방, 치료 또는 지연을 위한 약제의 제조를 위한 조성물의 용도를 더욱 제공하는 것이다. 바람직한 USH2A 관련 질환 또는 상태는 어셔 증후군 Ⅱ형이다. 상기 용도의 각각의 특징은 전술하는 본 명세서 내에서 상세히 설명하였다.
본 발명에 따른 치료 용도 또는 치료법은 적어도 1회, 적어도 1 주간, 1 개월간, 수개월간, 1년, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년 또는 6 년 또는 평생과 같은 긴 기간 지속된다. 본 발명에 사용하기 위해 본 명세서 내에서 정의된 각각의 엑손 13 스킵핑 AON 또는 이의 균등물을 이미 영향을 받은 개체 또는 USH2A 관련 질환 또는 상태가 발병할 위험성이 있는 개체의 생체 내에서 세포, 조직 및/또는 기관에 직접 투여하는 것이 적합할 수 있으며 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 직접 투여할 수도 있다.
본 발명의 AON, 조성물, 화합물 또는 보조 화합물의 투여 빈도는 질환의 중증도, 환자의 연령, 환자의 변이, 엑손 13 스킵핑 AON의 수(즉 투여량), 상기 AON의 제형, 투여 경로 등을 포함하는 몇 가지 변수에 따라 변동될 수 있다. 빈도는 매일, 매주, 적어도 2 주에 1 회, 또는 3 주 또는 4 주 또는 5 주 또는 더 긴 기간 간격으로 다양할 수 있다.
본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON의 투여량 범위는 엄격한 프로토콜 요건이 존재하는 임상 시험(생체 내 사용)에서 투여량 연구에 기초하여 설계되는 것이 바람직하다. 본 명세서 내에서 정의된 엑손 13 스킵핑 AON은 0.01 및 20 mg/kg, 바람직하게는 0.05 및 20 mg/kg 범위의 투여량으로 사용될 수 있다. 적절한 유리체강 내 투여량은 안구 당 0.05 mg과 5 mg 사이, 바람직하게는 안구 당 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg 또는 1.0 mg인 안구 당 0.1 mg 및 1 mg 사이이다.
바람직한 실시형태에서 본 명세서 내에서 정의된 AON의 농도는 0.1 nM 내지 1 μM 범위로 사용된다. 바람직하게는 이 범위는 망막 세포 또는 망막 조직과 같은 세포 모델에서 시험관 내 사용을 위한 것이다. 보다 바람직하게는 사용된 농도는 1 내지 400 nM, 더욱 바람직하게는 10 내지 200 nM, 더욱 바람직하게는 50 내지 100 nM의 범위이다. 다양한 AON이 사용되는 경우 이 농도 또는 용량은 AON의 총 농도 또는 첨가된 각각의 AON의 농도 또는 용량으로 언급될 수 있다.
바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 분자의 전달 비히클로서 본 명세서 내에서 전술한 바와 같은 바이러스 벡터, 바람직하게는 AAV 벡터는 주사 당 1×109 내지 1×1017 바이러스 입자 범위, 보다 바람직하게는 주사 당 1×1010 내지 1×1012 바이러스 입자 범위의 투여량으로 주입하는 것이다. 상기 주어진 AON의 농도 또는 용량의 범위는 생체 내, 시험관 내 또는 생체 외 사용을 위한 바람직한 농도 또는 투여량이다.
당업자는 사용된 AON, 치료하고자 하는 표적 세포, 유전자 표적 및 그 발현 수준, 사용된 배지 및 형질 감염 및 배양 조건에 따라 사용되는 AON의 농도 또는 용량이 더 다양할 수 있으며 더욱 최적화될 필요가 있음을 이해할 것이다.
본 발명에 따른 용도를 위한 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON, 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터, 또는 본 발명에 따른 조성물은 이미 USH2A 관련 질환에 걸렸거나 USH2A 관련 질환의 발병 위험성을 지니는 개체의 생체 내에서 세포, 조직 및/또는 기관에 투여하기에 적합할 수있으며 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 투여될 수 있다.
상기 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON, 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터, 또는 본 발명에 따른 조성물은 이미 USH2A 관련 질환에 걸렸거나 USH2A 관련 질환의 발병 위험성을 지니는 개체의 생체 내에서 세포, 조직 및/또는 기관에 직접 또는 간접적으로 투여하기에 적합할 수 있으며 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 직접 또는 간접적으로 투여될 수 있다.
어셔 증후군 Ⅱ 형은 망막 및 내이 세포에서 현저한 표현형을 가지므로 상기 세포는 망막 또는 내이 세포인 것이 바람직하고, 상기 조직은 망막 또는 내이이며 더욱 바람직하게는 그 기관은 눈이나 귀이다.
본 발명은 또한 세포, 바람직하게는 망막 세포를 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 USH2A의 스플라이싱을 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명의 특징은 바람직하게는 본 명세서 내에서 앞서 정의된 특징이다.
본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 조성물과 세포를 접촉시키는 것은 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 엑손 13 스킵핑 AON, 바이러스 벡터 및 조성물의 전달 방법의 용도를 포함한다. 접촉은 직접 또는 간접적일 수 있으며 생체 내, 생체 내 또는 시험관 내일 수 있다.
본 발명은 추가로 개체 내에서 USH2A 스플라이싱의 조절을 요구하는 USH2A 관련 질환 또는 상태의 치료 방법을 제공하는 것으로 상기 방법은 상기 개체의 세포, 바람직하게는 망막 세포에 본 발명에 따른 엑손 13 스킵핑 AON, 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 조성물을 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 특징은 바람직하게는 본 명세서 내에서 앞서 정의된 특징이다.
본 발명에 엑손 13 스킵핑 AON, 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 조성물과 세포, 바람직하게는 망막 세포를 접촉시키는 것은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 AON, 바이러스 벡터 및 조성물의 전달 방법의 용도를 포함한다. 접촉은 직접 또는 간접적일 수 있으며 생체 내, 생체 내 또는 시험관 내일 수있다. 다르게 지시되지 않는 한 본 명세서 내에 기재된 바와 같은 각각의 실시형태는 본 명세서 내에 기재된 다른 실시형태와 조합될 수 있다.
본 명세서에 제공된 서열 정보를 너무 좁게 해석하여 잘못 식별된 염기를 포함하지 않도록 하여야 한다. 당업자는 이러한 잘못 식별된 염기를 식별할 수 있으며 이러한 오류를 수정하는 방법을 인지하고 있다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 통합되어 있다.
(실시예 1) 인간 USH2A 프리-mRNA 내에서 엑손 13의 효율적 스킵핑을 위한
대안적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)의 제공 및 시험
인간 USH2A 유전자의 엑손 13의 서열을 엑손성 스플라이스 인핸서 모티프의 존재를 통해 추가로 분석하였다. 다중 사이트는 초기에 결정되었으며(도 1 참조) 이어서 5 개의 RNA AON (Ex13-1 내지 Ex13-5)을 IDT에서 구입하여 용융온도 58 ℃로 설계하였다. 초기에 모든 AON은 당 사슬 부위에서 2'-O-메틸기로 변형되었으며 포스포로티오에이트 골격을 지닌다. AON은 인산 완충 식염수에 용해시켰다.
배양 조건, 형질 감염, RT-PCR 및 분석 프로토콜은 WO 2016/005514호에 개시된 바와 같으며 당업자에게 공지된 일반적인 방법을 사용하였다. 10%(v/v) 우태아 혈청 (Sigma), 1% 10 U/μl 페니실린, 10 μg/μl 스트렙토마이신(Gibco) 및 1% GlutaMAX (Gibco)를 포함하는 RPMI1640 배지(Gibco) 내에서 인간 망막모세포종 세포를 0.5×106 세포/ml의 농도로 배양하였다. 세포를 일주일에 두 번 계대 배양하였다.
우선 AON1, AON2 및 Ex13-1 내지 Ex13-5 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 USH2A 프리-mRNA로부터 엑손 13을 스킵핑하는 능력에 대해 시험하였다. 형질 감염 전에 0.9ml Optimem의 총 부피로 1.0×106의 Weri-Rb1 세포를 6-웰 플레이트의 각 웰에 분주하였다. 형질 감염 혼합물은 원하는 농도의 1μl AON으로 보충된 50μl의 Optimem과 1.25μl의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)이 보충된 50μl의 Optimem을 혼합함으로써 제조하였다.
두 혼합물을 실온에서 5 분 동안 인큐베이션시켰다. 이 배양 단계 후에 두 혼합물을 철저하게 함께 혼합하고 세포에 첨가하기 전에 실온에서 추가 20 분 동안 배양하였다. 형질 감염 48 시간 후에 세포를 수집하고 직접 RNA 분리 절차를 수행하기 전에 1x PBS로 세척하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 Nucleospin RNA Ⅱ 분리 키트 (Machery Nagel)를 사용하여 형질 감염된 세포로부터 총 RNA를 분리하였다.
이어서 iScript cDNA 합성 키트 (Bio-Rad)를 사용하여 cDNA 합성을 위해 총 RNA 1μg을 사용하였다. cDNA의 5%를 각 PCR 반응에 사용하였다. USH2A cDNA의 일부는 표준 PCR 조건 하에서 인간 USH2A 유전자의 엑손 11 및 엑손 15에 각각 위치하는 정방 프라이머 (본 명세서에서 서열번호: 10으로 제공됨) 및 역방 프라이머 (본 명세서에서 서열번호: 11로 제공됨)를 사용하여 표준 PCR 조건하에 증폭시켰다.
PCR 생성물을 1.5% 아가로즈 겔에서 분리하였다. 정상 또는 비정상적으로 스플라이싱된 USH2A를 나타내는 밴드를 겔에서 분리하고 Nucleospin Extract Ⅱ 분리 키트를 사용하여 정제하고 ABIPRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing V2.0 Ready 반응 키트 및 ABIPRISM 3730 DNA 분석기(Applied Biosystems)를 통해 모든 가닥을 확인하여 서열분석 하였다.
RT-PCR 분석은 Weri-Rb1 세포에서 USH2A mRNA의 발현을 나타내었으며 AON1의 형질 감염은 엑손 12/13의 이중 스킵핑 뿐만 아니라 엑손 13 단독 스킵핑 또한 유도하였다 (WO 2016/005514의 도 5).
본 명세서 내에 개시된 신규한 AON의 목표는 엑손 13 단독 스킵핑 생성물의 증가와 함께 엑손 12를 보다 효율적으로 보유시키는 올리고뉴클레오타이드를 분리할 수 있는지 여부를 확인하는 것이다. 엑손 11에 위치한 정방 프라이머와 엑손 15에 위치한 역방 프라이머를 사용하여 RT 생성물을 분석함으로써 그러한 것이 실제로 가능하다는 것을 규명하였다.
도 2는 AON1 및 AON2를 대조군으로 사용하고 새로 식별된 AON인 Ex13-1 내지 Ex13-5를 사용하여 나타난 결과이다. AON2가 엑손 12와 엑손 13의 이중 스킵핑을 주로 유도하며 엑손 13 단독 스킵핑의 신호는 거의 유도하지 않는 것으로 나타났다. 놀랍게도 Ex13-1, Ex13-2 및 Ex13-3은 AON1 및 Ex13-4보다 단일 (엑손 13) 스킵핑에 대해 더 강한 신호를 나타내는 것으로 나타났지만 Ex13-5의 경우 그 신호가 거의 나타나지 않았다.
Ex13-3으로 형질 감염시킨 후에 비-스플라이싱된 생성물(겔 내의 상부)은 거의 나타나지 않았다. 또한 Ex13-3을 사용한 후 이중 엑손 12/13 스킵핑의 신호는 단일 (엑손 13) 스킵핑보다 낮은 강도를 나타내며 알려진 AON보다 향상되었음을 나타내었다.
(실시예 2) 상이한 화학적 변형을 지니는 AON을 사용한 Weri-Rb1 세포 내의
엑손 13 스킵핑
배양 조건, 형질 감염, RT-PCR 및 분석 프로토콜은 WO 2016/005514 및 상기 실시예 1에 개시된 바와 같다. 배양하기 전에 1.0x106 Weri-Rb1 세포를 6-웰 플레이트의 각 웰에 접종하였다. 세포를 Ex13-3 서열(서열번호: 7)을 지닌 합성 및 분리 올리고뉴클레오타이드와 함께 형질 감염제 첨가 없이 짐노틱하게 인큐베이션시켰으나 5종의 서로 다른 화학적 변형 패턴을 수행하였다 (LGD Biosearch로부터 구입):
Ex13-3 2OMe (또는 Ex13-3 OMe) = 'm' 소문자는 모든 당 부분 내의 2'-O-메틸 변형을 나타내고 별표(*)는 완전한 포스포로티오에이트 골격을 나타낸다.
5'-mA*mG*mC*mU*mU*mC*mG*mG*mA*mG*mA*mA*mA*mU*mU*mU*mA*mA*mA*mU*mC-3'
Ex13-3 2MOE (또는 Ex13-3 MOE) = 'M' 대문자는 모든 당 부분 내의 2'-O-메톡시에틸 변형을 나타내고 별표 (*)는 완전한 포스포로티오에이트 골격을 나타낸다: 모든 2'-O-메톡시에틸 변형 U는 실제로 5-메틸우리딘(= m5U 또는 티미딘)이고 모든 2'-O-메톡시에틸 변형 C는 실제로 5-메틸시토신(m5C)이다.
5'-MA*MG*MC*MU*MU*MC*MG*MG*MA*MG*MA*MA*MA*MU*MU*MU*MA*MA*MA*MU*MC-3'
Ex13-3 MOE OMe = 각각 'M'(대문자) 및 'm'(소문자) 는 당 부분 내의 MOE 2'-O-메톡시에틸 변형 또는 2'-O-메틸 변형을 나타내고 별표(*)는 완전한 포스포로티오에이트 골격을 나타낸다: 모든 2'-O-메톡시에틸 변형 U는 실제로 5-메틸우리딘(= m5U 또는 티미딘)이고 모든 2'-O-메톡시에틸 변형 C는 실제로 5-메틸시토신(m5C)이다.
5'-MA*MG*MC*MU*MU*mC*mG*mG*mA*mG*mA*mA*mA*mU*mU*mU*MA*MA*MA*MU*MC-3'
Ex13-3 8PS = 'm' 소문자는 모든 당 부분 내의 2'-O-메틸 변형을 나타내고 별표 (*)는 골격 내의 8개 포스포로티오에이트 연결(각 말단에서 4개)을 나타낸다:
5'-mA*mG*mC*mU*mUmCmGmGmAmGmAmAmAmUmUmUmA*mA*mA*mU*mC-3'
Ex13-3 11PS = 'm' 소문자는 모든 당 부분 내의 2'-O-메틸 변형을 나타내고 별표 (*)는 골격 내에 분산된 11개 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다:
5'-mA*mG*mC*mUmU*mCmG*mGmAmGmAmA*mAmU*mUmU*mAmA*mA*mU*mC-3'
AON을48 시간 동안 5 가지 및 10μM의 두 가지 농도로 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 대조군 AON은 전체 포스포로티오에이트화 골격을 함유하고 각 당 부분에 2'-O- 메틸 변형을 함유하였다. 대조군 AON은 다음 서열을 지니며, 5'-GGAUAGGUAUGAGAUAC-3'(서열번호: 22) 10 μM의 농도로 사용하였다. 인큐베이션 후 세포를 수집하고 RNA 분리를 직접 시행하기 전에 1x PBS로 세척하였다. 총 RNA를 실시예 1에서 기술된 바와 같이 분리하였다.
총 USH2A 발현 (Applied Biosystems, # Hs01071797_m1) 을 정량하기 위한 2개의 Taqman 유전자 발현 에세이와 USH2A (Applied Biosystems, # Hs01071800_m1) 내의 엑손 13 스킵핑 백분율을 정량하기 위한 에세이를 멀티플렉스 드랍렛 디지털 PCR (ddPCR) 반응을 통해 수행하였다. 인간 USH2A 유전자 내의 엑손 13 및 엑손 14 에 위치하는 정방 프라이머(본 명세서 내에서 서열번호: 17로 제공됨), 역방 프라이머(본 명세서 내에서 서열번호: 18로 제공됨) 및 6-플루오레세인 아미디트(6-FAM) 표지된 프로브(본 명세서 내에서 서열번호: 19로 제공됨)를 USH2A mRNA에서 엑손 13 스킵핑을 측정하기 위해 사용하였다.
제조자의 프로토콜을 사용하여 프로브용 슈퍼 믹스(dUTP 없음, Bio-Rad, # 186-3025)를 사용하여 ddPCR 혼합물을 준비하였다. ddPCR 에세이는 QX2000 Droplet Digital PCR 시스템(Bio-Rad)에서 수행되었다. Quanta Life Software(Bio-Rad) 및 Microsoft Excel을 사용하여 분석을 수행하였다. 총 USH2A mRNA 수준을 야생형 및 엑손 13스킵핑 USH2A mRNA 수준의 보정을 위해 사용하였다. 도 3은 상기 개략한 상이한 화학적 변형을 지닌 Ex13-3 올리고뉴클레오타이드로부터 수득된 결과를 나타낸다.
형질감염제를 사용하지 않는 조건 하에서 2'-OMe 변형 단독 또는 8PS 또는 11PS 변형보다 2'-O-메톡시에틸 (2'-O-MOE; 또는 2'-MOE = 2'-메톡시에톡시) 변형 단독 또는 2'-O-메틸 (2'-OMe) 변형 결합이 더욱 우세하게 나타남을 시각적으로 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 AON은 바람직하게는 당 부분에 2'-O-MOE 변형을 지닌 하나 이상의 뉴클레오타이드이거나 완전히 2'-O-MOE로 변형된 것이다. 이러한 짐노틱 조건 하에서 5 % 엑손 스킵핑 정도를 달성하였다.
Ex13-3 완전한 2'-O-메틸 및 완전 2'-O-메톡시에틸 버전을 용량-반응 시험을 통해 시험하였으나 이제 다시 형질감염 시약을 이용하여 Weri-Rb1 세포에서 시험하였다. 시험은 Ex13-3 AON의 스크램블된(scr) 버전을 대조군으로 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였고 ddPCR 분석은 전술한 바와 같았고 엑손 13 스킵핑 mRNA의 백분율을 결정하기 위해 다시 사용하였다.
10, 25, 50, 100 및 200 nM농도로 형질 감염된 AON을 시험하였다. 대조군 AON은 200nM의 최고 농도에서만 사용되었다. 결과를 도 4에 나타내었고, AON의 농도를 증가시켰을 때의 엑손 스킵핑 효과의 증가가 명확하게 나타났으며 또한 당 부분에서 2'-O-메틸 변형만을 지닌 AON보다 2'-O-메톡시에틸 변형을 지닌 AON이 보다 우수한 효과를 명백히 나타내었다.
(실시예 3) USH2A 환자 섬유아세포로부터 생성된 옵틱 컵 내에서 엑손 13
스킵핑을 유도하는 AON
이형 접합 화합물 내의 USH2A c.7595-2144A>G (p.Lys2532Thrfs*56) 및 c.2299delG (p.Glu767Serfs) 변이를 포함하여 USH2 환자로부터의 섬유아세포와 건강한 공여자로부터 섬유아세포를 옵틱 컵 생성을 위해 사용하였다. 각각의 개체로부터 섬유아세포는 Radboud UMC 줄기 세포 기술 센터에서 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 발현하는 4 종의 렌티 바이러스를 사용하여 재프로그램하였다(Okita 등. 2011. 인티그레이션 없는 인간 iPS 세포를 생성하는 보다 효율적인 방법. Methods 8 : 409-412).
간단히 말해 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC) 라인은 피더 세포(마우스 배아 섬유아세포)에서 생성되었으며 이후 필수 8 배지(Life Technologies; cat # A1517001)에서 유지되었다. 3 개의 클론을 6 패시지에 저온 보존하고 다능성 줄기 세포 마커(SSEA-4, NANOG, TRA1-81 및 OCT3/4)의 발현을 면역 세포 화학법으로 분석하였다.
또한 qPCR 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같이 총 RNA 분리 후 다능성 마커 LIN28, NANOG, OCT3/4 및 SOX2에 대해 수행되었다. 이어서 iPSC 콜로니를 채취하고 mTeSR1 배지에서 현탁 배양하여 응집체 형성을 유도 하였다. 응집체는 점진적으로 신경 유도 배지로 전이되었다. 7일 후, 응집체를 Matrigel 코팅 접시에 접종하고 배지를 매일 교체하였다.
분화 4 주째, 말굽 모양의 NR 도메인을 예리한 텅스텐 바늘로 수작업으로 떼어 내고 서서히 2 ~ 3 개월 동안 배양하여 3 차원 옵틱 컵을 점차적으로 형성시켰다(자세한 내용은 Zhong 등 2014 참조. 인간 iPSCs로부터의 기능적 광 수용체를 갖는 3 차원 망막 조직. Nat Comm 5 : 4047).
iPSC 유래 옵틱 컵을 성공적으로 생성한 후 (3 개월 분화 후) 완전히 2'-O-메틸로 변형된 Ex13-3 올리고뉴클레오타이드로 처리하고 완전한 포스포로티오에이트 골격으로 변형하였다. 치료는 서로 다른 2종 농도로 1개월 간 지속하였다: 2μM 및 10μM 이며 AON이 함유된 배지를 격일로 교체 신선화 시켰다. USH2A 전사체 분석을 통해 엑손 11 및 엑손 15의 인접 영역에 존재하는 프라이머로 성숙한 mRNA 내의 야생형 레벨 대 엑손 13 스킵핑 레벨을 측정하였다.
도 5는 이러한 분석 결과를 나타낸다 (옵틱 컵은 3 배로 생성되었으며 각 레인은 하나의 옵틱 컵을 나타냄). 처리되지 않은 옵틱 컵은 1239 bp의 야생형 밴드를 나타내었다. 2 μM 또는 10 μM Ex13-3으로 옵틱 컵을 처리하면 597 bp의 엑손 13이 없는 밴드가 생성되었다. 때로는 401bp의 밴드 (엑손 12와 엑손 13의 이중 스킵핑을 나타냄)가 환자 유래의 옵틱 컵뿐만 아니라 건강한 공여자의 옵틱 컵에서도 발생하였다.
후속 실험에서 상기한 바와 같이 동형 접합체에서 USH2A c.2299delG (p.Glu767Serfs) 변이를 지닌 USH2 환자의 섬유아세포로부터 옵틱 컵을 생성하였으나 예외적으로 배아체를 형성하기 위해 iPSC 콜로니를 선별 배양하였다 (문헌 Sangermano 등. 2016. Ophthalmology 123 (6) : 1375-85). 요약하면 배아체는 점차적으로 분화 배지로 전이되었다. 배아체를 7 일 후 Matrigel 코팅 접시에 뿌리고 배지를 매일 교체하여 옵틱 컵을 생성하였다.
성공적으로 생성시킨 후 격일로 교체하는 배지에 함유된 1μM, 2μM, 5μM 및 10μM 농도의 AON을 사용하여 1 개월 동안 Ex13-3 2'MOE 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (실시예 2 참조) 옵틱 컵을 처리하였다. 대조군으로서는 완전한 포스포로티오에이트 골격을 지닌 다음 서열 5'-CCUCUUACCUCAGUUACA-3'(서열번호: 23)을 지니고 당 부분이 2'-O-메톡시에틸로 변형된 AON을 사용하였다. 이 대조군 AON내에서 모든 2'-O-메톡시에틸 변형된 U'는 실제로 5-메틸우리딘 (= m5U 또는 티미딘)이고 모든 2'-O-메톡시에틸 변형된 C'는 실제로 5-메틸시토신 (m5C)이다.
그런 다음 USH2A 전사체 분석을 통해 mRNA에서 야생형 수준 대 엑손-13 스킵핑 수준을 결정하였다. 멀티플렉스 ddPCR 반응을 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 총 USH2A mRNA 수준을 사용하여 야생형 수준 및 엑손 13 USH2A mRNA 수준을 보정하였다. 도 6은 옵틱 컵 상에 Ex13-3 2'MOE 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 얻은 ddPCR 결과를 나타낸다.
형질감염 시약이 사용되지 않은 이러한 짐노틱 조건에서 단독으로 사용된 2'-O-메톡시에틸 변형은 USH2A mRNA에서 엑손 13 스킵핑을 유도하는데 효과적이라는 것이 명확하게 나타났다. 따라서 본 발명에 따른 AON은 바람직하게는 당 부분에 2'-O-MOE 변형을 지닌 하나 이상의 뉴클레오타이드이거나 또 다른 바람직한 실시형태에서 완전하게 2'-O-MOE로 변형된 것이다.
이러한 데이터는 in vitro 눈 모델에서 형질감염 시약을 사용하지 않고 엑손 스킵핑을 유도하는 AON으로 처리하면 USH2A 환자 물질에서 USH2A 프리-mRNA의 엑손 13이 유의미하게 스킵핑되는 결과를 나타낸다.
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<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 670
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
taaatatatt ttatctttag ggcttaggtg tgatcattgc aattttggat ttaaatttct 60
ccgaagcttt aatgatgttg gatgtgagcc ctgccagtgt aacctccatg gctcagtgaa 120
caaattctgc aatcctcact ctgggcagtg tgagtgcaaa aaagaagcca aaggacttca 180
gtgtgacacc tgcagagaaa acttttatgg gttagatgtc accaattgta aggcctgtga 240
ctgtgacaca gctggatccc tccctgggac tgtctgtaat gctaagacag ggcagtgcat 300
ctgcaagccc aatgttgaag ggagacagtg caataaatgt ttggagggaa acttctacct 360
acggcaaaat aattctttcc tctgtctgcc ttgcaactgt gataagactg ggacaataaa 420
tggctctctg ctgtgtaaca aatcaacagg acaatgtcct tgcaaattag gggtaacagg 480
tcttcgctgt aatcagtgtg agcctcacag gtacaatttg accattgaca attttcaaca 540
ctgccagatg tgtgagtgtg attccttggg gacattacct gggaccattt gtgacccaat 600
cagtggccag tgcctgtgtg tgcctaatcg tcaaggaaga aggtgtaatc agtgtcaacc 660
aggtaagaaa 670
<210> 2
<211> 642
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ggcttaggtg tgatcattgc aattttggat ttaaatttct ccgaagcttt aatgatgttg 60
gatgtgagcc ctgccagtgt aacctccatg gctcagtgaa caaattctgc aatcctcact 120
ctgggcagtg tgagtgcaaa aaagaagcca aaggacttca gtgtgacacc tgcagagaaa 180
acttttatgg gttagatgtc accaattgta aggcctgtga ctgtgacaca gctggatccc 240
tccctgggac tgtctgtaat gctaagacag ggcagtgcat ctgcaagccc aatgttgaag 300
ggagacagtg caataaatgt ttggagggaa acttctacct acggcaaaat aattctttcc 360
tctgtctgcc ttgcaactgt gataagactg ggacaataaa tggctctctg ctgtgtaaca 420
aatcaacagg acaatgtcct tgcaaattag gggtaacagg tcttcgctgt aatcagtgtg 480
agcctcacag gtacaatttg accattgaca attttcaaca ctgccagatg tgtgagtgtg 540
attccttggg gacattacct gggaccattt gtgacccaat cagtggccag tgcctgtgtg 600
tgcctaatcg tcaaggaaga aggtgtaatc agtgtcaacc ag 642
<210> 3
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic antisense oligonucleotide AON1
<400> 3
gagccaugga gguuacacug gcag 24
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic antisense oligonucleotide AON2
<400> 4
acacaggcac uggccacuga uu 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic antisense oligonucleotide Ex13-1
<400> 5
caccuaagcc cuaaagauaa aau 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic antisense oligonucleotide Ex13-2
<400> 6
caccuaagcc cuaaagauaa aau 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic antisense oligonucleotide Ex13-3
<400> 7
agcuucggag aaauuuaaau c 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic antisense oligonucleotide Ex13-4
<400> 8
ggcucacauc caacaucau 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic antisense oligonucleotide Ex13-5
<400> 9
ucacacugcc cagagugag 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer exon 11
<400> 10
aagttggtgc agatccttcg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer exon 15
<400> 11
agaaacactg gcctgtgacc 20
<210> 12
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
auuuuaucuu uagggcuuag gug 23
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
uuuagggcuu aggugugauc a 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
gauuuaaauu ucuccgaagc u 21
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
augauguugg augugagcc 19
<210> 16
<211> 19
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
cucacucugg gcaguguga 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer ddPCR
<400> 17
tgggacagtg gatggagata 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer ddPCR
<400> 18
tggcattgcc tggagaaata 20
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Probe ddPCR
<400> 19
attcaggcca gtgcaagtgc aaag 24
<210> 20
<211> 670
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
uaaauauauu uuaucuuuag ggcuuaggug ugaucauugc aauuuuggau uuaaauuucu 60
ccgaagcuuu aaugauguug gaugugagcc cugccagugu aaccuccaug gcucagugaa 120
caaauucugc aauccucacu cugggcagug ugagugcaaa aaagaagcca aaggacuuca 180
gugugacacc ugcagagaaa acuuuuaugg guuagauguc accaauugua aggccuguga 240
cugugacaca gcuggauccc ucccugggac ugucuguaau gcuaagacag ggcagugcau 300
cugcaagccc aauguugaag ggagacagug caauaaaugu uuggagggaa acuucuaccu 360
acggcaaaau aauucuuucc ucugucugcc uugcaacugu gauaagacug ggacaauaaa 420
uggcucucug cuguguaaca aaucaacagg acaauguccu ugcaaauuag ggguaacagg 480
ucuucgcugu aaucagugug agccucacag guacaauuug accauugaca auuuucaaca 540
cugccagaug ugugagugug auuccuuggg gacauuaccu gggaccauuu gugacccaau 600
caguggccag ugccugugug ugccuaaucg ucaaggaaga agguguaauc agugucaacc 660
agguaagaaa 670
<210> 21
<211> 642
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
ggcuuaggug ugaucauugc aauuuuggau uuaaauuucu ccgaagcuuu aaugauguug 60
gaugugagcc cugccagugu aaccuccaug gcucagugaa caaauucugc aauccucacu 120
cugggcagug ugagugcaaa aaagaagcca aaggacuuca gugugacacc ugcagagaaa 180
acuuuuaugg guuagauguc accaauugua aggccuguga cugugacaca gcuggauccc 240
ucccugggac ugucuguaau gcuaagacag ggcagugcau cugcaagccc aauguugaag 300
ggagacagug caauaaaugu uuggagggaa acuucuaccu acggcaaaau aauucuuucc 360
ucugucugcc uugcaacugu gauaagacug ggacaauaaa uggcucucug cuguguaaca 420
aaucaacagg acaauguccu ugcaaauuag ggguaacagg ucuucgcugu aaucagugug 480
agccucacag guacaauuug accauugaca auuuucaaca cugccagaug ugugagugug 540
auuccuuggg gacauuaccu gggaccauuu gugacccaau caguggccag ugccugugug 600
ugccuaaucg ucaaggaaga agguguaauc agugucaacc ag 642
<210> 22
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Control AON
<400> 22
ggauagguau gagauac 17
<210> 23
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Control AON
<400> 23
ccucuuaccu caguuaca 18
Claims (19)
- 인간 USH2A 프리-mRNA 내에서 엑손 13을 스킵핑하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (AON)에 있어서, AON 은 생리학적 조건 하에서 서열번호: 12, 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 서열 또는 그것의 일부에 결합 및/또는 상보적임을 특징으로 하는 AON.
- 인간 USH2A 프리-mRNA 내에서 엑손 13을 스킵핑하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (AON)에 있어서, AON 은 서열번호: 5, 서열번호: 6 또는 서열번호: 7 의 서열을 포함하거나 서열로 구성된 것임을 특징으로 하는 AON.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 AON은 올리고리보뉴클레오타이드임을 특징으로 하는 AON.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AON은 2'-O-메틸 변형된 당과 같은 2'-O 알킬 변형을 포함함을 특징으로 하는 AON.
- 제 4항에 있어서, 상기 AON 내의 모든 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형된 것임을 특징으로 하는 AON.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AON은 2'-O-메톡시에틸 변형을 포함함을 특징으로 하는 AON.
- 제 6항에 있어서, 상기 AON의 모든 뉴클레오타이드는 2'-O-메톡시에틸 변형을 지님을 특징으로 하는 AON.
- 제 4항 또는 제 6항에 있어서, 상기 AON은 2'-O-메틸 및 2'-O-메톡시에틸 변형을 포함하는 올리고리보뉴클레오타이드임을 특징으로 하는 AON.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, AON은 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 지님을 특징으로 하는 AON.
- 제 9항에 있어서, 모든 순차적 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 결합으로 상호 연결됨을 특징으로 하는 AON.
- 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 AON 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제 11항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 유리체 내 투여용이고, 안구 당 0.05 mg 및 5 mg 범위의 총 AON 양으로 투여되는 약제학적 조성물.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 유리체 내 투여용이고, 안구 당 총 AON은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 mg와 같은 0.1 내지 1 mg 범위의 용량으로 투여됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항에 따른 AON을 발현하는 바이러스 벡터.
- 약제로 사용하기 위한 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 AON, 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물, 또는 제 14항에 따른 바이러스 벡터.
- 어셔 증후군 Ⅱ형과 같은 USH2A 프리-mRNA 의 스플라이싱 조절을 요하는 USH2A 관련 질환 또는 상태의 치료, 예방 또는 지연을 위한 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 AON, 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물, 또는 제 14항에 따른 바이러스 벡터.
- 약제의 제조를 위한 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 AON, 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물, 또는 제 14항에 따른 바이러스 벡터의 용도.
- 어셔 증후군 Ⅱ형과 같은 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱 조절을 요하는 USH2A 관련 질환 또는 상태의 치료, 예방 또는 지연을 위한 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 AON, 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물, 또는 제 14항에 따른 바이러스 벡터의 용도.
- 세포 내에서 USH2A 프리-mRNA의 스플라이싱을 조절하는 방법에 있어서, 상기 방법은 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 AON, 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물, 또는 제 14항에 따른 바이러스 벡터와 세포를 접촉시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
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