KR20220038706A - 조작된 rna를 사용한 내인성 adar을 활용한 타겟 rna 편집 - Google Patents

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Abstract

본 명세서에는 타겟 RNA에서 아데노신의 탈아미노화를 위해 탈아미노효소-리크루팅 RNA를 숙주 세포에 도입하여 RNA를 편집하는 방법, 상기 RNA 편집 방법에 사용되는 탈아미노효소-리크루팅 RNA, 이를 포함하는 조성물 및 키트가 제공된다.

Description

조작된 RNA를 사용한 내인성 ADAR을 활용한 타겟 RNA 편집
(관련 출원 및 참조에 의한 원용)
본 출원은 2019년 7월 12일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/CN2019/095802의 우선권 이익을 주장하며, 그 내용은 전체가 참고로 여기에 포함된다.
(ASCII 텍스트 파일의 서열 목록 제출)
하기 ASCII 텍스트 파일에 대한 제출 내용은 그 전체가 참고로 여기에 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형식(CRF)(파일명: FD00254PCT-ST25.txt, 기록 날짜: 2020년 7월 10일, 크기: 16KB).
본 개시는 일반적으로 타겟 RNA에서 하나 이상의 아데노신을 탈아미노화하기 위해 아데노신 탈아미노효소를 리크루팅할 수 있는 조작된 RNA를 사용하여 RNA를 편집하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
게놈 편집은 생물의학 연구 및 질환 치료제 개발을 위한 강력한 도구이다. 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 및 CRISPR 시스템의 Cas 단백질과 같은 조작된 뉴클레아제를 사용하는 편집 기술은 수많은 유기체의 게놈을 조작하는데 적용되었다. 최근에는, RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)와 같은 탈아미노효소 단백질을 활용하여, RNA를 편집하기 위한 새로운 도구가 개발되었다. 포유류 세포에는 세 가지 유형의 ADAR 단백질, Adar1(2개의 이소폼, p110 및 p150), Adar2 및 Adar3(촉매 불활성)이 존재한다. ADAR 단백질의 촉매 기질은 이중 가닥 RNA이며, ADAR은 아데노신(A) 핵염기로부터 -NH2기를 제거하여 A를 이노신(I)으로 변경할 수 있다. (I)는 구아노신(G)으로 인식되고, 후속 세포 전사 및 번역 과정 동안에 시티딘(C)과 쌍을 이룬다. 타겟 RNA 편집을 달성하기 위해, ADAR 단백질 또는 그 촉매 도메인을 λN 펩타이드, SNAP-태그 또는 Cas 단백질(dCas13b)과 융합시키고, 키메라 ADAR 단백질을 타겟 부위에 리크루팅하도록 가이드 RNA를 설계하였다. 선택적으로, R/G 모티프를 포함하는 가이드 RNA와 함께 ADAR1 또는 ADAR2 단백질의 과발현은 타겟 RNA 편집을 가능하게 하는 것으로도 보고되어 있다.
그러나, 현재 사용가능한 ADAR 매개 RNA 편집 기술에는 특정 제한사항이 존재한다. 예를 들면, 유전자 치료를 위한 가장 효과적인 인비보 전달은 바이러스 벡터를 통한 것이지만, 매우 바람직한 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 카고 사이즈(~4.5kb)로 제한되어 있어, 단백질과 가이드 RNA 양쪽을 수용하는데 어려움이 있다. 또한, ADAR1의 과발현은 최근 RNA에 대한 비정상적인 과편집으로 인해 다발성 골수종에서 발암성을 부여하고, 실질적인 전반적 타겟 외 편집을 생성하는 것으로 보고되어 있다. 또한, 비인간 기원의 단백질 또는 그 도메인의 이소성 발현은 면역원성을 유발할 잠재적 위험을 갖는다. 또한, 기존의 후천성 면역 및 p53 매개 DNA 손상 반응은 Cas9와 같은 치료 단백질의 효능을 손상시킬 수 있다.
본 출원은 RNA 편집을 위해 RNA에 작용하는 내인성 아데노신 탈아미노효소("ADAR") 단백질을 활용할 수 있는 ADAR-리크루팅 RNA("dRNA" 또는 "arRNA")를 사용한 RNA 편집 방법을 제공한다. 또한, 본 명세서에는 이러한 방법에 사용되는 조작된 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 dRNA 또는 구축물, 및 이를 포함하는 조성물 및 키트가 제공된다. 또한, 본 명세서에는 개체의 세포에서 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA를 편집하는 단계를 포함하는, 개체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
일 양태에 있어서, 탈아미노효소-리크루팅 RNA(deaminase-recruiting RNA: dRNA) 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서,
(1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고,
(2) 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 또한
(3) 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 원형 RNA를 형성할 수 있는 선형 RNA이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 3' 결찰 서열과 5' 결찰 서열은 적어도 부분적으로 서로 상보적이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 약 20개 내지 약 75개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 RNA 리가아제에 의해 원형화된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 RNA 리가아제는 RNA 리가아제 RtcB이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 RNA 리가아제 RtcB는 숙주 세포에서 내인성으로 발현된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 원형 RNA이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산의 3' 말단에 연결된 3' 트위스터 리보자임 서열 및 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산의 5' 말단에 연결된 5' 트위스터 리보자임 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 3' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 5' 트위스터 서열은 트위스터 P1이다. 일부 실시형태에 있어서, 5' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 3' 트위스터 서열은 트위스터 P1이다.
또 다른 양태에 있어서, 본 명세서에는 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA) 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, 상기 dRNA는,
(1) 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟 RNA 서열, 및
(2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한
상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 타겟팅 RNA 서열의 5' 말단에 연결된 snoRNA 서열("5' snoRNA 서열")을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 타겟팅 RNA 서열의 3' 말단에 연결된 snoRNA 서열("3' snoRNA 서열")을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 적어도 약 70개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, 3' snoRNA 서열은 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 5' snoRNA 서열은 SEQ ID NO: 2의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 C/D 박스 snoRNA 서열이다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 H/ACA 박스 snoRNA 서열이다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 복합 C/D 박스 및 H/ACA 박스 snoRNA 서열이다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 고아 snoRNA 서열이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 프로모터는 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 바이러스 벡터 또는 플라스미드이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 AAV 벡터이다.
또 다른 양태에 있어서, 본 명세서에는 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서,
(1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟 RNA 서열을 포함하고,
(2) 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 또한
(3) 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, pol II 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 실시형태에 있어서, CMV 프로모터는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열을 포함한다.
이하의 실시형태는 위에서 설명된 세 가지 측면 모두에 적용가능하다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 바이러스 벡터 또는 플라스미드이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 AAV 벡터이다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 숙주 세포에 의해 내인성으로 발현된다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 50개 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 약 100개 내지 약 180개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 약 100개 내지 약 150개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 정반대쪽에 있는 시티딘, 아데노신 또는 우리딘을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 정반대쪽에 있는 시티딘 미스매치를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 시티딘 미스매치는 타겟팅 RNA 서열의 3' 말단으로부터 적어도 20개의 뉴클레오티드, 및 타겟팅 RNA 서열의 5' 말단으로부터 적어도 5개의 뉴클레오티드 떨어져 위치된다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA에서 비타겟 아데노신의 각각 반대쪽에 있는 하나 이상의 구아노신을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA에서 비타겟 아데노신의 반대쪽에 있는 2개 이상의 연속적인 미스매치 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 5' 최근접 이웃은 U, C, A 및 G로부터 선택되는 뉴클레오티드이며 선호도는 U＞C≒A＞G이고, 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 3' 최근접 이웃은 G, C, A 및 U로부터 선택되는 뉴클레오티드이며 선호도는 G>C>A≒U이다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟 아데노신은 타겟 RNA에서 UAG, UAC, UAA, UAU, CAG, CAC, CAA, CAU, AAG, AAC, AAA, AAU, GAG, GAC, GAA 및 GAU이다. 일부 실시형태에 있어서, 3-염기 모티프는 UAG이고, 타겟팅 RNA는 3-염기 모티프에서 우리딘의 정반대쪽에 있는 A, 타겟 아데노신의 정반대쪽에 있는 시티딘, 및 3-염기 모티브에서 구아노신의 정반대쪽에 있는 시티딘, 구아노신 또는 우리딘을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 프리메신저 RNA, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 트랜스퍼 RNA, 긴 비코딩 RNA 및 소형 RNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 RNA이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 프리메신저 RNA이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR3의 억제제를 숙주 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 인터페론의 자극제를 숙주 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 각각 상이한 타겟 RNA를 타겟팅하는 복수의 dRNA 또는 구축물을 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR(예를 들면, 외인성 ADAR)을 숙주 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟 RNA의 편집 효율은 적어도 40% 이상이다. 일부 실시형태에 있어서, 구축물 또는 dRNA는 면역 반응을 유도하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 E1008 돌연변이를 포함하는 ADAR1이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 탈아미노화는 상기 타겟 RNA에서 미스센스 돌연변이, 조기 정지 코돈, 비정상 스플라이싱 또는 선택적 스플라이싱을 초래하거나, 또는 상기 타겟 RNA에서 미스센스 돌연변이, 조기 정지 코돈, 비정상 스플라이싱 또는 선택적 스플라이싱의 역전을 초래한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 탈아미노화는 상기 타겟 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 점 돌연변이, 절단, 신장 및/또는 미스폴딩을 초래하거나, 또는 타겟 RNA에서 미스센스 돌연변이, 조기 정지 코돈, 비정상 스플라이싱 또는 선택적 스플라이싱의 역전에 의한 기능적인, 전장의, 정확하게 접힌 및/또는 야생형 단백질을 초래한다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 인간 또는 마우스 세포이다. 또한, 본 명세서에는 상기 세 가지 양태에서 제공된 방법 중 어느 하나에 의해 생성된 편집된 RNA 또는 상기 편집된 RNA를 갖는 숙주 세포가 제공된다.
또 다른 양태에 있어서, 본 명세서에는 상기 제공된 방법 중 어느 하나에 따라 개체의 세포에서 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA를 편집하는 단계를 포함하는, 개체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 질환 또는 병태는 유전성 유전질환 또는 하나 이상의 후천적 유전 돌연변이와 관련된 질환 또는 병태이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 G에서 A로의 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에 있어서, 질환 또는 병태는 단일 유전성 질환 또는 병태이다. 일부 실시형태에 있어서, 질환 또는 병태는 다유전성 질환 또는 병태이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 TP53이고, 질환 또는 병태는 암이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 IDUA이고, 질환 또는 병태는 I형 점액다당류증(MPS I)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 COL3A1이고, 질환 또는 병태는 엘러스-단로스 증후군이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 BMPR2이고, 질환 또는 병태는 주버트 증후군이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 FANCC이고, 질환 또는 병태는 판코니 빈혈증이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 MYBPC3이고, 질환 또는 병태는 원발성 가족성 비대성 심근병증이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 IL2RG이고, 질환 또는 병태는 X-연관성 중증 복합 면역부전증이다.
또 다른 양태에 있어서, 본 명세서에는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하는 타겟 RNA를 편집하기 위한 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)로서, 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 원형이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 dRNA가 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 원형 RNA를 형성할 수 있는 선형 RNA이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 3' 결찰 서열과 5' 결찰 서열은 적어도 부분적으로 서로 상보적이다. 일부 실시형태에 있어서, 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 약 20 내지 약 75개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 원형 RNA이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 프리메신저 RNA, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 트랜스퍼 RNA, 긴 비코딩 RNA 및 소형 RNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 RNA이다. 또한, 본 명세서에는 이 양태에서 설명된 바와 같은 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물이 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산의 3' 말단에 연결된 3' 트위스터 리보자임 서열 및 dRNA를 인코딩하는 핵산의 5' 말단에 연결된 5' 트위스터 리보자임 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 3' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 5' 트위스터 서열은 트위스터 P1이다. 일부 실시형태에 있어서, 5' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 3' 트위스터 서열은 트위스터 P1이다. 또한, 본 명세서에는 이 양태에서 설명된 바와 같은 구축물 또는 dRNA를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 또한, 본 명세서에는 본 양태에서 설명된 바와 같은 구축물 또는 dRNA를 포함하는 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하기 위한 키트가 제공된다.
또 다른 양태에 있어서, 본 명세서에는 타겟 RNA를 편집하기 위한 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)로서,
(1) 상기 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟 RNA 서열, 및
(2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 있는 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한
상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있는 dRNA가 더 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 타겟팅 RNA 서열의 5' 말단에 연결된 snoRNA 서열("5' snoRNA 서열")을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 타겟팅 RNA 서열의 3' 말단에 연결된 snoRNA 서열("3' snoRNA 서열")을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 적어도 약 70개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, 3' snoRNA 서열은 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 5' snoRNA 서열은 SEQ ID NO: 2의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 C/D 박스 snoRNA 서열이다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 H/ACA 박스 snoRNA 서열이다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 복합 C/D 박스 및 H/ACA 박스 snoRNA 서열이다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 고아 snoRNA 서열이다. 또한, 본 명세서에는 이 양태에서 설명된 바와 같은 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물이 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 프로모터는 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 프리메신저 RNA, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 트랜스퍼 RNA, 긴 비코딩 RNA 및 소형 RNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 RNA이다. 또한, 본 명세서에는 이 양태에서 설명된 바와 같은 구축물 또는 dRNA를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 또한, 본 명세서에는 이 양태에서 설명된 바와 같은 구축물 또는 dRNA를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하기 위한 키트가 제공된다.
또 다른 양태에 있어서, 본 명세서에는 숙주 세포에 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물로서,
(1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고,
(2) 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 또한
(3) 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 구축물이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, pol II 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 실시형태에 있어서, CMV 프로모터는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 바이러스 벡터 또는 플라스미드이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 AAV 벡터이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 프리메신저 RNA, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 트랜스퍼 RNA, 긴 비코딩 RNA 및 소형 RNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 RNA이다. 또한, 본 명세서에는 이 양태에서 설명된 바와 같은 구축물을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 또한, 본 명세서에는 이 양태에서 설명된 바와 같은 구축물을 포함하는 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하기 위한 키트가 제공된다.
본 명세서에 설명된 다양한 실시형태의 특성 중 하나, 일부 또는 전부는 본 출원의 다른 실시형태를 형성하기 위해 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 본 출원의 이들 및 다른 실시형태는 다음의 상세한 설명에 의해 추가로 설명된다.
도 1은 48시간 동안 pol II 프로모터(CMV)에 의해 구동되는 arRNA를 발현하는 플라스미드 및 Pol III 프로모터(U6)에 의해 구동되는 arRNA를 발현하는 플라스미드의 형질감염 후의 FACS 분석을 도시한다. EGFP 양성 백분율은 mCherry 양성 비율에 의해 결정된 형질감염 효율에 의해 정규화되었다. 데이터는 평균값±s.d.(n=3)이다.
도 2a-2c는 리포터 mRNA 상에서 타겟팅된 RNA 편집을 매개한 snoRNA 말단이 측면 배치된 Sno-arRNA151을 도시한다. 도 2a는 arRNA-발현 플라스미드의 개략도를 나타낸다. 형광 리포터-1을 타게팅하는 151-nt arRNA는 인간 U6 프로모터 하에서 발현되었다. 도 2b는 sno-arRNA 또는 arRNA 형질감염 결과의 FACS 결과를 나타낸다. sno-arRNA151, arRNA151, sno-대조군 RNA151 또는 대조군 RNA151을 리포터 발현 플라스미드와 함께 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 도 2c는 도 2b의 FACS 결과의 정량화를 나타낸다.
도 3a-3c는 CMV-프로모터 발현 sno-arRNA 및 hU6 프로모터 발현 sno-arRNA를 사용한 편집 효능을 도시한다. 도 3a는 상이한 시점에서의 hU6 유래 sno-arRNA 또는 arRNA의 정량적 FACS 결과를 나타낸다. 도 3b는 상이한 시점에서 CMV 또는 hU6 유래 arRNA의 정량적 FACS 결과를 나타낸다. 도 3c는 상이한 시점에서 CMV 또는 hU6 유래 sno-arRNA의 정량적 FACS 결과를 나타낸다.
도 4a-4e는 LEAPER 시스템에서 원형 arRNA를 사용한 편집 효능을 도시한다. 도 4a는 원형 arRNA 발현의 개략도를 나타낸다. 원형 arRNA 전사체는 5' 및 3' 결찰 서열이 측면에 위치되어 있으며, 각각 자가 절단되는 5'-트위스터 P3 U2A 및 3'-트위스터 P1 리보자임이 측면에 위치된다. 얻어진 RNA 말단은 결찰을 위해 RtcB에 의해 인식되었다. 도 4b는 리포터-1 및 리포터-3의 개략도를 나타낸다. mCherry 및 EGFP 유전자는 3×(리포터-1의 경우) 또는 1×(리포터-3의 경우) GGGGS 코딩 영역 및 프레임 내 UAG 정지 코돈을 함유하는 서열로 연결되었다. 리포터 발현 세포는 mCherry 단백질만을 생산하는 반면, 리포터 전사체의 UAG 정지 코돈에 대한 타겟 편집은 UAG를 UIG로 변환하여, 다운스트림 EGFP 발현을 허용할 수 있다. 도 4c는 12웰 플레이트(3×105세포/웰)에 시딩된 리포터-1을 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포에 1㎍의 원형 arRNA71, 원형 arRNA25-71-25, 원형 arRNA50-71-50, 원형 arRNA111, 원형 arRNA25-111-25, 원형 arRNA50-111-50, 원형 대조군 RNA123(비타겟 서열), arRNA71, 대조군 RNA71, arRNA111, 대조군 RNA111을 발현하는 플라스미드를 각각 형질감염시킨 실험 결과를 나타낸다. FACS 분석은 형질감염 2일 및 7일 후에 행해졌다. EGFP+ 세포의 비율은 형질감염 효율에 의해 정규화되었다. 도 4d는 12웰 플레이트(3×105세포/웰)에 시딩된 리포터-3을 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포에 1㎍의 대조군 RNA151(원형), 31-, 51-, 71-, 91-, 111-, 131-, 151-nt 원형 arRNA를 각각 발현하는 플라스미드를 형질감염시킨 실험 결과를 나타낸다. FACS 분석은 형질감염 2일 후에 행해졌다. EGFP+ 세포의 비율은 형질감염 효율에 의해 정규화되었다. 도 4e는 12웰 플레이트(2×105세포/웰)에 시딩된 HeLa 및 A549 세포에 0.5㎍의 리포터-1 발현 플라스미드 및 0.5㎍의 원형 arRNA111 발현 플라스미드를 각각 공-형질감염시킨 실험의 결과를 나타낸다. FACS 분석은 형질감염 2일 후에 행해졌다. EGFP+ 세포의 비율은 형질감염 효율에 의해 정규화되었다.
도 5는 48시간 및 96시간 동안 다양한 원형 arRNA를 공-형질감염시킨 후의 FACS 분석을 도시하며, EGFP 양성 백분율은 mCherry 양성에 의해 결정된 형질감염 효율에 의해 정규화되었다. 데이터는 평균값±s.d.(n=3)이다.
도 6a-6b는 48시간 및 96시간 동안 HEK293T 세포에서 다양한 원형 arRNA의 공-형질감염 후의 FACS 분석을 도시한다. EGFP 양성 백분율은 mCherry 양성에 의해 결정된 형질감염 효율에 의해 정규화되었다. 데이터는 평균값±s.d.(n=3)이다.
도 7은 EGFP 양성(EGFP+) 세포의 정량화를 도시한다. 리포터-1을 안정적으로 발현하는 세포를 토네이도 대조군 RNA111 바이러스 및 다양한 길이의 타겟팅 토네이도-arRNA 바이러스를 포함한 다양한 토네이도-arRNA 렌티바이러스로 감염시키고, 이어서 감염 2일 후의 FACS를 행했다. 데이터는 평균값±s.e.m.(n=2)이다.
본 설명은 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하기 위해 RNA 편집 방법(본 명세서에서 "개선된 LEAPER" 방법이라고 함) 및 특수 설계된 RNA(본 명세서에서 탈아미노효소-리크루팅 RNA("dRNA") 또는 ADAR-리크루팅 RNA("arRNA")이라고 함) 또는 이들 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 제공한다.
"RNA에서 프로그래밍가능한 편집을 위한 내인성 ADAR 활용법(Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA: LEAPER)는 "arRNA"라고도 하는 dRNA를 활용하여 타겟 RNA를 편집하기 위해 내인성 ADAR을 활용하는 본 출원의 발명자들에 의해 이전에 개발되었다. LEAPER 방법은 PCT/CN2018/110105 및 PCT/CN2020/084922에 설명되어 있으며, 그 전체가 참고로 여기에 포함된다. 구체적으로, 타겟 전사체에 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA를 사용하여 네이티브 ADAR1 또는 ADAR2를 리크루팅하여 타겟 RNA에서 특정 부위의 아데노신을 이노신으로 변화시켰다. 이와 같이, RNA 편집은 숙주 세포에서 ADAR 단백질의 이소성 또는 과발현없이 특정 시스템에서 달성될 수 있다.
본 출원은, 예를 들면 타겟 세포에서 dRNA의 레벨을 증가시켜 RNA 편집의 효율성을 증가시킬 수 있는 개선된 LEAPER 방법을 제공한다. 일 양태에 있어서, 개선된 LEAPER 방법은 원형 RNA 또는 원형 RNA를 형성할 수 있는 dRNA의 사용을 포함한다. 또 다른 양태에 있어서, 개선된 LEAPER 방법은 타겟팅 RNA 서열의 3' 또는 5'에 연결된 하나 이상의 소핵소체 RNA(snoRNA)를 포함하는 dRNA의 사용을 포함한다. 또 다른 양태에 있어서, 개선된 LEAPER 방법은 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")의 제어 하에 배치된 dRNA를 포함한다. 본 발명자들은 LEAPER 방법과 비교하여, 개선된 LEAPER 방법이 dRNA의 편집 효율을 상당히 증가시킴을 입증하였다. 이론에 얽매이지 않고, 개선된 LEAPER 방법에 사용된 dRNA의 안정성 또는 양의 증가는 이러한 RNA 편집 효율의 개선에 기여한 것으로 여겨진다.
따라서, 일 양태에서 본 출원은 개선된 LEAPER 방법 중 하나 이상에 의해 타겟 RNA를 편집하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 개선된 LEAPER 방법에 사용되는 dRNA 및 구축물이 제공된다.
또한, 본 명세서에는 RNA 편집 방법을 사용하여 개체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
I. 정의
특별히 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 언급된 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 간행물은 그 전체가 참고로 포함된다. 본 단락에 명시된 정의가 본 명세서에 참조로 포함된 특허, 출원 또는 기타 간행물에서 명시된 정의와 상반되거나 불일치한 경우에는 본 단락에 명시된 정의가 참조로 포함된 정의보다 우선한다.
명료함을 위해, 별도의 실시형태와 관련하여 설명된 본 개시의 특정 특징은 단일 실시형태로 조합하여 제공될 수도 있음을 이해한다. 또한, 반대로, 간결함을 위해, 단일 실시형태와 관려하여 설명된 본 개시의 다양한 특징은 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 제공될 수 있다. 특정 방법 단계, 시약 또는 조건에 관한 실시형태의 모든 조합은 본 개시에 의해 구체적으로 포함되며, 마치 각각의 조합 및 모든 조합이 개별적으로 또한 명시적으로 개시된 것처럼 본 명세서에 개시된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "a," "an," 및 "the"는 문맥에서 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있음을 추가로 유의한다. 따라서, 본 설명은 청구 요소의 인용, 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "단독", "단지" 등과 같은 배타적 용어의 사용을 위한 선행 근거로서의 역할을 하도록 의도된다.
용어 "탈아미노효소-리크루팅 RNA", "dRNA", "ADAR-리크루팅 RNA" 및 "arRNA"는 RNA에서 타겟 아데노신을 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 조작된 RNA를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열" 및 "핵산"은 상호교환적으로 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머릭 형태를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아데닌", "구아닌", "시토신", "티민", "우라실" 및 "하이포크산틴"은 이와 같은 핵염기를 지칭한다. 용어 "아데노신", "구아노신", "시티딘", "티미딘", "우리딘" 및 "이노신"은 리보오스 또는 데옥시리보오스 당 부위에 연결된 핵염기를 지칭한다. 용어 "뉴클레오시드"는 리보오스 또는 데옥시리보오스에 연결된 핵염기를 지칭한다. 용어 "뉴클레오티드"는 각각의 핵염기-리보실-포스페이트 또는 핵염기-데옥시리보실-포스페이트를 지칭한다. 용어 아데노신 및 아데닌(약어 "A"), 구아노신 및 구아닌(약어 "G"), 시토신 및 시티딘(약어 "C"), 우라실 및 우리딘(약어 "U"), 티민 및 티미딘(약어 "T"), 이노신 및 하이포크산틴(약어 "I")은 대응하는 핵염기, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되는 경우가 있다. 용어 핵염기, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 문맥상 달리 명확하게 요구되지 않는 한, 상호교환적으로 사용되는 경우가 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "도입하는" 또는 "도입"은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 dRNA 또는 본 명세서에 설명된 바와 같은 벡터, 그것의 하나 이상의 전사체를 포함하는 하나 이상의 구축물을 숙주 세포에 전달하는 것을 의미한다. 본 발명은 RNA, 예를 들면 프리메신저 RNA, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 트랜스퍼 RNA, 긴 비코딩 RNA 및 소형 RNA(예를 들면, miRNA)의 타겟팅된 편집을 가능하게 하기 위한 기본 플랫폼 역할을 한다. 본 출원의 방법은 바이러스, 리포솜, 전기천공, 미세주입 및 접합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 전달 시스템을 사용하여, 본 명세서에 설명된 dRNA 또는 구축물의 숙주 세포에의 도입을 달성할 수 있다. 종래의 바이러스 및 비바이러스 기반 유전자 전달 방법은 핵산을 포유류 세포 또는 타겟 조직에 도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 본 출원의 dRNA를 인코딩하는 핵산을 배양물 또는 숙주 유기체의 세포에 투여하는데 사용될 수 있다. 비바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, RNA(예를 들면, 본 명세서에 설명된 구축물의 전사체), 네이키드 핵산, 및 리포솜과 같은 전달 비히클과 복합화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템에는 숙주 세포에 전달하기 위한 에피솜 또는 통합 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스가 포함된다.
본 출원과 관련하여, "타겟 RNA"는 탈아미노효소-리크루팅 RNA 서열이 완전한 상보성 또는 실질적인 상보성을 갖도록 설계된 RNA 서열을 지칭하며, 상기 타겟 서열과 dRNA 사이의 혼성화는 타겟 아데노신을 함유하는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 영역을 형성하여, 타겟 아데노신을 탈아미노화하는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅한다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 진핵 세포(예를 들면, 인간 세포와 같은 포유류 세포)와 같은 숙주 세포에 자연적으로 존재한다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 숙주 세포에 도입된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "상보성"은 종래의 왓슨-크릭 염기쌍에 의해 다른 핵산과 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 의미한다. 상보성 백분율은 두번째 핵산과 수소 결합(즉, 왓슨-크릭 염기쌍)을 형성할 수 있는 핵산 분자의 잔기 백분율을 나타낸다(예를 들면, 10 중의 약 5, 6, 7, 8, 9, 10은 각각 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 상보적임). "완전히 상보적인"은 핵산 서열의 모든 인접 잔기가 제 2 핵산 서열에서 동일한 수의 인접 잔기와 수소 결합을 형성함을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 상보적인"은 약 40, 50, 60, 70, 80, 100, 150, 200, 250개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 영역에 걸쳐 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 어느 하나인 상보성의 정도를 의미하거나, 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 2개의 핵산을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 혼성화를 위한 "엄격한 조건"은 타겟 서열에 상보성을 갖는 핵산이 타겟 서열과 우세하게 혼성화하고, 실질적으로 비타겟 서열과 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 일반적으로 서열에 따라 달라지며, 여러 요인에 따라 변경된다. 일반적으로, 서열이 길수록 서열이 타겟 서열에 특이적으로 혼성화하는 온도가 높아진다. 엄격한 조건의 비제한적인 예는 Tijssen(1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter "Overview of Principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N,Y.에 상세하게 설명되어 있다.
"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 의미한다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기쌍 형성, 후그스테인 결합에 의해, 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 발생할 수 있다. 소정의 서열과 혼성화할 수 있는 서열은 소정의 서열의 "보체"라고 지칭된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함한", "함유하는" 및 "포함하는"은 개방적이고 비제한적인 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에 설명된 본 출원의 양태 및 실시형태는 양태 및 실시형태를 "구성하는" 및/또는 "필수적으로 이루어지는"을 포함할 수 있음을 이해한다.
용어 "약"은 명시적으로 사용되는지의 여부에 관계없이 본 명세서에 제공되는 모든 양은 실제 주어진 값을 의미하고, 이러한 주어진 값에 대한 실험 및/또는 측정 조건으로 인한 등가물 및 근사값을 포함하는 당업계의 통상의 기술을 기반으로 하여 합리적으로 추론될 수 있는 주어진 값에 대한 근사값을 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유류에 비독성인 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리학적으로 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 비제한적인 예는 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 소듐과 같은 염 형성 카운터이온; 및/또는 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 PLURONICS™와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 물질에 대한 용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 특정 장애의 측정가능한 개선 또는 예방에 영향을 미치는데 필요한 최소한의 최소 농도이다. 본 명세서의 유효량은 환자의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중과 같은 요소, 및 개체에서 소망의 반응을 유도해 내는 물질의 능력에 따라 달라질 수 있다. 또한, 유효량은 치료의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료학적으로 유익한 효과를 능가하는 양이다. 암과 관련하여, 유효량은 종양을 수축시키고, 및/또는 종양의 성장 속도를 감소시키기에(예를 들면, 종양 성장을 억제시키기에) 또는 암에서 소망하지 않는 다른 세포 증식을 예방하거나 지연시키기에 충분한 양을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 유효량은 암의 발병을 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 실시형태에 있어서, 유효량은 재발을 예방하거나 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 실시형태에 있어서, 유효량은 개체에서 재발률을 감소시키기에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 약물 또는 조성물의 유효량은, (i) 암세포의 수를 감소시키고; (ii) 종양 크기를 감소시키고; (iii) 말초 기관으로의 암세포 침윤을 억제, 지연, 소정 정도 늦추거나 바람직하게는 중지시키고; (iv) 종양 전이를 억제하고(즉, 소정 정도 늦추거나 바람직하게는 중지시키고); (v) 종양 성장을 억제하고; (vi) 종양의 발생 및/또는 재발을 예방하거나 지연시키고; (vii) 종양의 재발률을 감소시키고, 및/또는 (viii) 암과 관련된 하나 이상의 증상을 소정 정도 완화시킬 수 있다. 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 개시의 목적을 위해, 약물, 화합물 또는 약학 조성물의 유효량은 직접적으로 또는 간접적으로 예방적 또는 치료적 치료를 달성하기에 충분한 양이다. 임상적 맥락에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 약학 조성물의 유효량은 다른 약물, 화합물 또는 약학 조성물과 함께 달성되거나 달성되지 않을 수 있다. 따라서, "유효량"은 하나 이상의 치료제를 투여하는 것과 관련하여 고려될 수 있으며, 소망의 결과가 이루어지거나 달성될 수 있다면, 하나의 제제를 하나 이상의 다른 제제와 함께 유료량으로 제공하는 것이 고려될 수 있다.
본 명세서에 설명된 "숙주 세포"는 본 명세서에 설명된 바와 같이 변형될 수 있는 한 숙주 세포로서 사용될 수 있는 임의의 세포 유형을 지칭한다. 예를 들면, 숙주 세포는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)가 내인성으로 발현되는 숙주 세포일 수 있거나, 당업계에 공지된 방법에 의해 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)가 도입되어 있는 숙주 세포일 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포는 원핵 세포, 진핵 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 미리 확립된 세포주, 예를 들면 인간 세포주 또는 비-인간 세포주를 포함하는 포유류 세포주로부터 유래된다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 인간 개체와 같은 개체로부터 유래된다.
"재조합 AAV 벡터(rAAV 벡터)"는 적어도 하나의 측면에 있는 하나 이상의 이종성 서열(즉, AAV 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터, 및 실시형태에서 2개의 AAV 역전된 말단 반복 서열(ITR)을 지칭한다. 이러한 rAAV 벡터는 적절한 헬퍼 바이러스로 감염되고(또는 적절한 헬퍼 기능을 발현하는), AAV rep 및 cap 유전자 생성물(즉, AAV Rep 및 cap 단백질)을 발현하는 숙주 세포에 존재할 때에 복제되어 감염성 바이러스 입자에 패키징될 수 있다. rAAV 벡터가 더 큰 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 염색체 또는 클로닝 또는 형질감염에 사용되는 플라스미드와 같은 다른 벡터에서)에 통합되면, rAAV 벡터는 "프로-벡터"로 지칭될 수 있으며, 이는 "AAV 패키징 기능 및 적절한 헬퍼 기능이 존재하는 경우에 복제 및 캡슐화에 의해 구출될 수 있다. rAAV 벡터는 플라스미드, 선형 인공 염색체의 형태, 지질과 복합화되고, 리포솜 내에 캡슐화되고, 바이러스 입자, 특히 AAV 입자에 캡슐화된 형태를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다수의 형태일 수 있다. rAAV 벡터는 "재조합 아데노-관련 바이러스 입자(rAAV 입자)"를 생성하기 위해 AAV 바이러스 캡시드에 패키징될 수 있다.
당업계에서 잘 알려진 용어인 "AAV 역위 말단 반복(ITR)" 서열은 네이티브 단일 가닥 AAV 게놈의 양 말단에 존재하는 대략 145개의 뉴클레오티드 서열이다. ITR의 최외측 125개의 뉴클레오티드는 두 가지 대체 방향 중 어느 하나에 존재할 수 있으며, 상이한 AAV 게놈 사이 및 단일 AAV 게놈의 두 말단 사이에 이질성을 초래한다. 또한, 최외측의 125개의 뉴클레오티드는 자기 상보성의 수 개의 짧은 영역(A, A', B, B', C, C' 및 D 영역으로 지정됨)을 포함하여, ITR의 이 부분 내에서 가닥 내 염기쌍이 발생하도록 한다.
"패키지 삽입물"은 적응증, 사용법, 복용량, 투여, 금기사항, 패키징된 제품과 병용되는 기타 약물, 및/또는 그러한 약물의 사용에 관한 경고 등에 관한 정보를 포함하는 약물의 상업적 패키지에 관례적으로 포함된 적응증에 대한 정보를 포함하는 약물의 상업적 패키지에 포함되는 통상의 지침을 지칭한다.
"피험체", "환자" 또는 "개체"는 인간 또는 다른 동물과 같은 포유류를 포함하고, 통상은 인간이다. 일부 실시형태에 있어서, 치료제 및 조성물이 투여되는 피험체, 예를 들면 환자는 포유류이며, 통상은 인간과 같은 영장류이다. 일부 실시형태에 있어서, 영장류는 원숭이 또는 유인원이다. 피험체는 남성 또는 여성일 수 있으며, 유아, 소아, 청소년, 성인 및 노인 피험체를 포함하는 임의의 적합한 연령일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 피험체는 설치류, 개, 고양이, 소 또는 말과 같은 농장 동물 등의 영장류가 아닌 포유류이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 임상 병리학 과정 동안에 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정에 유익하고, 소망의 효과를 갖도록 설계된 임상 개입을 지칭한다. 본 개시의 목적을 위해, 치료의 바람직한 효과는 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 암 세포의 증식 감소(또는 파괴), 암세포 사멸 증가, 질환으로부터 얻어지는 증상의 감소, 질환 확산 방지, 질환의 재발 방지, 질환으로 고통받는 사람들의 삶의 질 향상, 질환 치료에 필요한 다른 약물의 복용량 감소, 질환의 진행 지연, 및/또는 개체의 생존 연장을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암과 관련된 하나 이상의 증상이 완화되거나 제거되면, 개인은 성공적으로 "치료"된다.
II. RNA 편집 방법
본 명세서에서는 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA) 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포(예를 들면, 진핵 세포)에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, (1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 또한 (2) 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
원형 dRNA
일 양태에 있어서, 본 명세서에는 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA) 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포(예를 들면, 진핵 세포)에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, (1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, (2) 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 또한 (3) 상기 dRNA는 원형 RNA 또는 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 본 명세서에는 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA) 또는 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, (1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, (2) 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 숙주 세포의 내인성으로 발현된 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 (3) 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 단백질(예를 들면, Cas, ADAR 또는 ADAR 및 Cas의 융합 단백질)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 임의의 단백질 또는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에 있어서, 본 명세서에는 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA) 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, (1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, (2) 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 숙주 세포의 내인성으로 발현된 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 (3) 상기 dRNA는 원형 RNA인 방법이 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 단백질(예를 들면, Cas, ADAR 또는 ADAR 및 Cas의 융합 단백질)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 임의의 단백질 또는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에 있어서, 본 명세서에는 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA) 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, (1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, (2) 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 숙주 세포의 내인성으로 발현된 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 (3) 상기 dRNA는 원형 RNA를 형성할 수 있는 선형 RNA인 방법이 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 단백질(예를 들면, Cas, ADAR 또는 ADAR 및 Cas의 융합 단백질)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 임의의 단백질 또는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에 있어서, 본 명세서에는 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA) 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, ADAR 또는 구축물은 숙주 세포에 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하고, (1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, (2) 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신("A") 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 (3) 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 ADAR은 숙주 세포의 내인성으로 인코딩된 ADAR이고, 상기 ADAR의 도입은 숙주 세포에서 ADAR을 과발현하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 ADAR은 숙주 세포에 대해 외인성이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물은 플라스미드와 같은 벡터, 또는 바이러스 벡터(예를 들면, AAV 또는 렌티바이러스 벡터)이다.
일 양태에 있어서, 본 출원은 복수의 RNA, 또는 상기 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 구축물을 숙주 세포에 도입함으로써 숙주 세포에서 복수의 타겟 RNA(예를 들면, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000개 또는 그 이상)를 편집하는 방법을 제공한다.
일 양태에 있어서, 상기 dRNA는 원형 RNA를 형성할 수 있는 선형 RNA이다. 일부 실시형태에 있어서, 원형은 토네이도 발현 시스템("지속적인 과발현을 위한 트위스터 최적화 RNA")을 이용하여, Litke, J.L. & Jaffrey, S.R. Highly efficient expression of circular RNA aptamers in cells using autocatalytic transcripts. Nat Biotechnol 37, 667-675(2019)에 설명된 바와 같이 행해지고, 그 전체가 참고로 여기에 포함된다. 간단히, 토네이도 발현 전사체에는 트위스터 리보자임이 측면에 있는 목적의 RNA가 포함된다. 트위스터 리보자임은 자가 절단이 가능한 촉매 RNA 서열이다. 리보자임은 신속하게 자가 촉매 절단을 행하여 RNA 리가아제에 의해 결찰되는 말단을 남긴다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물에 의해 도입된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산의 3' 말단에 연결된 3' 트위스터 리보자임 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산의 5' 말단에 연결된 5' 트위스터 리보자임 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산의 3' 말단에 연결된 3' 트위스터 리보자임 서열 및 dRNA를 인코딩하는 핵산의 5' 말단에 연결된 5' 트위스터 리보자임 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 3' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 5' 트위스터 서열은 트위스터 P1이다. 일부 실시형태에 있어서, 5' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 3' 트위스터 서열은 트위스터 P1이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 자가촉매 절단을 겪는다. 일부 실시형태에 있어서, 촉매화된 dRNA 생성물은 3' 말단에 2', 3'-환상 포스페이트 및 5'-히드록실기를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 촉매화된 dRNA 생성물은 유비쿼터스 내인성 RNA 리가아제(예를 들면, RNA 리가아제 RtcB)에 의해 결찰된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 전사체는 5' 및/또는 3' 결찰 서열이 측면에 더 있고, 이어서 5'-트위스터 리보자임 및/또는 3'-트위스터 리보자임에 의해 각각 측면에 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 3' 결찰 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 5' 결찰 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 적어도 부분적으로 서로 상보적이다. 일부 실시형태에 있어서, 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 서로 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 상보적이다. 일부 실시형태에 있어서, 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 서로 완전히 상보적이다.
일부 실시형태에 있어서, 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 독립적으로 적어도 약 20개의 뉴클레오티드, 적어도 약 25개의 뉴클레오티드, 적어도 약 30개의 뉴클레오티드, 적어도 약 35개의 뉴클레오티드, 적어도 약 40개의 뉴클레오티드, 적어도 약 45개의 뉴클레오티드, 적어도 약 50개의 뉴클레오티드, 적어도 약 55개의 뉴클레오티드, 적어도 약 60개의 뉴클레오티드, 적어도 약 65개의 뉴클레오티드, 적어도 약 70개의 뉴클레오티드, 적어도 약 75개의 뉴클레오티드, 적어도 약 80개의 뉴클레오티드, 적어도 약 85개의 뉴클레오티드, 적어도 약 90개의 뉴클레오티드, 적어도 약 95개의 뉴클레오티드 또는 적어도 약 100개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 독립적으로 약 20-30개의 뉴클레오티드, 약 30-40개의 뉴클레오티드, 약 40-50개의 뉴클레오티드, 약 50-60개의 뉴클레오티드, 약 60-70개의 뉴클레오티드, 약 70-80개의 뉴클레오티드, 약 80-90개의 뉴클레오티드, 약 90-100개의 뉴클레오티드, 약 100-125개의 뉴클레오티드, 약 125-150개의 뉴클레오티드, 약 20-50개의 뉴클레오티드, 약 50-100개의 뉴클레오티드 또는 약 100-150개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 RNA 리가아제에 의해 원형화된다. RNA 리가아제의 비제한적인 예는 RtcB, T4 RNA 리가아제 1, T4 RNA 리가아제 2, Rnl3 및 Trl1을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, RNA 리가아제는 숙주 세포에서 내인성으로 발현된다. 일부 실시형태에 있어서, RNA 리가아제는 RNA 리가아제 RtcB이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 RNA 리가아제(예를 들면, RtcB)를 숙주 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 숙주 세포에 도입되기 전에 원형화된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 화학적으로 합성된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 인비트로 효소 결찰(예를 들면, RNA 또는 DNA 리가아제 사용) 또는 화학적 결찰(예를 들면, 시아노겐 브로마이드 또는 유사한 축합제 사용)을 통해 원형화된다.
1개 또는 2개의 snoRNA 말단을 갖는 dRNA
또 다른 양태에 있어서, 본 명세서에는 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA) 또는 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포(예를 들면, 진핵 세포)에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, 상기 dRNA는, (1) 상기 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 본 명세서에는 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA) 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포(예를 들면, 진핵 세포)에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, 상기 dRNA는, (1) 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 숙주 세포의 RNA에 작용하는 내인성으로 발현된 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 단백질(예를 들면, Cas, ADAR 또는 ADAR과 Cas의 융합 단백질)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 임의의 단백질 또는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에 있어서, 본 명세서에는 (a) 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA) 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물 및 (b) ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포(예를 들면, 진핵 세포)에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, 상기 dRNA는, (1) 상기 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 숙주 세포의 내인성으로 인코딩된 ADAR이고, 상기 ADAR의 도입은 숙주 세포에서 ADAR을 과발현하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 숙주 세포에 대해 외인성이다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물은 플라스미드와 같은 벡터, 또는 바이러스 벡터(예를 들면, AAV 또는 렌티바이러스 벡터)이다.
일 양태에 있어서, 본 출원은 복수의 dRNA, 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 하나 이상의 구축물을 숙주 세포에 도입함으로써 숙주 세포에서 복수의 타겟 RNA(예를 들면, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000개 또는 그 이상)를 편집하는 방법을 제공한다.
소핵소체 RNA(snoRNA)는 리보솜 RNA, 트랜스퍼 RNA 및 소핵소체 RNA와 같은 다른 RNA의 화학적 변형을 안내하는 것으로 알려진 소형 비인코딩 RNA 분자이다. 특정 2차 구조 특징에 따른 snoRNA의 두 가지 주요 그룹이 존재한다: 박스 C/D 및 박스 H/ACA. snoRNA의 두 가지 구조적 특징은 이들이 보조 단백질과 함께 대응하는 RNA 결합 단백질(RBP)에 결합하여, 기능적인 소핵소체 리보핵단백질(snoRNP) 복합체를 형성할 수 있게 한다. 박스 C/D snoRNA는 메틸화와 관련된 것으로 여겨지는 반면, H/ACA 박스 snoRNA는 슈도우리딜화와 관련이 있는 것으로 여겨진다. snoRNA의 다른 패밀리는, 예를 들면 복합체 H/ACA 및 C/D 박스 snoRNA 및 고아 snoRNA를 포함한다. 본 명세서에 설명된 snoRNA 서열은 자연 발생 snoRNA, 그것의 일부, 또는 그것의 변이체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 타겟팅 RNA 서열의 5' 말단에 연결된 snoRNA 서열("5' snoRNA 서열")을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 타겟팅 RNA 서열의 3' 말단에 연결된 snoRNA 서열("3' snoRNA 서열")을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 타겟팅 RNA 서열의 5' 말단에 연결된 snoRNA 서열("5' snoRNA 서열") 및 타겟팅 RNA 서열의 3' 말단에 연결된 snoRNA 서열("3' snoRNA 서열")을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 적어도 약 50개의 뉴클레오티드, 적어도 약 60개의 뉴클레오티드, 적어도 약 70개의 뉴클레오티드, 적어도 약 80개의 뉴클레오티드, 적어도 약 90개의 뉴클레오티드, 적어도 약 100개의 뉴클레오티드, 적어도 약 110개의 뉴클레오티드, 적어도 약 120개의 뉴클레오티드, 적어도 약 130개의 뉴클레오티드, 적어도 약 140개의 뉴클레오티드, 적어도 약 150개의 뉴클레오티드, 적어도 약 160개의 뉴클레오티드, 적어도 약 170개의 뉴클레오티드, 적어도 약 180개의 뉴클레오티드, 적어도 약 190개의 뉴클레오티드 또는 적어도 약 200개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 약 50-75개의 뉴클레오티드, 약 75-100개의 뉴클레오티드, 약 100-125개의 뉴클레오티드, 약 125-150개의 뉴클레오티드, 약 150-175개의 뉴클레오티드, 약 175-200개의 뉴클레오티드, 약 50-100개의 뉴클레오티드, 약 100-150개의 뉴클레오티드, 약 150-200개의 뉴클레오티드, 약 125-175개의 뉴클레오티드, 또는 약 100-200개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에 있어서, 3' snoRNA 서열은 SEQ ID NO: 1(5'―AAGATTGTGTGTGGATCGATGATGACTTCCATATATACATTCCTTGGAAAGCTGAACAAAATGAGTGAAAACTCTATACCGTCATTCTCGTCGAACTGAGGTCCAGCACATTACTCCAACAG―3')의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 5' snoRNA 서열은, SEQ ID NO: 2(5'―GAGTGAGATCTTGGACCAATGATGACTTCCATACATGCATTCCTTGGAAAGCTGAACAAAATGAGTGGGAACTCTGTACTATCATCTTAGTTGAACTGAGGTCCACCGGGGGCTAA―3')의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 C/D 박스 snoRNA 서열이다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 H/ACA 박스 snoRNA 서열이다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 복합 C/D 박스 및 H/ACA 박스 snoRNA 서열이다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 고아 snoRNA 서열이다.
Pol II 프로모터를 갖는 구축물
또 다른 양태에 있어서, 본 명세서에는 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, (1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, (2) 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 또한 (3) 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, (1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, (2) 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 숙주 세포의 RNA에 작용하는 내인성으로 발현된 아데노신 디아미나아제(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 또한 (3) 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 단백질(예를 들면, Cas, ADAR 또는 ADAR과 Cas의 융합 단백질)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 임의의 단백질 또는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에 있어서, 본 명세서에는 (a) 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물 및 (b) ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, (1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, (2) 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 또한 (3) 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 숙주 세포의 내인성으로 인코딩된 ADAR이고, 상기 ADAR의 도입은 숙주 세포에서 ADAR을 과발현하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 숙주 세포에 대해 외인적이다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물은 플라스미드와 같은 벡터, 또는 바이러스 벡터(예를 들면, AAV 또는 렌티바이러스 벡터)이다.
일 양태에 있어서, 본 출원은 복수의 dRNA, 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 하나 이상의 구축물을 숙주 세포에 도입함으로써 숙주 세포에서 복수의 타겟 RNA(예를 들면, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000개 또는 그 이상)를 편집하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 하나의 Pol II 프로모터(예를 들면, CMV)는 2개 이상의 dRNA의 발현을 유도한다.
Pol II 프로모터의 비제한적 예는 CMV, SV40, EF-1α, CAG 및 RSV를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, Pol II 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 실시형태에 있어서, CMV 프로모터는, SEQ ID NO: 3 (5'―CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT―3')의 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 뮤린 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 식물 세포 또는 진균 세포이다.
본 명세서에 설명된 방법 또는 용도 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 HEK293T, HT29, A549, HepG2, RD, SF268, SW13 및 HeLa 세포와 같은 세포주이다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 섬유아세포, 상피 또는 면역 세포와 같은 1차 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 유사분열 후 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 뇌 세포, 예를 들면 소뇌 세포와 같은 중추 신경계(CNS)의 세포이다.
본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 숙주 세포에 대해 내인성이다. 일부 실시형태에 있어서, RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)는 숙주 세포에 자연적으로 또는 내인성으로 존재하며, 예를 들면 진핵 세포에 자연적으로 또는 내인성으로 존재한다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 숙주 세포에 의해 내인성으로 발현된다. 특정 실시형태에 있어서, ADAR은 숙주 세포에 외인성으로 도입된다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 ADAR1 및/또는 ADAR2이다. 특정 실시형태에 있어서, ADAR은 hADAR1, hADAR2, 마우스 ADAR1 및 ADAR2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 ADAR1의 p110 이소형("ADAR1p110") 및/또는 ADAR1의 p150 이소형("ADAR1p150")과 같은 ADAR1이다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 ADAR2이다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 숙주 세포에 의해 발현되는 ADAR2, 예를 들면 소뇌 세포에 의해 발현되는 ADAR2이다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 숙주 세포에 대해 외인성인 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 자연적으로 발생되는 ADAR의 과활성 돌연변이이다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 E1008Q 돌연변이를 포함하는 ADAR1이다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이 아니다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 조작된 이중 가닥 핵산-결합 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 dRNA의 상보적 RNA 서열에 융합된 MS2 헤어핀에 결합하는 MCP 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 DSB를 포함하지 않는다.
본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 β-튜불린의 단백질 발현 레벨에 대해 ADAR1(예를 들면, ADAR1p110 및/또는 ADAR1p150)의 높은 발현 레벨, 예를 들면 적어도 약 10%, 20%, 50%, 100%, 2x, 3x, 5x 또는 그 이상 중 어느 하나를 갖는다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 β-튜불린의 단백질 발현 레벨에 대해 ADAR2의 높은 발현 레벨, 예를 들면 적어도 약 10%, 20%, 50%, 100%, 2x, 3x, 5x 또는 그 이상 중 어느 하나를 갖는다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 β-튜불린의 단백질 발현 레벨에 대해, 예를 들면 약 5x, 3x, 2x, 100%, 50%, 20% 또는 그 이하 중 어느 하나 이하의 ADAR3의 낮은 발현 레벨을 갖는다.
본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 특정 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 적어도 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250개 중 어느 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 특정 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250개 중 어느 하나 이하의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 40-260, 45-250, 50-240, 60-230, 65-220, 70-220, 70-210, 70-200, 70-190, 70-180, 70-170, 70-160, 70-150, 70-140, 70-130, 70-120, 70-110, 70-100, 70-90, 70-80, 75-200, 80-190, 85-180, 90-170, 95-160, 100-200, 100-150, 100-175, 110-200, 110-175, 110-150, 또는 105-140개 중 어느 하나의 뉴클레오티드 길이이다.
본 명세서에 설명된 방법 또는 용도 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 ADAR-리크루팅 도메인을 포함하지 않는다. "ADAR-리크루팅 도메인"은 ADAR에 고친화도로 결합하는 뉴클레오티드 서열 또는 구조, 또는 조작된 ADAR 구축물에서 ADAR에 융합된 결합 파트너에 결합하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예시적인 ADAR-리크루팅 도메인에는 GluR-2, GluR-B(R/G), GluR-B(Q/R), GluR-6(R/G), 5HT2C, 및 FlnA(Q/R) 도메인이 포함되지만 이에 제한되지 않는다: 예를 들면, Wahlstedt, Helene, and Marie, "Site-selective versus promiscuous A-to-I editing. " Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA 2.6 (2011) : 761-771을 참조하며, 그 전체가 참조로 여기에 포함된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 이중 가닥 부분을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 MS2 줄기 루프와 같은 헤어핀을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 단일 가닥이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 DSB-결합 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 상보적 RNA 서열로 구성(또는 필수적으로 구성)된다.
본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 화학적 변형을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 2'-O-메틸 뉴클레오티드 또는 포스포로티오에이트 연결을 갖는 뉴클레오티드와 같은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 처음 3개 및 마지막 3개 잔기에서만 2'-O-메틸 및 포스포로티오에이트 연결 변형을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)가 아니다.
본 명세서에 설명된 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함한다. 본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 특정 실시형태에 있어서, dRNA의 타겟팅 RNA 서열은 적어도 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250개 중 어느 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 특정 실시형태에 있어서, dRNA의 타겟팅 RNA 서열은 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250개 중 어느 하나 이하의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, dRNA의 타겟팅 RNA 서열은 약 40-260, 45-250, 50-240, 60-230, 65-220, 70-220, 70-210, 70-200, 70-190, 70-180, 70-170, 70-160, 70-150, 70-140, 70-130, 70-120, 70-110, 70-100, 70-90, 70-80, 75-200, 80-190, 85-180, 90-170, 95-160, 100-200, 100-150, 100-175, 110-200, 110-160, 110-175, 110-150, 140-160, 105-140, 또는 105-155개 중 어느 하나의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, dRNA의 타겟팅 RNA 서열은 약 71개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 약 111개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 약 151개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기의 정반대쪽에 있는 시티딘, 아데노신 또는 우리딘을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기의 정반대쪽에 있는 시티딘 미스매치를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 시티딘 미스매치는 타겟팅 RNA 서열의 5' 말단으로부터 적어도 5개의 뉴클레오티드, 예를 들면 적어도 10개, 15개, 20개, 25개, 30개 또는 그 이상의 뉴클레오티드와 떨어져 위치된다. 일부 실시형태에 있어서, 시티딘 미스매치는 상보적 RNA 서열의 3' 말단으로부터 적어도 20개의 뉴클레오티드, 예를 들면 25개, 30개, 35개 또는 그 이상의 뉴클레오티드와 떨어져 위치된다. 일부 실시형태에 있어서, 시티딘 미스매치는 타겟팅 RNA 서열의 3' 말단으로부터 20개 이내(예를 들면, 15개, 10개, 5개 이하)의 뉴클레오티드와 떨어져 위치되지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 시티딘 미스매치는 타겟팅 RNA 서열의 3' 말단으로부터 적어도 20개의 뉴클레오티드(예를 들면, 적어도 25, 30, 35개 또는 그 이상의 뉴클레오티드) 및 5' 말단으로부터 적어도 5개의 뉴클레오티드(예를 들면, 적어도 10, 15, 20, 25, 30개 또는 그 이상의 뉴클레오티드)와 떨어져 위치된다. 일부 실시형태에 있어서, 시티딘 미스매치는 타겟팅 RNA 서열의 중심에 위치된다. 일부 실시형태에 있어서, 시티딘 미스매치는 dRNA에서 타겟팅 서열의 중심의 20개 이내(예를 들면, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 뉴클레오티드)의 뉴클레오티드에 위치된다.
본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA에서 비타겟 아데노신의 각각의 정반대쪽에 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 G와 같은 하나 이상의 구아노신(들)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA에서 비타겟 아데노신의 정반대쪽에 있는 2개 이상의 연속적인 미스매치 뉴클레오티드(예를 들면, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 미스매치 뉴클레오티드)를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 약 20개 이하의 비타겟 A, 예를 들면 약 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 중 어느 하나 이하의 비타겟 A를 포함한다. Gs 및 비타겟 A의 반대쪽에 있는 연속적인 미스매치 뉴클레오티드는 ADAR에 의한 오프 타겟 편집 효과를 감소시킬 수 있다.
본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 특정 실시형태에 있어서, 타겟 아데노신 잔기의 5' 최근접 이웃은 U, C, A 및 G로부터 선택되는 뉴클레오티드이며 선호도는 U>C≒A>G이고, 타겟 아데노신 잔기의 3' 최근접 이웃은 G, C, A 및 U로부터 선택되는 뉴클레오티드이며 선호도는 G>C>A≒U이다. 특정 실시형태에 있어서, 타겟 아데노신 잔기는 타겟 RNA에서 UAG, UAC, UAA, UAU, CAG, CAC, CAA, CAU, AAG, AAC, AAA, AAU, GAG, GAC, GAA 및 GAU로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3-염기 모티프에 존재한다. 특정 실시형태에 있어서, 3-염기 모티프는 UAG이고, dRNA는 3-염기 모티프에서 U의 정반대쪽에 있는 A, 타겟 A의 정반대쪽에 있는 C, 및 3-염기 모티프에서 G의 정반대쪽에 있는 C, G 또는 U를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 3-염기 모티프는 UAG이고, dRNA는 3-염기 모티프에서 U의 정반대쪽에 있는 A, 타겟 A의 정반대쪽에 있는 C, 및 3-염기 모티프에서 G의 정반대쪽에 있는 C, G 또는 U를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 3-염기 모티프는 타겟 RNA에서 UAG이고, dRNA는 타겟 RNA의 UAG의 반대쪽에 있는 ACC, ACG 또는 ACU를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 3-염기 모티프는 타겟 RNA에서 UAG이고, dRNA는 타겟 RNA의 UAG의 반대쪽에 있는 ACC를 포함한다.
본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 프리메신저 RNA, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 트랜스퍼 RNA, 긴 비코딩 RNA 및 소형RNA(예를 들면, miRNA)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 프리메신저 RNA이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 메신저 RNA이다.
본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 특정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR3의 억제제를 숙주 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR3의 억제제는 ADAR3에 대한 shRNA 또는 ADAR3에 대한 siRNA와 같은 ADAR3에 대한 RNAi이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 인터페론의 자극제를 숙주 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 인터페론에 의해 유도될 수 있으며, 예를 들면 ADAR은 ADARp150이다. 일부 실시형태에 있어서, 인터페론의 자극제는 IFNα이다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR3의 억제제 및/또는 인터페론의 자극제는 dRNA를 인코딩하는 동일한 구축물(예를 들면, 벡터)에 의해 인코딩된다.
본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 특정 실시형태에 있어서, 타겟 RNA의 편집 효율은 적어도 약 10%, 예를 들면 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 그 이상 중 어느 하나이다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟 RNA의 편집 효율은 적어도 약 40%이다. 일부 실시형태에 있어서, 편집 효율은 생어(Sanger) 시퀀싱에 의해 결정된다. 일부 실시형태에 있어서, 편집의 효율성은 차세대 시퀀싱에 의해 결정된다. 일부 실시형태에 있어서, 편집 효율은 형광 리포터, 예를 들면 EGFP와 같은 리포터 유전자의 발현을 평가함으로써 결정된다.
본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 특정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 낮은 타겟 외 편집 속도를 갖는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 타겟 RNA에서 비타겟 A에 대한 편집 효율이 약 1% 미만(예를 들면, 약 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.001% 또는 그 이하 중 어느 하나 이하)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 타겟 RNA에서 비타겟 A를 편집하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 비타겟 RNA에서 A에 대해 약 0.1% 미만(예를 들면, 약 0.05%, 0.01%, 0.005%, 0.001%, 0.0001% 또는 그 이하 중 어느 하나 이하)의 편집 효율을 갖는다.
본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 특정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 선천성 면역 반응과 같은 면역 반응을 유도하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 숙주 세포에서 인터페론 및/또는 인터루킨 발현을 유도하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 숙주 세포에서 IFN-β 및/또는 IL-6 발현을 유도하지 않는다.
또한, 본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 의해 생성된 편집된 RNA 또는 편집된 RNA를 갖는 숙주 세포가 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 편집된 RNA는 이노신을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 미스센스 돌연변이, 조기 종결 코돈, 선택적 스플라이싱 부위, 또는 비정상 스플라이싱 부위를 갖는 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 돌연변이의, 절단된, 또는 미스폴딩된 단백질을 포함한다.
핵산의 비바이러스 전달 방법에는 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미량주사, 바이오리스틱스, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 폴리양이온 또는 지질: 핵산 콘쥬게이트, 전기천공, 나노입자, 엑소솜, 미세소포, 또는 유전자총, 네이키드 DNA 및 인공 비리온이 포함된다.
핵산 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 바이러스를 특정 세포에 타겟팅하고, 바이러스 페이로드를 세포 핵으로 트래피킹하는데 높은 효율을 갖는다.
본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 따른 특정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 dRNA를 인코딩하는 바이러스 벡터(예를 들면, AAV 또는 렌티바이러스 벡터)를 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 벡터는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복(ITR) 서열의 측면에 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 2개의 AAV ITR의 측면에 있다. 일부 실시형태에 있어서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 또는 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR이다. 일부 실시형태에 있어서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다. 일부 실시형태에 있어서, 벡터는 스터퍼 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 스터퍼 핵산은 dRNA를 인코딩하는 핵산의 업스트림 또는 다운스트림에 위치된다. 일부 실시형태에 있어서, 벡터는 자가-상보성 rAAV 벡터이다. 일부 실시형태에 있어서, 벡터는 dRNA를 인코딩하는 제 1 핵산 서열 및 dRNA의 보체를 인코딩하는 제 2 핵산 서열을 포함하고, 상기 제 1 핵산 서열은 그것의 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥 내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되고, 상기 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 벡터는 rAAV 입자에 캡슐화된다. 일부 실시형태에 있어서, AAV 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AAVHSC15, AAVHSC17, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 마우스 AAV, 또는 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 dRNA를 인코딩하는 플라스미드를 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 dRNA(예를 들면, 합성 dRNA)를 숙주 세포에 전기천공하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 dRNA를 숙주 세포에 형질감염시키는 단계를 포함한다.
탈아미노화 후, 타겟 RNA 및/또는 타겟 RNA에 의해 인코딩되는 단백질의 변형은 타겟 RNA에서 타겟팅된 아데노신의 위치에 따라 상이한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 타겟 RNA에서 "A"가 "I"로 편집되었는지의 여부를 결정하기 위해, 당업계에 공지된 RNA 시퀀싱 방법을 사용하여 RNA 서열의 변형을 검출할 수 있다. 타겟 아데노신이 mRNA의 인코딩 영역에 위치되는 경우, RNA 편집은 mRNA에 의해 인코딩되는 아미노산 서열에 변화를 일으킬 수 있다. 예를 들면, mRNA에서 선천적 또는 후천적 점 돌연변이의 mRNA에 도입될 수 있는 점 돌연변이는 "A"가 "I"로 전환되기 때문에 야생형 유전자 생성물(들)을 생성하도록 역전될 수 있다. 당업계에 공지된 방법에 의한 아미노산 시퀀싱은 인코딩된 단백질에서 아미노산 잔기의 임의의 변화를 탐색하기 위해 사용될 수 있다. 정지 코돈의 변형은 기능적인, 연장된, 절단된, 전장의 및/또는 야생형 단백질의 존재를 평가함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 타겟 아데노신이 UGA, UAG 또는 UAA 정지 코돈에 위치되는 경우, 타겟 아데노신 잔기(UGA 또는 UAG) 또는 A(UAA)의 변형은 리드 스루(read-through) 돌연변이를 생성할 수 있고, 및/또는 연장된 단백질 또는 타겟 RNA에 의해 인코딩된 절단된 단백질은 기능적인, 전장의 및/또는 야생형 단백질을 생성하도록 역전될 수 있다. 또한, 타겟 RNA의 편집은 타겟 RNA에서 비정상 스플라이싱 부위 및/또는 선택적 스플라이싱 부위를 생성할 수 있고, 따라서 타겟 RNA에서 인코딩된 연장된, 절단된 또는 미스폴딩된 단백질, 또는 비정상 스플라이싱 또는 선택적 스플라이싱 부위는 기능적인, 정확하게 폴딩되는, 전장의 및/또는 야생형 단백질을 생성하기 위해 역전될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 본 출원은 선천적 및 후천적 유전적 변화, 예를 들면 미스센스 돌연변이, 조기 정지 코돈, 타겟 RNA에 의해 인코딩되는 비정상 스플라이싱 또는 선택적 스플라이싱 부위 모두의 편집을 고려한다. 타겟 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 기능을 평가하기 위해 알려진 방법을 사용하여 RNA 편집이 소망의 효과를 달성하는지의 여부를 탐색할 수 있다. 아데노신(A)의 이노신(I)으로의 탈아미노화는 단백질을 인코딩하는 돌연변이 RNA의 타겟 위치에서 돌연변이된 A를 교정할 수 있기 때문에, 이노신으로의 탈아미노화의 식별은 기능적 단백질이 존재하는지 여부, 또는 돌연변이된 아데노신의 존재로 인한 질환 또는 약물 내성 관련 RNA가 역전되거나 부분적으로 역전되었는지의 여부에 대한 평가를 제공할 수 있다. 마찬가지로, 아데노신(A)의 이노신(I)으로의 탈아미노화는 얻어진 단백질에서 점 돌연변이를 도입할 수 있기 때문에, 이노신으로의 탈아미노화의 식별은 질환의 원인 또는 질환의 관련 인자를 식별하기 위한 기능적 지표를 제공할 수 있다.
타겟 아데노신의 존재가 비정상 스플라이싱을 야기할 때, 판독은 비정상 스플라이싱의 발생 및 빈도에 대한 평가가 될 수 있다. 한편, 타겟 아데노신의 탈아미노화가 스플라이싱 부위를 도입하는 것이 바람직한 경우, 유사한 접근법을 사용하여 필요한 유형의 스플라이싱이 발생하는지의 여부를 확인할 수 있다. 타겟 아데노신의 탈아미노화 후 이노신의 존재를 식별하기 위한 예시적인 적합한 방법은 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하는 RT-PCR 및 시퀀싱이다.
타겟 아데노신(들)의 탈아미노화 효과는, 예를 들면 얻어진 단백질의 점 돌연변이, 조기 정지 코돈, 비정상인 스플라이싱 부위, 선택적 스플라이싱 부위 및 미스폴딩을 포함한다. 이들 효과는 유전적으로 유전되었거나 후천적 유전 돌연변이에 의해 유발된 어느 경우라도, 질환과 관련된 RNA 및/또는 단백질의 구조적 및 기능적 변화를 유도하거나, 또는 약물 내성의 발생과 관련된 RNA 및/또는 단백질의 구조적 및 기능적 변화를 유발할 수 있다. 따라서, 본 출원의 dRNA, 상기 dRNA를 인코딩하는 구축물, 및 상기 RNA 편집 방법은 유전성 유전 질환 또는 병태, 또는 질환 관련 RNA 및/또는 단백질의 구조 및/또는 기능을 변화시킴으로써 후천적 유전자 돌연변이와 관련된 질환 또는 병태의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 조절 RNA이다. 일부 실시형태에 있어서, 편집되는 타겟 RNA는 리보솜 RNA, 트랜스퍼 RNA, 긴 비코딩 RNA 또는 소형 RNA(예를 들면, miRNA, pri-miRNA, pre-miRNA, piRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, exRNA 또는 scaRNA)이다. 타겟 아데노신의 탈아미노화 효과에는, 예를 들면 타겟 RNA의 기능 손실 또는 기능 획득 및/또는 3차원 구조의 변화를 포함하여, 리보솜 RNA, 트랜스퍼 RNA, 긴 비코딩 RNA 또는 소형 RNA(예를 들면, miRNA)의 구조적 및 기능적 변화가 포함된다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟 RNA에서 타겟 A의 탈아미노화는 타겟 RNA의 하나 이상의 다운스트림 분자(예를 들면, 단백질, RNA 및/또는 대사산물)의 발현 레벨을 변화시킨다. 다운스트림 분자의 발현 레벨의 변화는 발현 레벨의 증가 또는 감소일 수 있다.
본 출원의 일부 실시형태는 숙주 세포에서 타겟 유전자의 상이한 변이체 또는 상이한 유전자를 스크리닝하는데 유용한, 숙주 세포에서 타겟 RNA의 다중 편집을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 복수의 dRNA를 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하고, 복수의 dRNA의 dRNA 중 적어도 2개는 상이한 서열을 갖고, 및/또는 상이한 타겟 RNA를 갖는다. 일부 실시형태에 있어서, 각각의 dRNA는 상이한 서열 및/또는 상이한 타겟 RNA를 갖는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 숙주 세포에서 단일 타겟 RNA의 복수(예를 들면, 적어도 2, 3, 5, 10, 50, 100, 1000개 또는 그 이상)의 변형을 생성한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 숙주 세포에서 타겟 RNA의 복수(예를 들면, 적어도 2, 3, 5, 10, 50, 100, 1000개 또는 그 이상)의 변형을 생성한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 숙주 세포의 복수의 개체군에서 복수의 타겟 RNA를 편집하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포의 각 집단은 숙주 세포의 다른 집단과 상이한 dRNA 또는 상이한 타겟 RNA를 갖는 dRNA를 수용한다.
III. 탈아미노효소-리크루팅 RNA, 구축물 및 라이브러리
또한, 본 명세서에는 본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 유용한 탈아미노효소-리크루팅 RNA 또는 구축물이 제공된다. 이 단락에 설명된 dRNA 또는 구축물 중 어느 하나는 본 명세서에 설명된 RNA 편집 및 치료 방법에 사용될 수 있다. 각각의 모든 조합이 개별적으로 설명된 바와 같이, dRNA 또는 구축물에 대해 본 명세서에 설명된 임의의 특징 및 파라미터가 서로 조합될 수 있음을 의도한다. 본 명세서에 설명된 dRNA는 CRISPR/Cas 시스템에서 사용되는 tracrRNA, crRNA 또는 gRNA를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟 RNA에 혼성화하는 상보적 RNA 서열을 포함하는, ADAR을 리크루팅함으로써 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 탈아미노화를 위한 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)가 제공된다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 설명된 탈아미노효소-리크루팅 RNA 중 어느 하나를 포함하는 구축물을 제공한다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 바이러스 벡터(예를 들면, 렌티바이러스 벡터) 또는 플라스미드이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 단일 dRNA를 인코딩한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 복수(예를 들면, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20개 또는 그 이상 중 어느 하나)의 dRNA를 인코딩한다.
일 양태에 있어서, 본 출원은 본 명세서에 설명된 복수의 탈아미노효소-리크루팅 RNA 또는 복수의 구축물을 포함하는 라이브러리를 제공한다.
일 양태에 있어서, 본 출원은 본 명세서에 설명된 탈아미노효소-리크루팅 RNA 또는 구축물을 포함하는 조성물 또는 숙주 세포를 제공한다. 특정 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 인간 세포이다.
원형 dRNA 및 구축물
일 양태에 있어서, 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟 RNA 서열을 포함하는 타겟 RNA를 편집하기 위한 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)로서, 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 원형이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 dRNA가 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 원형 RNA를 형성할 수 있는 선형 RNA이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 토네이도 방법에 의해 환형화된다. 또한, 일부 실시형태에 있어서, dRNA 전사체는 5' 및/또는 3' 결찰 서열이 측면에 있고, 이어서 5'-트위스터 리보자임 및/또는 3'-트위스터 리보자임이 각각 측면에 있다. 일부 실시형태에 있어서, 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 적어도 부분적으로 서로 상보적이다. 일부 실시형태에 있어서, 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서로 상보적이다. 일부 실시형태에 있어서, 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 서로 완전히 상보적이다.
일부 실시형태에 있어서, 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 독립적으로 적어도 약 20개의 뉴클레오티드, 적어도 약 25개의 뉴클레오티드, 적어도 약 30개의 뉴클레오티드, 적어도 약 35개의 뉴클레오티드, 적어도 약 40개의 뉴클레오티드, 적어도 45개의 뉴클레오티드, 적어도 약 50개의 뉴클레오티드, 적어도 약 55개의 뉴클레오티드, 적어도 약 60개의 뉴클레오티드, 적어도 약 65개의 뉴클레오티드, 적어도 약 70개의 뉴클레오티드, 적어도 약 75개의 뉴클레오티드, 적어도 약 80개의 뉴클레오티드, 적어도 약 85개의 뉴클레오티드, 적어도 약 90개의 뉴클레오티드, 적어도 약 95개의 뉴클레오티드 또는 적어도 약 100개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 독립적으로 약 20-30개의 뉴클레오티드, 약 30-40개의 뉴클레오티드, 약 40-50개의 뉴클레오티드, 약 50-60개의 뉴클레오티드, 약 60-70개의 뉴클레오티드, 약 70-80개의 뉴클레오티드, 약 80-90개의 뉴클레오티드, 약 90-100개의 뉴클레오티드, 약 100-125개의 뉴클레오티드, 약 125-150개의 뉴클레오티드, 약 20-50개의 뉴클레오티드, 약 50-100개의 뉴클레오티드 또는 약 100-150개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 RNA 리가아제에 의해 원형화된다. 일부 실시형태에 있어서, RNA 리가아제는 숙주 세포에서 내인성으로 발현된다. 일부 실시형태에 있어서, RNA 리가아제는 RNA 리가아제 RtcB이다. 일부 실시형태에 있어서, RNA 리가아제 RtcB는 숙주 세포에서 내인성으로 발현된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 인비트로 효소 결찰(예를 들면, RNA 또는 DNA 리가아제 사용) 또는 화학적 결찰(예를 들면, 시아노겐 브로마이드 또는 유사한 축합제 사용)을 통해 원형화된다.
또한, 본 명세서에는 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물이 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물에 의해 도입된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산의 3' 말단에 연결된 3' 트위스터 리보자임 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산의 5' 말단에 연결된 5' 트위스터 리보자임 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산의 3' 말단에 연결된 3' 트위스터 리보자임 서열 및 dRNA를 인코딩하는 핵산의 5' 말단에 연결된 5' 트위스터 리보자임 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 3' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 5' 트위스터 서열은 트위스터 P1이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 5' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 3' 트위스터 서열은 트위스터 P1이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 자가촉매 절단을 겪는다. 일부 실시형태에 있어서, 촉매화된 dRNA 생성물은 3' 말단에 2',3'-환형 포스페이트 및 5'-히드록실기를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 촉매된 dRNA 생성물은 유비쿼터스 내인성 RNA 리가아제(예를 들면, RNA 리가아제 RtcB)에 의해 결찰된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다.
1개 또는 2개의 snoRNA 말단 및 구축물을 갖는 dRNA
또 다른 양태에 있어서, 본 명세서에는 (1) 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 있는 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하는 타겟 RNA를 편집하기 위한 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)로서, 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있는 dRNA가 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 타겟팅 RNA 서열의 5' 말단에 연결된 snoRNA 서열("5' snoRNA 서열")을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 타겟팅 RNA 서열의 3' 말단에 연결된 snoRNA 서열("3' snoRNA 서열")을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 적어도 약 50개의 뉴클레오티드, 적어도 약 60개의 뉴클레오티드, 적어도 약 70개의 뉴클레오티드, 적어도 약 80개의 뉴클레오티드, 적어도 약 90개의 뉴클레오티드, 적어도 약 100개의 뉴클레오티드, 적어도 약 110개의 뉴클레오티드, 적어도 약 120개의 뉴클레오티드, 적어도 약 130개의 뉴클레오티드, 적어도 약 140개의 뉴클레오티드, 적어도 약 150개의 뉴클레오티드, 적어도 약 160개의 뉴클레오티드, 적어도 약 170개의 뉴클레오티드, 적어도 약 180개의 뉴클레오티드, 적어도 약 190개의 뉴클레오티드 또는 적어도 약 200개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 약 50-75개의 뉴클레오티드, 약 75-100개의 뉴클레오티드, 약 100-125개의 뉴클레오티드, 약 125-150개의 뉴클레오티드, 약 150-175개의 뉴클레오티드, 약 175-200개의 뉴클레오티드, 약 50-100개의 뉴클레오티드, 약 100-150개의 뉴클레오티드, 약 150-200개의 뉴클레오티드, 약 125-175개의 뉴클레오티드, 또는 약 100-200개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에 있어서, 3' snoRNA 서열은 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 5' snoRNA 서열은 SEQ ID NO: 2의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 C/D 박스 snoRNA 서열이다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 H/ACA 박스 snoRNA 서열이다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 복합 C/D 박스 및 H/ACA 박스 snoRNA 서열이다. 일부 실시형태에 있어서, snoRNA 서열은 고아 snoRNA 서열이다.
Pol II 프로모터를 갖는 구축물
또 다른 양태에 있어서, 본 명세서에는 숙주 세포에 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물로서, (1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, (2) 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 또한 (3) 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 구축물이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 코딩 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 Pol II 프로모터로서, 이러한 프로모터는 코딩 뉴클레오티드 서열의 전사 또는 발현을 제어한다. Pol II 프로모터는 제어 하에 코딩 뉴클레오티드 서열의 5'(업스트림)에 위치될 수 있다. Pol II 프로모터와 코딩 서열 사이의 거리는 그 프로모터와 프로모터가 유래된 유전자에서 그것이 조절하는 유전자 사이의 거리와 대략 동일할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이 거리의 변화는 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 코딩 뉴클레오티드 서열의 전사 또는 발현을 조절하는 5' UTR 및/또는 3' UTR을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, Pol II 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 실시형태에 있어서, CMV 프로모터는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 하나의 Pol II 프로모터(예를 들면, CMV)는 2개 또는 그 이상의 dRNA의 발현을 유도한다.
본 명세서에 설명된 dRNA, 구축물, 라이브러리 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA에서 편집되는 타겟 아데노신의 정반대쪽에 있는 시티딘, 아데노신 또는 우리딘을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 각각 타겟 RNA에서 비타겟 아데노신과 정반대쪽에 있는 하나 이상의 구아노신(들)을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 타겟 아데노신 잔기의 5' 최근접 이웃은 U, C, A 및 G로부터 선택되는 뉴클레오티드이며 선호도는 U>C≒A>G이고, 타겟 아데노신 잔기의 3' 최근접 이웃은 G, C, A 및 U로부터 선택되는 뉴클레오티드이며 선호도는 G>C>A≒U이다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟 아데노신 잔기의 5' 최근접 이웃은 U이다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟 아데노신 잔기의 5' 최근접 이웃은 C 또는 A이다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟 아데노신 잔기의 3' 최근접 이웃은 G이다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟 아데노신 잔기의 3' 최근접 이웃은 C이다.
본 명세서에 설명된 dRNA, 구축물, 라이브러리 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에 있어서, 타겟 아데노신 잔기는 타겟 RNA에서 UAG, UAC, UAA, UAU, CAG, CAC, CAA, CAU, AAG, AAC, AAA, AAU, GAG, GAC, GAA 및 GAU로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3-염기 모티프에 존재한다. 일부 실시형태에 있어서, 3-염기 모티프는 UAG이고, dRNA는 3-염기 모티프에서 U의 정반대쪽에 있는 A, 타겟 A의 정반대쪽에 있는 C, 및 3-염기 모티프에서 타겟 G의 정반대쪽에 있는 C, G 또는 U를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 3-염기 모티프는 타겟 RNA에서 UAG이고, dRNA는 타겟 RNA의 UAG와 반대쪽에 있는 ACC, ACG 또는 ACU를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기의 정반대쪽에 있는 시티딘 미스매치를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 시티딘 미스매치는 상보적 RNA 서열의 중심에 가깝고, 예를 들면 상보적 RNA 서열의 중심으로부터 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 뉴클레오티드 이내에 떨어져 있다. 일부 실시형태에 있어서, 시티딘 미스매치는 상보적 RNA 서열의 5' 말단으로부터 적어도 5개의 뉴클레오티드와 떨어져 있다. 일부 실시형태에 있어서, 시티딘 미스매치는 상보적 RNA 서열의 3' 말단으로부터 적어도 20개의 뉴클레오티드와 떨어져 있다.
본 명세서에 설명된 dRNA, 구축물, 라이브러리 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250개 중 어느 하나 초과의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 약 40-260, 45-250, 50-240, 60-230, 65-220, 70-210, 70-200, 70-190, 70-180, 70-170, 70-160, 70-150, 70-140, 70-130, 70-120, 70-110, 70-100, 70-90, 70-80, 75-200, 80-190, 85-180, 90-170, 95-160, 100-150 또는 105-140개 중 어느 하나의 뉴클레오티드 길이이다.
본 출원의 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함한다. 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA에 대한 타겟팅 RNA 서열의 혼성화를 허용하기 위해 타겟 RNA에 완전히 상보적이거나 실질적으로 상보적이다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA와 100% 서열 상보성을 갖는다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA에서 적어도 약 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200개, 또는 그 이상 중 어느 하나의 뉴클레오티의 연속 스트레치에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 이상 중 어느 하나로 상보적이다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열과 타겟 RNA 사이의 혼성화에 의해 형성된 dsRNA는 하나 이상(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상)의 비왓슨-크릭 염기쌍(즉, 미스매치)을 갖는다.
ADAR, 예를 들면 인간 ADAR 효소는 다수의 요인에 따라 다양한 특이성으로 이중 가닥 RNA(dsRNA) 구조를 편집한다. 하나의 중요한 요소는 dsRNA 서열을 구성하는 두 가닥의 상보성 정도이다. dRNA와 타겟 RNA 사이의 완전한 상보성은 일반적으로 ADAR의 촉매 도메인이 비차별적 방식으로 아데노신을 탈아미노화하도록 한다. ADAR의 특이성 및 효율성은 dsRNA 영역에 미스매치를 도입하여 변형될 수 있다. 예를 들면, A-C 미스매치는 편집할 아데노신의 탈아미노화의 특이성과 효율성을 높이기 위해 바람직하게 권장된다. 반대로, 타겟 아데노신 잔기(즉, "비타겟 A") 이외의 다른 A(아데노신) 위치의 G-A 미스매치는 타겟 외 편집을 감소시킬 수 있다. dRNA와 타겟 RNA 사이의 혼성화 및 dsRNA 형성에 대한 실질적인 상보성이 존재한다면, 완전한 상보성은 dRNA와 그것의 타겟 RNA 사이의 dsRNA 형성에 반드시 필요한 것은 아니다. 일부 실시형태에 있어서, dRNA 서열 또는 그것의 단일-가닥 RNA 영역은 최적으로 정렬될 때에 타겟 RNA에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나의 서열 상보성을 갖는다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적절한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있으며, 그 비제한적 예로는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들맨-브니쉬(Needleman-Wimsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러(Burrows-Wheeler) 변환에 기반한 알고리즘(예를 들면, 버로우즈-휠러 얼라이너)이 포함된다.
또한, 타겟 아데노신에 인접한 뉴클레오티드는 탈아미노화의 특이성 및 효율성에 영향을 미친다. 예를 들면, 아데노신 탈아미노화의 특이성 및 효율성의 측면에 있어서, 타겟 RNA 서열에서 편집되는 타겟 아데노신의 5' 최근접 이웃은 선호도가 U>C≒A>G이고, 타겟 RNA 서열에서 편집되는 타겟 아데노신의 3' 최근접 이웃은 G>C>A≒U이다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟 아데노신은 타겟 RNA에서 UAG, UAC, UAA, UAU, CAG, CAC, CAA, CAU, AAG, AAC, AAA, AAU, GAG, GAC, GAA 및 GAU로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3-염기 모티프에 존재하며, 아데노신의 탈아미노화 특이성 및 효율성은 다른 3-염기 모티프의 아데노신보다 높다. 일부 실시형태에 있어서, 편집되는 타겟 아데노신이 3-염기 모티프 UAG, UAC, UAA, UAU, CAG, CAC, AAG, AAC 또는 AAA에 존재하는 경우, 아데노신의 탈아미노화 효율성은 다른 모티프의 아데노신보다 훨씬 더 높다. 또한, 동일한 3-염기 모티프와 관련하여, dRNA의 다른 설계는 다른 탈아미노화 효율로 이어질 수 있다. 3-염기 모티프 UAG를 예로 들면, 일부 실시형태에 있어서, dRNA가 편집되는 타겟 아데노신의 정반대쪽에 있는 시티딘(C), 우리딘의 정반대쪽에 있는 아데노신(A), 및 구아노신의 정반대쪽에 있는 시티딘(C), 구아노신(G) 또는 우리딘(U)을 포함하는 경우, 타겟 아데노신의 탈아미노화 효율은 다른 dRNA 서열을 사용하는 것보다 더 높다. 일부 실시형태에 있어서, dRNA가 타겟 RNA의 UAG의 반대쪽에 있는 ACC, ACG 또는 ACU를 포함하는 경우, 타겟 RNA의 UAG에서 A의 편집 효율은 약 25%-90%(예를 들면, 약 25%-80% , 25%-70%, 25%-60%, 25%-50%, 25%-40%, 또는 25%-30%)에 도달할 수 있다.
타겟 아데노신 이외에, 타겟 RNA에는 편집하는 것이 바람직하지 않은 하나 이상의 아데노신이 존재할 수 있다. 이들 아데노신과 관련하여, 가능한 한 편집 효율을 감소시키는 것이 바람직하다. 구아노신이 타겟 RNA에서 아데노신의 정반대쪽에 있는 경우, 탈아미노화 효율이 상당히 감소된다는 것이 본 개시에 의해 발견된다. 따라서, 타겟 외 탈아미노화를 감소시키기 위해, dRNA는 타겟 RNA에서 편집되는 타겟 아데노신 이외의 하나 이상의 아데노신(들)의 정반대쪽에 있는 하나 이상의 구아노신을 포함하도록 설계될 수 있다.
타겟 RNA 서열 편집의 소망의 레벨의 특이성과 효율성은 다양한 응용 분야에 따라 변화될 수 있다. 본 특허 출원의 지침에 따라, 당업자는 필요에 따라 타겟 RNA 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 서열을 갖는 dRNA를 설계할 수 있을 것이며, 약간의 시행 착오를 통해 소망의 결과를 얻을 수 있을 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "미스매치"는 왓슨-크릭 염기쌍 규칙에 따라 완전한 염기쌍을 형성하지 않는 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 반대쪽의 뉴클레오티드를 지칭한다. 미스매치 염기쌍은, 예를 들면 G-A, C-A, U-C, A-A, G-G, C-C, U-U 염기쌍을 포함한다. A-C 매치를 예로 들면, 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기가 편집되는 경우, dRNA는 편집되는 A와 반대쪽에 있는 C를 포함하도록 설계되어, 타겟 RNA와 dRNA 사이의 혼성화에 의해 형성된 dsRNA에서 AC 미스매치를 발생시킨다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA와 타겟 RNA 사이의 혼성화에 의해 형성된 dsRNA는 미스매치를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, dRNA와 타겟 RNA 사이의 혼성화에 의해 형성된 dsRNA는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 미스매치 중 임의의 하나와 같은 하나 이상의 미스매치(예를 들면, 동일한 유형의 상이한 미스매치 유형)를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, dRNA와 타겟 RNA 사이의 혼성화에 의해 형성된 dsRNA는 하나 이상의 종류의 미스매치, 예를 들면 G-A, C-A, U-C, A-A, G-G, C-C 및 U-U로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 종류의 미스매치를 포함한다.
dRNA와 타겟 RNA 사이의 혼성화에 의해 형성된 dsRNA에서의 미스매치 뉴클레오티드는 돌출부를 형성할 수 있으며, 이는 타겟 RNA의 편집 효율성을 촉진할 수 있다. 미스매치로 인해 형성된 하나(타겟 아데노신에서만 형성됨) 또는 그 이상의 돌출부가 존재할 수 있다. 추가적인 돌출부-도입부 미스매치는 타겟 아데노신의 업스트림 및/또는 다운스트림일 수 있다. 돌출부는 단일-미스매치 돌출부(하나의 미스매칭 염기쌍에 의해 야기됨) 또는 다중 미스매치 돌출부(하나 초과의 연속적인 미스매칭 염기쌍, 예를 들면 2개 또는 3개의 연속적인 미스매칭 염기쌍에 의해 야기됨)일 수 있다.
dRNA에서 타겟팅 RNA 서열은 단일 가닥이다. dRNA는 완전히 단일 가닥이거나 하나 또는 그 이상(예를 들면, 1개, 2개, 3개 또는 그 이상)의 이중 가닥 영역 및/또는 하나 이상의 줄기 루프 영역을 가질 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 적어도 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200개 또는 그 이상 중 어느 하나의 뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에 있어서, 타겟팅 RNA 서열은 약 40-260, 45-250, 50-240, 60-230, 65-220, 70-220, 70-210, 70-200, 70-190, 70-180, 70-170, 70-160, 70-150, 70-140, 70-130, 70-120, 70-110, 70-100, 70-90, 70-80, 75-200, 80-190, 85-180, 90-170, 95-160, 100-200, 100-150, 100-175, 110-200, 110-160, 110-175, 110-150, 140-160, 105-140, 또는 105-155개 중 어느 하나의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, dRNA의 타겟팅 RNA 서열은 약 71개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 약 111개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 약 151개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 타겟팅 RNA 서열과는 별도로, dRNA를 안정화하기 위한 영역, 예를 들면 하나 이상의 이중 가닥 영역 및/또는 줄기 루프 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, dRNA의 이중 가닥 영역 또는 줄기 루프 영역은 약 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 10개 또는 그 이하 중 어느 하나 이하의 염기쌍을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 줄기 루프 또는 이중 가닥 영역을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 ADAR-리크루팅 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 ADAR-리크루팅 도메인을 포함하지 않는다.
dRNA는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 핵염기 변형 및/또는 백본 변형을 포함하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 갖는다. RNA에 대한 예시적인 변형은 포스포로티오에이트 백본 변형, 리보스의 2'-치환(예를 들면, 2'-O-메틸 및 2'-플루오로 치환), LNA, 및 L-RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 핵염기 또는 백본에 대한 변형을 갖지 않는다.
또한, 본 출원은 상기 단락에 설명된 임의의 구축물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 명세서에 설명된 dRNA를 포함하는 구축물을 고려한다. 본 명세서에 사용된 용어 "구축물"은 RNA로 전사되거나 단백질로 발현될 수 있는 코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소를 함유한다. 구축물이 숙주 세포에 도입될 때, 적절한 조건 하에 구축물의 코딩 뉴클레오티드 서열은 전사되거나 발현될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 프로모터가 코딩 뉴클레오티드 서열의 전사 또는 발현을 제어하도록, 코딩 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 프로모터는 제어 하에 코딩 뉴클레오티드 서열의 5'(업스트림)에 위치될 수 있다. 프로모터와 코딩 서열 사이의 거리는 그 프로모터와 프로모터가 유래된 유전자에서 그것이 조절하는 유전자 사이의 거리와 대략 동일할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이 거리의 변화는 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 코딩 뉴클레오티드 서열의 전사 또는 발현을 조절하는 5' UTR 및/또는 3' UTR을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 프로모터는 U6 프로모터이다. 일부 실시형태에 있어서, 프로모터는 상기 설명된 단락에서 논의된 바와 같은 폴리 II 프로모터이다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 본 출원에 개시된 dRNA 중 임의의 하나를 인코딩하는 벡터이다. 용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 부분적으로 이중 가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단을 포함하거나 자유 말단이 없는(예를 들면, 원형) 핵산 분자; DNA, RNA 또는 양쪽을 포함하는 핵산 분자; 및 당업계에 공지된 다른 종류의 폴리뉴클레오티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 벡터의 하나의 유형은 "플라스미드"이며, 이는 표준 분자 클로닝 기술과 같이, 추가의 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 특정 벡터(예를 들면, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터)는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다. 또한, 다른 벡터(예를 들면, 비에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입 시 숙주 세포의 게놈으로 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 그들이 작동가능하게 연결된 코딩 뉴클레오티드 서열의 전사 또는 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 전사 또는 발현에 적합한 형태로 본 출원의 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 재조합 발현 벡터는 전사 또는 발현되는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 전사 또는 발현에 사용되는 숙주 세포에 기초하여 선택될 수 있는 하나 이상의 조절 요소를 포함한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동가능하게 연결된"은 관심의 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현(예를 들면, 인비트로 전사/번역 시스템 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 때에 숙주 세포에서)을 허용하는 방식으로 조절 요소(들)에 연결됨을 의미하는 것으로 의도된다.
일부 실시형태에 있어서, 벡터는 rAAV 벡터이다. 일부 실시형태에 있어서, rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 캡시드 혈청형 등인 AAV ITR를 포함하지만 이에 제한되지 않는 AAV 혈청형으로부터 유래된 벡터이다. 일부 실시형태에 있어서, AAV의 핵산은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 캡시드 혈청형 등의 ITR을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, AAV의 핵산은 본 명세서에 설명된 바와 같은 dRNA를 추가로 인코딩한다. 임의의 AAV 혈청형의 사용은 본 개시의 범위 내에서 고려된다. 일부 실시형태에 있어서, 벡터는 rAAV 입자에 캡시드화된다. 일부 실시형태에 있어서, AAV 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AAVHSC15, AAVHSC17, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 마우스 AAV, 또는 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 구축물(예를 들면, 바이러스 벡터와 같은 벡터)이 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 구축물(예를 들면, 바이러스 벡터와 같은 벡터)이 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, dRNA를 인코딩하는 제 1 뉴클레오티드 서열 및 ADAR을 인코딩하는 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 구축물이 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 제 1 뉴클레오티드 서열 및 제 2 뉴클레오티드 서열은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시형태에 있어서, 제 1 뉴클레오티드 서열 및 제 2 뉴클레오티드 서열은 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시형태에 있어서, 프로모터는 유도성이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 구축물은 ADAR을 인코딩하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 벡터는 ADAR3의 억제제(예를 들면, ADAR3 shRNA 또는 siRNA) 및/또는 인터페론의 자극제(예를 들면, IFN-α)를 인코딩하는 핵산 서열(들)을 추가로 포함한다.
IV. 치료 방법
본 명세서에 설명된 RNA 편집 방법 및 조성물은 유전성 유전 질환 및 약물 내성을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 개체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 명세서에 설명된 RNA 편집 방법 중 어느 하나를 사용하여 타겟 RNA를 편집하는 단계를 포함하는, 생체외에서 개체(예를 들면, 인간 개체)의 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체의 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 생체외에서 개체(예를 들면, 인간 개체)의 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체의 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는, 생체외에서 개체(예를 들면, 인간 개체)의 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체의 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 생체외에서 개체(예를 들면, 인간 개체)의 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, ADAR은 내인성으로 발현된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 개체의 질환 또는 병태와 연관된다. 일부 실시형태에 있어서, 질환 또는 병태는 유전성 유전 질환, 또는 하나 이상의 후천적 유전 돌연변이(예를 들면, 약물 내성)와 관련된 질환 또는 병태이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 개체로부터 세포를 얻는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 명세서에 설명된 RNA 편집 방법 중 어느 하나를 사용하여 개체의 세포에서 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA를 편집하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들면, 인간 개체)의 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들면, 인간 개체)에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 RNA는 이고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들면, 인간 개체)에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들면, 인간 개체)에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 단리된 세포에서 내인성으로 발현되는 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 편집된 RNA를 갖는 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 편집된 RNA를 갖는 세포를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 질환 또는 병태는 유전성 유전 질환, 또는 하나 이상의 후천적 유전 돌연변이(예를 들면, 약물 내성)와 관련된 질환 또는 병태이다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들면, 인간 개체)의 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 이고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들면, 인간 개체)에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체(예를 들면, 인간 개체)에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 개체의 세포에서 내인성으로 발현되는 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 질환 또는 병태는 유전성 유전 질환, 또는 하나 이상의 후천적 유전 돌연변이(예를 들면, 약물 내성)와 관련된 질환 또는 병태이다.
본 출원의 방법을 이용하여 치료하기에 적합한 질환 및 상태는 RNA 전사체에서 돌연변이, 예를 들면 G에서 A로의 돌연변이, 예를 들면 미스센스 돌연변이, 조기 정지 코돈, 비정상 스플라이싱 또는 선택적 스플라이싱을 초래하는 G에서 A로의 돌연변이와 관련된 질환을 포함한다. 본 출원의 방법에 의해 회복될 수 있는 질환 관련 돌연변이의 예는 암과 관련된 TP53W53X(예를 들면, 158G>A), I형 점액다당류증(MPS I)과 관련된 IDUAW402X(예를 들면, 엑손 9에서의 TGG>TAG 돌연변이), 엘러스-단로스 증후군과 관련된 COL3A1W1278X(예를 들면, 3833G>A 돌연변이), 원발성 폐고혈압증과 관련된 BMPR2W298X(예를 들면, 893G>A), 주버트 증후군과 관련된 AHI1W725X(예를 들면, 2174G>A), 판코니 빈혈과 관련된 FANCCW506X(예를 들면, 1517G>A), 원발성 가족성 비대형 심근병증과 관련된 MYBPC3W1098X(예를 들면, 3293G>A), X-연관성 중증 복합 면역부전증과 관련된 IL2RGW237X(예를 들면, 710G>A)을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 질환 또는 병태는 암이다. 일부 실시형태에 있어서, 질환 또는 병태는 단일 유전성 질환이다. 일부 실시형태에 있어서, 질환 또는 병태는 다중유전성 질환이다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 암을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 dRNA인 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 암을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 암을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 단리된 세포에서 내인성으로 발현되는 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 TP53W53X(예를 들면, 158G>A)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 4(5'―GGGAGCAGCCUCUGGCAUUCUGGGAGCUUCAUCUGGACCUGGGUCUUCAGUGAACCAUUGUUCAAUAUCGUCCGGGGACAGCAUCAAAUCAUCCAUUGCUUGGGACGGCAA―3')의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 개체의 세포에서 내인성으로 발현되는 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 TP53W53X(예를 들면, 158G>A)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 4의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 MPS I(예를 들면, 헐러 증후군 또는 샤이에 증후군)을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 MPS I(예를 들면, 헐러 증후군 또는 샤이에 증후군)를 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 MPS I(예를 들면, 헐러 증후군 또는 샤이에 증후군)를 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 단리된 세포에서 내인성으로 발현된 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 IDUAW402X(예를 들면, 엑손 9에서 TGG>TAG 돌연변이)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 5(5'―GACCCCCACCGUGUGGUUGCUGUCCAGGACGGUCCCGGCCUGCGACACUUCGGCCCAGAGCUGCUCCUCAUCUGCGGGGCGGGGGGGCCGUCGCCGCGUGGGGUCGUUG―3')의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 MPS I(예를 들면, 헐러 증후군 또는 샤이에 증후군)를 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 이고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA 또는 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 MPS I(예를 들면, 헐러 증후군 또는 샤이에 증후군)를 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 MPS I(예를 들면, 헐러 증후군 또는 샤이에 증후군)를 치료 및 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 개체의 세포에서 내인성으로 발현된 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 IDUAW402X(예를 들면, 엑손 9에서 TGG>TAG 돌연변이)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 엘러스-단로스 증후군 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 이고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA 또는 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 엘러스-단로스 증후군 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 엘러스-단로스 증후군 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 단리된 세포에서 내인성으로 발현되는 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 COL3A1W1278X(예를 들면, 3833G>A 돌연변이)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 6(5'―CAUAUUACAGAAUACCUUGAUAGCAUCCAAUUUGCAUCCUUGGUUAGGGUCAACCCAGUAUUCUCCACUCUUGAGUUCAGGAUGGCAGAAUUUCAGGUCUCUGCAGUUUCU―3')의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 엘러스-단로스 증후군을 치료 및 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 이고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA 또는 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 엘러스-단로스 증후군을 치료 및 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 엘러스-단로스 증후군을 치료 및 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 개체의 세포에서 내인성으로 발현되는 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 COL3A1W1278X(예를 들면, 3833G>A 돌연변이)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 원발성 폐고혈압증을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA의 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 이고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 원발성 폐고혈압증을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 원발성 폐고혈압증을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 단리된 세포에서 내인성으로 발현되는 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 BMPR2W298X(예를 들면, 893G>A)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 7(5'―GUGAAGAUAAGCCAGUCCUCUAGUAACAGAAUGAGCAAGACGGCAAGAGCUUACCCAGUCACUUGUGUGGAGACUUAAAUACUUGCAUAAAGAUCCAUUGGGAUAGUACUC―3')의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 원발성 폐고혈압증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 dRNA인 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 원발성 폐고혈압증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 원발성 폐고혈압증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 개체의 세포에서 내인성으로 발현되는 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 BMPR2W298X(예를 들면, 893G>A)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 7의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 주버트 증후군을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 이고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA 또는 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 주버트 증후군을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 주버트 증후군을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 ADAR은 단리된 세포에서 내인성으로 발현되는 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 AHI1W725X(예를 들면, 2174G>A)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 8(5'―GUGAACGUCAAACUGUCGGACCAAUAUGGCAGAAUCUUCUCUCAUCUCAACUUUCCAUAUCCGUAUCAUGGAAUCAUAGCAUCCUGUAACUACUAGCUCUCUUACAGCUGG―3')의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 주버트 증후군을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 이고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 주버트 증후군을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 주버트 증후군을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 개체의 세포에서 내인성으로 발현된 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 AHI1W725X(예를 들면, 2174G>A)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 8의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 판코니 빈혈증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA의 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 이고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA 또는 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 판코니 빈혈증을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 판코니 빈혈증을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 단리된 세포에서 내인성으로 발현된 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 FANCCW506X(예를 들면, 1517G>A)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 9(5'―GCCAAUGAUCUCGUGAGUUAUCUCAGCAGUGUGAGCCAUCAGGGUGAUGACAUCCCAGGCGAUCGUGUGGCCUCCAGGAGCCCAGAGCAGGAAGUUGAGGAGAAGGUGCCU―3')의 핵산 서열을 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 판코니 빈혈증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 이고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA 또는 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 판코니 빈혈증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 판코니 빈혈증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 개체의 세포에서 내인성으로 발현되는 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 FANCCW506X(예를 들면, 1517G>A)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 9의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 원발성 가족성 비대성 심근병증을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 이고, 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 원발성 가족성 비대성 심근병증을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 원발성 가족성 비대성 심근병증을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 단리된 세포에서 내인성으로 발현된 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 MYBPC3W1098X(예를 들면, 3293G>A)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 10(5'―CAAGACGGUGAACCACUCCAUGGUCUUCUUGUCGGCUUUCUGCACUGUGUACCCCCAGAGCUCCGUGUUGCCGACAUCCUGGGGUGGCUUCCACUCCAGAGCCACAUUAAG―3')의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 원발성 가족성 비대성 심근병증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 이고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA 또는 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 원발성 가족성 비대성 심근병증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 원발성 가족성 비대성 심근병증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 ADAR은 개체의 세포에서 내인성으로 발현되는 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 MYBPC3W1098X(예를 들면, 3293G>A)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 원발성 가족성 비대성 심근병증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 이고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA 또는 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 X-연관성 중증 복합 면역부전증을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 생체외에서 개체의 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA와 관련된 X-연관성 중증 복합 면역부전증을 치료하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 단리된 세포에서 내인성으로 발현된 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 단리된 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 IL2RGW237X(예를 들면, 710G>A)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 11(5'―AGGAUUCUCUUUUGAAGUAUUGCUCCCCCAGUGGAUUGGGUGGCUCCAUUCACUCCAAUGCUGAGCACUUCCACAGAGUGGGUUAAAGCGGCUCCGAACACGAAACGUGUA―3')의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 도입하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 X-연관성 중증 복합 면역부전증을 치료 및 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 이고, 또한 상기 dRNA는 원형 RNA 또는 원형 RNA를 형성할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 X-연관성 중증 복합 면역부전증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 유효량의 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 돌연변이(예를 들면, G>A 돌연변이)를 갖는 타겟 RNA로 X-연관성 중증 복합 면역부전증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, ADAR은 개체의 세포에서 내인성으로 발현되는 ADAR이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 타겟 RNA는 IL2RGW237X(예를 들면, 710G>A)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 dRNA는 SEQ ID NO: 11의 핵산 서열을 포함한다.
일반적으로, 조성물(예를 들면, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물)의 투여량, 일정 및 투여 경로는 개체의 크기 및 상태에 따라, 및 표준 약학 실무에 따라 결정될 수 있다. 예시적인 투여 경로는 정맥내, 동맥내, 복강내, 폐내, 방광내, 근육내, 기관내, 피하, 안구내, 척수강내, 또는 경피를 포함한다.
본 출원의 RNA 편집 방법은 동물 세포, 예를 들면 포유류 세포에서 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 식물 또는 진균, 예를 들면 내생적으로 ADAR을 발현하는 식물 또는 진균에서 RNA의 변형에 사용될 수 있다. 본 명세서에 설명된 방법은 개선된 특성을 갖는 유전자 조작된 식물 및 진균을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 명세서에 설명된 치료 방법 중 어느 하나에 사용하기 위한 본 명세서에 설명된 dRNA, 구축물, 편집된 RNA를 갖는 세포, 및 조성물 중 어느 하나, 및 질환 또는 병태를 치료하기 위한 의약품의 제조에 있어서 본 명세서에 설명된 dRNA, 구축물, 편집된 세포, 및 조성물 중 어느 하나가 제공된다.
V. 조성물, 키트 및 제조품
또한, 본 명세서에 설명된 바와 같은 편집된 RNA를 갖는 dRNA, 구축물, 라이브러리, 또는 숙주 세포 중 어느 하나를 포함하는 조성물(예를 들면, 약학 조성물)이 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 본 명세서에 설명된 dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 구축물 중 어느 하나, 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 용량 및 농도에서 수용체에게 무독성이며, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 방부제(예를 들면, 옥타데실디메틸벤질암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 올리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨과 같은 당; 소듐과 같은 염 형성 카운터 이온; 금속 복합체(예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 동결건조된 제제가 제공된다. 인비보 투여에 사용되는 약학 조성물은 멸균되어야 한다. 이것은, 예를 들면 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
본 명세서에 설명된 바와 같은 dRNA, 구축물, 조성물, 라이브러리 또는 편집된 숙주 세포 중 어느 하나를 포함하는, 본 명세서에 설명된 RNA 편집 방법 또는 치료 방법 중 어느 하나에 유용한 키트가 추가로 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하기 위한 키트로서, 상기 dRNA는 상기 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 이고, 또는 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는 키트가 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 포함하는 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하기 위한 키트로서, 상기 dRNA는 (1) 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열 및 (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있는 키트가 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하기 위한 키트로서, 상기 dRNA는 타겟 RNA에 혼성화하는 타겟팅 RNA 서열을 포함하고, 상기 dRNA는 타겟 RNA에서 타겟 아데노신 잔기를 탈아미노화하기 위해 ADAR을 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 키트가 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 키트는 ADAR 또는 상기 ADAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 키트는 ADAR3의 억제제 또는 그것의 구축물을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 키트는 인터페론의 자극제 또는 그것의 구축물을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 키트는 본 명세서에 설명된 RNA 편집 방법 또는 치료 방법 중 임의의 하나를 실시하기 위한 지침서를 추가로 포함한다.
본 출원의 키트는 적절한 패키징에 담겨 있다. 적합한 패키징에는 바이알, 보틀, 병, 가요성 패키징(예를 들면, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 키트는 형질감염 또는 형질도입 시약, 세포 배양 배지, 완충액 및 해석 정보와 같은 추가 구성요소를 선택적으로 제공할 수 있다.
따라서, 본 출원은 제조 물품을 더 제공한다. 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기에는 바이알(예를 들면, 밀봉된 바이알), 보틀, 병, 가요성 패키징 등이 포함된다. 일부 실시형태에 있어서, 용기는 약학 조성물을 보유하고, 멸균 액세스 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 약학 조성물을 보유하는 용기는 재구성된 제형의 반복 투여(예를 들면, 2-6회 투여)를 허용하는 다용도 바이알일 수 있다. 패키지 삽입물은 이러한 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 복용량, 투여, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 상업용 패키지에 관례적으로 포함된 지침서를 지칭한다. 추가로, 제조품은 주사용 정균수(BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로오스 용액과 같은 약학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제 2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
키트 또는 제조 물품은 약국, 예를 들면 병원 약국 및 조제 약국과 같은 저장 및 사용에 충분한 양으로 패키징된, 약학 조성물 및 사용 지침의 다중 단위 용량을 포함할 수 있다.
하기 예시적인 실시형태 및 실시예는 본 출원의 순전히 예시적인 것으로 의도되고, 따라서 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 하기 예시적인 실시형태 및 실시예 및 상세한 설명은 제한이 아니라 예시를 위해 제공된다.
예시적인 실시형태
본 출원은 하기 실시형태를 제공한다.
1. 탈아미나아제-리크루팅 RNA(dRNA) 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서,
(1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟 RNA 서열을 포함하고,
(2) 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고,
(3) 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는, 방법.
2. 실시형태 1에 있어서, 상기 dRNA는 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열을 추가로 포함하는, 방법.
3. 실시형태 2에 있어서, 상기 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 적어도 부분적으로 서로 상보적인, 방법.
4. 실시형태 2 또는 실시형태 3에 있어서, 상기 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 약 20개 내지 약 75개의 뉴클레오티드 길이인, 방법.
5. 실시형태 1-4 중 어느 하나에 있어서, 상기 dRNA는 RNA 리가아제 RtcB에 의해 원형화되는, 방법.
6. 실시형태 4에 있어서, 상기 RNA 리가아제 RtcB는 숙주 세포에서 내인성으로 발현되는, 방법.
7. 실시형태 1-6 중 어느 하나에 있어서, 상기 dRNA는 원형 RNA인, 방법.
8. 실시형태 1-6 중 어느 하나에 있어서, 상기 dRNA는 원형 RNA를 형성할 수 있는 선형 RNA인, 방법.
9. 실시형태 1-6 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산의 3' 말단에 연결된 3' 트위스터 리보자임 서열 및 dRNA를 인코딩하는 핵산의 5' 말단에 연결된 5' 트위스터 리보자임 서열을 추가로 포함하는, 방법.
11. 실시형태 10에 있어서, 상기 3' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 상기 5' 트위스터 서열은 트위스터 P1인, 방법.
12. 실시형태 10에 있어서, 상기 5' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 상기 3' 트위스터 서열은 트위스터 P1인, 방법.
13. 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA) 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, 상기 dRNA는,
(1) 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열, 및
(2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한
상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있는, 방법.
14. 실시형태 13에 있어서, 상기 dRNA는 타겟팅 RNA 서열의 5' 말단에 연결된 snoRNA 서열("5' snoRNA 서열")을 포함하는, 방법.
15. 실시형태 13 또는 실시형태 14에 있어서, 상기 dRNA는 타겟팅 RNA 서열의 3' 말단에 연결된 snoRNA 서열("3' snoRNA 서열")을 포함하는, 방법.
16. 실시형태 13-15 중 어느 하나에 있어서, 상기 snoRNA 서열은 적어도 약 70개의 뉴클레오티드 길이인, 방법.
17. 실시형태 13-16 중 어느 하나에 있어서, 상기 3' snoRNA 서열은 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
18. 실시형태 13-17 중 어느 하나에 있어서, 상기 5' snoRNA 서열은 SEQ ID NO: 2의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
19. 실시형태 13-18 중 어느 하나에 있어서, 상기 snoRNA 서열은 C/D 박스 snoRNA 서열인, 방법.
20. 실시형태 13-18 중 어느 하나에 있어서, 상기 snoRNA 서열은 H/ACA 박스 snoRNA 서열인, 방법.
21. 실시형태 13-18 중 어느 하나에 있어서, 상기 snoRNA 서열은 복합 C/D 박스 및 H/ACA 박스 snoRNA 서열인, 방법.
22. 실시형태 13-18 중 어느 하나에 있어서, 상기 snoRNA 서열은 고아 snoRNA 서열인, 방법.
23. 실시형태 13-22 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
24. 실시형태 9-12 및 실시형태 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는, 방법.
25. 실시형태 24에 있어서, 상기 프로모터는 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")인, 방법.
26. 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서,
(1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고,
(2) 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 또한
(3) 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는, 방법.
27. 실시형태 25 또는 26에 있어서, 상기 Pol II 프로모터는 CMV 프로모터인, 방법.
28. 실시형태 27에 있어서, 상기 CMV 프로모터는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
29. 실시형태 9-12 및 23-28 중 어느 하나에 있어서, 상기 구축물은 바이러스 벡터 또는 플라스미드인, 방법.
30. 실시형태 29에 있어서, 상기 구축물은 AAV 벡터인, 방법.
31. 실시형태 1-30 중 어느 하나에 있어서, 상기 ADAR은 숙주 세포에 의해 내인성으로 발현되는, 방법.
32. 실시형태 31에 있어서, 상기 숙주 세포가 T 세포인, 방법.
33. 실시형태 1-32 중 어느 하나에 있어서, 상기 타겟팅 RNA 서열은 50개 초과의 뉴클레오티드 길이인, 방법.
34. 실시형태 33에 있어서, 상기 타겟팅 RNA 서열은 약 100개 내지 약 150개의 뉴클레오티드 길이인, 방법.
35. 실시형태 1-34 중 어느 하나에 있어서, 상기 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 정반대쪽에 있는 시티딘, 아데노신 또는 우리딘을 포함하는, 방법.
36. 실시형태 35에 있어서, 상기 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 정반대쪽에 있는 시티딘 미스매치를 포함하는, 방법.
37. 실시형태 36에 있어서, 상기 시티딘 미스매치는 타겟팅 RNA 서열의 3' 말단으로부터 적어도 20개의 뉴클레오티드, 및 타겟팅 RNA 서열의 5' 말단으로부터 적어도 5개의 뉴클레오티드 떨어져 위치되는, 방법.
38. 실시형태 1-37 중 어느 하나에 있어서, 상기 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA에서 비타겟 아데노신의 각각의 반대쪽에 있는 하나 이상의 구아노신을 추가로 포함하는, 방법.
39. 실시형태 1-38 중 어느 하나에 있어서, 상기 타겟팅 RNA 서열은 타겟 RNA에서 비타겟 아데노신의 반대쪽에 있는 2개 이상의 연속적 미스매치 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
40. 실시형태 1-39 중 어느 하나에 있어서, 상기 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 5' 최근접 이웃은 U, C, A 및 G로부터 선택되는 뉴클레오티드이며 선호도는 U>C≒A>G이고, 상기 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 3' 최근접 이웃은 G, C, A 및 U로부터 선택되는 뉴클레오티드이며 선호도는 G>C＞A≒U인, 방법.
41. 실시형태 1-40 중 어느 하나에 있어서, 상기 타겟 아데노신은 타겟 RNA에서 UAG, UAC, UAA, UAU, CAG, CAC, CAA, CAU, AAG, AAC, AAA, AAU, GAG, GAC, GAA 및 GAU로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3-염기 모티프에 존재하는, 방법.
42. 실시형태 41에 있어서, 상기 3-염기 모티프는 UAG이고, 상기 타겟팅 RNA는 3-염기 모티프에서 우리딘의 정반대쪽에 있는 A, 상기 타겟 아데노신의 정반대쪽에 있는 시티딘, 및 3-염기 모티프에서 상기 구아노신의 정반대쪽에 있는 시티딘, 구아노신 또는 우리딘을 포함하는, 방법.
43. 실시형태 1-42 중 어느 하나에 있어서, 상기 타겟 RNA는 프리메신저 RNA, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 트랜스퍼 RNA, 긴 비코딩 RNA 및 소형 RNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 RNA인, 방법.
44. 실시형태 43에 있어서, 상기 타겟 RNA는 프리메신저 RNA인, 방법.
45. 실시형태 1-44 중 어느 하나에 있어서, 상기 ADAR3의 억제제 및/또는 숙주 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
46. 실시형태 1-45 중 어느 하나에 있어서, 인터페론의 자극제를 숙주 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
47. 실시형태 1-46 중 어느 하나에 있어서, 각각 상이한 타겟 RNA를 타겟팅하는 복수의 dRNA 또는 구축물을 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
48. 실시형태 1-47 중 어느 하나에 있어서, 상기 타겟 RNA를 편집하는 효율이 적어도 40%인, 방법.
49. 실시형태 1-48 중 어느 하나에 있어서, 상기 구축물 또는 dRNA는 면역 반응을 유도하지 않는, 방법.
50. 실시형태 1-49 중 어느 하나에 있어서, ADAR(예를 들면, 외인성 ADAR)을 숙주 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
51. 실시형태 50에 있어서, 상기 ADAR은 E1008 돌연변이를 포함하는 ADAR1인, 방법.
52. 실시형태 1-51 중 어느 하나에 있어서, 상기 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 탈아미노화는 타겟 RNA에서 미스센스 돌연변이, 조기 정지 코돈, 비정상 스플라이싱 또는 선택적 스플라이싱, 또는 타겟 RNA에서 미스센스 돌연변이, 조기 정지 코돈, 비정상 스플라이싱 또는 선택적 스플라이싱의 역전을 초래하는, 방법.
53. 실시형태 52에 있어서, 상기 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 탈아미노화는 상기 타겟 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 점 돌연변이, 절단, 신장 및/또는 미스폴딩을 초래하거나, 또는 상기 타겟 RNA에서 미스센스 돌연변이, 조기 정지 코돈, 비정상 스플라이싱, 또는 선택적 스플라이싱의 역전에 의한 기능적인, 전장의, 정확하게 접힌 및/또는 야생형 단백질을 초래하는, 방법.
54. 실시형태 1-53 중 어느 하나에 있어서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포인, 방법.
55. 실시형태 54에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유류 세포인, 방법.
56. 실시형태 55에 있어서, 상기 숙주 세포는 인간 또는 마우스 세포인, 방법.
57. 실시형태 1-56 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 편집된 RNA 또는 편집된 RNA를 갖는 숙주 세포.
58. 실시형태 1-57 중 어느 하나의 방법에 따라 개체의 세포에서 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA를 편집하는 단게를 포함하는, 개체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법.
59. 실시형태 58에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 유전성 유전 질환 또는 하나 이상의 후천적 유전 돌연변이와 관련된 질환 또는 병태인, 방법.
60. 실시형태 58 또는 59에 있어서, 상기 타겟 RNA는 G에서 A로의 돌연변이를 갖는, 방법.
61. 실시형태 58-60 중 어느 하나에 있어서, 질환 또는 병태는 단일 유전 질환 또는 병태인, 방법.
62. 실시형태 58-61 중 어느 하나에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 다유전 질환 또는 병태인, 방법.
63. 실시형태 58-62 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 상기 타겟 RNA는 TP53이고, 질환 또는 병태는 암이고;
(ii) 상기 타겟 RNA는 IDUA이고, 질환 또는 병태는 I형 점액다당류증(MPS I)이고;
(iii) 상기 타겟 RNA는 COL3A1이고, 질환 또는 병태는 엘러스-단로스 증후군이고;
(iv) 상기 타겟 RNA는 BMPR2이고, 질환 또는 병태는 주버트 증후군이고;
(v) 상기 타겟 RNA는 FANCC이고, 질환 또는 병태는 판코니 빈혈증이고;
(vi) 상기 타겟 RNA는 MYBPC3이고, 질환 또는 병태는 원발성 가족성 비대 심근병증이고; 또는
(vii) 상기 타겟 RNA는 IL2RG이고, 질환 또는 병태는 X-연관성 중증 복합 면역부전증인, 방법.
64. 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하는 타겟 RNA를 편집하기 위한 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)로서, 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 상기 dRNA는 원형이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는, 방법.
65. 실시형태 64에 있어서, 상기 dRNA는 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열을 추가로 포함하는, dRNA.
66. 실시형태 65에 있어서, 상기 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 적어도 부분적으로 서로 상보적인, dRNA.
67. 실시형태 65 또는 66에 있어서, 상기 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 약 20개 내지 약 75개의 뉴클레오티드 길이인, dRNA.
68. 실시형태 64-67 중 어느 하나에 있어서, 상기 dRNA는 원형 RNA인, dRNA.
69. 실시형태 64-67 중 어느 하나에 있어서, 상기 dRNA는 원형 RNA를 형성할 수 있는 선형 RNA인, dRNA.
70. 실시형태 64-69 중 어느 하나에 기재된 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물.
71. 실시형태 70의 구축물에 있어서, 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산의 3' 말단에 연결된 3' 트위스터 리보자임 서열 및 dRNA를 인코딩하는 핵산의 5' 말단에 연결된 5' 트위스터 리보자임 서열을 추가로 포함하는 구축물.
72. 실시형태 71에 있어서, 상기 3' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 5' 트위스터 서열은 트위스터 P1인 구축물.
73. 실시형태 72에 있어서, 상기 5' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 3' 트위스터 서열은 트위스터 P1인 구축물.
74. 타겟 RNA를 편집하기 위한 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)로서,
(1) 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열, 및
(2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 있는 소핵소체 RNA(snoRNA)를 포함하고, 또한
상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있는, dRNA.
75. 실시형태 74에 있어서, 상기 dRNA는 타겟팅 RNA 서열의 5' 말단에 연결된 snoRNA 서열("5' snoRNA 서열")을 포함하는, dRNA.
76. 실시형태 75에 있어서, 상기 dRNA는 타겟팅 RNA 서열의 3' 말단에 연결된 snoRNA 서열("3' snoRNA 서열")을 포함하는, dRNA.
77. 실시형태 74-76 중 어느 하나에 있어서, 상기 snoRNA 서열은 적어도 약 70개의 뉴클레오티드 길이인, dRNA.
78. 실시형태 76-77 중 어느 하나에 있어서, 상기 3' snoRNA 서열은 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 포함하는, dRNA.
79. 실시형태 75-78 중 어느 하나에 있어서, 상기 5' snoRNA 서열은 SEQ ID NO: 2의 핵산 서열을 포함하는, dRNA.
80. 실시형태 74-79 중 어느 하나에 있어서, 상기 snoRNA 서열은 C/D 박스 snoRNA 서열인, dRNA.
81. 실시형태 74-79 중 어느 하나에 있어서, 상기 snoRNA 서열은 H/ACA 박스 snoRNA 서열인, dRNA.
82. 실시형태 74-79 중 어느 하나에 있어서, 상기 snoRNA 서열은 복합 C/D 박스 및 H/ACA 박스 snoRNA 서열인, dRNA.
83. 실시형태 74-79 중 어느 하나에 있어서, 상기 snoRNA 서열은 고아 snoRNA 서열인, dRNA.
84. 실시형태 74-83 중 어느 하나에 기재된 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물.
85. 실시형태 70-73 및 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 구축물.
86. 실시형태 85에 있어서, 상기 프로모터는 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")인 구축물.
87. 숙주 세포에 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물로서,
(1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고,
(2) 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 또한
(3) 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 구축물.
88. 실시형태 86 또는 실시형태 87에 있어서, 상기 Pol II 프로모터는 CMV 프로모터인 구축물.
89. 실시형태 88에 있어서, 상기 CMV 프로모터는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열을 포함하는 구축물.
90. 실시형태 70-73 및 실시형태 84-89 중 어느 하나에 있어서, 상기 구축물은 바이러스 벡터 또는 플라스미드인 구축물.
91. 실시형태 90에 있어서, 상기 구축물은 AAV 벡터인 구축물.
92. 실시형태 64-91 중 어느 하나에 있어서, 상기 타겟 RNA는 프리메신저 RNA, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 트랜스퍼 RNA, 긴 비코딩 RNA 또는 소형 RNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 RNA인 구축물 또는 dRNA.
93. 실시형태 64-91 중 어느 하나에 기재된 구축물 또는 dRNA를 포함하는 숙주 세포.
94. 실시형태 64-91 중 어느 하나에 기재된 구축물 또는 dRNA를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하기 위한 키트.
실시예
재료 및 방법
플라스미드 구축
이중 형광 리포터는 mCherry 및 EGFP(EGFP 제 1 코돈 ATG가 삭제됨) 인코딩 DNA를 증폭하는 PCR에 의해 클로닝되었으며, 3×GS 링커 및 타겟팅 DNA 서열은 PCR 동안 프라이머를 통해 추가되었다. 이어서, PCR 생성물은 Type II 제한 효소 BsmB1(Thermo) 및 T4 DNA 리가아제(NEB)에 의해 절단되고 연결되었으며, 이어서 pLenti 백본(pLenti-CMV-MCS-SV-Bsd, Stanley Cohen Lab, Stanford University)에 삽입되었다.
dLbuCas13 DNA는 Lbu 플라스미드(Addgene #83485)로부터 PCR 증폭되었다. ADAR1DD 및 ADAR2DD는 Adar1(p150) cDNA 및 Adar2 cDNA로부터 증폭되었고, 양쪽은 Xiamen University의 Han의 연구실에서 기증한 것이다. ADAR1DD 또는 ADAR2DD를 dLbuCas13 DNA에 오버랩 PCR을 통해 융합하고, 융합된 PCR 생성물을 pLenti 백본에 삽입했다.
포유류 세포에서 dRNA의 발현을 위해, dRNA 서열을 직접 합성하고(짧은 dRNA의 경우) 어닐링하거나 오버랩되는 ssDNA를 합성하여 PCR 증폭하고, 생성물을 골든 게이트 클로닝에 의해 U6 발현 하에 대응하는 벡터에 클로닝하였다.
전장 Adar1(p110) 및 Adar1(p150)은 Adar1(p150) cDNA로부터 PCR 증폭되었고, 전장 Adar2는 Adar2 cDNA로부터 PCR 증폭되었으며, 이어서 각각 pLenti 백본에 클로닝되었다.
이중 형광 리포터(리포터-1 및 리포터-3)의 2개의 버전의 경우, mCherry 및 EGFP(EGFP의 시작 코돈 ATG가 삭제됨) 코딩 서열을 PCR 증폭하고, BsmBI(Thermo Fisher Scientific, ER0452)를 사용하여 분해하고, 이어서 GGGGS 링커를 이용하여 T4 DNA 리가아제(NEB, M0202L)-매개 결찰을 행하였다. 계속해서, 결찰 생성물은 pLenti-CMV-MCS-PURO 백본에 삽입되었다.
dLbuCas13-ADARDD(E1008Q) 발현 구축의 경우, ADAR1DD 유전자가 ADAR1p150 구축물(Jiahuai Han's lab, Xiamen University로부터 제공)로부터 증폭되었다. dLbuCas13 유전자는 Lbu_C2c2_R472A_H477A_R1048A_H1053A 플라스미드(Addgene #83485)로부터 PCR에 의해 증폭되었다. ADAR1DD(과활성 E1008Q 변이체)는 오버랩-PCR에 의해 생성되고, 이어서 dLbuCas13에 융합되었다. 결찰 생성물을 pLenti-CMV-MCS-BSD 백본에 삽입했다.
arRNA-발현 구축물의 경우, arRNA의 서열을 합성하고, pLenti-sgRNA-lib 2.0(Addgene #89638) 백본에 골든 게이트 클로닝하고, arRNA의 전사는 hU6 프로모터에 의해 구동되었다. ADAR 발현 구축물의 경우, 전장 ADAR1p110 및 ADAR1p150은 ADAR1p150 구축물로부터 PCR 증폭되었고, 전장 ADAR2는 ADAR2 구성으로부터 PCR 증폭되었다(Jiahuai Han's lab, Xiamen University로부터 제공). 이어서, 증폭된 생성물을 pLenti-CMV-MCS-BSD 백본에 클로닝했다.
병원성 돌연변이를 갖는 유전자를 발현하는 구축물의 경우, TP53(Vigenebio로부터 주문) 및 기타 6가지 질환 관련 유전자(COL3A1, BMPR2, AHI1, FANCC, MYBPC3 및 IL2RG, 중국 의과학원 병원체 생물학 연구소 Jianwei Wang의 실험실로부터 제공)는 돌연변이유발 PCR을 통해 G>A 돌연변이가 도입된 대응하는 유전자를 인코딩하는 구축물로부터 증폭되었다. 증폭된 생성물은 Gibson 클로닝 방법을 통해 pLenti-CMV-MCS-mCherry 백본에 클로닝되었다.
포유류 세포주 및 세포 배양
포유류 세포주는 37℃, 5% CO2 하에서 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 10% 소태아 혈청(Lanzhou Bailing Biotechnology Co, Ltd, Lanzhou, China)이 첨가된 둘베코 변형 이글 배지(10-013-CV, Corning, Tewksbury, MA, USA)에서 배양되었다. Adar1-KO 세포주는 EdiGene China로부터 구입했으며, 유전자형 분석 결과도 EdiGene China에 의해 제공되었다.
HeLa 및 B16 세포주는 Z. Jiang의 실험실(Peking University)로부터제공되었다. 그리고, HEK293T 세포주는 C. Zhang의 실험실(Peking University)로부터 제공되었다. RD 세포주는 J Wang의 실험실(Institute of Pathogen Biology, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences))로부터 제공되었다. SF268 세포주는 Cell Center, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences로부터 제공되었다. A549 및 SW13 세포주는 EdiGene Inc.로부터 제공되었다. HepG2, HT29, NIH3T3 및 MEF 세포주는 Peking University의 본 출원인의 실험실에서 유지 관리되었다. 이러한 포유류 세포주는 37℃, 5% CO2 하에서 1% 페니실린-스트렙토마이신이 더 보충된 10% 소태아 혈청(CellMax, SA201.02)을 갖는 둘베코 변형 이글 배지(Corning, 10-013-CV)에서 배양되었다. 달리 언급되지 않는 한, 제조사의 지시에 따라 X-tremeGENE HP DNA 형질감염 시약(Roche, 06366546001)으로 세포를 형질감염시켰다.
인간 1차 폐 섬유아세포(#3300) 및 인간 1차 기관지 상피 세포(#3210)는 ScienCell Research Laboratories, Inc.로부터 구입하였고, 섬유아세포 배지(ScienCell, #2301) 및 기관지 상피 세포 배지(ScienCell, #3211)에서 각각 배양하였다. 두 배지 모두 15% 소태아 혈청(BI) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충되었다. 1차 GM06214 및 GM01323은 Coriell Institute for Medical Research로부터 주문되었고, 15% 소태아 혈청(BI) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 갖는 둘베코 변형 이글 배지(Corning, 10-013-CV)에서 배양하였다. 모든 세포는 37℃, 5% CO2 하에서 배양되었다.
리포터 시스템 형질감염, FACS 분석 및 생어 시퀀싱
이중 형광 리포터 편집 실험의 경우, 293T-WT 세포 또는 293T-Adar1-KO 세포를 6개의 웰 플레이트(6×105세포/웰)에 시딩하였고, 24시간 후, 공급자의 프로토콜에 따라 X-tremeGENE HP DNA 형질감염 시약(06366546001; Roche, Mannheim, German)을 사용하여 15㎍ 리포터 플라스미드 및 15㎍ dRNA 플라스미드를 공-형질감염시켰다. 48-72시간 후, 세포를 수집하고 FACS 분석을 행하였다. 리포터 mRNA 편집을 더 확인하기 위해, 본 발명자들은 FACS Aria 유세포 분석기(BD Biosciences)를 사용하여 리포터 및 dRNA 플라스미드로 형질감염된 293T-WT 세포로부터 EGFP 양성 세포를 분류하고, 이어서 전체 RNA 단리(TIANGEN, DP430)를 행하였다. 이어서, RNA를 RT-PCR(TIANGEN, KR103-04)을 통해 cDNA로 역전사하고, 타겟팅된 유전자좌를 대응하는 프라이머 쌍(23 PCR 주기)으로 PCR 증폭하고, PCR 생성물을 생어 시퀀싱을 위해 정제하였다.
Adar1(p110), Adar1(p150) 또는 Adar2 구제 및 과발현 실험을 위해, 293T-WT 세포 또는 293T-Adar1-KO 세포를 12웰 플레이트(2.5×105세포/웰)에 시딩하고, 24시간 후, 0.5㎍ 리포터 플라스미드, 0.5㎍ dRNA 플라스미드 및 0.5㎍ Adar1/2 플라스미드(대조군으로서 pLenti 백본)를 X-tremeGENE HP DNA 형질감염 시약(06366546001, Roche, Mannheim, German)을 사용하여 공-형질감염시켰다. 48~72시간 후, 세포를 수집하고, FACS 분석을 행하였다.
내인성 mRNA 실험을 위해, 293T-WT 세포를 6개의 웰 플레이트(6×105세포/웰)에 시딩하였고, 대략 70% 컨플루언트일 때, 3㎍ dRNA 플라스미드를 X-tremeGENE HP DNA 형질감염 시약(06366546001, Roche, Mannheim, German)을 사용하여 형질감염시켰다. 72시간 후, 세포를 수집하고, 이후의 RNA 분리를 위해 FACS를 통해 GFP-양성 또는 BFP-양성 세포(대응하는 형광 메이커에 따름)를 분류했다.
인간 1차 T 세포의 단리 및 배양
원발성 인간 T 세포는 건강한 인간 기증자의 루카페레시스 생성물로부터 분리되었다. 간단히 말해서, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 Ficoll 원심분리(Dakewei, AS1114546)에 의해 분리되었고, T 세포는 PBMC로부터 EasySep 인간 T 세포 분리 키트(STEMCELL, 17951)를 사용하여 자기 음성 선택에 의해 분리되었다. 분리 후, T 세포를 X-vivo15 배지, 10% FBS 및 IL2(1000 U/ml)에서 배양하고, CD3/CD28 DynaBeads(ThermoFisher, 11131D)로 2일 동안 자극하였다. 건강한 기증자의 루카페레시스 생성물은 AllCells LLC China로부터 획득하였다. 모든 건강한 기증자는 정보에 입각한 동의를 하였다.
렌티바이러스 패키징 및 리포터 세포주 구축
발현 플라스미드를 X-tremeGENE HP DNA 형질감염 시약을 통해 2개의 바이러스 패키징 플라스미드인 pR874 및 pVSVG(Addgene)와 함께 HEK293T-WT 세포에 공-형질감염시켰다. 72시간 후, 상등액 바이러스를 수집하여 -80℃에 보관하였다. HEK293T-WT 세포를 렌티바이러스로 감염시키고, 72시간 후, mCherry-양성 세포를 FACS를 통해 분류하고 배양하여 제한 희석 방법에 의해 매우 낮은 EGFP 백그라운드를 갖는 이중 형광 리포터 시스템을 안정적으로 발현하는 단일 클론 세포주를 선택하였다.
안정적인 리포터 세포주의 경우, 리포터 구축물(pLenti-CMV-MCSPURO 백본)을 2개의 바이러스 패키징 플라스미드인 pR8.74 및 pVSVG와 함께 HEK293T 세포에 공-형질감염시켰다. 72시간 후, 상등액 바이러스를 수집하여 -80℃에 보관하였다. HEK293T 세포를 렌티바이러스로 감염시키고, 이어서 mCherry 양성 세포를 FACS를 통해 분류하고 배양하여 검출 가능한 EGFP 백그라운드 없이 이중 형광 리포터 시스템을 안정적으로 발현하는 단일 클론 세포주를 선택하였다. HEK293T ADAR1--/-- 및 TP53--/-- 세포주는 이전에 보고된 방법60에 따라 생성되었다. ADAR1 타겟팅 sgRNA 및 CMV 구동 퓨로마이신 내성 유전자를 함유하는 PCR 증폭 공여자 DNA를 HEK293T 세포에 공-형질감염시켰다. 이어서, 형질감염 7일 후에 세포를 퓨로마이신으로 처리하였다. 단일 클론을 퓨로마이신 내성 세포로부터 단리하고, 이어서 시퀀싱 및 웨스턴 블롯을 통해 검증하였다.
내인성 또는 외인성 발현 전사체의 RNA 편집
이중 형광 리포터, HEK293T 세포 또는 HEK293T ADAR1--/-- 세포에서 RNA 편집을 평가하기 위해 세포를 6웰 플레이트에 접종하였다(6×105세포/웰). 24시간 후, 세포를 1.5㎍ 리포터 플라스미드 및 1.5㎍ arRNA 플라스미드로 공-형질감염시켰다. ADAR1p110, ADAR1p150 또는 ADAR2 단백질 발현의 효과를 조사하기 위해, 편집 효율을 EGFP 양성 비율 및 딥 시퀀싱으로 분석하였다.
HEK293T ADAR1--/-- 세포를 12웰 플레이트(2.5×105 세포/웰)에 시딩하였다. 24시간 후, 세포를 리포터 플라스미드 0.5㎍, arRNA 플라스미드 0.5㎍ 및 ADAR1/2 플라스미드 0.5㎍(대조군으로서 pLenti 백본)으로 공-형질감염시켰다. 편집 효율은 EGFP 양성 비율 및 심층 시퀀싱으로 분석되었다.
내인성 mRNA 전사체에 대한 RNA 편집을 평가하기 위해, HEK293T 세포를 6웰 플레이트(6×105세포/웰)에 시딩하였다. 24시간 후, 세포를 3㎍의 arRNA 플라스미드로 형질감염시켰다. 딥 시퀀싱으로 편집 효율성을 분석하였다.
다중 세포주에서의 RNA 편집 효율을 평가하기 위해, 8-9×104(RD, SF268, HeLa) 또는 15×105(HEK293T) 세포를 12웰 플레이트에 시딩했다. HT29, A549, HepG2, SW13, NIH3T3, MEF 및 B16과 같이 형질감염이 어려운 세포의 경우, 2-2.5×105세포를 6웰 플레이트에 시딩했다. 24시간 후, 리포터 및 arRNA 플라스미드를 이들 세포에 공-형질감염시켰다. 편집 효율은 EGFP 양성 비율에 의해 분석했다.
EGFP 양성 비율을 평가하기 위해, 형질감염 후 48∼72시간에서 세포를 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석에 의해 분류 및 수집했다. mCherry 신호는 리포터/arRNA-발현 세포를 위한 형광 선택 마커로 사용되었으며, EGFP+/mCherry+ 세포의 백분율을 편집 효율에 대한 판독값으로서 계산했다.
A에서 I로의 편집 속도의 NGS 정량화를 위해, 형질감염 후 48 내지 72시간에, 세포를 분류하고 FACS 분석에 의해 수집하고, 이어서 RNA 분리(TIANGEN, DP420)를 실시하였다. 이어서, 전체 RNA를 RT-PCR(TIANGEN, KR103-04)을 통해 cDNA로 역전사하고, 이하의 표에 나열된 대응하는 프라이머를 사용하여 타겟팅된 유전자좌를 PCR 증폭하였다.
Figure pct00001
PCR 생성물은 생어 시퀀싱 또는 NGS(Illumina HiSeq X Ten)를 위해 정제되었다.
다수의 세포주에서 테스팅
HEK293T(양성 대조군) 및 HEK293T ADAR1-/-(음성 대조군) 세포 외에,상이한 조직 및 기관으로부터 유래하는 1개의 마우스 세포주(NIH3T3) 및 7개의 인간 세포주(RD, HeLa, SF268, A549, HepG2, HT-29, SW13)를 실험을 행하기 위해 선택했다. 형질감염 효율이 더 높은 세포주의 경우, 약 8-9×104세포(RD, HeLa, SF268) 또는 1.5×105(HEK293T)를 12웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하고, 형질감염이 곤란한 것(A549, HepG2, HT-29, SW13, NIH3T3)에 대해서는, 2-2.5×105 세포를 6웰 플레이트에 플레이팅했다. 또한, 모든 이들 세포를 37℃에서 5% CO2와 함께 10%소태아 혈청(FBS, CellMax)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Corning)에서 유지되었다. 24시간 후, CG2 리포터 및 71개의 뉴클레오티드 dRNA(35-C-35) 플라스미드를 X-tremeGENE HP DNA 형질감염 시약(Roche)을 사용하여 상이한 유형의 세포에 공-형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포를 트립신화하고, FACS(BD)를 통해 분석했다. 형질감염 효율이 낮은 세포는 mCherry 및 BFP 양성 세포가 상당히 적었기 때문에, 6웰 플레이트에 플레이팅된 세포에 대해서는 FACS 분석을 위한 총 세포수를 1×105까지 증가시켰다.
실시예 1. CMV 프로모터를 사용하여 arRNA 발현을 유도함으로써 LEAPER 최적화
RNA 폴리머라아제 II(Pol II)가 편집 효율성을 향상시킬 수 있는지의 여부를 테스트하기 위해, Pol II 프로모터(CMV)에 의해 구동되는 arRNA를 발현하는 플라스미드를 구축하였다. EGFP 발현에 기반한 리포터 시스템(리포터 1, 도 4B)을 사용하여, CMV에 의해 구동되는 arRNA와 U6 프로모터 사이의 RNA 편집 효율을 비교하였다(arRNA51). 처리되지 않은 세포를 모조군(Mock)으로서 사용하였다. 비타겟팅 RNA로 형질감염된 세포도 대조군으로서 사용하였다(대조군 RNA). CMV-arRNA가 RNA 편집에서 U6-arRNA를 능가하는 것으로 밝혀졌다(도 1).
Figure pct00002
실시예 2. sno-arRNA에 의해 매개된 RNA 편집
arRNA를 안정화하고 핵 국소화를 향상시키기 위해, arRNA는 snoRNA 말단을 갖도록 조작되었다. 형광 리포터-1을 타겟팅하는 151-nt arRNA는 snoRNA 말단이 측면 배치되었다(도 2a):
Figure pct00003
Figure pct00004
이중 형광 리포터-1은 mCherry의 서열(SEQ ID NO: 21), 3×GS 링커 및 타겟팅된 A를 포함하는 서열(SEQ ID NO: 22), 및 eGFP의 서열(SEQ ID NO: 23)을 포함한다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
이어서, 인간 U6 구동 sno-arRNA151, arRNA151, sno-대조군 RNA151 또는 대조군 RNA151을 리포터 발현 플라스미드와 함께 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, EGFP 양성 비율을 FACS 분석을 통해 정량화했다. FACS 결과는 snoRNA 말단이 측면 배치된 sno-arRNA151이 선형 arRNA보다 낮은 거의 38% EGFP 양성 비율로 리포터 mRNA에서 타겟팅된 RNA 편집을 매개할 수 있음을 나타내었다(도 2b-2c).
snoRNA 말단이 arRNA를 안정화하는지 테스트하기 위해, 상이한 시점에서 EGPF 양성 비율을 측정했다. 인간 U6 프로모터 하에 있는 sno-arRNA151, arRNA151, sno-대조군 RNA151 또는 대조군 RNA151을 HEK293T-리포터 세포에 형질감염시켰다. EGFP 양성 비율은 형질감염 후 3일, 6일 및 12일의 3개의 시점에서 측정되었다. 결과는 sno-arRNA가 연장된 시간 동안 arRNA보다 더 높은 편집 효율을 나타냄을 보여주었으며, 이는 snoRNA 말단이 arRNA를 분해로부터 보호하고, sno-arRNA의 풍부함을 향상시킬 수 있음을 나타낸다(도 3a).
arRNA의 발현 레벨을 더욱 향상시키기 위해, 바이러스 기반의 강력한 프로모터-CMV를 사용하여 arRNA 또는 sno-arRNA를 발현시켰다. 그 결과, CMV-프로모터 발현 arRNA(CMV_arRNA)가 U6-프로모터 발현 arRNA(U6_arRNA)보다 훨씬 높은 편집 효율을 나타냈다. 또한, U6_arRNA 그룹의 EGFP 양성 비율은 장기간에 걸쳐 감소한 반면, CMV_arRNA의 EGFP 양성 비율은 형질감염 6일 후 여전히 증가했다. 마찬가지로, CMV-프로모터 발현 sno-arRNA(CMV_sno-arRNA)는 U6-프로모터 발현 sno-arRNA(U6_sno-arRNA)보다 훨씬 더 높은 편집 효율을 달성하였다(도 3B 및 도 3C).
이상의 결과를 바탕으로, snoRNA 말단이 arRNA를 안정화시킬 수 있고, CMV 프로모터에 의해 구동되는 arRNA 또는 sno-arRNA가 발현 수준을 증가시킬 수 있음을 입증하였다. 이들 두 가지 전략 모두 arRNA의 편집 효율성을 크게 높일 수 있다.
실시예 3. 원형 arRNA에 의해 매개되는 RNA 편집
mCherry와 EGFP 사이에 프레임 내 정지 코돈을 포함하는 리포터-1을 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포(도 4b)는 모두 리포터-1을 타겟팅하는 원형 arRNA71 및 원형 arRNA111을 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. EGFP 형광은 RNA에 대한 타겟 편집의 효율성을 나타낸다. 가장 효율적인 arRNA 구조를 테스트하기 위해, 원형 arRNA는 양쪽 말단 결찰 서열에 연결되는 25-nt 또는 50-nt 링커와 함께 측면 배치되었다(도 4a). 또한, 비교를 위해, 선형(비원형) arRNA71 및 arRNA111은 동시에 형질감염시켰다. 원형 arRNA는 선형 arRNA와 비교하여 EGFP+ 세포 및 EGFP 강도의 비율(도 4c)을 모두 크게 개선한 반면, 25-nt 또는 50-nt 링커를 갖는 원형 arRNA는 효율성 개선을 약화시키는 것으로 나타났다(도 4c).
리포터-3을 안정적으로 발현하는 HEK293T(도 4b)에 있어서, 길이가 편집 효율에 미치는 영향을 추가로 테스트하였다. 리포터 EGFP 비율에 기초하여, 원형 arRNA의 길이는 편집 효율과 양의 상관관계가 있었으며, 111-nt 내지 151-nt(도 4d)에서 정점을 이루었고, 71-nt는 원형 arRNA 활성에 대한 최소 길이였다(도 4d).
이중 형광 리포터-3은 mCherry의 서열(SEQ ID NO: 21), 1×GS 링커(이탤릭체 및 볼드체로 나타냄) 및 타겟팅된 A(SEQ ID NO: 24)를 포함하는 서열, 및 eGFP의 서열(SEQ ID NO: 23)을 포함한다.
Figure pct00008
원형 arRNA는 ADAR1의 낮은 발현 레벨 또는 ADAR3의 높은 발현으로 인해 우리가 테스트한 다중 세포주 중에서 LEAPER 효율이 상대적으로 낮은 HeLa 및 A549 세포에 사용되었다. 원형 arRNA는 EGFP 리포터 분석에 기초하여 두 세포주 모두에서 편집 효율을 유의하게 증가시키는 것으로 밝혀졌다(도 4e).
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 4. 원형 arRNA를 갖는 LEAPER 시스템을 사용한 조기 정지 코돈의 수정
다수의 질환은 조기 정지 코돈(PTC)에 의해 발생된다. PTC 관련 질환 치료에서 LEAPER-원형 arRNA의 가능성을 조사하기 위해, 프레임 내 UAA 정지 코돈 리포터를 구축했다. 원형 arRNA의 3개의 버전(즉, 토네이도-arRNA111-A1, 토네이도-arRNA111-A2 및 토네이도-arRNA111-2A)은 이 리포터의 UAA 사이트를 타겟팅하도록 설계되어, 3개의 상이한 arRNA의 EGFP 양성 비율을 비교하였다. TAA 코돈의 제 2 아데노신을 타겟팅하는 토네이도-arRNA111-A2가 보다 효율적인 것으로 밝혀졌다(도 5).
실시예 5. 원형 arENA를 갖는 LEAPER 시스템을 사용한 mRNA 스플라이싱의 조절
새로운 스플라이싱 생성물을 생성하기 위해 mRNA 스플라이싱을 조작하는 것은 뒤센 근이영양증과 같은 질환을 치료하기 위한 전략이다. RG6 스플라이싱 리포터를 사용하여 LEAPER-원형 arRNA가 스플라이싱 수용체 부위를 변경할 수 있는지 테스트하였다. 원형 arRNA의 3개의 버전은 토네이도-arRNA71(71-nt), 토네이도-arRNA71(111-nt) 및 토네이도-arRNA71+BP(수용체 위치와 분기점을 모두 타겟팅하는 111-nt)를 포함하는 RG6 스플라이싱 수용체 부위를 타겟팅하도록 설계되었다. HEK293T 세포에 있어서, RG6 리포터는 스플라이싱 패턴이 LEAPER-토네이도에 의해 변경된 경우, EGFP 단백질보다 더 많은 dsRNA 단백질을 발현하였다(도 6a). 본 발명자들은 LEAPER-원형 arRNA가 세포 스플라이싱 기구를 효율적으로 타겟팅할 수 있음을 발견하였다(도 6b).
실시예 6. 원형 arENA를 갖는 LEAPER 시스템의 렌티바이러스 전달
치료 RNA의 지속적인 투여는 그 효능에 중요하다. 원형 arRNA를 갖는 LEAPER의 렌티바이러스 전달이 RNA 편집을 달성할 수 있는지의 여부를 테스트하였다. 원형 arRNA를 갖는 LEAPER는 다양한 토네이도-arRNA가 게놈에 통합되어 안정적으로 발현될 수 있는 렌티바이러스 전달을 통해 작동할 수 있음을 발견하였다. 토네이도-arRNA의 길이는 편집 효율과 양의 상관관계가 있었다(도 7).
(참조 문헌)
Figure pct00011
Figure pct00012
SEQUENCE LISTING <110> Peking University <120> TARGETED RNA EDITING BY LEVERAGING ENDOGENOUS ADAR USING ENGINEERED RNAS <130> FD00254PCT <150> PCT/CN2019/095802 <151> 2019-07-12 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <400> 1 aagattgtgt gtggatcgat gatgacttcc atatatacat tccttggaaa gctgaacaaa 60 atgagtgaaa actctatacc gtcattctcg tcgaactgag gtccagcaca ttactccaac 120 ag 122 <210> 2 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <400> 2 gagtgagatc ttggaccaat gatgacttcc atacatgcat tccttggaaa gctgaacaaa 60 atgagtggga actctgtact atcatcttag ttgaactgag gtccaccggg ggctaa 116 <210> 3 <211> 508 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <400> 3 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc 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sequence <400> 51 gagcuguaca agcugcaggg cggaggaggc agcgccugcu cgcgaugcua gagggcucug 60 ccagugagca agggcgagga gcuguuc 87

Claims (43)

  1. 탈아미노효소-리크루팅 RNA(deaminaserecruiting RNA: dRNA) 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서,
    (1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고,
    (2) 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 또한
    (3) 상기 dRNA는 원형 RNA이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 dRNA는 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열을 추가로 포함하고, 선택적으로
    (i) 상기 3' 결찰 서열과 5' 결찰 서열은 적어도 부분적으로 서로 상보적이고; 및/또는
    (ii) 상기 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 약 20 내지 약 75개의 뉴클레오티드 길이인, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 dRNA는 원형 RNA인, dRNA.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 dRNA는 원형 RNA를 형성할 수 있는 선형 RNA인, dRNA.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 dRNA는 RNA 리가아제 RtcB에 의해 원형화되고, 선택적으로 상기 RNA 리가아제 RtcB는 숙주 세포에서 내인성으로 발현되는, 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 구축물은 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산의 3' 말단에 연결된 3' 트위스터 리보자임 서열 및 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산의 5' 말단에 연결된 5' 트위스터 리보자임 서열을 추가로 포함하는 방법으로서, 선택적으로
    (i) 상기 3' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 상기 5' 트위스터 서열은 트위스터 P1이고; 또는
    (ii) 상기 5' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 상기 3' 트위스터 서열은 트위스터 P1인, 방법.
  8. 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA) 또는 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서, 상기 dRNA는,
    (1) 상기 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열, 및
    (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고; 또한
    상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있는, 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    (i) 상기 dRNA는 상기 타겟팅 RNA 서열의 5' 말단에 연결된 snoRNA 서열("5' snoRNA 서열")을 포함하고;
    (ii) 상기 dRNA는 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 말단에 연결된 snoRNA 서열("3' snoRNA 서열")을 포함하고;
    (iii) 상기 snoRNA 서열은 적어도 약 70개의 뉴클레오티드 길이이고;
    (iv) 상기 3' snoRNA 서열은 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 포함하고;
    (v) 상기 5' snoRNA 서열은 SEQ ID NO: 2의 핵산 서열을 포함하고; 및/또는
    (vi) 상기 snoRNA 서열은 C/D 박스 snoRNA 서열, H/ACA 박스 snoRNA 서열, 복합 C/D 박스 및 H/ACA 박스 snoRNA 서열, 또는 고아 snoRNA 서열인, 방법.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    상기 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제 6 항, 제 7 항 또는 제 10 항에 있어서,
    상기 구축물은 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하고, 상기 프로모터는 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")인, 방법.
  12. 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하는 방법으로서,
    (1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고,
    (2) 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 또한
    (3) 상기 구축물은 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는, 방법.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    상기 Pol II 프로모터는 CMV 프로모터이고, 선택적으로 상기 CMV 프로모터는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  14. 제 6 항, 제 7 항 및 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 구축물은 바이러스 벡터 또는 플라스미드이고, 선택적으로 상기 구축물은 AAV 벡터인, 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ADAR은 숙주 세포에 의해 내인성으로 발현되고, 선택적으로 상기 숙주 세포는 T 세포인, 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 타겟팅 RNA 서열은 50개 초과의 뉴클레오티드 길이이고, 선택적으로 상기 타겟팅 RNA 서열은 약 100개 내지 약 150개의 뉴클레오티드 길이이고;
    (ii) 상기 타겟팅 RNA 서열은 상기 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 정반대쪽에 있는 시티딘, 아데노신 또는 우리딘을 포함하고, 선택적으로 상기 타겟팅 RNA 서열은 상기 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 정반대쪽에 있는 시티딘 미스매치를 포함하고, 예를 들면 상기 시티딘 미스매치는 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 말단으로부터 적어도 20개의 뉴클레오티드 및 상기 타겟팅 RNA 서열의 5' 말단으로부터 적어도 5개의 뉴클레오티드와 떨어져 위치되고;
    (iii) 상기 타겟팅 RNA 서열은 상기 타겟 RNA에서 비타겟 아데노신의 각각 반대쪽에 있는 하나 이상의 구아노신을 추가로 포함하고;
    (iv) 상기 타겟팅 RNA 서열은 상기 타겟 RNA에서 비타겟 아데노신의 반대쪽에 있는 2개 이상의 연속적인 미스매치 뉴클레오티드를 포함하고;
    (v) 상기 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 5' 최근접 이웃은 U, C, A 및 G로부터 선택되는 뉴클레오티드이며 선호도는 U＞C≒A＞G이고, 상기 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 3' 최근접 이웃은 G, C, A 및 U로부터 선택되는 뉴클레오티드이며 선호도는 G>C>A≒U이고;
    (vi) 상기 타겟 아데노신은 상기 타겟 RNA에서 UAG, UAC, UAA, UAU, CAG, CAC, CAA, CAU, AAG, AAC, AAA, AAU, GAG, GAC, GAA 및 GAU로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3-염기 모티프에 존재하고, 선택적으로 상기 3-염기 모티프는 UAG이고, 상기 타겟팅 RNA는 상기 3-염기 모티프에서 우리딘의 정반대쪽에 있는 A, 상기 타겟 아데노신의 정반대쪽에 있는 시티딘, 및 상기 3-염기 모티프에서 구아노신의 정반대쪽에 있는 시티딘, 구아노신 또는 우리딘을 포함하고; 및/또는
    (vii) 상기 타겟 RNA는 프리메신저 RNA, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 트랜스퍼 RNA, 긴 비코딩 RNA 및 소형 RNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 RNA이고, 선택적으로 상기 타겟 RNA는 프리메신저 RNA인, 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ADAR3의 억제제 및/또는 인터페론의 자극제를 숙주 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각 상이한 타겟 RNA를 타겟팅하는 복수의 dRNA 또는 구축물을 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 타겟 RNA의 편집 효율은 적어도 40%인, 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 구축물 또는 dRNA는 면역 반응을 유도하지 않는, 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ADAR을 숙주 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 ADAR은 E1008 돌연변이를 포함하는 ADAR1인, 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 탈아미노화는 상기 타겟 RNA에서 미스센스 돌연변이, 조기 정지 코돈, 비정상 스플라이싱 또는 선택적 스플라이싱을 초래하거나, 또는 상기 타겟 RNA에서 미스센스 돌연변이, 조기 정지 코돈, 비정상 스플라이싱 또는 선택적 스플라이싱의 역전을 초래하고, 선택적으로 상기 타겟 RNA에서 타겟 아데노신의 탈아미노화는 상기 타겟 RNA에 의해 인코딩된 단백질의 점 돌연변이, 절단, 신장 및/또는 미스폴딩을 초래하거나, 또는 상기 타겟 RNA에서 미스센스 돌연변이, 조기 정지 코돈, 비정상 스플라이싱 또는 선택적 스플라이싱의 역전에 의한 기능적인, 전장의, 정확하게 접힌 및/또는 야생형 단백질을 초래하는, 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 진핵 세포이고, 선택적으로 상기 숙주 세포는 포유류 세포이고, 예를 들면 상기 숙주 세포는 인간 또는 마우스 세포인, 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 생성된 편집된 RNA 또는 편집된 RNA를 갖는 숙주 세포.
  25. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 개체의 세포에서 질환 또는 병태와 관련된 타겟 RNA를 편집하는 단계를 포함하는, 개체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    (i) 상기 질환 또는 병태는 유전성 유전 질환 또는 하나 이상의 후천적 유전 돌연변이와 관련된 질환 또는 병태이고;
    (ii) 상기 타겟 RNA는 G에서 A로의 돌연변이를 갖고; 및/또는
    (iii) 상기 질환 또는 병태는 단일 유전 또는 다유전 질환 또는 병태인, 방법.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,
    (i) 상기 타겟 RNA는 TP53이고, 질환 또는 병태는 암이고;
    (ii) 상기 타겟 RNA는 IDUA이고, 질환 또는 병태는 I형 점액다당류증(MPS I)이고;
    (iii) 상기 타겟 RNA는 COL3A1이고, 질환 또는 병태는 엘러스-단로스 증후군이고;
    (iv) 상기 타겟 RNA는 BMPR2이고, 질환 또는 병태는 주버트 증후군이고;
    (v) 상기 타겟 RNA는 FANCC이고, 질환 또는 병태는 판코니 빈혈증이고;
    (vi) 상기 타겟 RNA는 MYBPC3이고, 질환 또는 병태는 원발성 가족성 비대 심근병증이고; 또는
    (vii) 상기 타겟 RNA는 IL2RG이고, 질환 또는 병태는 X-연관성 중증 복합 면역부전증인, 방법.
  28. 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하는 타겟 RNA를 편집하기 위한 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)로서, 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 또한 상기 dRNA는 원형이거나 원형 RNA를 형성할 수 있는, dRNA.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 dRNA는 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열을 추가로 포함하고, 선택적으로
    (i) 상기 3' 결찰 서열과 5' 결찰 서열은 적어도 부분적으로 서로 상보적이고; 및/또는
    (ii) 상기 3' 결찰 서열 및 5' 결찰 서열은 약 20 내지 약 75개의 뉴클레오티드 길이인, dRNA.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
    상기 dRNA는 원형 RNA인, dRNA.
  31. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
    상기 dRNA는 원형 RNA를 형성할 수 있는 선형 RNA인, dRNA.
  32. 제 28 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 기재된 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 dRNA를 인코딩하는 핵산의 3' 말단에 연결된 3' 트위스터 리보자임 서열 및 상기 dRNA를 인코딩하는 핵산의 5' 말단에 연결된 5' 트위스터 리보자임 서열을 추가로 포함하는 구축물로서, 선택적으로
    (i) 상기 3' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 상기 5' 트위스터 서열은 트위스터 P1이고; 또는
    (ii) 상기 5' 트위스터 서열은 트위스터 P3 U2A이고, 상기 3' 트위스터 서열은 트위스터 P1인 구축물.
  34. 타겟 RNA를 편집하기 위한 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)로서,
    (1) 상기 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열, 및
    (2) 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 및/또는 5' 말단에 있는 소핵소체 RNA(snoRNA) 서열을 포함하고, 또한
    상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있는, dRNA.
  35. 제 34 항에 있어서,
    (i) 상기 dRNA는 상기 타겟팅 RNA 서열의 5' 말단에 연결된 snoRNA 서열("5' snoRNA 서열")을 포함하고;
    (ii) 상기 dRNA는 상기 타겟팅 RNA 서열의 3' 말단에 연결된 snoRNA 서열("3' snoRNA 서열")을 포함하고;
    (iii) 상기 snoRNA 서열은 적어도 약 70개의 뉴클레오티드 길이이고;
    (iv) 상기 3' snoRNA 서열은 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 포함하고;
    (v) 상기 5' snoRNA 서열은 SEQ ID NO: 2의 핵산 서열을 포함하고; 및/또는
    (vi) 상기 snoRNA 서열은 C/D 박스 snoRNA 서열, H/ACA 박스 snoRNA 서열, 복합 C/D 박스 및 H/ACA 박스 snoRNA 서열, 또는 고아 snoRNA 서열인, dRNA.
  36. 제 34 항 또는 제 35 항에 기재된 dRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물.
  37. 제 32 항, 제 33 항 또는 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하고, 상기 프로모터는 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")인 구축물.
  38. 숙주 세포에 탈아미노효소-리크루팅 RNA(dRNA)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 구축물로서,
    (1) 상기 dRNA는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 타겟팅 RNA 서열을 포함하고,
    (2) 상기 dRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 또한
    (3) 상기 구축물은 dRNA를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 폴리머라아제 II 프로모터("Pol II 프로모터")를 포함하는 구축물.
  39. 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서,
    상기 Pol II 프로모터는 CMV 프로모터이고, 선택적으로 상기 CMV 프로모터는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열을 포함하는 구축물.
  40. 제 32 항, 제 33 항 및 제 36 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 구축물은 바이러스 벡터 또는 플라스미드이고, 선택적으로 상기 구축물은 AAV 벡터인 구축물.
  41. 제 28 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 타겟 RNA는 프리메신저 RNA, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 트랜스퍼 RNA, 긴 비코딩 RNA 및 소형 RNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 RNA인 구축물 또는 dRNA.
  42. 제 28 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 기재된 구축물 또는 dRNA를 포함하는 숙주 세포.
  43. 제 28 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 기재된 구축물 또는 dRNA를 포함하는 숙주 세포에서 타겟 RNA를 편집하기 위한 키트.
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