JP2022537477A - 機能的エレメントの同定方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ゲノム配列の機能的エレメントを同定するための方法、およびゲノム配列の機能的エレメントを同定するために使用されるライブラリーを提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、標的ゲノム領域または標的タンパク質の機能的エレメントを同定するための方法に関する。具体的には、本発明は、それらの自然生物学的背景におけるその機能に重要な要素を同定するためのハイスループット戦略に関する。
ＲＮＡ誘導したＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９ヌクレアーゼ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）は、二重鎖断裂（ＤＳＢ）を生成することにより、標的ゲノムの遺伝子座にｉｎｄｅｌ（挿入または欠失）と部位特異的突然変異を導入し、それにより内部修復メカニズム、特に非同源末端接続（ＮＨＥＪ）を活性化する（１，２）。突然変異誘発は、特にリーディングフレームの転位は、遺伝子表現を完全に排除することができ、これによりＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムをゲノム工学（３，４）、さらにはハイスループット機能スクリーニング（５－８）のための強力なツールとなる。高分解能で調節的エレメントまたはタンパク質コード配列の役割をよりよく理解するために、関連する生物学的アッセイにおいて、ＣＲＩＳＰＲによる飽和突然変異誘発は使用されている（９，１０）。これらの試みはｓｇＲＮＡ コード領域からの間接的シークエンシングデータのみを収集したため、塩基識別の分解能には限界があった。さらに、特に目的タンパク質が細胞の活性に不必要である場合、この戦略を使用して完全な機能ドメインまたは重要なアミノ酸情報を取得することは不可能である。伝統的な方法は、主に共免疫沈殿（Ｃｏ－ＩＰ）とトランケーション突然変異誘発（１１）の組み合わせなどの体外生化学的測定が主であったが、これらの技術は、時間がかかり、労力がかかり、分解能が低く、いずれも天然の生物学的環境で不可能であることは言うまでもない。したがって、当技術分野では、目的タンパク質またはゲノム配列の機能的エレメントを同定するために、より正確で包括的な戦略および方法が強く求められている。
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本発明は、ＣＲＩＳＰＲ増強飽和突然変異誘発および分類ＤＮＡ断片シークエンシングとの結合法と呼ばれ、目的ゲノム領域または目的タンパク質の機能的エレメントを同定するためのハイスループット戦略および方法を提供することによって、前述のニーズの少なくともいくつかを満たす戦略または方法である（ＣＲＩＳＰＲ－Ｅｍｐｏｗｅｒｅｄ Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ａｓｓｏｒｔｅｄ－ＤＮＡ－ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＣＲＥＳＭＡＳ）。具体的には、本発明は飽和突然変異誘発を適用し、表現型変化を引き起こすインフレーム突然変異（インフレーム欠失およびミスセンス部位特異的突然変異）のみを検索し、標的遺伝子の重要度にかかわらず、ゲノム領域またはタンパク質の機能に関連するキーサイトを同定する。
このアプローチを使用して、本発明者らは、六種のタンパク質、三種の細菌毒素受容体および三種のがん薬物ターゲットをマッピングし、既知のドメインまたはサイトおよび薬物または毒素敏感性に重要な役割を果たす新しいアミノ酸を含む単一アミノ酸分解能でそれらの統合機能図を取得した。さらに、この新規なアプローチは、重要な残基の包括かつ正確な単アミノ酸置換パターンを明らかにし、タンパク質の機能を除去したり、薬剤耐性を与えることができる。拡張可能なＣＲＥＳＭＡＳ戦略は極めて高い精度と高効率を有し、高分解能で複数のタンパク質の配列－機能マッピングを行うことができ、且つタンパク質機能と薬剤耐性のメカニズムの研究を加速する可能性がある。
一態様では、本発明は、目的タンパク質の機能的エレメントを同定する方法に関し、当該方法は、各アミノ酸をカバーする複数の突然変異を提供するためにＣＲＩＳＰＲシステムを用いる飽和誘変を行うこと、機能喪失表現型を引き起こすインフレーム突然変異の検索すること、シークエンシング分析するためにＰＣＲがｓｇＲＮＡコード領域および標的遺伝子のｃＤＮＡを増幅すること、および目的タンパク質に必要なアミノ酸を同定するためにシーケンシングデータを分析のための計算プロセスを確立することを含む。一実施形態では、目的タンパク質の機能的エレメントの同定は、単アミノ酸分解能で行われる。一実施形態では、目的タンパク質の機能的エレメントは、その天然の生物学的背景において同定される。一実施形態では、インフレーム突然変異は、インフレーム欠失およびミスセンス部位特異的突然変異である。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いることによる飽和変異誘発は、目的タンパク質の全長にわたる各アミノ酸のｓｇＲＮＡ を設計することを含む。一実施形態では、各ｓｇＲＮＡはＤＳＢサイトの周囲約１０ｂｐ、例えば、７～１３ｂｐ、例えば、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、１１ｂｐ、および１２ｂｐに影響を及ぼすように設計される。一実施形態では、インフレーム欠失は、“運転者の欠失”（単一のアミノ酸欠失のみを含む）または“乗客の欠失”（複数のアミノ酸欠失を含む）などの運転者の欠失を含む。
一実施形態では、計算プロセスは以下を含む：
公開されているバイオインフォマティクスツールを使用して、標的遺伝子の参照配列にシークエンシングリードをマッピングし、前記バイオインフォマティクスツールは、例えば、Ｂｏｗｔｉｅ２ ２．３．２およびＳＡＭｔｏｏｌｓ １．３．１。
リードをフィルターし、ミスセンス突然変異またはインフレーム欠失などを保持する。
ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異比率を以下のように計算する：
公開されているバイオインフォマティクスツールを使用して、標的遺伝子の参照配列にシークエンシングリードをマッピングし、前記バイオインフォマティクスツールは、例えば、Ｂｏｗｔｉｅ２ ２．３．２およびＳＡＭｔｏｏｌｓ １．３．１。
リードをフィルターし、ミスセンス突然変異またはインフレーム欠失などを保持する。
ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異比率を以下のように計算する：
インフレーム欠失を含む断片について、各アミノ酸の欠失比率を以下のように計算する：
インフレーム欠失をコードし、またアミノ酸欠失の数により、単一のアミノ酸欠失のみであれば「運転者の欠失」、複数のアミノ酸欠失であれば「乗客の欠失」としてインフレーム欠失を分類する。
実験群と対照群との間の倍数変化を計算し、
各アミノ酸の必須性スコアを以下のように算出する：
突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各アミノ酸について計算しスコア突然変異＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）、
欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、運転者の欠失と乗客の欠失に次のように重みを付ける：
欠失倍数変化＝運転者の倍数変化＋α＊乗客の倍数変化、続いて、１００回並べ替えてヌル分布を確立し、且つアミノ酸ごとに計算しスコア欠失＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）、
スコア突然変異及びスコア欠失を以下のように正規化する：
実験群と対照群との間の倍数変化を計算し、
各アミノ酸の必須性スコアを以下のように算出する：
突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各アミノ酸について計算しスコア突然変異＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）、
欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、運転者の欠失と乗客の欠失に次のように重みを付ける：
欠失倍数変化＝運転者の倍数変化＋α＊乗客の倍数変化、続いて、１００回並べ替えてヌル分布を確立し、且つアミノ酸ごとに計算しスコア欠失＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）、
スコア突然変異及びスコア欠失を以下のように正規化する：
スコア突然変異及びスコア欠失の重みを計算する：
ａ ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ａ ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
必須性スコアの計算は以下のとおりである：
必須性スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ ＋ ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
必須性スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ ＋ ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
一実施形態では、本方法は、必須スコアに従ってアミノ酸の機能的重要度に基づいてアミノ酸をランク付けすることをさらに含む。
一態様では、本発明は一種類のライブラリーに関し、複数のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡを含むゲノム配列の機能的エレメントを同定するためにＣＲＥＳＭＡＳに用いられ、前記ガイドＲＮＡが、１００個以上のゲノム配列を標的とし、前記ゲノム配列には、連続ゲノム領域の１０００塩基対ごとにＰＡＭ配列の上流にある非重複切断部位が含むゲノム配列の機能的エレメント同定するためのライブラリーである。
一実施形態では、ライブラリー内の各ＲＮＡはＤＳＢサイトの周囲約１０ｂｐ、例えば、７～１３ｂｐ、例えば、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、１１ｂｐ、および１２ｂｐに影響を及ぼすように設計される。一実施形態では、ライブラリーは連続するゲノム領域内の各ＰＡＭ配列の上流のゲノム配列を標的とするガイドＲＮＡ を含む。一実施形態では、ＰＡＭ配列は、少なくとも一種類のＣａｓタンパク質に特異的である。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのガイドＲＮＡは、少なくとも１つのＣａｓタンパク質の特異性が複数のＰＡＭ配列より多いことを基づいて選択される一実施形態では、前記目的遺伝子の表現は、前記複数のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡの中の少なくとも一つのガイドＲＮＡの前記標的化とすることによって変化される。一実施形態では、前記ライブラリーは細胞集団、好ましく、真核細胞集団に導入される。一実施形態では、前記標的化は連続ゲノム領域のＮＨＥＪを引き起こす。一実施形態では、標的化は１００以上の配列、例えば、約１，０００以上の配列、約１００，０００以上の配列に対するものである。
一実施形態では、標的化は、細胞集団中の各細胞に一つまたは複数のベクターを導入するベクターシステムを含み、前記ベクターシステムは、操作された非天然のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム含み、それは：
Ｉ．Ｃａｂタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、調節的エレメントに作動可能に接続され、
ＩＩ． ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ、
そのうち成分ＩおよびＩＩが同じまたは異なるベクター内にあり、そこに転写されたガイド配列を含むガイドＲＮＡが、ｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓシステムと連続するゲノム領域内の標的配列の配列に特異的に結合するようにガイドし、これにより、Ｃａｓタンパク質が連続するゲノム領域を切断するように誘導する。
Ｉ．Ｃａｂタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、調節的エレメントに作動可能に接続され、
ＩＩ． ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ、
そのうち成分ＩおよびＩＩが同じまたは異なるベクター内にあり、そこに転写されたガイド配列を含むガイドＲＮＡが、ｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓシステムと連続するゲノム領域内の標的配列の配列に特異的に結合するようにガイドし、これにより、Ｃａｓタンパク質が連続するゲノム領域を切断するように誘導する。
一実施形態では、一つ以上のベクターはプラスミドベクターである。調節的エレメントは、誘導性プロモーターであり、好ましくは、誘導性プロモーターはドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）誘導性プロモーターである。
一態様では、本発明はＣＲＥＳＭＡＳ方法に関し、それは以下を含む：
（ａ） 前記請求項のいずれか１項に記載のライブラリーを、各細胞が１つ以下のガイドＲＮＡを含む少なくとも１つのＣａｓタンパクを含む細胞集団に改造するように導入すること；
（ｂ） 細胞表現型の変化に基づいて細胞を少なくとも二組に選別する；
（ｃ） 各グループにガイドＲＮＡ の相対的な表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を存在し、それによって各グループに存在するガイドＲＮＡの表現によって前記細胞表現型の変化に関連するゲノム部位を決定する；
（ｄ） シークエンシングのために、標的遺伝子の１つまたは複数のｃＤＮＡまたはＤＮＡ配列を増幅する；
（ｅ） シークエンシングリードを標的遺伝子の参照配列にマッピングする；
（ｆ） リードをフィルターし、ミスセンス突然変異またはインフレームに欠失したリードのみを保持する；および
（ｇ） バイオインフォマティクスプロセスを適用することにより、細胞の表現型に対する各アミノ酸またはヌクレオチドの重みが決定される。
（ａ） 前記請求項のいずれか１項に記載のライブラリーを、各細胞が１つ以下のガイドＲＮＡを含む少なくとも１つのＣａｓタンパクを含む細胞集団に改造するように導入すること；
（ｂ） 細胞表現型の変化に基づいて細胞を少なくとも二組に選別する；
（ｃ） 各グループにガイドＲＮＡ の相対的な表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を存在し、それによって各グループに存在するガイドＲＮＡの表現によって前記細胞表現型の変化に関連するゲノム部位を決定する；
（ｄ） シークエンシングのために、標的遺伝子の１つまたは複数のｃＤＮＡまたはＤＮＡ配列を増幅する；
（ｅ） シークエンシングリードを標的遺伝子の参照配列にマッピングする；
（ｆ） リードをフィルターし、ミスセンス突然変異またはインフレームに欠失したリードのみを保持する；および
（ｇ） バイオインフォマティクスプロセスを適用することにより、細胞の表現型に対する各アミノ酸またはヌクレオチドの重みが決定される。
一実施プロモーターまたはエンハンサー形態では、細胞表現型の変化は、目的遺伝子の転写および／または表現の増加または減少である。一実施形態では、細胞を高発現グループと低発現グループに分類される。一実施形態では、細胞表現型の変化は、機能喪失または機能獲得を含む。一実施形態では、当方法は、単一のアミノ酸分解能で目的タンパク質の機能的エレメントを同定するために使用される。
一実施形態では、上記の方法はノンコーディングＲＮＡ、プロモーターまたはエンハンサーの機能マップを同定するために用いられる。形態では、唯一の変更は、目的タンパク質の機能的エレメントが同定される場合、ｃＤＮＡの代わりにゲノム上の標的領域のＰＣＲ増幅を実行する。
一態様では、本発明は化合物に対する耐性に関連する機能的エレメントをスクリーニングする方法に関し、それは以下を含む：
（ａ） 上記ライブラリーのいずれかを、Ｃａｓタンパク質を含むように改造された細胞集団に導入し、ここで、該細胞集団の各細胞は１つ以下のガイドＲＮＡを含む；
（ｂ） 化合物による細胞集団を処理する；及び
（ｃ） 処理前と比較して、前記化合物で処理した後のガイドＲＮＡの表現（Ｔｅｒｍａｎｅｎｔ）を決定することにより、指示ＲＮＡをリッチにすることにより、前記化合物に対する耐性に関連するゲノム部位を特定する；
（ｄ） シークエンシングのために、標的遺伝子の１つまたは複数のｃＤＮＡまたはＤＮＡ配列を増幅する；
（ｅ） シークエンシングリードを標的遺伝子の参照配列にマッピングする；
（ｆ） リードをフィルターし、ミスセンス突然変異またはインフレームに欠失したリードのみを保持する；および
（ｇ） バイオインフォマティクスプロセスを適用することにより、化合物に対する各アミノ酸またはヌクレオチドの抵抗性の重み付けを決定される。
ある実施形態では、バイオインフォマティクスプロセスは以下を含む：
（ｈ） ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異比率を以下のように計算する：
（ａ） 上記ライブラリーのいずれかを、Ｃａｓタンパク質を含むように改造された細胞集団に導入し、ここで、該細胞集団の各細胞は１つ以下のガイドＲＮＡを含む；
（ｂ） 化合物による細胞集団を処理する；及び
（ｃ） 処理前と比較して、前記化合物で処理した後のガイドＲＮＡの表現（Ｔｅｒｍａｎｅｎｔ）を決定することにより、指示ＲＮＡをリッチにすることにより、前記化合物に対する耐性に関連するゲノム部位を特定する；
（ｄ） シークエンシングのために、標的遺伝子の１つまたは複数のｃＤＮＡまたはＤＮＡ配列を増幅する；
（ｅ） シークエンシングリードを標的遺伝子の参照配列にマッピングする；
（ｆ） リードをフィルターし、ミスセンス突然変異またはインフレームに欠失したリードのみを保持する；および
（ｇ） バイオインフォマティクスプロセスを適用することにより、化合物に対する各アミノ酸またはヌクレオチドの抵抗性の重み付けを決定される。
ある実施形態では、バイオインフォマティクスプロセスは以下を含む：
（ｈ） ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異比率を以下のように計算する：
（ｉ）インフレーム欠失を含む断片について、各アミノ酸の欠失比率を以下のように計算する：
（ｊ） インフレーム欠失をコードし、またアミノ酸欠失の数により、単一のアミノ酸欠失のみであれば「運転者の欠失」、複数のアミノ酸欠失であれば「乗客の欠失」としてインフレーム欠失を分類する。
（ｋ） 実験群と対照群との間の倍数変化を計算し、
（ｌ） 各アミノ酸の必須性スコアを以下のように算出する：
（１） 突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各アミノ酸について計算しスコア突然変異＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）、
（２） 欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、運転者の欠失と乗客の欠失に次のように重みを付ける：
欠失倍数変化＝運転者の倍数変化＋α＊乗客の倍数変化、続いて、１００回並べ替えてヌル分布を確立し、且つアミノ酸ごとに計算しスコア欠失＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）、
（３） スコア突然変異及びスコア欠失を以下のように正規化する：
（ｋ） 実験群と対照群との間の倍数変化を計算し、
（ｌ） 各アミノ酸の必須性スコアを以下のように算出する：
（１） 突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各アミノ酸について計算しスコア突然変異＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）、
（２） 欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、運転者の欠失と乗客の欠失に次のように重みを付ける：
欠失倍数変化＝運転者の倍数変化＋α＊乗客の倍数変化、続いて、１００回並べ替えてヌル分布を確立し、且つアミノ酸ごとに計算しスコア欠失＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）、
（３） スコア突然変異及びスコア欠失を以下のように正規化する：
（４） スコア突然変異及びスコア欠失の重みを計算する：
ａ ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ａ ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
（５） 必須性スコアの計算は以下のとおりである：
必須スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ＋ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
本明細書の方法では、化合物は、真核細胞内の１つ以上のゲノム領域またはタンパク質の構造および／または機能に影響を与える任意の化合物であり得る。例えば、それは、本明細書に例示されるように、毒素または薬物であり得る。一部の実施形態では、真核細胞はヒト細胞である。真核細胞はヒト細胞である。
必須スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ＋ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
本明細書の方法では、化合物は、真核細胞内の１つ以上のゲノム領域またはタンパク質の構造および／または機能に影響を与える任意の化合物であり得る。例えば、それは、本明細書に例示されるように、毒素または薬物であり得る。一部の実施形態では、真核細胞はヒト細胞である。真核細胞はヒト細胞である。
一態様では、本発明は、目的タンパク質の機能的要素を同定するための方法であり、当該方法は、細胞集団に導入されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いてタンパク質をコードするゲノム遺伝子を破壊することによる目的タンパク質の飽和突然変異誘発を行い、ＤＮＡシークエンシングの決定による表現型変化に関する破壊されたゲノム部位を決定し、標的遺伝子のｃＤＮＡをシークエンシングし、表現型の変化を引き起こすインフレーム突然変異を検索すること、および単一のアミノ酸分解能で目的タンパク質の機能的エレメントを同定するためのバイオインフォマティクスプロセスを確立し、シークエンシングデータを分析することを含む。この方法では、目的のタンパク質の機能的エレメントは、その天然の生物学的背景において同定される。
この方法において、インフレーム突然変異が、インフレーム欠失及びミスセンス特異的突然変異である。一部の実施形態では、破壊は細胞集団内の各細胞に一つ又は複数のベクターのベクターシステムを導入することを含み、前記ベクターシステムが、操作された非天然のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含み、それは以下を含む：
Ｉ．Ｃａｂタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、調節的エレメントに作動可能に接続され、および。
ＩＩ．標的タンパク質をコードするゲノム遺伝子のガイドＲＮＡ、
Ｉ．Ｃａｂタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、調節的エレメントに作動可能に接続され、および。
ＩＩ．標的タンパク質をコードするゲノム遺伝子のガイドＲＮＡ、
成分ＩとＩＩは同じまたは異なるベクター上にあり、それらが転写されると、ガイド配列を含むガイドＲＮＡがｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓシステムとゲノム遺伝子の標的配列とは特異的に結合するように指示し、Ｃａｓタンパク質によるゲノム領域の切断を誘導する。
一実施形態では、一つ以上のベクターはプラスミドベクターである。一実施形態では、調節的エレメントは誘導性プロモーターである。一実施形態では、ゲノム遺伝子内の１０００塩基対ごとに、ガイドＲＮＡはＰＡＭ配列の上流に重複しない切断サイトを含む少なくとも１００のゲノム配列を標的とする。一実施形態では、各ガイドＲＮＡ は、ＤＳＢ サイトの周囲約１０ｂｐ（例えば、７～１３ｂｐ、例えば、８、９、１０、１１、１２ｂｐ）に影響を及ぼすように設計される。一実施形態では、前記ライブラリーは、ゲノム遺伝子内の各ＰＡＭ配列の上流にあるゲノム配列を標的とするガイドＲＮＡが含まれる。一実施形態では、ＰＡＭ配列は、少なくとも一種類のＣａｓタンパク質に特異的である。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのガイドＲＮＡは、少なくとも１つのＣａｓタンパク質の特異性が複数のＰＡＭ配列より多いことを基づいて選択される一実施形態では、前記目的遺伝子の表現は、前記複数のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡの中の少なくとも一つのガイドＲＮＡの前記標的化とすることによって変化される。一実施形態では、前記標的化はゲノム遺伝子のＮＨＥＪを引き起こす。
一態様では、本発明は、例えば本発明のいずれかの方法により、タンパク質のゲノム遺伝子の機能に重要なゲノム部位またはアミノ酸サイトとして同定された機能的エレメントを突然変異させることにより遺伝子またはタンパク質を修飾する方法に関する。該方法によってタンパク質の機能に重要であると同定されたアミノ酸サイトにおいてアミノ酸置換および／または欠失を有する変異体タンパク質も検討される。
本明細書に記載される方法およびツールは、ゲノム編集に関心があり得る関連する機能単位の同定を可能にするために、ゲノム領域の体系的な調査に関する。したがって、一態様では、本発明は、ゲノム領域を調査する方法を提供し、該方法は、ディープスキャニング突然変異誘発ライブラリーを生成することおよびライブラリーを導入することによって変更された細胞集団の表現型の変化について調査することを含む。
したがって、本発明の一態様は、複数のｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓシステムガイドＲＮＡを含むことができ、少なくとも１つの連続するゲノム領域内でゲノム配列を標的化することができるガイド配列を含むことができるディープスキャン突然変異誘導ライブラリーを含む。より具体的には、ライブラリーのガイドＲＮＡ は、ゲノム領域内の代表的な数のゲノム配列を標的とすべきであると想定される。例えば、ガイドＲＮＡ は、想定されるゲノム領域内の少なくとも５０個、より具体的には少なくとも１００個のゲノム配列を標的とすべきである。
ゲノム領域を標的とする能力は、ＰＡＭ （前間隔配列隣接基底系列）の存在によって決定される；すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列である。ＰＡＭの正確な配列および長さの要件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素によって異なるが、ＰＡＭは通常、前間隔配列（すなわち、標的配列）に隣接する２～５塩基対の配列である。当技術分野で既知のＰＡＭ 配列であり、且つ当業者は所与のＣＲＩＳＰＲ酵素に対するＰＡＭ配列を同定することができる。具体的な実施形態では、ＰＡＭ 配列は、少なくとも一つのＣａｓ タンパク質に特異的であるように選択され得る。代替実施形態では、ガイダンス配列ＲＮＡは、少なくとも１つのＣａｓタンパク質に特異的な複数のＰＡＭ配列に基づいて選択され得る。
具体的な実施形態では、ライブラリーは、ゲノム領域内のＰＡＭ配列１０００塩基対毎の上流の非重複切断部位を含む少なくとも１００のゲノム配列を含む。具体的な実施形態では、ライブラリーは連続するゲノム領域内の各ＰＡＭ 配列の上流のゲノム配列を標的とするガイドＲＮＡ を含む。
該ライブラリーには、生物体目的のゲノム領域を標的とするガイドＲＮＡ を含む。本発明のいくつかの実施形態において、生物または対象は、真核生物（ヒトを含む哺乳動物を含む）または非ヒト真核生物または非ヒト動物または非ヒト哺乳動物である。一部の実施形態では、生物体または対象は非ヒト動物であり、節足動物、例えば昆虫であってもよいし、線虫であってもよい。本発明のいくつかの方法において、生物または対象は植物である。本発明のいくつかの方法において、生物または対象は、哺乳動物、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物は、例えば、齧歯動物（好ましくは、マウスまたはラット）、有蹄類動物、または霊長類動物であり得る。本発明のいくつかの方法において、生物または対象は、微細藻類を含む藻類または真菌である。
本明細書で提供される方法およびツールは、連続ゲノム領域を調べるのに特に有利である。そのような連続的なゲノム領域はゲノム全体までを含むことができるが、特に有利なのは、ゲノムの機能的エレメントが調査される方法であり、これは通常、ゲノムＤＮＡの５０～１００ｋｂの領域などの限られた領域をカバーする。特定の目的は、コードゲノム領域の調査にこの方法の使用することである。当業者であれば、本発明の方法を使用して、例えば、目的遺伝子のコード領域の５’および３’領域のような非コードゲノム領域を問い合わせることができ、これは、目的のタンパク質を問い合わせた場合のｃＤＮＡではなく、プランを改変することによってゲノム上の標的領域にＰＣＲ増幅可能であることが理解できる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、連続する目的のゲノム領域内の複数の配列を特異的に標的化するために本発明で使用することができる。前記標的化は通常、工学的に非自然的に存在するｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓシステムを含む１つまたは複数のベクターのベクターシステムを細胞グループの各細胞に導入することを含み、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、少なくとも１種類のＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡを含む。これらの方法では、Ｃａｓ タンパク質とガイドＲＮＡ はシステムの同じまたは異なるベクターに配置し、各細胞に統合されることができ、したがって、各ガイド配列は、細胞グループの各細胞における連続するゲノム領域内の配列を標的とする。より具体的に細胞集団の細胞で表現するプロモーターに適した細胞内での表現を保証するために、Ｃａｓタンパク質は調節的エレメントと動作可能に接続されている。具体の実施形態では、プロモーターは、ドキシサイクリン誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターである。細胞集団の細胞で転写されると、ガイド配列を含むガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをガイドし、連続ゲノム領域の標的配列と配列特異的に結合する。一般に、ｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓシステムの結合は、Ｃａｓタンパク質による連続ゲノム領域の切断を誘導する。
本出願は、表現型の変化に関連する機能的エレメントをスクリーニングする方法を提供する。表現型の変化は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質および／または細胞機能レベルを含む一つまたは複数のレベルで検出することができる。表現型の変化は、細胞の生存、成長、免疫応答、毒素や薬物などの化合物に対する耐性において検出することができる。
表現型の変化に関連するゲノム部位をスクリーニングする方法は、本明細書で企図される目的のゲノム領域を標的とするガイドＲＮＡ のライブラリーを細胞集団に導入することを含む。一般に、前記細胞はＣａｓ タンパク質を含むように改造される。しかしながら、具体の実施形態では、Ｃａｓ タンパク質はまた、ガイドＲＮＡ と同時に導入することができる。本明細書で企図される方法において、細胞集団にライブラリーを導入して、コロニーの各細胞が一つのガイドＲＮＡを含まないようにする。その後、細胞は通常、観察された表現型に基づいて選別され、それらが細胞において表現型の変化を引き起こすか否かに基づいて、表現型の変化に関連するゲノム部位が同定される。一般的に、この方法では、表現型に基づいて細胞を少なくとも２つのグループに分類し、各グループに存在するガイドＲＮＡの相対的な表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を決定し、かつ表現型の変化に関連するゲノム部位を各グループに存在する指導ＲＮＡの表現によって決定される。
本出願では、化合物に対する耐性に関連するゲノム部位をスクリーニングする方法も提供し、これにより、細胞が化合物と接触し、化合物に対する表現型応答に基づいてスクリーニングされる。より具体的には、このような方法は、本明細書で企図されるＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムガイドＲＮＡのライブラリを細胞集団（Ｃａｓタンパク質を含むように改造された、または同時に導入された）に導入し、この化合物で細胞集団を処理すること；また、初期の時点と比較して後の時点での化合物による処置後したガイドＲＮＡ の表現を決定する。これらの方法では、化合物耐性に関連するゲノム部位は、濃縮されたガイドＲＮＡ によって決定される。
具体の実施形態では、この方法は、ゲノム部位を含む領域のシークエンシングまたは全ゲノムのシークエンシングをさらに含み得る。
本出願はまた、本発明の方法を使用して薬剤耐性に関連する機能的エレメントをスクリーニングする方法に関する。
本明細書に記載される他の実施形態は、本明細書に開示される方法によって同定された遺伝子の一つまたは複数の機能的領域のゲノム破壊のための治療方法およびツールに関する。本明細書に記載のこれらおよびさらなる実施形態は、ゲノム領域または目的タンパク質における機能領域の部分的の発見に基づく。
本明細書に例示された具体の方法では、カバー密度を最大化するために、２つのタイプの前間区領域シーケンスはモチーフ（ＰＡＭ）に隣接しており、ＮＧＧおよびＮＡＧは共にｓｇＲＮＡの設計に含まれる。抗がん剤または毒素を用いたライブラリースクリーニングの後、ゲノムＤＮＡを抽出してｓｇＲＮＡバーコードの従来のＰＣＲ増幅に用い、続いてＮＧＳ分析を行う。同時に、ＲＮＡ 逆転写からの標的遺伝子のＰＣＲ増幅を行い、長さ約２５０ｂｐの断片化されたＰＣＲ産物がＮＧＳを受ける。次に、野生型配列、またはアウトフレー挿入欠落の断片やインフレーム挿入の配列を含む配列をフィルターし、部位特異的突然変異またはインフレーム欠失を含む配列のみが、さらなる分析のために保持されるようにする。部位特異的突然変異については、本発明者らは、同義またはナンセンス変異をスクリーニングし続け、ミスセンス突然変異を含む突然変異のみを保持した。インフレーム欠失の場合、各リードによって引き起こされたアミノ酸欠失の数によって突然変異タイプを分類し、単アミノ酸欠失のみが含む場合が「運転者の欠失」、複数のアミノ酸欠失を含む場合が「乗客の欠失」として分類した。欠失パターンをデコードした後、欠失倍数変化を計算した。同様に、ミスセンス突然変異の倍数変化も計算した。次に、標的遺伝子にウィンドウのスライドを適用することによって、フィルターされたリードのすべての情報を用いて、ミスセンス突然変異、運転者の欠失、および乗客の欠失の倍数変化の加重平均値を計算した。次に、ランク付けによって加重平均値の有意水準を推定し、各アミノ酸の必須スコアを得た。このスコアは、インフレーム欠失および部位特異的突然変異の状況をカウントし、各アミノ酸の必須性を定量化し、機能的重要度に従ってアミノ酸をランク付けすることを可能にする。同時に、各アミノ酸のミスセンス突然変異のパーセンテージを計算することによってアミノ酸置換パターンの取得を試みた。この単純化されたワークフローおよびバイオインフォマティクスプロセスは、天然の生物学的環境におけるタンパク質の重要な機能的エレメントの同定を可能にすることが目的である。
本発明は、具体の実施形態および特定の図面を参照して説明されるが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。請求項における任意の参照符号は、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。記載される図面は概略的なものに過ぎず、非限定的である。図面において、説明の目的のために、いくつかのエレメントのサイズは誇張され、縮尺通りに描かれていない場合がある。用語「含む」は、本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、他の要素またはステップを排除しない。単数名詞に言及する場合、不定冠詞または定冠詞「一つ（ａ）」または「一種（ａｎ）」、「前記（ｔｈｅ）」を使用し、特に明記しない限り、該名詞の複数形を含む。
特に明記がない限り、本発明の実施は、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム学および組換えＤＮＡの従来の技術を当技術の範囲内で採用する。参照Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ和Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第２版（１９８９）； ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等編集，（１９８７））； ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ。）：ＰＧＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ和Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編集（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ和Ｌａｎｅ編集。（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．ＬＦｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））。
以下の用語または定義の提供は、本発明の理解に役立つ。本明細書で明確に定義されない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の当業者と同じ意味を有する。業者は特に本分野の定義および用語のＳａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：に注目する；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）； およびＡｕｓｕｂｅｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７） ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９９）。
遺伝学において、「ナンセンス突然変異」とはＤＮＡ配列の部位特異的突然変異であり、早すぎる終止コドン、または転写されたｍＲＮＡのナンセンスコドン、および切断された、不完全な、通常は非機能的タンパク質産物を招く。ナンセンス突然変異の機能的効果は、コードＤＮＡ 中の終止コドンの位置次第である。例えば、ナンセンス突然変異の役割は、ナンセンス突然変異がどの程度元の終止コドンに接近し、およびタンパク質の機能的サブドメインが影響を受ける程度に依存する。ナンセンス突然変異は、単一のヌクレオチドの変化が異なるアミノ酸置換を引き起こす部位特異的突然変異である「ミスセンス突然変異」とは異なる。
遺伝学において、「ナンセンス突然変異」とはＤＮＡ配列の部位特異的突然変異であり、早すぎる終止コドン、または転写されたｍＲＮＡのナンセンスコドン、および切断された、不完全な、通常は非機能的タンパク質産物を招く。ナンセンス突然変異の機能的効果は、コードＤＮＡ 中の終止コドンの位置次第である。例えば、ナンセンス突然変異の役割は、ナンセンス突然変異がどの程度元の終止コドンに接近し、およびタンパク質の機能的サブドメインが影響を受ける程度に依存する。ナンセンス突然変異は、単一のヌクレオチドの変化が異なるアミノ酸置換を引き起こす部位特異的突然変異である「ミスセンス突然変異」とは異なる。
「同義置換または突然変異」とは、タンパク質をコードする遺伝子のエクソンにおける一つの塩基の別の塩基に進化的置換であり、その結果、生成されたアミノ酸配列は修飾されていない。これが可能なのは、遺伝暗号が「縮重」しているため可能であり、これは一部のアミノ酸は複数の３塩基対コドンによってコードされていることを意味する。特定のアミノ酸の一部のコドンは、同じアミノ酸をコードする他のコドンとは一つの塩基対しか異なるものがあるので、「通常」塩基突然変異の代わりに一つの代替物を用いると、遺伝子を翻訳する際、同じアミノ酸が成長中のポリペプチド鎖に混ぜてしまうことを招く。
タンパク質は、あってもなくてもよい領と必須領域の両方が含まれ、必須領域の突然変異がその機能を失う。対応するＤＮＡコード配列では、リーディングフレームのシフトを引き起こす突然変異は、突然変異が重要なサイトで発生するか非重要なサイトで発生するかに関係なく、遺伝子表現を破壊によってその機能を破壊する高い可能性がある。抗がん剤または細菌毒素のタンパク質をターゲットした場合、インフレーム欠失または部位特異的突然変異（ナンセンス突然変異を除く）は、そのような突然変異が非重要なサイトで発生した場合、耐性表現型を生成しない。非必須遺伝子について、各対立遺伝子の破壊は「機能喪失表現型」を実現するために必要な条件である。これらの劣性突然変異タイプは以下のうちの１つである可能性がある：フレームシフト挿入欠失、インフレーム欠失、またはキーサイトに影響を及ぼすミスセンス部位特異的突然変異。必須遺伝子について、唯一の薬剤耐性シナリオは、タンパク質の表現と細胞活性に対する重要な役割を変更することなく、インフレーム欠失またはミスセンス突然変異が薬物標的のキーサイトに影響を与える。これらの突然変異は優性であるため、「機能獲得表現型」を達成するには、１つの対立遺伝子の適切な突然変異で十分である。
野生型二倍体細胞において、遺伝子を有する二つの野生型対立遺伝子は、いずれも正常な遺伝子産物を生じる。ヘテロ接合体（優性または劣性の重要な遺伝子型をテストする）において、単一の野生型対立遺伝子は、野生型表現型を生じるのに十分な正常遺伝子産物を提供することができる。そのような場合、“機能喪失型突然変異”は劣性である。ある場合によっては、細胞は単一の野生型対立遺伝子の活性レベルを「上げる」ことができ、ヘテロ接合子における野生型遺伝子産物の総量がホモ接合の野生型の半分を超える。しかしながら、突然変異事象は、該遺伝子にいくつかの新しい機能を付与する。ヘテロ接合体では、新しい機能が表現されるので、「機能獲得型突然変異」は優性対立遺伝子のように作用し、何らかの新たな表現型を生成する可能性が高い。
「飽和突然変異誘発」は、単一のコドンまたはコドンセットをランダム化して、その位置に全ての可能なアミノ酸を生成するランダムな突然変異誘発技術である。
「コドン」は三つのヌクレオチドのセットであり、あるアミノ酸をコードするトリプレットである。最初のコドンがリーディングフレームを確立し、新しいコドンが始まる。タンパク質のアミノ酸主鎖配列は連続するトリプレットで定義される。コドンは、タンパク質合成のための遺伝情報の翻訳する鍵である。ｍＲＮＡ の翻訳が開始されると、「リーディングフレーム」を設定し、トリプレットが次々と読み取られる間に「リーディングフレーム」を維持する。遺伝子コードの読み取りは、ｍＲＮＡのコドンを監視する三つのルールに縛られる。まず、コドンは５’から３’の方向に読み取られる。第二に、コドンは重複せず、かつ情報にギャップはない。上記のように、最後のルールは、情報を「リーディングフレーム」に固定されて翻訳することである。
「フレームシフト突然変異」は、フレームエラーまたはリーディングフレームシフトとも呼ばれ、３で割り切れないＤＮＡ配列のヌクレオチド数のｉｎｄｅｌ（挿入または欠失）によって引き起こされる遺伝突然変異である。コドンの遺伝子発現のトリプレット性質のために、挿入または欠失はリーディングフレームを変更する可能性があり、その結果、本来とはまったく異なる翻訳になってしまう。フレームシフト突然変異は通常、突然変異後にコドンが異なるアミノ酸をコードするように読み取られる。フレームシフト変異はまた、配列内で遭遇する最初の終止コドン（“ＵＡＡ ”、“ＵＧＡ ”または“ＵＡＧ ”）を変化させる。生じるペプチドは異常に短いか異常長い可能性があり、かつ機能しない可能性が高い。
「アウトフレー挿入欠失（Ｏｕｔ－ｏｆ－ｆｒａｍｅ ｉｎｄｅｌ）」は遺伝子コードに「リーディングフレーム」の外側の挿入および／または欠損（ｉｎｄｅｌ）を読み取らせることを指し、「インフレーム欠失」はＤＮＡ配列の中で３で割り切れる数のヌクレオチドの欠失であるため、この欠失はリーディングフレームを変更しない。
本明細書における「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、一般的に、Ｃａｓ 遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト（ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ ）配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムのコンテキストでの「ダイレクトリピート（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ）」とｔｒａｃｒＲＮＡプロセッシングの部分的なダイレクトリピートを含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムのコンテキストでは「間隔配列（ｓｐａｃｅｒ）」とも呼ばれる”）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列およびトランスクリプトを含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の表現に関与したり、またはを活性化を指示するトランスクリプトやその他の要素を指す。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の要素は、タイプＩ、タイプＩＩ、またはタイプＩＩＩ のＣＲＩＳＰＲシステムから得られる。
発現ベクター内で、「動作可能に連結された」とは、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法（例えば、体外転写／翻訳システムにおいて、またはベクターが標的細胞に導入された際に、標的細胞の中におる）で目的の調節配列との接続を示すことが意図される。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成における文脈では、「標的配列」とは、ガイド配列が相互補完的に設計されていることを示す配列であり、標的配列とガイド配列とのハイブリッドがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリッドを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性がある限り、完全な相補性は必要ではない。
一般的に内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリッドするガイドし、一つまたは複数のＣａｓ タンパク質と複合体を形成するガイド配列を含む）による標的序列の中や近く（例えば離れが１個や２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、５０個またはそれ以上の塩基対以内）の１つまたは２つの鎖の切断をもたらす。理論に拘束されることを望まないが、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全部または部分（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５またはそれ以上のヌクレオチド）を含むか、またはこれらから構成されてもよく、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成してもよい、例えば、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ってｔｒａｃｒメイト（ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ）配列の全部または一部とハイブリッドすることによって、前記ｔｒａｃｒメイト配列がガイド配列に作動可能に連結された。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列が十分な相補性を有し、ハイブリッドしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与する。標的配列と同様に、機能を達成するのに十分である限り、完全な相補性は必要とされない。いくつかの実施形態において、最適に整列された場合、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒパートナー配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を有する。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントの表現を駆動する１つ以上のベクターを宿主細胞に導入して、ＣＲＩＳＰＲシステムのエレメントの表現が１つ以上の標的サイトでガイドし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を導く。別の実施形態において、宿主細胞は、Ｃａｓ ９および／またはＯＣＴ １を安定して発現するように工学化される。
一般に、指示配列は、任意のポリヌクレオチド配列であり、それは、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有し、標的配列とハイブリッドし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を指示する。一部の実施形態では、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適なアラインメントを行う場合、指示配列とその対応する標的配列との間の補完性は、約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム，Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｉｍｓｃｈアルゴリズム，Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒに基づいて変換のアルゴリズム（例えばＢｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ），ＣｌｕｓｔａｌＷ， Ｃｌｕｓｔａｉ Ｘ， ＢＬＡＴ， Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ （Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＥＬＡＮＤ （Ｉ！ｆｕｍｍａ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ），ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）。一部の実施形態では、ガイド配列の長さは、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５個またはそれ以上のヌクレオチドより多く。一部の実施形態では、ガイド配列の長さは、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、１１、１０個またはそれ以下のヌクレオチド未満である。ガイド配列は、ＣＲ１ＳＰＲ複合体と標的配列の配列に特異的結合させるガイド能力を任意の適切な測定により評価することができ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムの成分（試験すべきガイド配列を含む）を対応する標的配列を持つ宿主細胞に提供することができ、例えば、以下のように行われる：ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードしたベクター転写を用いて、次に、標的配列内で優先カットの評価を行い、例えば、本明細書で説明するＳｕｒｖｅｙｏｒ測定によって行われる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は以下のように試験管内で評価することができる：標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素が提供され、複合体は、テストすべきガイド配列およびテストガイド配列とは異なるコントロールガイド配列を含み、かつ結合または比較テストとコントロールのガイド配列反応との間の標的配列の切断速度を比較する。他の測定も可能であり、当業者であれば思いつくであろう。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部である（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のドメインより多く）。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、および任意の２つのドメイン間の任意結合配列を含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合できるタンパク質ドメインの例には、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列および以下の活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインがあるがこれに限定されない：メチル化酵素活性、脱メチル化酵素活性、転写活性化活性、転写阻害活性、転写放出因子活性、歴史的修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性。
一部の態様では、本発明は、１つまたは複数のマルチヌクレオチド（例えば、本明細書で説明する１つまたは複数のベクター、１つまたは複数のトランスクリプト、および／またはそこから転写された１つまたは複数のタンパク質）を宿主細胞に送達する方法を提供する。本発明は、ＤＮＡに基づくゲノムを標的修飾するための基本プラットフォームの役割を果たす。ウイルス、リポソーム、電気穿孔、顕微鏡注射、およびコンジュゲーションを含むがこれらに限定されない多くの送達システムと相対することができる。
一部の態様では、本発明はさらに、これらの方法によって生成された細胞、およびそれによって産生される生物（例えば、動物、植物、または真菌）をさらに提供する。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ガイド配列と組み合わせて（かつ選択的にガイド配列と複合する）細胞に送達される。従来のウイルスベースおよび非ウイルスベースの遺伝子転移法は、哺乳動物細胞または標的組織に核酸を導入するために利用可能である。このような方法は、ＣＲＩＳＰＲシステムのコンポーネントをコードする核酸を培養物や宿主生物の細胞に施用するために使用することができる。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターのトランスクリプト）、ヌード核酸、およびリポソームなどの送達ベクターと複合した核酸が含まれる。ウィルス送達システムには、細胞に送達されるエピソーム（ｅｐｉｓｏｍａｌ）または統合ゲノムを持つＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。
ｇＲＮＡの設計が比較的容易であることと、Ｃａｓ９が任意の遺伝子座を実際に修飾する能力により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は本発明においてスクリーニング実験に用いられる。スクリーニング実験では、ＣＲＩＳＰＲが集めたライブラリーまたはＣＲＩＳＰＲライブラリーは、数千個のプラスミドで構成されており、各プラスミドには、標的タンパク質の全長にまたがる異なる標的配列に向けられたｇＲＮＡが含まれる。具体的には、標的タンパク質の飽和突然変異誘発を達成するために、ｓｇＲＮＡは２種類のプレスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、ＮＧＧおよびＮＡＧを含むように設計されており、かつ各ｓｇＲＮＡ はＤＳＢサイトの周囲の１０ｂｐ に影響を与えて、カバー密度を最大にするように設計された。ＣＲＩＳＰＲスクリーニング実験は順遺伝的スクリーニングである可能性があり、この中で望ましい表現型は既知するが、タンパク質のキーとなるアミノ酸は既知しない。一般的に、ＣＲＩＳＰＲに基づくスクリーニングは、レンチウイルスを用いて「プールされた」ｇＲＮＡライブラリーを哺乳類のＣａｓ９表現細胞株に送することによって実行される。ｇＲＮＡライブラリーで形質導入した後、目的表現型（例えば生存、薬物や毒素耐性、成長や増殖）について突然変異細胞をスクリーニングして、タンパク質の機能と望ましい表現型に重要なアミノ酸を同定する。
プールされたレンチウイルスｇＲＮＡ ライブラリーは、レンチウイルス転移するベクターの異種混合物であり、各ベクターは、特定配列に対する単一のｇＲＮＡ をコードし、各配列を標的とするいくつかのｇＲＮＡ がライブラリーに存在する。
プールされたレンチウイルスＣＲＩＳＰＲライブラリーを用いたスクリーニングの実施は、ライブラリー増幅、細胞形質導入、遺伝子スクリーニング、およびデータ分析を含む多段階プロセスである。簡単に言うと、ｇＲＮＡを含むプラスミドの初期ストックを増幅してＤＮＡの総量を増加させ、増幅されたライブラリーを使って個別のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ ＋ Ｃａｓ９を含むレンチウイルスを生成する。単一ベクターライブラリーについては、単一のｇＲＮＡ およびＣａｓ ９を含むレンチウイルスで野生型細胞を形質導入することによって、突然変異細胞を１つのステップで作製した。多くの場合、マルチキャリアライブラリーでは、ｇＲＮＡ文庫を用いてＣａｓを発現させる細胞が伝達される。両方の場合において、形質導入された細胞は、ｇＲＮＡとＣａｓ９を含む細胞を濃縮するために選択され、得られた突然変異細胞集団を目的の特定の表現型についてスクリーニングされた。最終集団からのゲノムＤＮＡの次世代配列決定（ＮＧＳ）は、スクリーニング中に濃縮または消費されたｇＲＮＡを同定する。最後にバイオインフォマティクスプロセスを設計して得られたデータを分析する。
ライブラリ増幅
通常に、プールされたレンチウイルスＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡライブラリーはＤＮＡ等分の試料として送達され、多くの場合、ＤＮＡ の量は実験に使用するには不十分である。このような場合、最初のステップはライブラリーを「増幅」することであり、これは全グループにおける個々のｇＲＮＡプラスミドの相対的な割合を維持しながらプラスミドＤＮＡの量を増やすことを意味する。ライブラリーＤＮＡ を細菌に変換し、細菌の中で一定期間増殖させた後に、プラスミドＤＮＡ を収穫することで増幅する。ほとんどのライブラリーでは、電気穿孔を使用すると転換効率が向上するため、化学転化の代わりに電気穿孔を使用される。多くの場合、転化された細菌は、適切な抗生物質を含むＬＢ 寒天プレート上で増殖し、これは、プレート上での増殖がライブラリーの表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を維持し、増殖中に急速に増殖するプラスミドが濃縮される可能性を低下させるのに役立つためである。転化および増幅されたｇＲＮＡ プラスミドの数の推定値は、希釈プレートアッセイを行うことによって得ることができる。このために、形質転換されたサンプルを希釈し、抗生物質を含むＬＢプレートにプレーティングし、プレート上で生じる細菌コロニーの数を、増幅されたライブラリーに存在するｇＲＮＡプラスミドの総数の間接的な測定値として使用しました。この測定は重要な制御手段であり、機能スクリーニングに使用する前に最終的な増幅ライブラリーの内容を既知する。
通常に、プールされたレンチウイルスＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡライブラリーはＤＮＡ等分の試料として送達され、多くの場合、ＤＮＡ の量は実験に使用するには不十分である。このような場合、最初のステップはライブラリーを「増幅」することであり、これは全グループにおける個々のｇＲＮＡプラスミドの相対的な割合を維持しながらプラスミドＤＮＡの量を増やすことを意味する。ライブラリーＤＮＡ を細菌に変換し、細菌の中で一定期間増殖させた後に、プラスミドＤＮＡ を収穫することで増幅する。ほとんどのライブラリーでは、電気穿孔を使用すると転換効率が向上するため、化学転化の代わりに電気穿孔を使用される。多くの場合、転化された細菌は、適切な抗生物質を含むＬＢ 寒天プレート上で増殖し、これは、プレート上での増殖がライブラリーの表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を維持し、増殖中に急速に増殖するプラスミドが濃縮される可能性を低下させるのに役立つためである。転化および増幅されたｇＲＮＡ プラスミドの数の推定値は、希釈プレートアッセイを行うことによって得ることができる。このために、形質転換されたサンプルを希釈し、抗生物質を含むＬＢプレートにプレーティングし、プレート上で生じる細菌コロニーの数を、増幅されたライブラリーに存在するｇＲＮＡプラスミドの総数の間接的な測定値として使用しました。この測定は重要な制御手段であり、機能スクリーニングに使用する前に最終的な増幅ライブラリーの内容を既知する。
細胞の形質導入
ライブラリーが増幅され、代表性が確認されると、次のステップは、プールされたｇＲＮＡライブラリーを含有するレンチウイルスを作製することである。一般的に、ＣＲＩＳＰＲライブラリー及び適切なパッケージングおよびエンベロープベクター（例えば、Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ社の実験室からのｐｓＰＡＸ２、Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃１２２６０、ｐＭＤ２．Ｇ、Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ社の実験室からのＡｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃１２２５９、ＡｄｄｇｅｎｅからのｐＶＳＶＧとｐＲ８．７４）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトする。あるいは、レンチウイルスパッケージング細胞型はｇＲＮＡライブラリーのみでトランスフェクトされてもよい。トランスフェクションしてから４８時間以降に培地を収集することを提案する解決手段が多いが、最大ウイルス力価は特定のライブラリーに応じて変化するので、いくらかの最適化を必要とする可能性がある。
ライブラリーが増幅され、代表性が確認されると、次のステップは、プールされたｇＲＮＡライブラリーを含有するレンチウイルスを作製することである。一般的に、ＣＲＩＳＰＲライブラリー及び適切なパッケージングおよびエンベロープベクター（例えば、Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ社の実験室からのｐｓＰＡＸ２、Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃１２２６０、ｐＭＤ２．Ｇ、Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ社の実験室からのＡｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃１２２５９、ＡｄｄｇｅｎｅからのｐＶＳＶＧとｐＲ８．７４）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトする。あるいは、レンチウイルスパッケージング細胞型はｇＲＮＡライブラリーのみでトランスフェクトされてもよい。トランスフェクションしてから４８時間以降に培地を収集することを提案する解決手段が多いが、最大ウイルス力価は特定のライブラリーに応じて変化するので、いくらかの最適化を必要とする可能性がある。
形質導入ステップの目的は、Ｃａｓ９および単一ｇＲＮＡを安定的に共発現する突然変異細胞集団を生成することである。１つのステップにおいて野生型細胞から突然変異細胞を直接生成することができるため、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９を含む単一ベクターライブラリーはマルチベクターシステムよりも使用しやすい。その後、レンチウイルス形質導入後に選択して、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡについてポジティブである細胞集団を単離した。抗生物質を用いて選択する場合、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを含有する細胞のみを選択するために、死滅曲線を実行して最適な抗生物質濃度を決定すべきである。
理論的には、任意の細胞型をスクリーニングに使用することができるが、細胞の最終的なコロニーは、スクリーニング前にライブラリーの代表性を維持するために、十分な数でなければならない。スクリーニングに必要な細胞の確実な数は、検討される特定のライブラリーに基づいて変動する。これを理解するための最も簡単な方法は、最終的な突然変異細胞集団から復帰作業して、スクリーニングの開始時に必要な細胞の確実な数を決定する。例えば、１００００個のｇＲＮＡのライブラリーが１００×の代表で使用されると仮定する。このライブラリーを用いたスクリーニングに必要な細胞の最小数は１００００個のｇＲＮＡｓ×１００個の細胞／ｇＲＮＡ＝１０６個の細胞である（スクリーニングのための対照条件を除く）。複数のｇＲＮＡを単一の細胞に伝達すると、複数の遺伝子変化を引き起こし、どの突然変異が観察された表現型を実際にもたらすかが不明であるようになるため、最終的なコロニーにおける各細胞は１つのｇＲＮＡのみを含まなければならない。したがって、＜１の感染多重度（ＭＯＩ）（すなわち、１つの細胞当たりにウイルス粒子が１つ未満）でレンチウイルスｇＲＮＡライブラリーを細胞に形質導入することを提案する解決手段が多い。
遺伝子スクリーニング
遺伝子スクリーニングは、ポジティブ（スクリーニング中に濃縮されたｇＲＮＡを示す）またはネガティブ（スクリーニング中に枯渇したｇＲＮＡを示す）として広く定義され得る。ＣＲＩＳＰＲライブラリーは、突然変異時に化学療法薬に対する耐性を付与する遺伝子を探すために、ポジティブ選択薬物スクリーニングに使用することができる。ポジティブ選択薬物スクリーニングでは、突然変異細胞集団を処理して、遺伝子変更により耐薬性を促進する細胞を選択的に濃縮するために、全ての野生型細胞を死滅させる（死滅曲線）最適濃度を決定することが重要であり得る。さらに、ゲノムＤＮＡにおける最終的なｇＲＮＡ数を、並行して実行される対照条件（例えば、ベクター対照）と比較して、ｇＲＮＡ分布の薬物非依存的変化を制御し、例えば、薬物の非存在下での所与のｇＲＮＡによる細胞増殖に対する影響、またはベクター自体の影響を制御する。一方、ネガティブスクリーニングは、スクリーニング中にコロニーから排除されたｇＲＮＡを同定するために用いられ、それらが他のコロニーに対して選択的劣性であることを示す。ネガティブ選択によるスクリーニングの例として、所定の期間にわたって突然変異細胞を増殖させ、しばらくした時点と最初の時点のｇＲＮＡ分布を比較する。
遺伝子スクリーニングは、ポジティブ（スクリーニング中に濃縮されたｇＲＮＡを示す）またはネガティブ（スクリーニング中に枯渇したｇＲＮＡを示す）として広く定義され得る。ＣＲＩＳＰＲライブラリーは、突然変異時に化学療法薬に対する耐性を付与する遺伝子を探すために、ポジティブ選択薬物スクリーニングに使用することができる。ポジティブ選択薬物スクリーニングでは、突然変異細胞集団を処理して、遺伝子変更により耐薬性を促進する細胞を選択的に濃縮するために、全ての野生型細胞を死滅させる（死滅曲線）最適濃度を決定することが重要であり得る。さらに、ゲノムＤＮＡにおける最終的なｇＲＮＡ数を、並行して実行される対照条件（例えば、ベクター対照）と比較して、ｇＲＮＡ分布の薬物非依存的変化を制御し、例えば、薬物の非存在下での所与のｇＲＮＡによる細胞増殖に対する影響、またはベクター自体の影響を制御する。一方、ネガティブスクリーニングは、スクリーニング中にコロニーから排除されたｇＲＮＡを同定するために用いられ、それらが他のコロニーに対して選択的劣性であることを示す。ネガティブ選択によるスクリーニングの例として、所定の期間にわたって突然変異細胞を増殖させ、しばらくした時点と最初の時点のｇＲＮＡ分布を比較する。
データ分析
任意の成功したスクリーニングの最終結果は、観察された表現型に必要な標的配列または要素を有するｇＲＮＡが濃縮（ポジティブセレクション）または消費される（ネガティブセレクション）変異細胞の集団を取得することである。したがって、データ解析ステップの目的は、実験群において枯渇または濃縮されたｇＲＮＡ および配列またはエレメントを同定することである。細胞の最終的なコロニーは数千種類のｇＲＮＡを含んでいると考えられるため、ゲノム配列の分析には次世代シークエンシング（ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＮＧＳ）が必要である。個々のｇＲＮＡプラスミドは、ゲノムＤＮＡ中に存在する全ての他のｇＲＮＡとｇＲＮＡを区別するバーコードを含む。したがって、ＣＲＩＳＰＲスクリーニングデータからの分析の最初のステップは、ＰＣＲを使用してゲノムＤＮＡに対するｇＲＮＡを増幅し、ＮＧＳを実行して最終的な突然変異細胞集団に存在するｇＲＮＡを特定することである。ＮＧＳの最終的な結果は、すべてのバーコードの元のカウントであり、そこからｇＲＮＡ配列と標的遺伝子を推定することができる。
任意の成功したスクリーニングの最終結果は、観察された表現型に必要な標的配列または要素を有するｇＲＮＡが濃縮（ポジティブセレクション）または消費される（ネガティブセレクション）変異細胞の集団を取得することである。したがって、データ解析ステップの目的は、実験群において枯渇または濃縮されたｇＲＮＡ および配列またはエレメントを同定することである。細胞の最終的なコロニーは数千種類のｇＲＮＡを含んでいると考えられるため、ゲノム配列の分析には次世代シークエンシング（ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＮＧＳ）が必要である。個々のｇＲＮＡプラスミドは、ゲノムＤＮＡ中に存在する全ての他のｇＲＮＡとｇＲＮＡを区別するバーコードを含む。したがって、ＣＲＩＳＰＲスクリーニングデータからの分析の最初のステップは、ＰＣＲを使用してゲノムＤＮＡに対するｇＲＮＡを増幅し、ＮＧＳを実行して最終的な突然変異細胞集団に存在するｇＲＮＡを特定することである。ＮＧＳの最終的な結果は、すべてのバーコードの元のカウントであり、そこからｇＲＮＡ配列と標的遺伝子を推定することができる。
配列またはエレメントが“ヒット”であるかどうかを判断する１つの方法は、配列またはエレメントを標的にしたサンプル中の濃縮または枯渇したｇＲＮＡの量を定性比較することである。前の節で述べたように、ライブラリには通常、遺伝子ごとに複数の異なるｇＲＮＡが含まれており、かつ特定の遺伝子に対する複数のｇＲＮＡの一致した濃縮または消費は、特定の配列対が観察される表現型にとって重要であることを示す有力な証拠である。同じターゲットに向けられた２つの異なるｇＲＮＡが同じオフターゲット効果を持つことは不可能であるため、いくつかのｇＲＮＡをオフターゲット効果の内部コントロールとして使用することができる。しかしながら、ヒットを定義するために任意の閾値を設定すること（例えば、六つのｇＲＮＡ のうちの二つがヒットを満たすこと）は、潜在的な偏差の原因であり得るか、または偽陽性もしくは陰性の結果をもたらし得る。これを回避するために、様々な統計分析を用いて、偏差のない方法でヒットを決定することもできる。各スクリーニングは異なるため、どの統計方法が特定のスクリーニングに最も適合するかを知ることは非常に重要である。
本発明のデータ分析プロセスにおいて、野生型配列またはアウトフレー挿入欠失もしくはインフレーム挿入を含む配列のデータをフィルターし、部位特異的突然変異またはインフレーム欠失を含む配列のみが、さらなる分析のために保持されるようにする。部位特異的突然変異については、同義またはナンセンス突然変異をフィルターし、ミスセンス突然変異を含む突然変異のみを保持する。インフレーム欠失の場合、毎回のリードに引き起こされたアミノ酸欠失の数に基づいて突然変異タイプを分類する必要があり、単アミノ酸欠失のみが含む場合が「運転者の欠失」という類に定義される；複数のアミノ酸欠失を含む場合が「乗客の欠失」という類に定義される。バイオインフォマティクス分析は具体的に以下を含む：
ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異比率を以下のように計算する：
インフレーム欠失を含む断片について、各アミノ酸の欠失比率を以下のように計算する：
各アミノ酸の必須性スコアを以下のように算出する：
突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各アミノ酸について計算しスコア突然変異＝－ｌｏｇ １０（Ｐ 値）、
欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、欠失した運転者と欠失した乗客に次のように重みを付ける：
欠失倍数変化＝運転者の倍数変化＋α＊乗客の倍数変化、続いて、１００回並べ替えてヌル分布を確立し、且つアミノ酸ごとに計算しスコア欠失＝－ｌｏｇ １０（Ｐ 値）、
スコア突然変異及びスコア欠失を以下のように正規化する：
突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各アミノ酸について計算しスコア突然変異＝－ｌｏｇ １０（Ｐ 値）、
欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、欠失した運転者と欠失した乗客に次のように重みを付ける：
欠失倍数変化＝運転者の倍数変化＋α＊乗客の倍数変化、続いて、１００回並べ替えてヌル分布を確立し、且つアミノ酸ごとに計算しスコア欠失＝－ｌｏｇ １０（Ｐ 値）、
スコア突然変異及びスコア欠失を以下のように正規化する：
スコア突然変異及びスコア欠失の重みを計算する：
ａ ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ａ ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
必須性スコアの計算は以下のとおりである：
必須スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ＋ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
最後に、アミノ酸は必須スコアに従ってそれらの機能的重要度に基づいてランク付けされる。
必須スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ＋ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
最後に、アミノ酸は必須スコアに従ってそれらの機能的重要度に基づいてランク付けされる。
材料と方法
細胞と試薬
Ｃａｓ９を安定して表現するＨｅＬａ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、胎牛血清（ＦＢＳ， ＣｅｌｌＭａｘ）を１０％含むドゥルベコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、５％ＣＯ２の状態に３７℃で培養した。
細胞と試薬
Ｃａｓ９を安定して表現するＨｅＬａ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、胎牛血清（ＦＢＳ， ＣｅｌｌＭａｘ）を１０％含むドゥルベコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、５％ＣＯ２の状態に３７℃で培養した。
プラスミド構築
ｐＬＬ３．７（Ａｄｄｇｅｎｅ）のＵ６プロモーターをヒトＵ６プロモーター、ｃｃｄＢボックス、ｓｇＲＮＡステントに置き換えることにより、ｓｇＲＮＡベクター（ｐｌｅｎｔｉ－ｓｇｒｎａ－ｇｆｐ）がクローされた。Ｃａｓ ９表現ベクター（ｐＬｅｎｔｉ－ＯＣ－ＩＲＥＳ－ＢＳＤ）１は以前に報告された。ｐＨＲ－ＳＦＦＶＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ （Ａｄｄｇｅｎｅ）のＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９エレメントをヒトＨＢＥＧＦコード配列と３ｘＦＬＡＧに置き換えることにより、ｐｃＤＮＡ－ＨＢＥＧＦがクローされた。単一のアミノ酸欠失を有するＨＢＥＧＦのｃＤＮＡを発現するベクターを、ＰＣＲ定点誘変（ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩ融合ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）により構築された。ＨＢＥＧＦ の異なる欠失突然変異体を生成するために使用されたプライマーを以下に列挙する。
ｐＬＬ３．７（Ａｄｄｇｅｎｅ）のＵ６プロモーターをヒトＵ６プロモーター、ｃｃｄＢボックス、ｓｇＲＮＡステントに置き換えることにより、ｓｇＲＮＡベクター（ｐｌｅｎｔｉ－ｓｇｒｎａ－ｇｆｐ）がクローされた。Ｃａｓ ９表現ベクター（ｐＬｅｎｔｉ－ＯＣ－ＩＲＥＳ－ＢＳＤ）１は以前に報告された。ｐＨＲ－ＳＦＦＶＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ （Ａｄｄｇｅｎｅ）のＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９エレメントをヒトＨＢＥＧＦコード配列と３ｘＦＬＡＧに置き換えることにより、ｐｃＤＮＡ－ＨＢＥＧＦがクローされた。単一のアミノ酸欠失を有するＨＢＥＧＦのｃＤＮＡを発現するベクターを、ＰＣＲ定点誘変（ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩ融合ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）により構築された。ＨＢＥＧＦ の異なる欠失突然変異体を生成するために使用されたプライマーを以下に列挙する。
ＨＢＥＧＦ－２９－Ｆ ５’－ＧＡＣＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＧＴＴＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＡＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）
ＨＢＥＧＦ－２９－Ｒ ５’－ＣＴＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＨＢＥＧＦ－６３－Ｆ ５’－ＧＡＣＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＧＴＴＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＡＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）
ＨＢＥＧＦ－６３－Ｒ ５’－ＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＣＡＡＡＣＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）
ＨＢＥＧＦ－７０－Ｆ ５’－ＧＣＡＡＧＡＧＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴＴＧＡＧＡＧＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）
ＨＢＥＧＦ－７０－Ｒ ５’－ＧＡＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）
ＨＢＥＧＦ－１１５－Ｆ ５’－ＣＧＧＡＡＡＴＡＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）
ＨＢＥＧＦ－１１５－Ｒ ５’－ＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧＴＣＣＴＴＧＴＡＴＴＴＣＣＧ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）
ＨＢＥＧＦ－１１９－Ｆ ５’－ＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）
ＨＢＥＧＦ－１１９－Ｒ ５’－ＣＡＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣ －３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）
ＨＢＥＧＦ－１２５－Ｆ ５’－ＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＣＣＧＧＧＣＴＣＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）
ＨＢＥＧＦ－１２５－Ｒ ５’－ＧＧＡＧＣＣＣＧＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）
ＨＢＥＧＦ－１２７－Ｆ ５’－ＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＧＧＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）
ＨＢＥＧＦ－１２７－Ｒ ５’－ＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＡＣＡＴ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）
ＨＥＢＧＦ－１３３－Ｆ ５’－ＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４）
ＨＢＥＧＦ－１３３－Ｒ ５’－ＧＴＡＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）
ＨＥＢＧＦ－１３４－Ｆ ５’－ＣＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６）
ＨＢＥＧＦ－１３４－Ｒ ５’－ＧＧＴＡＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＧ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）
ＨＥＢＧＦ－１３８－Ｆ ５’－ＣＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＴＣＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８）
ＨＢＥＧＦ－１３８－Ｒ ５’－ＧＡＣＡＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９）
ＨＥＢＧＦ－１４１－Ｆ ５’－ＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＧＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０）
ＨＢＥＧＦ－１４１－Ｒ ５’－ＧＣＣＣＡＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＣＣＣＧＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１）
ＨＥＢＧＦ－１５２－Ｆ ５’－ＧＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＣＴＴＡＴＡＴＡＣＣＴＡＴＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２）
ＨＢＥＧＦ－１５２－Ｒ ５’－ＣＡＴＡＧＧＴＡＴＡＴＡＡＧＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＧＡＧＧＣ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３）
ＨＥＢＧＦ－１５３－Ｆ ５’－ＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＴＡＣＣＴＡＴＧＡＣＣ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４）
ＨＢＥＧＦ－１５３－Ｒ ５’－ＧＧＴＣＡＴＡＧＧＴＡＴＡＴＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＧＡＧＧ－３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５）
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）
ＨＢＥＧＦ－２９－Ｒ ５’－ＣＴＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＨＢＥＧＦ－６３－Ｆ ５’－ＧＡＣＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＧＴＴＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＡＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）
ＨＢＥＧＦ－６３－Ｒ ５’－ＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＣＡＡＡＣＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）
ＨＢＥＧＦ－７０－Ｆ ５’－ＧＣＡＡＧＡＧＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴＴＧＡＧＡＧＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）
ＨＢＥＧＦ－７０－Ｒ ５’－ＧＡＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）
ＨＢＥＧＦ－１１５－Ｆ ５’－ＣＧＧＡＡＡＴＡＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）
ＨＢＥＧＦ－１１５－Ｒ ５’－ＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧＴＣＣＴＴＧＴＡＴＴＴＣＣＧ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）
ＨＢＥＧＦ－１１９－Ｆ ５’－ＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）
ＨＢＥＧＦ－１１９－Ｒ ５’－ＣＡＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣ －３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）
ＨＢＥＧＦ－１２５－Ｆ ５’－ＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＣＣＧＧＧＣＴＣＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）
ＨＢＥＧＦ－１２５－Ｒ ５’－ＧＧＡＧＣＣＣＧＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）
ＨＢＥＧＦ－１２７－Ｆ ５’－ＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＧＧＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）
ＨＢＥＧＦ－１２７－Ｒ ５’－ＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＡＣＡＴ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）
ＨＥＢＧＦ－１３３－Ｆ ５’－ＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４）
ＨＢＥＧＦ－１３３－Ｒ ５’－ＧＴＡＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）
ＨＥＢＧＦ－１３４－Ｆ ５’－ＣＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６）
ＨＢＥＧＦ－１３４－Ｒ ５’－ＧＧＴＡＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＧ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）
ＨＥＢＧＦ－１３８－Ｆ ５’－ＣＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＴＣＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８）
ＨＢＥＧＦ－１３８－Ｒ ５’－ＧＡＣＡＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９）
ＨＥＢＧＦ－１４１－Ｆ ５’－ＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＧＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０）
ＨＢＥＧＦ－１４１－Ｒ ５’－ＧＣＣＣＡＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＣＣＣＧＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１）
ＨＥＢＧＦ－１５２－Ｆ ５’－ＧＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＣＴＴＡＴＡＴＡＣＣＴＡＴＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２）
ＨＢＥＧＦ－１５２－Ｒ ５’－ＣＡＴＡＧＧＴＡＴＡＴＡＡＧＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＧＡＧＧＣ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３）
ＨＥＢＧＦ－１５３－Ｆ ５’－ＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＴＡＣＣＴＡＴＧＡＣＣ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４）
ＨＢＥＧＦ－１５３－Ｒ ５’－ＧＧＴＣＡＴＡＧＧＴＡＴＡＴＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＧＡＧＧ－３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５）
ｓｇＲＮＡ ライブラリー設計
標的遺伝子のｈｇ１９ＣＤＳ配列をＵＣＳＣゲノムブラウザー（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）からダウンロードし、自作のスクリプトを使用して、ＮＡＧまたはＮＧＧ ＰＡＭ配列を持つすべての潜在的なｓｇＲＮＡをライブラリーを構築するために設計した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡライブラリーの構築
三つの薬物関連タンパク質および三つの毒素受容体をそれぞれ標的とする１、２３６、および３、７１２のｓｇＲＮＡ を含む二つのライブラリーを構築した。ｓｇＲＮＡ をコードするアレイベースのオリゴヌクレオチドをＰＣＲ によって合成し、５’末端にＢｓｍＢＩ認識部位を含む対応するプライマーを用いて増幅した。ｓｇＲＮＡ をコードするアレイベースのオリゴヌクレオチドをＰＣＲ 増幅するために使用されるプライマー（薬物関連タンパク質を標的とするｓｇＲＮＡ オリゴヌクレオチドを増幅するために使用されるプライマー）を以下に列挙する。
標的遺伝子のｈｇ１９ＣＤＳ配列をＵＣＳＣゲノムブラウザー（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）からダウンロードし、自作のスクリプトを使用して、ＮＡＧまたはＮＧＧ ＰＡＭ配列を持つすべての潜在的なｓｇＲＮＡをライブラリーを構築するために設計した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡライブラリーの構築
三つの薬物関連タンパク質および三つの毒素受容体をそれぞれ標的とする１、２３６、および３、７１２のｓｇＲＮＡ を含む二つのライブラリーを構築した。ｓｇＲＮＡ をコードするアレイベースのオリゴヌクレオチドをＰＣＲ によって合成し、５’末端にＢｓｍＢＩ認識部位を含む対応するプライマーを用いて増幅した。ｓｇＲＮＡ をコードするアレイベースのオリゴヌクレオチドをＰＣＲ 増幅するために使用されるプライマー（薬物関連タンパク質を標的とするｓｇＲＮＡ オリゴヌクレオチドを増幅するために使用されるプライマー）を以下に列挙する。
薬物ライブラリーＦ ５’－ＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＣＧ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６）
薬物ライブラリーＲ ５’－（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：２７）
毒素ライブラリーＦ ５’－ＴＣＴＴＣＡＴＡＴＣＧＴＡＴＣＧＴＧＣＧ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８）
毒素ライブラリーＲ ５’－ＴＡＧＴＣＧＣＴＡＧＧＣＴＡＴＡＡＣＧＴ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９）
薬物ライブラリーＲ ５’－（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：２７）
毒素ライブラリーＦ ５’－ＴＣＴＴＣＡＴＡＴＣＧＴＡＴＣＧＴＧＣＧ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８）
毒素ライブラリーＲ ５’－ＴＡＧＴＣＧＣＴＡＧＧＣＴＡＴＡＡＣＧＴ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９）
増幅されたＤＮＡ産物は、ゴールデンゲート（Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ）法を使用してベクターに接続された。次いで、ライゲーション混合物をＴｒａｎｓ１－Ｔ１コンピテントセル（Ｔｒａｎｓｇｅｎ）に形質転換して、プラスミドライブラリーを生成した。続いて、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡ転写試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ｓｇＲＮＡプラスミドライブラリーを２つのウイルスパッケージングプラスミドｐＶＳＶＧおよびｐＲ８．７４（Ａｄｄｇｅｎｅ）とともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞に転写した。次いで、ＨｅＬａ 細胞を低ＭＯＩ （約０、３）のレンチウイルスで感染させ、ＥＧＦＰ ＋細胞を感染した後の４８時間でＦＡＣＳ によって収集した。
ライブラリースクリーニング
ＢＩ ２５３６およびホウレンテゾミのスクリーニングについては、それぞれ３．５ × １０６個の細胞を持つ１５０ｍｍのシャーレ２個からなる実験を繰り返した。接種後２４時間、適切な濃度の薬物で細胞を処理する。スクリーニングの最初のラウンドでは、ライブラリー細胞を４ｎｇ／ｍｌのＢＩ２５３６で１．５日培養し、または４ｎｇ／ｍｌのホウレゾミで３日培養した後、新鮮なＤＭＥＭで培養した。耐性細胞を再度接種し、５－１０日間培養し、その後の薬物スクリーニングに使用する。スクリーニングの第二ラウンドのでは、ライブラリー細胞を５ｎｇ／ｍｌのＢＩ２５３６と４日間、または８ｎｇ／ｍｌのホウベンゾミと５日間インキュベートした。クリーニングの第二ラウンドのでは、ライブラリー細胞を６ｎｇ／ｍｌ のＢＩ ２５３６と３日間インキュベートした。６－ＴＧスクリーニングでは、合計１．８×１０７個のライブラリー細胞を１５０ｍｍシャーレにプレートあたり３×１０６個の細胞でプレーティングした。三つの細胞プレートを一つの繰り返しとしてグループに分けた。細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌ の６－ＴＧ で６日間処理し、生き残した細胞を増殖のために再播種し、次のラウンドのスクリーニングに用いた。第二ラウンドおよび第三ラウンドについて、ライブラリー細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌおよび３００ｎｇ／ｍｌ の６－ＴＧ とそれぞれ４日間インキュベートした。ＴｃｄＢスクリーニングのために、１５０ｍｍ の四つのペトリ皿にそれぞれ、３．５×１０６個の細胞を実験的反復として播種した。スクリーニングの各ラウンドで、細胞は適切な濃度で処理された：第一ラウンドは７０ ｎｇ ／ ｍｌ、２第二ラウンドと第三ラウンドは１００ ｎｇ ／ ｍｌであった。ＨＢＥＧＦ およびＡＮＴＸＲ１スクリーニングの詳細は、本発明者らの以前の報告と同じである（１）。
スクリーニングされた各耐性細胞を収集して、ゲノムＤＮＡとトータルＲＮＡを抽出にもちいて、逆転写を実行した。次に、ＰＣＲ 増幅によって得られた標的遺伝子のｓｇＲＮＡ コード領域およびｃＤＮＡ を次世代シークエンシング（ＮＧＳ ）分析にかけた。
ＢＩ ２５３６およびホウレンテゾミのスクリーニングについては、それぞれ３．５ × １０６個の細胞を持つ１５０ｍｍのシャーレ２個からなる実験を繰り返した。接種後２４時間、適切な濃度の薬物で細胞を処理する。スクリーニングの最初のラウンドでは、ライブラリー細胞を４ｎｇ／ｍｌのＢＩ２５３６で１．５日培養し、または４ｎｇ／ｍｌのホウレゾミで３日培養した後、新鮮なＤＭＥＭで培養した。耐性細胞を再度接種し、５－１０日間培養し、その後の薬物スクリーニングに使用する。スクリーニングの第二ラウンドのでは、ライブラリー細胞を５ｎｇ／ｍｌのＢＩ２５３６と４日間、または８ｎｇ／ｍｌのホウベンゾミと５日間インキュベートした。クリーニングの第二ラウンドのでは、ライブラリー細胞を６ｎｇ／ｍｌ のＢＩ ２５３６と３日間インキュベートした。６－ＴＧスクリーニングでは、合計１．８×１０７個のライブラリー細胞を１５０ｍｍシャーレにプレートあたり３×１０６個の細胞でプレーティングした。三つの細胞プレートを一つの繰り返しとしてグループに分けた。細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌ の６－ＴＧ で６日間処理し、生き残した細胞を増殖のために再播種し、次のラウンドのスクリーニングに用いた。第二ラウンドおよび第三ラウンドについて、ライブラリー細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌおよび３００ｎｇ／ｍｌ の６－ＴＧ とそれぞれ４日間インキュベートした。ＴｃｄＢスクリーニングのために、１５０ｍｍ の四つのペトリ皿にそれぞれ、３．５×１０６個の細胞を実験的反復として播種した。スクリーニングの各ラウンドで、細胞は適切な濃度で処理された：第一ラウンドは７０ ｎｇ ／ ｍｌ、２第二ラウンドと第三ラウンドは１００ ｎｇ ／ ｍｌであった。ＨＢＥＧＦ およびＡＮＴＸＲ１スクリーニングの詳細は、本発明者らの以前の報告と同じである（１）。
スクリーニングされた各耐性細胞を収集して、ゲノムＤＮＡとトータルＲＮＡを抽出にもちいて、逆転写を実行した。次に、ＰＣＲ 増幅によって得られた標的遺伝子のｓｇＲＮＡ コード領域およびｃＤＮＡ を次世代シークエンシング（ＮＧＳ ）分析にかけた。
候補ｓｇＲＮＡ 配列の同定
ＤＮｅａｓｙ ＢｌｏｏｄとＴｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて適切な数のライブラリー細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。異なる薬物／毒素処理に対して、ライブラリー細胞の適切な数は異なる： ＡＮＴＸＲ １は、６．２５×１０５個、ＣＳＰＧ ４は、３×１０６個、ＨＢＥＧＦ は、２．５×１０５個、ＨＰＲＴ １は、１．７５×１０５個、ＰＬＫ １は、６．３×１０５個、ＰＳＭＢ ５は、３×１０５個。ｓｇＲＮＡ領域は、プライマー１を用いてｓｇＲＮＡの側面配列をアニーリングした２６サイクルのＰＣＲにより増幅される。各リピートのＰＣＲ産物をプールし、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で精製し、異なるバーコード（ＮＥＢ＃７３７０、＃７３３５、＃７５００）でインデックスを付け、ＮＧＳで分析した。
ＤＮｅａｓｙ ＢｌｏｏｄとＴｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて適切な数のライブラリー細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。異なる薬物／毒素処理に対して、ライブラリー細胞の適切な数は異なる： ＡＮＴＸＲ １は、６．２５×１０５個、ＣＳＰＧ ４は、３×１０６個、ＨＢＥＧＦ は、２．５×１０５個、ＨＰＲＴ １は、１．７５×１０５個、ＰＬＫ １は、６．３×１０５個、ＰＳＭＢ ５は、３×１０５個。ｓｇＲＮＡ領域は、プライマー１を用いてｓｇＲＮＡの側面配列をアニーリングした２６サイクルのＰＣＲにより増幅される。各リピートのＰＣＲ産物をプールし、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で精製し、異なるバーコード（ＮＥＢ＃７３７０、＃７３３５、＃７５００）でインデックスを付け、ＮＧＳで分析した。
ｃＤＮＡ 調製及びシークエンシング
ＲＮＡｐｒｅｐ純粋な細胞／細菌キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を使用してライブラリー細胞からトータルＲＮＡを抽出し、Ｑｕａｎｔｓｃｒｉｐｔ ＲＴキット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を使用してｃＤＮＡを合成した。二ステップの方法でＮＧＳライブラリを構築する。第一ステップはＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ（２６個のサイクル；ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｋａｒａ）を含む。異なる遺伝子のためのプライマー（ｃＤＮＡ増幅プライマー）を表１に示した。
ＲＮＡｐｒｅｐ純粋な細胞／細菌キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を使用してライブラリー細胞からトータルＲＮＡを抽出し、Ｑｕａｎｔｓｃｒｉｐｔ ＲＴキット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を使用してｃＤＮＡを合成した。二ステップの方法でＮＧＳライブラリを構築する。第一ステップはＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ（２６個のサイクル；ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｋａｒａ）を含む。異なる遺伝子のためのプライマー（ｃＤＮＡ増幅プライマー）を表１に示した。
ＣＳＰＧ ４のコード配列長は約６．９ｋｂであり、３つの増幅反応を用いて，その全長を含むオーバーラップフラグメント（～５０ ｂｐ）を得る。各ｃＤＮＡ 断片のＰＣＲ 産物をプールし、精製した（ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５，Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。次に、ＣｏｖａｒｉｓＳ２システムを使用して各遺伝子の１μｇのｃＤＮＡを約２５０ｂｐにカットした。ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてカットされた製品を精製して濃縮し、また、異なるバーコードを使用して、ＮＧＳ分析用のインデックスを作成した。
機能ドメインのアルゴリズムの同定
Ｂｏｗｔｉｅ２ ２．３．２を使用してシーケンスリードをターゲット遺伝子の参照配列にマッピングし、ＳＡＭｔｏｏｌｓ１．３．１を使用して選別した。次に、リードをフィルターして、ミスセンス突然変異またはインフレーム欠失のみを含むリードを保持した。ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異率を次のように計算した：
Ｂｏｗｔｉｅ２ ２．３．２を使用してシーケンスリードをターゲット遺伝子の参照配列にマッピングし、ＳＡＭｔｏｏｌｓ１．３．１を使用して選別した。次に、リードをフィルターして、ミスセンス突然変異またはインフレーム欠失のみを含むリードを保持した。ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異率を次のように計算した：
インフレーム欠失を含む断片について、各アミノ酸の欠失比率を以下のように計算した：
そして、それらが生成したアミノ酸の欠失の数に基づいて突然変異のタイプを分類し、一つのアミノ酸しか欠落していない場合が「運転士の欠失（ｄｒｉｖｅｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）」、複数の場合が「乗客の欠失（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）」として分類した。突然変異／欠失の比率を決定し、欠失パターンをデコードした後、実験群と対照群との間の倍数変化を計算した。
次に、各アミノ酸の必須性スコアを以下のように算出する：突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各アミノ酸について計算しスコア突然変異＝－ｌｏｇ １０（Ｐ 値）。欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、運転者の欠失と乗客の欠失に次のように重みを付ける：
欠失倍数変化＝運転者倍数変化＋α＊乗客倍数変化。
続いて、並べ替えてヌル分布（ｎｕｌｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を確立し、（且つアミノ酸ごとに計算したスコア欠失＝－ｌｏｇ １０（Ｐ 値）。次に、スコア突然変異及びスコア欠失は以下のように正規化した：
欠失倍数変化＝運転者倍数変化＋α＊乗客倍数変化。
続いて、並べ替えてヌル分布（ｎｕｌｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を確立し、（且つアミノ酸ごとに計算したスコア欠失＝－ｌｏｇ １０（Ｐ 値）。次に、スコア突然変異及びスコア欠失は以下のように正規化した：
続いて、計算したスコア突然変異及びスコア欠失の重みが以下のとおりである：
ａ ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ａ ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
最終的に、必須性スコアの計算は以下のとおりである：
必須スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ＋ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
必須スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ＋ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
スクリーニング結果の検証
ＰＳＭＢ５およびＰＬＫ１の重要な突然変異を検証するために、ｓｇＲＮＡは突然変異部位の近くに設計され、検証された残基の代わりに１１９ ｎｔのｓｓＯＤＮドナーごとに１つのアミノ酸をコードする。すべてのｓｇＲＮＡ（重要な変異を検証するために使用されるｓｇＲＮＡ配列）およびｓｓＯＤＮドナー配列（ｓｓＯＤＮドナーは検証された残基の代わりにアミノ酸をコードする）を以下の表２に示した。
ＰＳＭＢ５およびＰＬＫ１の重要な突然変異を検証するために、ｓｇＲＮＡは突然変異部位の近くに設計され、検証された残基の代わりに１１９ ｎｔのｓｓＯＤＮドナーごとに１つのアミノ酸をコードする。すべてのｓｇＲＮＡ（重要な変異を検証するために使用されるｓｇＲＮＡ配列）およびｓｓＯＤＮドナー配列（ｓｓＯＤＮドナーは検証された残基の代わりにアミノ酸をコードする）を以下の表２に示した。
ＨｅＬａ 細胞は、６穴あき板で１μｇのｓｇＲＮＡと２μｇのｓｓＯＤＮドナーを転写した。１．５×１０５個の細胞を、転写後１４日間、薬選択の２４時間前に６穴あき板に接種する。適切な用量の薬物で細胞を７２時間処理する：ホウレンチゾミ（８ｎｇ／ｍｌ ）； ＢＩ２５３６（１０ｎｇ／ｍｌ）。ＴＩＡＮａｍｐゲノムＤＮＡキット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を使って薬剤耐性細胞のゲノムを抽出する。
ＴｒａｎｓＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの高忠実度（Ｔｒａｎｓｇｅｎ）を使用して突然変異サイトを増幅し、通用なＤＮＡ精製キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を用いて精製した。プライマー（ＰＳＭＢ ５遺伝子突然変異部位を増幅するためのプライマー）を表３に列挙した。
ＴｒａｎｓＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの高忠実度（Ｔｒａｎｓｇｅｎ）を使用して突然変異サイトを増幅し、通用なＤＮＡ精製キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を用いて精製した。プライマー（ＰＳＭＢ ５遺伝子突然変異部位を増幅するためのプライマー）を表３に列挙した。
ＰＣＲ断片をｐＥＡＳＹ－Ｔ５ Ｚｅｒｏクローンキット（Ｔｒａｎｓｇｅｎ）にクローンしてシークエンシングに用いる。
細胞毒性の測定
薬物または毒素処理の２４時間前に、９６穴あき板（ジフテリア毒素（ＤＴ）用の５，０００個の細胞とホウレンチゾミ用の３０００個の細胞）に播種し、 異なる濃度のホウレンチゾミまたはＤＴを添加した。細胞を３７°Ｃで４８時間（ＤＴ ）または７２時間（ホウレンチゾミ）インキュベートし、そして、１ｍｇ／ｍｌ のＭＴＴ （３－［４．５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２．５－ジフェニルテトラゾール臭化物）を添加した。ＢｉｏＴｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、５７０ｎｍでのスペクトロメータの読み取り値を収集しました。
結果
タンパク質マッピング機能エレメントにおけるアプローチを試験するために、本発明者らは、細菌毒素受容体をコードする三つの遺伝子（ＡＮＴＸＲ １、ＣＳＰＧ ４およびＨＢＥＧＦ ）およびがん薬物標的をコードする三つの遺伝子（ＨＰＲＴ １、ＰＬＫ １およびＰＳＭＢ ５）（表４）を選択した。
薬物または毒素処理の２４時間前に、９６穴あき板（ジフテリア毒素（ＤＴ）用の５，０００個の細胞とホウレンチゾミ用の３０００個の細胞）に播種し、 異なる濃度のホウレンチゾミまたはＤＴを添加した。細胞を３７°Ｃで４８時間（ＤＴ ）または７２時間（ホウレンチゾミ）インキュベートし、そして、１ｍｇ／ｍｌ のＭＴＴ （３－［４．５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２．５－ジフェニルテトラゾール臭化物）を添加した。ＢｉｏＴｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、５７０ｎｍでのスペクトロメータの読み取り値を収集しました。
結果
タンパク質マッピング機能エレメントにおけるアプローチを試験するために、本発明者らは、細菌毒素受容体をコードする三つの遺伝子（ＡＮＴＸＲ １、ＣＳＰＧ ４およびＨＢＥＧＦ ）およびがん薬物標的をコードする三つの遺伝子（ＨＰＲＴ １、ＰＬＫ １およびＰＳＭＢ ５）（表４）を選択した。
本発明者らは、ＨｅＬａ細胞を選択してスクリーニングのためのＣＲＩＳＰＲライブラリーを構築し、それは、ＨＰＲＴ１（１２）を標的とする６－ＴＧ（チオグアニン）、ＰＬＫ１（１３）を標的とするＢＩ２５３６、およびＰＳＭＢ５（１４）を標的とするボルテゾミブなど、この細胞株における毒素（８、１１）および薬物の適切な死滅条件を決定したためである（図２Ａ）。
標的遺伝子については、ｓｇＲＮＡをコンピュータ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）上で設計し、チップ上でプール（ｐｏｏｌ）として合成して、３つの受容体コード化遺伝子の全長をカバーする飽和ＣＲＩＳＰＲライブラリー、および３つの薬物標的をカバーする別のライブラリーを構築した（図２Ｂ）。
処理された対照スクリーニングを除いて、本発明者らは６つの処理中のそれぞれに対して２回の繰り返し機能スクリーニングを行った。各ｓｇＲＮＡがＤＳＢ部位の周囲の１０－ｂｐ（１５）に影響を及ぼすと仮定すると（図２Ｃ）、６つの遺伝子のｓｇＲＮＡカバレッジは約０．９９であった。毒素（ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ毒素、ジフテリア毒素、またはクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ）または薬物（６－ＴＧ、ＢＩ２５３６、またはボルテゾミブ）による処理を三回した後、抵抗性細胞を得て、ＮＧＳ分析による通常のｓｇＲＮＡ解読（８、１６）のためにゲノムＤＮＡを抽出した。
処理された対照スクリーニングを除いて、本発明者らは６つの処理中のそれぞれに対して２回の繰り返し機能スクリーニングを行った。各ｓｇＲＮＡがＤＳＢ部位の周囲の１０－ｂｐ（１５）に影響を及ぼすと仮定すると（図２Ｃ）、６つの遺伝子のｓｇＲＮＡカバレッジは約０．９９であった。毒素（ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ毒素、ジフテリア毒素、またはクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ）または薬物（６－ＴＧ、ＢＩ２５３６、またはボルテゾミブ）による処理を三回した後、抵抗性細胞を得て、ＮＧＳ分析による通常のｓｇＲＮＡ解読（８、１６）のためにゲノムＤＮＡを抽出した。
同時に、これらの得た耐性細胞を全ＲＮＡ単離および逆転写に供してｃＤＮＡを得、その後、これをＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。特異的プライマー増幅を用いて標的遺伝子の全長ｃＤＮＡを得た。ＣＳＰＧ４などの大型遺伝子については、その全長をカバーするように三対のプライマーを使用して３つの重複するフラグメントを増幅した。選択的スプライシングを有する遺伝子については、全ての代替転写物が含まれることを確実にするために、特異的プライマー対を設計した（図２Ｄおよび表１）。ＮＧＳのサイズ要件のため、ＰＣＲフラグメントを、平均的に２５０－ｂｐの小さなサイズにさらに分割した（図２Ｅ）。全ての実験手順の後、本発明者らは、シークエンシングデータを分析して標的遺伝子の機能に不可欠なアミノ酸を決定するための計算手順を確立した。
全て６つの標的の対照ライブラリーの突然変異パーセントは低レベルであり、これらの値はスクリーニング後に有意に増加し、特に、ＣＲＩＳＰＲライブラリーが生成したインデルであった。全ての対照群における比較的高い点突然変異率は、ＰＣＲ増幅およびＮＧＳにおいて生じたエラーに起因する可能性がある。しかしながら、点突然変異のリードは、全ての６回のスクリーニング後に増加し、何らかの点突然変異が耐性表現型に確実に寄与することを示した（図３Ａ）。次いで、本発明者らは、２回の繰り返し間のｓｇＲＮＡ倍数変化と欠失突然変異および点突然変異との関連性によりスクリーニングの品質を評価すると、ｓｇＲＮＡ倍数変化の相関係数範囲が０．３６～０．８５（図３Ｂ）、欠失が０．４５～０．９９（図４Ａ）、点突然変異が０．６１～０．９９（図４）であることを見出し、本発明の方法の高い一致性が示された。全て３つの毒素受容体が細胞生存に必須ではないため、スクリーニング後のｓｇＲＮＡは、そのコード配列にわたって均一に分布し（図３Ａ、図５Ａおよび図６Ａ）、これは、これらの大部分がフレームシフトインデルを生成することができ、標的遺伝子発現の破壊を引き起こすことを示している。興味深いことに、３つの毒素受容体のＣ－末端部分に対応するコード領域を標的とする大部分のｓｇＲＮＡは、一貫して濃縮することができず（図３Ａ、図５Ａおよび図６Ａ）、これは、その大部分の細胞内Ｃ－末端領域が機能的に必須ではないことを示している。しかしながら、ｓｇＲＮＡコード領域のＮＧＳは、多くの配列－機能情報を明らかにすることができなかった。
ＣＲＥＳＭＡＳポリシーおよび簡略化アルゴリズムを用いて、機能的に関連するアミノ酸マップを得ることができる。本発明者らは、このアミノ酸欠失型の意味が曖昧ではないため、ドライバ欠失には意図的に実線を割り当て、一方、乗客欠失には灰色線（１０％の割合）を割り当てた。本発明者らはまた、問い合わせを容易にするために、単一のミスセンス突然変異データと欠失データを１つのグラフに組み合わせた。単一アミノ酸欠失と同様に、ミスセンス点突然変異によるタンパク質機能の喪失は、影響を受けたアミノ酸がタンパク質の機能に非常に重要であることを示す。
ジフテリア毒素（ＤＴ）の受容体をコードするＨＢＥＧＦの機能的スクリーニングについては、ほとんどの耐性細胞は、報告されたＤＴ結合部位（１７）であるＥＧＦ様ドメイン（図７Ｂ）において欠失を有する。必要性スコアを計算し、以下の表６に示す。
必須性スコアを計算することにより（表６）、本発明者らは、スコアが最も高いアミノ酸がＥＧＦ様ドメインに確実に濃縮されることを見出し、毒素結合の調節におけるこのドメインの必要性がさらに確認された。全てのアミノ酸の中で、ＤＴ－ＨＢＥＧＦ相互作用に必要な３つの既知のアミノ酸であるＦ１１５、Ｌ１２７、およびＥ１４１（１７）は、上位（第２１位、第１５位、および第２８位）である。重要なことに、ＣＲＥＳＭＡＳ方法は、これらの３つ以外の多くの新しい部位が受容体機能にとって重要であることを明らかにした（図７Ｃ）。本発明者らの結果を検証するために、本発明者らは、ＨｅＬａＨＥＧＦ－／－細胞（８）においてレンチウイルス感染によって野生型または突然変異体ＨＢＥＧＦ ｃＤＮＡを発現させた。本発明者らは、５つの上位の部位（Ｇ１１９、Ｋ１２５、Ｉ１３３、Ｃ１３４、Ｙ１３８）、３つの既知のポジティブ部位、および五つの下位（Ｌ２９、Ｄ６３、Ｄ７０、Ｎ１５２、Ｒ１５３）の部位を検証した。ＨｅＬａ ＨＢＥＧＦ－／－は、ＤＴに対する全体的な耐性を示し、野生型ＨＢＥＧＦ発現は、毒素に対する細胞の感受性を回復させることができる。これらの５つの上位の部位（Ｇ１１９、Ｋ１２５、Ｉ１３３、Ｃ１３４、Ｙ１３８）のうちの１つの単一アミノ酸欠失、または既知のポジティブ部位（Ｆ１１５、Ｌ１２７、Ｅ１４１）のうちの１つの単一アミノ酸欠失を含有する突然変異体ＨＢＥＧＦのすべての発現は、ＤＴに対する細胞の感受性をレスキューすることができなかったが、５つの下位の部位（Ｌ２９、Ｄ６３、Ｄ７０、Ｎ１５２、Ｒ１５３）のうちのいずれかの欠失を有する突然変異体ＨＢＥＧＦは、野生型と同様にレスキューした（図７Ｄ）。これらの結果は、ＥＧＦ様ドメイン中の何らかのアミノ酸がＤＴ－により誘発された細胞毒性に必要であるという本発明者らのスクリーニング結果を裏付ける。注目すべきことに、ＨＢＥＧＦについてＤＴ結合ドメイン中のいくつかのアミノ酸がスクリーニングされたという事実は、ＣＲＥＳＭＡＳが低い偽陽性率を有することを示す。
炭疽毒素の受容体ＡＮＴＸＲ１について、すべての耐性細胞は、細胞質ドメインをコードする領域を除いて、コード領域全体にわたって様々な欠失を有し（図５Ｂおよび５Ｃ）、これは、炭疽毒素とＡＮＴＸＲ１との間の相互作用が受容体の細胞外領域によって支配されることを示している。既知のＰＡ結合部位（１８）及び膜貫通ドメインに加えて、様々な程度の重要度を示す多くの新規アミノ酸が同定された（図５Ｂ）。ｓｇＲＮＡシークエンシングの結果（図５Ａ）と一致して、細胞質領域内のアミノ酸の大部分は不必要であり（図５Ｂ）、これもまた、低偽陽性率を示している。炭疽毒性の媒介においてＡＮＴＸＲ１機能に重要な高順位アミノ酸であって、２つの既知の部位Ｈ５７およびＥ１５５（１８）（図５Ｃ）を含むものは、必須性スコアの計算によって決定された。
ＣＳＰＧ４、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）の受容体について、突然変異体のピークは、主に最初と最後の両方のＣＳＰＧリピートに位置した（図６Ｂ及び６Ｃ）。最初のＣＳＰＧリピートは、既知のＴｃｄＢ結合部位（１１）であり、最後の２つのリピートは新たな発見である。重要なことに、上記のＨＢＥＧＦおよびＡＮＴＸＲ１の両方とは異なり、ほとんどの情報データは欠失突然変異に由来し、ＣＳＰＧ４にはＴ７７８に影響を及ぼすミスセンス点突然変異が存在し、これは高度に濃縮されており（図６Ｂ）、このアミノ酸がＴｃｄＢ毒性を媒介する受容体にとって重要であることを示している。
がん薬物標的をコードする３つの遺伝子について、ＨＰＲＴ１は非必須遺伝子であり、ＰＬＫ１およびＰＳＭＢ５は２つの必須遺伝子（１９）である。非必須標的ＨＰＲＴ１について、ライブラリーの６－ＴＧスクリーニングは、ｓｇＲＮＡの大部分が濃縮され、均一に分布しており（図８Ａ）、細菌毒素スクリーニングからのものと同様の結果を示した（図３Ａ、５Ａ、６Ａ）。タンパク質全体における各アミノ酸の重要な役割が完全に埋められる。ＣＲＥＳＭＡＳ方法は、６－ＴＧに対する細胞の感受性の媒介において、ＨＰＲＴ１の機能にとって重要な多くの部位が存在することを示した（図８Ｂ）。この観察結果は、四量体ＨＰＲＴ１の既知の構造と一致し、必須性スコアの高い部位の分布も一致した（図８Ｃ）（１２）。
必須の標的であるＰＬＫ１およびＰＳＭＢ５について、ｓｇＲＮＡシークエンシングは、ｓｇＲＮＡのインフレーム突然変異が発生した何らかの重要なアミノ酸のおおよその位置を確実に提供した（図９Ａおよび図１０Ａ）。ｓｇＲＮＡ濃縮は間接的な証拠を提供し、解像度が低いため、本発明者らは、ＣＲＥＳＭＡＳポリシーが、より正確でより包括的なグラフをより詳細に明らかにすると考える。実際には、ＰＳＭＢ５およびＰＬＫ１において、タンパク質機能に重要なより多くのアミノ酸が高精度で同定された（図９Ｂおよび図１０Ｂ）。注目すべきことに、最終的なスクリーニング結果は、ミスセンス突然変異および可変数の欠失を含み、両方の場合での最も高い必須アミノ酸が、必須性スコアに基づいて得られた（図９Ｃおよび図１０Ｃ）。ここでも、本発明者らは、ＰＳＭＢ５におけるＢｏｒｔｅｚｏｍｉｂと相互作用した既知の重要部位（Ｒ７８、Ｔ８０、Ｍ１０４、Ａ１０８、Ｃ１２２、およびＧ２４２）（２０－２２）および新規の必須残基（図９Ｂ－Ｃ）を同定した。同様に、本発明者らは、ＢＩ２５３６－ＰＬＫ１相互作用にとって重要な既知の残基Ｒ１３６（２２、２３）および新規の必須残基Ｆ１８３（図１０Ｂ－Ｃ）を同定した。
ミスセンス点突然変異は、ＰＳＭＢ５およびＰＬＫ１に薬物耐性を付与する主な形態であるため、本発明者らは、欠失ではなく特定の点突然変異を生成して検証に用いるためにｓｓＯＤＮ媒介の方法（２４）を用いると決定した。本発明者らは、ＰＳＭＢ５中の９個のアミノ酸残基（Ｒ７８、Ｔ８０、Ｖ９０、Ｍ１０４、Ａ１０８、Ｄ１１０、Ｃ１１１、Ｃ１２２、およびＧ２４２）を選択し、対照としてＤ１１０、Ｃ１１１を含めた。点突然変異のための適切なアミノ酸を選択するために、スクリーニング結果または以前に報告された突然変異型からの選択が好ましい。残りについては、全ての置換をアラニンにした（表２）。以下のいずれかの突然変異を含むドナーでトランスフェクトされた細胞は、可変数のボルテゾミブ耐性コロニーであるＲ７８Ｎ、Ｔ８０Ａ、Ｖ９０Ａ、Ｍ１０４Ａ、Ａ１０８Ｔ、Ｃ１２２Ｆ、およびＧ２４２Ｄを生成した（図９Ｄ）。対照的に、Ｄ１１０ＡおよびＣ１１１Ａはボルテゾミブ耐性コロニーを生成することができず、これは、本発明者らの検証方法が信頼できることを示している（図９Ｄ）。興味深いことに、本発明者らのスクリーニングおよび検証結果とはことなり、ＳＷ１５７３およびＣＥＭ（２１、２５）においてＣ１１１部位がＰＳＭＢ５にとって重要であることが以前に報告された（図９Ｄ）。この違いは、アミノ酸の作用が生物学的環境から影響を受けること、または耐性表現型生成の代わりに正しいアミノ酸を生成することができないことを示す。ボルテゾミブ耐性のプールされた細胞を検証するために、本発明者らは、遺伝子座を標的とするゲノム領域をシークエンシングし、これらの全て７つの部位が予想される突然変異を含むことを確認した（図１１および表３）。本発明者らの結果をさらに検証するために、本発明者らは、いくつかの突然変異プールから個々のクローンを単離し（図１２）、細胞生存アッセイを行った。点突然変異のＲ７８Ｎ、Ｖ９０Ｌ、Ａ１０８Ｔ、Ｃ１２２Ｆ、およびＧ２４２Ｄがボルテゾミブに耐性を付与することを証明した（図９Ｅ）。これらのうち、Ｔ８０およびＡ１０８はＰＳＭＢ５とボルテゾミブ（２０－２２）の直接結合に係り、Ｒ７８、Ｍ１０４およびＣ１２２の突然変異は、薬物結合部位構造を破壊することによってボルテゾミブに耐性（２２、２６、２７）を付与することが報告された。Ｇ２４２は、ボルテゾミブ感受性に関連する別の既知の部位であるが、メカニズムはまだ不明である（２７）。Ｖ９０部位は新たな発見である。本発明者らは、２つの独立したＶ９０Ｌクローンを選択し、両者は全て薬物耐性を付与した。Ｖ９０が薬物感受性をどのように媒介するか、Ｖ９０突然変異がボルテゾミブ結合ポケット（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ）の周囲の構造を変化させるかどうかは、まだ決定されていない。
ＰＬＫ１について、本発明者らは、２つの上位にある残基（Ｒ１３６、Ｆ１８３）および１つの潜在的な偽陰性部位（Ｃ６７）を検証した。報告によれば、Ｒ１３６はＢＩ２５３６の重要なアミノ酸であり、ＰＬＫ１とＢＩ２５３６との結合時、Ｆ１８３が構造的に重要である（２２、２３）。これらの３つの部位の１つにおける点突然変異は、プールされたアッセイにおいてＢＩ２５３６に抵抗性を付与した（図１０Ｄ）。
ミスセンス突然変異については、各アミノ酸は１９種の非同義置換を有する。本発明者らは、異なる置換が異なる効果を有し得るが、いくつかの変化が表現型の差異を生じ得ないと仮定する。ＣＲＥＳＭＡＳポリシーがこのような詳細を生成できるかどうかを調べるために、本発明者らは、各ＰＳＭＢ５およびＰＬＫ１スクリーニングから最初の１０個のヒットのミスセンス突然変異データを検索し、アミノ酸パターン分析を行った。本発明者らは、これらのアミノ酸の明確なパターン選好を明らかにし、何らかの置換のみが細胞に薬物耐性を付与し得ることを示した（図１３Ａ－Ｂ）。ほとんどの部位における複数の置換は、薬物阻害の致死作用を回避することができ、例えばＶ９０ＰＳＭＢ５およびＡ３８６ＰＫ１（図１３Ｃ－Ｄ）が挙げられ、いくつかの部位における単一の特定の置換のみは薬物耐性を付与することができ、例えば、ＰＳＭＢ５についてはＭ１０４ＩおよびＣ１２２Ｙが挙げられ（図１３Ｅ）、ＰＬＫ１についてはＦ１８３Ｌが挙げられる（図１３Ｆ）。Ｒ１３６ＧＰＬＫ１は、唯一の突然変異型ではないが、ＢＩ２５３６細胞に耐性を付与する主要な形態である（図１３Ｆ）。同様に興味深いことに、ＰＳＭＢ５、Ａ１０５、およびＡ４３のうち２つの部位が非常に類似した突然変異選好パターンを有し（図１３Ｇ）、そのＰｅａｒｓｏｎ相関係数が０．５４である（図１３Ｈ）ことが留意される。
ミスセンス突然変異については、各アミノ酸は１９種の非同義置換を有する。本発明者らは、異なる置換が異なる効果を有し得るが、いくつかの変化が表現型の差異を生じ得ないと仮定する。ＣＲＥＳＭＡＳポリシーがこのような詳細を生成できるかどうかを調べるために、本発明者らは、各ＰＳＭＢ５およびＰＬＫ１スクリーニングから最初の１０個のヒットのミスセンス突然変異データを検索し、アミノ酸パターン分析を行った。本発明者らは、これらのアミノ酸の明確なパターン選好を明らかにし、何らかの置換のみが細胞に薬物耐性を付与し得ることを示した（図１３Ａ－Ｂ）。ほとんどの部位における複数の置換は、薬物阻害の致死作用を回避することができ、例えばＶ９０ＰＳＭＢ５およびＡ３８６ＰＫ１（図１３Ｃ－Ｄ）が挙げられ、いくつかの部位における単一の特定の置換のみは薬物耐性を付与することができ、例えば、ＰＳＭＢ５についてはＭ１０４ＩおよびＣ１２２Ｙが挙げられ（図１３Ｅ）、ＰＬＫ１についてはＦ１８３Ｌが挙げられる（図１３Ｆ）。Ｒ１３６ＧＰＬＫ１は、唯一の突然変異型ではないが、ＢＩ２５３６細胞に耐性を付与する主要な形態である（図１３Ｆ）。同様に興味深いことに、ＰＳＭＢ５、Ａ１０５、およびＡ４３のうち２つの部位が非常に類似した突然変異選好パターンを有し（図１３Ｇ）、そのＰｅａｒｓｏｎ相関係数が０．５４である（図１３Ｈ）ことが留意される。
要するに、ＣＲＥＳＭＡＳは配列－機能マッピングを生成する強力な方法である。突然変異誘発切断を使用して潜在的な機能ドメインを同定することは、通常、非常に面倒であり、タンパク質のサイズが大きすぎると、ますます困難になる。ターゲットタンパク質の全長にわたる各アミノ酸の意味を評価することは、不可能ではないにしても技術的に困難である。最近、Ｇｉｌｌｓ及び共同研究者らは、細菌又は酵母においてターゲットタンパク質の機能関連突然変異をマッピングする方法を記載したが、この方法は、相同組換え率に大きく依存し、高等真核生物におけるその効率的な適用を妨げる（２８）。大型タンパク質を処理する場合、ＣＲＥＳＭＡＳは非常に強力である。さらに、複数の遺伝子を同時にスキャンして、その対応するタンパク質の機能エレメントを得ることができる。
ＣＲＩＳＰＲ飽和突然変異誘発は、各アミノ酸を網羅する多重突然変異を提供する。多くの他の方法とは異なり、インフレームまたは点突然変異の方面においてごくわずかな割合のＮＧＳデータのみがＣＲＥＳＭＡＳに有用なリードである。本発明者らは、データ前処理中に大量のリードをフィルタリングしたが、本発明者らのバイオインフォマティクスプロセスが十分に高感度であり、中程度のシークエンシング深度で残りのリードから機能エレメントをマッピングできることを見出した。本発明者らが全て６つのアッセイにおいてタンパク質機能に重要なアミノ酸の大部分を同定できるという事実は、ＣＲＥＳＭＡＳが低い偽陰性率を有することを示す。
ＣＲＥＳＭＡＳ方法は突然変異によりタンパク質機能を消失させるすべての残基を潜在的に発見する可能性がある。しかしながら、これは、ＣＲＥＳＭＡＳスクリーニングから得られた各ヒットがタンパク質機能に直接関連することを意味しない。いくつかの残基は、所与のタンパク質の全体構造にとって重要であるが、タンパク質の酵素活性またはその相互作用パートナーとの接触を直接媒介しない場合がある。例えば、本発明者らは、毒素のエンドサイトーシスに直接関与することなく受容体機能を維持する重要な領域であるＡＮＴＸＲ１の膜貫通ドメイン内に位置する複数のヒット（図５Ｂ）を同定した。
ＣＲＥＳＭＡＳポリシーは、単なるタンパク質の研究に限定されない。それはまた、非コードＲＮＡ、プロモーターおよびエンハンサーなどの調節エレメントの機能ダイヤグラムを得るのに非常に適している。解決手段の補正は、上記のｃＤＮＡ上ではなくゲノム上の標的化領域上でのＰＣＲ増幅である。
本発明は、標的ゲノム領域または標的タンパク質の機能的エレメントを同定するための方法に関する。具体的には、本発明は、それらの自然生物学的背景におけるその機能に重要なエレメントを同定するためのハイスループット戦略に関する。
ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９ヌクレアーゼ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することにより、標的ゲノムの遺伝子座にｉｎｄｅｌ（挿入または欠失）と部位特異的突然変異を導入し、それにより内部修復メカニズム、特に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を活性化する（１，２）。突然変異は、特にリーディングフレームの移動（フレームシフト）をもたらす誘発は、遺伝子発現を完全に排除することができ、これによりＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムをゲノム工学（３，４）、さらにはハイスループット機能スクリーニング（５－８）のための強力なツールとなる。高分解能で調節的エレメントまたはタンパク質コード配列の役割をよりよく解明するために、関連する生物学的アッセイにおいて、ＣＲＩＳＰＲによる飽和突然変異誘発は使用されている（９，１０）。これらの試みはｓｇＲＮＡ コード領域からの間接的シークエンシングデータのみを収集したため、塩基識別の分解能には限界があった。さらに、特に目的タンパク質が細胞の活性に不必要である場合、この戦略を使用して完全な機能ドメインまたは重要なアミノ酸情報を取得することは不可能である。伝統的な方法は、主に共免疫沈降（Ｃｏ－ＩＰ）とトランケーション突然変異誘発（１１）の組み合わせなどの体外生化学的測定が主であったが、これらの技術は、時間がかかり、労力がかかり、分解能が低く、いずれも天然の生物学的環境で不可能であることは言うまでもない。したがって、当技術分野では、目的タンパク質またはゲノム配列の機能的エレメントを同定するために、より正確で包括的な戦略および方法が強く求められている。
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本発明は、ＣＲＩＳＰＲ強化された飽和突然変異誘発および分類ＤＮＡ断片シークエンシングとの組み合わせ方法と呼ばれ、目的ゲノム領域または目的タンパク質の機能的エレメントを同定するためのハイスループット戦略および方法を提供することによって、前述のニーズの少なくともいくつかを満たす（ＣＲＩＳＰＲ－Ｅｍｐｏｗｅｒｅｄ Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ａｓｓｏｒｔｅｄ－ＤＮＡ－ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＣＲＥＳＭＡＳ）。具体的には、本発明は飽和突然変異誘発を適用し、表現型変化を引き起こすインフレーム突然変異（インフレーム欠失およびミスセンス部位特異的突然変異）のみを検索し、標的遺伝子の重要度にかかわらず、ゲノム領域またはタンパク質の機能に関連するキーサイトを同定する。
この方法を使用して、本発明者らは、六種のタンパク質、三種の細菌毒素受容体および三種のがん薬物ターゲットをマッピングし、単一アミノ酸分解能でそれらの、既知のドメインまたはサイト（部位）および薬物または毒素感受性に重要な役割を果たす新しいアミノ酸を含む統合機能図を取得した。さらに、この新規な方法は、重要な残基の包括かつ正確な単アミノ酸置換パターンを明らかにし、タンパク質の機能を除去したり、薬剤耐性を与えることができる。拡張可能なＣＲＥＳＭＡＳ戦略は極めて高い精度と高効率を有し、高分解能で複数のタンパク質の配列－機能マッピングを行うことができ、且つタンパク質機能と薬剤耐性のメカニズムの研究を加速する可能性がある。
一態様では、本発明は、目的タンパク質の機能的エレメントを同定する方法に関し、当該方法は、各アミノ酸をカバーする複数の突然変異を提供するためにＣＲＩＳＰＲシステムを用いる飽和誘変を行うこと、機能喪失表現型を引き起こすインフレーム突然変異の検索すること、シークエンシング分析するためにＰＣＲによりｓｇＲＮＡコード領域および標的遺伝子のｃＤＮＡを増幅すること、および目的タンパク質に必要なアミノ酸を同定するためにシーケンシングデータを分析のための計算プロセスを確立することを含む。一実施形態では、目的タンパク質の機能的エレメントの同定は、単アミノ酸分解能で行われる。一実施形態では、目的タンパク質の機能的エレメントは、その天然の生物学的背景において同定される。一実施形態では、インフレーム突然変異は、インフレーム欠失およびミスセンス部位特異的突然変異である。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いることによる飽和変異誘発は、目的タン
パク質の全長にわたる各アミノ酸のｓｇＲＮＡ を設計することを含む。一実施形態では
、各ｓｇＲＮＡはＤＳＢサイトの周囲約１０ｂｐ、例えば、７～１３ｂｐ、例えば、８ｂ
ｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、１１ｂｐ、および１２ｂｐに影響を及ぼすように設計される。一
実施形態では、インフレーム欠失は、“運転者の欠失”（単一のアミノ酸欠失のみを含む
）または“乗客の欠失”（複数のアミノ酸欠失を含む）などの運転者の欠失を含む。
パク質の全長にわたる各アミノ酸のｓｇＲＮＡ を設計することを含む。一実施形態では
、各ｓｇＲＮＡはＤＳＢサイトの周囲約１０ｂｐ、例えば、７～１３ｂｐ、例えば、８ｂ
ｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、１１ｂｐ、および１２ｂｐに影響を及ぼすように設計される。一
実施形態では、インフレーム欠失は、“運転者の欠失”（単一のアミノ酸欠失のみを含む
）または“乗客の欠失”（複数のアミノ酸欠失を含む）などの運転者の欠失を含む。
一実施形態では、計算プロセスは以下を含む：
公衆の使用可能なバイオインフォマティクスツールを使用して、標的遺伝子の参照配列にシークエンシングリードをマッピングし、前記バイオインフォマティクスツールは、例えば、Ｂｏｗｔｉｅ２ ２．３．２およびＳＡＭｔｏｏｌｓ １．３．１である。
リードをフィルターし、ミスセンス突然変異またはインフレーム欠失などを保持する。
ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異比率を以下のように計算する：
公衆の使用可能なバイオインフォマティクスツールを使用して、標的遺伝子の参照配列にシークエンシングリードをマッピングし、前記バイオインフォマティクスツールは、例えば、Ｂｏｗｔｉｅ２ ２．３．２およびＳＡＭｔｏｏｌｓ １．３．１である。
リードをフィルターし、ミスセンス突然変異またはインフレーム欠失などを保持する。
ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異比率を以下のように計算する：
インフレーム欠失を含む断片について、各アミノ酸の欠失比率を以下のように計算する：
インフレーム欠失をデコードし、またアミノ酸欠失の数により、単一のアミノ酸欠失のみであれば「運転者の欠失」、複数のアミノ酸欠失であれば「乗客の欠失」としてインフレーム欠失を分類する。
実験群と対照群との間の倍数変化を計算する。
各アミノ酸の必須性スコアを以下のように算出する：
突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各アミノ酸についてスコア突然変異＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を計算する。
欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、運転者の欠失と乗客の欠失に次のように重み付けを付ける：
欠失倍数変化＝運転者の倍数変化＋α＊乗客の倍数変化、続いて、１００回並べ替えてヌル分布を確立し、且つアミノ酸ごとにスコア欠失＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を計算する。
スコア突然変異及びスコア欠失を以下のように正規化する：
実験群と対照群との間の倍数変化を計算する。
各アミノ酸の必須性スコアを以下のように算出する：
突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各アミノ酸についてスコア突然変異＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を計算する。
欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、運転者の欠失と乗客の欠失に次のように重み付けを付ける：
欠失倍数変化＝運転者の倍数変化＋α＊乗客の倍数変化、続いて、１００回並べ替えてヌル分布を確立し、且つアミノ酸ごとにスコア欠失＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を計算する。
スコア突然変異及びスコア欠失を以下のように正規化する：
スコア突然変異及びスコア欠失の重み付けを計算する：
ａ ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ａ ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
必須性スコアの計算は以下のとおりである：
必須性スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ ＋ ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
必須性スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ ＋ ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
一実施形態では、本方法は、必須スコアに従ってアミノ酸の機能的重要度に基づいてア
ミノ酸をランク付けすることをさらに含む。
ミノ酸をランク付けすることをさらに含む。
一態様では、本発明はライブラリーに関し、複数のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡを含むゲノム配列の機能的エレメントを同定するためにＣＲＥＳＭＡＳに用いられ、前記ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの連続ゲノム領域内の複数のゲノム配列を標的とすることができるガイド配列を含み、１００個以上のゲノム配列を標的とし、前記ゲノム配列には、連続ゲノム領域の１０００塩基対ごとにＰＡＭ配列の上流にある非重複切断部位が含む。
一実施形態では、ライブラリー内の各ＲＮＡはＤＳＢサイトの周囲約１０ｂｐ、例えば、７～１３ｂｐ、例えば、８～ｂｐ、９～ｂｐ、１０～ｂｐ、１１～ｂｐ、および１２～ｂｐに影響を及ぼすように設計される。一実施形態では、ライブラリーは連続ゲノム領域内の各ＰＡＭ配列の上流のゲノム配列を標的とするガイドＲＮＡ を含む。一実施形態では、ＰＡＭ配列は、少なくとも一種類のＣａｓタンパク質に特異的である。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのガイドＲＮＡは、少なくとも１つのＣａｓタンパク質に特異的な複数のＰＡＭ配列に基づいて選択される。一実施形態では、前記目的遺伝子の表現は、前記複数のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡの中の少なくとも一つのガイドＲＮＡの前記標的によって変化される。一実施形態では、前記ライブラリーは細胞集団、好ましく、真核細胞集団に導入される。一実施形態では、前記標的は連続ゲノム領域のＮＨＥＪを引き起こす。一実施形態では、標的は１００以上の配列、例えば、約１，０００以上の配列、約１００，０００以上の配列に対するものである。
一実施形態では、標的は、細胞集団中の各細胞に一つまたは複数のベクターのベクターシステムを導入することを含み、前記ベクターシステムは、操作された非天然のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含み、それは、
Ｉ．調節的エレメントに作動可能に接続される、Ｃａｂタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡを含む。
そのうち成分ＩおよびＩＩが同じまたは異なるベクター内にあり、そこに転写されたガイド配列を含むガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと連続ゲノム領域内の標的配列との配列特異的結合をガイドし、これにより、Ｃａｓタンパク質が前記連続ゲノム領域を切断するように誘導する。
Ｉ．調節的エレメントに作動可能に接続される、Ｃａｂタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡを含む。
そのうち成分ＩおよびＩＩが同じまたは異なるベクター内にあり、そこに転写されたガイド配列を含むガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと連続ゲノム領域内の標的配列との配列特異的結合をガイドし、これにより、Ｃａｓタンパク質が前記連続ゲノム領域を切断するように誘導する。
一実施形態では、前記一つ以上のベクターはプラスミドベクターである。調節的エレメントは、誘導性プロモーターであり、好ましくは、誘導性プロモーターはドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）誘導性プロモーターである。
一態様では、本発明はＣＲＥＳＭＡＳ方法に関し、
（ａ） 前記請求項のいずれか１項に記載のライブラリーを、少なくとも１つのＣａｓタンパクを含む改造された細胞集団に導入し、前記集団の各細胞が１つ以下のガイドＲＮＡを含むこと；
（ｂ） 細胞表現型の変化に基づいて細胞を少なくとも二つのグループに選別すること；
（ｃ） 各グループに存在するガイドＲＮＡの相対的な表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を決定し、それによって各グループに存在するガイドＲＮＡの表現によって前記細胞表現型の変化に関連するゲノム部位を決定すること；
（ｄ） シークエンシングのために、標的された１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数のｃＤＮＡまたはＤＮＡ配列を増幅すること；
（ｅ） シークエンシングリードを標的された遺伝子の参照配列にマッピングする；
（ｆ） リードをフィルターし、ミスセンス突然変異またはインフレーム欠失を有するリードのみを残すこと；および
（ｇ） バイオインフォマティクスプロセスを適用することにより、細胞の表現型に対す
る各アミノ酸またはヌクレオチドの重み付けが決定されること、を含む。
（ａ） 前記請求項のいずれか１項に記載のライブラリーを、少なくとも１つのＣａｓタンパクを含む改造された細胞集団に導入し、前記集団の各細胞が１つ以下のガイドＲＮＡを含むこと；
（ｂ） 細胞表現型の変化に基づいて細胞を少なくとも二つのグループに選別すること；
（ｃ） 各グループに存在するガイドＲＮＡの相対的な表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を決定し、それによって各グループに存在するガイドＲＮＡの表現によって前記細胞表現型の変化に関連するゲノム部位を決定すること；
（ｄ） シークエンシングのために、標的された１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数のｃＤＮＡまたはＤＮＡ配列を増幅すること；
（ｅ） シークエンシングリードを標的された遺伝子の参照配列にマッピングする；
（ｆ） リードをフィルターし、ミスセンス突然変異またはインフレーム欠失を有するリードのみを残すこと；および
（ｇ） バイオインフォマティクスプロセスを適用することにより、細胞の表現型に対す
る各アミノ酸またはヌクレオチドの重み付けが決定されること、を含む。
一実施形態では、細胞表現型の変化は、目的遺伝子の転写および／または発現の増加または減少である。一実施形態では、細胞を高発現グループと低発現グループに分類される。一実施形態では、細胞表現型の変化は、機能喪失または機能獲得を含む。一実施形態では、当方法は、単一のアミノ酸分解能で目的タンパク質の機能的エレメントを同定するために使用される。
一実施形態では、上記の方法はノンコーディングＲＮＡ、プロモーターまたはエンハンサーの機能図を同定するために用いられる。形態では、唯一の修飾は、目的タンパク質の機能的エレメントが同定される場合、ｃＤＮＡの代わりにゲノム上の標的領域のＰＣＲ増幅を実行する。
一態様では、本発明は化合物に対する耐性に関連する機能的エレメントをスクリーニン
グする方法に関し、
（ａ） 上記のいずれかのライブラリーを、Ｃａｓタンパク質を含むように改造された細胞集団に導入し、ここで、該細胞集団の各細胞は１つ以下のガイドＲＮＡを含むこと；
（ｂ） 化合物により細胞集団を処理すること；及び
（ｃ） 処理前と比較して、前記化合物で処理した後のガイドＲＮＡの表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を決定することにより、ガイドＲＮＡを濃縮することにより、前記化合物に対する耐性に関連するゲノム部位を特定すること；
（ｄ） シークエンシングのために、標的された１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数のｃＤＮＡまたはＤＮＡ配列を増幅すること；
（ｅ） シークエンシングリードを標的された遺伝子の参照配列にマッピングすること；
（ｆ） リードをフィルターし、ミスセンス突然変異またはインフレーム欠失を有するリードのみを残すこと；および
（ｇ） バイオインフォマティクスプロセスを適用することにより、化合物に対する各ア
ミノ酸またはヌクレオチドの抵抗性の重み付けを決定されることを、含む。
ある実施形態では、バイオインフォマティクスプロセスは以下を含む：
（ｈ） ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異比率を以下のように計算する：
グする方法に関し、
（ａ） 上記のいずれかのライブラリーを、Ｃａｓタンパク質を含むように改造された細胞集団に導入し、ここで、該細胞集団の各細胞は１つ以下のガイドＲＮＡを含むこと；
（ｂ） 化合物により細胞集団を処理すること；及び
（ｃ） 処理前と比較して、前記化合物で処理した後のガイドＲＮＡの表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を決定することにより、ガイドＲＮＡを濃縮することにより、前記化合物に対する耐性に関連するゲノム部位を特定すること；
（ｄ） シークエンシングのために、標的された１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数のｃＤＮＡまたはＤＮＡ配列を増幅すること；
（ｅ） シークエンシングリードを標的された遺伝子の参照配列にマッピングすること；
（ｆ） リードをフィルターし、ミスセンス突然変異またはインフレーム欠失を有するリードのみを残すこと；および
（ｇ） バイオインフォマティクスプロセスを適用することにより、化合物に対する各ア
ミノ酸またはヌクレオチドの抵抗性の重み付けを決定されることを、含む。
ある実施形態では、バイオインフォマティクスプロセスは以下を含む：
（ｈ） ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異比率を以下のように計算する：
（ｉ）インフレーム欠失を含む断片について、各アミノ酸の欠失比率を以下のように計算
する：
する：
（ｊ） インフレーム欠失をデコードし、また欠失されたアミノ酸の数により、単一のアミノ酸欠失のみであれば「運転者の欠失」、複数のアミノ酸欠失であれば「乗客の欠失」としてインフレーム欠失を分類する。
（ｋ） 実験群と対照群との間の倍数変化を計算し、
（ｌ） 各アミノ酸の必須性スコアを以下のように算出する：
（１） 突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各
アミノ酸についてスコア突然変異＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を計算する、
（２） 欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、運転者の欠
失と乗客の欠失に次のように重みを付ける：
欠失倍数変化＝運転者の倍数変化＋α＊乗客の倍数変化、続いて、１００回並べ替えてヌ
ル分布を確立し、且つアミノ酸ごとにスコア欠失＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を計算する、
（３） スコア突然変異及びスコア欠失を以下のように正規化する：
（ｋ） 実験群と対照群との間の倍数変化を計算し、
（ｌ） 各アミノ酸の必須性スコアを以下のように算出する：
（１） 突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各
アミノ酸についてスコア突然変異＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を計算する、
（２） 欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、運転者の欠
失と乗客の欠失に次のように重みを付ける：
欠失倍数変化＝運転者の倍数変化＋α＊乗客の倍数変化、続いて、１００回並べ替えてヌ
ル分布を確立し、且つアミノ酸ごとにスコア欠失＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を計算する、
（３） スコア突然変異及びスコア欠失を以下のように正規化する：
（４） スコア突然変異及びスコア欠失の重み付けを計算する：
ａ ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ａ ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
（５） 必須性スコアの計算は以下のとおりである：
必須スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ＋ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
本明細書の方法では、前記化合物は、真核細胞内の１つ以上のゲノム領域またはタンパク質の構造および／または機能に影響を与える任意の化合物であり得る。例えば、それは、本明細書に例示されるように、毒素または薬物であり得る。一部の実施形態では、真核細胞はヒト細胞である。
必須スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ＋ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
本明細書の方法では、前記化合物は、真核細胞内の１つ以上のゲノム領域またはタンパク質の構造および／または機能に影響を与える任意の化合物であり得る。例えば、それは、本明細書に例示されるように、毒素または薬物であり得る。一部の実施形態では、真核細胞はヒト細胞である。
一局面では、本発明は、目的タンパク質の機能的要素を同定するための方法であり、当
該方法は、細胞集団に導入されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いてタンパク質をコ
ードするゲノム遺伝子を破壊することによる目的タンパク質の飽和突然変異誘発を行い、
ＤＮＡシークエンシングによる表現型変化に関する破壊されたゲノム部位を決定し、標的遺伝子のｃＤＮＡをシークエンシングし、表現型の変化を引き起こすインフレーム突然変異を検索すること、および単一のアミノ酸分解能で目的タンパク質の機能的エレメントを同定するためのバイオインフォマティクスプロセスを確立し、シークエンシングデータを分析することを含む。この方法では、目的のタンパク質の機能的エレメントは、その天然の生物学的背景において同定される。
該方法は、細胞集団に導入されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いてタンパク質をコ
ードするゲノム遺伝子を破壊することによる目的タンパク質の飽和突然変異誘発を行い、
ＤＮＡシークエンシングによる表現型変化に関する破壊されたゲノム部位を決定し、標的遺伝子のｃＤＮＡをシークエンシングし、表現型の変化を引き起こすインフレーム突然変異を検索すること、および単一のアミノ酸分解能で目的タンパク質の機能的エレメントを同定するためのバイオインフォマティクスプロセスを確立し、シークエンシングデータを分析することを含む。この方法では、目的のタンパク質の機能的エレメントは、その天然の生物学的背景において同定される。
この方法において、インフレーム突然変異が、インフレーム欠失及びミスセンス特異的
突然変異である。一部の実施形態では、前記破壊は細胞集団内の各細胞に一つ又は複数のベクターのベクターシステムを導入することを含み、前記ベクターシステムが、
Ｉ．調節的エレメントに作動可能に接続された、Ｃａｂタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、および
ＩＩ．タンパク質をコードするゲノム遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、を含む、操作された非天然のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。
突然変異である。一部の実施形態では、前記破壊は細胞集団内の各細胞に一つ又は複数のベクターのベクターシステムを導入することを含み、前記ベクターシステムが、
Ｉ．調節的エレメントに作動可能に接続された、Ｃａｂタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、および
ＩＩ．タンパク質をコードするゲノム遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、を含む、操作された非天然のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。
なお、成分ＩとＩＩは同じまたは異なるベクター上にあり、転写された、ガイド配列を含むガイドＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとゲノム遺伝子の標的配列とは配列特異的に結合するようにガイドし、これにより、Ｃａｓタンパク質によるゲノム領域の切断を誘導する。
一実施形態では、前記一つ以上のベクターはプラスミドベクターである。一実施形態では、調節的エレメントは誘導性プロモーターである。一実施形態では、ゲノム遺伝子内の１０００塩基対ごとに、ガイドＲＮＡは、ＰＡＭ配列の上流にある非重複切断部位を含む少なくとも１００のゲノム配列を標的とする。一実施形態では、各ガイドＲＮＡは、ＤＳＢサイトの周囲約１０ｂｐ（例えば、７～１３ｂｐ、例えば、８、９、１０、１１、１２ｂｐ）に影響を及ぼすように設計される。一実施形態では、前記ライブラリーは、ゲノム遺伝子内の各ＰＡＭ配列の上流にあるゲノム配列を標的とするガイドＲＮＡが含まれる。一実施形態では、ＰＡＭ配列は、少なくとも一種類のＣａｓタンパク質に特異的である。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのガイドＲＮＡは、少なくとも１つの
Ｃａｓタンパク質の特異的な複数のＰＡＭ配列に基づいて選択される。一実施形態では、前記目的遺伝子の表現は、前記複数のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡの中の少なくとも一つのガイドＲＮＡの前記標的によって変化される。一実施形態では、前記標的はゲノム遺伝子のＮＨＥＪを引き起こす。
Ｃａｓタンパク質の特異的な複数のＰＡＭ配列に基づいて選択される。一実施形態では、前記目的遺伝子の表現は、前記複数のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡの中の少なくとも一つのガイドＲＮＡの前記標的によって変化される。一実施形態では、前記標的はゲノム遺伝子のＮＨＥＪを引き起こす。
一局面では、本発明は、例えば本発明のいずれかの方法により、タンパク質のゲノム遺
伝子の機能に重要なゲノム部位またはアミノ酸サイトとして同定された機能的エレメント
を突然変異させることにより遺伝子またはタンパク質を修飾する方法に関する。該方法に
よってタンパク質の機能に重要であると同定されたアミノ酸サイトにおいてアミノ酸置換
および／または欠失を有する変異体タンパク質も検討される。
伝子の機能に重要なゲノム部位またはアミノ酸サイトとして同定された機能的エレメント
を突然変異させることにより遺伝子またはタンパク質を修飾する方法に関する。該方法に
よってタンパク質の機能に重要であると同定されたアミノ酸サイトにおいてアミノ酸置換
および／または欠失を有する変異体タンパク質も検討される。
本明細書に記載される方法およびツールは、ゲノム編集に関心があり得る関連する機能単位の同定を可能にするために、ゲノム領域の体系的な調査に関する。したがって、一態様では、本発明は、ゲノム領域を調査する方法を提供し、該方法は、ディープスキャニング突然変異誘発ライブラリーを生成することおよびライブラリーを導入することによって変更された細胞集団の表現型の変化について調査することを含む。
したがって、本発明の一態様は、複数のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡを含むことができるディープスキャン突然変異誘導ライブラリーを含み、前記ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡは、少なくとも１つの連続ゲノム領域内でゲノム配列を標的化することができるガイド配列を含むことができる。より具体的には、想定されるライブラリーのガイドＲＮＡは、ゲノム領域内の代表的な数のゲノム配列を標的とすべきである。例えば、ガイドＲＮＡは、想定されるゲノム領域内の少なくとも５０個、より具体的には少なくとも１００個のゲノム配列を標的とすべきである。
ゲノム領域を標的とする能力は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）の存在によって決定される；すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列である。ＰＡＭの正確な配列および長さの要件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素によって異なるが、ＰＡＭは通常、プロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２～５塩基対の配列である。当技術分野で既知のＰＡＭ配列であり、且つ当業者は所定のＣＲＩＳＰＲ酵素に対するＰＡＭ配列を同定することができる。具体的な実施形態では、ＰＡＭ 配列は、少なくとも一つのＣａｓタンパク質に特異的であるように選択され得る。代替実施形態では、ガイド配列ＲＮＡは、少なくとも１つのＣａｓタンパク質に特異的な複数のＰＡＭ配列に基づいて選択され得る。
具体的な実施形態では、ライブラリーは、ゲノム領域内の１０００塩基対ごとのＰＡＭ配列の上流の非重複切断部位を含む少なくとも１００のゲノム配列を含む。具体的な実施形態では、ライブラリーは連続ゲノム領域内の各ＰＡＭ 配列の上流のゲノム配列を標的とするガイドＲＮＡを含む。
該ライブラリーには、生物体の目的ゲノム領域を標的とするガイドＲＮＡを含む。本発明のいくつかの実施形態において、生物体または被験者は、真核生物（ヒトを含む哺乳動物を含む）または非ヒト真核生物または非ヒト動物または非ヒト哺乳動物である。一部の実施形態では、生物体または被験者は非ヒト動物であり、節足動物、例えば昆虫であってもよいし、線虫であってもよい。本発明のいくつかの方法において、生物体または被験者は植物である。本発明のいくつかの方法において、生物体または被験者は、哺乳動物、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物は、例えば、げっ歯動物（好ましくは、マウスまたはラット）、有蹄類動物、または霊長類動物であり得る。本発明のいくつかの方法において、生物体または被験者は、微細藻類を含む藻類または真菌である。
本明細書で提供される方法およびツールは、連続ゲノム領域を調べるのに特に有利である。そのような連続的なゲノム領域はゲノム全体までを含むことができるが、特に有利なのは、ゲノムの機能的エレメントが調査される方法であり、これは通常、ゲノムＤＮＡの５０～１００ｋｂの領域などのゲノムの限られた領域をカバーする。特定の目的は、コードゲノム領域の調査にこの方法の使用することである。当業者であれば、本発明の方法を使用して、例えば、目的遺伝子のコード領域の５’および３’領域のようなノンコーディングゲノム領域を調査することができ、これは、目的のタンパク質を調査した場合のｃＤＮＡではなく、プランを改変することによってゲノム上の標的領域をＰＣＲ増幅することが理解できる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、連続する目的のゲノム領域内の複数の配列を特異的に標的化するために本発明で使用することができる。前記標的化は通常、工学操作された、非自然的に存在するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む１つまたは複数のベクターのベクターシステムを細胞集団の各細胞に導入することを含み、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、少なくとも１種類のＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡを含む。これらの方法では、Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡはシステムの同じまたは異なるベクターに配置され、各細胞に組み込まれることができ、したがって、各ガイド配列は、細胞集団の各細胞における連続ゲノム領域内の配列を標的とする。細胞内での発現を保証するために、Ｃａｓタンパク質は調節的エレメントと動作可能に連結されており、より具体的に、細胞集団の前記細胞で発現するプロモーターに適する。具体の実施形態では、プロモーターは、ドキシサイクリン誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターである。細胞集団の細胞で転写されると、ガイド配列を含むガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを連続ゲノム領域の標的配列と配列特異的に結合するようにガイドする。一般に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの結合は、Ｃａｓタンパク質による連続ゲノム領域の切断を誘導する。
本出願は、表現型の変化に関連する機能的エレメントをスクリーニングする方法を提供する。表現型の変化は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質および／または細胞機能レベルを含む一つまたは複数のレベルで検出することができる。表現型の変化は、細胞の生存、成長、免疫応答、毒素や薬物などの化合物に対する耐性において検出することができる。
表現型の変化に関連するゲノム部位をスクリーニングする方法は、本明細書で企図される目的のゲノム領域を標的とするガイドＲＮＡのライブラリーを細胞集団に導入することを含む。一般に、前記細胞はＣａｓタンパク質を含むように改造される。しかしながら、具体の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はまた、ガイドＲＮＡと同時に導入することができる。本明細書で企図される方法において、細胞集団にライブラリーを導入して、集団の各細胞が一つ以下のガイドＲＮＡを含むようにする。その後、細胞は通常、観察された表現型に基づいて選別され、それらが細胞において表現型の変化を引き起こすか否かに基づいて、表現型の変化に関連するゲノム部位が同定される。一般的に、この方法では、表現型に基づいて細胞を少なくとも２つのグループに分類し、各グループに存在するガイドＲＮＡの相対的な表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を決定し、かつ表現型の変化に関連するゲノム部位を各グループに存在する指導ＲＮＡの表現によって決定される。
本出願では、化合物に対する耐性に関連するゲノム部位をスクリーニングする方法も提供し、これにより、細胞が化合物と接触し、前記化合物に対する表現型応答に基づいてスクリーニングされる。より具体的には、このような方法は、本明細書で企図されるＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムガイドＲＮＡのライブラリを細胞集団（Ｃａｓタンパク質を含むように改造された、または同時にＣａｓタンパク質が導入された）に導入し、この化合物で細胞集団を処理すること；また、初期の時点と比較して後の時点での化合物による処置したガイドＲＮＡの表現を決定する。これらの方法では、化合物耐性に関連するゲノム部位は、濃縮されたガイドＲＮＡによって決定される。
具体の実施形態では、前記方法は、ゲノム部位を含む領域のシークエンシングまたは全ゲノムのシークエンシングをさらに含み得る。
本出願はまた、本発明の方法を使用して薬剤耐性に関連する機能的エレメントをスクリーニングする方法に関する。
本明細書に記載される他の実施形態は、本明細書に開示される方法によって同定された遺伝子の一つまたは複数の機能的領域のゲノム破壊のための治療方法およびツールに関する。本明細書に記載のこれらおよびさらなる実施形態は、部分的にゲノム領域または目的タンパク質における機能領域の発見に基づく。
本明細書に例示された具体の方法では、カバー密度を最大化するために、２つのタイプのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、即ちＮＧＧおよびＮＡＧは共にｓｇＲＮＡの設計に含まれる。抗がん剤または毒素を用いたライブラリースクリーニングの後、ゲノムＤＮＡを抽出してｓｇＲＮＡバーコードの従来のＰＣＲ増幅に用い、続いてＮＧＳ分析を行う。同時に、ＲＮＡ逆転写からの標的遺伝子のＰＣＲ増幅を行い、長さ約２５０ｂｐの断片化されたＰＣＲ産物がＮＧＳを受ける。次に、野生型配列、またはアウトフレーム挿入欠落の断片やインフレーム挿入の配列を含む配列をフィルターし、部位特異的突然変異またはインフレーム欠失を含む配列のみが、さらなる分析のために保持されるようにする。部位特異的突然変異については、本発明者らは、同義またはナンセンス変異をスクリーニングし続け、ミスセンス突然変異を含む突然変異のみを保持した。インフレーム欠失の場合、各リードによって引き起こされたアミノ酸欠失の数によって突然変異タイプを分類し、単アミノ酸欠失のみが含む場合が「運転者の欠失」、複数のアミノ酸欠失を含む場合が「乗客の欠失」として分類した。欠失パターンをデコードした後、欠失倍数変化を計算した。同様に、ミスセンス突然変異の倍数変化も計算した。次に、標的遺伝子にウィンドウのスライドを適用することによって、フィルターされたリードのすべての情報を用いて、ミスセンス突然変異、運転者の欠失、および乗客の欠失の倍数変化の加重平均値を計算した。次に、ランク付けによって加重平均値の有意水準を推定し、各アミノ酸の必須スコアを得た。このスコアは、インフレーム欠失および部位特異的突然変異の状況をカウントし、各アミノ酸の必須性を定量化し、機能的重要度に従ってアミノ酸をランク付けすることを可能にする。同時に、各アミノ酸のミスセンス突然変異のパーセンテージを計算することによってアミノ酸置換パターンの取得を試みた。この単純化されたワークフローおよびバイオインフォマティクスプロセスは、天然の生物学的環境におけるタンパク質の重要な機能的エレメントの同定を可能にすることが目的である。
本発明は、具体の実施形態および特定の図面を参照して説明されるが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。請求項における任意の参照符号は、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。記載される図面は概略的なものに過ぎず、非限定的である。図面において、説明の目的のために、いくつかのエレメントのサイズは誇張され、縮尺通りに描かれていない場合がある。用語「含む」は、本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、他の要素またはステップを排除しない。単数名詞に言及する場合、不定冠詞または定冠詞「一つ（ａ）」または「一種（ａｎ）」、「前記（ｔｈｅ）」を使用し、特に明記しない限り、該名詞の複数形を含む。
特に明記がない限り、本発明の実施は、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム学および組換えＤＮＡの従来の技術を当技術の範囲内で採用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈとＭａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，バージョン２（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集，（１９８７））； ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ。）：ＰＧＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓとＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編集（１９９５）），ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ編集。（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．ＬＦｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照してください。
以下の用語または定義の提供は、本発明の理解に役立つ。本明細書で明確に定義されな
い限り、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の当業者と同じ意味を有する。当業者は特に本分野の定義および用語に関するＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，バージョン２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）； およびＡｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９９）を参照できる。
遺伝学において、「ナンセンス突然変異」とはＤＮＡ配列の部位特異的突然変異であり、早期終止コドン、または転写されたｍＲＮＡのナンセンスコドン、および切断された、不完全な、通常は非機能的タンパク質産物を招く。ナンセンス突然変異の機能的効果は、コードＤＮＡ中の終止コドンの位置次第である。例えば、ナンセンス突然変異の役割は、ナンセンス突然変異がどの程度元の終止コドンに接近し、およびタンパク質の機能的サブドメインが影響を受ける程度に依存する。ナンセンス突然変異は、単一のヌクレオチドの変化が異なるアミノ酸置換を引き起こす部位特異的突然変異である「ミスセンス突然変異」とは異なる。
い限り、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の当業者と同じ意味を有する。当業者は特に本分野の定義および用語に関するＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，バージョン２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）； およびＡｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９９）を参照できる。
遺伝学において、「ナンセンス突然変異」とはＤＮＡ配列の部位特異的突然変異であり、早期終止コドン、または転写されたｍＲＮＡのナンセンスコドン、および切断された、不完全な、通常は非機能的タンパク質産物を招く。ナンセンス突然変異の機能的効果は、コードＤＮＡ中の終止コドンの位置次第である。例えば、ナンセンス突然変異の役割は、ナンセンス突然変異がどの程度元の終止コドンに接近し、およびタンパク質の機能的サブドメインが影響を受ける程度に依存する。ナンセンス突然変異は、単一のヌクレオチドの変化が異なるアミノ酸置換を引き起こす部位特異的突然変異である「ミスセンス突然変異」とは異なる。
「同義置換または突然変異」とは、タンパク質をコードする遺伝子のエクソンにおける一つの塩基の別の塩基に進化的置換であり、その結果、生成されたアミノ酸配列は修飾されていない。これが可能なのは、遺伝暗号が「縮重」しているためであり、これは一部のアミノ酸は複数の３塩基対コドンによってコードされていることを意味する。特定のアミノ酸の一部のコドンは、同じアミノ酸をコードする他のコドンとは一つの塩基対しか異なるものがあるので、「通常」塩基の代わりに一つの代替物を用いる突然変異は、遺伝子を翻訳する際、同じアミノ酸が成長中のポリペプチド鎖に混ぜてしまうことを招く。
タンパク質は、あってもなくてもよい領域と必須領域の両方が含まれ、必須領域の突然変異がその機能を失う。対応するＤＮＡコード配列では、リーディングフレームのシフトを引き起こす突然変異のいずれかは、突然変異が重要なサイト（キーサイト）で発生するか非重要なサイトで発生するかに関係なく、遺伝子発現を破壊することによってその機能を破壊する高い可能性がある。抗がん剤または細菌毒素のタンパク質をターゲットした場合、インフレーム欠失または部位特異的突然変異（ナンセンス突然変異を除く）は、そのような突然変異が非重要なサイトで発生した場合、耐性表現型を生成しない。非必須遺伝子について、各対立遺伝子の破壊は「機能喪失表現型」を実現するために必要な条件である。これらの劣性突然変異タイプはフレームシフト挿入欠失、インフレーム欠失、またはキーサイトに影響を及ぼすミスセンス点突然変異のうちの１つである可能性がある。必須遺伝子について、唯一の薬剤耐性シナリオは、タンパク質の発現と細胞活性に対する重要な役割を変更することなく、インフレーム欠失またはミスセンス突然変異が薬物標的のキーサイトに影響を与える。これらの突然変異は優性であるため、「機能獲得表現型」を達成するには、１つの対立遺伝子の適切な突然変異で十分である。
野生型二倍体細胞において、遺伝子を有する二つの野生型対立遺伝子は、いずれも正常な遺伝子産物を生じる。ヘテロ接合体（優性または劣性をテストするための重要な遺伝子型）において、単一の野生型対立遺伝子は、野生型表現型を生じるのに十分な正常遺伝子産物を提供することができる。そのような場合、“機能喪失型突然変異”は劣性である。ある場合によっては、細胞は単一の野生型対立遺伝子の活性レベルを「アップレギュレーション」ことができ、ヘテロ接合子における野生型遺伝子産物の総量がホモ接合の野生型の半分を超える。しかしながら、突然変異イベントは、該遺伝子にいくつかの新しい機能を付与する。ヘテロ接合体では、新しい機能が表現されるので、「機能獲得型突然変異」は優性対立遺伝子のように作用し、何らかの新たな表現型を生成する可能性が高い。
「飽和突然変異誘発」は、単一のコドンまたはコドンセットをランダム化して、その位置に全ての可能なアミノ酸を生成するランダム突然変異誘発技術である。
「コドン」は三つのヌクレオチドのセットであり、あるアミノ酸をコードするトリプレットである。最初のコドンがリーディングフレームを確立し、新しいコドンが始まる。タンパク質のアミノ酸主鎖配列は連続するトリプレットで定義される。コドンは、タンパク質合成のための遺伝情報の翻訳の鍵である。ｍＲＮＡの翻訳が開始されると、「リーディングフレーム」を設定し、トリプレットが次々と読み取られる間に「リーディングフレーム」を維持する。遺伝子コードの読み取りは、ｍＲＮＡのコドンを監視する三つのルールに縛られる。まず、コドンは５’から３’の方向に読み取られる。第二に、コドンは重複せず、かつ情報にギャップはない。上記のように、最後のルールは、情報を「リーディングフレーム」に固定されて翻訳することである。
「フレームシフト突然変異」は、フレームエラーまたはリーディングフレームシフトとも呼ばれ、ＤＮＡ配列における３で割り切れない数ヌクレオチドのｉｎｄｅｌ（挿入または欠失）によって引き起こされる遺伝突然変異である。コドンの遺伝子発現のトリプレット性質のために、挿入または欠失はリーディングフレームを変更する可能性があり、その結果、本来とはまったく異なる翻訳になってしまう。フレームシフト突然変異は通常、突然変異後にコドンが異なるアミノ酸をコードするように読み取られる。フレームシフト変異はまた、配列内で遭遇する最初の終止コドン（“ＵＡＡ”、“ＵＧＡ”または“ＵＡＧ”）を変化させる。生じるペプチドは異常に短いか異常長い可能性があり、かつ機能しない可能性が高い。
「アウトフレーム挿入欠失（Ｏｕｔ－ｏｆ－ｆｒａｍｅ ｉｎｄｅｌ）」は遺伝子コードが「リーディングフレーム」の外側に挿入および／または欠損（ｉｎｄｅｌ）を読み取らせることを引き起こすものと指し、「インフレーム欠失」はＤＮＡ配列の中で３で割り切れる数のヌクレオチドの欠失であるため、この欠失はリーディングフレームを変更しない。
本明細書における「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、一般的に、Ｃａｓ 遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト（ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ ）配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムのコンテキストでの「ダイレクトリピート（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ）」とｔｒａｃｒＲＮＡプロセッシングの部分的なダイレクトリピートを含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムのコンテキストでは「スペーサー配列（ｓｐａｃｅｒ）」とも呼ばれる”）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列およびトランスクリプトを含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与したり、または活性化を指示するトランスクリプトやその他の要素を指す。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の要素は、タイプＩ、タイプＩＩ、またはタイプＩＩＩ のＣＲＩＳＰＲシステムから得られる。
発現ベクター内で、「動作可能に連結された」とは、目的ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システムにおいて、またはベクターが標的細胞に導入された際に、標的細胞の中におる）で目的の調節配列との連結を示すことが意図される。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成における文脈では、「標的配列」とは、ガイド配列がそれと相補的に設計されていることを示す配列であり、標的配列とガイド配列とのハイブリッドがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリッドを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性がある限り、完全な相補性は必要ではない。
一般的に内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリッドし、一つまたは複数のＣａｓタンパク質と複合体を形成するガイド配列を含む）を形成することは、標的序列の中や近く（例えば１個や２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、５０個またはそれ以上の塩基対以内離れたところ）の１つまたは２つの鎖の切断をもたらす。理論に拘束されることを望まないが、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全部または部分（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５またはそれ以上のヌクレオチド）を含むか、またはこれらから構成されてもよく、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成してもよい、例えば、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ってｔｒａｃｒメイト（ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ）配列の全部または一部とハイブリッドすることによって、前記ｔｒａｃｒメイト配列がガイド配列に作動可能に連結された。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列が十分な相補性を有し、ハイブリッドしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与する。標的配列と同様に、機能を達成するのに十分である限り、完全な相補性は必要とされない。いくつかの実施形態において、最適にアラインメントされた場合、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒメイト配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を有する。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターを宿主細胞に導入して、ＣＲＩＳＰＲシステムのエレメントの発現が１つ以上の標的サイトでＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するようにガイドする。別の実施形態において、宿主細胞は、Ｃａｓ９および／またはＯＣＴ１を安定して発現するように工学操作される。
一般に、指示配列は、任意のポリヌクレオチド配列であり、それは、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有し、標的配列とハイブリッドし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を指示する。一部の実施形態では、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適なアラインメントを行う場合、指示配列とその対応する標的配列との間の相補性は、約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム，Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｉｍｓｃｈアルゴリズム，Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒに基づいて変換のアルゴリズム（例えばＢｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ），ＣｌｕｓｔａｌＷ， Ｃｌｕｓｔａｉ Ｘ， ＢＬＡＴ， Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ （Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＥＬＡＮＤ （Ｉ！ｆｕｍｍａ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ），ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）。一部の実施形態では、ガイド配列の長さは、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５個またはそれ以上のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ガイド配列の長さは、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、１１、１０個またはそれ以下のヌクレオチドである。ガイド配列は、ＣＲ１ＳＰＲ複合体と標的配列の特異的結合をガイドする能力を任意の適切な測定方法により評価することができ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムの成分（テストされるガイド配列を含む）を対応する標
的配列を持つ宿主細胞に提供することができ、例えば、以下のように行われる：ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターでトランスフェクトし、次に、標的配列内で優先切断の評価を行い、例えば、本明細書で説明するＳｕｒｖｅｙｏｒ測定によって行われる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は以下のように試験管内で評価することができる：テストされるガイド配列およびテストガイド配列とは異なるコントロールガイド配列を含む、標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素が提供され、そして結合またはテストとコントロールガイド配列との反応との間の標的配列の切断速度を比較する。他の測定も可能であり、当業者であれば思いつくであろう。
的配列を持つ宿主細胞に提供することができ、例えば、以下のように行われる：ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターでトランスフェクトし、次に、標的配列内で優先切断の評価を行い、例えば、本明細書で説明するＳｕｒｖｅｙｏｒ測定によって行われる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は以下のように試験管内で評価することができる：テストされるガイド配列およびテストガイド配列とは異なるコントロールガイド配列を含む、標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素が提供され、そして結合またはテストとコントロールガイド配列との反応との間の標的配列の切断速度を比較する。他の測定も可能であり、当業者であれば思いつくであろう。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部である（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のドメイン）。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、および任意の２つのドメイン間の任意リンカー配列を含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合できるタンパク質ドメインの例には、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列およびメチル化酵素活性、脱メチル化酵素活性、転写活性化活性、転写阻害活性、転写放出因子活性、歴史的（ｈｉｓｔｏｒｉｃ）修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインがあるがこれに限定されない。
一部の態様では、本発明は、１つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載の１つまたは複数のベクター、１つまたは複数のトランスクリプト、および／またはそこから転写された１つまたは複数のタンパク質）を宿主細胞に送達する方法を提供する。本発明は、ＤＮＡに基づくゲノムを標的修飾するための基本プラットフォームの役割を果たす。ウイルス、リポソーム、エレクトロポレーション、顕微鏡注射、およびコンジュゲーションを含むがこれらに限定されない多くの送達システムと組み合わせることができる。
一部の態様では、本発明はさらに、これらの方法によって生成された細胞、およびそれらの細胞によって産生される生物体（例えば、動物、植物、または真菌）をさらに提供する。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ガイド配列と組み合わせて（かつ選択的にガイド配列と複合する）細胞に送達される。従来のウイルスおよび非ウイルスによる遺伝子導入法は、哺乳動物細胞または標的組織に核酸を導入するために利用可能である。このような方法は、ＣＲＩＳＰＲシステムのコンポーネントをコードする核酸の培養物や宿主生物体の細胞に投与するために使用することができる。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターのトランスクリプト）、裸の核酸、およびリポソームなどの送達ベクターと複合した核酸が含まれる。ウィルス送達システムには、細胞に送達されるエピソーム（ｅｐｉｓｏｍａｌ）または組み込まれたゲノムを持つＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。
ｇＲＮＡの設計が比較的容易であることと、Ｃａｓ９が任意の遺伝子座を実際に修飾する能力により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は本発明においてスクリーニング実験に用いられる。スクリーニング実験では、ＣＲＩＳＰＲがプールされたライブラリーまたはＣＲＩＳＰＲライブラリーは、数千個のプラスミドで構成されており、各プラスミドには、標的タンパク質の全長に亘る異なる標的配列に向けられたｇＲＮＡが含まれる。具体的には、標的タンパク質の飽和突然変異誘発を達成するために、ｓｇＲＮＡは２種類のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、即ちＮＧＧおよびＮＡＧを含むように設計されており、かつ各ｓｇＲＮＡ はＤＳＢサイトの周囲の１０－ｂｐに影響を与えて、カバー密度を最大にするように設計された。ＣＲＩＳＰＲスクリーニング実験は順遺伝的スクリーニングであってもよく、この中で望ましい表現型は既知するが、タンパク質のキーとなるアミノ酸は既知しない。一般的に、ＣＲＩＳＰＲに基づくスクリーニングは、レンチウイルスを用いて「プールされた」ｇＲＮＡライブラリーを哺乳類のＣａｓ９発現細胞株に送することによって実行される。ｇＲＮＡライブラリーで形質導入した後、目的表現型（例えば生存、薬物や毒素耐性、成長や増殖）について突然変異細胞をスクリーニングして、タンパク質の機能と望ましい表現型に重要なアミノ酸を同定する。
プールされたレンチウイルスｇＲＮＡライブラリーは、レンチウイルストランスファーベクターの異種混合物であり、各ベクターは、特定配列に対する単一のｇＲＮＡをコードし、各配列を標的とするいくつかのｇＲＮＡがライブラリーに存在する。
プールされたレンチウイルスＣＲＩＳＰＲライブラリーを用いたスクリーニングの実施は、ライブラリー増幅、細胞形質導入、遺伝子スクリーニング、およびデータ分析を含む多段階プロセスである。簡単に言うと、ｇＲＮＡを含むプラスミドの初期ストックを増幅してＤＮＡの総量を増加させ、増幅されたライブラリーを使って個別のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９を含むレンチウイルスを生成する。単一ベクターライブラリーについては、単一のｇＲＮＡおよびＣａｓ９を含むレンチウイルスで野生型細胞を形質導入することによって、突然変異細胞を１つのステップで作製した。多くの場合、マルチベクターライブラリーでは、ｇＲＮＡライブラリーを用いてＣａｓを発現させる細胞が形質導入される。両方の場合において、形質導入された細胞は、ｇＲＮＡとＣａｓ９を含む細胞を濃縮するために選択され、得られた突然変異細胞集団を目的の特定の表現型についてスクリーニングされた。最終集団からのゲノムＤＮＡの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、スクリーニング中に濃縮または消費されたｇＲＮＡを同定する。最後にバイオインフォマティクスプロセスを設計して得られたデータを分析する。
ライブラリ増幅
通常に、プールされたレンチウイルスＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡライブラリーはＤＮＡアリコートとして送達され、多くの場合、ＤＮＡ の量は実験に使用するには不十分である。このような場合、最初のステップはライブラリーを「増幅」することであり、これは全グループにおける個々のｇＲＮＡプラスミドの相対的な割合を維持しながらプラスミドＤＮＡの量を増やすことを意味する。ライブラリーＤＮＡは細菌に形質転換され、細菌の中で一定期間増殖させた後に、プラスミドＤＮＡを回収することで増幅される。ほとんどのライブラリーでは、エレクトロポレーションを使用すると転換効率が向上するため、化学形質転化の代わりにエレクトロポレーションを使用される。多くの場合、転化された細菌は、適切な抗生物質を含むＬＢ寒天プレート上で増殖し、これは、プレート上での増殖がライブラリーの表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を維持し、増殖中に急速に増殖するプラスミドが濃縮される可能性を低下させるのに役立つためである。形質転換および増幅されたｇＲＮＡプラスミドの数の推定値は、希釈プレートアッセイを行うことによって得ることができる。このために、形質転換されたサンプルを希釈し、抗生物質を含むＬＢプレートにプレーティングし、プレート上で生じる細菌コロニーの数を、増幅されたライブラリーに存在するｇＲＮＡプラスミドの総数の間接的な測定値として使用した。この測定は重要な制御手段として、機能スクリーニングに使用される前に最終的に増幅されたライブラリーの内容を把握する。
通常に、プールされたレンチウイルスＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡライブラリーはＤＮＡアリコートとして送達され、多くの場合、ＤＮＡ の量は実験に使用するには不十分である。このような場合、最初のステップはライブラリーを「増幅」することであり、これは全グループにおける個々のｇＲＮＡプラスミドの相対的な割合を維持しながらプラスミドＤＮＡの量を増やすことを意味する。ライブラリーＤＮＡは細菌に形質転換され、細菌の中で一定期間増殖させた後に、プラスミドＤＮＡを回収することで増幅される。ほとんどのライブラリーでは、エレクトロポレーションを使用すると転換効率が向上するため、化学形質転化の代わりにエレクトロポレーションを使用される。多くの場合、転化された細菌は、適切な抗生物質を含むＬＢ寒天プレート上で増殖し、これは、プレート上での増殖がライブラリーの表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を維持し、増殖中に急速に増殖するプラスミドが濃縮される可能性を低下させるのに役立つためである。形質転換および増幅されたｇＲＮＡプラスミドの数の推定値は、希釈プレートアッセイを行うことによって得ることができる。このために、形質転換されたサンプルを希釈し、抗生物質を含むＬＢプレートにプレーティングし、プレート上で生じる細菌コロニーの数を、増幅されたライブラリーに存在するｇＲＮＡプラスミドの総数の間接的な測定値として使用した。この測定は重要な制御手段として、機能スクリーニングに使用される前に最終的に増幅されたライブラリーの内容を把握する。
細胞の形質導入
ライブラリーが増幅され、代表性が確認されると、次のステップは、プールされたｇＲＮＡライブラリーを含有するレンチウイルスを作製することである。一般的に、ＣＲＩＳＰＲライブラリー及び適切なパッケージングおよびエンベロープベクター（例えば、Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏの実験室からのｐｓＰＡＸ２、Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃１２２６０、ｐＭＤ２．Ｇ、Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏの実験室からのＡｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃１２２５９、ＡｄｄｇｅｎｅからのｐＶＳＶＧとｐＲ８．７４）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトする。あるいは、レンチウイルスパッケージング細胞型はｇＲＮＡライブラリーのみでトランスフェクトされてもよい。トランスフェクトしてから４８時間以降に培地を収集することを提案する解決手段が多いが、最大ウイルス力価は特定のライブラリーに応じて変化するので、ある程度の最適化を必要とする可能性がある。
ライブラリーが増幅され、代表性が確認されると、次のステップは、プールされたｇＲＮＡライブラリーを含有するレンチウイルスを作製することである。一般的に、ＣＲＩＳＰＲライブラリー及び適切なパッケージングおよびエンベロープベクター（例えば、Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏの実験室からのｐｓＰＡＸ２、Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃１２２６０、ｐＭＤ２．Ｇ、Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏの実験室からのＡｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃１２２５９、ＡｄｄｇｅｎｅからのｐＶＳＶＧとｐＲ８．７４）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトする。あるいは、レンチウイルスパッケージング細胞型はｇＲＮＡライブラリーのみでトランスフェクトされてもよい。トランスフェクトしてから４８時間以降に培地を収集することを提案する解決手段が多いが、最大ウイルス力価は特定のライブラリーに応じて変化するので、ある程度の最適化を必要とする可能性がある。
形質導入ステップの目的は、Ｃａｓ９および単一ｇＲＮＡを安定的に共発現する突然変異細胞集団を生成することである。１つのステップにおいて野生型細胞から突然変異細胞を直接生成することができるため、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９を含む単一ベクターライブラリーはマルチベクターシステムよりも使用しやすい。その後、レンチウイルス形質導入後に選択して、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡに陽性の細胞集団を単離した。抗生物質を用いて選択する場合、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを含有する細胞のみを選択するために、死滅曲線を実行して最適な抗生物質濃度を決定すべきである。
理論的には、任意の細胞型をスクリーニングに使用することができるが、細胞の最終集団は、スクリーニング前にライブラリーの代表性を維持するために、十分な数でなければならない。スクリーニングに必要な細胞の確実な数は、検討される特定のライブラリーに応じて変動する。これを把握するための最も簡単な方法は、最終的な突然変異細胞集団から復帰作業して、スクリーニングの開始時に必要な細胞の確実な数を決定する。例えば、１００００個のｇＲＮＡのライブラリーが１００×の代表で使用されると仮定する。このライブラリーを用いたスクリーニングに必要な細胞の最小数は１００００個のｇＲＮＡｓ×１００個の細胞／ｇＲＮＡ＝１０６個の細胞である（スクリーニングのための対照条件を除く）。複数のｇＲＮＡを単一の細胞に伝達すると、複数の遺伝子変化を引き起こし、どの突然変異が観察された表現型を実際にもたらすかが不明であるようになるため、最終集団における各細胞は１つのｇＲＮＡのみを含まなければならない。したがって、＜１の感染多重度（ＭＯＩ）（すなわち、１つの細胞当たりにウイルス粒子が１つ未満）でレンチウイルスｇＲＮＡライブラリーを細胞に形質導入することを提案する解決手段が多い。
遺伝子スクリーニング
遺伝子スクリーニングは、ポジティブ（スクリーニング中に濃縮されたｇＲＮＡを示す）またはネガティブ（スクリーニング中に枯渇したｇＲＮＡを示す）として広く定義され得る。ＣＲＩＳＰＲライブラリーは、突然変異時に化学療法薬に対する耐性を付与する遺伝子を探すために、ポジティブ選択薬物スクリーニングに使用することができる。ポジティブ選択薬物スクリーニングでは、突然変異細胞集団を処理して、遺伝子修飾されて耐薬性を促進する細胞を選択的に濃縮するために、全ての野生型細胞を死滅させる（死滅曲線）最適濃度を決定することが重要であり得る。さらに、ゲノムＤＮＡにおける最終的なｇＲＮＡ数を、並行して実行される対照条件（例えば、ベクター対照）と比較して、ｇＲＮＡ分布の薬物非依存的変化を制御し、例えば、薬物の非存在下での所定のｇＲＮＡによる細胞増殖に対する影響、またはベクター自体の影響を制御する。一方、ネガティブスクリーニングは、スクリーニング中に集団から排除されたｇＲＮＡを同定するために用いられ、それらが他の集団に対して選択的劣性であることを示す。ネガティブ選択によるスクリーニングの例として、所定の期間にわたって突然変異細胞を増殖させ、しばらくした時点と最初の時点のｇＲＮＡ分布を比較する。
遺伝子スクリーニングは、ポジティブ（スクリーニング中に濃縮されたｇＲＮＡを示す）またはネガティブ（スクリーニング中に枯渇したｇＲＮＡを示す）として広く定義され得る。ＣＲＩＳＰＲライブラリーは、突然変異時に化学療法薬に対する耐性を付与する遺伝子を探すために、ポジティブ選択薬物スクリーニングに使用することができる。ポジティブ選択薬物スクリーニングでは、突然変異細胞集団を処理して、遺伝子修飾されて耐薬性を促進する細胞を選択的に濃縮するために、全ての野生型細胞を死滅させる（死滅曲線）最適濃度を決定することが重要であり得る。さらに、ゲノムＤＮＡにおける最終的なｇＲＮＡ数を、並行して実行される対照条件（例えば、ベクター対照）と比較して、ｇＲＮＡ分布の薬物非依存的変化を制御し、例えば、薬物の非存在下での所定のｇＲＮＡによる細胞増殖に対する影響、またはベクター自体の影響を制御する。一方、ネガティブスクリーニングは、スクリーニング中に集団から排除されたｇＲＮＡを同定するために用いられ、それらが他の集団に対して選択的劣性であることを示す。ネガティブ選択によるスクリーニングの例として、所定の期間にわたって突然変異細胞を増殖させ、しばらくした時点と最初の時点のｇＲＮＡ分布を比較する。
データ分析
任意の成功したスクリーニングの最終結果は、観察された表現型に必要な標的配列または要素を有するｇＲＮＡが濃縮（ポジティブセレクション）または消費される（ネガティブセレクション）変異細胞の集団を取得することである。したがって、データ解析ステップの目的は、実験群において枯渇または濃縮されたｇＲＮＡおよび配列またはエレメントを同定することである。細胞の最終的な集団は数千種類のｇＲＮＡを含んでいると考えられるため、ゲノム配列の分析には次世代シークエンシング（ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＮＧＳ）が必要である。個々のｇＲＮＡプラスミドは、当該ｇＲＮＡとゲノムＤＮＡ中に存在する全ての他のｇＲＮＡとを区別するバーコードを含む。したがって、ＣＲＩＳＰＲスクリーニングデータからの分析の最初のステップは、ＰＣＲを使用してゲノムＤＮＡに対するｇＲＮＡを増幅し、ＮＧＳを実行して最終的な突然変異細胞集団にどのようなｇＲＮＡが存在するかを特定することである。ＮＧＳの最終的な結果は、すべてのバーコードの元のカウントであり、そこからｇＲＮＡ配列と標的遺伝子を推定することができる。
任意の成功したスクリーニングの最終結果は、観察された表現型に必要な標的配列または要素を有するｇＲＮＡが濃縮（ポジティブセレクション）または消費される（ネガティブセレクション）変異細胞の集団を取得することである。したがって、データ解析ステップの目的は、実験群において枯渇または濃縮されたｇＲＮＡおよび配列またはエレメントを同定することである。細胞の最終的な集団は数千種類のｇＲＮＡを含んでいると考えられるため、ゲノム配列の分析には次世代シークエンシング（ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＮＧＳ）が必要である。個々のｇＲＮＡプラスミドは、当該ｇＲＮＡとゲノムＤＮＡ中に存在する全ての他のｇＲＮＡとを区別するバーコードを含む。したがって、ＣＲＩＳＰＲスクリーニングデータからの分析の最初のステップは、ＰＣＲを使用してゲノムＤＮＡに対するｇＲＮＡを増幅し、ＮＧＳを実行して最終的な突然変異細胞集団にどのようなｇＲＮＡが存在するかを特定することである。ＮＧＳの最終的な結果は、すべてのバーコードの元のカウントであり、そこからｇＲＮＡ配列と標的遺伝子を推定することができる。
配列またはエレメントが“ヒット”であるかどうかを判断する１つの方法は、所定のサンプル中の、配列またはエレメントを標的にした濃縮または枯渇したｇＲＮＡの量を定性的に比較することである。前の節で述べたように、ライブラリには通常、遺伝子ごとに複数の異なるｇＲＮＡが含まれており、かつ特定の遺伝子に対する複数のｇＲＮＡの一致した濃縮または消費は、特定の配列対が観察される表現型にとって重要であることを示す有力な証拠である。同じターゲットに向けられた２つの異なるｇＲＮＡが同じオフターゲット効果を持つことは不可能であるため、いくつかのｇＲＮＡをオフターゲット効果の内部コントロールとして使用することができる。しかしながら、ヒットを定義するために任意の閾値を設定すること（例えば、六つのｇＲＮＡのうちの二つがヒットを満たすこと）は、潜在的な偏差の原因であり得るか、または偽陽性もしくは陰性の結果をもたらし得る。これを回避するために、様々な統計分析を用いて、偏差のない方法でヒットを決定することもできる。各スクリーニングは異なるため、どの統計方法が特定のスクリーニングに最も適合するかを知ることは非常に重要である。
本発明のデータ分析プロセスにおいて、野生型配列またはアウトフレー挿入欠失もしくはインフレーム挿入を含む配列のデータをフィルターし、部位特異的突然変異またはインフレーム欠失を含む配列のみが、さらなる分析のために保持されるようにする。部位特異的突然変異については、同義またはナンセンス突然変異をフィルターし、ミスセンス突然変異を含む突然変異のみを保持する。インフレーム欠失の場合、毎回のリードに引き起こされたアミノ酸欠失の数に基づいて突然変異タイプを分類する必要があり、単アミノ酸欠失のみが含む場合が「運転者の欠失」というタイプに定義される；複数のアミノ酸欠失を含む場合が「乗客の欠失」というタイプに定義される。バイオインフォマティクス分析は具体的に以下を含む：
ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異比率を以下のように計算する：
インフレーム欠失を含む断片について、各アミノ酸の欠失比率を以下のように計算する：
各アミノ酸の基本スコアを以下のように算出する：
突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各アミノ酸についてスコア突然変異＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を計算する、
欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、運転者の欠失と乗客の欠失に次のように重みを付ける：
欠失倍数変化＝運転者の倍数変化＋α＊乗客の倍数変化、続いて、１００回並べ替えてヌル分布を確立し、且つアミノ酸ごとにスコア欠失＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を計算する、
スコア突然変異及びスコア欠失を以下のように正規化する：
突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各アミノ酸についてスコア突然変異＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を計算する、
欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、運転者の欠失と乗客の欠失に次のように重みを付ける：
欠失倍数変化＝運転者の倍数変化＋α＊乗客の倍数変化、続いて、１００回並べ替えてヌル分布を確立し、且つアミノ酸ごとにスコア欠失＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を計算する、
スコア突然変異及びスコア欠失を以下のように正規化する：
スコア突然変異及びスコア欠失の重み付けを計算する：
ａ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ａ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
必須性スコアの計算は以下のとおりである：
必須スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ＋ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
最後に、アミノ酸は必須スコアに従ってそれらの機能的重要度に基づいてランク付けされる。
必須スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ＋ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
最後に、アミノ酸は必須スコアに従ってそれらの機能的重要度に基づいてランク付けされる。
材料と方法
細胞と試薬
Ｃａｓ９を安定して発現するＨｅＬａ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＣｅｌｌＭａｘ）を１０％含むドゥルベコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、５％ＣＯ２ 、３７℃で培養した。
細胞と試薬
Ｃａｓ９を安定して発現するＨｅＬａ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＣｅｌｌＭａｘ）を１０％含むドゥルベコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、５％ＣＯ２ 、３７℃で培養した。
プラスミド構築
ｐＬＬ３．７（Ａｄｄｇｅｎｅ）のＵ６プロモーターをヒトＵ６プロモーター、ｃｃｄＢボックス、ｓｇＲＮＡスキャフォールドに置き換えて、ｓｇＲＮＡベクター（ｐｌｅｎｔｉ－ｓｇｒｎａ－ｇｆｐ）がクローンされた。Ｃａｓ９発現ベクター（ｐＬｅｎｔｉ－ＯＣ－ＩＲＥＳ－ＢＳＤ）１は以前に報告された。ｐＨＲ－ＳＦＦＶＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ （Ａｄｄｇｅｎｅ）のＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９エレメントをヒトＨＢＥＧＦコード配列と３ｘＦＬＡＧに置き換えて、ｐｃＤＮＡ－ＨＢＥＧＦがクローンされた。単一のアミノ酸欠失を有するＨＢＥＧＦを発現するｃＤＮＡベクターを、ＰＣＲ部位特異的変異誘発（ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩ融合ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）により構築された。ＨＢＥＧＦの異なる欠失突然変異体を生成するために使用されたプライマーを以下に挙げる。
ｐＬＬ３．７（Ａｄｄｇｅｎｅ）のＵ６プロモーターをヒトＵ６プロモーター、ｃｃｄＢボックス、ｓｇＲＮＡスキャフォールドに置き換えて、ｓｇＲＮＡベクター（ｐｌｅｎｔｉ－ｓｇｒｎａ－ｇｆｐ）がクローンされた。Ｃａｓ９発現ベクター（ｐＬｅｎｔｉ－ＯＣ－ＩＲＥＳ－ＢＳＤ）１は以前に報告された。ｐＨＲ－ＳＦＦＶＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ （Ａｄｄｇｅｎｅ）のＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９エレメントをヒトＨＢＥＧＦコード配列と３ｘＦＬＡＧに置き換えて、ｐｃＤＮＡ－ＨＢＥＧＦがクローンされた。単一のアミノ酸欠失を有するＨＢＥＧＦを発現するｃＤＮＡベクターを、ＰＣＲ部位特異的変異誘発（ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩ融合ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）により構築された。ＨＢＥＧＦの異なる欠失突然変異体を生成するために使用されたプライマーを以下に挙げる。
ＨＢＥＧＦ－２９－Ｆ ５’－ＧＡＣＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＧＴＴＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＡＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＨＢＥＧＦ－２９－Ｒ ５’－ＣＴＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＨＢＥＧＦ－６３－Ｆ ５’－ＧＡＣＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＧＴＴＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＡＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＨＢＥＧＦ－６３－Ｒ ５’－ＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＣＡＡＡＣＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
ＨＢＥＧＦ－７０－Ｆ ５’－ＧＣＡＡＧＡＧＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴＴＧＡＧＡＧＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
ＨＢＥＧＦ－７０－Ｒ ５’－ＧＡＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
ＨＢＥＧＦ－１１５－Ｆ ５’－ＣＧＧＡＡＡＴＡＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
ＨＢＥＧＦ－１１５－Ｒ ５’－ＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧＴＣＣＴＴＧＴＡＴＴＴＣＣＧ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
ＨＢＥＧＦ－１１９－Ｆ ５’－ＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
ＨＢＥＧＦ－１１９－Ｒ ５’－ＣＡＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣ －３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
ＨＢＥＧＦ－１２５－Ｆ ５’－ＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＣＣＧＧＧＣＴＣＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
ＨＢＥＧＦ－１２５－Ｒ ５’－ＧＧＡＧＣＣＣＧＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
ＨＢＥＧＦ－１２７－Ｆ ５’－ＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＧＧＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
ＨＢＥＧＦ－１２７－Ｒ ５’－ＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＡＣＡＴ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
ＨＥＢＧＦ－１３３－Ｆ ５’－ＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
ＨＢＥＧＦ－１３３－Ｒ ５’－ＧＴＡＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
ＨＥＢＧＦ－１３４－Ｆ ５’－ＣＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
ＨＢＥＧＦ－１３４－Ｒ ５’－ＧＧＴＡＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＧ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
ＨＥＢＧＦ－１３８－Ｆ ５’－ＣＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＴＣＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
ＨＢＥＧＦ－１３８－Ｒ ５’－ＧＡＣＡＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
ＨＥＢＧＦ－１４１－Ｆ ５’－ＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＧＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）
ＨＢＥＧＦ－１４１－Ｒ ５’－ＧＣＣＣＡＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＣＣＣＧＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
ＨＥＢＧＦ－１５２－Ｆ ５’－ＧＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＣＴＴＡＴＡＴＡＣＣＴＡＴＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
ＨＢＥＧＦ－１５２－Ｒ ５’－ＣＡＴＡＧＧＴＡＴＡＴＡＡＧＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＧＡＧＧＣ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
ＨＥＢＧＦ－１５３－Ｆ ５’－ＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＴＡＣＣＴＡＴＧＡＣＣ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
ＨＢＥＧＦ－１５３－Ｒ ５’－ＧＧＴＣＡＴＡＧＧＴＡＴＡＴＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＧＡＧＧ－３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＨＢＥＧＦ－２９－Ｒ ５’－ＣＴＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＨＢＥＧＦ－６３－Ｆ ５’－ＧＡＣＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＧＴＴＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＡＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＨＢＥＧＦ－６３－Ｒ ５’－ＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＣＡＡＡＣＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
ＨＢＥＧＦ－７０－Ｆ ５’－ＧＣＡＡＧＡＧＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴＴＧＡＧＡＧＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
ＨＢＥＧＦ－７０－Ｒ ５’－ＧＡＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
ＨＢＥＧＦ－１１５－Ｆ ５’－ＣＧＧＡＡＡＴＡＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
ＨＢＥＧＦ－１１５－Ｒ ５’－ＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧＴＣＣＴＴＧＴＡＴＴＴＣＣＧ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
ＨＢＥＧＦ－１１９－Ｆ ５’－ＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
ＨＢＥＧＦ－１１９－Ｒ ５’－ＣＡＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣ －３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
ＨＢＥＧＦ－１２５－Ｆ ５’－ＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＣＣＧＧＧＣＴＣＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
ＨＢＥＧＦ－１２５－Ｒ ５’－ＧＧＡＧＣＣＣＧＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
ＨＢＥＧＦ－１２７－Ｆ ５’－ＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＧＧＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
ＨＢＥＧＦ－１２７－Ｒ ５’－ＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＡＣＡＴ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
ＨＥＢＧＦ－１３３－Ｆ ５’－ＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
ＨＢＥＧＦ－１３３－Ｒ ５’－ＧＴＡＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
ＨＥＢＧＦ－１３４－Ｆ ５’－ＣＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
ＨＢＥＧＦ－１３４－Ｒ ５’－ＧＧＴＡＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＧ －３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
ＨＥＢＧＦ－１３８－Ｆ ５’－ＣＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＴＣＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＴＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
ＨＢＥＧＦ－１３８－Ｒ ５’－ＧＡＣＡＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
ＨＥＢＧＦ－１４１－Ｆ ５’－ＣＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＧＣ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）
ＨＢＥＧＦ－１４１－Ｒ ５’－ＧＣＣＣＡＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＣＣＣＧＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
ＨＥＢＧＦ－１５２－Ｆ ５’－ＧＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＣＴＴＡＴＡＴＡＣＣＴＡＴＧ－３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
ＨＢＥＧＦ－１５２－Ｒ ５’－ＣＡＴＡＧＧＴＡＴＡＴＡＡＧＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＧＡＧＧＣ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
ＨＥＢＧＦ－１５３－Ｆ ５’－ＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＴＡＣＣＴＡＴＧＡＣＣ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
ＨＢＥＧＦ－１５３－Ｒ ５’－ＧＧＴＣＡＴＡＧＧＴＡＴＡＴＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＧＡＧＧ－３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
ｓｇＲＮＡ ライブラリー設計
標的遺伝子のｈｇ１９ＣＤＳ配列をＵＣＳＣゲノムブラウザー（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）からダウンロードし、自作のスクリプトを使用して、ライブラリーを構築するために、ＮＡＧまたはＮＧＧ ＰＡＭ配列を持つすべての潜在的なｓｇＲＮＡを設計した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡライブラリーの構築
それぞれ三つの薬物関連タンパク質および三つの毒素受容体をそれぞれ標的とする１２３６および３７１２個のｓｇＲＮＡを含む二つのライブラリーを構築した。ｓｇＲＮＡをコードするアレイベースのオリゴヌクレオチドをＰＣＲによって合成し、５’末端にＢｓｍＢＩ認識部位を含む対応するプライマーを用いて増幅した。ｓｇＲＮＡをコードするアレイベースのオリゴヌクレオチドをＰＣＲ 増幅するために使用されるプライマー（薬物関連タンパク質を標的とするｓｇＲＮＡ オリゴヌクレオチドを増幅するために使用されるプライマー）を以下に挙げる。
標的遺伝子のｈｇ１９ＣＤＳ配列をＵＣＳＣゲノムブラウザー（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）からダウンロードし、自作のスクリプトを使用して、ライブラリーを構築するために、ＮＡＧまたはＮＧＧ ＰＡＭ配列を持つすべての潜在的なｓｇＲＮＡを設計した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡライブラリーの構築
それぞれ三つの薬物関連タンパク質および三つの毒素受容体をそれぞれ標的とする１２３６および３７１２個のｓｇＲＮＡを含む二つのライブラリーを構築した。ｓｇＲＮＡをコードするアレイベースのオリゴヌクレオチドをＰＣＲによって合成し、５’末端にＢｓｍＢＩ認識部位を含む対応するプライマーを用いて増幅した。ｓｇＲＮＡをコードするアレイベースのオリゴヌクレオチドをＰＣＲ 増幅するために使用されるプライマー（薬物関連タンパク質を標的とするｓｇＲＮＡ オリゴヌクレオチドを増幅するために使用されるプライマー）を以下に挙げる。
薬物ライブラリーＦ ５’－ＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＣＧ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）
薬物ライブラリーＲ ５’－（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）
毒素ライブラリーＦ ５’－ＴＣＴＴＣＡＴＡＴＣＧＴＡＴＣＧＴＧＣＧ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）
毒素ライブラリーＲ ５’－ＴＡＧＴＣＧＣＴＡＧＧＣＴＡＴＡＡＣＧＴ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
薬物ライブラリーＲ ５’－（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）
毒素ライブラリーＦ ５’－ＴＣＴＴＣＡＴＡＴＣＧＴＡＴＣＧＴＧＣＧ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）
毒素ライブラリーＲ ５’－ＴＡＧＴＣＧＣＴＡＧＧＣＴＡＴＡＡＣＧＴ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
増幅されたＤＮＡ産物は、ゴールデンゲート（Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ）法を使用してベクターにライゲーションされた。次いで、ライゲーション混合物をＴｒａｎｓ１－Ｔ１コンピテント
セル（Ｔｒａｎｓｇｅｎ）に形質転換して、プラスミドライブラリーを生成した。続いて、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ｓｇＲＮＡプラスミドライブラリーを２つのウイルスパッケージングプラスミドｐＶＳＶＧおよびｐＲ８．７４（Ａｄｄｇｅｎｅ）とともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。次いで、ＨｅＬａ細胞を低ＭＯＩ（約０、３）のレンチウイルスで感染させ、感染した後の４８時間でＦＡＣＳ によってＥＧＦＰ ＋ 細胞を収集した。
セル（Ｔｒａｎｓｇｅｎ）に形質転換して、プラスミドライブラリーを生成した。続いて、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ｓｇＲＮＡプラスミドライブラリーを２つのウイルスパッケージングプラスミドｐＶＳＶＧおよびｐＲ８．７４（Ａｄｄｇｅｎｅ）とともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。次いで、ＨｅＬａ細胞を低ＭＯＩ（約０、３）のレンチウイルスで感染させ、感染した後の４８時間でＦＡＣＳ によってＥＧＦＰ ＋ 細胞を収集した。
ライブラリースクリーニング
ＢＩ ２５３６およびボルテゾミブのスクリーニングについては、実験ごとにそれぞれ３．５×１０６個の細胞を持つ１５０ｍｍのシャーレ２個を繰り返した。接種後２４時間、適切な濃度の薬物で細胞を処理する。スクリーニングの最初のラウンドでは、ライブラリー細胞を４ｎｇ／ｍｌのＢＩ２５３６で１．５日培養し、または４ｎｇ／ｍｌのボルテゾミブで３日培養した後、新鮮なＤＭＥＭで培養した。耐性細胞を再度播種し、５－１０日間培養し、次のラウンドの薬物スクリーニングに使用する。スクリーニングの第二ラウンドでは、ライブラリー細胞を５ｎｇ／ｍｌのＢＩ２５３６と４日間、または８ｎｇ／ｍｌのボルテゾミブと５日間インキュベートした。クリーニングの第三ラウンドでは、ライブラリー細胞を６ｎｇ／ｍｌのＢＩ ２５３６と３日間インキュベートした。６－ＴＧスクリーニングでは、合計１．８×１０７個のライブラリー細胞を１５０ｍｍシャーレにプレートあたり３×１０６個の細胞でプレーティングした。三つの細胞プレートを一つの繰り返しとして一つのグループに分けた。細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌの６－ＴＧで６日間処理し、生き残した細胞を増殖のために再播種し、次のラウンドのスクリーニングに用いた。第二ラウンドおよび第三ラウンドについて、ライブラリー細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌおよび３００ｎｇ／ｍｌの６－ＴＧとそれぞれ４日間インキュベートした。ＴｃｄＢスクリーニングのために、１５０ｍｍの四つのペトリ皿にそれぞれ、３．５×１０６個の細胞を実験的繰り返しとして播種した。スクリーニングの各ラウンドで、細胞は適切な濃度で処理された：第一ラウンドは７０ｎｇ／ｍｌ、第二ラウンドと第三ラウンドは１００ｎｇ／ｍｌであった。ＨＢＥＧＦおよびＡＮＴＸＲ１スクリーニングの詳細は、本発明者らの以前の報告と同じである（１）。
スクリーニングされた各耐性細胞を収集して、ゲノムＤＮＡとトータルＲＮＡを抽出にもちいて、逆転写を実行した。次に、ＰＣＲ増幅によって得られた標的遺伝子のｓｇＲＮＡコード領域およびｃＤＮＡを次世代シークエンシング（ＮＧＳ）分析にかけた。
ＢＩ ２５３６およびボルテゾミブのスクリーニングについては、実験ごとにそれぞれ３．５×１０６個の細胞を持つ１５０ｍｍのシャーレ２個を繰り返した。接種後２４時間、適切な濃度の薬物で細胞を処理する。スクリーニングの最初のラウンドでは、ライブラリー細胞を４ｎｇ／ｍｌのＢＩ２５３６で１．５日培養し、または４ｎｇ／ｍｌのボルテゾミブで３日培養した後、新鮮なＤＭＥＭで培養した。耐性細胞を再度播種し、５－１０日間培養し、次のラウンドの薬物スクリーニングに使用する。スクリーニングの第二ラウンドでは、ライブラリー細胞を５ｎｇ／ｍｌのＢＩ２５３６と４日間、または８ｎｇ／ｍｌのボルテゾミブと５日間インキュベートした。クリーニングの第三ラウンドでは、ライブラリー細胞を６ｎｇ／ｍｌのＢＩ ２５３６と３日間インキュベートした。６－ＴＧスクリーニングでは、合計１．８×１０７個のライブラリー細胞を１５０ｍｍシャーレにプレートあたり３×１０６個の細胞でプレーティングした。三つの細胞プレートを一つの繰り返しとして一つのグループに分けた。細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌの６－ＴＧで６日間処理し、生き残した細胞を増殖のために再播種し、次のラウンドのスクリーニングに用いた。第二ラウンドおよび第三ラウンドについて、ライブラリー細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌおよび３００ｎｇ／ｍｌの６－ＴＧとそれぞれ４日間インキュベートした。ＴｃｄＢスクリーニングのために、１５０ｍｍの四つのペトリ皿にそれぞれ、３．５×１０６個の細胞を実験的繰り返しとして播種した。スクリーニングの各ラウンドで、細胞は適切な濃度で処理された：第一ラウンドは７０ｎｇ／ｍｌ、第二ラウンドと第三ラウンドは１００ｎｇ／ｍｌであった。ＨＢＥＧＦおよびＡＮＴＸＲ１スクリーニングの詳細は、本発明者らの以前の報告と同じである（１）。
スクリーニングされた各耐性細胞を収集して、ゲノムＤＮＡとトータルＲＮＡを抽出にもちいて、逆転写を実行した。次に、ＰＣＲ増幅によって得られた標的遺伝子のｓｇＲＮＡコード領域およびｃＤＮＡを次世代シークエンシング（ＮＧＳ）分析にかけた。
候補ｓｇＲＮＡ配列の同定
ＤＮｅａｓｙ ＢｌｏｏｄとＴｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて適切な数のライブラリー細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。異なる薬物／毒素処理に対して、ライブラリー細胞の適切な数は異なる：ＡＮＴＸＲ１は、６．２５×１０５個、ＣＳＰＧ４は、３×１０６個、ＨＢＥＧＦは、２．５×１０５個、ＨＰＲＴ１は、１．７５×１０５個、ＰＬＫ１は、６．３×１０５個、ＰＳＭＢ ５は、３×１０５個である。ｓｇＲＮＡ領域は、プライマー１を用いてｓｇＲＮＡの隣接配列をアニーリングした２６サイクルのＰＣＲにより増幅される。各リピートのＰＣＲ産物をプールし、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で精製し、異なるバーコード（ＮＥＢ＃７３７０、＃７３３５、＃７５００）でインデックスを付け、ＮＧＳで分析した。
ＤＮｅａｓｙ ＢｌｏｏｄとＴｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて適切な数のライブラリー細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。異なる薬物／毒素処理に対して、ライブラリー細胞の適切な数は異なる：ＡＮＴＸＲ１は、６．２５×１０５個、ＣＳＰＧ４は、３×１０６個、ＨＢＥＧＦは、２．５×１０５個、ＨＰＲＴ１は、１．７５×１０５個、ＰＬＫ１は、６．３×１０５個、ＰＳＭＢ ５は、３×１０５個である。ｓｇＲＮＡ領域は、プライマー１を用いてｓｇＲＮＡの隣接配列をアニーリングした２６サイクルのＰＣＲにより増幅される。各リピートのＰＣＲ産物をプールし、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で精製し、異なるバーコード（ＮＥＢ＃７３７０、＃７３３５、＃７５００）でインデックスを付け、ＮＧＳで分析した。
ｃＤＮＡ 調製及びシークエンシング
ＲＮＡｐｒｅｐピュアセル／バクテリアキット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を使用してライブラリー細胞からトータルＲＮＡを抽出し、Ｑｕａｎｔｓｃｒｉｐｔ ＲＴキット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を使用してｃＤＮＡを合成した。二ステップの方法でＮＧＳライブラリを構築する。第一ステップはＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅する（２６個のサイクル；ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｋａｒａ）を含む。異なる遺伝子のためのプライマー（ｃＤＮＡ増幅プライマー）を表１に示した。
ＲＮＡｐｒｅｐピュアセル／バクテリアキット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を使用してライブラリー細胞からトータルＲＮＡを抽出し、Ｑｕａｎｔｓｃｒｉｐｔ ＲＴキット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を使用してｃＤＮＡを合成した。二ステップの方法でＮＧＳライブラリを構築する。第一ステップはＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅する（２６個のサイクル；ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｋａｒａ）を含む。異なる遺伝子のためのプライマー（ｃＤＮＡ増幅プライマー）を表１に示した。
ＣＳＰＧ４のコード配列長は約６．９ｋｂであり、３つの増幅反応を用いて、その全長を含むオーバーラップフラグメント（～５０ｂｐ）を得た。各ｃＤＮＡ断片のＰＣＲ産物を集めて、精製した（ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５，Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。次に、ＣｏｖａｒｉｓＳ２システムを使用して各遺伝子の１μｇのｃＤＮＡを約２５０ｂｐに切断した。ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて切断された産物を精製して濃縮し、また、異なるバーコードを使用して、ＮＧＳ分析用のインデックスを作成した。
機能ドメインの同定の計算方法
Ｂｏｗｔｉｅ２ ２．３．２を使用してシークエンシングリードをターゲット遺伝子の参照配列にマッピングし、ＳＡＭｔｏｏｌｓ１．３．１を使用して選別した。次に、リードをフィルターして、ミスセンス突然変異またはインフレーム欠失のみを含むリードを残した。ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異率を次のように計算した：
Ｂｏｗｔｉｅ２ ２．３．２を使用してシークエンシングリードをターゲット遺伝子の参照配列にマッピングし、ＳＡＭｔｏｏｌｓ１．３．１を使用して選別した。次に、リードをフィルターして、ミスセンス突然変異またはインフレーム欠失のみを含むリードを残した。ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異率を次のように計算した：
インフレーム欠失を含む断片について、各アミノ酸の欠失比率を以下のように計算した：
そして、それらが生成したアミノ酸の欠失の数に基づいて突然変異のタイプを分類し、一つのアミノ酸しか欠落していない場合が「運転者の欠失（ｄｒｉｖｅｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）」、複数のアミノ酸欠失の場合が「乗客の欠失（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）」として分類した。突然変異／欠失の比率を決定し、欠失パターンをデコードした後、実験群と対照群との間の倍数変化を計算した。
次に、各アミノ酸の必須性スコアを以下のように算出した。突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各アミノ酸についてスコア突然変異＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を計算した。欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、運転者の欠失と乗客の欠失に次のように重みを付けた。
欠失倍数変化＝運転者倍数変化＋α＊乗客倍数変化。
続いて、並べ替えてヌル分布（ｎｕｌｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を確立し、（且つアミノ酸ごとにスコア欠失＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を計算した。次に、スコア突然変異
及びスコア欠失は以下のように正規化した。
欠失倍数変化＝運転者倍数変化＋α＊乗客倍数変化。
続いて、並べ替えてヌル分布（ｎｕｌｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を確立し、（且つアミノ酸ごとにスコア欠失＝－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を計算した。次に、スコア突然変異
及びスコア欠失は以下のように正規化した。
続いて、スコア突然変異及びスコア欠失の重み付けを以下のとおり計算した。
ａ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ａ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
最終的に、必須性スコアの計算は以下のとおりである：
必須スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ＋ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
必須スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ＋ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ。
スクリーニング結果の検証
ＰＳＭＢ５およびＰＬＫ１の重要な突然変異を検証するために、ｓｇＲＮＡは突然変異部位の近くに設計され、検証された残基の代わりに１１９ｎｔのｓｓＯＤＮドナーごとに１つのアミノ酸をコードする。すべてのｓｇＲＮＡ（重要な変異を検証するためのｓｇＲＮＡ配列）およびｓｓＯＤＮドナー配列（ｓｓＯＤＮドナーは検証された残基の代わりに一つのアミノ酸をコードする）を以下の表２に示した。
ＰＳＭＢ５およびＰＬＫ１の重要な突然変異を検証するために、ｓｇＲＮＡは突然変異部位の近くに設計され、検証された残基の代わりに１１９ｎｔのｓｓＯＤＮドナーごとに１つのアミノ酸をコードする。すべてのｓｇＲＮＡ（重要な変異を検証するためのｓｇＲＮＡ配列）およびｓｓＯＤＮドナー配列（ｓｓＯＤＮドナーは検証された残基の代わりに一つのアミノ酸をコードする）を以下の表２に示した。
ＨｅＬａ細胞に、６ウェルプレートで１μｇのｓｇＲＮＡと２μｇのｓｓＯＤＮドナーをトランスフェクトした。１．５×１０５個の細胞を、トランスフェクション後１４日間、薬物による選択の２４時間前に６ウェルプレートに播種した。適切な用量の薬物で細胞を７２時間処理した（ボルテゾミブ（８ｎｇ／ｍｌ）、ＢＩ２５３６（１０ｎｇ／ｍｌ））。ＴＩＡＮａｍｐゲノムＤＮＡキット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を使って薬剤耐性細胞のゲノムを抽出した。
ＴｒａｎｓＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの高忠実度（Ｔｒａｎｓｇｅｎ）を使用して突然変異サイトを増幅し、汎用のＤＮＡ精製キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を用いて精製した。プライマー（ＰＳＭＢ５遺伝子突然変異部位を増幅するためのプライマー）を表３に挙げた。
ＴｒａｎｓＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの高忠実度（Ｔｒａｎｓｇｅｎ）を使用して突然変異サイトを増幅し、汎用のＤＮＡ精製キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を用いて精製した。プライマー（ＰＳＭＢ５遺伝子突然変異部位を増幅するためのプライマー）を表３に挙げた。
ＰＣＲ断片をｐＥＡＳＹ－Ｔ５ Ｚｅｒｏクローンキット（Ｔｒａｎｓｇｅｎ）にクローンしてシークエンシングに用いた。
細胞毒性の測定
薬物または毒素処理の２４時間前に、９６ウェルプレートに細胞（ジフテリア毒素（ＤＴ）用の５，０００個の細胞とボルテゾミブ用の３０００個の細胞）を播種し、異なる濃度のボルテゾミブまたはＤＴを添加した。細胞を３７℃で４８時間（ＤＴ）または７２時間（ボルテゾミブ）インキュベートした後に、１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（３－［４．５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２．５－ジフェニルテトラゾール臭化物）を添加した。ＢｉｏＴｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、５７０ｎｍでの分光光度計の読み取り値を収集した。
結果
タンパク質マッピング機能エレメントにおけるＣＲＥＳＭＡＳ方法をテストするために、本発明者らは、細菌毒素受容体をコードする三つの遺伝子（ＡＮＴＸＲ１、ＣＳＰＧ４およびＨＢＥＧＦ）および抗がん剤ターゲットをコードする三つの遺伝子（ＨＰＲＴ１、ＰＬＫ１およびＰＳＭＢ５）（表４）を選択した。
薬物または毒素処理の２４時間前に、９６ウェルプレートに細胞（ジフテリア毒素（ＤＴ）用の５，０００個の細胞とボルテゾミブ用の３０００個の細胞）を播種し、異なる濃度のボルテゾミブまたはＤＴを添加した。細胞を３７℃で４８時間（ＤＴ）または７２時間（ボルテゾミブ）インキュベートした後に、１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（３－［４．５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２．５－ジフェニルテトラゾール臭化物）を添加した。ＢｉｏＴｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、５７０ｎｍでの分光光度計の読み取り値を収集した。
結果
タンパク質マッピング機能エレメントにおけるＣＲＥＳＭＡＳ方法をテストするために、本発明者らは、細菌毒素受容体をコードする三つの遺伝子（ＡＮＴＸＲ１、ＣＳＰＧ４およびＨＢＥＧＦ）および抗がん剤ターゲットをコードする三つの遺伝子（ＨＰＲＴ１、ＰＬＫ１およびＰＳＭＢ５）（表４）を選択した。
本発明者らは、ＨｅＬａ細胞を選択してスクリーニングのためのＣＲＩＳＰＲライブラリーを構築し、それは、ＨＰＲＴ１（１２）を標的とする６－ＴＧ（チオグアニン）、ＰＬＫ１（１３）を標的とするＢＩ２５３６、およびＰＳＭＢ５（１４）を標的とするボルテゾミブなど、この細胞株における毒素（８、１１）および薬物の適切な傷害条件を決定したためである（図２Ａ）。
標的遺伝子については、ｓｇＲＮＡをコンピュータ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）上で設計し、チップ上でプール（ｐｏｏｌ）として合成して、３つの受容体コーディング遺伝子の全長をカバーする飽和ＣＲＩＳＰＲライブラリー、および３つの薬物ターゲットをカバーする別のライブラリーを構築した（図２Ｂ）。
処理されていない対照スクリーニングを除いて、本発明者らは６つの処理中のそれぞれに対して機能スクリーニングを２回繰り返した。各ｓｇＲＮＡがＤＳＢ部位の周囲の１０－ｂｐ（１５）に影響を及ぼすと仮定すると（図２Ｃ）、６つの遺伝子のｓｇＲＮＡカバレッジは約０．９９であった。毒素（ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ毒素、ジフテリア毒素、またはクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ）または薬物（６－ＴＧ、ＢＩ２５３６、またはボルテゾミブ）による処理を三回した後、耐性細胞を得て、ＮＧＳ分析による通常のｓｇＲＮＡ解読（デクリプション） （８、１６）のためにゲノムＤＮＡを抽出した。
処理されていない対照スクリーニングを除いて、本発明者らは６つの処理中のそれぞれに対して機能スクリーニングを２回繰り返した。各ｓｇＲＮＡがＤＳＢ部位の周囲の１０－ｂｐ（１５）に影響を及ぼすと仮定すると（図２Ｃ）、６つの遺伝子のｓｇＲＮＡカバレッジは約０．９９であった。毒素（ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ毒素、ジフテリア毒素、またはクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ）または薬物（６－ＴＧ、ＢＩ２５３６、またはボルテゾミブ）による処理を三回した後、耐性細胞を得て、ＮＧＳ分析による通常のｓｇＲＮＡ解読（デクリプション） （８、１６）のためにゲノムＤＮＡを抽出した。
同時に、これらの得た耐性細胞を全ＲＮＡ単離および逆転写に供してｃＤＮＡを得た後に、これをＰＣＲ増幅のための鋳型（テンプレート）として使用した。特異的プライマーを用いた増幅によって標的遺伝子の完全長ｃＤＮＡを得た。ＣＳＰＧ４などの大型遺伝子については、その全長をカバーするように三対のプライマーを使用して３つのオーバーラップしたフラグメントを増幅した。選択的スプライシングを有する遺伝子については、全ての代替転写物（トランスクリプト）が含まれることを確実にするために、特異的プライマー対を設計した（図２Ｄおよび表１）。ＮＧＳのサイズ要件のため、ＰＣＲフラグメントを、平均的に２５０－ｂｐの小さなサイズにさらに分割した（図２Ｅ）。全ての実験手順の後、本発明者らは、シークエンシングデータを分析して標的遺伝子の機能に不可欠なアミノ酸を決定するための計算手順を確立した。
全て６つのターゲットの対照ライブラリーの突然変異パーセントは低レベルであり、これらの値、特に、ＣＲＩＳＰＲライブラリーで生成した挿入欠失はスクリーニング後に有意に増加した。全ての対照群における比較的高い点突然変異率は、ＰＣＲ増幅およびＮＧＳにおいて生じたエラーに起因する可能性がある。しかしながら、点突然変異のリードは、６回のスクリーニングのいずれかの後に増加し、何らかの点突然変異が耐性表現型に確実に寄与することを示した（図３Ａ）。次いで、本発明者らは、２回の繰り返し間のｓｇＲＮＡ倍数変化と欠失突然変異および点突然変異との関連性によりスクリーニングの品質を評価すると、ｓｇＲＮＡ倍数変化の相関係数範囲が０．３６～０．８５（図３Ｂ）、欠失が０．４５～０．９９（図４Ａ）、点突然変異が０．６１～０．９９（図４）であることを見出し、本発明の方法の高い一致性が示された。全て３つの毒素受容体が細胞生存に必須ではないため、スクリーニング後のｓｇＲＮＡは、そのコード配列にわたって均一に分布し（図３Ａ、図５Ａおよび図６Ａ）、これは、これらの大部分がフレームシフト挿入欠失を生成することができ、標的遺伝子発現の破壊を引き起こすことを示している。興味深いことに、３つの毒素受容体のＣ－末端部分に対応するコード領域を標的とする大部分のｓｇＲＮＡは、一貫して濃縮することができず（図３Ａ、図５Ａおよび図６Ａ）、これは、その大部分の細胞内Ｃ－末端領域が機能的に必須ではないことを示している。しかしながら、ｓｇＲＮＡコード領域のＮＧＳは、多くの配列－機能情報を明らかにすることができなかった。
ＣＲＥＳＭＡＳポリシーおよび簡略化アルゴリズムを用いて、機能的に関連するアミノ酸マップを得ることができる。本発明者らは、運転者欠失には、このアミノ酸欠失型の意味が曖昧ではないため、意図的に実線を割り当て、一方、乗客欠失には灰色線（１０％の割合）を割り当てた。本発明者らはまた、見やすくするために、単一のミスセンス突然変異データと欠失データを１つのグラフに合併した。単一アミノ酸欠失と同様に、ミスセンス点突然変異によるタンパク質機能の喪失は、影響を受けたアミノ酸がタンパク質の機能に非常に重要であることを示す。
ジフテリア毒素（ＤＴ）の受容体をコードするＨＢＥＧＦの機能的スクリーニングについては、ほとんどの耐性細胞は、報告されたＤＴ結合部位（１７）であるＥＧＦ様ドメイン（図７Ｂ）において欠失を有する。必要性スコアを計算し、以下の表６に示す。
必須性スコアを計算したことにより（表６）、本発明者らは、スコアが最も高いアミノ酸がＥＧＦ様ドメインに確実に濃縮されることを見出し、毒素結合の調節におけるこのドメインの必要性がさらに確認された。全てのアミノ酸の中で、ＤＴ－ＨＢＥＧＦ相互作用に必要な３つの既知のアミノ酸であるＦ１１５、Ｌ１２７、およびＥ１４１（１７）は、上位（第２１位、第１５位、および第２８位）である。重要なことに、ＣＲＥＳＭＡＳ方法は、これらの３つ以外の多くの新しい部位が受容体機能にとって重要であることを明らかにした（図７Ｃ）。本発明者らの結果を検証するために、本発明者らは、ＨｅＬａＨＥＧＦ－／－細胞（８）においてレンチウイルス感染によって野生型または突然変異体ＨＢＥＧＦ ｃＤＮＡを発現させた。本発明者らは、５つの上位の部位（Ｇ１１９、Ｋ１２５、Ｉ１３３、Ｃ１３４、Ｙ１３８）、３つの既知のポジティブ部位、および五つの下位（Ｌ２９、Ｄ６３、Ｄ７０、Ｎ１５２、Ｒ１５３）の部位を検証した。ＨｅＬａ ＨＢＥＧＦ－／－は、ＤＴに対する全体的な耐性を示し、野生型ＨＢＥＧＦは、毒素に対する細胞の感受性を回復させることを示した。これらの５つの上位の部位（Ｇ１１９、Ｋ１２５、Ｉ１３３、Ｃ１３４、Ｙ１３８）のうちの１つの単一アミノ酸欠失、または既知のポジティブ部位（Ｆ１１５、Ｌ１２７、Ｅ１４１）のうちの１つの単一アミノ酸欠失を含有する突然変異体ＨＢＥＧＦのすべての発現は、ＤＴに対する細胞の感受性をレスキューすることができなかったが、５つの下位の部位（Ｌ２９、Ｄ６３、Ｄ７０、Ｎ１５２、Ｒ１５３）のうちのいずれかの欠失を有する突然変異体ＨＢＥＧＦは、野生型と同様にレスキューした（図７Ｄ）。これらの結果は、ＥＧＦ様ドメイン中の何らかのアミノ酸がＤＴ－により誘発された細胞毒性に必要であるという本発明者らのスクリーニング結果を裏付ける。注目すべきことに、ＨＢＥＧＦについてＤＴ結合ドメイン中のいくつかのアミノ酸がスクリーニングされたという事実は、ＣＲＥＳＭＡＳが低い偽陽性率を有することを示す。
炭疽毒素の受容体ＡＮＴＸＲ１について、すべての耐性細胞は、細胞質ドメインをコードする領域を除いて、コード領域全体にわたって様々な欠失を有し（図５Ｂおよび５Ｃ）、これは、炭疽毒素とＡＮＴＸＲ１との間の相互作用が受容体の細胞外領域によって支配されることを示している。既知のＰＡ結合部位（１８）及び膜貫通ドメインに加えて、様々な程度の重要度を示す多くの新規アミノ酸が同定された（図５Ｂ）。ｓｇＲＮＡシークエンシングの結果（図５Ａ）と一致して、細胞質領域内のアミノ酸の大部分は不必要であり（図５Ｂ）、これもまた、ＣＲＥＳＭＡＳの低偽陽性率を示している。炭疽毒性の媒介においてＡＮＴＸＲ１機能に重要な高順位アミノ酸であって、２つの既知の部位Ｈ５７およびＥ１５５（１８）（図５Ｃ）を含むものは、必須性スコアの計算によって決定された。
ＣＳＰＧ４、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）の受容体について、突然変異体のピークは、主に最初と最後の両方のＣＳＰＧリピートに位置した（図６Ｂ及び６Ｃ）。最初のＣＳＰＧリピートは、既知のＴｃｄＢ結合部位（１１）であり、最後の２つのリピートは新たに発見されたものである。重要なことに、上記のＨＢＥＧＦおよびＡＮＴＸＲ１の両方とは異なり、ほとんどの情報データは欠失突然変異に由来し、ＣＳＰＧ４にはＴ７７８に影響を及ぼす高度に濃縮されているミスセンス点突然変異が存在しており（図６Ｂ）、このアミノ酸がＴｃｄＢ毒性を媒介する受容体にとって重要であることを示している。
抗がん剤ターゲットをコードする３つの遺伝子について、ＨＰＲＴ１は非必須遺伝子であり、ＰＬＫ１およびＰＳＭＢ５は２つの必須遺伝子（１９）である。非必須ターゲットＨＰＲＴ１について、ライブラリーの６－ＴＧスクリーニングは、ほとんどのｓｇＲＮＡが濃縮され、均一に分布しており（図８Ａ）、細菌毒素スクリーニングからのものと同様の結果を示した（図３Ａ、５Ａ、６Ａ）。タンパク質全体における各アミノ酸の重要な役割が完全に埋められる。ＣＲＥＳＭＡＳ方法は、６－ＴＧに対する細胞の感受性の媒介において、ＨＰＲＴ１の機能にとって重要な多くの部位が存在することを示した（図８Ｂ）。この観察結果は、四量体ＨＰＲＴ１の既知の構造と一致し、必須性スコアの高い部位の分布も一致した（図８Ｃ）（１２）。
必須のターゲットであるＰＬＫ１およびＰＳＭＢ５について、ｓｇＲＮＡシークエンシングは、ｓｇＲＮＡのインフレーム突然変異が発生した何らかの重要なアミノ酸のおおよその位置を確実に提供した（図９Ａおよび図１０Ａ）。ｓｇＲＮＡ濃縮は間接的な証拠を提供し、解像度が低いため、本発明者らは、ＣＲＥＳＭＡＳポリシーが、より正確でより包括的なグラフをより詳細に明らかにすると考える。実際には、ＰＳＭＢ５およびＰＬＫ１において、タンパク質機能に重要なより多くのアミノ酸が高精度で同定された（図９Ｂおよび図１０Ｂ）。注目すべきことに、最終的なスクリーニング結果は、ミスセンス突然変異および可変数の欠失を含み、両方の場合での最も高い必須アミノ酸が、必須性スコアに基づいて得られた（図９Ｃおよび図１０Ｃ）。ここでも、本発明者らは、ＰＳＭＢ５におけるＢｏｒｔｅｚｏｍｉｂと相互作用した既知の重要部位（Ｒ７８、Ｔ８０、Ｍ１０４、Ａ１０８、Ｃ１２２、およびＧ２４２）（２０－２２）および新規の必須残基（図９Ｂ－Ｃ）を同定した。同様に、本発明者らは、ＢＩ２５３６－ＰＬＫ１相互作用にとって重要な既
知の残基Ｒ１３６（２２、２３）および新規の必須残基Ｆ１８３（図１０Ｂ－Ｃ）を同定した。
知の残基Ｒ１３６（２２、２３）および新規の必須残基Ｆ１８３（図１０Ｂ－Ｃ）を同定した。
ミスセンス点突然変異は、ＰＳＭＢ５およびＰＬＫ１に薬物耐性を付与する主な形態であるため、本発明者らは、ｓｓＯＤＮ媒介の方法
（２４）
を用いて、欠失ではなく特定の点突然変異を生成して検証に用いることと決定した。本発明者らは、ＰＳＭＢ５中の９個のアミノ酸残基（Ｒ７８、Ｔ８０、Ｖ９０、Ｍ１０４、Ａ１０８、Ｄ１１０、Ｃ１１１、Ｃ１２２、およびＧ２４２）を選択し、対照としてＤ１１０とＣ１１１を含めた。点突然変異のための適切なアミノ酸を選択するために、スクリーニング結果または以前に報告された突然変異型からのが好ましい。残りについては、全ての置換をアラニンにした（表２）。以下のいずれかの突然変異を含むドナーでトランスフェクトされた細胞は、可変数のボルテゾミブ耐性コロニーであるＲ７８Ｎ、Ｔ８０Ａ、Ｖ９０Ａ、Ｍ１０４Ａ、Ａ１０８Ｔ、Ｃ１２２Ｆ、およびＧ２４２Ｄを生成した（図９Ｄ）。対照的に、Ｄ１１０ＡおよびＣ１１１Ａはボルテゾミブ耐性コロニーを生成することができず、これは、本発明者らの検証方法が信頼できることを示している（図９Ｄ）。興味深いことに、本発明者らのスクリーニングおよび検証結果とは異なり、ＳＷ１５７３およびＣＥＭ（２１、２５）においてＣ１１１部位がＰＳＭＢ５にとって重要であることが以前に報告された（図９Ｄ）。この違いは、アミノ酸の作用が生物学的環境から影響を受けること、または耐性表現型生成のために正しいアミノ酸置換を生成することができないことを示す。ボルテゾミブ耐性のプールされた細胞を検証するために、本発明者らは、遺伝子座を標的とするゲノム領域をシークエンシングし、これらの全て７つの部位が予想される突然変異を含むことを確
認した（図１１および表３）。本発明者らの結果をさらに検証するために、本発明者らは、いくつかの突然変異ライブラリーから個々のクローンを単離し（図１２）、細胞生存率アッセイを行った。点突然変異のＲ７８Ｎ、Ｖ９０Ｌ、Ａ１０８Ｔ、Ｃ１２２Ｆ、およびＧ２４２Ｄがボルテゾミブに耐性を付与することを証明した（図９Ｅ）。これらのうち、Ｔ８０およびＡ１０８はＰＳＭＢ５とボルテゾミブ（２０－２２）の直接結合に関与し、Ｒ７８、Ｍ１０４およびＣ１２２の突然変異は、薬物結合部位構造を破壊することによってボルテゾミブに耐性（２２、２６、２７）を付与することが報告された。Ｇ２４２は、メカニズムはまだ不明であるが、ボルテゾミブ感受性に関連する別の既知の部位である （２７）。Ｖ９０部位は新たな発見である。本発明者らは、２つの独立したＶ９０Ｌクローンを選択し、両者は全て薬物耐性を付与した。Ｖ９０が薬物感受性をどのように媒介するか、Ｖ９０突然変異がボルテゾミブ結合ポケット（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ）の周囲の構造を変化させるかどうかは、まだ決定されていない。
認した（図１１および表３）。本発明者らの結果をさらに検証するために、本発明者らは、いくつかの突然変異ライブラリーから個々のクローンを単離し（図１２）、細胞生存率アッセイを行った。点突然変異のＲ７８Ｎ、Ｖ９０Ｌ、Ａ１０８Ｔ、Ｃ１２２Ｆ、およびＧ２４２Ｄがボルテゾミブに耐性を付与することを証明した（図９Ｅ）。これらのうち、Ｔ８０およびＡ１０８はＰＳＭＢ５とボルテゾミブ（２０－２２）の直接結合に関与し、Ｒ７８、Ｍ１０４およびＣ１２２の突然変異は、薬物結合部位構造を破壊することによってボルテゾミブに耐性（２２、２６、２７）を付与することが報告された。Ｇ２４２は、メカニズムはまだ不明であるが、ボルテゾミブ感受性に関連する別の既知の部位である （２７）。Ｖ９０部位は新たな発見である。本発明者らは、２つの独立したＶ９０Ｌクローンを選択し、両者は全て薬物耐性を付与した。Ｖ９０が薬物感受性をどのように媒介するか、Ｖ９０突然変異がボルテゾミブ結合ポケット（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ）の周囲の構造を変化させるかどうかは、まだ決定されていない。
ＰＬＫ１について、本発明者らは、２つの上位にある残基（Ｒ１３６、Ｆ１８３）および１つの潜在的な偽陰性部位（Ｃ６７）を検証した。報告によれば、Ｒ１３６はＢＩ２５３６の重要なアミノ酸であり、ＰＬＫ１とＢＩ２５３６との結合時、Ｆ１８３が構造的に重要である（２２、２３）。これらの３つの部位の１つにおける点突然変異は、プールされたアッセイにおいてＢＩ２５３６に抵抗性を付与した（図１０Ｄ）。
ミスセンス突然変異については、各アミノ酸は１９種の非同義置換を有する。本発明者らは、異なる置換が異なる効果を有し得るが、いくつかの変化が表現型の差異を生じ得ないと仮定する。ＣＲＥＳＭＡＳポリシーがこのような詳細を生成できるかどうかを調べるために、本発明者らは、各ＰＳＭＢ５およびＰＬＫ１スクリーニングから最初の１０個のヒットのミスセンス突然変異データを検索し、アミノ酸パターン分析を行った。本発明者らは、これらのアミノ酸の明確なパターン選好を明らかにし、何らかの置換のみが細胞に薬物耐性を付与し得ることを示した（図１３Ａ－Ｂ）。ほとんどの部位における複数の置換は、薬物阻害の致死作用を回避することができ、例えばＶ９０ＰＳＭＢ５およびＡ３８６ＰＫ１（図１３Ｃ－Ｄ）が挙げられ、いくつかの部位における単一の特定の置換のみは薬物耐性を付与することができ、例えば、ＰＳＭＢ５についてはＭ１０４ＩおよびＣ１２２Ｙが挙げられ（図１３Ｅ）、ＰＬＫ１についてはＦ１８３Ｌが挙げられる（図１３Ｆ）。Ｒ１３６ＧＰＬＫ１は、唯一の突然変異型ではないが、ＢＩ２５３６細胞に耐性を付与する主要な形態である（図１３Ｆ）。同様に興味深いことに、ＰＳＭＢ５、Ａ１０５、およびＡ４３のうち２つの部位が非常に類似した突然変異選好パターンを有し（図１３Ｇ）、そのＰｅａｒｓｏｎ相関係数が０．５４である（図１３Ｈ）ことが留意される。
ミスセンス突然変異については、各アミノ酸は１９種の非同義置換を有する。本発明者らは、異なる置換が異なる効果を有し得るが、いくつかの変化が表現型の差異を生じ得ないと仮定する。ＣＲＥＳＭＡＳポリシーがこのような詳細を生成できるかどうかを調べるために、本発明者らは、各ＰＳＭＢ５およびＰＬＫ１スクリーニングから最初の１０個のヒットのミスセンス突然変異データを検索し、アミノ酸パターン分析を行った。本発明者らは、これらのアミノ酸の明確なパターン選好を明らかにし、何らかの置換のみが細胞に薬物耐性を付与し得ることを示した（図１３Ａ－Ｂ）。ほとんどの部位における複数の置換は、薬物阻害の致死作用を回避することができ、例えばＶ９０ＰＳＭＢ５およびＡ３８６ＰＫ１（図１３Ｃ－Ｄ）が挙げられ、いくつかの部位における単一の特定の置換のみは薬物耐性を付与することができ、例えば、ＰＳＭＢ５についてはＭ１０４ＩおよびＣ１２２Ｙが挙げられ（図１３Ｅ）、ＰＬＫ１についてはＦ１８３Ｌが挙げられる（図１３Ｆ）。Ｒ１３６ＧＰＬＫ１は、唯一の突然変異型ではないが、ＢＩ２５３６細胞に耐性を付与する主要な形態である（図１３Ｆ）。同様に興味深いことに、ＰＳＭＢ５、Ａ１０５、およびＡ４３のうち２つの部位が非常に類似した突然変異選好パターンを有し（図１３Ｇ）、そのＰｅａｒｓｏｎ相関係数が０．５４である（図１３Ｈ）ことが留意される。
要するに、ＣＲＥＳＭＡＳは配列－機能マッピングを生成する強力な方法である。トランケーション突然変異誘発を使用して潜在的な機能ドメインを同定することは、通常、非常に面倒であり、タンパク質のサイズが大きすぎると、ますます困難になる。目的タンパク質の全長にわたる各アミノ酸の意味を評価することは、不可能ではないにしても技術的に困難である。最近、Ｇｉｌｌｓ及び共同研究者らは、細菌又は酵母において目的タンパク質の機能関連突然変異をマッピングする方法を記載したが、この方法は、相同組換え率に大きく依存し、高等真核生物におけるその効率的な適用を妨げる（２８）。大型タンパク質を処理する場合、ＣＲＥＳＭＡＳは非常に強力である。さらに、複数の遺伝子を同時にスキャンして、その対応するタンパク質の機能エレメントを得ることができる。
ＣＲＩＳＰＲ飽和突然変異誘発は、各アミノ酸を網羅する多重突然変異を提供する。多くの他の方法とは異なり、インフレームまたは点突然変異の方面においてごくわずかな割合のＮＧＳデータのみがＣＲＥＳＭＡＳに有用なリードである。本発明者らは、データ前処理中に大量のリードをフィルタリングしたが、本発明者らのバイオインフォマティクスプロセスが十分に高感度であり、中程度のシークエンシング深度で残りのリードから機能エレメントをマッピングできることを見出した。本発明者らが全て６つのアッセイにおいてタンパク質機能に重要なアミノ酸の大部分を同定できるという事実は、ＣＲＥＳＭＡＳが低い偽陰性率を有することを示す。
ＣＲＥＳＭＡＳ方法は突然変異によりタンパク質機能を消失させるすべての残基を潜在的に発見する可能性がある。しかしながら、これは、ＣＲＥＳＭＡＳスクリーニングから得られた各ヒットがタンパク質機能に直接関連することを意味しない。いくつかの残基は、所定のタンパク質の全体構造にとって重要であるが、タンパク質の酵素活性またはその相互作用パートナーとの接触を直接媒介しない場合がある。例えば、本発明者らは、毒素のエンドサイトーシスに直接関与することなく受容体機能を維持する重要な領域であるＡＮＴＸＲ１の膜貫通ドメイン内に位置する複数のヒット（図５Ｂ）を同定した。
ＣＲＥＳＭＡＳポリシーは、単なるタンパク質の研究に限定されない。それはまた、ノンコーディングＲＮＡ、プロモーターおよびエンハンサーなどの調節エレメントの機能図を得るのに非常に適している。解決手段の補正は、上記のｃＤＮＡ上ではなくゲノム上の標的化領域上でのＰＣＲ増幅である。
Claims (42)
- ゲノム配列の機能的エレメントを同定するためのライブラリーであって、複数のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡを含み、前記ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの連続ゲノム領域内の複数のゲノム配列を標的とすることができるガイド配列を含み、前記ガイドＲＮＡは、１００個以上のゲノム配列を標的とし、前記ゲノム配列には、前記連続ゲノム領域の１０００塩基対ごとにＰＡＭ配列の上流にある非重複切断部位を含む、ライブラリー。
- 前記ライブラリーは前記連続するゲノム領域内の各ＰＡＭ 配列の上流にあるゲノム配列を標的とするガイドＲＮＡを含む、請求項１に記載のライブラリー。
- 各ガイドＲＮＡ が、ＤＳＢ 部位の周囲約１０ｂｐ に影響を及ぼすように設計されている、請求項１または２に記載のライブラリー。
- 前記ＰＡＭ配列が少なくとも１つのＣａｓタンパク質に特異的である、請求項１から３のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡが、少なくとも１つのＣａｓタンパク質に特異的な複数のＰＡＭ配列に基づいて選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記標的が、前記連続ゲノム領域のＮＨＥＪ をもたらす、請求項１から５のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記複数のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ システムガイドＲＮＡ のうちの少なくとも一つのガイドＲＮＡの前記標的は、細胞表現型を変化させ、および／または遺伝子の転写および／または発現を増加または減少させる、請求項１から６のいずれか一項に記載のライブラリー。
- プラスミドライブラリー又はウイルスライブラリーである、請求項１から７のいずれか一項に記載のライブラリー。
- ベクターライブラリー又は宿主細胞ライブラリーである、請求項１から７のいずれか一項に記載のライブラリー。
- ゲノム配列の機能的エレメントを同定する方法であって、
（ａ） 前記請求項のいずれか１項に記載のライブラリーを、各細胞が１つ以下のガイドＲＮＡを含む、少なくとも１つのＣａｓタンパクを含むことに適合する細胞集団に導入すること；
（ｂ） 細胞表現型の変化に基づいて前記細胞を少なくとも二つのグループに選別すること；
（ｃ） 各グループにガイドＲＮＡ の相対的な表現を決定し、それによって各グループに存在するガイドＲＮＡの表現によって前記細胞表現型の変化に関連するゲノム部位を決定すること；
（ｄ） シークエンシングのために、標的遺伝子の１つまたは複数のｃＤＮＡまたはＤＮＡ配列を増幅すること、
（ｅ） シークエンシングリードを前記標的遺伝子の参照配列にマッピングすること；
（ｆ） 前記リードをフィルターし、ミスセンス突然変異またはインフレーム欠失を有するリードのみを残すこと；および
（ｇ） バイオインフォマティクスプロセスを適用することにより、前記細胞の表現型に対する各アミノ酸またはヌクレオチドの重み付けが決定されること、を含む、方法。 - 前記細胞表現型の変化は、機能の喪失、機能の獲得、遺伝子転写の減少、遺伝子転写の増加、遺伝子発現の減少および遺伝子発現の増加からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
- 前記ゲノム配列が機能性タンパク質をコードするために使用される、請求項１０又は１１に記載の方法。
- 単一アミノ酸分解能で前記タンパク質の機能的エレメントを同定するために使用される、請求項１２に記載の方法。
- 前記ゲノム配列が、非コードＲＮＡまたは遺伝子調節的エレメントをコードするために使用される、請求項１０または１１に記載の方法。
- 前記遺伝子調節的エレメントが、プロモーター又はエンハンサーである、請求項１４に記載の方法。
- 前記同定が天然の生物学的背景にある、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオインフォマティクスフローは
（ｈ） ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異比率を以下のように計算する：
（ｋ） 実験群と対照群との間の倍数変化を計算する、
（ｌ） 各アミノ酸の必須性スコアを以下のように算出する：
（１） 突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各アミノ酸についてスコア突然変異＝－ｌｏｇ １０（Ｐ 値）を計算する、
（２） 欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、運転者の欠失と乗客の欠失に次のように重み付けを付ける：
欠失倍数変化＝運転者の倍数変化＋α＊乗客の倍数変化、続いて、１００回並べ替えてヌル分布を確立し、且つアミノ酸ごとにスコア欠失＝－ｌｏｇ １０（Ｐ 値）を計算する、
（３）スコア突然変異及びスコア欠失を以下のように正規化する：
ａ ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
必須スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ＊スコアＧＨＩＪＩＫＬＭ＋ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭ
である、ことを含み、請求項１０～１６のいずれか一項に記載の方法。 - 薬物又は毒素の耐性に関連する機能的エレメントをスクリーニングする方法であって、
（ａ） 前記請求項のいずれか１項に記載のライブラリーを、各細胞が１つ以下のガイドＲＮＡを含む、少なくとも１つのＣａｓタンパクを含むことに適合する細胞集団に導入すること；
（ｂ） 前記薬物又は毒素で前記細胞集団を処理し且つ前記薬物又は毒素に対する耐性の変化に基づいて細胞を少なくとも二つのグループに分類すること；
（ｃ） 各グループにガイドＲＮＡ の相対的な表現を決定し、それによって各グループに存在するガイドＲＮＡの表現によって前記耐性の変化に関連するゲノム部位を決定すること；
（ｄ） シークエンシングのために、標的遺伝子の１つまたは複数のｃＤＮＡまたはＤＮＡ配列を増幅すること、
（ｅ） シークエンシングリードを前記標的遺伝子の参照配列にマッピングすること；
（ｆ） 前記リードをフィルターし、ミスセンス突然変異またはインフレーム欠失を有するリードのみを残すこと；および
（ｇ） バイオインフォマティクスプロセスを適用することにより、前記薬物または毒素に対する各アミノ酸またはヌクレオチドの耐性の重み付けを決定されること、を含む方法。 - 前記ゲノム配列が、機能性タンパク質をコードするものである、請求項１８に記載の方法。
- 単一アミノ酸分解能で前記タンパク質の機能的エレメントを同定するために使用される、請求項１９に記載の方法。
- 前記ゲノム配列が、ノンコーディングＲＮＡまたは遺伝子調節的エレメントをコードするために使用される、請求項１８に記載の方法。
- 前記遺伝子調節的エレメントが、プロモーター又はエンハンサーである、請求項２１に記載の方法。
- 前記同定が天然の生物学的背景にある、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団が、少なくとも一つの連続ゲノム領域内の複数のゲノム配列を標的とすることが可能なガイド配列を含む複数のガイドＲＮＡ に導入され、前記ガイドＲＮＡ が、連続するゲノム領域内の１０００塩基対ごとのＰＡＭ配列の上流にある非重複切断部位を含む。連続ゲノム領域内の１０００塩基対ごとのＰＡＭ配列の上流にある非重複切断部位を含むなくとも１００のゲノム配列を標的とする、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 各ガイドＲＮＡ が、ＤＳＢ 部位の周囲約１０ｂｐ に影響を及ぼすように設計される、請求項２４に記載の方法。
- 前記ＰＡＭ 配列が、少なくとも一つのＣａｓ タンパク質に特異的である、請求項２４または２５に記載の方法。
- 前記ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのガイドＲＮＡは、少なくとも１つのＣａｓタンパク質に特異性的な複数のＰＡＭ配列に基づいて、選択される、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオインフォマティクスパイプラインが
（ｈ） ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異比率を以下のように計算する：
（ｋ） 実験群と対照群との間の倍数変化を計算する、
（ｌ） 各アミノ酸の必須性スコアを以下のように算出する：
（１） 突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各アミノ酸についてスコア突然変異＝－ｌｏｇ １０（Ｐ 値）を計算する、
（２） 欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、欠失した運転者と欠失した乗客に次のように重みを付ける：
欠失倍数変化＝運転者の倍数変化＋α＊乗客の倍数変化、続いて、１００回並べ替えてヌル分布を確立し、且つアミノ酸ごとにスコア欠失＝－ｌｏｇ １０（Ｐ 値）を計算する、
（３） スコア突然変異及びスコア欠失を以下のように正規化する：
ａ ＝欠失倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
必須性スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ＊ＧＨＩＪＩＫＬＭ ＋ ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭであること、を含む、請求項１８～２７のいずれか一項に記載の方法。 - 目的タンパク質の機能的エレメントを同定する方法であって、細胞集団に導入されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いて前記目的タンパク質をコードするゲノム遺伝子を破壊することで、前記目的タンパク質に飽和突然変異誘発を行い、標的遺伝子のＤＮＡ およびｃＤＮＡ をシークエンシングすることにより表現型の変化に関連する破壊されたゲノム部位を決定し、前記表現型の変化を引き起こすインフレーム突然変異を検索すること、および単一のアミノ酸分解能で前記目的タンパク質の機能的エレメントを同定するためのバイオインフォマティクスプロセスを確立することを含む、方法。
- 前記目的タンパク質の機能的エレメントは、その天然の生物学的背景において同定される、請求項２９に記載の方法。
- インフレーム突然変異が、インフレーム欠失及びミスセンス部位特異的突然変異である、請求項２９又は３０に記載の方法。
- 前記細胞表現型の変化は、機能の喪失、機能の獲得、遺伝子転写の減少、遺伝子転写の増加、遺伝子発現の減少および遺伝子発現の増加からなる群から選択される、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
- 単一アミノ酸分解能で前記タンパク質の機能的エレメントを同定するための、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記破壊は前記細胞集団内の各細胞に一つ又は複数のベクターのベクターシステムを導入することを含み、前記ベクターシステムが、
Ｉ． 調節的エレメントに作動可能に連結されたＣａｓ タンパク質またはＣａｓ タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、および
ＩＩ． 前記目的タンパク質をコードするゲノム遺伝子を標的とするガイドＲＮＡを、含む、操作された非天然のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含み、
成分ＩとＩＩは同じまたは異なるベクター上にあり、それらが転写されると、ガイド配列を含むガイドＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとゲノム遺伝子の標的配列とは特異的に結合するようにガイドし、前記Ｃａｓタンパク質によるゲノム領域の切断を誘導する、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の方法。 - 前記１つまたは複数のベクターはプラスミドベクターである、請求項３４に記載の方法。
- 前記調節的エレメントが、誘導性プロモーターである、請求項３４または３５に記載の方法。
- 前記集団内の各細胞が一つ以下のガイドＲＮＡ を含み、前記細胞集団に導入された複数のガイドＲＮＡ が、前記目的タンパク質をコードする少なくとも１つの連続ゲノム領域内の複数のゲノム配列を標的とすることができるガイド配列を含み、そのガイドＲＮＡは、１００個以上のゲノム配列を標的とし、前記ゲノム配列には、前記連続ゲノム領域の１０００塩基対ごとにＰＡＭ配列の上流にある非重複切断部位を含む、請求項２９～３６のいずれか一項に記載の方法。
- 各ガイドＲＮＡ が、ＤＳＢ 部位の周囲約１０ｂｐ に影響を及ぼすように設計される、請求項３７に記載の方法。
- 前記ＰＡＭ 配列が、少なくとも一つのＣａｓ タンパク質に特異的である、請求項３７または３８に記載の方法。
- 前記ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのガイドＲＮＡ が、少なくとも一つのＣａｓ タンパク質に特異的な複数のＰＡＭ 配列に基づいて選択される、請求項２９～３９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオインフォマティクスフローは
前記バイオインフォマティクスツールを用いて、シークエンシングリードを標的遺伝子の参照配列にマッピングする、
リードをフィルターし、ミスセンス突然変異またはインフレーム欠失を有するリードのみを残す、
ミスセンス突然変異を含む断片について、各アミノ酸の突然変異比率を以下のように計算する：
ｉｉｉ ）実験群と対照群との間の倍数変化を計算する、
ｉｖ ）各アミノ酸の必須性スコアを以下のように算出する：
（１） 突然変異倍数変化については、全ての倍数変化に基づいてヌル分布を確立し、各アミノ酸についてスコア突然変異＝－ｌｏｇ １０（Ｐ 値）を計算する、
（２） 欠失の倍数変化に対し、まず調整可能なパラメーターαを適用して、欠失した運転者と欠失した乗客に次のように重みを付ける：
欠失倍数変化＝運転者の倍数変化＋α＊乗客の倍数変化、続いて、１００回並べ替えてヌル分布を確立し、且つアミノ酸ごとにスコア欠失＝－ｌｏｇ １０（Ｐ 値）を計算する、
（３） スコア突然変異及びスコア欠失を以下のように正規化する：
ａ ＝欠失の倍数変化＞１のアミノ酸の数
ｂ ＝突然変異の倍数変化＞１のアミノ酸の数
必須性スコア＝ｗＧＨＩＪＩＫＬＭ＊ＧＨＩＪＩＫＬＭ ＋ ｗＳＴＵＴＩＫＬＭ＊スコアＳＴＵＴＩＫＬＭであることを含む、請求項２９～４０のいずれか一項に記載の方法。 - 必須スコアに基づいてアミノ酸の機能的重要度に基づいてアミノ酸をランク付けすることをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
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