TW202136513A

TW202136513A - 靶向編輯rna的新方法

Info

Publication number: TW202136513A
Application number: TW109147079A
Authority: TW
Inventors: 袁鵬飛; 易澤軒; 劉能銀
Original assignee: 大陸商博雅輯因（北京）生物科技有限公司
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2021-10-01
Also published as: AU2020417930A1; JP2023509178A; CA3163281A1; CN114728080A; EP4085931A4; IL294336A; US20230060517A1; WO2021136520A1; EP4085931A1; KR20220122727A

Abstract

本申請涉及一種使細胞中靶標RNA中的靶標胞嘧啶脫氨基的方法，包括將經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域或表現該經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體和包含將所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域募集到所述靶標RNA的arRNA寡核苷酸或表現該arRNA的構建體導入所述細胞。同時，本申請提供了一種用於RNA編輯的工程化組合物或系統，以及應用該工程化組合物或系統校正T到C突變治療疾病的用途。

Description

靶向編輯RNA的新方法

本申請屬於基因編輯治療領域，具體地，本申請創造了一種名為CUSPER(C to U Specific Programmable Editing of RNA)的靶向編輯RNA的方法，其包括利用CUSPER技術進行RNA上由C到U鹼基的精準位點編輯，可用於治療由於T到C突變導致的疾病。

近年來，以CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)為首的基因組編輯技術正在飛速發展，並對生物以及醫學諸多領域產生了深遠的影響。許多科研工作者和生物技術公司也在致力於將該技術推上臨床。2019年9月，北京大學鄧宏魁教授與其合作者發表文章11首次報導了利用CRISPR技術編輯幹細胞並將其回輸至患者，以治療其愛滋病和白血病的臨床試驗結果，為CRISPR技術在基因治療方向的轉化做出了巨大的貢獻。

儘管CRISPR技術存在極大的應用前景，但該技術也存在一系列缺陷，導致該技術從科研階段向臨床治療應用的轉化步履維艱。問題之一便是CRISPR技術用到的核心作用酶：Cas9。基於CRISPR的DNA編輯技術，必須外源表現Cas9或擁有相似功能的其它核酸酶，從而造成了以下幾個問題。首先，需要外源表現的核酸酶通常具有較大的分子量，這使得通過病毒載劑將其遞送至體內的效率急劇下降。其次，由於核酸酶的外源表現，使這種方法存在潛在的核酸酶脫靶可能，這將導致其應用中的潛在致癌風險。最後，外源表現的Cas9等類似核酸酶是從細菌中發現的，而非人類或哺乳動物天然存在的，這使其可能引起患者體內的免疫反應，這一態樣可能會對患者自身造成損傷，另一態樣也可能會使外源表現的核酸酶被中和，從而失去應有的活性，影響治療效果。

2017年，麻省理工學院張鋒教授及其課題組報導了一種名為REPAIR (RNA Editing for Programmable A to I Replacement)的RNA編輯技術，通過外源表現Cas13-ADAR融合蛋白及單嚮導RNA (single guide RNA, sgRNA)可以實現靶向目標RNA的A到I的編輯2，但是該方法同CRISPR技術一樣，仍需要外源蛋白的表現。無法解決外源蛋白表現造成的問題。

2019年1月，Thorsten Stafforst課題組報導了名為RESTORE (recruiting endogenous ADAR to specific trans for oligonucleotide-mediated RNA editing, Merkle et al., 2019)的RNA單鹼基編輯技術。RESTORE能夠擺脫對外源蛋白的依賴，但RESTORE技術需要在IFN-γ存在的前提下才能有較高的編輯效率，而IFN-γ是決定自體免疫發展和嚴重程度的關鍵因數9，這使得該技術在醫學領域的應用大打折扣。另一態樣，RESTORE技術中同樣也用到一段嚮導RNA，而其使用的嚮導RNA是化學合成的寡核苷酸，並且其合成的寡核苷酸需要人為引入大量的化學修飾以保證其穩定性。在此等化學修飾中，有一部分是非天然的修飾，使得該寡核苷酸可能存在毒性或免疫原性；還有一部分修飾會導致相同鹼基鏈的不同構象，使得對於相同的RNA序列，可能有數十種不同的構象組合，這增加了其向細胞內遞送的難度。

2019年7月，北京大學魏文勝教授課題組在Nature Biotechnology上發表的文章⁴ 中，首次報導了一種核酸編輯技術：LEAPER (Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing of RNA)。與CRISPR技術不同的是，一態樣該技術從原理上擺脫了對外源核酸酶過表現的依賴，並且可以通過化學合成RNA完成，也可以通過腺相關病毒(AAV)、慢病毒等載劑遞送至患者發揮功能，這使得其遞送手段的選擇上更加靈活多變，使得該技術在向醫學領域轉化的過程中，具有更大的優勢；另一態樣該技術只能實現腺苷A到肌酐I（肌酐I在蛋白質翻譯過程中會被識別為鳥酐G）的編輯，使得對其他突變，例如T到C的突變無能為力。此外，與CRISPR技術類似，該技術同樣需要一段RNA作為嚮導，以便將內源的核酸酶招募至所需編輯的位點。該段嚮導RNA被命名為arRNA (adar-recruiting RNA)。

2019年7月，張鋒教授課題組報導了一種名為RESCUE（RNA Editing for Specific C to U Exchange)的新技術¹ 。該技術基於2017年該課題組報導的Cas13-ADAR基本骨架，在負責反應的ADAR催化結構域上做了不同的突變嘗試。最終將ADAR催化結構域的A到I編輯活性修改為C到U編輯活性，從而實現了特定位點RNA上C到U的編輯，進一步拓展了對鹼基的精準編輯範疇。然而，該技術仍需要外源表現Cas13與ADAR突變後的融合蛋白，無法解決細菌源蛋白表現造成的問題。

為了解決上述基因編輯技術中的問題，以便將基因編輯技術更好地應用於醫學領域，迫切地需要找到一種易於遞送且可高效精準糾正T至C突變的定向基因編輯技術。

本申請創造了一種新的RNA編輯技術CUSPER (C to U Specific Programmable Editing of RNA)，該技術無需依賴細菌來源的Cas13b的表現，並且將RNA編輯的應用範疇從A到I的編輯拓展到C到U的編輯。

在本申請中，一態樣由於無需依賴細菌來源的大分子蛋白的表現，因此減少了潛在的免疫系統風險，和因免疫系統對外源蛋白的攻擊而對系統編輯效率帶來的影響；另一態樣，隨著需要引入的蛋白分子量的顯著縮減，其遞送方式也變得更加靈活，可以包括化學轉化及生物學遞送，例如AAV遞送等。因此，本申請提供的技術方案，不僅解決了C到U的單鹼基編輯技術問題，而且提高了編輯系統的安全性、穩定性和使用的靈活性，更加利於體內應用，更具生物醫藥領域的應用前景。

具體地，本申請涉及：

1. 一種用於RNA編輯的工程化組合物或系統，包含： 1）經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域或表現該經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體，其中，所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域經過修飾具有催化胞苷脫氨基的活性，和 2）將所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域募集到靶標RNA的arRNA或包含該arRNA或包含其編碼序列的構建體；其中所述arRNA包含與所述靶標RNA雜交的互補RNA序列，並且所述arRNA募集所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域至靶標RNA致使靶標RNA中的靶標胞苷脫氨基。

在一些實施方案中，所述表現經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體和包含所述arRNA的編碼序列的構建體為同一構建體。在一些實施方案中，所述表現經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體和包含所述arRNA的編碼序列的構建體為分開的構建體。

在一些實施方案中，本申請的經修飾的腺苷脫氨酶蛋白是腺苷脫氨酶蛋白（例如ADAR2蛋白）經過缺失、添加或取代一個或多個胺基酸而具有胞苷脫氨基的活性的蛋白質。在一些實施方案中，本申請的經修飾的腺苷脫氨酶蛋白是腺苷脫氨酶蛋白（例如ADAR2蛋白）或其催化結構域是經過取代一個或多個胺基酸而具有胞苷脫氨基的活性的蛋白質。在一些實施方案中，本申請經修飾的腺苷脫氨酶蛋白包含如下突變修飾： E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T，其中所述突變修飾的胺基酸編號與NP_001103.1中的胺基酸編號一致。在一些實施方案中，本申請經修飾的腺苷脫氨酶蛋白包含以其它ADAR2同源蛋白作為參考序列並具有 E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T相應突變的蛋白。

在一些實施方案中，本申請用於RNA編輯的工程化組合物或系統包含上述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白的催化結構域。在一些實施方案中，所述催化結構域為上述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白的催化結構域。

2. 項1的工程化組合物或系統，其中所述腺苷脫氨酶在一個或多個位點發生突變修飾從而具有對胞苷脫氨使其轉化成尿苷的活性。

3. 項2的工程化組合物或系統，其中所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域為ADAR2蛋白或其同源蛋白或其催化結構域。

4. 項3中的工程化組合物或系統，其中所述突變修飾包含： E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T，其中所述突變修飾的胺基酸編號與NP_001103.1中的胺基酸編號一致。

在一些實施方案中，所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域為NP_001103.1蛋白的同源蛋白，具有與如下突變相應的突變： E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T。

5. 項1-4中任一項的工程化組合物或系統，其中所述arRNA與靶標RNA雜交時，其與靶標胞苷相對的靶向鹼基為A、U、C、或G。

6. 項5中所述的工程化組合物或系統，其中所述靶向鹼基為U或C。

7. 項1-6中任一項的工程化組合物或系統，其中：

所述arRNA在對應於靶標RNA的靶標鹼基的上游、下游、或上游和下游的一個或多個位置包含非配對核苷酸，以形成和靶標鹼基上游、下游、或上游和下游的一個或多個位置的核苷酸錯配。

8. 項7中的工程化組合物或系統，其中所述arRNA靶向鹼基的3’最近鄰鹼基與靶標RNA形成錯配。

9. 項8中所述的工程化組合物或系統，其中所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶向鹼基的3’最近鄰鹼基與靶標RNA形成G-G錯配。

10. 項1-9中任一項的工程化組合物或系統，所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶向鹼基的5’最近鄰鹼基與靶標RNA不形成錯配。

11. 項10中的工程化組合物或系統，其中所述靶向鹼基的5’最近鄰鹼基為U。

12. 項9中的工程化組合物或系統，其中當所述arRNA與靶標RNA雜交時，與所述arRNA的靶向鹼基的5’最近鄰鹼基相對的靶標RNA中的鹼基優選次序從高到低為G或C、U或A（G≈C＞U≈A）。

13. 項1-6中任一項的工程化組合物或系統，其中當所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶標鹼基及其5’和3’相鄰鹼基形成的靶標鹼基三聯體僅在靶標鹼基處形成錯配，其中所述靶標鹼基三聯體選自：ACG、ACC、UCC、UCG、CCC、CCG、UCA、UCU。

14. 項1-13任一項的工程化組合物或系統，其中所述arRNA長度＞50nt、＞55nt、＞60nt、＞65nt、＞70nt、＞75nt、＞80nt、＞85nt、＞90nt、＞95nt、＞100nt、＞105nt、＞110nt、＞115nt、＞120nt。在一些實施方案中，所述arRNA長約151-53 nt、131-61 nt、121-61 nt、111-65、101-71 nt、91-71 nt、81-71 nt。在一些具體實施方案中，所述arRNA的長度是該項定義的長度範疇內的任一正整數。

15. 項1-14任一項的工程化組合物或系統，其中所述arRNA中靶向鹼基距離3’端及5’端的長度相等。

16. 項1-14中任一項的組合物，其中所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度為45-5nt，40-5nt，35-10nt，25nt-15nt，24nt-11nt。在一些具體實施方案中，所述arRNA的長度是該項定義的長度範疇內的任一正整數。

17. 項1-14任一項的工程化組合物或系統，其中所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度為80-30nt，70-35nt，60-40nt，55nt-35nt，55nt-45nt。在一些具體實施方案中，所述arRNA的長度是該項定義的長度範疇內的任一正整數。

18. 項1-17任一項的工程化組合物或系統，其中所述arRNA是化學修飾的。

19. 項18的工程化組合物或系統，其中所述化學修飾包括2’-O-甲基修飾或核苷酸間3’硫代修飾。

20. 一種使細胞中靶標RNA中的靶標胞嘧啶脫氨基的方法，包括將如下1）和2）導入所述細胞： 1）經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域或表現該經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體，和 2）將所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域募集到所述靶標RNA的arRNA或包含該arRNA或包含其編碼序列的構建體，其中，所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域經過修飾具有催化胞苷脫氨基的活性，所述arRNA包含與所述靶標RNA雜交的互補RNA序列，並且所述arRNA募集所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域至靶標RNA致使靶標RNA中的靶標胞苷脫氨基。

在一些實施方案中，本申請的經修飾的腺苷脫氨酶蛋白是腺苷脫氨酶蛋白（例如ADAR2蛋白）經過缺失、添加或取代一個或多個胺基酸而具有胞苷脫氨基的活性的蛋白質。在一些實施方案中，本申請的經修飾的腺苷脫氨酶蛋白是腺苷脫氨酶蛋白（例如ADAR2蛋白）或其催化結構域是經過取代一個或多個胺基酸而具有胞苷脫氨基的活性的蛋白質。在一些實施方案中，本申請經修飾的腺苷脫氨酶蛋白包含如下突變修飾： E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T，其中所述突變修飾的胺基酸編號與NP_001103.1中的胺基酸編號一致。在一些實施方案中，本申請經修飾的腺苷脫氨酶蛋白包含以其它ADAR2蛋白作為參考序列並具有 E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T相應突變的蛋白。

在一些實施方案中，本申請用於RNA編輯的工程化組合物或系統包含上述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白的催化結構域。

21. 項20的方法，其中，所述表現經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體和包含所述arRNA的編碼序列的構建體為同一構建體，被同時導入所述細胞，或者所述表現經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體和包含所述arRNA的編碼序列的構建體為分開的構建體，所述分開的構建體被同時或分開地導入所述細胞。

22. 項20或21的方法，其中所述腺苷脫氨酶在一個或多個位點發生突變修飾從而具有對胞苷脫氨使其轉化成尿苷的活性。

23. 項22的方法，其中所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域為ADAR2蛋白或其同源蛋白或其催化結構域。

24. 項23中的方法，其中所述突變修飾包含： E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T，其中所述突變修飾的胺基酸編號與NP_001103.1中的胺基酸編號一致。

25. 項21-24中任一項方法，其中所述arRNA與靶標RNA雜交時，其與靶標胞苷相對的靶向鹼基為A、U、C、或G。

26. 項25中所述的方法，其中所述靶向鹼基為U或C。

27. 項21-26中任一項的方法，其中：

28. 項27中的方法，其中所述arRNA靶向鹼基的3’最近鄰鹼基與靶標RNA形成錯配。

29. 項28中所述的方法，其中所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶向鹼基的3’最近鄰鹼基與靶標RNA形成G-G錯配。

30. 項21-29中任一項的方法，所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶向鹼基的5’最近鄰鹼基與靶標RNA不形成錯配。

31. 項30中的方法，其中所述靶向鹼基的5’最近鄰鹼基為U。

32. 項29中的方法，其中當所述arRNA與靶標RNA雜交時，與所述arRNA的靶向鹼基的5’最近鄰鹼基相對的靶標RNA中的鹼基優選次序從高到低為G或C、U或A（G≈C＞U≈A）。

33. 項21-26中任一項的方法，其中當所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶標鹼基及其5’和3’相鄰鹼基形成的靶標鹼基三聯體僅在靶標鹼基處形成錯配，其中所述靶標鹼基三聯體選自：ACG、ACC、UCC、UCG、CCC、CCG、UCA、UCU。

34. 項21-33任一項的方法，其中所述arRNA長度＞50nt、＞55nt、＞60nt、＞65nt、＞70nt、＞75nt、＞80nt、＞85nt、＞90nt、＞95nt、＞100nt、＞105nt、＞110nt、＞115nt、＞120nt。在一些實施方案中，所述arRNA長約151-53 nt、1131-61 nt、121-61 nt、111-65、101-71 nt、91-71 nt、81-71 nt。在一些具體實施方案中，所述arRNA的長度是該項定義的長度範疇內的任一正整數。

35. 項21-34任一項的方法，其中所述arRNA中靶向鹼基距離3’端及5’端的長度相等。

36. 項21-34中任一項的方法，其中所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度為45-5nt，40-5nt，35-10nt，25nt-15nt，24nt-11nt。在一些具體實施方案中，所述arRNA的長度是該項定義的長度範疇內的任一正整數。

37. 項21-34任一項的方法，其中所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度為80-30nt，70-35nt，60-40nt，55nt-35nt，55nt-45nt。在一些具體實施方案中，所述arRNA的長度是該項定義的長度範疇內的任一正整數。

38. 項21-37任一項的方法，其中所述arRNA是化學修飾的。

39. 項38的方法，其中所述化學修飾包括2’-O-甲基修飾或核苷酸間3’硫代修飾。

40. 項21-39中任一項的方法，其中所述細胞為哺乳動物細胞。

41. 一種治療由T到C突變引起的疾病的方法，包括使用如項21-39中任一項的方法使包含所述T到C突變轉錄形成的信使RNA中靶標鹼基C脫氨基，以校正所述突變。

42. 一種經修飾的腺苷脫氨酶蛋白，其中所述腺苷脫氨酶蛋白為ADAR2，其包含 E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T突變修飾，其中所述突變修飾的胺基酸編號與NP_001103.1中的胺基酸編號一致，所述ADAR2蛋白經過所述突變修飾而具有催化胞苷脫氨基的活性。

43. 如項42中所述的經修飾的腺苷脫氨酶蛋白用於催化胞苷脫氨基轉化為尿苷的用途。

發明詳述

為解決現有基因編輯技術中普遍依賴異種外源蛋白的困境，在更多種類的鹼基上實現精準的單個鹼基編輯，本申請創造了一種RNA編輯技術CUSPER(C to U Specific Programmable Editing of RNA)。CUSPER將RNA編輯的應用範疇從A到I的編輯拓展到C到U的編輯，且由於使用了哺乳動物本身表現的酶蛋白進行編輯，避免了向細胞內引入異種外源蛋白，從而提高了安全性，並使整個基因編輯過程更加高效便利。 [定義]

如本文所用，“CUSPER技術”是本申請技術方案中的原創技術，其中的CUSPER是“C to U Specific Programmable Editing of RNA”的縮寫，即“將胞苷C轉變為尿苷U的特異性可程式設計RNA編輯”。該技術使用一段可與靶標RNA互補雜交的短RNA，將經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或包含其催化結構域的蛋白募集到靶標RNA，以對靶標胞苷脫氨基，使其轉變為尿苷。其中所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或包含其催化結構域的蛋白經修飾而具有催化胞嘧啶脫氨基的活性。所述可與靶標RNA互補雜交的短RNA即arRNA。本申請中所使用的“arRNA(adar-recruiting RNA)”是指可以招募腺苷脫氨酶蛋白或包含其催化結構域至靶標RNA的單鏈RNA，該arRNA募集所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域至靶標RNA致使靶標RNA中的靶標胞苷脫氨基。如本文所用，核酸的“互補”是指一條核酸通過傳統的Watson-Crick鹼基配對與另一條核酸形成氫鍵的能力。百分比互補性表示核酸分子中可與另一核酸分子形成氫鍵(即，Watson-Crick鹼基配對)的殘基的百分比(例如，10個中的約5、6、7、8、9、10 個分別為約50%，60%，70%，80%，90%和100%互補)。“完全互補”是指核酸序列的所有連續殘基與第二核酸序列中相同數量的連續殘基形成氫鍵。如本文所用，“基本上互補”是指在約40、50、60、70、80、100、150、200、250或更多個核苷酸的區域內，至少約70%，75%，80%，85%，90%，95%，97%，98%，99%或100%中的任何一個的互補程度，或指在嚴格條件下雜交的兩條核酸。對於單個鹼基或單個核苷酸，按照Watson-Crick鹼基配對原則，A與T或U、C與G或I配對時，被稱為互補或匹配，反之亦然；而除此以外的鹼基配對都稱為不互補或不匹配。

“雜交”是指其中一種或多種多核苷酸反應形成複合物的反應，所述複合物通過核苷酸殘基的鹼基之間的氫鍵穩定。所述氫鍵可以通過Watson Crick鹼基配對，Hoogstein結合或以任何其他序列特異性的方式發生。能夠與給定序列雜交的序列稱為給定序列的“互補序列”。

如本文所用，術語“遞送”是指將核酸、蛋白等生物大分子通過某些途徑從細胞膜外引入細胞膜內。所述“遞送”例如電轉染、脂質體轉染、脂質-奈米顆粒遞送、病毒遞送、外泌體遞送等方式。

如本文所用，術語“靶標RNA”是指待編輯的目標RNA，其包含待編輯的胞苷。所述靶標RNA可以是成熟mRNA或mRNA前體。所述待編輯的胞苷被稱為“靶標鹼基”、“靶標胞苷”或“靶標C”。在靶標RNA的5’端與靶標胞苷相鄰的鹼基稱為“5’相鄰鹼基”；在靶標RNA的3’端與靶標胞苷相鄰的鹼基稱為“3’相鄰鹼基”；靶標鹼基及其3’和5’ 相鄰鹼基組成的鹼基三聯體在本文中被稱為“靶標鹼基三聯體”。當arRNA與靶標RNA雜交時，在arRNA上與所述靶標鹼基相對的鹼基稱為“靶向鹼基”，在arRNA的5’端與靶向鹼基相鄰的鹼基稱為“5’最近鄰鹼基”；在arRNA的3’端與靶向鹼基相鄰的鹼基稱為“3’最近鄰鹼基”；靶向鹼基及其3’和5’ 最近鄰鹼基組成的鹼基三聯體在本文中被稱為“靶向鹼基三聯體”。

在本文中，靶向鹼基距離3’端的長度是指靶向鹼基的3’最近鄰鹼基至3’最末端鹼基的所有鹼基個數；所述靶向鹼基距離5’端的長度是指靶向鹼基的5’最近鄰鹼基至5’最末端鹼基的所有鹼基個數。

如本文所用，術語“腺苷脫氨酶（Adenosine to inosine acting on RNA enzyme，ADAR)”是指是一類在真核生物（包括人等哺乳動物）各組織中廣泛表現的腺苷脫氨酶，能夠催化RNA分子中腺苷A到肌苷I的轉換。

在本申請中， E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T突變是指發生於ADAR2蛋白的一系列突變，其中所述突變修飾的胺基酸編號與NP_001103.1中的胺基酸編號一致，即使用NP_001103.1作為參考序列。熟習此項技術者應當知曉，對於不同的ADAR2蛋白的參考序列，所述突變中的胺基酸編號可能發生變化。因此，如本申請所用， E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T突變包括不同ADAR2蛋白參考序列中與所述突變胺基酸位置對應的突變，所述ADAR2蛋白經過所述突變修飾而具有催化胞苷脫氨基的活性。相應的，本申請提供的經修飾的腺苷脫氨酶蛋白，包括以NP_001103.1作為參考序列並包含 E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T突變修飾的ADAR2，也涵蓋以不同ADAR2蛋白作為參考序列並包含相應突變修飾的ADAR2。

如本文所用，術語“構建體”是指包含某一核酸序列的核酸載劑，所述核酸載劑可以是線性核酸分子、質粒或病毒載劑等。所述核酸分子可以是單鏈也可以是雙鏈分子。所述特定的核酸序列可以是DNA序列也可以是RNA序列。在一些實施方案中，所述核酸序列不經過轉錄、翻譯或表現而直接發揮其功能。在一些實施方案中，所述核酸序列為DNA序列，其經過轉錄形成RNA後以RNA分子形式發揮功能。在一些實施方案中，所述核酸序列為RNA，其經過翻譯後以多肽或蛋白質的形式發揮作用。在一些實施方案中，所述核酸序列為DNA，其經過轉錄和翻譯步驟形成蛋白質後以蛋白質的形式發揮功能。所述構建體可以通過包裝為病毒、脂質奈米顆粒或外泌體等形式進入細胞，亦可以通過電轉化、顯微注射、化學轉化等方式進入細胞。

本申請所用術語“修飾”是指通過化學方法例如基因工程方法改變核酸或蛋白的組成或結構，從而使所述核酸或蛋白的一項或多項特性或功能發生改變。例如，在本申請中，腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域經過修飾，例如添加、缺失和/或突變一個或多個胺基酸後具有催化胞苷脫氨基的作用。 [工程化組合物或系統]

本申請提供了一種用於RNA編輯的工程化組合物或系統，其包含： 1）經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域或表現該經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體，其中，所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域經過修飾具有催化胞苷脫氨基的活性，和 2）將所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域募集到靶標RNA的arRNA或包含該arRNA或包含其編碼序列的構建體；其中所述arRNA包含與所述靶標RNA雜交的互補RNA序列，並且所述arRNA募集所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域至靶標RNA致使靶標RNA中的靶標胞苷脫氨基。

在一些實施方案中，本申請的經修飾的腺苷脫氨酶蛋白是腺苷脫氨酶蛋白（例如ADAR2蛋白）經過缺失、添加或取代一個或多個胺基酸而具有胞苷脫氨基的活性的蛋白質。在一些實施方案中，本申請的經修飾的腺苷脫氨酶蛋白是腺苷脫氨酶蛋白（例如ADAR2蛋白）或其催化結構域是經過取代一個或多個胺基酸而具有胞苷脫氨基的活性的蛋白質。在一些實施方案中，本申請經修飾的腺苷脫氨酶蛋白包含如下突變修飾： E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T，其中所述突變修飾的胺基酸編號與NP_001103.1中的胺基酸編號一致。在一些實施方案中，本申請經修飾的腺苷脫氨酶蛋白包含以其它ADAR2同源蛋白作為參考序列並具有E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T相應突變的蛋白。

在一些實施方案中，本申請用於RNA編輯的工程化組合物或系統包含上述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域。在一些實施方案中，所述催化結構域為上述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白的催化結構域。

在一些實施方案中，所述腺苷脫氨酶在一個或多個位點發生突變修飾從而具有對胞苷脫氨使其轉化成尿苷的活性。在一些實施方案中，所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域為ADAR2蛋白或其同源蛋白或所述ADAR2蛋白的催化結構域或所述ADAR2蛋白同源蛋白的催化結構域。在一些實施方案中，所述突變修飾包含： E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T，其中所述突變修飾的胺基酸編號與NP_001103.1中的胺基酸編號一致。

在一些實施方案中，所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域通過構建體導入細胞進行表現，所述構建體選自線性核酸、質粒及病毒載劑中的任意。在一些實施方案中，所述細胞為真核細胞。在一些實施方案中，所述細胞為哺乳動物細胞。在一些實施方案中，所述細胞為人細胞。

在一些實施方案中，所述arRNA與靶標RNA雜交時，其與靶標胞苷相對的靶向鹼基為A、U、C、或G。在一些實施方案中，優選的靶向鹼基順序為U＞C＞A≈G，即，當多條arRNA序列相比，其中除靶向鹼基以外其他的所有鹼基均相同時，靶向鹼基為U或C的arRNA通常具有更高的編輯效率。因此優選地，在一些實施方案中，所述靶向鹼基為U或C。

在一些實施方案中，所述arRNA在對應於靶標RNA的靶標鹼基的上游、下游、或上游和下游的一個或多個位置包含非配對核苷酸，以形成和靶標鹼基上游、下游、或上游和下游的一個或多個位置的核苷酸錯配。在一些實施方案中，所述arRNA靶向鹼基的3’最近鄰鹼基與靶標RNA形成錯配。在一些實施方案中，所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶向鹼基的3’最近鄰鹼基與靶標RNA形成G-G錯配。在一些實施方案中，所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶向鹼基的5’最近鄰鹼基與靶標RNA不形成錯配。在一些實施方案中，所述靶向鹼基的5’最近鄰鹼基與靶標RNA不形成錯配，且其中所述靶向鹼基的5’最近鄰鹼基為U。在一些實施方案中，當所述arRNA與靶標RNA雜交時，與所述arRNA的靶向鹼基的5’最近鄰鹼基相對的靶標RNA中的鹼基優選次序從高到低為G或C、U或A。在一些實施方案中，當所述arRNA與靶標RNA互補雜交時，所述arRNA靶向三聯體以外的一個或多個鹼基與靶標RNA形成錯配。並且在一些實施方案中，所述錯配可以進一步提高基於所述arRNA的靶向編輯效率。

在一些實施方案中，當所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶標鹼基及其5’和3’相鄰鹼基形成的靶標鹼基三聯體僅在靶標鹼基處形成錯配，並且，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端及5’端的長度相等，此時，優選地其中所述靶標鹼基三聯體選自：ACG、ACC、UCC、UCG、CCC、CCG、UCA、UCU。在一些實施方案中，當所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶標鹼基及其5’和3’相鄰鹼基形成的靶標鹼基三聯體僅在靶標鹼基處形成錯配，並且，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端及5’端的長度不相等，此時，其中所述靶標鹼基三聯體選自：ACG、ACC、UCC、UCG、CCC、CCG、UCA、UCU。

在一些實施方案中，所述arRNA長度＞50nt、＞55nt、＞60nt、＞65nt、＞70nt、＞75nt、＞80nt、＞85nt、＞90nt、＞95nt、＞100nt、＞105nt、＞110nt、＞115nt、＞120nt。在一些實施方案中，所述arRNA長約151-53 nt、131-61 nt、121-61 nt、111-65、101-71 nt、91-71 nt、81-71 nt。在一些具體實施方案中，所述arRNA的長度是該項定義的長度範疇內的任一正整數。

在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端及5’端的長度相等。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端及5’端的長度不相等。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度為45-5nt，40-5nt，35-10nt，25nt-15nt，24nt-11nt。在一些具體實施方案中，所述長度選自本項定義的長度範疇內的任一正整數。

在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度為80-30nt，70-35nt，60-40nt，55nt-35nt，55nt-45nt。在一些具體實施方案中，所述長度選自本項定義的長度範疇內的任一正整數。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度大於80。

在一些實施方案中，所述arRNA由化學合成。在一些實施方案中，所述arRNA為寡核苷酸。在一些實施方案中，所述arRNA是化學修飾的。在一些實施方案中，所述化學修飾包括2’-O-甲基修飾或核苷酸間3’硫代修飾。在一些實施方案中，所述化學修飾選自如下的一項或多項：序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾，前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接，序列中全部U均被2`-OMe修飾，靶向鹼基的3’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的A，靶向鹼基的5’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的C，靶向鹼基與其3’最近鄰鹼基和5’最近鄰鹼基分別以硫代磷酸酯鍵連接，前5個和後5個核苷酸分別被2`-OMe修飾，和前5個和後5個核苷酸間連接為硫代磷酸酯鍵連接。

在一些實施方案中，所述arRNA由一種構建體編碼並轉錄生成。在一些實施方案中，所述構建體選自線性核酸鏈、病毒載劑或質粒。 [編輯RNA的方法]

本申請提供了一種使細胞中靶標RNA中的靶標胞嘧啶脫氨基的方法——CUSPER（程式化的C到U的RNA編輯），包括將如下1）和2）導入所述細胞： 1）經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域或表現該經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體，和 2）將所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域募集到所述靶標RNA的arRNA或包含該arRNA或包含其編碼序列的構建體。其中，所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域經過修飾具有催化胞苷脫氨基的活性，所述arRNA包含與所述靶標RNA雜交的互補RNA序列，並且所述arRNA募集所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域至靶標RNA致使靶標RNA中的靶標胞苷脫氨基。

在一些實施方案中，所述細胞為真核細胞。在一些實施方案中，所述細胞為哺乳動物細胞。在一些實施方案中，所述細胞為人細胞。在一些實施方案中，所述細胞為小鼠細胞。

熟習此項技術者應當知曉，所述表現經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體包含所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的編碼序列。在一些實施方案中，所述表現經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體與包含所述arRNA的編碼序列的構建體為同一構建體。在一些實施方案中，所述表現經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的編碼序列的構建體與包含所述arRNA的編碼序列的構建體為不同構建體，即所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的編碼序列與所述arRNA的編碼序列分別位於不同構建體上。在一些實施方案中，所述不同構建體為兩個或多於兩個。在一些實施方案中，所述不同的構建體同時或分開地導入所述細胞。應當理解，本段所說的不同構建體指的是非同一個構建體，並不代表所述不同構建體分別屬於不同的構建體類別。在一些實施方案中，將所述表現該經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體與所述將所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域募集到所述靶標RNA的arRNA或包含該arRNA的構建體或包含該arRNA的編碼序列的構建體導入同一細胞。在一些實施方案中，將經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域或表現該經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體，和多種arRNA或包含所述arRNA的構建體或包含所述arRNA的編碼序列的構建體導入細胞，以實現對靶標RNA的高通量編輯，其中所述的多種arRNA為靶向不同靶標RNA的arRNA，或為靶向同一靶標RNA不同靶標鹼基（例如C）位點的arRNA。

因此，本申請還涵蓋一種高通量編輯細胞中靶標RNA中的靶標胞嘧啶的方法，包括將如下1）和2）導入所述細胞： 1）經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域或表現該經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體，和 2）將所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域募集到所述靶標RNA的多種（例如2種以上、5種以上、5種以上、10種以上）arRNA或包含該arRNA或包含其編碼序列的構建體，其中，所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域經過修飾具有催化胞苷脫氨基的活性，所述多種（例如2種以上、5種以上、5種以上、10種以上）arRNA包含分別與所述靶標RNA雜交的互補RNA序列，並且所述arRNA募集所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域至靶標RNA致使靶標RNA中的靶標胞苷脫氨基。

在一些實施方案中，所述表現經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體和包含所述arRNA的編碼序列的構建體為同一構建體，或者所述表現經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體和包含所述arRNA的編碼序列的構建體為分開的構建體，所述分開的構建體被同時或分開地導入所述細胞。

在一些實施方案中，所述腺苷脫氨酶在一個或多個位點發生突變修飾從而具有對胞苷脫氨使其轉化成尿苷的活性。

在一些實施方案中，所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域為ADAR2蛋白或其同源蛋白或其催化結構域。

在一些實施方案中，所述突變修飾包含： E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T，其中所述突變修飾的胺基酸編號與NP_001103.1中的胺基酸編號一致。在一些實施方案中，所述構建體選自病毒載劑、質粒和線性核酸。在一些實施方案中，所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域或表現該經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體以及包含將所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域募集到所述靶標RNA的arRNA的寡核苷酸或轉錄該arRNA的構建體通過病毒侵染、化學轉染、電轉染、外泌體遞送、或奈米脂質顆粒遞送等方式被導入所述細胞。

在一些實施方案中，所述腺苷脫氨酶在一個或多個位點發生突變修飾從而具有對胞苷脫氨使其轉化成尿苷的活性。在一些實施方案中，所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域為ADAR2蛋白或其同源蛋白或其催化結構域。在一些實施方案中，所述突變修飾包含： E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T，其中所述突變修飾的胺基酸編號與NP_001103.1中的胺基酸編號一致。

在一些實施方案中，所述arRNA與靶標RNA雜交時，其與靶標胞苷相對的靶向鹼基為A、U、C、或G。在一些實施方案中，所述arRNA與靶標RNA雜交時，其與靶標胞苷相對的靶向鹼基優選為U或C。

在一些實施方案中，所述arRNA在對應於靶標RNA的靶標鹼基的上游、下游、或上游和下游的一個或多個位置包含非配對核苷酸，以形成和靶標鹼基上游、下游、或上游和下游的一個或多個位置的核苷酸錯配。在一些實施方案中，所述arRNA靶向鹼基的3’最近鄰鹼基與靶標RNA形成錯配。在一些實施方案中，所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶向鹼基的3’最近鄰鹼基與靶標RNA形成G-G錯配。在一些實施方案中，所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶向鹼基的5’最近鄰鹼基與靶標RNA不形成錯配。在一些實施方案中，所述靶向鹼基的5’最近鄰鹼基為U。在一些實施方案中，當所述arRNA與靶標RNA雜交時，與所述arRNA的靶向鹼基的5’最近鄰鹼基相對的靶標RNA中的鹼基優選次序從高到低為G或C、U或A（G≈C＞U≈A）。在一些實施方案中，當所述arRNA與靶標RNA雜交時，與所述arRNA的靶向鹼基的5’最近鄰鹼基相對的靶標RNA中的鹼基優選為G或C。在一些實施方案中，當所述arRNA與靶標RNA雜交時，與所述arRNA的靶向鹼基的5’最近鄰鹼基相對的靶標RNA中的鹼基最優選為G。在一些實施方案中，當所述arRNA與靶標RNA互補雜交時，所述arRNA靶向三聯體以外的一個或多個鹼基與靶標RNA形成錯配。並且在一些實施方案中，所述錯配可以進一步提高基於所述arRNA的靶向編輯效率。

在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端及5’端的長度相等。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端及5’端的長度不相等。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度為45-5nt，40-5nt，35-10nt，25nt-15nt，24nt-11nt。在一些具體實施方案中，所述長度為本項定義的長度範疇內的任一正整數。

在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度為80-30nt，70-35nt，60-40nt，55nt-35nt，55nt-45nt。在一些具體實施方案中，所述長度為本項定義的長度範疇內的任一正整數。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度大於80。

在一些實施方案中，所述arRNA為寡核苷酸或包含於寡核苷酸。在一些實施方案中，所述寡核苷酸是化學修飾的。在一些實施方案中，所述化學修飾包括2’-O-甲基修飾或核苷酸間3’硫代修飾。在一些實施方案中，所述化學修飾選自如下的一項或多項：序列前3個和後3個核苷酸分別被2`-OMe修飾，前3個和後3個核苷酸間連接均為硫代磷酸酯鍵連接，序列中全部U均被2`-OMe修飾，靶向鹼基的3’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的A，靶向鹼基的5’最近鄰鹼基為2`-OMe修飾的C，靶向鹼基與其3’最近鄰鹼基和5’最近鄰鹼基分別以硫代磷酸酯鍵連接，前5個和後5個核苷酸分別被2`-OMe修飾，和前5個和後5個核苷酸間連接為硫代磷酸酯鍵連接。

在一些實施方案中，所述arRNA由一種構建體編碼並轉錄生成。在一些實施方案中，所述構建體選自線性核酸鏈、病毒載劑或質粒。 [RNA編輯相關酶蛋白及其用途]

本申請提供了一種經修飾的腺苷脫氨酶蛋白，其中所述腺苷脫氨酶蛋白為ADAR2，其包含對應於Genebank登記號為NP_001103.1的ADAR2中如下胺基酸突變：E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T，或所述NP_001103.1的同源ADAR2蛋白相應位置的胺基酸突變，所述ADAR2蛋白經過所述突變修飾而具有催化胞苷脫氨基的活性。

本申請同時還提供了所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白用於催化胞苷脫氨基轉化為尿苷的用途。在一些實施方案中，所述催化胞苷脫氨基轉化為尿苷的用途發生於細胞內。在一些實施方案中，所述催化胞苷脫氨基轉化為尿苷的用途發生於細胞外。 [疾病治療方法]

本申請提供了一種治療由T到C突變引起的疾病的方法，包括使用如前所述的編輯RNA的方法使包含所述T到C突變轉錄形成的信使RNA中靶標鹼基C脫氨基，以校正所述突變。

在一些實施方案中，所述治療由T到C突變引起的疾病的方法包括將如前所述的工程化組合物或系統注射入個體體內。在一些實施方案中，所述治療將包括將如下1）和2）注射入個體體內。

1）經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域或表現該經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體，和

2）將所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域募集到所述靶標RNA的arRNA或包含該arRNA或包含其編碼序列的構建體。其中，所述腺苷脫氨酶蛋白為如前所述的RNA編輯相關酶蛋白。

在一些實施方案中，所述注射為靜脈注射、動脈灌注、肌肉注射、皮下注射或瘤內注射。

在一些實施方案中，所述由T到C突變引起的疾病包括遺傳性疾病和癌症。 [套組及製劑]

本申請還提供了一種套組，其用於催化胞苷脫氨基轉化為尿苷。在一些實施方案中，所述套組包含如前所述的工程化組合物或系統。在一些實施方案中，所述套組包含編碼或表現所述工程化組合物系統中所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域和/或將所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域募集到靶標RNA的arRNA的構建體。

本申請提供的利用CUSPER技術對RNA進行靶向編輯的方法，具有以下優點：

一態樣，新的技術招募編輯蛋白(例如腺苷脫氨酶（ADAR）)時，不像RESCUE技術，需要設計含Cas13b招募骨架的嚮導RNA，也不需要細菌來源的Cas13b過表現，減小了外源表現蛋白的長度使得通過病毒載劑進行裝載及人體內遞送容易、多樣，同時，也可以減小外源表現的核酸酶被中和導致的基因編輯失敗的可能性，這使得其在應用至醫療領域時比RESCUE技術具有顯著優勢。

另一態樣，新的體系不像LEAPER技術，LEAPER技術僅能實現RNA編輯的應用範疇從A到I的編輯，而新的體系將該編輯拓寬至C到U，這使得很多在基因組上呈現T到C突變的遺傳病，以及其它需要將C轉變為T/U的應用，可以用本申請的技術治療。

因此，本申請的技術相比於現有技術而言，應用範疇更廣，更加安全有效。

以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明並不限於此。在本發明的技術構思範疇內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，包括各個技術特徵以任何其它的合適方式進行組合，此等簡單變型和組合同樣應當視為本發明所公開的內容，均屬於本發明的保護範疇。

下面結合具體實施例，對本發明的技術方案作進一步的詳述，但本發明並不限於以下實施例。如未特別指出，以下所涉及的試劑均可通過商業途徑購得。為簡便起見，部分操作未詳述操作的參數、步驟及所使用的儀器，應當理解，此等都是熟習此項技術者所熟知並可重複再現的。實施例

實施例 1 ：經修飾的 ADAR2 及 BFP 報告體系的分子構建

[1. 突變型ADAR2-r16-293T的構建]

參照參考文獻1中報導的RESCUE技術對ADAR2（RNA腺苷脫氨酶2）催化結構域進行突變誘發，突變位點與文獻中r16相同 (dADAR2(E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T) r16, https://benchling.com/s/seq-19Ytwwh0i0vSIbyXYZ95)，其中所述突變修飾的胺基酸編號與NP_001103.1中的胺基酸編號一致。使用业内常規DNA合成技術體外合成包含上述突變的ADAR2編碼序列片段，並通過酶切連接插入pLenti-ADAR2質粒載劑（pLenti-ADAR2質粒骨架由魏文勝教授試驗室惠贈）的ADAR2 XmaI酶切位點及AscI酶切位點之間。通過以上步驟構建的質粒命名為pLenti-ADAR2-r16，其包含上述突變的ADAR2基因命名為ADAR2-r16。ADAR2-r16全長cDNA序列為：SEQ ID NO 1。通過第二代慢病毒包裝體系（pCAG-VSVG 由Arthur Nienhuis & Patrick Salmon 惠贈(Addgene plasmid # 35616 ; http://n2t.net/addgene:35616 ; RRID:Addgene_35616); pCMVR8.74 由 Didier Trono惠贈 (Addgene plasmid # 22036 ; http://n2t.net/addgene:22036；RRID:Addgene_22036)）將pLenti-ADAR2-r16包裝成慢病毒，並使用所述慢病毒侵染293T細胞並於48小時後使用10ug/ml終濃度的Blasticidin (Solarbio B9300)進行抗性篩選。篩選過後存活的細胞稱為ADAR2-r16-293T。

SEQ ID NO 1： ATGGATATAGAAGATGAAGAAAACATGAGTTCCAGCAGCACTGATGTGAAGGAAAACCGCAATCTGGACAACGTGTCCCCCAAGGATGGCAGCACACCTGGGCCTGGCGAGGGCTCTCAGCTCTCCAATGGGGGTGGTGGTGGCCCCGGCAGAAAGCGGCCCCTGGAGGAGGGCAGCAATGGCCACTCCAAGTACCGCCTGAAGAAAAGGAGGAAAACACCAGGGCCCGTCCTCCCCAAGAACGCCCTGATGCAGCTGAATGAGATCAAGCCTGGTTTGCAGTACACACTCCTGTCCCAGACTGGGCCCGTGCACGCGCCTTTGTTTGTCATGTCTGTGGAGGTGAATGGCCAGGTTTTTGAGGGCTCTGGTCCCACAAAGAAAAAGGCAAAACTCCATGCTGCTGAGAAGGCCTTGAGGTCTTTCGTTCAGTTTCCTAATGCCTCTGAGGCCCACCTGGCCATGGGGAGGACCCTGTCTGTCAACACGGACTTCACATCTGACCAGGCCGACTTCCCTGACACGCTCTTCAATGGTTTTGAAACTCCTGACAAGGCGGAGCCTCCCTTTTACGTGGGCTCCAATGGGGATGACTCCTTCAGTTCCAGCGGGGACCTCAGCTTGTCTGCTTCCCCGGTGCCTGCCAGCCTAGCCCAGCCTCCTCTCCCTGCCTTACCACCATTCCCACCCCCGAGTGGGAAGAATCCCGTGATGATCTTGAACGAACTGCGCCCAGGACTCAAGTATGACTTCCTCTCCGAGAGCGGGGAGAGCCATGCCAAGAGCTTCGTCATGTCTGTGGTCGTGGATGGTCAGTTCTTTGAAGGCTCGGGGAGAAACAAGAAGCTTGCCAAGGCCCGGGCTGCGCAGTCTGCCCTGGCCGCCATTTTTAACTTGCACTTGGATCAGACGCCATCTCGCCAGCCTATTCCCAGTGAGGGTCTTCAGCTGCATTTACCGCAGGTTTTAGCTGACGCTGTCTCACGCCTGGTCATAGGTAAGTTTGGTGACCTGACCGACAACTTCTCCTCCCCTCACGCTCGCAGAATAGGTCTGGCTGGAGTCGTCATGACAACAGGCACAGATGTTAAAGATGCCAAGGTGATATGTGTTTCTACAGGATCTAAATGTATTAATGGTGAATACCTAAGTGATCGTGGCCTTGCATTAAATGACTGCCATGCAGAAATAGTATCTCGGAGATCCTTGCTCAGATTTCTTTATACACAACTTGAGCTTTACTTAAATAACGAGGATGATCAAAAAAGATCCATCTTTCAGAAATCAGAGCGAGGGGGGTTTAGGCTGAAGGAGAATATACAGTTTCATCTGTACATCAGCACCTCTCCCTGTGGAGATGCCAGAATCTTCTCACCACATGAGGCAATCCTGGAAGAACCAGCAGATAGACACCCAAATCGTAAAGCAAGAGGACAGCTACGGACCAAAATAGAGGCTGGTCAGGGGACGATTCCAGTGCGCAACAATGCGAGCATCCAAACGTGGGACGGGGTGCTGCAAGGGGAGCGGCTGCTCACCATGTCCTGCAGTGACAAGATTGCACGCTGGAACGTGGTGGGCATCCAGGGATCACTGCTCAGCATTTTCGTGGAGCCCATTTACTTCTCGAGCATCATCCTGGGCAGCCTTTACCACGGGGACCACCTTTCCAGGGCCATGTACCAGCGGATCTCCAACATAGAGGACCTGCCACCTCTCTACACCCTCAACAAGCCTTTGCTCACAGGCATCAGCAATGCAGAAGCACGGCAGCCAGGGAAGGCCCCCATATTCAGTGTCAACTGGACGGTAGGCGACTCCGCTATTGAGGTCATCAACGCCACGACTGGGAAGGGAGAGCTGGGCCGCGCGTCCCGCCTGTGTAAGCACGCGTTGTACTGTCGCTGGATGCGTGTGCACGGCAAGGTTCCCTCCCACTTACTACGCTCCAAGATTACCAAGCCCAACGTGTACCATGAGACAAAGCTGGCGGCAAAGGAGTACCAGGCCGCCAAGGCGCGTCTGTTCACAGCCTTCATCAAGGCGGGGCTGGGGGCCTGGGTGGAGAAGCCCACCGAGCAGGACCAGTTCTCACTCACGCCCGATTACAAGGATGACGACGATAAGTAG

[2. BFP報告體系的構建]

BFP報告體系參照參考文獻7構建，全部BFP（藍色螢光蛋白）cDNA序列在體外合成，具體序列為：SEQ ID NO 2。BFP cDNA序列通過CMV啟動子後的多純系位點純系至pCDH-CMV質粒載劑（pCDH-CMV質粒骨架由Kazuhiro Oka惠贈，Addgene plasmid # 72265; http://n2t.net/addgene:72265; RRID: Addgene_72265)。報告體系中待編輯的靶標鹼基為BFP序列第199位的鹼基C，對應第66位組胺酸，參見圖1。

SEQ ID NO 2： ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCTGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCCA CGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGA

該序列第198,199,200位的鹼基依次為CCA，命名為BFP-CCA，縮略為C*。當199位的鹼基C在RNA水準/程度通過脫氨基化被編輯為U之後，BFP螢光蛋白會從原先的藍色螢光變為綠色螢光，從而可以通過流式細胞儀FITC（Fluorescein isothiocyanate，異硫氰酸螢光素）通道偵測到信號。由於198位核苷酸從C突變為A、T、G後，對應密碼子（196、197、198位鹼基）ACC、ACA、ACT、ACG均編碼蘇胺酸，因此該位突變為同義突變。這使得該報告體系可以同時測定和比較在mRNA上靶標鹼基的5’上游相鄰鹼基不同時，C到U的編輯效率。可據此使用定點突變誘發套組（Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit, NEB E0554S)向198位置鹼基中引入突變，從而198,199,200三個位置鹼基分別為：GCA，命名為BFP-GCA，縮略為G*；ACA，命名為BFP-ACA，縮略為A*；TCA命名為BFP-UCA，縮略為U*。

實施例 2 ： CUSPER 體系的初步測試

[1.arRNA的設計與合成]

本實施例中使用的arRNA包含與靶標mRNA互補的反義RNA，靶標鹼基位於arRNA的中間位置，5’上游以及3’下游按照相同長度向兩邊延伸。由於合成長度的限制，本實施例選取長度為91nt的RNA進行體外合成。如圖3所示，當所述arRNA第46位核苷酸分別為A、U、G、C時，則分別縮寫為A^、U^、G^、C^。四種合成的arRNA具體序列見下表1。如圖2所示，與LEAPER技術設計方法不同的是，本批試驗中四條arRNA的設計，由於試驗目的是確定靶標鹼基與arRNA上的靶向鹼基錯配時的編輯效率，因此使用了不同的靶向鹼基進行了測試，即對第46位分別為A、U、G、C的arRNA進行了測試。而在arRNA第47位的5’最近鄰鹼基(對應報告體系第198位)則按照引入突變前的BFP序列的靶標三聯體鹼基（即CCA）進行設計，即所述arRNA靶向鹼基的5’最近鄰鹼基（第47位）為與A互補的U。這意味著，當且僅當後續測試的報告體系為BFP-CCA的時候，arRNA的設計方才與LEAPER技術一致，即：當arRNA與靶標RNA雜交時，僅在靶標鹼基存在錯配；而當報告體系為BFP-GCA，BFP-TCA，BFP-ACA的時候，arRNA的設計不僅在靶標鹼基存在錯配，而且在arRNA靶標鹼基的3’相鄰鹼基處也存在錯配。

表1

ar RNA 名稱	ar RNA 序列
A^	SEQ ID NO 3： gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccguAggucaggguggucacgagggugggccagggcacgggcagcuugcc
U^	SEQ ID NO 4： gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccguUggucaggguggucacgagggugggccagggcacgggcagcuugcc
C^	SEQ ID NO 5： gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccguCggucaggguggucacgagggugggccagggcacgggcagcuugcc
G^	SEQ ID NO 6： gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccguGggucaggguggucacgagggugggccagggcacgggcagcuugcc

注：大寫字母只為突出序列間差異，同一字母的大小寫不同不代表鹼基的差異。

[2. C到U編輯測試]

ADAR2-r16-293T以300000個細胞/孔的密度鋪板至6孔板，鋪板後24小時，用Lipofectamine 3000轉染 (Invitrogen L3000015)，轉染步驟按照說明書進行。按照說明書採用不同濃度的Lipofectamine 3000轉染試劑進行兩次重複試驗，重複1每孔使用3.75μL的Lipofectamine 3000，重複每孔2使用7.5μL的Lipofectamine 3000。每孔添加2.5μg BFP報告質粒（選自：BFP-GCA，縮略為G*； BFP-ACA，縮略為A*；BFP-TCA，縮略為T*; BFP-CCA，縮略為C*)以及25pmol化學合成的arRNA。轉染後48h通過FACS偵測FITC通道信號強度。陽性細胞平均螢光強度(Mean Fluorescent Intensity, MFI)統計結果如圖3所示。

圖3中mRNA行表示對應孔中添加的BFP報告體系質粒，arRNA行表示對應孔中添加的arRNA。BFP報告體系中，198,199,200三個鹼基在原始序列中為CCA，而當198位C變為A、T或G的時候，對應的65位胺基酸均為蘇胺酸，所以BFP-GCA、BFP-CCA、BFP-ACA、BFP-TCA四種不同報告體系198位的改變不會造成原本蛋白功能的改變。而當199位C被編輯變為U時，199、200、201形成的密碼子從CAC變為UAC，對應的66位胺基酸從組胺酸(Histidine, His, H)變為酪胺酸(Tyrosine，Tyr，Y)，從而實現BFP到GFP的螢光轉變。如圖3所示，當不加入任何arRNA時，報告體系本底GFP信號MFI約為5×10⁴ (mRNA行標注為U*，arRNA行標注為/的報告體系；以及，mRNA行標注為A*，arRNA標注為/的報告體系)。而當通過DNA水準/程度的點突變，使199位C突變為T時，GFP信號MFI約為2.4×10⁶ ~3.1×10⁶ ，比本底值高約100倍。因此，如果199位元的C在RNA水準/程度全部變為U，則可導致GFP MFI的約100倍提升。

在DNA水準/程度199位C不變的基礎上，如圖3所示，而當加入arRNA後，GFP的MFI最多能提升至超過5×10⁵ ，螢光強度超過了DNA水準/程度的199位C點突變成T後螢光強度的20%。這說明，本申請的技術可以在不改變DNA序列的前提下，通過在轉錄水準/程度上將199位的C轉變為U，從而改變最終的蛋白功能。

在LEAPER技術文獻中(Qu et al., 2019，原圖2f，對應於本申請圖4），當靶標鹼基3’相鄰鹼基（如N² 位置所示）為A時，LEAPER技術對靶標鹼基5’相鄰鹼基（如N1位置所示）的偏好(指在5’上游鹼基為A、U、G或C時，相同arRNA所得到的編輯效率)是：U ＞ C≈A ＞ G。在RESCUE技術文獻中(Abudayyeh et al., 2019，原圖1c，對應於本申請圖5）當靶標鹼基3’相鄰鹼基為A時，RESCUE技術對靶標鹼基5’相鄰鹼基的偏好是：U≈A ＞＞ C≈G。而在本申請的CUSPER技術中，吾人意外地發現，該技術在當靶標鹼基3’相鄰鹼基為A時，對靶標鹼基5’上游鹼基的偏好與LEAPER技術和RESCUE技術兩者均不相同，如圖3所示，如果固定arRNA為編輯效率較高的U^或者C^，可以看到，本申請的技術對5’上游鹼基的偏好是：G ＞ C ＞＞ U≈A。

[3. 對CUSPER鹼基偏好性的進一步確定]

為進一步確定CUSPER的編輯能力及其鹼基偏好性，吾人對實施例2第2部分做了進一步重複，如圖6所示。相較於實施例2第2部分，本部分中補充了實施例2第2部分中未涉及的僅有BFP-GCA和BFP-CCA兩個報告體系質粒而不添加任何arRNA情況下的對照試驗。並且對圖3相關測試中MFI超過本底值2倍以上的條件做了重複。同時，試驗中重複1和重複 2對應兩株不同批次製作的ADAR2-r16-293T。

如圖6所示，重複試驗中該體系對靶標鹼基5’相鄰鹼基的偏好呈現出與圖3顯示的實施例2第2部分的相關測試類似的模式，均為在5’相鄰鹼基為G或C時有較好編輯效率，且G大於C。

以上結果表明，本申請的技術可以在不改變DNA序列的前提下，從轉錄水準/程度影響最終蛋白功能。同時，該技術對靶標鹼基5’相鄰鹼基的偏好可能與LERPER和RESCUE技術均不相同，具體參見表2。值得注意的是，本研究中對於BFP-GCA、BFP-TCA、BFP-ACA的測試中，arRNA的設計不僅在靶標鹼基處存在一個錯配，在arRNA的3’下游也存在另外一個錯配 (如圖2所示)。因此，後續還需進一步測試當此等位置不存在錯配時，該技術對5’上游鹼基的偏好是否還存在類似的模式。

表2. 三種RNA編輯技術靶標鹼基相鄰鹼基偏好性對比

技術名稱	錯配數量	當靶標鹼基 3’ 相鄰鹼基為 A 時，對 5’ 相鄰鹼基的偏好性
CUSPER 技術	CCA一個錯配其餘兩個錯配	G ＞ C ＞＞ A ≈ U
LEAPER⁴	均一個錯配	U ＞ C ≈ A ＞ G
RESCUE¹	均一個錯配	U≈A ＞＞ C≈G

實施例 3 ： 3’ 及 5’ 相鄰鹼基均無錯配的情況下，對 CUSPER 編輯體系的測試

通過對GFP信號的讀取，吾人可以快速粗略地判斷不同arRNA的編輯效率，但如果需要進一步確認編輯效率，則需通過二代定序（Next Generation Sequencing, NGS)來最終確認mRNA中有多少比例的C被編輯成U。同時，RNA單鹼基編輯體系無論是A到I (Qu et al., 2019) 還是C到U (Abudayyeh et al., 2019)其靶標鹼基A或者C的5’相鄰鹼基和3’相鄰鹼基對其編輯效率影響較大。由於BFP到GFP報告體系的限制，如果以BFP的DNA序列(SEQ ID NO 2)中第199位的C為靶標鹼基，當5’相鄰鹼基（第198位）C變為A、T、G時均不影響對應的65位胺基酸；但當3’相鄰鹼基（第200位）的A變為T、C或G時，則會導致其完全失去GFP信號。因此，通過報告體系讀取GFP的試驗無法對3’相鄰鹼基為T、C、G的體系進行測試。而如果通過二代定序則可直接讀取編輯後其mRNA中U占A、U、C、G的百分比，從而較為方便地比較4種不同5’相鄰鹼基和4種不同3’相鄰鹼基共16種情況下，其編輯效率的高低。

參照實施例1.2的步驟，根據BFP的DNA序列(SEQ ID NO 2)中第198、199、200位的DNA序列不同，吾人構建了16個不同的報告體系，即ACA、ACT (對應mRNA：ACU)、ACC、ACG、TCA (對應mRNA：UCA)、TCT (對應mRNA：UCU)、TCC (對應mRNA：UCC)、TCG (對應mRNA：UCG)、CCA、CCT (對應mRNA：CCU)、CCC、CCG、GCA、GCT (對應mRNA：GCU)、GCC、GCG。並且參照實施例1.1的慢病毒包裝、侵染步驟，侵染293T，使其穩定整合入293T細胞中。

與以上16個不同的報告體系相對應，在mRNA靶標鹼基C對應arRNA靶向鹼基為U的基礎上，使arRNA靶向鹼基的3’及5’最近鄰鹼基可與靶標RNA中靶標鹼基的5’及3’相鄰鹼基以沃森克裡克鹼基配對原則互補配對。所合成arRNA序列見表3，其中mRNA中靶標以及其5’和3’相鄰鹼基與arRNA靶向鹼基以及其5’和3’最近鄰鹼基的對應關係表見圖7。

按照以下步驟，向16個不同的報告體系細胞中，轉染入對應的arRNA，並進行RNA提取和二代定序。

1.細胞培養採用含有10%FBS (Vistech SE100-011)的DMEM (Hyclone SH30243.01)。報告體系細胞以15000個細胞/孔，傳至12孔板。此時記為0小時。

2.細胞傳代後24小時，用RNAi MAX(Invitrogen, 13778150)試劑將12.5pmol的arRNA轉入每個孔。轉染步驟參照供應商說明書。

3.細胞傳代後72小時，用胰酶(Invitrogen 25300054)消化整孔細胞，用800μL TRIzol (Invitrogen, 15596018)收樣，採用Direct-zol RNA Miniprep套組(Zymo Resaerch, R2052)進行RNA提取，每個樣品取1000ng提取好的總RNA用TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix套組(全式金，AT311)進行反轉錄合成cDNA，取1μL反轉錄產物，用序列為ggagtgagtacggtgtgcCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTT（SEQ ID NO：7）和gagttggatgctggatggGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAG（SEQ ID NO：8）的兩個引子以及Q5暖開機酶(NEB, M0494L)進行PCR。PCR產物用Hi-TOM套組(諾禾致源，REF PT045)進行建庫並按照以下步驟完成二代定序和資料分析。

i. Illumina定序

將構建好的定序文庫，通過NovaSeq6000平臺以PE150方式進行高通量定序。

ii. 定序資料處理

高通量定序得到的原始資料以fastp (v0.19.6)進行質控，過濾掉低品質、帶有連接子序列、及含有polyG等的序列。將得到的高品質定序數據以自主開發的拆分腳本按照相應的Barcode序列拆分到每個樣本，使用BWA (v0.7.17-r1188) 軟體與擴增的目的地區域序列進行比對，通過SAMtools (v1.9) 進行格式轉換以生成BAM檔、統計比對資訊並重新排序和建立索引。

iii. 編輯效率分析

使用JACUSA (v1.3.0)軟體偵測所有的mRNA靶標鹼基，所用參數為：call-1 -a B,R,D,I,Y,M:4 -C ACGT -c 2 -p 1 -P UNSTRANDED -R -u DirMult-CE。過濾掉同時在對照和處理樣本中出現的高頻突變之後，以C-＞U突變之外的平均突變頻率的三倍作為閾值，將靶標鹼基C到U的突變頻率在閾值之上的部分作為真實的靶標C突變為U的頻率。

二代定序結果如圖8顯示。通過二代定序可以證實，CUSPER體系確實可以實現mRNA的C到U單鹼基編輯。相較於實施例2可以看出，如果靶向鹼基的5’及3’最近鄰鹼基與靶標RNA均無錯配，則編輯效率相對較低，而當靶向鹼基的5’最近鄰鹼基與靶標RNA形成G-G錯配時，便可以提高編輯效率。此外，當除靶標鹼基的C-U錯配以外，靶向鹼基的5’及3’最近鄰鹼基均與靶標鹼基的3’及5’相鄰鹼基以沃森-克裡克原則配對時，當mRNA上靶標鹼基三聯體為下述序列時可以獲得較高的編輯效率：ACG、ACC、UCC、UCG、CCC、CCG、UCA、UCU。

表3. 3’及5’相鄰鹼基均無錯配的arRNA序列

arRNA 名稱	arRNA 序列
arRNA-GCA	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgUUCgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc （SEQ ID NO：9）
arRNA-GCU	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgAUCgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc （SEQ ID NO：10）
arRNA-GCC	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgGUCgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc（SEQ ID NO：11）
arRNA-GCG	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgCUCgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc（SEQ ID NO：12）
arRNA-CCA	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgUUGgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc（SEQ ID NO：13）
arRNA-CCU	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgAUGgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc（SEQ ID NO：14）
arRNA-CCC	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgGUGgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc（SEQ ID NO：15）
arRNA-CCG	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgCUGgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc（SEQ ID NO：16）
arRNA-UCA	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgUUAgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc（SEQ ID NO：17）
arRNA-UCU	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgAUAgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc（SEQ ID NO：18）
arRNA-UCC	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgGUAgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc（SEQ ID NO：19）
arRNA-UCG	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgCUAgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc（SEQ ID NO：20）
arRNA-ACA	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgUUUgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc（SEQ ID NO：21）
arRNA-ACU	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgAUUgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc（SEQ ID NO：22）
arRNA-ACC	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgGUUgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc（SEQ ID NO：23）
arRNA-ACG	gcugcuucauguggucgggguagcggcugaagcacugcacgccgCUUgucaggguggucacg agggugggccagggcacgggcagcuugcc（SEQ ID NO：24）
arRNA- 隨機	Uaauccugaauaucgcgcaauuccccagcagagaacaucgcggugugaacgucccuuuauaccgg gcagguauagcugaaaucagcguggc（SEQ ID NO：25）

注：大小寫字母無區別，大寫字母只為突出序列間差異。其中arRNA，以其靶向的靶標鹼基三聯體命名。

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無

圖1顯示了BFP報告體系以及待進行C到U編輯的靶標鹼基。圖2顯示了當靶向為點為U時，CUSPER和RESCUE技術設計嚮導RNA時靶標鹼基的選擇以及靶向為點相鄰鹼基的設計原則。圖3顯示了對CUSPER編輯體系的測試。圖中“/”代表未添加對應質粒或arRNA，僅添加相同體積水。圖4顯示了LEAPER技術對靶標鹼基相鄰上下游鹼基的偏好性。圖中箭頭所示為與圖3對應的當靶標鹼基的3’相鄰鹼基為A時，LEAPER技術對5’相鄰上游的偏好性。圖5顯示了RESCUE技術對靶標鹼基相鄰上下游鹼基的偏好性。圖中箭頭所示為與圖3對應的當3’相鄰鹼基為A時，RESCUE技術對5’相鄰鹼基的偏好性。圖6顯示了對CUSPER編輯體系的重複測試結果。圖中“/”代表未添加對應質粒或arRNA而僅添加相同體積水。圖7顯示靶標C對應U，及其相鄰鹼基無錯配的情況下，mRNA與對應arRNA序列。圖8顯示靶標C對應U，及其相鄰鹼基無錯配的情況下全部16種3’和5’相鄰鹼基組合的C到U RNA編輯效率

Claims

一種用於RNA編輯的工程化組合物或系統，包含： 1）經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域或表現該經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體，其中，所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域經過修飾具有催化胞苷脫氨基的活性；和 2）將所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域募集到靶標RNA的arRNA或包含該arRNA或包含其編碼序列的構建體；其中所述arRNA包含與所述靶標RNA雜交的互補RNA序列，並且所述arRNA募集所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域至靶標RNA致使靶標RNA中的靶標胞苷脫氨基。
如請求項1所述的工程化組合物或系統，其中所述腺苷脫氨酶在一個或多個位點發生突變修飾從而具有對胞苷脫氨使其轉化成尿苷的活性。
如請求項2所述的工程化組合物或系統，其中所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域為ADAR2蛋白或其同源蛋白或其催化結構域。
如請求項3所述的工程化組合物或系統，其中所述突變修飾包含： E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T，其中所述突變修飾的胺基酸編號與NP_001103.1中的胺基酸編號一致。
如請求項1至請求項4中任一項所述的工程化組合物或系統，其中所述arRNA與靶標RNA雜交時，其與靶標胞苷相對的靶向鹼基為A、U、C、或G。
如請求項5所述的工程化組合物或系統，其中所述靶向鹼基為U或C。
如請求項1至請求項6中任一項所述的工程化組合物或系統，其中：所述arRNA在對應於靶標RNA的靶標鹼基的上游、下游、或上游和下游的一個或多個位置包含非配對核苷酸，以形成和靶標鹼基上游、下游、或上游和下游的一個或多個位置的核苷酸錯配。
如請求項7所述的工程化組合物或系統，其中所述arRNA靶向鹼基的3’最近鄰鹼基與靶標RNA形成錯配。
如請求項8所述的工程化組合物或系統，其中所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶向鹼基的3’最近鄰鹼基與靶標RNA形成G-G錯配。
如請求項1至請求項9中任一項所述的工程化組合物或系統，所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶向鹼基的5’最近鄰鹼基與靶標RNA不形成錯配。
如請求項10所述的工程化組合物或系統，其中所述靶向鹼基的5’最近鄰鹼基為U。
如請求項9所述的工程化組合物或系統，其中當所述arRNA與靶標RNA雜交時，與所述arRNA的靶向鹼基的5’最近鄰鹼基相對的靶標RNA中的鹼基優選次序從高到低為G或C、U或A。
如請求項1至請求項6中任一項所述的工程化組合物或系統，其中當所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶標鹼基及其5’和3’相鄰鹼基形成的靶標鹼基三聯體僅在靶標鹼基處形成錯配，其中所述靶標鹼基三聯體選自：ACG、ACC、UCC、UCG、CCC、CCG、UCA、UCU。
如請求項1至請求項13中任一項所述的工程化組合物或系統，其中所述arRNA的長度＞50nt。
如請求項1至請求項14中任一項所述的工程化組合物或系統，其中所述arRNA中靶向鹼基距離3’端及5’端的長度相等。
如請求項1至請求項14中任一項所述的組合物，其中所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度為45-5nt，40-5nt，35-10nt，25nt-15nt，24nt-11nt。
如請求項1至請求項14中任一項所述的工程化組合物或系統，其中所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度為80-30nt，70-35nt，60-40nt，55nt-35nt，55nt-45nt。
如請求項1至請求項17中任一項所述的工程化組合物或系統，其中所述arRNA是化學修飾的。
如請求項18所述的工程化組合物或系統，其中所述化學修飾包括2’-O-甲基修飾或核苷酸間3’硫代修飾。
一種使細胞中靶標RNA中的靶標胞嘧啶脫氨基的方法，包括將如下1）和2）導入所述細胞： 1）經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域或表現該經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體；和 2）將所述經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域募集到所述靶標RNA的arRNA或包含該arRNA或包含其編碼序列的構建體，其中，所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域經過修飾具有催化胞苷脫氨基的活性，所述arRNA包含與所述靶標RNA雜交的互補RNA序列，並且所述arRNA募集所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域至靶標RNA致使靶標RNA中的靶標胞苷脫氨基。
如請求項20所述的方法，其中，所述表現經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體和包含所述arRNA的編碼序列的構建體為同一構建體，或者所述表現經修飾的腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域的構建體和包含所述arRNA的編碼序列的構建體為分開的構建體，所述分開的構建體被同時或分開地導入所述細胞。
如請求項20或21所述的方法，其中所述腺苷脫氨酶在一個或多個位點發生突變修飾從而具有對胞苷脫氨使其轉化成尿苷的活性。
如請求項22所述的方法，其中所述腺苷脫氨酶蛋白或其催化結構域為ADAR2蛋白或其同源蛋白或其催化結構域。
如請求項23所述的方法，其中所述突變修飾包含： E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T，其中所述突變修飾的胺基酸編號與NP_001103.1中的胺基酸編號一致。
如請求項21至請求項24中任一項所述的方法，其中所述arRNA與靶標RNA雜交時，其與靶標胞苷相對的靶向鹼基為A、U、C、或G。
如請求項25所述的方法，其中所述靶向鹼基為U或C。
如請求項21至請求項26中任一項所述的方法，其中：所述arRNA在對應於靶標RNA的靶標鹼基的上游、下游、或上游和下游的一個或多個位置包含非配對核苷酸，以形成和靶標鹼基上游、下游、或上游和下游的一個或多個位置的核苷酸錯配。
如請求項27所述的方法，其中所述arRNA靶向鹼基的3’最近鄰鹼基與靶標RNA形成錯配。
如請求項28所述的方法，其中所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶向鹼基的3’最近鄰鹼基與靶標RNA形成G-G錯配。
如請求項21至請求項29中任一項所述的方法，所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶向鹼基的5’最近鄰鹼基與靶標RNA不形成錯配。
如請求項30所述的方法，其中所述靶向鹼基的5’最近鄰鹼基為U。
如請求項29所述的方法，其中當所述arRNA與靶標RNA雜交時，與所述arRNA的靶向鹼基的5’最近鄰鹼基相對的靶標RNA中的鹼基優選次序從高到低為G或C、U或A。
如請求項21至請求項26中任一項所述的方法，其中當所述arRNA與靶標RNA雜交時，所述靶標鹼基及其5’和3’相鄰鹼基形成的靶標鹼基三聯體僅在靶標鹼基處形成錯配，其中所述靶標鹼基三聯體選自：ACG、ACC、UCC、UCG、CCC、CCG、UCA、UCU。
如請求項21至請求項33中任一項所述的方法，其中所述arRNA長度＞50nt。
如請求項21至請求項34中任一項所述的方法，其中所述arRNA中靶向鹼基距離3’端及5’端的長度相等。
如請求項21至請求項34中任一項所述的方法，其中所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度為45-5nt，40-5nt，35-10nt，25nt-15nt，24nt-11nt。
如請求項21至請求項34中任一項所述的方法，其中所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度為80-30nt，70-35nt，60-40nt，55nt-35nt，55nt-45nt。
如請求項21至請求項37中任一項所述的方法，其中所述arRNA是化學修飾的。
如請求項38所述的方法，其中所述化學修飾包括2’-O-甲基修飾或核苷酸間3’硫代修飾。
如請求項21至請求項39中任一項所述的方法，其中所述細胞為哺乳動物細胞。
一種治療由T到C突變引起的疾病的方法，包括使用如請求項21至請求項39中任一項所述的方法使包含所述T到C突變轉錄形成的信使RNA中靶標鹼基C脫氨基，以校正所述突變。
一種經修飾的腺苷脫氨酶蛋白，其中所述腺苷脫氨酶蛋白為ADAR2，其包含對應於Genebank登記號為NP_001103.1的ADAR2中如下胺基酸突變：E488Q/V351G/S486A/T375S/S370C/P462A/N597I/L332I/I398V/K350I/M383L/D619G/S582T/V440I/S495N/K418E/S661T，或所述NP_001103.1的同源ADAR2蛋白相應位置的胺基酸突變，所述ADAR2蛋白經過所述突變修飾而具有催化胞苷脫氨基的活性。
一種如請求項42所述的經修飾的腺苷脫氨酶蛋白用於催化胞苷脫氨基轉化為尿苷的用途。