JP2023509178A

JP2023509178A - Ｒｎａをターゲティング編集する新しい方法

Info

Publication number: JP2023509178A
Application number: JP2022540984A
Authority: JP
Inventors: ▲鵬▼▲飛▼ 袁; ▲澤▼▲軒▼ 易; 能▲銀▼ ▲劉▼
Original assignee: Edigene Therapeutics Beijing Inc
Current assignee: Edigene Therapeutics Beijing Inc
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2023-03-07
Also published as: EP4085931A1; WO2021136520A1; EP4085931A4; TW202136513A; IL294336A; US20230060517A1; CA3163281A1; AU2020417930A1; CN114728080A; KR20220122727A

Abstract

修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、または前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する構築物と、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを前記標的ＲＮＡに動員するａｒＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み、または前記ａｒＲＮＡを発現する構築物とを細胞に導入することを含む、前記細胞内の標的ＲＮＡ中の標的シトシンを脱アミノ化する方法が提供される。また、ＲＮＡ編集のための操作された組成物またはシステム、及び疾患の治療における、ＴからＣへの変異を修正するための操作された組成物またはシステムの使用が提供される。【選択図】なし

Description

本願は、遺伝子編集療法の分野に属し、具体的には、本願は、ＣＵＳＰＥＲ（ＣｔｏＵＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＥｄｉｔｉｎｇｏｆＲＮＡ；ＣからＵへのプログラム可能な特異的ＲＮＡ編集）と名付ける、ＲＮＡをターゲティング編集する方法を発明し、該方法は、ＣＵＳＰＥＲ技術を使用してＲＮＡにおけるＣからＵ塩基への正確な部位編集を行うことを含み、ＴからＣへの変異によって引き起こされる疾患の治療に使用できる。

近年、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ；クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート、クリスパー）に代表されるゲノム編集技術が急速に発展しており、生物学や医学の多くの分野に大きな影響を与えている。多くの研究者やバイオテクノロジー企業も、この技術を臨床に持ち込もうと取り組んでいる。２０１９年９月、北京大学のデン宏魁教授とその共同研究者は、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して幹細胞を編集し、それらを患者に再注入してＡＩＤＳと白血病を治療する臨床試験の結果を初めて報告する文章^１１を発表し、遺伝子治療の方向へのＣＲＩＳＰＲ技術の転換に多大な貢献をした。

ＣＲＩＳＰＲ技術には大きな応用の可能性があるが、一連の欠点もあり、この技術の科学研究段階から臨床治療への応用への転換を困難にしている。問題の１つは、ＣＲＩＳＰＲ技術が使用する中心的な酵素Ｃａｓ９である。ＣＲＩＳＰＲに基づくＤＮＡ編集技術では、Ｃａｓ９または類似した機能を持つその他のヌクレアーゼを外因的に発現させる必要があるため、次のような問題が生じる。まず、外因性発現を必要とするヌクレアーゼは通常、分子量が大きいため、ウイルスベクターを介した体内への送達効率が大幅に低下する。第二に、ヌクレアーゼの外因性発現により、この方法には潜在的なヌクレアーゼのオフターゲットの可能性があり、その応用で潜在的な発がんリスクにつながる可能性がある。最後に、外因的に発現されるＣａｓ９及び他の類似したヌクレアーゼは細菌に見出され、ヒトや哺乳動物に自然には存在しないため、患者の体内の免疫応答を誘発する可能性があり、患者自身に損傷を与え得る一方、外因的に発現されるヌクレアーゼを中和し、それによって本来の活性を失い、治療効果に影響を与える可能性もある。

２０１７年、ＭＩＴの張鋒教授及びその研修グループは、ＲＥＰＡＩＲ（プログラム可能なＡからＩへの置換のためのＲＮＡ編集、ＲＮＡＥｄｉｔｉｎｇｆｏｒＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＡｔｏＩＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）と呼ばれるＲＮＡ編集技術を報告した。この技術は、Ｃａｓ１３－ＡＤＡＲ融合タンパク質とシングルガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）の外因性発現により、ＡからＩへの標的ターゲットＲＮＡの編集も実現できるが^２、ＣＲＩＳＰＲ技術と同様に、この方法でも外因性タンパク質の編集が必要であり、外来タンパク質の発現による問題を解決できない。

２０１９年１月、ＴｈｏｒｓｔｅｎＳｔａｆｆｏｒｓｔのグループは、ＲＥＳＴＯＲＥと呼ばれるＲＮＡ単一塩基編集技術を報告した（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＡＤＡＲｔｏｓｐｅｃｉｆｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ，Ｍｅｒｋｌｅｅｔａｌ．，２０１９）。ＲＥＳＴＯＲＥは、外来タンパク質への依存を取り除くことができる。しかし、ＲＥＳＴＯＲＥ技術はＩＦＮ－γの存在下でしか高い編集効率を備えることができず、ＩＦＮ－γは自己免疫の発達と重症度を決定する重要な要素であり^９、医療分野でのこの技術の適用を大幅に減らす。一方、ＲＥＳＴＯＲＥ技術ではガイドＲＮＡも使用されており、使用されるガイドＲＮＡは化学的に合成したオリゴヌクレオチドであり、合成オリゴヌクレオチドは、安定性を確保するために人工的に大量の化学修飾を導入する必要がある。これらの化学修飾の中には、オリゴヌクレオチドを毒性または免疫原性にする可能性のある非天然の修飾もあり、同じ塩基鎖の異なるコンフォメーションをもたらすいくつかの修飾もあるため、同じＲＮＡ配列に対して数十の異なるコンフォメーションの組み合わせが存在する可能性があり、細胞への送達がより困難になっている。

２０１９年７月、北京大学の魏文勝教授の研究グループは、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに掲載された文章^４で、核酸編集技術であるＬＥＡＰＥＲ（ＬｅｖｅｒａｇｉｎｇＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓＡＤＡＲｆｏｒＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＥｄｉｔｉｎｇｏｆＲＮＡ；ＲＮＡのプログラム可能な編集のための内因性ＡＤＡＲの活用）を初めて報告した。ＣＲＩＳＰＲ技術とは異なり、この技術は原理的に外因性ヌクレアーゼの過剰発現への依存を取り除き、ＲＮＡを化学的に合成することができ、また、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）やレンチウイルスなどのベクターを介して患者に送達して機能を果たすこともできる。これにより、その送達方法の選択がよりフレキシブルになり、医療分野に変換するプロセスで該技術がより有利になる。一方、この技術はアデノシンＡからクレアチニンＩ（クレアチニンＩは、タンパク質の翻訳中にグアニンＧとして認識される）への編集しか実現できず、ＴからＣへの突然変異などの他の突然変異を不可能にする。さらに、ＣＲＩＳＰＲ技術と同様に、この技術も目的の編集部位に内因性ヌクレアーゼを動員するためのガイドとしてＲＮＡのフラグメントを必要としている。このガイドＲＮＡはａｒＲＮＡ（ａｄａｒ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇＲＮＡ）と名付けられた。

２０１９年７月、張鋒教授の研究グループは、ＲＥＳＣＵＥ（ＲＮＡＥｄｉｔｉｎｇｆｏｒＳｐｅｃｉｆｉｃＣｔｏＵＥｘｃｈａｎｇｅ）という新しい技術を報告した^１。この技術は、２０１７年に該研究グループによって報告されたＣａｓ１３－ＡＤＡＲの基本骨格に基づいており、反応に関与するＡＤＡＲの触媒ドメインに対してさまざまな変異の試みを行った。最後に、ＡＤＡＲ触媒ドメインのＡからＩへの編集活性をＣからＵへの編集活性に変更することで、ＲＮＡの特定の部位のＣからＵへの編集を実現し、塩基の精密な編集の範囲をさらに拡大した。ただし、この技術はまだＣａｓ１３とＡＤＡＲの間で変異した融合タンパク質の外因性発現を必要とし、細菌のタンパク質発現によって引き起こされる問題を解決することはできない。

Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｂ．，Ｋｏｏｂ，Ｊ．，Ｋｅｌｌｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｌａｄｈａ，Ａ．，．．．＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．（２０１９）．Ａｃｙｔｏｓｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅｆｏｒｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｓｉｎｇｌｅ－ｂａｓｅＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６５（６４５１），３８２－３８６．Ｃｏｘ，Ｄ．Ｂ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．，Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｂ．，Ｋｅｌｌｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．（２０１７）．ＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｗｉｔｈＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５８（６３６６），１０１９－１０２７．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（２０１４）．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ，ｅｓｓｅｎｔｉａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２４（６），３７４－３８７．Ｍｅｒｋｌｅ，Ｔ．，Ｍｅｒｚ，Ｓ．，Ｒｅａｕｔｓｃｈｎｉｇ，Ｐ．，Ｂｌａｈａ，Ａ．，Ｌｉ，Ｑ．，Ｖｏｇｅｌ，Ｐ．，．．．＆Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ，Ｔ．（２０１９）．ＰｒｅｃｉｓｅＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｂｙｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＡＤＡＲｓｗｉｔｈａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎａｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３７（２），１３３．Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｋ．Ｍ．，Ｃａｕｖｉ，Ｄ．Ｍ．，Ｔｏｏｍｅｙ，Ｃ．Ｂ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｋ．Ｖ．，＆Ｋｏｎｏ，Ｄ．Ｈ．（２０１３）．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ ａｎｄｓｙｓｔｅｍｉｃａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６（８７），１２３．Ｑｕ，Ｌ．，Ｙｉ，Ｚ．，Ｚｈｕ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｃａｏ，Ｚ．，Ｚｈｏｕ，Ｚ．，．．．＆Ｂａｏ，Ｙ．（２０１９）．ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｂｙｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＡＤＡＲｕｓｉｎｇｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３７（９），１０５９－１０６９．Ｖｕ，Ｌ．Ｔ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．Ｔ．Ｋ．，ＭｄＴｈｏｕｆｉｃ，Ａ．Ａ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．，＆Ｔｓｕｋａｈａｒａ，Ｔ．（２０１６）．ＣｈｅｍｉｃａｌＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ：ｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｃａｒｂｏｘｙｖｉｎｙｌｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌｂｉｏｌｏｇｙ＆ｄｒｕｇｄｅｓｉｇｎ，８７（４），５８３－５９３．Ｘｕ，Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｘｉｅ，Ｌ．，Ｓｕ，Ｂ．，Ｍｏｕ，Ｄ．，．．．＆Ｚｈａｏ，Ｌ．（２０１９）．ＣＲＩＳＰＲ－ｅｄｉｔｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎａｐａｔｉｅｎｔｗｉｔｈＨＩＶａｎｄａｃｕｔｅｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ．ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，３８１（１３），１２４０－１２４７．

遺伝子編集技術における上記の問題を解決し、遺伝子編集技術をよりよく医療分野に応用するためには、送達が容易でありながら、ＴからＣへの変異を高効率で正確に修正できる標的遺伝子編集技術を見つけることが急務である。

本願は、細菌由来Ｃａｓ１３ｂの発現に依存しない新しいＲＮＡ編集技術ＣＵＳＰＥＲ（ＣｔｏＵＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＥｄｉｔｉｎｇｏｆＲＮＡ）を作成し、ＲＮＡ編集の適用範囲をＡからＩへの編集からＣからＵへの編集に拡大した。

本出願では、細菌由来の高分子タンパク質の発現に依存する必要がないため、免疫系への潜在的なリスクと、免疫系による外来タンパク質への攻撃によるシステムの編集効率への影響を低減することができる。また、導入する必要があるタンパク質の分子量が大幅に減少したことで、その送達方法もよりフレキシブルになり、化学変換やＡＡＶ送達などの生物学的送達を含み得る。したがって、本願によって提供される技術案は、ＣからＵへの単一塩基編集の技術的問題を解決するだけでなく、編集システムの安全性、安定性、及び柔軟性を向上させ、生体内での応用により寄与し、生物医学の分野でより多くの応用の見通しがある。

具体的には、本願は下記の項に係る。

１、ＲＮＡ編集のための操作された組成物またはシステムであって、
１）修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、または前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する構築物と、
２）前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを標的ＲＮＡに動員するａｒＲＮＡ、または前記ａｒＲＮＡもしくはそのコード配列を含む構築物と
を含み、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインがシチジンの脱アミノ化を触媒する活性を有し、
前記ａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを標的ＲＮＡに動員して、前記標的ＲＮＡ中の標的シチジンを脱アミノ化する、
前記操作された組成物またはシステム。

一部の実施形態では、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する前記構築物と、前記ａｒＲＮＡのコード配列を含む前記構築物とは同一の構築物である。一部の実施形態では、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する前記構築物と、前記ａｒＲＮＡのコード配列を含む前記構築物とは別々の構築物である。

いくつかの実施形態では、本願の修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質は、アデノシンデアミナーゼタンパク質（例えば、ＡＤＡＲ２タンパク質）が１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加または置換によりシチジン脱アミノ化の活性を有するタンパク質である。いくつかの実施形態では、本願の修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質は、アデノシンデアミナーゼタンパク質（例えば、ＡＤＡＲ２タンパク質）またはその触媒ドメインが、１つまたは複数のアミノ酸を置換することによりシチジン脱アミノ化の活性を有するタンパク質である。いくつかの実施形態では、本願の修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質は次の変異修飾：Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔを含み、前記変異修飾のアミノ酸番号は、ＮＰ＿００１１０３．１のアミノ酸番号と同じである。いくつかの実施形態では、本願の修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質は、その他のＡＤＡＲ２相同タンパク質を参考配列として、且つ、Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔに対応する変異を有するタンパク質を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集のための本願の操作された組成物またはシステムは、上記の修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質の触媒ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記触媒ドメインは、上記の修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質の触媒ドメインである。

２、前記アデノシンデアミナーゼは、シチジンを脱アミノ化してウリジンに変換する活性を有するように、１つまたは複数の部位で変異修飾されている、項１に記載の操作された組成物またはシステム。

３、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、ＡＤＡＲ２タンパク質またはその相同タンパク質またはその触媒ドメインである、項２に記載の操作された組成物またはシステム。

４、前記変異修飾は、Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔを含み、前記変異修飾のアミノ酸番号は、ＮＰ＿００１１０３．１のアミノ酸番号と同じである、項３に記載の操作された組成物またはシステム。

いくつかの実施形態では、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、ＮＰ＿００１１０３．１タンパク質の相同タンパク質であり、下記の変異：Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔに対応する変異を有する。

５、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、標的シチジンに対向するターゲティング塩基はＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧである、項１～４のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。

６、前記ターゲティング塩基はＵまたはＣである、項５に記載の操作された組成物またはシステム。

７、前記ａｒＲＮＡは、標的塩基の上流、下流、または上流及び下流の１つもしくは複数の位置でヌクレオチドミスマッチを形成するために、標的ＲＮＡに対応する標的塩基の上流、下流、または上流及び下流の１つもしくは複数の位置に不対ヌクレオチドを含む、
項１～６のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。

８、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の３’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとミスマッチが形成される、項７に記載の操作された組成物またはシステム。

９、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ターゲティング塩基の３’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとＧ－Ｇミスマッチが形成される、項８に記載の操作された組成物またはシステム。

１０、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ターゲティング塩基の５’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとミスマッチを形成しない、項１～９のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。

１１、前記ターゲティング塩基の５'最近傍塩基はＵである、項１０に記載の操作された組成物またはシステム。

１２、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の５’最近傍塩基に対向する標的ＲＮＡの塩基の好ましい順序は、高い方から低い方へ、ＧまたはＣ、ＵまたはＡ（Ｇ≒Ｃ＞Ｕ≒Ａ）である、項９に記載の操作された組成物またはシステム。

１３、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記標的塩基とその５’及び３’隣接塩基によって形成される標的塩基トリプレットは、標的塩基でのみミスマッチを形成し、前記標的塩基トリプレットは、ＡＣＧ、ＡＣＣ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＵＣＡ、ＵＣＵから選択される、項１～６のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。

１４、前記ａｒＲＮＡの長さが５０ｎｔを超え、５５ｎｔを超え、６０ｎｔを超え、６５ｎｔを超え、７０ｎｔを超え、７５ｎｔを超え、８０ｎｔを超え、８５ｎｔを超え、９０ｎｔを超え、９５ｎｔを超え、１００ｎｔを超え、１０５ｎｔを超え、１１０ｎｔを超え、１１５ｎｔを超え、１２０ｎｔを超える、項１～１３のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。一部の実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは約１５１～５３ｎｔ、１３１～６１ｎｔ、１２１～６１ｎｔ、１１１～６５ｎｔ、１０１～７１ｎｔ、９１～７１ｎｔ、８１～７１ｎｔである。一部の具体的な実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、前記定義された長さ範囲内のいずれか１つの正の整数である。

１５、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端及び５’末端からの長さが同じである、項１～１４のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。

１６、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端からの長さが４５～５ｎｔ、４０～５ｎｔ、３５～１０ｎｔ、２５ｎｔ～１５ｎｔ、２４ｎｔ～１１ｎｔである、項１～１４のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。一部の具体的な実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、前記定義された長さ範囲内のいずれか１つの正の整数である。

１７、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、５’末端からの長さが８０～３０ｎｔ、７０～３５ｎｔ、６０～４０ｎｔ、５５ｎｔ～３５ｎｔ、５５ｎｔ～４５ｎｔである、項１～１４のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。一部の具体的な実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、前記定義された長さ範囲内のいずれか１つの正の整数である。

１８、前記ａｒＲＮＡが化学修飾されている、項１～１７のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。

１９、前記化学修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾またはヌクレオチド間３’チオ修飾を含む、項１８に記載の操作された組成物またはシステム。

２０、細胞内の標的ＲＮＡ中の標的シトシンを脱アミノ化する方法であって、
１）修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、または前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する構築物と、
２）前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを前記標的ＲＮＡに動員するａｒＲＮＡ、または前記ａｒＲＮＡもしくはそのコード配列を含む構築物と
を前記細胞に導入することを含み、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインがシチジンの脱アミノ化を触媒する活性を有し、前記ａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを標的ＲＮＡに動員して、前記標的ＲＮＡ中の標的シチジンを脱アミノ化する、
前記方法。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集のための本願の操作された組成物またはシステムは、上記の修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質の触媒ドメインを含む。

２１、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する前記構築物と、前記ａｒＲＮＡのコード配列を含む前記構築物とは同一の構築物であり、同時に前記細胞に導入され、あるいは、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する前記構築物と、前記ａｒＲＮＡのコード配列を含む前記構築物とは別々の構築物であり、前記別々の構築物は、同時にまたは別々に前記細胞に導入される、項２０に記載の方法。

２２、前記アデノシンデアミナーゼは、シチジンを脱アミノ化してウリジンに変換する活性を有するように、１つまたは複数の部位で変異修飾している、項２０または２１に記載の方法。

２３、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、ＡＤＡＲ２タンパク質またはその相同タンパク質またはその触媒ドメインである、項２２に記載の方法。

２４、前記変異修飾は、Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔを含み、前記変異修飾のアミノ酸番号は、ＮＰ＿００１１０３．１のアミノ酸番号と同じである、項２３に記載の方法。

一部の実施形態では、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、ＮＰ＿００１１０３．１タンパク質の相同タンパク質であり、下記の変異：Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔに対応する変異を有する。

２５、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、標的シチジンに対向するターゲティング塩基はＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧである、項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。

２６、前記ターゲティング塩基はＵまたはＣである、項２５に記載の方法。

２７、前記ａｒＲＮＡは、標的塩基の上流、下流、または上流及び下流の１つもしくは複数の位置でヌクレオチドミスマッチを形成するために、標的ＲＮＡに対応する標的塩基の上流、下流、または上流及び下流の１つもしくは複数の位置に不対ヌクレオチドを含む、
項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。

２８、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の３’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとミスマッチを形成する、項２７に記載の方法。

２９、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ターゲティング塩基の３’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとＧ－Ｇミスマッチを形成する、項２８に記載の方法。

３０、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ターゲティング塩基の５’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとミスマッチを形成しない、項２１～２９のいずれか一項に記載の方法。

３１、前記ターゲティング塩基の５'最近傍塩基はＵである、項３０に記載の方法。

３２、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の５’最近傍塩基に対向する標的ＲＮＡの塩基の好ましい順序は、高い方から低い方へ、ＧまたはＣ、ＵまたはＡ（Ｇ≒Ｃ＞Ｕ≒Ａ）である、項２９に記載の方法。

３３、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記標的塩基とその５’及び３’隣接塩基によって形成される標的塩基トリプレットは、標的塩基でのみミスマッチを形成し、前記標的塩基トリプレットは、ＡＣＧ、ＡＣＣ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＵＣＡ、ＵＣＵから選択される、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。

３４、前記ａｒＲＮＡの長さが５０ｎｔを超え、５５ｎｔを超え、６０ｎｔを超え、６５ｎｔを超え、７０ｎｔを超え、７５ｎｔを超え、８０ｎｔを超え、８５ｎｔを超え、９０ｎｔを超え、９５ｎｔを超え、１００ｎｔを超え、１０５ｎｔを超え、１１０ｎｔを超え、１１５ｎｔを超え、１２０ｎｔを超える、項２１～３３のいずれか一項に記載の方法。一部の実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは約１５１～５３ｎｔ、１３１～６１ｎｔ、１２１～６１ｎｔ、１１１～６５ｎｔ、１０１～７１ｎｔ、９１～７１ｎｔ、８１～７１ｎｔである。一部の具体的な実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、前記定義された長さ範囲内のいずれか１つの正の整数である。

３５、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端及び５’末端からの長さが同じである、項２１～３４のいずれか一項に記載の方法。

３６、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端からの長さが４５～５ｎｔ、４０～５ｎｔ、３５～１０ｎｔ、２５ｎｔ～１５ｎｔ、２４ｎｔ～１１ｎｔである、項２１～３４のいずれか一項に記載の方法。一部の具体的な実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、前記定義された長さ範囲内のいずれか１つの正の整数である。

３７、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、５’末端からの長さが８０～３０ｎｔ、７０～３５ｎｔ、６０～４０ｎｔ、５５ｎｔ～３５ｎｔ、５５ｎｔ～４５ｎｔである、項２１～３４のいずれか一項に記載の方法。一部の具体的な実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、前記定義された長さ範囲内のいずれか１つの正の整数である。

３８、前記ａｒＲＮＡが化学修飾されている、項２１～３７のいずれか一項に記載の方法。

３９、前記化学修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾またはヌクレオチド間３’チオ修飾を含む、項３８に記載の方法。

４０、前記細胞が哺乳動物細胞である、項２１～３９のいずれか一項に記載の方法。

４１、項２１～３９のいずれか一項に記載の方法を用いて、ＴからＣへの変異転写を含んで形成されるメッセンジャーＲＮＡ中の標的塩基Ｃを脱アミノ化し、前記変異を修正することを含む、前記ＴからＣへの変異によって引き起こされる疾患を治療するための方法。

４２、修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質であって、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質はＡＤＡＲ２であり、Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔ変異修飾を含み、前記変異修飾のアミノ酸番号はＮＰ＿００１１０３．１のアミノ酸番号と同じであり、前記ＡＤＡＲ２タンパク質は前記変異修飾によりシチジンの脱アミノ化を触媒する活性を有する、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質。

４３、シチジンを脱アミノ化してウリジンへの変換を触媒するための、項４２に記載の修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質の使用。

ＢＦＰレポーターシステムと、ＣからＵに編集される標的塩基を示す図である。ターゲティング部位がＵであるときＣＵＳＰＥＲ及びＲＥＳＣＵＥ技術によってガイドＲＮＡを設計する場合の標的塩基の選択及びターゲティング部位の隣接塩基の設計原則を示す図である。ＣＵＳＰＥＲ編集システムのテストを示す図である。図中の「／」は、対応するプラスミドやａｒＲＮＡを添加せず、同量の水のみを添加したことを表す。標的塩基に隣接する上流及び下流の塩基に対するＬＥＡＰＥＲ技術の優先度を示す図である。図中の矢印は、図３に対応して、標的塩基の３’隣接塩基がＡである場合、５’隣接上流に対するＬＥＡＰＥＲ技術の優先度を示す。標的塩基に隣接する上流及び下流の塩基に対するＲＥＳＣＵＥ技術の優先度を示す図である。図中の矢印は、図３に対応して、３’隣接塩基がＡである場合、５’隣接上流に対するＲＥＳＣＵＥ技術の優先度を示す。ＣＵＳＰＥＲ編集システムで繰り返しテストを行った結果を示す図である。図中の「／」は、対応するプラスミドやａｒＲＮＡを添加せず、等量の水のみを添加したことを表す。標的ＣがＵに対応し、その隣接する塩基にミスマッチがない場合のｍＲＮＡ及び対応するａｒＲＮＡ配列を示す図である。標的ＣがＵに対応し、その隣接塩基にミスマッチがない場合の３’及び５’隣接塩基の１６の組み合わせすべてのＣからＵへのＲＮＡ編集効率を示す図である。

既存の遺伝子編集技術は一般に異種外来タンパク質に依存しているというジレンマを解決し、より多くの種類の塩基で正確な単一塩基編集を実現するために、本願はＲＮＡ編集技術ＣＵＳＰＥＲ（ＣｔｏＵＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＥｄｉｔｉｎｇ）を作成した。ＣＵＳＰＥＲは、ＲＮＡ編集の適用範囲をＡからＩへの編集からＣからＵへの編集へと拡大し、哺乳類自身が発現する酵素タンパク質を編集に使用するため、細胞への異種外来タンパク質の導入を回避し、安全性を高め、遺伝子編集プロセス全体がより効率的かつ便利になる。

定義
本明細書において、「ＣＵＳＰＥＲ技術」とは、本願の技術案における独自の技術であり、ＣＵＳＰＥＲは「ＣｔｏＵＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＥｄｉｔｉｎｇｏｆＲＮＡ」の略語、すなわち「シチジンＣからウリジンＵへのプログラム可能な特異的ＲＮＡ編集」である。この技術は、標的ＲＮＡに相補的にハイブリダイズできる短いＲＮＡを使用して、修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを含むタンパク質を標的ＲＮＡに動員し、標的シチジンを脱アミノ化してウリジンに変換する。前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを含むタンパク質は、修飾されてシトシンの脱アミノ化を触媒する活性を有する。前記標的ＲＮＡに相補的にハイブリダイズできる短いＲＮＡはすなわちａｒＲＮＡである。本出願において使用される場合、「ａｒＲＮＡ（ａｄａｒ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇＲＮＡ）」は、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを標的ＲＮＡに動員することができる一本鎖ＲＮＡを指し、このａｒＲＮＡは前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを標的ＲＮＡに動員して、標的ＲＮＡ中の標的シチジンを脱アミノ化する。本明細書で使用される場合、核酸の「相補」とは、従来のワトソン－クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成によって別の核酸と水素結合を形成する核酸の能力を指す。パーセント相補性は、別の核酸と水素結合（すなわち、ワトソン－クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうち約５、６、７、８、９、１０がそれぞれ約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列のすべての連続する残基が、第２の核酸配列における同じ数の連続する残基と水素結合を形成することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、約４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％のいずれか１つである相補性の程度、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。単一の塩基または単一のヌクレオチドの場合、ワトソン－クリックの塩基対形成の原理に従って、ＡがＴまたはＵと、ＣがＧまたはＩとペアリングする場合、それは相補的またはマッチングと呼ばれ、その逆も同様である。これ以外のすべての塩基対形成は、非相補的または非マッチングと呼ばれる。

「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。前記水素結合は、ワトソンクリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合、またはその他の配列特異的な方法で発生できる。所与の配列とハイブリダイズすることができる配列は、所与の配列の「相補配列」と呼ばれる。

本明細書で使用される場合、「送達」という用語は、何らかの手段によって、細胞膜の外側から細胞膜内への核酸やタンパク質などの生物学的高分子の導入を指す。「送達」としては、例えば、エレクトロトランスフェクション、リポフェクション、脂質－ナノ粒子送達、ウイルス送達、エクソソーム送達などが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「標的ＲＮＡ」という用語は、編集されるアデノシン（Ａ）を含む、編集される標的ＲＮＡを指す。前記標的ＲＮＡは成熟ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体であり得る。前記編集されるシチジンは、「標的塩基」、「標的シチジン」または「標的Ｃ」と呼ばれる。標的ＲＮＡの５’末端で標的シチジンに隣接する塩基は「５’隣接塩基」と呼ばれ、標的ＲＮＡの３’末端で標的シチジンに隣接する塩基は「３’隣接塩基」と呼ばれ、標的塩基ならびにその３’及び５’隣接塩基からなる塩基トリプレットは、本明細書では「標的塩基トリプレット」と呼ばれる。ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記標的塩基の反対側のａｒＲＮＡ上の塩基は「ターゲティング塩基」と呼ばれ、ａｒＲＮＡの５’末端でターゲティング塩基に隣接する塩基は「５’最近傍塩基」と呼ばれ、ａｒＲＮＡの３’末端でターゲティング塩基に隣接する塩基は「３’最近傍塩基」と呼ばれ、ターゲティング塩基ならびにその３’及び５’最近傍塩基からなる塩基トリプレットは、本明細書で「ターゲティング塩基トリプレット」と呼ばれる。

本明細書では、３’末端からのターゲティング塩基の長さとは、ターゲティング塩基の３’最近傍塩基から３’の最末端の塩基までのすべての塩基数を指す。５’末端からのターゲティング塩基の長さとは、ターゲティング塩基の５’最近傍塩基から５’の最末端の塩基までのすべての塩基数を指す。

本明細書で使用される場合、「アデノシンデアミナーゼ（ＡｄｅｎｏｓｉｎｅｔｏｉｎｏｓｉｎｅａｃｔｉｎｇｏｎＲＮＡｅｎｚｙｍｅ，ＡＤＡＲ）」という用語は、真核生物（ヒトなどの哺乳動物を含む）の様々な組織で広く発現され、ＲＮＡ分子内のアデノシンＡからイノシンＩへの変換を触媒することができるアデノシンデアミナーゼのクラスを指す。

本願において、Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔ変異とは、ＡＤＡＲ２タンパク質に発生する一連の変異を指し、前記変異修飾のアミノ酸番号は、ＮＰ＿００１１０３．１のアミノ酸番号と同じであり、すなわち、ＮＰ＿００１１０３．１を参考配列とする。異なるＡＤＡＲ２タンパク質の参考配列によって、前記変異のアミノ酸番号が変わる可能性があることを当業者は知るであろう。そのため、本願に使用されるように、Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔ変異は、異なるＡＤＡＲ２タンパク質の参考配列中の、前記変異のアミノ酸位置に対応する変異を含み、前記ＡＤＡＲ２タンパク質は前記変異修飾によりシチジンの脱アミノ化を触媒する活性を有する。それに対応して、本願で提供される修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質は、ＮＰ＿００１１０３．１を参考配列として、かつＥ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔ変異修飾を含むＡＤＡＲ２を含み、また、異なるＡＤＡＲ２タンパク質を参考配列として、対応する変異修飾を含むＡＤＡＲ２もカバーしている。

本明細書で使用される場合、「構築物」という用語は、ある核酸配列を含む核酸ベクターを指し、これは、線状核酸分子、プラスミドまたはウイルスベクターなどであり得る。前記核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得る。前記特定な核酸配列は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列であり得る。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、転写、翻訳、または発現されることなく直接機能する。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、転写されてＲＮＡを形成した後、ＲＮＡ分子として機能するＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、翻訳された後にポリペプチドまたはタンパク質として機能するＲＮＡである。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、タンパク質を形成するための転写及び翻訳ステップの後にタンパク質として機能するＤＮＡである。前記構築物は、ウイルス、脂質ナノ粒子、またはエクソソームなどの形にパッケージングして細胞に入ることができ、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、化学形質転換などによって細胞に導入することもできる。

本明細書で使用される「修飾」という用語は、遺伝子工学的方法などの化学的方法によって核酸またはタンパク質の組成または構造を変化させ、それによって前記核酸またはタンパク質の１つまたは複数の特性または機能を変化させることを指す。例えば、本願において、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、１つまたは複数のアミノ酸を付加、欠失、及び/または変異させることなどによって修飾された後、シチジンの脱アミノ化を触媒する作用を有する。

操作された組成物またはシステム
本願は、ＲＮＡ編集のための操作された組成物またはシステムを提供し、この操作された組成物またはシステムは、
１）修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、または前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する構築物と、
２）前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを標的ＲＮＡに動員するａｒＲＮＡ、または前記ａｒＲＮＡもしくはそのコード配列を含む構築物と
を含み、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインがシチジンの脱アミノ化を触媒する活性を有し、
前記ａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを標的ＲＮＡに動員して、前記標的ＲＮＡ中の標的シチジンを脱アミノ化する。

いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼは１つまたは複数の部位で変異修飾することによってシチジンを脱アミノ化してウリジンに変換する活性を有する。いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、ＡＤＡＲ２タンパク質またはその相同タンパク質または前記ＡＤＡＲ２タンパク質の触媒ドメインまたは前記ＡＤＡＲ２タンパク質の相同タンパク質の触媒ドメインである。いくつかの実施形態では、前記変異修飾は、Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔを含み、前記変異修飾のアミノ酸番号は、ＮＰ＿００１１０３．１のアミノ酸番号と同じである。

いくつかの実施形態では、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、線状核酸、プラスミド、及びウイルスベクターから選択されるいずれかの構築物を細胞に導入することによって発現される。いくつかの実施形態では、前記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞はヒト細胞である。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、標的シチジンに対向するターゲティング塩基はＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧである。いくつかの実施形態では、ターゲティング塩基の好ましい順序は、Ｕ＞Ｃ＞Ａ≒Ｇである。すなわち、複数のａｒＲＮＡ配列を比較する場合、ターゲティング塩基以外の塩基がすべて同じであると、通常、ターゲティング塩基がＵまたはＣであるａｒＲＮＡの方が編集効率がより高い。したがって、好ましくは、いくつかの実施形態では、前記ターゲティング塩基はＵまたはＣである。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、標的塩基の上流、下流、または上流及び下流の１つもしくは複数の位置でヌクレオチドミスマッチを形成するために、標的ＲＮＡに対応する標的塩基の上流、下流、または上流及び下流の１つもしくは複数の位置に不対ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡターゲティング塩基の３’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとミスマッチを形成する。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ターゲティング塩基の３’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとＧ－Ｇミスマッチを形成する。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ターゲティング塩基の５’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとミスマッチを形成しない。いくつかの実施形態では、前記ターゲティング塩基の５’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとミスマッチを形成しなく、前記ターゲティング塩基の５'最近傍塩基はＵである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の５’最近傍塩基に対向する標的ＲＮＡの塩基の好ましい順序は、高い方から低い方へ、ＧまたはＣ、ＵまたはＡである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ａｒＲＮＡのターゲティングトリプレット以外の１つまたは複数の塩基は標的ＲＮＡとミスマッチを形成する。そして、いくつかの実施形態では、前記ミスマッチは、前記ａｒＲＮＡに基づくターゲティング編集の効率をさらに向上させることができる。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記標的塩基とその５’及び３’隣接塩基によって形成される標的塩基トリプレットは、標的塩基でのみミスマッチを形成し、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端及び５’末端からの長さが等しく、このとき、好ましくは、前記標的塩基トリプレットは、ＡＣＧ、ＡＣＣ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＵＣＡ、ＵＣＵから選択される。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記標的塩基とその５’及び３’隣接塩基によって形成される標的塩基トリプレットは、標的塩基でのみミスマッチを形成し、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端及び５’末端からの長さが等しくなく、このとき、前記標的塩基トリプレットは、ＡＣＧ、ＡＣＣ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＵＣＡ、ＵＣＵから選択される。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さが５０ｎｔを超え、５５ｎｔを超え、６０ｎｔを超え、６５ｎｔを超え、７０ｎｔを超え、７５ｎｔを超え、８０ｎｔを超え、８５ｎｔを超え、９０ｎｔを超え、９５ｎｔを超え、１００ｎｔを超え、１０５ｎｔを超え、１１０ｎｔを超え、１１５ｎｔを超え、１２０ｎｔを超える。一部の実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは約１５１～５３ｎｔ、１３１～６１ｎｔ、１２１～６１ｎｔ、１１１～６５ｎｔ、１０１～７１ｎｔ、９１～７１ｎｔ、８１～７１ｎｔである。一部の具体的な実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、前記定義された長さ範囲内のいずれか１つの正の整数である。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端及び５’末端からの長さが同じである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端及び５’末端からの長さが同じではない。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端からの長さが４５～５ｎｔ、４０～５ｎｔ、３５～１０ｎｔ、２５ｎｔ～１５ｎｔ、２４ｎｔ～１１ｎｔである。一部の具体的な実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、前記定義された長さ範囲内のいずれか１つの正の整数である。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、５’末端からの長さが８０～３０ｎｔ、７０～３５ｎｔ、６０～４０ｎｔ、５５ｎｔ～３５ｎｔ、５５ｎｔ～４５ｎｔである。一部の具体的な実施形態では、前記長さは、前記定義された長さ範囲内のいずれか１つの正の整数である。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、５’末端からの長さが８０を超える。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが化学合成されている。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡはオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態では、前記化学修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾またはヌクレオチド間３’チオ修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記化学修飾は、
配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されていること、
最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエート結合であること、
配列内のすべてのＵは、２’－ＯＭｅによって修飾されていること、
ターゲティング塩基の３’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＡであること、
ターゲティング塩基の５’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＣであること、
ターゲティング塩基は、ホスホロチオエート結合によって、それぞれ３’最近傍塩基と５’最近傍塩基に結合されていること、
最初の５ヌクレオチド及び最後の５ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されていること、及び
最初の５ヌクレオチドと最後の５ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって結合されていること
から選択される１つまたは複数である。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは構築物によってコードされ、転写されて生成する。いくつかの実施形態では、前記構築物は、線状核酸鎖、ウイルスベクター、またはプラスミドから選択される。

ＲＮＡ編集方法
本願は、細胞内の標的ＲＮＡ中の標的シトシンを脱アミノ化する方法、すなわちＣＵＳＰＥＲ（ＣからＵへのプログラム可能な特異的ＲＮＡ編集）を提供し、該方法は、
１）修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、または前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する構築物と、
２）前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを前記標的ＲＮＡに動員するａｒＲＮＡ、または前記ａｒＲＮＡもしくはそのコード配列を含む構築物と
を前記細胞に導入することを含み、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインが修飾されてシチジンの脱アミノ化を触媒する活性を有し、前記ａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを標的ＲＮＡに動員して、前記標的ＲＮＡ中の標的シチジンを脱アミノ化する。

いくつかの実施形態では、前記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞はマウス細胞である。

いくつかの実施形態では、本願の修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質は、アデノシンデアミナーゼタンパク質（例えば、ＡＤＡＲ２タンパク質）が１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加または置換によりシチジン脱アミノ化の活性を有するタンパク質である。いくつかの実施形態では、本願の修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質は、アデノシンデアミナーゼタンパク質（例えば、ＡＤＡＲ２タンパク質）またはその触媒ドメインが、１つまたは複数のアミノ酸を置換することによりシチジン脱アミノ化の活性を有するタンパク質である。いくつかの実施形態では、本願の修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質は次の変異修飾：Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔを含み、前記変異修飾のアミノ酸番号は、ＮＰ＿００１１０３．１のアミノ酸番号と同じである。いくつかの実施形態では、本願の修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質は、その他のＡＤＡＲ２タンパク質を参考配列として、且つ、Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔに対応する変異を有するタンパク質を含む。

当業者は、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを発現する前記構築物が、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインのコード配列を含むことを知っているであろう。いくつかの実施形態では、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する前記構築物と、前記ａｒＲＮＡのコード配列を含む前記構築物とは同一の構築物である。いくつかの実施形態では、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインのコード配列を発現する前記構築物と、前記ａｒＲＮＡのコード配列を含む前記構築物とは別々の構築物であり、すなわち、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインのコード配列は、前記ａｒＲＮＡのコード配列とはそれぞれ異なる構築物に位置する。いくつかの実施形態では、前記異なる構築物は２つ以上である。いくつかの実施形態では、前記別々の構築物は、同時にまたは別々に前記細胞に導入される。本段落で言及された異なる構築物は、同一の構築物ではないことを指し、これは、別々の構築物が構築物の異なるカテゴリーに属することを意味しないことを理解されたい。いくつかの実施形態では、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する前記構築物と、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを前記標的ＲＮＡに動員するａｒＲＮＡまたは前記ａｒＲＮＡを含む構築物または前記ａｒＲＮＡのコード配列を含む構築物とを同一の細胞に導入する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡのハイスループット編集を実現するように、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、または前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する構築物と、複数のａｒＲＮＡまたは前記ａｒＲＮＡを含む構築物または前記ａｒＲＮＡのコード配列を含む構築物とを細胞に導入し、ここで、前記複数のａｒＲＮＡは、異なる標的ＲＮＡを標的とするａｒＲＮＡ、または同一の標的ＲＮＡの異なる標的塩基（例えばＣ）部位を標的とするａｒＲＮＡである。

そのため、本願はまた、細胞内の標的ＲＮＡ中の標的シトシンのハイスループット編集のための方法をカバーし、該方法は、
１）修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、または前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する構築物と、
前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを前記標的ＲＮＡに動員する複数（例えば、２種以上、５種以上、５種以上、１０種以上）のａｒＲＮＡ、または前記ａｒＲＮＡもしくはそのコード配列を含む構築物と
を前記細胞に導入することを含み、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインがシチジンの脱アミノ化を触媒する活性を有し、前記複数（例えば、２種以上、５種以上、５種以上、１０種以上）のａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡにそれぞれハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを標的ＲＮＡに動員して、前記標的ＲＮＡ中の標的シチジンを脱アミノ化する。

いくつかの実施形態では、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する前記構築物と、前記ａｒＲＮＡのコード配列を含む前記構築物とは同一の構築物であり、あるいは、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する前記構築物と、前記ａｒＲＮＡのコード配列を含む前記構築物とは別々の構築物であり、前記別々の構築物は、同時にまたは別々に前記細胞に導入される。

いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼは、シチジンを脱アミノ化してウリジンに変換する活性を有するように、１つまたは複数の部位で変異修飾している。

いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、ＡＤＡＲ２タンパク質またはその相同タンパク質またはその触媒ドメインである。

いくつかの実施形態では、前記変異修飾は、Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔを含み、前記変異修飾のアミノ酸番号は、ＮＰ＿００１１０３．１のアミノ酸番号と同じである。いくつかの実施形態において、前記構築物は、ウイルスベクター、プラスミド、及び線状核酸から選択される。いくつかの実施形態では、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、または前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する前記構築物と、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを前記標的ＲＮＡに動員するａｒＲＮＡのオリゴヌクレオチド、または前記ａｒＲＮＡを転写する構築物とを、ウイルス感染、化学的トランスフェクション、エレクトロトランスフェクション、エキソソーム送達、またはナノ脂質粒子送達によって前記細胞に導入する。

いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質は１つまたは複数の部位で変異修飾することによってシチジンを脱アミノ化してウリジンに変換する活性を有する。いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、ＡＤＡＲ２タンパク質またはその相同タンパク質またはその触媒ドメインである。いくつかの実施形態では、前記変異修飾は、Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔを含み、前記変異修飾のアミノ酸番号は、ＮＰ＿００１１０３．１のアミノ酸番号と同じである。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、標的シチジンに対向するターゲティング塩基はＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、標的シチジンに対向するターゲティング塩基はＵまたはＣである。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、標的塩基の上流、下流、または上流及び下流の１つもしくは複数の位置でヌクレオチドミスマッチを形成するために、標的ＲＮＡに対応する標的塩基の上流、下流、または上流及び下流の１つもしくは複数の位置に不対ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡターゲティング塩基の３’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとミスマッチを形成する。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ターゲティング塩基の３’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとＧ－Ｇミスマッチを形成する。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ターゲティング塩基の５’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとミスマッチを形成しない。いくつかの実施形態では、前記ターゲティング塩基の５'最近傍塩基はＵである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の５’最近傍塩基に対向する標的ＲＮＡの塩基の好ましい順序は、高い方から低い方へ、ＧまたはＣ、ＵまたはＡ（Ｇ≒Ｃ＞Ｕ≒Ａ）である。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の５’最近傍塩基に対向する標的ＲＮＡの塩基は好ましくはＧまたはＣである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の５’最近傍塩基に対向する標的ＲＮＡの塩基は最も好ましくはＧである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ａｒＲＮＡのターゲティングトリプレット以外の１つまたは複数の塩基は標的ＲＮＡとミスマッチを形成する。そして、いくつかの実施形態では、前記ミスマッチは、前記ａｒＲＮＡに基づくターゲティング編集の効率をさらに向上させることができる。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端及び５’末端からの長さが同じである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端及び５’末端からの長さが同じではない。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端からの長さが４５～５ｎｔ、４０～５ｎｔ、３５～１０ｎｔ、２５ｎｔ～１５ｎｔ、２４ｎｔ～１１ｎｔである。一部の具体的な実施形態では、前記長さは、前記定義された長さ範囲内のいずれか１つの正の整数である。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡはオリゴヌクレオチドであるか、またはオリゴヌクレオチドに含まれている。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは化学修飾されている。いくつかの実施形態では、前記化学修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾またはヌクレオチド間３’チオ修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記化学修飾は、
配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されていること、
最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエート結合であること、
配列内のすべてのＵは、２’－ＯＭｅによって修飾されていること、
ターゲティング塩基の３’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＡであること、
ターゲティング塩基の５’最近傍塩基は２’－ＯＭｅによって修飾されたＣであること、
ターゲティング塩基は、ホスホロチオエート結合によって、それぞれ３’最近傍塩基と５’最近傍塩基に結合されていること、
最初の５ヌクレオチド及び最後の５ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅによって修飾されていること、及び
最初の５ヌクレオチドと最後の５ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって結合されていること
から選択される１つまたは複数である。

ＲＮＡ編集関連酵素タンパク質及びその使用
本願は、修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質を提供し、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質はＡＤＡＲ２であり、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１０３．１のＡＤＡＲ２に対応する以下のアミノ酸変異：Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔ、または前記ＮＰ＿００１１０３．１の相同なＡＤＡＲ２タンパク質の対応する位置のアミノ酸変異を含み、前記ＡＤＡＲ２タンパク質は前記変異修飾によりシチジンの脱アミノ化を触媒する活性を有する。

本願はまた、シチジンを脱アミノ化してウリジンへの変換を触媒するための前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質の使用を提供する。いくつかの実施形態では、シチジンを脱アミノ化してウリジンへの変換を触媒する使用は、細胞内で起こる。いくつかの実施形態では、シチジンを脱アミノ化してウリジンへの変換を触媒する使用は、細胞外で起こる。

疾患の治療方法
本願は、前述のＲＮＡ編集方法を用いて、ＴからＣへの変異転写を含んで形成されるメッセンジャーＲＮＡ中の標的塩基Ｃを脱アミノ化し、前記変異を修正することを含む、前記ＴからＣへの変異によって引き起こされる疾患を治療するための方法を提供する。

いくつかの実施形態では、前記ＴからＣへの変異によって引き起こされる疾患を治療するための方法は、前記の操作された組成物またはシステムを被験者に注射することを含む。いくつかの実施形態では、前記治療は、下記の
１）修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、または前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する構築物と、
２）前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを前記標的ＲＮＡに動員するａｒＲＮＡ、または前記ａｒＲＮＡもしくはそのコード配列を含む構築物と
を被験者に注射することを含む。ここで、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質は、前述のＲＮＡ編集関連酵素タンパク質である。

いくつかの実施形態では、前記注射は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、または腫瘍内注射である。

いくつかの実施形態では、前記ＴからＣへの変異によって引き起こされる疾患は、遺伝病及びがんを含む。

キット及び製剤
本願はまた、シチジンを脱アミノ化してウリジンへの変換を触媒するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、前記キットは、前述の操作された組成物またはシステムを含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、前記操作された組成物及びシステムにおける修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインをコードもしくは発現する、及び／または前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを標的ＲＮＡに動員するａｒＲＮＡの構築物を含む。

本願で提供されるＣＵＳＰＥＲ技術を使用してＲＮＡをターゲティング編集する方法には、次の利点がある。

新技術が編集されたタンパク質（アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）など）を動員する場合、ＲＥＳＣＵＥ技術とは異なり、Ｃａｓ１３ｂ動員バックボーンを含むガイドＲＮＡを設計する必要がなく、細菌由来のＣａｓ１３ｂの過剰発現を必要とせず、外因性発現タンパク質の長さを短くすることで、ウイルスベクターによるパッケージ及び人体への送達が容易かつ多様になるとともに、外因的に発現したヌクレアーゼの中和によって引き起こされる遺伝子編集の失敗の可能性を減らすことができる。これによって、医療分野に適用した場合、ＲＥＳＣＵＥ技術よりも大きな利点がある。

一方、新しいシステムは、ＲＮＡ編集の適用範囲でＡからＩへの編集のみを実現できるＬＥＡＰＥＲ技術とは違って、編集をＣからＵへと広げた。これにより、ゲノム上にＴからＣへの変異を示す多くの遺伝病を、及びＣからＴ／Ｕへの変換を必要とする他の用途に、本願の技術で治療することが可能になる。

したがって、従来技術と比較して、本願の技術は適用範囲が広く、より安全で効果的である。

本発明の好ましい実施形態は、以上で詳細に説明されてきたが、本発明はそれに限定されない。本発明の技術構想の範囲内で、他の適切な方法で様々な技術的特徴を組み合わせるなど、本発明の技術案に対して様々な簡単な変形を行うことができる。これらの簡単な変形及び組み合わせもまた、本発明によって開示される内容と見なされるべきであり、すべてが本発明の保護範囲に属する。

本発明の技術案は、具体的な実施例を組み合わせて以下でさらに詳細に説明されるが、本発明は、以下の実施例に限定されない。特に断りのない限り、下記の試薬は市販されている。簡潔にするために、いくつかの操作は、使用されるパラメータ、ステップ、及び機器を詳述しておらず、これらは、当業者によってよく知られており、再現可能であることを理解されたい。

実施例１：修飾されたＡＤＡＲ２及びＢＦＰレポーターシステムの分子構築
１、変異型ＡＤＡＲ２－ｒ１６－２９３Ｔの構築
参考文献１に報道されたＲＥＳＣＵＥ技術を参照してＡＤＡＲ２（ＲＮＡアデノシンデアミナーゼ２）の触媒ドメインの変異を誘発し、変異部位は文献のｒ１６と同じであり（ｄＡＤＡＲ２（Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔ）ｒ１６，ｈｔｔｐｓ：／／ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ．ｃｏｍ／ｓ／ｓｅｑ－１９Ｙｔｗｗｈ０ｉ０ｖＳＩｂｙＸＹＺ９５）、前記変異修飾のアミノ酸番号は、ＮＰ＿００１１０３．１のアミノ酸番号と一致している。上述の変異を含むＡＤＡＲ２コード配列フラグメントを、本分野における従来のＤＮＡ合成技術を使用してインビトロで合成し、制限酵素ライゲーションにより、ｐＬｅｎｔｉ－ＡＤＡＲ２プラスミドベクター（ｐＬｅｎｔｉ－ＡＤＡＲ２プラスミドバックボーンは、魏文勝教授の研究室から寄贈された）のＡＤＡＲ２ＸｍａＩ制限部位とＡｓｃＩ制限部位の間に挿入した。上記の手順で構築されたプラスミドをｐＬｅｎｔｉ－ＡＤＡＲ２－ｒ１６と命名し、上記の変異を含むＡＤＡＲ２遺伝子をＡＤＡＲ２－ｒ１６と命名した。ＡＤＡＲ２－ｒ１６の全長ｃＤＮＡ配列は、配列番号１である。ｐＬｅｎｔｉ－ＡＤＡＲ２－ｒ１６を、第２世代のレンチウイルスパッケージングシステム（ｐＣＡＧ－ＶＳＶＧは、ＡｒｔｈｕｒＮｉｅｎｈｕｉｓ＆ＰａｔｒｉｃｋＳａｌｍｏｎから寄贈され（Ａｄｄｇｅｎｅｐｌａｓｍｉｄ＃３５６１６；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：３５６１６；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿３５６１６）；ｐＣＭＶＲ８．７４は、ＤｉｄｉｅｒＴｒｏｎｏから寄贈された（Ａｄｄｇｅｎｅｐｌａｓｍｉｄ＃２２０３６；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：２２０３６；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿２２０３６））によってレンチウイルスにパッケージ化し、前記レンチウイルスを使用して２９３Ｔ細胞に感染させ、４８時間後に最終濃度１０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）（ＳｏｌａｒｂｉｏＢ９３００）を使用して耐性スクリーニングした。スクリーニング後に生存した細胞は、ＡＤＡＲ２－ｒ１６－２９３Ｔと呼ばれる。
配列番号１：
ＡＴＧＧＡＴＡＴＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＡＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＣＧＴＧＴＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＴＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＧＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＣＴＧＧＴＴＴＧＣＡＧＴＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＣＧＣＧＣＣＴＴＴＧＴＴＴＧＴＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＣＡＧＧＴＴＴＴＴＧＡＧＧＧＣＴＣＴＧＧＴＣＣＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＣＡＡＡＡＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＧＧＴＣＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＴＴＴＣＣＴＡＡＴＧＣＣＴＣＴＧＡＧＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＣＡＡＣＡＣＧＧＡＣＴＴＣＡＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＣＡＣＧＣＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＡＧＣＣＴＣＣＣＴＴＴＴＡＣＧＴＧＧＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＧＧＧＧＡＣＣＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＣＧＧＴＧＣＣＴＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＴＡＣＣＡＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧＴＧＧＧＡＡＧＡＡＴＣＣＣＧＴＧＡＴＧＡＴＣＴＴＧＡＡＣＧＡＡＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＣＡＡＧＴＡＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＴＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＡＴＧＧＴＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＧＣＴＣＧＧＧＧＡＧＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＧＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＣＣＡＴＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＴＣＧＣＣＡＧＣＣＴＡＴＴＣＣＣＡＧＴＧＡＧＧＧＴＣＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＴＡＣＣＧＣＡＧＧＴＴＴＴＡＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＧＧＴＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＣＡＣＧＣＴＣＧＣＡＧＡＡＴＡＧＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＴＣＧＴＣＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＴＴＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＧＧＴＧＡＴＡＴＧＴＧＴＴＴＣＴＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＧＴＡＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＡＴＡＣＣＴＡＡＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＣＣＴＴＧＣＡＴＴＡＡＡＴＧＡＣＴＧＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＡＴＡＧＴＡＴＣＴＣＧＧＡＧＡＴＣＣＴＴＧＣＴＣＡＧＡＴＴＴＣＴＴＴＡＴＡＣＡＣＡＡＣＴＴＧＡＧＣＴＴＴＡＣＴＴＡＡＡＴＡＡＣＧＡＧＧＡＴＧＡＴＣＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡＧＡＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＧＧＧＧＴＴＴＡＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴＣＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＣＣＡＣＡＴＧＡＧＧＣＡＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＡＴＡＧＡＣＡＣＣＣＡＡＡＴＣＧＴＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＧＧＡＣＣＡＡＡＡＴＡＧＡＧＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧＧＧＡＣＧＡＴＴＣＣＡＧＴＧＣＧＣＡＡＣＡＡＴＧＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＡＡＣＧＴＧＧＧＡＣＧＧＧＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＴＧＡＣＡＡＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＴＧＧＡＡＣＧＴＧＧＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＧＣＴＣＡＧＣＡＴＴＴＴＣＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＴＴＴＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＣＧＧＧＧＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣＣＡＴＧＴＡＣＣＡＧＣＧＧＡＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＣＡＡＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＧＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＴＡＴＴＣＡＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＧＧＴＡＧＧＣＧＡＣＴＣＣＧＣＴＡＴＴＧＡＧＧＴＣＡＴＣＡＡＣＧＣＣＡＣＧＡＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＧＣＧＴＣＣＣＧＣＣＴＧＴＧＴＡＡＧＣＡＣＧＣＧＴＴＧＴＡＣＴＧＴＣＧＣＴＧＧＡＴＧＣＧＴＧＴＧＣＡＣＧＧＣＡＡＧＧＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＧＣＴＣＣＡＡＧＡＴＴＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＣＧＴＧＴＡＣＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＡＡＡＧＧＡＧＴＡＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＧＣＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣＧＣＣＣＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＴＡＧ

２、ＢＦＰレポーターシステムの構築
ＢＦＰレポーターシステムは参考文献７を参照して構築され、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）ｃＤＮＡ配列がすべてインビトロで合成された。具体的な配列は配列番号２である。ＢＦＰｃＤＮＡ配列は、ＣＭＶプロモーターの後ろのマルチクローニング部位を介してｐＣＤＨ－ＣＭＶプラスミドベクターにクローニングした（ｐＣＤＨ－ＣＭＶプラスミドバックボーンはＫａｚｕｈｉｒｏＯｋａから寄贈された、Ａｄｄｇｅｎｅｐｌａｓｍｉｄ＃７２２６５；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：７２２６５；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿７２２６５）。レポーターシステムで編集される標的塩基は、６６番目のヒスチジンに対応するＢＦＰ配列の１９９番目の位置にある塩基Ｃである。図１を参照されたい。

この配列の１９８番目、１９９番目、及び２００番目の塩基は順にＣＣＡであり、ＢＦＰ－ＣＣＡと呼ばれ、Ｃ＊と略される。１９９番目の塩基ＣをＲＮＡレベルでの脱アミノ化によりＵに編集すると、ＢＦＰ蛍光タンパク質は元の青色蛍光から緑色蛍光に変化し、フローサイトメトリーＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，フルオロセインイソチオシアネート）チャネルでシグナルを検出できる。１９８番目のヌクレオチドがＣからＡ、Ｔ、及びＧに変異されると、対応するコドン（１９６、１９７、及び１９８番目の塩基）ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＴ、及びＡＣＧはすべてスレオニンをコードしているため、この変異は同義変異である。これにより、該レポーターシステムは、ｍＲＮＡ上の標的塩基の５’上流の隣接塩基が異なる場合に、ＣからＵへの編集効率を同時に測定及び比較できる。これに基づいて、部位特異的突然変異誘発キット（Ｑ５（登録商標）Ｓｉｔｅ－ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ、ＮＥＢＥ０５５４Ｓ）を使用して、１９８番目の塩基に突然変異を導入した。これにより、１９８番目、１９９番目、及び２００番目３つの位置の塩基は、それぞれ、ＧＣＡがＢＦＰ－ＧＣＡと名付けられ、Ｇ＊と略記され、ＡＣＡがＢＦＰ－ＡＣＡと名付けられ、Ａ＊と略記され、ＴＣＡがＢＦＰ－ＵＣＡと名付けられ、Ｕ＊と略記される。

実施例２：ＣＵＳＰＥＲシステムの初歩的テスト
ＬａｒＲＮＡの設計及び合成
本実施例で使用されるａｒＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡを含み、標的塩基はａｒＲＮＡの中央に位置し、５’上流と３’下流は両側に同じ長さで伸びている。合成長の制限により、本実施例では、９１ｎｔの長さのＲＮＡを選択してインビトロ合成した。図３に示すように、前記ａｒＲＮＡの４６番目の塩基がそれぞれＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃである場合、それぞれＡ＾、Ｕ＾、Ｇ＾、Ｃ＾と略記する。４つの合成されたａｒＲＮＡの具体的な配列を以下の表１に示す。図２に示すように、ＬＥＡＰＥＲ技術の設計法とは異なり、この実験バッチでは４つのａｒＲＮＡの設計を行った。実験の目的は、標的塩基がａｒＲＮＡ上のターゲティング塩基とミスマッチする場合の編集効率を決定することであるため、異なるターゲティング塩基をテストに使用した。つまり、４６番目がそれぞれＡ、Ｕ、Ｇ、及びＣであるａｒＲＮＡをテストした。ａｒＲＮＡの４７番目の５’最近傍塩基（レポーターシステムの１９８位に対応する）では、変異導入前のＢＦＰ配列の標的トリプレット塩基（すなわちＣＣＡ）に従って設計した。つまり、前記ａｒＲＮＡターゲティング塩基の５’最近傍塩基（４７番目）は、Ａに相補的なＵである。これは、後続のテストのレポーターシステムがＢＦＰ－ＣＣＡである場合にのみ、ａｒＲＮＡの設計がＬＥＡＰＥＲ技術と一致することを意味する。つまり、ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡとハイブリダイズする場合、標的塩基のみにミスマッチがあるが、レポーターシステムがＢＦＰ－ＧＣＡ、ＢＦＰ－ＴＣＡ、ＢＦＰ－ＡＣＡの場合、ａｒＲＮＡの設計は標的塩基にミスマッチがあるだけではなく、ａｒＲＮＡの標的塩基の３’隣接塩基にもミスマッチがある。

２、ＣからＵへの編集テスト
ＡＤＡＲ２－ｒ１６－２９３Ｔを６ウェルプレートに３００，０００細胞／ウェルの密度で播種し、播種の２４時間後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬ３００００１５）でトランスフェクトし、取扱説明書に従ってトランスフェクション手順を実行した。取扱説明書に従って、異なる濃度のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬を使用して、２回の繰り返し実験を行い、繰り返し１では、１ウェルあたり３．７５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用し、繰り返し２では、１ウェルあたり７．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用した。１ウェルあたり２．５μｇのＢＦＰレポータープラスミド（ＢＦＰ－ＧＣＡ、Ｇ＊と略記；ＢＦＰ－ＡＣＡ、Ａ＊と略記；ＢＦＰ－ＴＣＡ、Ｔ＊と略記；ＢＦＰ－ＣＣＡ、Ｃ＊と略記から選択された）及び２５ｐｍｏｌの化学合成されたａｒＲＮＡを添加した。ＦＩＴＣチャネルシグナル強度を、トランスフェクションの４８時間後にＦＡＣＳによって検出した。陽性細胞の平均蛍光強度（ＭｅａｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＩｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＭＦＩ）の統計結果を図３に示す。

図３では、ｍＲＮＡの行は対応するウェルに添加されたＢＦＰレポーターシステムプラスミドを表し、ａｒＲＮＡの行は対応するウェルに添加されたａｒＲＮＡを表す。ＢＦＰレポーターシステムでは、１９８、１９９、２００番目の３塩基が元の配列ではＣＣＡであり、１９８番目のＣがＡ、Ｔ、またはＧに変更されると、６５番目の対応するアミノ酸はすべてスレオニンになるため、ＢＦＰ－ＧＣＡ、ＢＦＰ－ＣＣＡ、ＢＦＰ－ＡＣＡ、及びＢＦＰ－ＴＣＡの４つの異なるレポーターシステムの１９８位の変更は、元のタンパク質機能の変更を引き起こさない。１９９番目のＣがＵに編集されると、１９９、２００、及び２０１位で形成されるコドンがＣＡＣからＵＡＣに変更され、対応する６６番目のアミノ酸がヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、Ｈｉｓ、Ｈ）からチロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ、Ｔｙｒ、Ｙ）に変更され、これによってＢＦＰからＧＦＰへの蛍光転換を実現する。図３に示すように、ａｒＲＮＡを添加しない場合、レポーターシステムのバックグラウンドＧＦＰシグナルＭＦＩは約５×１０^４であった（ｍＲＮＡの行はＵ＊、ａｒＲＮＡの行は／のレポーターシステムと注釈され、ｍＲＮＡの行はＡ＊、ａｒＲＮＡは／のレポーターシステムと注釈された）。しかし、１９９番目のＣをＤＮＡレベルでの点変異によりＴに変異させた場合、ＧＦＰシグナルＭＦＩは約２．４×１０^６～３．１×１０^６であり、バックグラウンド値の約１００倍であった。したがって、１９９番目のＣがすべてＲＮＡレベルでＵに変更される場合、ＧＦＰＭＦＩは約１００倍に増加することになる。

ＤＮＡレベルの１９９番目のＣは変化しないことから、図３に示すように、ａｒＲＮＡを添加するとＧＦＰのＭＦＩは最大で５×１０^５以上に増加し、蛍光強度は、ＤＮＡレベルでの１９９番目のＣからＴへの変異後の蛍光強度の２０％を超えた。これは、本願の技術が、ＤＮＡ配列を変えることなく転写レベルで１９９番目のＣをＵに変換することにより、最終的なタンパク質機能を変えることができることを示している。

ＬＥＡＰＥＲの技術文献（Ｑｕｅｔａｌ．，２０１９，元図２ｆ、本願の図４に対応）では、標的塩基の３’隣接塩基（Ｎ^２の位置に示されている）がＡの場合、ＬＥＡＰＥＲ技術は標的塩基の５’隣接塩基（Ｎ１の位置に示されている）に対する優先度（５’上流の塩基がＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣである場合に、同じａｒＲＮＡによって得られる編集効率を指す）はＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇである。ＲＥＳＣＵＥの技術文献（Ａｂｕｄａｙｙｅｈｅｔａｌ．，２０１９，元図１ｃ、本願の図５に対応）では、標的塩基の３’隣接塩基がＡの場合、ＲＥＳＣＵＥ技術は標的塩基の５’隣接塩基に対する優先度は、Ｕ≒Ａ＞＞Ｃ≒Ｇである。本願のＣＵＳＰＥＲ技術では、標的塩基の３’隣接塩基がＡの場合、標的塩基の５’上流の塩基の優先度は、ＬＥＡＰＥＲ技術及びＲＥＳＣＵＥ技術の両方とも違うことを予想外に発見した。図３に示すように、固定されたａｒＲＮＡが編集効率の高いＵ＾またはＣ＾である場合、本願の技術は５’上流の塩基の優先度がＧ＞Ｃ＞＞Ｕ≒Ａであることが分かる。

３、ＣＵＳＰＥＲ塩基優先度のさらなる確認
ＣＵＳＰＥＲの編集能力及びその塩基優先度をさらに確認するために、図６に示すように、実施例２の第２の部分をさらに繰り返した。実施例２の第２の部分と比較して、この部分は、実施例２の第２の部分が係わっていない２つのレポーターシステムプラスミド、すなわちＢＦＰ－ＧＣＡ及びＢＦＰ－ＣＣＡのみを有し、何らかのａｒＲＮＡを添加しない対照実験を追加した。さらに、図３の関連試験でＭＦＩがバックグラウンド値を２倍以上超える条件も繰り返した。また、実験の繰り返し１と繰り返し２は、２つの異なるバッチで作成されたＡＤＡＲ２－ｒ１６－２９３Ｔに対応する。

図６に示すように、繰り返し実験における標的塩基の５’隣接塩基に対するシステムの優先度は、図３に示す実施例２の第２の部分の相関試験と同様のパターンを示し、いずれも５’隣接塩基がＧまたはＣである場合には編集効率が高く、ＧはＣよりも大きかった。

上記の結果は、本願の技術が、ＤＮＡ配列を変更せずに、転写レベルから最終的なタンパク質機能に影響を与えることができることを示している。同時に、標的塩基の５’隣接塩基に対するこの技術の優先度は、ＬＥＲＰＥＲ及びＲＥＳＣＵＥ技術の優先度とは異なり得る。詳細については、表２を参照されたい。なお、この研究におけるＢＦＰ－ＧＣＡ、ＢＦＰ－ＴＣＡ、及びＢＦＰ－ＡＣＡのテストでは、ａｒＲＮＡの設計は標的塩基に１つのミスマッチがあるだけでなく、ａｒＲＮＡの３’下流にも別のミスマッチがある（図２に示す）。したがって、これらの位置にミスマッチがない場合、５’の上流の塩基に対するこの技術の優先度に同様のパターンがあるかどうかをさらにテストする必要がある。

実施例３：３’及び５’隣接塩基にミスマッチがない場合のＣＵＳＰＥＲ編集システムのテスト
ＧＦＰシグナルを読み取ることで、さまざまなａｒＲＮＡの編集効率を迅速かつ大まかに判断できるが、編集効率をさらに確認する必要がある場合は、次世代シーケンシング（ＮｅｘｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）を使用して、ｍＲＮＡにおけるＣからＵへの編集の割合を最終的に確認する必要がある。また、ＲＮＡ単一塩基編集システムは、ＡからＩ（Ｑｕｅｔａｌ．，２０１９）またはＣからＵ（Ａｂｕｄａｙｙｅｈｅｔａｌ．，２０１９）のいずれであっても、その標的塩基ＡまたはＣの５’隣接塩基及び３’隣接塩基は、その編集効率に大きな影響を与える。ＢＦＰからＧＦＰレポーターシステムの制限により、ＢＦＰのＤＮＡ配列（配列番号２）の１９９番目のＣを標的塩基として使用すると、５’隣接塩基（１９８位）のＣがＡ、Ｔ、Ｇに変更される場合、対応する６５番目のアミノ酸には影響しないが、３’隣接塩基（２００位）ＡがＴ、Ｃ、またはＧに変更されると、ＧＦＰシグナルが完全に失われる。したがって、レポーターシステムによってＧＦＰを読み取る試験では、３’隣接塩基がＴ、Ｃ、Ｇであるシステムをテストすることはできない。しかし、次世代シーケンシングを使用すると、編集後のｍＲＮＡのＡ、Ｕ、Ｃ、及びＧにおけるＵの割合を直接読み取ることができるため、４つの異なる５’隣接塩基と４つの異なる３’隣接塩基、合計１６種の状況下の編集効率を比較することが便利になる。

実施例１．２のステップを参照して、ＢＦＰのＤＮＡ配列（配列番号２）における１９８番目、１９９番目及び２００番目のＤＮＡ配列の相違に従って、１６の異なるレポーターシステム、すなわちＡＣＡ、ＡＣＴ（対応するｍＲＮＡ：ＡＣＵ）、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＴＣＡ（対応するｍＲＮＡ：ＵＣＡ）、ＴＣＴ（対応するｍＲＮＡ：ＵＣＵ）、ＴＣＣ（対応するｍＲＮＡ：ＵＣＣ）、ＴＣＧ（対応するｍＲＮＡ：ＵＣＧ）、ＣＣＡ、ＣＣＴ（対応するｍＲＮＡ：ＣＣＵ）、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＧＣＡ、ＧＣＴ（ｍＲＮＡに対応：ＧＣＵ）、ＧＣＣ、ＧＣＧを構築した。また、実施例１．１のレンチウイルスパッケージング及び感染ステップを参照して、２９３Ｔを感染し、それらを２９３Ｔ細胞に安定して組み込んだ。

上記の１６の異なるレポーターシステムに対応して、ｍＲＮＡ標的塩基Ｃに対応するａｒＲＮＡターゲティング塩基がＵであることに基づいて、ａｒＲＮＡターゲティング塩基の３’及び５’最近傍塩基を、標的ＲＮＡの標的塩基の５’及び３’隣接塩基とワトソン・クリック塩基対形成原理に従って相補的に対形成させた。合成されたａｒＲＮＡ配列を表３に示す。ここで、ｍＲＮＡ内の標的及びその５’及び３’隣接塩基と、ａｒＲＮＡターゲティング塩基及びとその５’、３’最近傍塩基との対応関係を図７に示す。

次の手順に従って、対応するａｒＲＮＡを１６の異なるレポーターシステム細胞にトランスフェクトし、ＲＮＡ抽出及び次世代シーケンシングを実行した。

１、細胞培養には、１０％ＦＢＳ（ＶｉｓｔｅｃｈＳＥ１００－０１１）を含むＤＭＥＭ（ＨｙｃｌｏｎｅＳＨ３０２４３．０１）を使用した。レポーターシステム細胞を１５，０００細胞／ウェルで１２ウェルプレートに移した。この時間を０時間として記録した。

２、細胞継代の２４時間後、１２．５ｐｍｏｌのａｒＲＮＡをＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１３７７８１５０）試薬で各ウェルにトランスフェクトした。トランスフェクション手順は、供給業者の取扱説明書を参照されたい。

３、細胞を継代してから７２時間後に、ウェル全体の細胞をトリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ２５３０００５４）で消化し、８００μＬＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１５５９６０１８）でサンプルを収集し、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌＲＮＡＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＺｙｍｏＲｅｓａｅｒｃｈ，Ｒ２０５２）を使用してＲＮＡを抽出し、各サンプルから１０００ｎｇの抽出した全ＲＮＡを取り、ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｏｎｅ－ＳｔｅｐｇＤＮＡＲｅｍｏｖａｌａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｕｐｅｒＭｉｘＫｉｔ（ＴｒａｎｓＧｅｎＢｉｏｔｅｃｈ，ＡＴ３１１）で逆転写してｃＤＮＡを合成した。１μＬの逆転写生成物を取り、配列ｇｇａｇｔｇａｇｔａｃｇｇｔｇｔｇｃＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴ（配列番号７）及びｇａｇｔｔｇｇａｔｇｃｔｇｇａｔｇｇＧＴＡＧＴＴＧＣＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号８）の２つのプライマー及びＱ５ホットスタート酵素（ＮＥＢ、Ｍ０４９４Ｌ）を使用してＰＣＲを実行した。ＰＣＲ産物はＨｉ－ＴＯＭキット（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ、ＲＥＦＰＴ０４５）でライブラリーを構築し、次の手順に従って次世代シーケンシング及びデータ分析を完成した。

ｉ、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング
構築したシーケンシングライブラリは、ＮｏｖａＳｅｑ６０００プラットフォームを介してＰＥ１５０モードでハイスループットシーケンシングした。
ｉｉ、シーケンシングデータの処理
ハイスループットシーケンシングで得られた生データをｆａｓｔｐ（ｖ０．１９．６）で品質管理し、低品質、リンカー配列やｐｏｌｙＧなどを含む配列を除外した。得られた高品質のシーケンシングデータは、対応するバーコードシーケンスに従って自己開発の分割スクリプトで各サンプルに分割し、ＢＷＡ（ｖ０．７．１７－ｒ１１８８）ソフトウェアを使用して増幅された目標領域の配列とアライメントし、ＢＡＭファイルの生成、アライメント情報の統計、並べ替え、及びインデックスの作成のためにＳＡＭｔｏｏｌｓ（ｖ１．９）によってフォーマット変換した。
ｉｉｉ、編集効率の分析
ＪＡＣＵＳＡ（ｖ１．３．０）ソフトウェアを使用して、すべてのｍＲＮＡ標的塩基を検出した。使用されるパラメーターは、ｃａｌｌ－１－ａＢ，Ｒ，Ｄ，Ｉ，Ｙ，Ｍ：４－ＣＡＣＧＴ－ｃ２－ｐ１－ＰＵＮＳＴＲＡＮＤＥＤ－Ｒ－ｕＤｉｒＭｕｌｔ－ＣＥである。対照と処理サンプルの両方に出現する高頻度変異を除外した後、Ｃ－＞Ｕ変異以外の平均変異頻度の３倍をしきい値として使用し、標的塩基ＣからＵへの変異頻度がしきい値を超えている部分を、標的ＣからＵへの実際の変異頻度とした。

次世代シーケンシングの結果を図８に示す。ＣＵＳＰＥＲシステムが実際にｍＲＮＡのＣからＵへの単一塩基編集を達成できることは、次世代シーケンシングによって確認できる。実施例２と比較すると、ターゲティング塩基の５’及び３’最近傍塩基と標的ＲＮＡとの間にいずれもミスマッチがない場合、編集効率が比較的低いが、ターゲティング塩基の５’最近傍塩基と標的ＲＮＡとがＧ－Ｇミスマッチを形成する場合、編集効率を向上させることができる。さらに、標的塩基のＣ－Ｕミスマッチを除いて、ターゲティング塩基の５’及び３’最近傍塩基がすべて、ワトソン－クリックの原理に従って標的塩基の３’及び５’隣接塩基と対形成すると、ｍＲＮＡ上の標的塩基トリプレットがＡＣＧ、ＡＣＣ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＵＣＡ、ＵＣＵの配列である場合に、より高い編集効率が得られる。

Claims

ＲＮＡ編集のための操作された組成物またはシステムであって、
１）修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、または前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する構築物と、
２）前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを標的ＲＮＡに動員するａｒＲＮＡ、または前記ａｒＲＮＡもしくはそのコード配列を含む構築物と
を含み、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインがシチジンの脱アミノ化を触媒する活性を有し、
前記ａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを標的ＲＮＡに動員して、前記標的ＲＮＡ中の標的シチジンを脱アミノ化する、
前記操作された組成物またはシステム。
前記アデノシンデアミナーゼは、シチジンを脱アミノ化してウリジンに変換する活性を有するように、１つまたは複数の部位で変異修飾されている、請求項１に記載の操作された組成物またはシステム。
前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、ＡＤＡＲ２タンパク質またはその相同タンパク質またはその触媒ドメインである、請求項２に記載の操作された組成物またはシステム。
前記変異修飾は、Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔを含み、前記変異修飾のアミノ酸番号は、ＮＰ＿００１１０３．１のアミノ酸番号と同じである、請求項３に記載の操作された組成物またはシステム。
前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、標的シチジンに対向するターゲティング塩基はＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧである、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。
前記ターゲティング塩基はＵまたはＣである、請求項５に記載の操作された組成物またはシステム。
前記ａｒＲＮＡは、標的塩基の上流、下流、または上流及び下流の１つもしくは複数の位置でヌクレオチドミスマッチを形成するために、標的ＲＮＡに対応する標的塩基の上流、下流、または上流及び下流の１つもしくは複数の位置に不対ヌクレオチドを含む、
請求項１～６のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。
前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の３’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとミスマッチを形成する、請求項７に記載の操作された組成物またはシステム。
前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ターゲティング塩基の３’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとＧ－Ｇミスマッチを形成する、請求項８に記載の操作された組成物またはシステム。
前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ターゲティング塩基の５’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとミスマッチを形成しない、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。
前記ターゲティング塩基の５'最近傍塩基はＵである、請求項１０に記載の操作された組成物またはシステム。
前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の５’最近傍塩基に対向する標的ＲＮＡの塩基の好ましい順序は、高い方から低い方へ、ＧまたはＣ、ＵまたはＡである、請求項９に記載の操作された組成物またはシステム。
前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記標的塩基とその５’及び３’隣接塩基によって形成される標的塩基トリプレットは、標的塩基でのみミスマッチを形成し、前記標的塩基トリプレットは、ＡＣＧ、ＡＣＣ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＵＣＡ、ＵＣＵから選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。
前記ａｒＲＮＡの長さが５０ｎｔを超える、請求項１～１３のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。
前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端及び５’末端からの長さが同じである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。
前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端からの長さが４５～５ｎｔ、４０～５ｎｔ、３５～１０ｎｔ、２５ｎｔ～１５ｎｔ、２４ｎｔ～１１ｎｔである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。
前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、５’末端からの長さが８０～３０ｎｔ、７０～３５ｎｔ、６０～４０ｎｔ、５５ｎｔ～３５ｎｔ、５５ｎｔ～４５ｎｔである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。
前記ａｒＲＮＡが化学修飾されている、請求項１～１７のいずれか一項に記載の操作された組成物またはシステム。
前記化学修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾またはヌクレオチド間３’チオ修飾を含む、請求項１８に記載の操作された組成物またはシステム。
細胞内の標的ＲＮＡ中の標的シトシンを脱アミノ化する方法であって、
１）修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、または前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する構築物と、
２）前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを前記標的ＲＮＡに動員するａｒＲＮＡ、または前記ａｒＲＮＡもしくはそのコード配列を含む構築物と
を前記細胞に導入することを含み、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインが修飾されたことによりシチジンの脱アミノ化を触媒する活性を有し、前記ａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを標的ＲＮＡに動員して、前記標的ＲＮＡ中の標的シチジンを脱アミノ化する、
前記方法。
前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する前記構築物と、前記ａｒＲＮＡのコード配列を含む前記構築物とは同一の構築物であり、あるいは、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインを発現する前記構築物と、前記ａｒＲＮＡのコード配列を含む前記構築物とは別々の構築物であり、前記別々の構築物は、同時にまたは別々に前記細胞に導入される、請求項２０に記載の方法。
前記アデノシンデアミナーゼは、シチジンを脱アミノ化してウリジンに変換する活性を有するように、１つまたは複数の部位で変異修飾されている、請求項２０または２１に記載の方法。
前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、ＡＤＡＲ２タンパク質またはその相同タンパク質またはその触媒ドメインである、請求項２２に記載の方法。
前記変異修飾は、Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔを含み、前記変異修飾のアミノ酸番号は、ＮＰ＿００１１０３．１のアミノ酸番号と同じである、請求項２３に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、標的シチジンに対向するターゲティング塩基はＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧである、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
前記ターゲティング塩基はＵまたはＣである、請求項２５に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡは、標的塩基の上流、下流、または上流及び下流の１つもしくは複数の位置でヌクレオチドミスマッチを形成するために、標的ＲＮＡに対応する標的塩基の上流、下流、または上流及び下流の１つもしくは複数の位置に不対ヌクレオチドを含む、
請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の３’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとミスマッチを形成する、請求項２７に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ターゲティング塩基の３’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとＧ－Ｇミスマッチを形成する、請求項２８に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ターゲティング塩基の５’最近傍塩基は、標的ＲＮＡとミスマッチを形成しない、請求項２１～２９のいずれか一項に記載の方法。
前記ターゲティング塩基の５'最近傍塩基はＵである、請求項３０に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基の５’最近傍塩基に対向する標的ＲＮＡの塩基の好ましい順序は、高い方から低い方へ、ＧまたはＣ、ＵまたはＡである、請求項２９に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合、前記標的塩基とその５’及び３’隣接塩基によって形成される標的塩基トリプレットは、標的塩基でのみミスマッチを形成し、前記標的塩基トリプレットは、ＡＣＧ、ＡＣＣ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＵＣＡ、ＵＣＵから選択される、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡの長さが５０ｎｔを超える、請求項２１～３３のいずれか一項に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端及び５’末端からの長さが同じである、請求項２１～３４のいずれか一項に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、３’末端からの長さが４５～５ｎｔ、４０～５ｎｔ、３５～１０ｎｔ、２５ｎｔ～１５ｎｔ、２４ｎｔ～１１ｎｔである、請求項２１～３４のいずれか一項に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡのターゲティング塩基は、５’末端からの長さが８０～３０ｎｔ、７０～３５ｎｔ、６０～４０ｎｔ、５５ｎｔ～３５ｎｔ、５５ｎｔ～４５ｎｔである、請求項２１～３４のいずれか一項に記載の方法。
前記ａｒＲＮＡが化学修飾されている、請求項２１～３７のいずれか一項に記載の方法。
前記化学修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾またはヌクレオチド間３’チオ修飾を含む、請求項３８に記載の方法。
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２１～３９のいずれか一項に記載の方法。
請求項２１～３９のいずれか一項に記載の方法を用いて、ＴからＣへの変異転写を含んで形成されるメッセンジャーＲＮＡ中の標的塩基Ｃを脱アミノ化し、前記変異を修正することを含む、前記ＴからＣへの変異によって引き起こされる疾患を治療するための方法。
修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質であって、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質はＡＤＡＲ２であり、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１０３．１のＡＤＡＲ２に対応する以下のアミノ酸変異：Ｅ４８８Ｑ／Ｖ３５１Ｇ／Ｓ４８６Ａ／Ｔ３７５Ｓ／Ｓ３７０Ｃ／Ｐ４６２Ａ／Ｎ５９７Ｉ／Ｌ３３２Ｉ／Ｉ３９８Ｖ／Ｋ３５０Ｉ／Ｍ３８３Ｌ／Ｄ６１９Ｇ／Ｓ５８２Ｔ／Ｖ４４０Ｉ／Ｓ４９５Ｎ／Ｋ４１８Ｅ／Ｓ６６１Ｔ、または前記ＮＰ＿００１１０３．１の相同なＡＤＡＲ２タンパク質の対応する位置のアミノ酸変異を含み、前記ＡＤＡＲ２タンパク質は前記変異修飾によりシチジンの脱アミノ化を触媒する活性を有する、前記修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質。
シチジンを脱アミノ化してウリジンへの変換を触媒するための、請求項４２に記載の修飾されたアデノシンデアミナーゼタンパク質の使用。