CN117645998A - 一种arRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于基因编辑领域，具体涉及一种arRNA及其应用。本申请提供一种arRNA，该arRNA包括与靶RNA序列相同的区域以及与靶RNA序列互补的区域，与靶RNA序列相同的区域位于与靶RNA序列互补的区域之间，通过特定的设计能够与将arRNA与靶标RNA序列形成Loop环结构，将ADAR固定在编辑窗口范围内，由此来提高ADAR介导的RNA编辑的编辑效率。同时，本申请还有利于加强工程化ADAR介导的环状RNA用于治疗和探索性转化研究的前景。

Description

一种arRNA及其应用

技术领域

本申请属于基因编辑领域，具体涉及一种arRNA及其应用。

背景技术

RNA编辑，即在RNA水平的编辑。RNA编辑（RNA editing）是新发现的在mRNA水平上遗传信息改变的过程。研究证明，mRNA中个别碱基的取代和加减，造成mRNA的碱基序列与它的基因的碱基序列不一致，使其仍能参与翻译，所有这一系列的改变不是发生在基因水平上，也不是发生在拼接水平上，而是发生在成熟的mRNA水平上。

相比于DNA编辑，RNA编辑最大优势在于RNA具备很短的生命周期。因此，RNA修饰具备可回复性，更为安全。尤其是面临转录本可变剪接发生异常而造成的相关疾病时，DNA编辑无法奏效，只能通过RNA编辑进行治疗。因此，在许多领域内RNA编辑是DNA编辑的补充手段，在特定领域RNA编辑则具有不可比拟的巨大优势。

人源细胞内存在一类蛋白ADAR（Adenosine Deaminases Acting on RNA），能够对腺苷酸（Adenosine）进行脱氨反应，变成次黄嘌呤核苷酸（Inosine），即腺苷酸到次黄嘌呤核苷酸（A-to-I）。在翻译过程中，I被视为G（Guanosine），因此ADAR具备A-G的编辑能力。由于I会被识别为G，因此A-to-I RNA编辑在不改变基因组序列的情况下，时空特异性地增加了转录组和蛋白组的多样性。由此引申发展的RNA编辑技术作为治疗遗传性疾病的基因疗法具有巨大的前景。目前，ADAR作为一种细胞内源的RNA脱氨酶已经被广泛应用于RNA碱基编辑。

基于ADAR的RNA编辑利用了细胞翻译机制的一个独特性质，即由于结构相似性，肌苷会被识别为鸟嘌呤。这使得ADAR编辑器能够引入特定位点的、由RNA引导的腺嘌呤到肌苷（A-to-I）的改变，从而打开了广泛的治疗潜力，包括修正致病突变、调节基因表达或改变蛋白质相互作用等。RNA碱基编辑作为一项全新的疾病治疗策略，越来越受到广泛关注。

但传统技术中基于ADAR的RNA编辑存在编辑效率低的问题。

发明内容

基于此，本申请一实施例提供一种arRNA及其应用，采用该arRNA具有较高的编辑效率。

本申请一方面提供一种arRNA，所述arRNA包括与靶RNA序列相同的区域以及与靶RNA序列互补的区域，所述与靶RNA序列相同区域包括一个或多个；每一个所述与靶RNA序列相同的区域的上游和下游均设有所述与靶RNA序列互补的区域。

且所述与靶RNA相同的区域的长度为4bp~6bp，两段相邻的所述与靶RNA序列相同的区域之间的间隔长度为24bp~26bp。

在其中一个实施例中，所述arRNA的长度为120bp~200bp。

在其中一个实施例中，所述arRNA的长度为120bp、150bp或200bp。

在其中一个实施例中，所述靶RNA为mRNA前体。

本申请还提供所述的arRNA在制备基于RNA编辑的药物中的应用。

本申请另一方面提供包含所述的arRNA的构建体或递送体。

本申请还提供一种宿主细胞，其包含所述的arRNA、或所述的构建体或递送体。

本申请另一方面提供一种治疗遗传性疾病的药物，其有效成分包括所述的arRNA。

在其中一个实施例中，所述arRNA包括通过腺病毒或慢病毒构建的递送体。

本申请还提供所述的治疗遗传性疾病的药物在治疗遗传性疾病中的应用。

本申请提供一种arRNA，该arRNA包括与靶RNA序列相同的区域以及与靶RNA序列互补的区域，与靶RNA序列相同的区域位于与靶RNA序列互补的区域之间，通过特定的设计能够与将arRNA与靶标RNA序列形成Loop环结构，将ADAR固定在编辑窗口范围内，由此来提高ADAR介导的RNA编辑的编辑效率。同时，本申请还有利于加强工程化ADAR介导的环状RNA用于治疗和探索性转化研究的前景。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为arRNA与靶RNA序列形成Loop环结构的示意图；

图2为荧光比较阳性细胞的比例；

图3为流式分析阳性细胞的数量；

其中，EGFP Cells为：EGFP阳性细胞；mock为模拟。

具体实施方式

下面结合实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

术语

在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非与本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。

本申请中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1~10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

术语“流式分析”流式细胞术（是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。流式细胞术广泛用于分析细胞表面和细胞内分子的表达、鉴定并确定异质细胞群中的不同细胞类型、评估分离亚群的纯度以及分析细胞大小和容积。这种技术可同时分析单个细胞的多个参数，主要用于测定荧光标记的抗体检测蛋白产生的荧光强度，或结合了特定细胞分子的配体，如碘化丙啶与DNA的结合。其染色过程包括从细胞培养物或组织样品制备单细胞悬液。然后将获得的细胞培养在包含未标记或荧光标记抗体的试管或多孔板中，再用流式细胞仪分析。

术语“Lip2000”Lipofectamine 2000试剂以其出色的转染性能为蛋白表达、基因沉默和功能测定递送DNA或siRNA。Lipofectamine 2000转染试剂可有效处理所有常见细胞系和多种难以转染的细胞系，可在含或不含血清的培养基中使用。

术语“RNA编辑”RNA编辑是一种RNA分子中特定核苷酸序列发生变化的过程。RNA编辑事件包括核苷酸插入、缺失、碱基替换等。目前，在真核生物、原核生物以及病毒中均发现了RNA编辑现象；从细胞结构的角度出发，RNA编辑可发生在细胞核、细胞浆、也可发生在线粒体和植物细胞的质体（叶绿体、色质体和白色体）中；从RNA类型出发，RNA编辑可发生在tRNA、rRNA、mRNA、miRNA上；RNA编辑的形式主要包括A-to-I、C-to-U、U-to-C、tRNAediting、snoRNA介导的rRNAs核苷酸修饰。

术语“载体”是指能够运输或转移外来核酸分子的核酸分子。该术语涵盖表达载体和转录载体两者。术语“表达载体”是指能够在靶细胞中表达插入物，且通常含有驱动插入物的表达的控制序列（诸如增强子、启动子和终止子序列）的载体。术语“转录载体”是指能够被转录、但不被翻译的载体。转录载体用于扩增其插入物。外来核酸分子被称为“插入物”或“转基因”。载体通常由插入物和用作载体的骨架的较大序列组成。基于载体的结构或来源，主要类型的载体包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体（诸如λ噬菌体）、病毒载体（诸如腺病毒载体）和人工染色体。

术语“宿主细胞”是指其中可繁殖载体并且表达其DNA或RNA的细胞。该细胞可以是原核或真核的，受体细胞也叫宿主细胞。受体细胞有原核受体细胞（最主要是大肠杆菌）、真核受体细胞（最主要是酵母菌）、动物细胞和昆虫细胞（其实也是真核受体细胞）。原核受体细胞中，最常用的宿主细胞是大肠杆菌。

术语“EGFP”Enhanced Green Fluorescent Protein 即增强绿色荧光蛋白EGFP是GFP突变系。应用较多的是 GFP的突变体：增强型绿色荧光蛋白（EGFP）（64位苯丙异亮），发射出的荧光强度比GFP大6倍以上，因此，比GFP更适合作为 一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。

术语“启动子”启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身不被转录。但有一些启动子（如tRNA启动子）位于转录起始点的下游,这些DNA序列可以被转录。启动子的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子一般位于转录起始位点的上游。

术语“密码子”密码子（codon）是指信使RNA分子中每相邻的三个核苷酸编成一组，在蛋白质合成时，代表某一种氨基酸的规律。

其中，密码子（codon）：mRNA（或DNA）上的三联体核苷酸残基序列，该序列编码着一个特定的氨基酸，tRNA的反密码子与mRNA的密码子互补。起始密码子（iniation codon）：指定蛋白质合成起始位点的密码子。最常见的起始密码子是甲硫氨酸或缬氨酸密码。终止密码子（termination codon）：任何tRNA分子都不能正常识别的，但可被特殊的蛋白质结合并引起新合成的肽链从翻译机器上释放的密码子。存在三个终止密码子：UAG，UAA和UGA。

术语“Loop环”即R环（R-loop）是一种DNA：RNA杂合链（DNA：RNAhybrids），由一条RNA单链侵入双链DNA，与其中一条DNA模板链结合，从而释放出一条DNA单链而产生。R-loop在细胞生命活动中扮演着重要角色，与基因组稳定性、转录调控，以及表观修饰等重要生物学过程有着密不可分的关系。很多因素参与对R-loop的调控，例如RNA转录和加工、染色体的修饰、DNA损伤反应等；同时，许多酶蛋白，如核糖核酸酶、解旋酶和拓扑异构酶等也参与调节细胞内的R-loop水平。

本申请一方面提供一种arRNA，arRNA包括与靶RNA序列相同的区域以及与靶RNA序列互补的区域，与靶RNA序列相同区域包括一个或多个，每一个与靶RNA序列相同的区域上游和下游均设有与靶RNA序列互补的区域。

且与靶RNA相同的区域的长度为4bp~6bp，两段相邻的与靶RNA序列相同的区域之间的间隔长度为24bp~26bp。例如与靶RNA相同的区域的长度为4bp、5bp、6bp，两段相邻的与靶RNA序列相同的区域之间的间隔长度为24bp、25bp、26bp。

可选地，靶标RNA为mRNA前体。可以理解的是，生物体内的RNA种类繁多，功能各异，大致分为两类，一类是编码RNA，一类是非编码RNA。编码RNA主要包括mRNA，核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA）或者前体mRNA（pre-mRNA），这两者描述的都是成熟mRNA的前身。

在一个具体的示例中，arRNA序列的长度为120bp~200bp。例如120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp。

可选地，arRNA序列的长度为120bp、150bp或200bp。

本申请还提供所述的arRNA在制备基于RNA编辑药物中的应用。

本申请还提供包含所述的arRNA的构建体或递送体。

可选地，包括质粒。可以理解的是包括质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。作为质粒载体，适合于待使用的宿主的质粒，例如源自大肠杆菌（E .coli）的质粒、源自芽孢杆菌属（Bacillus）细菌的质粒或源自酵母的质粒为本领域技术人员熟知的，并且许多质粒载体可市售获得。

本申请还提供一种宿主细胞，其包含核酸分子或表达载体。可以用于将表达载体引入到宿主中的方法没有特别限制，只要其可将核酸引入到宿主中即可，并且其实例包括：包括使用钙离子的方法、电穿孔法、原生质球法和醋酸锂法。

本申请还提供一种治疗遗传性疾病的药物，其有效包含arRNA。

可选地，arRNA包括通过腺病毒或慢病毒构建的递送体。

本申请还提供上述治疗遗传性疾病的药物在治疗遗传性疾病中的应用。

本申请根据ADAR存在编辑窗口不稳定的原理，设计了与靶RNA相同序列的Loop环，从而固定了ADAR在编辑窗口范围内，由此来提高ADAR介导的RNA编辑的编辑效率。本申请将加强工程化ADAR招募RNA用于治疗和探索性转化研究的前景。

一、方法简介：

本申请利用失活的绿色荧光蛋白EGFP作为报告系统，即将EGFP编码框中的一个本应为G的核苷酸突变为A，使得由UGG编码的色氨酸变成终止密码子UAG。在该系统中EGFP由于提前引入了终止密码子，提前终止表达，从而不发光。而只有在将突变的A重新修复为G后，绿色荧光才会表达，并通过荧光显微镜观察及流式细胞分析仪对绿色荧光的细胞进行定量分析，来评判修复系统的编辑效率。

根据ADAR的作用窗口为30bp左右，且左边5bp，右边25bp。设计ADAR介导的RNA（arRNA）时，在编辑位点左边5bp后设计一个与靶RNA序列相同的5bp序列，由此形成左Loop环；右边25bp后设计一个与靶RNA序列相同的5bp序列，由此形成右Loop环。通过其他序列与靶序列互补配对，引导ADAR到正确位点，同时通过arRNA与靶RNA序列形成的Loop环固定ADAR的作用窗口，不让其左右滑动，从而提高RNA编辑的效率。通过对不同长度的arRNA进行测试，发现长度为150 bp的具备Loop结构的arRNA的效果最好。

二、基本原理：

人源细胞内存在着一类蛋白ADAR（Adenosine Deaminases Acting on RNA），能够对腺苷酸（Adenosine）进行脱氨反应，变成次黄嘌呤核苷酸（Inosine）。在翻译过程中，I被视为G（Guanosine），因此ADAR具备A-G的编辑能力。

3、dEGFPI相关信息，如SEQ ID NO.1所示：

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctAgccctcgctggtgtcgtcgctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtccggactcagatctcgataa（SEQ ID NO.1）

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

实施例1

1、设计arRNA与靶RNA序列形成Loop环结构。

如图1所示，根据dEGFPI的序列，设计arRNA，大写A和C为编辑位点，第一行为dEGFPI上的靶RNA序列，第二行为arRNA-Loop序列，分别设计了120bp，150bp和200bp的长度的arRNA。

2、构建arRNA Loop载体：将合成好的不同长度的arRNA-Loop序列连接至U6启动子启动的arRNA环化骨架中间。

3、细胞转染

提前一天在24孔板中铺入对数生长期的293细胞，每孔转染0.5μg的dEGFPI和0.25μg的不同长度的arRNA Loop载体，无Loop结构的arRNA载体为阳性对照组，单转dEGFPI质粒的为阴性对照组。转染试剂为Lip2000，4h~6h换液。

4、荧光观察

48h后用荧光显微镜进行观察，结果如图2所示。

5、流式细胞仪分析

荧光显微镜拍照后小心用PBS清洗细胞，去除残余的培养基等成分。随后用200μLPBS轻轻吹打细胞使之重悬，收集细胞重悬液至流式管中，上流式细胞分析仪比较各组之间绿色荧光细胞的数量，结果如图3所示。

6、结果分析

根据荧光显微镜和流式细胞分析仪的结果，发现具备Loop结构的arRNA编辑A到G的效率比无Loop结构的arRNA的效率高，且150bp的Loop结构的arRNA的效果最好。

经以上步骤，成功设计并合成不同长度新型的ADAR介导的环状arRNA，同时通过荧光显微镜和流式细胞分析仪的结果，发现具备Loop结构的arRNA编辑A到G的效率比无Loop结构的arRNA的效率高，且150bp的Loop结构的arRNA的效果最好。由此方法可针对其他基因设计相同结构的arRNA，由此来提高A-to-G修复的效率，加强工程化ADAR招募RNA用于治疗和探索性转化研究的前景。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书和附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种arRNA，其特征在于，所述arRNA包括与靶RNA序列相同的区域以及与靶RNA序列互补的区域；

所述与靶RNA序列相同区域包括一个或多个；每一个所述与靶RNA序列相同的区域的上游和下游均设有所述与靶RNA序列互补的区域；

且所述与靶RNA相同的区域的长度为4bp~6bp，两段相邻的所述与靶RNA序列相同的区域之间的间隔长度为24bp~26bp。

2.根据权利要求1所述的arRNA，其特征在于，所述arRNA的长度为120bp~200bp。

3.根据权利要求1所述的arRNA，其特征在于，所述arRNA的长度为120bp、150bp或200bp。

4.根据权利要求1所述的arRNA，其特征在于，所述靶RNA为mRNA前体。

5.权利要求1~4任一项所述的arRNA在制备基于RNA编辑的药物中的应用。

6.包含权利要求1~4任一项所述的arRNA的构建体或递送体。

7.一种宿主细胞，其包含1~4任一项所述的arRNA、或包含权利要求6所述的构建体或递送体。

8.一种治疗遗传性疾病的药物，其特征在于，其有效成分包括权利要求1~4任一项所述的arRNA。

9.根据权利要求8所述的治疗遗传性疾病的药物，其特征在于，所述arRNA包括通过腺病毒或慢病毒构建的递送体。

10.权利要求8~9任一项所述的治疗遗传性疾病的药物在治疗遗传性疾病中的应用。