CN107201365B - 一种特异性敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA序列及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种特异性敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA序列，序列如SEQ ID NO：3所示。本发明还提供了所述sgRNA序列的用途及一种用于敲除二氢叶酸还原酶基因的试剂盒。本发明提供的sgRNA，能够用于快速、高效、特异性敲除CHO细胞中的DHFR基因，并获得DHFR基因缺失细胞株，可大大提高外源蛋白的产量，应用前景良好。

Description

一种特异性敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA序列及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种特异性敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA序列及其应用。
背景技术
中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO细胞)是目前生产药物蛋白最常用的宿主细胞，其表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能等方面接近天然蛋白，被广泛应用于抗体、重组蛋白药物和疫苗等产品的研发和生产中，提高CHO细胞中表达产物的产量是研究者们长期的追求。
二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)是一种催化5，6-二氢叶酸还原为5，6，7，8-四氢叶酸的蛋白酶，参与细胞内的嘌呤代谢过程。当细胞株缺失了DHFR基因，将携带DHFR基因的表达载体转染细胞，阳性细胞也就获得了DHFR基因，此时在培养基中加入甲氨喋呤(Methotrexate，MTX)，会导致DHFR基因扩增，连带其两侧片段也得到相应扩增，可使目的基因的拷贝数增加几百到几千倍，从而达到目的基因的高效表达。因此，急需要敲除CHO细胞株的DHFR基因，以提高外源基因蛋白表达量。
Crispr/Cas9系统，是细菌和古细菌在进化过程中演变出来的一种用于抵御外来侵害的免疫入侵系统，在现代基因工程应用领域与TALEN(transcription activator-likeeffector nuclease)以及ZFN(zinc-finger nuclease)技术并列成为三大基因组编辑工具。CRISPR-Cas9技术具有特异性DNA识别能力，Cas9核酸内切酶在向导核糖核酸(guideRNA，sgRNA)引导下切割双链DNA，造成基因组双链断裂，利用细胞基因组修复的不稳定性产生非特异重组来产生修复错误(插入或者缺失)，从而可能产生移码突变而造成基因功能的丧失，实现基因敲除的目的。相比较于TALEN及ZFN技术，其sgRNA的设计和合成工作量远远小于TALEN和ZFN识别模块的构建过程，易于操作，而且毒性低、效率更高、更容易得到纯合子突变体。
现有报道中，仅见Sigma公司利用ZFN技术敲除DHFR，构建DHFR-/-型的CHO细胞系，细胞毒性较大。设计出特异性靶向敲除DHFR基因的sgRNA，利用CRISPR-Cas9系统构建DHFR-/-型的CHO细胞系，对外源蛋白高效表达意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种sgRNA序列及其应用。
本发明提供了一种特异性敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA序列，序列如SEQ IDNO：3所示。
本发明还提供了一种核苷酸序列，序列如SEQ ID NO：11所示。
本发明还提供了一种重组质粒，它包括SEQ ID NO：3或11所示的序列。
本发明还提供了上述序列在敲除二氢叶酸还原酶基因中的用途。
本发明还提供了上述序列在制备二氢叶酸还原酶基因缺失细胞株中的用途。
本发明还提供了一种用于敲除二氢叶酸还原酶基因的试剂盒，它包括上述sgRNA序列或重组质粒。
本发明还提供了一种敲除CHO细胞中二氢叶酸还原酶基因的方法，它是利用CRISPR/Cas9系统在CHO细胞中对二氢叶酸还原酶基因进行改造，步骤如下：
a、合成上述序列及其互补链，变性、退火，形成双链；
b、将步骤a制备的双链插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到重组表达质粒；
c、将步骤b的重组表达载体转染CHO细胞，挑取单个细胞，接种培养；
d、待单个细胞增殖为单克隆后，鉴定并确认CHO细胞中的二氢叶酸还原酶基因被敲除，并获得二氢叶酸还原酶基因缺失的CHO细胞。
其中，所述CHO细胞为CHO-S亚型细胞。
其中，所述Cas9表达载体为CRISPR/Cas9载体。
本发明还提供了上述方法制备得到的二氢叶酸还原酶基因缺失细胞株。
本发明提供的特异性靶向敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA，能够引导Cas9快速、高效、特异性敲除CHO细胞中的DHFR基因，实现了在基因组水平对DHFR基因的沉默；获得的DHFR基因缺失细胞株，与野生型CHO-S细胞的细胞形态和生长特性相同，可大大提高外源蛋白的产量，为产业化生产重组蛋白提供了良好基础。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为CHO-S细胞DHFR基因Exon1部分序列及sgRNA靶向序列
图2为荧光素酶法鉴定各sgRNA引导Cas9切割目标DNA的效率图
图3为CHO-S/DHFR-/-/G3单克隆细胞生长速度图
图4.为细胞形态观察图：
左图：CHO-S/DHFR-/-/G3单克隆细胞；右图：野生型CHO-S细胞(对照)；
图5CHO-S/DHFR-/-细胞支原体检测(PC：阳性对照；NC：阴性对照；A2，G3：单克隆细胞株编号)
图6为不同MTX剂量处理下TNFR2-Fc表达量图。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明所用的实验试剂如下：
Lipofectamine 2000,Invitrogen公司,REF.11668-030,lot.1828123；
Trypsin0.25％,Hyclone公司，SH42605.01,Cas.9002-07-7；
DEME/F-12,Gibco公司，REF.C11330500CP，Lot.8115411；
Foetal Bovine Serum，Hyclone公司，Cat.SH30084.03，Lot.YK0119；
Opti-MEM，Gibco公司，REF.31985-062，Lot.1800574；
Phosphate Buffered Saline，Hyclone公司，Cat.SH30256.01B,Lot.NAG1428
DEME,Gibco公司，REF.C11995500CP,Lot.8116413；
Renilla Luciferase Assay Substrate，Promega公司，REF.E289A,Lot.0000119245；
Renilla Luciferase Assay Buffer，Promega公司，REF.E290A,Lot.0000141517；
Stop&Glo Substrate，Promega公司，REF.E640A,Lot.0000133610；
HT Supplement，Gibco公司，REF.11067-030,Lot.1797757；
UCA CRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒，百奥塞图公司，Cat.BCG-DX001,Lot.BBCTG201409。
CHO-S细胞：购自invitrogen公司，货号：A1155701。
实施例1利用本发明sgRNA序列敲除CHO细胞的二氢叶酸还原酶基因
1、设计靶向CHO-S细胞DHFR基因的sgRNA
根据Genbank公布的CHO细胞的DHFR基因序列，针对第一外显子(Exon1)，设计不同的sgRNA序列，设计的sgRNA序列见表1：
表1sgRNAs序列
序号 SgRNA序列(5‐‐‐3) 方向 PAM序列 SgRNA序列位置
SgRNA1‐h(SEQ ID NO：1) GCAAGAACGGAGACCUUCCC 正向 TGG Exon1
SgRNA2‐h(SEQ ID NO：2) GUCGCCGUGUCCCAGAAUAU 正向 GGG Exon1
SgRNA3‐h(SEQ ID NO：3) GCCAAUGCUCAGGUACUGGC 正向 TGG Exon1
CHO-S细胞DHFR基因Exon1部分序列及sgRNA靶向序列见图1。
提取CHO-S细胞基因组DNA，使用表2引物扩增基因组DNA，凝胶回收扩增产物，连接至precut pUCA(LUC)载体(百奥赛图公司的UCA CRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒中试剂)，标记为precut pUCA(LUC)-DHFR，涂Kna抗性平板，挑取4个克隆进行测序，并和Genbank公布的DHFR基因序列比对，检测sgRNA靶点位置序列有无突变，结果显示sgRNA靶点序列无突变。
表2扩增DHFR基因sgRNA靶点所用引物
SEQ ID NO：6DHFR基因SgRNA1-h、2-h、3-h靶点周围DNA序列
2、构建靶向DHFR基因的CRISPR/Cas9/sgRNA载体
分别合成sgRNA正向和反向互补序列，并在正向序列5端加入CACC接头序列，在反向序列5端加入AAAC接头序列，合成序列见表3，通过变性退火方法组建双链sgRNA片段。
表3组建CRISPR/Cas9/sgRNA载体用各sgRNA正向和反向序列
序号 SgRNA序列(5---3)
SgRNA1-h-正向(SEQ ID NO：7) CACCGCAAGAACGGAGACCTTCCC
SgRNA1-h-反向(SEQ ID NO：8) AAACGGGAAGGTCTCCGTTCTTGC
SgRNA2-h-正向(SEQ ID NO：9) CACCGTCGCCGTGTCCCAGAATAT
SgRNA2-h-反向(SEQ ID NO：10) AAACATATTCTGGGACACGGCGAC
SgRNA3-h-正向(SEQ ID NO：11) CACCGCCAATGCTCAGGTACTGGC
SgRNA3-h-反向(SEQ ID NO：12) AAACGCCAGTACCTGAGCATTGGC
用BsmB I酶切CRISPR/Cas9载体(百奥赛图公司的UCA CRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒中试剂)，1％琼脂糖凝胶回收目的片段，T4DNA连接酶连接各sgRNA片段和酶切载体，并转化DH5a感受态细胞，涂Amp抗性平板，每个平板挑选5个阳性克隆进行测序核实。对测序正确质粒用高纯度试剂盒进行纯化和保存。
3、针对DHFR基因的sgRNA活性鉴定
采取luciferase法鉴定各sgRNA引导Cas9切割靶基因的活性，具体步骤为：传代293细胞(293细胞培养基为：高糖DEME+10％FBS)至24孔板，次日用脂质体转染法转染CRISPR-Cas9-sgRNA-h和SSA luciferase-cut-gene载体(每种sgRNA做3次转染)(其中，Lipofectamine 2000转染试剂2ul，CRISPR-Cas9-sgRNA-h载体0.8ug，SSA-luciferase-cut-gene 0.2ug)，以有活性sgRNA的CRISPR-Cas9和SSA luciferase-cut-gene载体转染作为阳性对照(标记为Positive)。
转染72小时后取上清40ul，并添加10ul luciferase底物，检测luciferase强度。检测结果见表4和图2。
表4荧光素酶法鉴定各sgRNA引导Cas9切割目标DNA的效率
SgRNA1-h SgRNA2-h SgRNA3-h Positive
A 435880 538070 1554960 858650
B 441770 632550 1455950 1075760
C 427220 515720 1672710 1011520
Ave. 434956.7 562113.3 1561207 981976.7
sgRNA/PC 0.44294 0.57243 1.589861 1
可见，携带SgRNA3-h的质粒转染细胞后，产生的荧光强度显著优于阳性对照，说明其活性好，切割目标DNA的效率高，而其它sgRNA的效果不佳。
4、敲除CHO-S细胞内的DHFR基因
复苏CHO-S细胞，传至6孔板，采用脂质体转染法，选择CRISPR-Cas9-SgRNA3-h质粒转染CHO-S细胞(转染时：Lipofectamine 2000转染试剂4ul，CRISPR-Cas9-SgRNA3-h载体2ug)，次日传至25cm2方瓶中，选用含有750ug/ml G418、0.5mM次黄嘌呤钠、0.08mM胸腺嘧啶的无血清生长培养基进行加压筛选，每2-3天更换新鲜培养基，加压2周后，对存活细胞进行有限稀释法单克隆，培养至4块96孔板中，继续培养2周。
5、挑选CHO-S/DHFR-/-单克隆细胞
挑选30个细胞形态好、生长速度快的单克隆进行消化，细胞传至一块48孔板，次日提取48孔板上细胞基因组DNA(30个DNA样本)，使用表2的引物分别扩增SgRNA3-h靶点周围序列，琼脂糖凝胶回收目的片段，而后连接至T载体，转化DH5a感受态细胞，涂Amp抗性平板(共60块平板)，次日从每个平板上挑取5个克隆测序。
和原序列进行比对分析，选择全部为错意突变、细胞生长状态好、生长速度快的单克隆进行二次单克隆培养。从二次单克隆中挑选5个单克隆进行鉴定，挑选全部为错意突变、细胞生长状态好、生长速度快且支原体检测阴性的单克隆进行放大培养和冻存。
对最终选取的单克隆细胞(编号CHO-S/DHFR-/-/G3、A2)进行生长速度(图3)、细胞形态观察分析(图4)和支原体检测(图5)，结果显示挑选得到的单克隆细胞生长速度与野生型CHO-S细胞相近，细胞形态无明显差异，且没有支原体污染。
其中，CHO-S/DHFR-/-/G3单克隆细胞的突变情况如下：双链DNA突变不一样，而且插入/缺失bp数都不是3的整倍数，其中一条链(突变体A-)多2bp，另一条链(突变体B-)少4bp。
SEQ ID NO：13CHO-S/DHFR-/-/G3单克隆细胞测序(突变体A-多2bp)
SEQ ID NO：14CHO-S/DHFR-/-/G3单克隆细胞测序(突变体B-少4bp)
可知，本发明sgRNA序列可以用于敲除CHO细胞的二氢叶酸还原酶基因，并且获得了二氢叶酸还原酶基因缺失细胞株。获得的细胞株与野生型CHO-S细胞具有相同的细胞形态和倍增速度，可用于后续的功能性重组蛋白的表达。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：
试验例1本发明CHO-S/DHFR-/-细胞株用于表达外源蛋白的效果验证
按照分子克隆方法，构建含有TNFR2-Fc(即肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白)和DHFR基因的表达载体(构建方法为：将pcDNA3.1载体上的Neo抗性片段替换为DHFR基因，命名为pcDNA3.1/DHFR,合成TNFR2-Fc基因，将其插入到pcDNA3.1/DHFR载体的多克隆位点区即可)，并分别转染本发明的CHO-S/DHFR-/-/G3细胞株和wtCHO-S细胞株(野生型)，使用2ug/ml的嘌呤霉素加压5天(杀死未转染质粒的CHO细胞)。取等量细胞至6孔板中，添加不同剂量的MTX加压2周，更换新的生长培养基，24小时后收集培养基，ELISA检测培养上清中Fc融合蛋白表达情况。
结果显示CHO-S/DHFR-/-细胞表达的TNFR2-Fc远高于CHO-S细胞，而且随着MTX浓度的升高，其TNFR2-Fc表达量也提高(图6)。
可见，本发明构建的CHO-S/DHFR-/-细胞株可以用于高效表达外源蛋白。
综上，本发明特异性靶向敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA，能够引导Cas9快速、高效、特异性敲除CHO细胞中的二氢叶酸还原酶基因，并获得二氢叶酸还原酶基因缺失放入细胞株，能够大大提高外源蛋白的产量，应用前景良好。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川丰讯科技发展有限公司
<120> 一种特异性敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA序列及其应用
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<212> RNA
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gucgccgugu cccagaauau 20
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<211> 20
<212> RNA
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<212> DNA
<213> DHFR-EXO1-R2引物
<400> 5
tgaggaggtg gtggtcattc tttgg 25
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<212> DNA
<213> DHFR基因SgRNA1-h、2-h、3-h靶点周围DNA序列
<400> 6
cggggcctct gatgttcaaa taggatgcta ggcttgttga gggcgtggcc tccgattcac 60
aagtgggaag cagcgccggg cgactgcaat ttcgcgccaa acttggggga agcacagcgt 120
acaggctgcc taggtgatcg ctgctgctgt catggttcga ccgctgaact gcatcgtcgc 180
cgtgtcccag aatatgggca tcggcaagaa cggagacctt ccctggccaa tgctcaggta 240
ctggctggat tgggttaggg aaaccgaggc ggttcgctga atcgggtcga gcacttggcg 300
gagacgcgcg ggccaactac ttagggacag tcatgagggg taggcccgcc ggctgcagcc 360
cttgcccatg cccgcggtga tccccatgct gtgccagcct ttgcccagag gcgctctagc 420
tgggagcaaa gtccggtcac tgggcagcac caccccccgg acttgcatgg gtagccgctg 480
agatggagcc tgagcacacg tgacagggtc cctgttaacg cagtgtttct ctaactttca 540
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<211> 24
<212> DNA
<213> SgRNA1-h-反向引物
<400> 8
aaacgggaag gtctccgttc ttgc 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> SgRNA2-h-正向引物
<400> 9
caccgtcgcc gtgtcccaga atat 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> SgRNA2-h-反向引物
<400> 10
aaacatattc tgggacacgg cgac 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> SgRNA3-h-正向引物
<400> 11
caccgccaat gctcaggtac tggc 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> SgRNA3-h-反向引物
<400> 12
aaacgccagt acctgagcat tggc 24
<210> 13
<211> 472
<212> DNA
<213> CHO-S/DHFR-/-/G3单克隆细胞测序，链A
<400> 13
ggggcctctg atgttcaaat aggatgctag gcttgttgag ggcgtggcct ccgattcaca 60
agtgggaagc agcgccgggc gactgcaatt tcgcgccaaa cttgggggaa gcacagcgta 120
caggctgcct aggtgatcgc tgctgctgtc atggttcgac cgctgaactg catcgtcgcc 180
gtgtcccaga atatgggcat cggcaagaac ggagaccttg tccctggcca atgctcaggt 240
actggctgga ttgggttagg gaaaccgagg cggttcgctg aatcgggtcg agcacttggc 300
ggagacgcgc gggccaacta cttagggaca gtcatgaggg gtaggcccgc cggctgcagc 360
ccttgcccat gcccgcggtg atccccatgc tgtgccagcc tttgcccaga ggcgctctag 420
ctgggagcaa agtccggtca ctgggcagca ccaccccccg gacttgcatg gg 472
<210> 14
<211> 466
<212> DNA
<213> CHO-S/DHFR-/- /G3单克隆细胞测序，链B
<400> 14
ggggcctctg atgttcaaat aggatgctag gcttgttgag ggcgtggcct ccgattcaca 60
agtgggaagc agcgccgggc gactgcaatt tcgcgccaaa cttgggggaa gcacagcgta 120
caggctgcct aggtgatcgc tgctgctgtc atggttcgac cgctgaactg catcgtcgcc 180
gtgtcccaga atatgggcat cggcaagaac ggagaccctg gccaatgctc aggtactggc 240
tggattgggt tagggaaacc gaggcggttc gctgaatcgg gtcgagcact tggcggagac 300
gcgcgggcca actacttagg gacagtcatg aggggtaggc ccgccggctg cagcccttgc 360
ccatgcccgc ggtgatcccc atgctgtgcc agcctttgcc cagaggcgct ctagctggga 420
gcaaagtccg gtcactgggc agcaccaccc cccggacttg catggg 466

Claims (10)

1.一种特异性敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA序列，其特征在于，序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一种核苷酸序列，其特征在于，序列如SEQ ID NO：11所示。
3.一种重组质粒，其特征在于，它包括SEQ ID NO：3或11所示的序列。
4.权利要求1所述的sgRNA序列或权利要求2所述的核苷酸序列在敲除二氢叶酸还原酶基因中的用途。
5.权利要求1所述的sgRNA序列或权利要求2所述的核苷酸序列在制备二氢叶酸还原酶基因缺失细胞株中的用途。
6.一种用于敲除二氢叶酸还原酶基因的试剂盒，其特征在于，它包括权利要求1所述的sgRNA序列或权利要求2所述的核苷酸序列或权利要求3所述的重组质粒。
7.一种敲除CHO细胞中二氢叶酸还原酶基因的方法，其特征在于，它是利用CRISPR/Cas9系统在CHO细胞中对二氢叶酸还原酶基因进行改造，步骤如下：
a、合成SEQ ID NO：3或11所示的序列及其互补链，变性、退火，形成双链；
b、将步骤a制备的双链插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到重组表达质粒；
c、将步骤b的重组表达载体转染CHO细胞，挑取单个细胞，接种培养；
d、待单个细胞增殖为单克隆后，鉴定并确认CHO细胞中的二氢叶酸还原酶基因被敲除，并获得二氢叶酸还原酶基因缺失的CHO细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述CHO细胞为CHO‐S亚型细胞。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述Cas9表达载体为CRISPR/Cas9载体。
10.权利要求7‐9任意一项所述方法制备得到的二氢叶酸还原酶基因缺失细胞株。
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