CN114457077A - 靶向新型冠状病毒rna及其反义链utr的脱氧核酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了靶向新型冠状病毒RNA及其反义链UTR的脱氧核酶及其应用。本发明提供了一种靶向新型冠状病毒RNA或其反义链UTR的脱氧核酶，为由一个催化中心和两个靶基因连接臂组成的单链DNA；所述靶基因连接臂分别连接于所述催化中心的两端；所述靶基因结合臂用于特异性结合新型冠状病毒RNA或其反义链UTR。本发明所提供的脱氧核酶能够在基因水平切割并阻断病毒复制，可为治疗包括新冠病毒提供候选抗病毒药物靶分子。该药物分子与传统的应用病毒编码基因或蛋白制备的抗体药物相比，将具有特异性高、不惧怕病毒变异等优点；与RNA疫苗相比则具有稳定性好的优势。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种靶向新型冠状病毒RNA及其反义链UTR的脱氧核酶及其应用。
背景技术
近来，新冠病毒出现至少10余种变异突变，包括新近出现的Delta变异和南非的奥密克戎变异病毒株，与原始病毒差异较大，导致其免受人体免疫反应的影响，无论是通过免疫或者曾经感染而获得的免疫力，抵御效果都会降低，为目前COVID-19的抗病毒疫苗和临床抗病毒药物的有效性构成严重威胁。因此靶向设计直接作用新冠病毒的核酸保守序列的抗病毒药物对于治疗COVID-19十分重要且必要。
SARS-CoV-2是冠状病毒科的RNA病毒，SARS-CoV-2的基因组是大约30kb的单链正链RNA，包括5'帽结构和3'poly(A)尾巴。病毒感染进入细胞后，全长正链基因组 RNA充当复制和转录的模板，以产生用于基因组复制的全长负链RNA和用于产生亚基因组mRNA的亚基因组负链RNA，产生的亚基因组RNA与基因组RNA具有相同的3′和 5′末端非编码区。并且RNA基因组本身是控制和启用其功能的中央调节中心，RNA 分子折叠成复杂的高级结构，这些结构也是其细胞功能不可或缺的，其中5'UTR(非编码区)和3'UTR在病毒复制、翻译以及逃避细胞抗病毒过程中发挥重要作用。此外 SARS-CoV-2的结构蛋白序列为适应环境变异率较高，而非结构蛋白序列非常保守，不易发生变异。
脱氧核酶(DNAzyme)是体外合成的具有催化功能的单链DNA片段，对DNA和RNA 等核酸具有高效催化活性和结构识别能力。目前通过人工模拟已经合成了几十种脱氧核酶，包括8-17型脱氧核酶、10-23型脱氧核酶、“手枪型”脱氧核酶等。其中10-23 型脱氧核酶是通过体外筛选从1014个随机序列中获得的第10轮循环的第23个克隆，由一个催化中心和两个靶基因结合臂组成，通过靶基因结合臂与靶基因mRNA的互补配对，催化RNA特定部位的切割反应，从mRNA水平对基因进行灭活，进而调控蛋白表达。其切割位点为5'-R↓Y-3'(R＝A/G，Y＝U/C)，切割效率AU＝GU＞GC＞AC。酶促动力学研究表明，脱氧核酶的催化效率高于发夹型核酶、锤头型核酶等，并且与小干扰RNA相比，具有特异、稳定、低毒、制备成本低等优点，在病毒感染性疾病中应用广泛，具有很好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向新型冠状病毒RNA及其反义链UTR的脱氧核酶及其应用。
第一方面，本发明要求保护一种靶向新型冠状病毒RNA或其反义链UTR的脱氧核酶。
本发明要求保护的靶向新型冠状病毒RNA或其反义链UTR的脱氧核酶为由一个催化中心和两个靶基因连接臂组成的单链DNA；所述靶基因连接臂分别连接于所述催化中心的两端；所述靶基因结合臂用于特异性结合新型冠状病毒RNA或其反义链UTR。
进一步地，所述催化中心的序列为SEQ ID No.1。
进一步地，所述靶基因连接臂的长度为9个核苷酸。
在本发明的具体实施方式中，所述靶基因连接臂可选自如下：SEQ ID No.3的第1-9位、SEQ ID No.3的第25-33位、SEQ ID No.4的第1-9位、SEQ ID No.4的第25-33位、SEQ IDNo.5的第1-9位、SEQ ID No.5的第25-33位、SEQ ID No.6 的第1-9位、SEQ ID No.6的第25-33位、SEQ ID No.7的第1-9位、SEQ ID No.7 的第25-33位、SEQ ID No.8的第1-9位、SEQ IDNo.8的第25-33位、SEQ ID No.9 的第1-9位、SEQ ID No.9的第25-33位、SEQ ID No.10的第1-9位、SEQ ID No.10 的第25-33位、SEQ ID No.14的第1-9位、SEQ ID No.14的第25-33位、SEQ ID No.16 的第1-9位、SEQ ID No.16的第25-33位、SEQ ID No.18的第1-9位、SEQ IDNo.18 的第25-33位、SEQ ID No.19的第1-9位、SEQ ID No.19的第25-33位、SEQ ID No.20的第1-9位、SEQ ID No.20的第25-33位、SEQ ID No.33的第1-9位、SEQ ID No.33 的第25-33位、SEQ ID No.40的第1-9位、SEQ ID No.40的第25-33位、SEQ ID No.41 的第1-9位、SEQID No.41的第25-33位、SEQ ID No.43的第1-9位、SEQ ID No.43 的第25-33位、SEQ IDNo.47的第1-9位、SEQ ID No.47的第25-33位、SEQ ID No.48 的第1-9位、SEQ ID No.48的第25-33位、SEQ ID No.50的第1-9位、SEQ ID No.50 的第25-33位、SEQ ID No.60的第1-9位、SEQ ID No.60的第25-33位、SEQ ID No.62 的第1-9位、SEQ ID No.62的第25-33位。
在本发明的具体实施方式中，所述脱氧核酶具体为如下任一：
(A1)核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的单链DNA(对应实施例中的P3-2)；
(A2)核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的单链DNA(对应实施例中的P3-3)；
(A3)核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的单链DNA(对应实施例中的P3-4)；
(A4)核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的单链DNA(对应实施例中的P3-5)；
(A5)核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的单链DNA(对应实施例中的P3-6)；
(A6)核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的单链DNA(对应实施例中的P3-7)；
(A7)核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的单链DNA(对应实施例中的P3-8)；
(A8)核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的单链DNA(对应实施例中的P3-9)；
(A9)核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的单链DNA(对应实施例中的P3-13)；。
(A10)核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的单链DNA(对应实施例中的P3-15)；
(A11)核苷酸序列如SEQ ID No.18所示的单链DNA(对应实施例中的P5-1)；
(A12)核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的单链DNA(对应实施例中的P5-2)；
(A13)核苷酸序列如SEQ ID No.20所示的单链DNA(对应实施例中的P5-3)；
(A14)核苷酸序列如SEQ ID No.33所示的单链DNA(对应实施例中的F3-3)；
(A15)核苷酸序列如SEQ ID No.40所示的单链DNA(对应实施例中的F3-10)；
(A16)核苷酸序列如SEQ ID No.41所示的单链DNA(对应实施例中的F3-11)；
(A17)核苷酸序列如SEQ ID No.43所示的单链DNA(对应实施例中的F3-13)；
(A18)核苷酸序列如SEQ ID No.47所示的单链DNA(对应实施例中的F3-17)；
(A19)核苷酸序列如SEQ ID No.48所示的单链DNA(对应实施例中的F3-18)；
(A20)核苷酸序列如SEQ ID No.50所示的单链DNA(对应实施例中的F5-2)；
(A21)核苷酸序列如SEQ ID No.60所示的单链DNA(对应实施例中的F5-12)；
(A22)核苷酸序列如SEQ ID No.62所示的单链DNA(对应实施例中的F5-14)。
各序列中，G为鸟嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，A为腺嘌呤核苷酸单体；各序列中间部分(第10-24位)为所述脱氧核酶的催化中心序列。
其中，P3-2、P3-3、P3-4、P3-5、P3-6、P3-7、P3-8、P3-9、P3-13和P3-15靶向新型冠状病毒RNA的3’-UTR；P5-1、P5-2和P5-3靶向新型冠状病毒RNA的5’-UTR； F3-3、F3-10、F3-11、F3-13、F3-17和F3-18靶向新型冠状病毒RNA反义链的5’-UTR； F5-2、F5-12和F5-14靶向新型冠状病毒RNA反义链的3’-UTR。
在所述脱氧酶中，磷酸酯基团在磷酸二酯键部分的单键氧位置可为氧或硫或甲氧基。
第二方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的脱氧核酶在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。
第三方面，本发明要求保护一种抗新型冠状病毒药物。
本发明要求保护的抗新型冠状病毒药物，其活性成分为前文第一方面中所述的脱氧核酶。
第四方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的脱氧核酶在制备用于细胞内切割新型冠状病毒RNA或其反义链UTR的产品中的应用。
在上述各方面中，所述新型冠状病毒为SARS-CoV-2。
本发明选取SARS-CoV-2RNA及其反义链的5'UTR和3'UTR序列中所有的AU碱基作为切割靶点，设计并合成特异的脱氧核酶分子，深入研究脱氧核酶在基因水平切割并阻断病毒复制，可为治疗包括新冠病毒提供候选抗病毒药物靶分子。该药物分子与传统的应用病毒编码基因或蛋白制备的抗体药物相比，将具有特异性高、不惧怕病毒变异等优点；与RNA疫苗相比则具有稳定性好的优势。
附图说明
图1为琼脂糖凝胶电泳检测转录后RNA。
图2为脱氧核酶体外靶向切割3'UTR RNA。
图3为脱氧核酶体外靶向切割3'UTR-antisense RNA。
图4为脱氧核酶体外靶向切割5'UTR RNA。
图5为脱氧核酶体外靶向切割5'UTR-antisense RNA。
图6为双荧光素酶报告基因检测靶向3'UTR RNA的脱氧核酶在细胞内的切割作用。
图7为双荧光素酶报告基因检测靶向3'UTR-antisense RNA的脱氧核酶在细胞内的切割作用。
图8为双荧光素酶报告基因检测靶向5'UTR RNA的脱氧核酶在细胞内的切割作用。
图9为双荧光素酶报告基因检测靶向5'UTR-antisense RNA的脱氧核酶在细胞内的切割作用。
图10为检测筛选得到的靶向3'UTR RNA的脱氧核酶在A549细胞中的细胞毒性。
图11为检测筛选得到的靶向3'UTR-antisense RNA的脱氧核酶在A549细胞中的细胞毒性。
图12为检测筛选得到的靶向5'UTR RNA的脱氧核酶在A549细胞中的细胞毒性。
图13为检测筛选得到的靶向5'UTR-antisense RNA的脱氧核酶在A549细胞中的细胞毒性。
图6至图9中，*表示与P3-0组相比在P<0.05水平上差异显著，**表示与P3-0 组相比在P<0.01水平上差异显著，***表示与P3-0组相比在P<0.001水平上差异显著。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、设计并合成靶向SARS-CoV-2RNA及其反义链UTR的脱氧核酶
根据GenBank中的SARS-CoV-2(GenBank登录号：MN908947.3)序列，选取5'UTR(1-265bp)，3'UTR(29675-29903bp)及其对应的反向互补序列中的 AU作为切割靶点，设计并合成脱氧核酶，其中5'UTR对应的反向互补序列为反义链的3'UTR，标记为5'UTR-antisense，同理，3'UTR-antisense为反义链的5'UTR。
本发明设计并合成的脱氧核酶为10-23型脱氧核酶，为由一个催化中心和两个靶基因结合臂组成的单链脱氧核糖核酸，催化中心序列高度保守，序列为 5'-GGCTAGCTACAACGA-3'(SEQ ID No.1)，催化中心两端各9个核苷酸(即靶基因结合臂)用于结合靶RNA，实现对靶RNA高效切割。具体如下：
靶向SARS-CoV-2的3'UTR的脱氧核酶的序列为：
P3-1：5'-TATGTGAGAGGCTAGCTACAACGATAAAGTTAA-3'(SEQ ID No.2)；
P3-2：5'-AGATTGCTAGGCTAGCTACAACGAGTGAGATTA-3'(SEQ ID No.3)；
P3-3：5'-GATTAAAGAGGCTAGCTACAACGATGCTATGTG-3'(SEQ ID No.4)；
P3-4：5'-ACACACTGAGGCTAGCTACAACGATAAAGATTG-3'(SEQ ID No.5)；
P3-5：5'-CCTCCCTAAGGCTAGCTACAACGAGTTACACAC-3'(SEQ ID No.6)；
P3-6：5'-CGGTGAAAAGGCTAGCTACAACGAGTGGTGGCT-3'(SEQ ID No.7)；
P3-7：5'-TCCCTAGCAGGCTAGCTACAACGATGTTCACTG-3'(SEQ ID No.8)；
P3-8：5'-TCTTCCATAGGCTAGCTACAACGAAGGCAGCTC-3'(SEQ ID No.9)；
P3-9：5'-GCTCTTCCAGGCTAGCTACAACGAATAGGCAGC-3'(SEQ ID No.10)；
P3-10：5'-TTTTACACAGGCTAGCTACAACGATAGGGCTCT-3'(SEQ ID No.11)；
P3-11：5'-TAAAATTAAGGCTAGCTACAACGATTTACACAT-3'(SEQ ID No.12)；
P3-12：5'-CTACTAAAAGGCTAGCTACAACGATAATTTTAC-3'(SEQ ID No.13)；
P3-13：5'-ACATGGGGAGGCTAGCTACAACGAAGCACTACT-3'(SEQ ID No.14)；
P3-14：5'-AAAATCACAGGCTAGCTACAACGAGGGGGATAG-3'(SEQ ID No.15)；
P3-15：5'-CTATTAAAAGGCTAGCTACAACGACACATGGGG-3'(SEQ ID No.16)；
P3-16：5'-AAGAAGCTAGGCTAGCTACAACGATAAAATCAC-3'(SEQ ID No.17)。
靶向SARS-CoV-2的5'UTR的脱氧核酶的序列为：
P5-1：5'-GGGAAGGTAGGCTAGCTACAACGAAAACCTTTA-3'(SEQ ID No.18)；
P5-2：5'-TACAAGAGAGGCTAGCTACAACGACGAAAGTTG-3'(SEQ ID No.19)；
P5-3：5'-GAGAACAGAGGCTAGCTACAACGACTACAAAGA-3'(SEQ ID No.20)；
P5-4：5'-CCACACAGAGGCTAGCTACAACGATTTAAAGTT-3'(SEQ ID No.21)；
P5-5：5'-CACTAAGCAGGCTAGCTACAACGAGCAGCCGAG-3'(SEQ ID No.22)；
P5-6：5'-TATTAATTAGGCTAGCTACAACGAACTGCGTGA-3'(SEQ ID No.23)；
P5-7：5'-AGTTATTAAGGCTAGCTACAACGATATACTGCG-3'(SEQ ID No.24)；
P5-8：5'-AATTAGTTAGGCTAGCTACAACGATAATTATAC-3'(SEQ ID No.25)；
P5-9：5'-CGACAGTAAGGCTAGCTACAACGATAGTTATTA-3'(SEQ ID No.26)；
P5-10：5'-TGCAGAAGAGGCTAGCTACAACGAAGACGAGTT-3'(SEQ ID No.27)；
P5-11：5'-TGCTGATGAGGCTAGCTACAACGACGGCTGCAA-3'(SEQ ID No.28)；
P5-12：5'-ATGTGCTGAGGCTAGCTACAACGAGATCGGCTG-3'(SEQ ID No.29)；
P5-13：5'-AAACCTAGAGGCTAGCTACAACGAGTGCTGATG-3'(SEQ ID No.30)。
靶向SARS-CoV-2的3'UTR-antisense的脱氧核酶的序列为：
F3-1：5'-TTAGGAGAAGGCTAGCTACAACGAGACAAAAAA-3'(SEQ ID No.31)；
F3-2：5'-TGATTTTAAGGCTAGCTACAACGAAGCTTCTTA-3'(SEQ ID No.32)；
F3-3：5'-CCCATGTGAGGCTAGCTACAACGATTTAATAGC-3'(SEQ ID No.33)；
F3-4：5'-CTATCCCCAGGCTAGCTACAACGAGTGATTTTA-3'(SEQ ID No.34)；
F3-5：5'-GTAGTGCTAGGCTAGCTACAACGACCCCATGTG-3'(SEQ ID No.35)；
F3-6：5'-TAAAATTAAGGCTAGCTACAACGATTTAGTAGT-3'(SEQ ID No.36)；
F3-7：5'-TGTGTAAAAGGCTAGCTACAACGATAATTTTAG-3'(SEQ ID No.37)；
F3-8：5'-GAGCCCTAAGGCTAGCTACAACGAGTGTAAAAT-3'(SEQ ID No.38)；
F3-9：5'-CTGCCTATAGGCTAGCTACAACGAGGAAGAGCC-3'(SEQ ID No.39)；
F3-10：5'-AGCTGCCTAGGCTAGCTACAACGAATGGAAGAG-3'(SEQ ID No.40)；
F3-11：5'-AGTGAACAAGGCTAGCTACAACGAGCTAGGGAG-3'(SEQ ID No.41)；
F3-12：5'-GGAGTACGAGGCTAGCTACAACGACGAGTGTAC-3'(SEQ ID No.42)；
F3-13：5'-GCCACCACAGGCTAGCTACAACGATTTCACCGA-3'(SEQ ID No.43)；
F3-14：5'-TGTGTAACAGGCTAGCTACAACGATAGGGAGGA-3'(SEQ ID No.44)；
F3-15：5'-AATCTTTAAGGCTAGCTACAACGACAGTGTGTA-3'(SEQ ID No.45)；
F3-16：5'-ACATAGCAAGGCTAGCTACAACGACTTTAATCA-3'(SEQ ID No.46)；
F3-17：5'-AATCTCACAGGCTAGCTACAACGAAGCAATCTT-3'(SEQ ID No.47)；
F3-18：5'-TAACTTTAAGGCTAGCTACAACGACTCACATAG-3'(SEQ ID No.48)。
靶向SARS-CoV-2的5'UTR-antisense的脱氧核酶的序列为：
F5-1：5'-AAGGTAAGAGGCTAGCTACAACGAGGAGAGCCT-3'(SEQ ID No.49)；
F5-2：5'-ATCAGCACAGGCTAGCTACAACGACTAGGTTTC-3'(SEQ ID No.50)；
F5-3：5'-AGCCGATCAGGCTAGCTACAACGACAGCACATC-3'(SEQ ID No.51)；
F5-4：5'-TGCAGCCGAGGCTAGCTACAACGACATCAGCAC-3'(SEQ ID No.52)；
F5-5：5'-ACTCGTCTAGGCTAGCTACAACGACTTCTGCAG-3'(SEQ ID No.53)；
F5-6：5'-AATAACTAAGGCTAGCTACAACGATACTGTCGT-3'(SEQ ID No.54)；
F5-7：5'-TATAATTAAGGCTAGCTACAACGAAACTAATTA-3'(SEQ ID No.55)；
F5-8：5'-GCAGTATAAGGCTAGCTACAACGATAATAACTA-3'(SEQ ID No.56)；
F5-9：5'-CACGCAGTAGGCTAGCTACAACGAAATTAATAA-3'(SEQ ID No.57)；
F5-10：5'-TCGGCTGCAGGCTAGCTACAACGAGCTTAGTGC-3'(SEQ ID No.58)；
F5-11：5'-ACTTTAAAAGGCTAGCTACAACGACTGTGTGGC-3'(SEQ ID No.59)；
F5-12：5'-TCTTGTAGAGGCTAGCTACAACGACTGTTCTCT-3'(SEQ ID No.60)；
F5-13：5'-AACTTTCGAGGCTAGCTACAACGACTCTTGTAG-3'(SEQ ID No.61)；
F5-14：5'-AAAGGTTTAGGCTAGCTACAACGAACCTTCCCA-3'(SEQ ID No.62)。
阴性对照p3-0是具有相同催化中心，两端靶基因结合臂为随机序列的脱氧核酶，其序列为：5'-GCGACGTGAGGCTAGCTACAACGAAGTGCAGCG-3'(SEQ ID No.63)。
上述各序列中，G为鸟嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，A为腺嘌呤核苷酸单体；中间部分(第10-24位)为脱氧核酶10-23的催化核心序列。
实施例2、体外转录获得SARS-CoV-2正义链及反义链UTR RNA
根据SARS-CoV-2的5'UTR和3'UTR序列设计引物进行多轮PCR扩增(PCR扩增相关试剂购自Takara公司)，获得5'UTR(GenBank登录号：MN908947.3的第1-265bp 位,Update：VRL18-MAR-2020)和3'UTR片段(GenBank登录号：MN908947.3的第 29675-29903位,Update：VRL18-MAR-2020)；将PCR产物进行胶回收(Promega公司) 后，克隆入pGM-T载体(天根生化科技有限公司产品)；通过PCR扩增筛选阳性菌落进行测序验证；序列比对后得到pGM-T-3'UTR、pGM-T-3'UTR-antisense、pGM-T-5'UTR、 pGM-T-5'UTR-antisense质粒。
重组质粒pGM-T-3'UTR结构描述为：在pGM-T载体缺口处连入SARS-CoV-2的 3'UTR片段(GenBank登录号：MN908947.3的第29675-29903位,Update：VRL 18-MAR-2020)后得到的重组质粒。
重组质粒pGM-T-3'UTR-antisense结构描述为：在pGM-T载体缺口处连入 SARS-CoV-2的5'UTR片段(GenBank登录号：MN908947.3的第1-265bp位,Update： VRL 18-MAR-2020)的反向互补序列后得到的重组质粒。
重组质粒pGM-T-5'UTR结构描述为：在pGM-T载体缺口处连入SARS-CoV-2的 5'UTR片段(GenBank登录号：MN908947.3的第1-265bp位,Update：VRL 18-MAR-2020) 后得到的重组质粒。
重组质粒pGM-T-5'UTR-antisense结构描述为：在pGM-T载体缺口处连入 SARS-CoV-2的3'UTR片段(GenBank登录号：MN908947.3的第29675-29903位,Update： VRL 18-MAR-2020)的反向互补序列后得到的重组质粒。
用Nde I限制性内切酶(NEB公司)酶切重组质粒后，以此线性化质粒为模板，利用T7体外转录试剂盒(购自ThermoFisher公司)进行体外转录，获得SARS-CoV-2 正义链及反义链UTR RNA。
结果如图1所示，可用于后续切割实验。
实施例3、脱氧核酶在体外对SARS-CoV-2正义链及反义链UTR RNA切割效果的观察
将上述实施例2体外转录得到的RNA与特异性脱氧核酶进行底物切割实验。取5 μL浓度为1μM的脱氧核酶与5μL的2×切割缓冲液(配方：50mmol/L Tris-HCl pH7.5、10mmol/LMgCl2、150mmol/L NaCl、0.01％SDS)混匀，5μL浓度为0.5μM的 RNA与5μL的2×切割缓冲液混匀，37℃温浴10min后混合，37℃继续温浴2h。采用8M尿素，15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离切割产物，银染后观察脱氧核酶对RNA 底物的切割作用。
结果显示：
如图2所示，脱氧核酶P3-2、P3-3、P3-4、P3-5、P3-6、P3-7、P3-8、P3-9、 P3-13、P3-15出现针对3'UTR RNA的特异切割条带；如图3所示，脱氧核酶F3-2、 F3-3、F3-4、F3-5、F3-8、F3-9、F3-10、F3-11、F3-13、F3-17、F3-18出现针对 3'UTR-antisense RNA的特异切割条带；如图4所示，脱氧核酶P5-1、P5-2、P5-3 出现针对5'UTR RNA的特异切割条带；如图5所示，脱氧核酶F5-2、F5-5、F5-6、 F5-12、F5-13、F5-14，出现针对5'UTR-antisense RNA的特异切割条带。
实施例4、双荧光素酶报告基因检测脱氧核酶在细胞内的切割作用
根据SARS-CoV-2正义链及反义链UTR设计引物(3'UTR F：5'-TGC TCT AGA ACTTTA ATC TCA CAT AGC AA-3'，R：5'-CGC CAT ATG TTT TTT TGT CAT TCT CCT AAG-3'； 3'UTR-antisense F：5'-TGC TCT AGA TTT TTT TGT CAT TCT CCT AAG-3'，R：5'-CGC CATATG ACT TTA ATC TCA CAT AGC AA-3'；5'UTR F：5'-TGC TCT AGA ATT AAA GGT TTA TACCTT CCC A-3'，R：5'-CGC CAT ATG AGG CTC TCC ATC TTA CCT TTC-3'； 5'UTR-antisenseF：5'-TGC TCT AGA AGG CTC TCC ATC TTA CCT TTC-3'，R：5'-CGC CAT ATG ATT AAA GGTTTA TAC CTT CCC A-3')，以其对应的pGM-T-UTR载体(即实施例2构建的4个重组质粒)为模板进行PCR扩增；PCR产物进行胶回收后利用限制性内切酶Xba I/Nde I(NEB公司)进行双酶切，克隆入pGL-3M载体(由pGL-3-control 载体改构而成，在其Xba I酶切位点后顺次插入Pst I、EcoR I、Nde I三个酶切位点。pGL-3-control载体为Promega公司产品，货号为HG-VQP0122)；通过PCR扩增筛选阳性菌落进行测序验证；序列比对后得到pGL-3M-3'UTR、 pGL-3M-3'UTR-antisense、pGL-3M-5'UTR、pGL-3M-5'UTR-antisense质粒。
重组质粒pGL-3M-3'UTR的结构描述为：在pGL-3M载体的酶切位点Xba I/Nde I 之间克隆入SARS-CoV-2的3'UTR片段(GenBank登录号：MN908947.3的第29675-29903 位,Update：VRL 18-MAR-2020)后得到的重组质粒。
重组质粒pGL-3M-3'UTR-antisense结构描述为：在pGL-3M载体的酶切位点Xba I/Nde I之间克隆入SARS-CoV-2的5'UTR片段(GenBank登录号：MN908947.3的第1-265bp位,Update：VRL 18-MAR-2020)的反向互补序列后得到的重组质粒。
重组质粒pGL-3M-5'UTR结构描述为：在pGL-3M载体的酶切位点Xba I/Nde I之间克隆入SARS-CoV-2的5'UTR片段(GenBank登录号：MN908947.3的第1-265bp 位,Update：VRL18-MAR-2020)后得到的重组质粒。
重组质粒pGL-3M-5'UTR-antisense结构描述为：在pGL-3M载体的酶切位点Xba I/Nde I之间克隆入SARS-CoV-2的3'UTR片段(GenBank登录号：MN908947.3的第 29675-29903位,Update：VRL 18-MAR-2020)的反向互补序列后得到的重组质粒。
HEK-293细胞(ATCC)用含10％小牛血清的DMEM培养基(Gibco公司)培养，在 24孔细胞培养板中每孔接种5×104个细胞，当细胞密度达到70％时利用转染试剂 Jetprime(Polyplus-Transfection公司)转染pGL-3M-UTR(上述构建的4个重组质粒，100ng/孔)、pRL-TK(Progema公司,10ng/孔)和脱氧核酶(0.5μM/孔)，选择上述体外切割效应明显的脱氧核酶进行检测，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48h后通过Dual-Luciferase ReporterAssay System(Promega公司)测量荧光活性。每个样品的读数显示为萤火虫/海肾荧光强度的比值，将实验组结果与阴性对照组P3-0结果比较进行归一化处理，得到最终结果。
结果如图6至图9显示，P3-2、P3-3、P3-4、P3-5、P3-6、P3-7、P3-8、P3-9、 P3-13、P3-15、P5-1、P5-2、P5-3、F3-3、F3-10、F3-11、F3-13、F3-17、F3-18、 F5-2、F5-12、F5-14在细胞内对其各自的靶RNA有切割作用。
实施例5、脱氧核酶的细胞毒性评价
A549细胞(ATCC)以2.5×103的浓度接种于96孔细胞培养板，培养18h后利用转染试剂Jetprime转染0.5μM在细胞中有切割作用的脱氧核酶(见实施例4)，同时设置未转染细胞作为对照，每组设置5个复孔，48h后加入DMEM培养基稀释的CCK-8 试剂(东仁公司)，37℃、5％CO2培养箱中继续孵育1.5h后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
结果如图10至图13所示，与对照组(Mock)相比，48h后加入脱氧核酶的细胞活力没有明显下降，该结果表明，0.5μM的脱氧核酶对细胞没有明显的毒性，筛选得到的23种脱氧核酶可以特异切割其对应的靶RNA，阻断病毒复制与生成，有望成为治疗新型冠状病毒感染的药物。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 靶向新型冠状病毒RNA及其反义链UTR的脱氧核酶及其应用
<130> GNCLN220665
<160> 63
<170> PatentIn version 3.5
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gcgacgtgag gctagctaca acgaagtgca gcg 33
Claims (9)
1.一种靶向新型冠状病毒RNA或其反义链UTR的脱氧核酶，其特征在于：所述脱氧核酶为由一个催化中心和两个靶基因连接臂组成的单链DNA；所述靶基因连接臂分别连接于所述催化中心的两端；所述靶基因结合臂用于特异性结合新型冠状病毒RNA或其反义链UTR。
2.根据权利要求1所述的脱氧核酶，其特征在于：所述催化中心的序列为SEQ ID No.1。
3.根据权利要求1或2所述的脱氧核酶，其特征在于：所述靶基因连接臂的长度为9个核苷酸。
4.根据权利要求3所述的脱氧核酶，其特征在于：所述靶基因连接臂选自如下：SEQ IDNo.3的第1-9位、SEQ ID No.3的第25-33位、SEQ ID No.4的第1-9位、SEQ ID No.4的第25-33位、SEQ ID No.5的第1-9位、SEQ ID No.5的第25-33位、SEQ ID No.6的第1-9位、SEQ IDNo.6的第25-33位、SEQ ID No.7的第1-9位、SEQ ID No.7的第25-33位、SEQ ID No.8的第1-9位、SEQ ID No.8的第25-33位、SEQ ID No.9的第1-9位、SEQ ID No.9的第25-33位、SEQ IDNo.10的第1-9位、SEQ ID No.10的第25-33位、SEQ ID No.14的第1-9位、SEQ ID No.14的第25-33位、SEQ ID No.16的第1-9位、SEQ ID No.16的第25-33位、SEQ ID No.18的第1-9位、SEQ ID No.18的第25-33位、SEQ ID No.19的第1-9位、SEQ ID No.19的第25-33位、SEQ IDNo.20的第1-9位、SEQ ID No.20的第25-33位、SEQ ID No.33的第1-9位、SEQ ID No.33的第25-33位、SEQ ID No.40的第1-9位、SEQ ID No.40的第25-33位、SEQ ID No.41的第1-9位、SEQ ID No.41的第25-33位、SEQ ID No.43的第1-9位、SEQ ID No.43的第25-33位、SEQ IDNo.47的第1-9位、SEQ ID No.47的第25-33位、SEQ ID No.48的第1-9位、SEQ ID No.48的第25-33位、SEQ ID No.50的第1-9位、SEQ ID No.50的第25-33位、SEQ ID No.60的第1-9位、SEQ ID No.60的第25-33位、SEQ ID No.62的第1-9位、SEQ ID No.62的第25-33位。
5.根据权利要求4所述的脱氧核酶，其特征在于：所述脱氧核酶为如下任一：
(A1)核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的单链DNA；
(A2)核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的单链DNA；
(A3)核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的单链DNA；
(A4)核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的单链DNA；
(A5)核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的单链DNA；
(A6)核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的单链DNA；
(A7)核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的单链DNA；
(A8)核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的单链DNA；
(A9)核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的单链DNA；
(A10)核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的单链DNA；
(A11)核苷酸序列如SEQ ID No.18所示的单链DNA；
(A12)核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的单链DNA；
(A13)核苷酸序列如SEQ ID No.20所示的单链DNA；
(A14)核苷酸序列如SEQ ID No.33所示的单链DNA；
(A15)核苷酸序列如SEQ ID No.40所示的单链DNA；
(A16)核苷酸序列如SEQ ID No.41所示的单链DNA；
(A17)核苷酸序列如SEQ ID No.43所示的单链DNA；
(A18)核苷酸序列如SEQ ID No.47所示的单链DNA；
(A19)核苷酸序列如SEQ ID No.48所示的单链DNA；
(A20)核苷酸序列如SEQ ID No.50所示的单链DNA；
(A21)核苷酸序列如SEQ ID No.60所示的单链DNA；
(A22)核苷酸序列如SEQ ID No.62所示的单链DNA。
6.根据权利要求1-5中任一所述的脱氧核酶，其特征在于：所述脱氧酶中磷酸酯基团在磷酸二酯键部分的单键氧位置为氧或硫或甲氧基。
7.权利要求1-6中任一所述的脱氧核酶在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。
8.一种抗新型冠状病毒药物，其活性成分为权利要求1-6中任一所述的脱氧核酶。
9.权利要求1-6中任一所述的脱氧核酶在制备用于细胞内切割新型冠状病毒RNA或其反义链UTR的产品中的应用。
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