CN113817730A

CN113817730A - 一种抑制新型冠状病毒(CoV19)的siRNA及其组合物和应用

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Publication number: CN113817730A
Application number: CN202110159379.0A
Authority: CN
Inventors: 张敬新; 郝肖瑶; 高悦; 魏长城
Original assignee: Nanjing Geneleap Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Geneleap Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2041-02-04
Also published as: CN113817730B

Abstract

本发明涉及一种小干扰核酸或核苷酸修饰的小干扰核酸，其中所述核酸能够抑制新型冠状病毒COVID19基因的表达。本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本发明提供的小干扰核酸作为活性成分。本发明还提供了所述小干扰核酸及其药物组合物在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染药物中的应用。本发明所述小干扰核酸对新型冠状病毒COVID19基因的表达具有良好的抑制作用。

Description

一种抑制新型冠状病毒(CoV19)的siRNA及其组合物和应用

技术领域

本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及靶向新型冠状病毒COVID-19 的小干扰核酸分子及其组合物和应用。

背景技术

新型冠状病毒(CoV19或COVID-19，SARS-CoV-2，以下简称“新冠病毒”)作为一种正链RNA病毒，病毒通过附着并进入肺上皮细胞，在溶酶体内进行脱壳，释放病毒正链RNA，正链RNA指导结构蛋白的表达，并通过以自身为模板转录成负链RNA，负链RNA作为一些非结构蛋白的模板，翻译成多种非结构蛋白的聚合物，在经过蛋白水解产生包括RdRP等多种非结构蛋白，并依赖RdRP复制形成子代正链RNA，并产生大量的亚基因组RNA。亚基因组RNA翻译结构蛋白，并组装形成新的病毒粒子。

RNA干扰药物是近年来发展起来的一种新型药物，通过RNA干扰通过靶向降解互补的 mRNA，有效的靶向抑制目的基因的表达。小干扰RNA可以降解本身病毒RNA以及形成的负链RNA和亚基因组RNA，从而有效的抑制病毒复制，并抑制病毒包装关键蛋白的表达，从而达到治疗和预防新冠病毒感染的目的。

发明内容

本发明提供一种能够抑制新型冠状病毒COVID19表达的小干扰核酸分子，优选地，所述小干扰核酸是siRNA。

在本发明的一个方面，本发明提供的小干扰核酸能够抑制新型冠状病毒COVID19表达。优选地，所述小干扰核酸靶向新型冠状病毒COVID19 mRNA上对应的以下基因或蛋白表达区：S-protein endoRNAse，M-protein。

所述小干扰核酸包含正义链和反义链，其中正义链包含选自以下序列中至少连续16个与新型冠状病毒mRNA相同的核苷酸序列：如SEQ ID NO.1/3/5/7中任一所示。

优选地，所述小干扰核酸为以下所述序列的任一组：如SEQ ID NO.1所示正义链和SEQ ID NO.2所示反义链；或如SEQ ID NO.3所示正义链和SEQ ID NO.4所示反义链；或如SEQ ID NO.5所示正义链和SEQ ID NO.6所示反义链；或如SEQ ID NO.7所示正义链和SEQID NO.8所示反义链。

在本发明的一个方面，本发明提供的小干扰核酸包含核苷酸修饰，所述核苷酸修饰包含但是不限于以下修饰的一种或多种：

l)戊糖的2’-OH甲氧基修饰:

正义链和反义链中的胞嘧啶(C)核苷酸和尿嘧啶(U)核苷酸的戊糖的2’-OH位被甲氧基修饰；甲氧基修饰如下：

2)+2碱基悬垂

正义链和反义链向5’端或3’端延伸2个核苷酸达到21碱基+2碱基悬垂；2碱基悬垂具有跟Dicer酶切割dsRNA形成的小干扰RNA相同的结构，这种结构有利于形成RISC诱导沉默复合体，从而提高沉默效率。其序列与其相应的mRNA一致，但是在3’端比互补的RNA 链多2个碱基，形成2碱基悬垂。

3)戊糖的2’-OH位被氟修饰

正义链中5’-3’方向的第7、9和11位及其他重要位点的核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰；反义链中5’-3’方向的第2、14和16位及其他重要位点的核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，氟修饰如下：

4)部分或全部2’-OH位被甲氧基或氟修饰

正义链和反义链中核苷酸的戊糖的大部分或全部2’-OH位被甲氧基或氟修饰。

5)末端二个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰

所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰、硼烷化磷酸盐修饰等；优选地，磷酸二酯键的修饰是硫代磷酸修饰，能够使本发明提供的小干扰核酸的稳定性更好，并且基本上不会影响小干扰核酸的活性。硫代磷酸修饰如下：

进一步有选地，本发明提供的包含核苷酸修饰的小干扰核酸选自具有以下修饰核苷酸序列的任一组：如SEQ ID NO.21所示正义链和SEQ ID NO.22所示反义链；或如SEQ IDN O.23所示正义链和SEQ ID NO.24所示反义链；或如SEQ ID NO.25所示正义链和SEQ IDNO.26所示反义链；或如SEQ ID NO.27所示正义链和SEQ ID NO.28所示反义链；或者，

如SEQ ID NO.29所示正义链和SEQ ID NO.30所示反义链；如SEQ ID NO.31所示正义链和SEQ ID NO.32所示反义链；如SEQ ID NO.33所示正义链和SEQ ID NO.34所示反义链；或如SEQ ID NO.35所示正义链和SEQ ID NO.36所示反义链；或如SEQ ID NO. 37所示正义链和SEQ ID NO.38所示反义链；或如SEQ ID NO.39所示正义链和SEQ ID NO.40所示反义链；或者，

如SEQ ID NO.41所示正义链和SEQ ID NO.42所示反义链；或如SEQ ID NO.43所示正义链和SEQ ID NO.44所示反义链；或如SEQ ID NO.45所示正义链和SEQ ID NO. 46所示反义链；或如SEQ ID NO.47所示正义链和SEQ ID NO.48所示反义链；或如SEQ ID NO.49所示正义链和SEQ ID NO.50所示反义链；或如SEQ ID NO.51所示正义链和S EQ ID NO.52所示反义链。

此外，在本发明上文所述小干扰核酸的基础上，末端可引入有助于透膜的基团，包括但不限于胆固醇、蛋白、多肽、高分子、适配体(aptamer)、维生素、叶酸、胆酸、或脂类等亲脂性分子；或以脂质体、高分子、脂类分子或纳米粒包裹以利于干扰核酸与细胞内的mRNA 发生作用。

小干扰核酸(优选siRNA)的化学合成方法是本领域技术人员所公知的，一般来说，所述化学合成的方法包括：(1)寡聚核糖核苷酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐四个步骤。包括但不限于以下方法：设计并获得目标RNA序列后，可在自动DNA/RNA合成仪(例如，AppliedBiosystems EXPEDITE8909)上设定合成1毫摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第n次(19≥n≥2)循环中，在第n-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。将连接有siRNA的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1-5毫升的乙醇/乙胺(体积比为1∶3)，然后密封，置于55-70℃温箱中，孵育2-30小时，取出连接有siRNA的固相支持物并用双蒸水淋洗2-3次(每次约1毫升)，收集洗脱液，并在室温下干燥30-40分钟。然后，加入1-5毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)，室温放置4-12小时，再加入2-5毫升乙醇，收集沉淀即得到siRNA的粗产物。将得到的siRNA的粗产物溶解于2-5毫升浓度为1-5摩尔/毫升的乙酸铵水溶液中，然后通过 C18高压液相色谱进行分离，得到纯化的siRNA产物。用浓度为75重量％的乙醇水溶液洗涤纯化的siRNA产物2-4次(每次2-5毫升)，以除去盐份，并室温下干燥。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)，将此溶液加热至90-95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，并维持室温16-22小时，得到含有siRNA的溶液。

本发明还提供了一种药物组合物，其中，该药物组合物含有本发明提供的小干扰核酸中的至少一种作为活性成分，以及药学上可接受的载体或者辅料。所述药学上可接受的载体或者辅料包括但不限于以下中的一种或多种：药学上可接受的溶剂、分散剂、附加剂、塑形剂、药物辅料。通常，这些物质是无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质。

在本发明的一个方面，所述药物组合物还包括其他化学治疗剂中的一种或几种。

配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括但并不限于：肺部、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明中，所述药物组合物的剂型可以为制药领域中的任意剂型，优选地，所述药物组合物可以为注射液。

本发明还提供了本发明上文所述小干扰核酸在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染药物中的应用。优选地，所述冠状病毒是冠状病毒是新型冠状病毒COVID19；进一步优选地，所述感染是肺部感染。

本发明还提供了治疗/缓解/预防冠状病毒(优选新型冠状病毒COVID19)感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用上文中本发明所述小干扰核酸或其组合物。

具体实施方式

参照以下实施例可以更好地理解本发明。但是，应理解，以下实施例仅用于举例说明目的，而不应被理解为以任何方式限制本发明的保护范围。

实施例1.siRNA的设计与合成

选取Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,complete genome,(NC_045512.2)为 mRNA序列为模板，分别针对新型冠状病毒CoV19不同区，设计siRNA分子。

设计原则：长度选择：本研究通过不同的设计工具，选用多种设计模式，包括但不限于 19nt+dTdT，21nt，21nt+dTdT,以及21nt+2nt序列悬垂的方式进行设计，从而对比不同设计的差异；有些文献报道证明dTdT悬垂可以增强siRNA在细胞培养基和转染细胞内的核酸酶耐受性和稳定性。化学优化的说明：

修饰目的和效果：由于小干扰核酸(siRNA)的稳定性较差，在体内容易被核酸酶降解，因此我们对具有较强活性的siRNA进行化学修饰，以增加siRNA的血清稳定性，从而有效地抑制目的基因的表达。并且该小干扰核酸包含但不限于以下1-5所示方式之一或组合的修饰：

l)戊糖的2’-OH甲氧基修饰:

2)+2碱基悬垂

3)戊糖的2’-OH位被氟修饰

4)大部分或全部2’-OH位被甲氧基或氟修饰

5)末端二个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰

正义链和反义链的5’和3’端二个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰，能够使本发明提供的小干扰核酸的稳定性更好，并且基本上不会影响小干扰核酸的活性。硫代磷酸修饰如下：

化学修饰代码注释

在以下序列代号中，

小写字母m表示该字母m右侧的一个核苷酸的核糖基为2’-羟基被甲氧基取代而成的2’ -甲氧基核糖基；

小写字母f表示该字母f右侧的一个核苷酸的核糖基为2’-羟基被氟取代而成的2’- 氟代核糖基；

小写字母r表示该字母r右侧的一个核苷酸为核糖核苷酸，大写字母表示核苷酸的碱基组成；

*号表示二个核苷酸之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。

例如，在由正义链5’端第1个大写字母C及其左侧的m组成的“mC”表示所含碱基为胞嘧啶、核糖基的2’-羟基被甲氧基取代的核苷酸；由反义链5’端第2个大写字母U及其左侧的f组成的“fU”表示所含碱基为尿嘧啶、核糖基的2’-羟基被氟取代的核苷酸。

siRNA合成方式：

本实验所使用的siRNA由广州锐博、美国IDT和上海生工进行合成和质量确认；其中化学修饰的RNA均从上海生工采购。siRNA采用通用方法合成。

按照从左至右5’端到3’端顺序，设计siRNA分子如表1所示。

表1.新冠病毒siRNA序列

实施例2 siRNA抑制效应的测定

2.1.慢病毒载体的制备

本实施例使用的慢病毒购自南京金斯瑞生物科技有限公司,该慢病毒中插入一段新型冠状病毒(SARS-CoV-2)基因组序列(来源：Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2, complete genome,NC_045512.2)，以及一段EGFP绿色荧光蛋白基因序列同时带有puroR嘌呤霉素抗性筛选基因)。

2.2.稳转Vero-E6细胞系培养

取vero-E6细胞(来源：中国科学院细胞库)按1x10⁵个细胞/孔接种于24孔板中，培养在DMEM+10％胎牛血清(FBS)+1％sodium Pyuvate培养基中，37℃，5％CO2培养箱中过夜。

将实施例2.1中制备的含有新型冠状病毒基因组和EGFP绿色荧光蛋白基因序列的慢病毒溶液按MOI为1、10、100的滴度分别加入到上述24孔板细胞中，孵育6h后弃液，并更换DMEM+10％FBS+1％sodium Pyuvate培养；

培养48小时后，加入含7ug/ml嘌呤霉素的生长培养基(DMEM+10％FBS+1％sodiumPyuvate+7ug/ml Puromycin)，并每三天更换一次培养基，继续培养14天用于细胞筛选。

2.3.siRNA的转染

取构建的稳转Vero-E6细胞系，按1x10⁵个/孔接种于24孔板，于DMEM+10％FBS+1％sodium Pyuvate的培养基中培养，37℃，5％CO2培养箱中，生长过夜后至细胞融合度约为80％。

取实施例1中制备的siRNA干粉5nmol/tube，加250uL DEPC-H2O稀释，从而获得浓度为20pmol/uL的siRNA溶液。用25uL无血清DMEM稀释siRNA，至终浓度分别为3nM、0.3nM和0.03nM；用25uL无血清DMEM对1.5ul RNAiMAX转染试剂进行稀释；将上述siRNA 溶液与稀释的RNAiMAX转染试剂溶液在室温下混合均匀，室温下静置孵育5min后加入到 24孔板细胞中，继续培养48h。

2.4.荧光PCR检测siRNA序列抑制率

通过荧光实时定量PCR分别对实施例2.3中转染siRNA的Vero-E6细胞新型冠状病毒 mRNA进行检测。

细胞转染siRNA后培养48h，倾去96孔板中的培养液，用50ul PBS洗涤细胞一次。利用

Fast Advanced Cells-to-CT^TM Kit试剂盒提取总RNA并逆转录为cDNA，按照表2 体系和条件，取22.5ul裂解样本制备cDNA：

表2

将上述方法制备的cDNA用DEPC水稀释10倍，作为Q-PCR的模板。利用Taqman^TM Fastadvanced Master Mix试剂盒，按表3体系配制10ul/孔的qPCR反应体系，加入到384孔板中进行检测。每个样品设三个复孔，以b-actin基因作为内参，以特异性基因作为报告基因，引物序列见表4，探针序列见表5。

表3.PCR反应体系

表4.引物序列：

表5.探针序列：

实验反应条件如下：

从荧光定量PCR结果来看，相比阴性对照组，siRNA分子均有效降低了新型冠状病毒 mRNA的表达率，且抑制率低于或者相当于阳性对照组(锐博生物，siP0000004-1-5，针对靶基因下游eGFP的阳性参照物)，可见siRNA分子对新型分子的新型冠状病毒mRNA的表达具有明显的抑制效果，见表6。举例说明，其中，LYG-C281在3nM的浓度下实现和阴性对照(0.98)/或者98％比将靶标S protein mRNA抑制到0.15/或者15％的表达水平。

表6.siRNA对mRNA相对表达水平的抑制

实施例3 siRNA的核苷酸修饰

由于小干扰核酸(siRNA)的稳定性较差，在体内容易被核酸酶降解，因此对本发明中具有较强活性的siRNA进行化学修饰，以增加siRNA的血清稳定性。

基于本发明实施例1中所列siRNA核酸序列对siRNA序列核苷酸进行修饰设计，其中，小写字母m表示该字母m右侧的一个核苷酸的核糖基为2’-羟基被甲氧基取代而成的2’-甲氧基核糖基；小写字母f表示该字母f右侧的一个核苷酸的核糖基为2’-羟基被氟取代而成的2’- 氟代核糖基；小写字母r表示该字母r右侧的一个核苷酸为核糖核苷酸，大写字母表示核苷酸的碱基组成；*号表示二个核苷酸之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。例如，在由正义链5’端第1个大写字母C及其左侧的m组成的“mC”表示所含碱基为胞嘧啶、核糖基的2’-羟基被甲氧基取代的核苷酸；由反义链5’端第2个大写字母U及其左侧的f组成的“fU”表示所含碱基为尿嘧啶、核糖基的2’-羟基被氟取代的核苷酸。

通过化学合成方法合成表7中所列siRNA分子：

表7.修饰的siRNA分子

实施例4修饰的siRNA的抑制效果验证

通过荧光定量PCR对修饰的siRNA分子的新型冠状病毒mRNA表达抑制效果进行验证与分析。

取上述构建的稳转Vero-E6细胞系，按1x10⁴个/孔接种于96孔板，于DMEM+10％FBS+1％sodium Pyuvate的培养基中培养，37℃，5％CO2培养箱中生长过夜后至细胞融合度约为80％。

取实施例3制备的修饰siRNA干粉5nmol/tube，加250uL DEPC-H₂O稀释，从而获得浓度为20pmol/uL的siRNA溶液。用25uL opti-MEM培养基稀释siRNA，配置成终浓度分别为3nM、0.3nM和0.03nM或者1nM、0.1nM和0.01nM；用25uL opti-MEM培养基对1.5ul RNAiMAX转染试剂进行稀释；将上述siRNA溶液与稀释的RNAiMAX转染试剂溶液在室温下等体积混合均匀，室温下静置孵育5min后加入10uL到96孔板细胞中，继续培养48h。按照上述实施例2.4所述荧光定量PCR所述方法对本发明中修饰的各siRNA的新型分子的新型冠状病毒mRNA表达抑制效果进行验证与分析。其中以b-actin基因作为内参，以EGFP 基因或特异性基因作为报告基因，引物序列见表8，探针序列见表9。结果见表10-表11。举例说明，其中，LYG-C461在1nM的浓度下实现和阴性对照1.0(100％)比将靶标EndoRNase mRNA抑制到0.24(24％)的表达水平。

从荧光定量PCR结果来看，相比阴性对照组，修饰的siRNA分子均有效降低了新型冠状病毒mRNA的表达率，且抑制率低于或者相当于阳性对照组(锐博生物，siP0000004-1-5，针对靶基因下游eGFP的阳性参照物)，可见修饰后siRNA分子对新型分子的新型冠状病毒 mRNA的表达具有明显的抑制效果。

表8.引物序列：

表9.探针序列：

表10.化学修饰siRNA对mRNA相对表达的抑制

表11.化学修饰siRNA对mRNA相对表达的抑制

Claims

1.一种能够抑制新型冠状病毒COVID19表达的小干扰核酸分子，其特征在于，所述小干扰核酸分子包含正义链和反义链，其中正义链包含选自以下序列中至少连续16个与新型冠状病毒mRNA相同的核苷酸序列：如SEQ ID NO.1/3/5/7中任一所示。

2.根据权利要求1所述小干扰核酸分子，其中，所述小干扰核酸分子是具有以下所述序列的任一组的分子：

如SEQ ID NO.1所示正义链和SEQ ID NO.2所示反义链；或如SEQ ID NO.3所示正义链和SEQ ID NO.4所示反义链；或如SEQ ID NO.5所示正义链和SEQ ID NO.6所示反义链；或如SEQ ID NO.7所示正义链和SEQ ID NO.8所示反义链。

3.根据权利要求1或2所述小干扰核酸分子，其中，该小干扰核酸分子的核苷酸包含但并不限于有以下一种或多种核苷酸的修饰：

1)正义链和反义链向5’端或3’端延伸2个核苷酸达到21碱基+2碱基悬垂；

2)正义链中5’-3’方向的第7、9和11位及其他重要位点的核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰；

3)反义链中5’-3’方向的第2、14和16位及其他重要位点的核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰；

4)正义链和反义链中核苷酸的戊糖的大部分或全部2’-OH位被甲氧基或氟修饰；

5)正义链和反义链中的胞嘧啶(C)核苷酸和尿嘧啶(U)核苷酸的戊糖的2’-OH位被甲氧基修饰；

6)正义链和反义链的5’和3’端二个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰。

4.根据权利要求3所述小干扰核酸分子，其中，该小干扰核酸分子是具有以下所述修饰的核酸序列的任一组的分子：

如SEQ ID NO.21所示正义链和SEQ ID NO.22所示反义链；或如SEQ ID NO.23所示正义链和SEQ ID NO.24所示反义链；或如SEQ ID NO.25所示正义链和SEQ ID NO.26所示反义链；或如SEQ ID NO.27所示正义链和SEQ ID NO.28所示反义链。

5.一种小干扰核酸分子，其中，该小干扰核酸分子是具有以下所述修饰的核酸序列的任一组的分子：

如SEQ ID NO.29所示正义链和SEQ ID NO.30所示反义链；如SEQ ID NO.31所示正义链和SEQ ID NO.32所示反义链；如SEQ ID NO.33所示正义链和SEQ ID NO.34所示反义链；或如SEQ ID NO.35所示正义链和SEQ ID NO.36所示反义链；或如SEQ ID NO.37所示正义链和SEQ ID NO.38所示反义链；或如SEQ ID NO.39所示正义链和SEQ ID NO.40所示反义链；或如SEQ ID NO.41所示正义链和SEQ ID NO.42所示反义链；或如SEQ ID NO.43所示正义链和SEQ ID NO.44所示反义链；或如SEQ ID NO.45所示正义链和SEQ ID NO.46所示反义链；或如SEQ ID NO.47所示正义链和SEQ ID NO.48所示反义链；或如SEQ ID NO.49所示正义链和SEQ ID NO.50所示反义链；或如SEQ ID NO.51所示正义链和SEQ ID NO.52所示反义链。

6.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求1-5中任一项所述的小干扰核酸分子作为活性成分。

7.根据权利要求6所述药物组合物，其中，该药物组合物还包含药学可接受的载体和/或辅料。

8.权利要求1-5任一项所述小干扰核酸分子在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染药物中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其中冠状病毒是新型冠状病毒COVID19。

10.根据权利要求9所述应用，其中，所述感染是肺部感染。