CN104830862A - 一种抗乙型肝炎病毒的脱氧核酶10-23及其应用 - Google Patents
一种抗乙型肝炎病毒的脱氧核酶10-23及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗乙型肝炎病毒脱氧核酶 10-23及其在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用，是以乙型肝炎病毒S基因保守序列为靶点，能够在细胞外特异性地有效切割HBV S基因mRNA，并在细胞中显著抑制HBV S基因复制及表达。本发明具有高特异性、高稳定性、高效性、低毒性、低成本等优点，为治疗乙型肝炎提供新途径。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种抗乙型肝炎病毒的脱氧核酶及其制备方法和应用。
背景技术
乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染性疾病，该病由一种嗜肝细胞的小包膜DNA 病毒——乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）引发，持续性病毒感染会导致肝脏损伤、肝硬化以及原发性肝细胞癌。全球约1/2的人生活在HBV 高流行区，众多HBV慢性感染者正面临着肝病所致的死亡风险，每年有数百万患者死于HBV相关的肝硬化和肝癌。
我国属于HBV高流行区，估计人群HBsAg阳性率约10％，即我国乙型肝炎病毒携带者接近1亿多人，慢性乙型肝炎现症患者超过3000万人，每年与HBV相关的肝硬化和肝癌死者达数十万。因此，HBV 感染已成为我国严重的公共卫生问题之一。
目前针对HBV感染的常规疗法大多依赖化学制剂或细胞因子等，但存在转阴率低、对人体毒性较大、易产生抗药性等当前乙肝治疗药物的普遍缺点。例如，干扰素a只对一小部分HBV感染者有疗效，而核苷类似物虽能通过抑制HBV复制发挥明显的抗HBV作用，但是可能诱发病毒变异及停药后反弹，从而无法达到令人满意的疗效。虽然许多国家已相继开发出针对HBV感染具有良好预防作用的乙肝疫苗，但对于已感染HBV的机体却难以发挥治疗和清除病毒的作用。因此，发展一种新型抗病毒药物已成为迫切需要。
近年来随着体外分子进化技术（SELEX）的发展，人们发现，除了RNA分子以外，某些序列独特的单链小分子DNA也具备酶的活性，称之为脱氧核酶（Deoxyribozyme, DRz）。它可通过碱基互补配对特异性结合并在特定位点裂解靶RNA 分子，同时又可能具有类似反义脱氧寡核苷酸（ASODN）对靶RNA的反义抑制活性，因此在基因调控和抗病毒治疗方面的潜在应用价值受到人们的广泛关注。
脱氧核酶10-23（DRz10-23）是Santoro等从1014个随机序列中通过体外PCR 筛选法获得的第10轮循环的第23个克隆，并因之而得名。该酶活性中心由15个脱氧核糖核苷酸组成，其5′末端第8个碱基可以是T、C或A ,以T 活性最高，其余序列高度保守。脱氧核酶DRz活性中心两侧的碱基序列一般长7-9nts，必须与靶RNA碱基序列互补配对，从而保证DRz对靶RNA切割的特异性。
HBV基因组全长3.2kb，包括四个开放阅读框，分别编码核心抗原（C）、表面抗原（S）、聚合酶（P）以及X 蛋白。HBV各基因转录产物RNA同时为病毒复制和蛋白翻译所必需，且HBV基因组高度重叠，因此在RNA水平阻断HBV各蛋白的表达具有一举两得的优势。
脱氧核酶10-23的酶动力学研究表明，其催化效率比发夹型核酶及锤头型核酶的催化效率更高。由于脱氧核酶10-23在靶底物上识别的剪切位点为5′…R↓Y…3′(其中R = A/G，Y = U/C)，该位点在RNA分子中广泛存在，包括病毒RNA翻译起始密码子A/UG在内可能均是良好的剪切靶位，因此较Rz有更多的剪切位点可供选择。除此之外，化学性质相对稳定、分子量相对小、不易受核酸酶降解、在技术上易于制备且成本较低以及脱氧核酶与靶RNA 形成的DNA-RNA杂交分子较易解离等特点均成为脱氧核酶应用于基因治疗等方面的优势。
脱氧核酶10-23作为一种潜在的强有力的RNA特异性切割工具，无论是在体外应用于RNA限制性内切酶，还是在体内作为RNA水平上的基因失活剂，均具有很好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于通过对乙型肝炎病毒S基因保守序列为靶点进行研究，提供一种靶向治疗乙型肝炎的脱氧核酶10-23及其在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种抗乙型肝炎病毒脱氧核酶10-23，其序列为5'-GTCCAGAAGAAGGCTAGCTACAACGACAACAAGAA-3'，其中G为鸟嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，A为腺嘌呤核苷酸单体；下划线所示为脱氧核酶10-23的催化核心序列。
核苷酸单体中的碱基为鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或腺嘌呤。
本发明同时提供脱氧核酶10-23在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用。
本发明通过实验研究脱氧核酶10-23对HBV S基因表达的影响，结果显示脱氧核酶10-23在细胞外能特异性地高效切割HBV S基因mRNA，从而抑制HBV S基因表达。根据以上实验结果，本发明提供了上述脱氧核酶在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用。
本发明所涉及的脱氧核酶具有如下优点：以乙型肝炎病毒重要基因——表面抗原基因（S基因）保守序列为靶点，具有高特异性、高稳定性、高效性、低毒性、低成本等优点。
附图说明
图1为HBV全基因组PCR扩增结果；
图2为HBV S基因PCR扩增结果；
图3为重组质粒pUC18-HBV-S双酶切鉴定结果；
图4为HBV S基因测序结果；
图5为HBV S基因体外转录产物电泳结果；
图6为脱氧核酶10-23体外切割HBV S基因mRNA电泳结果。
具体实施方式
本发明以乙型肝炎病毒S基因保守序列为靶点，设计并合成特异性靶向乙型肝炎病毒S基因mRNA的脱氧核酶10-23，通过细胞外切割实验，探讨脱氧核酶10-23对乙型肝炎病毒S基因mRNA的切割效果，并最终获得能够高效特异切割乙型肝炎病毒S基因mRNA的脱氧核酶10-23。脱氧核酶10-23作为一种强有力的RNA特异性切割工具，不仅能够从RNA水平阻断乙型肝炎病毒S基因表达为表面抗原，干扰病毒进入细胞；同时还可通过切断病毒前基因组RNA而达到抑制HBV DNA复制的目的，从而可制备成为特异性抗乙型肝炎病毒的基因药物，为靶向治疗乙型肝炎提供新型工具。
以下阐述本发明涉及的脱氧核酶10-23具体实施例。
实施例1：设计并合成抗乙型肝炎病毒的脱氧核酶10-23
根据序列比对，选取乙型肝炎病毒（C基因型）S基因中的保守序列作为切割靶点，设计并合成针对乙型肝炎病毒S基因mRNA的脱氧核酶10-23。
本发明中设计并合成的脱氧核酶10-23为单链脱氧核糖核酸，长度35个碱基，其序列为：5'-GTCCAGAAGAAGGCTAGCTACAACGACAACAAGAA-3'，其中G为鸟嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，A为腺嘌呤核苷酸单体；序列栏中下划线代表脱氧核酶10-23的催化核心序列。
实施例2：利用体外转录系统获取含乙型肝炎病毒S基因的mRNA
按病毒DNA抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）操作说明书从乙肝大三阳病人血清中提取HBV 基因组DNA，如图1所示，其中1：DNA marker；2：HBV全基因组。
根据GenBank登录的乙型肝炎病毒（C基因型）S基因mRNA编码序列设计上、下游引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
上游引物：5'-GGGGTCGACTAATACGACTCACTATAGGGTAAACCC TGTTCCGACTACTG-3'，上游引物中下划线代表T7启动子序列。
下游引物：5'-CCCGAATTCAGAGGAGCCACA AAGGTTCCAC-3'。
以HBV基因组DNA为模板进行PCR反应获取S基因，如图2所示，其中1：DNA marker；2：HBV S基因PCR产物。
PCR产物进行胶回收（SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司）后，利用限制性核酸内切酶SalI/EcoRI（购自TaKaRa公司）进行双酶切，克隆入pUC18载体，构建pUC18-HBV-S重组质粒。双酶切鉴定（如图3所示，其中1：DNA marker；2：HBV S基因PCR产物；3：pUC18质粒单酶切；4：pUC18-HBV-S重组质粒双酶切），无误后测序验证如图4所示。EcoRI线性化后，利用T7体外转录试剂盒（购自TaKaRa公司）进行体外转录获得HBV S 基因mRNA（如图5所示，其中1：RNA marker；2：HBV S基因体外转录产物），可用于后续切割实验。
结论：成功获取HBV S 基因mRNA。
实施例3：脱氧核酶10-23细胞外对HBV S基因mRNA切割效果的观察
将上述体外转录获得的HBV S 基因mRNA与特异性脱氧核酶DRz10-23 在1M MgCl2、1M Tris-HCl（pH7.5）条件下于37℃共浴30分钟，1.5%变性琼脂糖凝胶电泳分离。
结果：细胞外切割体系在相应位置出现明显特异性切割产物条带，未加脱氧核酶10-23的阴性对照与加反义脱氧寡核苷酸ASODN的对照均未出现切割产物条带（如图6所示，其中1：RNA marker；2：空白对照；3：DRz切割HBV S基因mRNA；4:ASODN对照）。
结论：脱氧核酶10-23能特异切割HBV S 基因mRNA，阻断S 基因mRNA表达成为表面抗原，可用于抗乙型肝炎病毒感染。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (3)
1.一种抗乙型肝炎病毒的脱氧核酶10-23，其特征在于，所述脱氧核酶DRz10-23序列为5'-GTCCAGAAGAAGGCTAGCTACAACGACAACAAGAA-3'，其中G为鸟嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，A为腺嘌呤核苷酸单体；下划线所示为脱氧核酶10-23的催化核心序列。
2.根据权利要求1所述一种抗乙型肝炎病毒的脱氧核酶10-23，其特征在于：所述核苷酸单体中的碱基为鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或腺嘌呤。
3.权利要求1所述脱氧核酶10-23在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用。
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