CN104293790A - 一种抗MRSA群体感应agr系统反义脱氧核酶的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种反义抗菌脱氧核酶——DNAzyme23。本发明的反义抗菌脱氧核酶以金黄色葡萄球菌群体感应agr系统效应分子RNAIII为靶点，不影响细菌生长状态，能够有效阻断agr信号通路、显著减弱细菌毒力，尤其可以显著减弱耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的致病力。具有高特异性、低毒、安全、不易诱导细菌耐药性的增加等优点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种抑制MRSA群体感应agr系统的反义抗菌脱氧核酶及其制备方法和应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌与多种人类感染性疾病密切相关，如皮肤感染、呼吸道感染、甚至包括威胁生命的坏死性肌膜炎、坏死性肺炎等。目前治疗MRSA最有效的药物是万古霉素，然而随着耐万古霉素MRSA的出现，人们即将面临无药可用的境地，因此寻找新的特异性抗MRSA感染的新靶点及新策略成为细菌感染治疗领域的研究热点和难点。
人类滥用抗生素是导致细菌发生耐药的最主要原因之一，在持续的抗生素选择性压力作用下，细菌耐药是一个必然发生的事件，每一种新的抗生素一经问世，很快便会产生耐药。探索和研制不易诱导细菌产生耐药的抗菌新策略和新药物是当今世界各国科学家必须面对的紧迫研究课题。群体感应系统是广泛存在于细菌内的一种群体行为调控机制，它不仅控制细菌间的信息交流和细菌的多种生命活动，而且也是致病菌生物被膜形成、毒力因子释放、致病力大小，以及耐药性发生的重要调控系统。
agr是金黄色葡萄球菌主要的群体感应系统，控制着许多毒力基因的表达，与细菌的致病力密切相关。agr是一个双组份信号系统，由AgrA，AgrB，AgrC，AgrD及效应分子RNAIII构成。RNAIII是一个具有复杂二级结构的调节性RNA，在不同的葡萄球菌中RNAIII的结构高度保守。RNAIII一方面编码26个氨基酸的δ-溶血素，另一方面能够调节个别胞外蛋白和多功能调节子的转录。
反义抗菌剂突破以细菌蛋白为靶点的经典研究思路，以细菌体内致病、耐药、群体感应等相关基因为靶点，从阻断相关基因的表达入手，进而达到抑制或杀灭细菌的作用，为抗耐药菌治疗带来了新的希望。与经典的抗生素相比较，反义抗菌剂具备以下突出的优点：一、以细菌基因为靶点，特异性高；二、靶点明确，研发成本低，只需知道基因序列就可得到相应的反义药物；三、生产成本低，用常规的寡核苷酸合成技术就能合成。因而反义抗菌剂被认为是抗耐药菌感染最有希望的突破口，代表着21世纪分子治疗领域革命性的进展。
10-23型脱氧核酶能在RNA的A-U位点切割，可切割任何mRNA的起始密码AUG，从而调控蛋白质的表达。10-23型脱氧核酶是一种潜在的强有力的RNA特异性切割工具，在体外可应用于RNA限制性内切酶，在生物系统内，可在RNA水平上阻断靶基因表达。
发明内容
本发明的目的在于通过对MRSA群体感应agr系统效应分子RNAIII mRNA为靶点进行研究，提供一种反义脱氧核酶抗金黄色葡萄球菌agr系统的应用。
本发明的目的是这样实现的：
一种反义抗菌脱氧核酶DNAzyme23，序列为5'-TTAAACAACTCAGGCTAGCTACAACGACAA-3'，其中A为腺嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，G为鸟嘌呤核苷酸单体；下划线所示序列为10-23型脱氧核酶的催化核心；所有核苷酸均进行硫代修饰。
本发明通过试验研究DNAzyme23对MRSA菌株(LAC)群体感应agr系统效应分子RNAIII的影响，结果显示DNAzyme23能浓度依赖性地抑制靶基因RNAⅢ的表达、显著降低α-toxin的分泌。另外，功能学实验表明，DNAzyme23处理组的细菌培养上清对兔红细胞的裂解，与对照组相比明显降低。根据这些试验结果，本发明提供了上述反义抗菌脱氧核酶在制备抗耐药菌的药物中的应用。优选所述的耐药菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
本发明所涉及的反义抗菌脱氧核酶具有如下优点和显著的进步：以金黄色葡萄球菌agr群体感应系统RNAIII效应分子为靶点，具有高特异性、低毒、安全、不易诱导细菌耐药性的增加等优点。能够有效阻断agr信号通路、并减弱细菌毒力。具体表现在：RT-PCR法检测发现，DNAzyme23能剂量依赖性地抑制LAC菌株RNAIII基因的表达；Western blot显示DNAzyme23能够显著降低α-toxin的分泌。
附图说明
图1DNAzyme对RNAIII表达变化的影响柱状图；***P<0.001vs.control。
图2DNAzyme23对α-toxin表达的影响柱状图；*P<0.05vs.control；**P<0.01vs.control；***P<0.001vs.control。
图3DNAzyme23对溶血素分泌的影响柱状图；*P<0.05vs.control；***P<0.001vs.control。
具体实施方式
本发明以金黄色葡萄球菌agr群体感应系统效应分子RNAIII为靶点，设计并合成特异性靶向RNAIII mRNA的脱氧核酶(deoxyribozyme,DNAzyme)，通过细菌最小抑菌浓度测定、RNAIII和α-toxin表达水平及溶血素分泌实验，探讨脱氧核酶抑制金黄色葡萄球菌感染的效果，并最终筛选出效果显著的DNAzyme23，其可制备成为特异性降低MRSA致病力的新型药物——反义抗菌剂，为MRSA感染的防治寻找出了新的突破口。
以下是本发明涉及的DNAzyme的筛选实施例及DNAzyme23的效果试验例。
实施例1 设计、合成并筛选抗金葡菌RNAIII mRNA的DNAzyme
⑴筛选RNAIII mRNA的有效靶点，设计特异高效的DNAzyme：采用RNA Structure4.5软件详细分析RNAIII mRNA的序列并预测其二级结构，以30个碱基为DNAzyme基本长度，在非保守序列区、非折叠区选择有效靶点，筛选出最优的7条DNAzyme(见表1)。
表1 针对RNAIII mRNA设计的脱氧核酶(DNAzyme)
注：序列栏中下划线代表DNAzyme的催化活性中心。
实施例2 DNAzyme对LAC的最小抑菌浓度研究
以微孔板MIC测定方法作为有效抑菌反义靶位筛选的方法。发明人首先对7条抗RNAIIIDNAzyme序列(anti-RNAIII DNAzyme 23、70、72、105、109、232-1和232-2)对LAC的MIC进行测定，结果显示7条DNAzyme均不具有抗菌活性(见表2)。
表2 DNAzyme对LAC的最小抑菌浓度(MIC)
实施例3 RT-PCR检测DNAzyme对RNAIII表达变化的影响
将新鲜过夜培养的菌液转种于营养肉汤培养基中，35℃、210rpm培养至对数生长中期，向培养液中加入不同浓度的DNAzyme23，共孵育6h。培养结束后收集细菌，Trizol法提取细菌总RNA，反转录获得cDNA作为反应模板，RT反应条件：37℃、60min，冰浴后进行PCR。PCR反应条件：95℃预变性2min，95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环。PCR引物：5’-TTCAATGGCACAAGAT-3’和5’-GTCCAAGGAAACTAAC-3’。图1结果显示7条反义脱氧核酶中DNAzyme23、DNAzyme72、DNAzyme232-1三条序列能明显抑制RNAIII基因的表达，其中DNAzyme23效果最优。
实施例4 Western blot检测DNAzyme23对α-toxin表达的影响
将新鲜过夜培养的菌液转种于营养肉汤培养基中，35℃、210rpm培养至对数生长中期，向培养液中加入不同浓度的DNAzyme23，共孵育6h。培养结束后收集细菌，取40μl收集的细菌上清与10μl 5×蛋白上样缓冲液混合，100℃煮沸10min。进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、丽春红预染，根据蛋白Marker和目的蛋白所处的位置将30-50KD区域裁剪下来。将膜用含5％脱脂奶粉的TBS室温封闭1h后；一抗4℃孵育过夜；次日将膜放入二抗稀释液中，室温孵育2h后检测。图2结果显示DNAzyme23能浓度依赖性的抑制α-toxin的表达。
实施例5 溶血试验检测DNAzyme23对溶血素分泌的影响
制备4％的兔红细胞悬液，加入不同浓度的DNAzyme组和PBS空白对照组，置于37℃水浴锅30min。以50μl 2％的Triton-100作为100％溶血阳性对照，以50μl PBS作为0％溶血阴性对照。30min后，120g、离心7min，将各组上清转移到干净的96孔板中，用酶标仪测每孔的A545nm。按公式：溶血率(％)＝(药物组-PBS)/(2％Triton-100-PBS)×100％计算各组溶血率。图3结果显示，DNAzyme23处理后，金葡菌上清中溶血素的分泌受到了明显的抑制且呈浓度依赖性。
Claims (4)
1.一种反义抗菌脱氧核酶DNAzyme23，序列为5'-TTAAACAACTCAGGCTAGCTACAACGACAA-3'，其中A为腺嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，G为鸟嘌呤核苷酸单体；下划线所示序列为10-23型脱氧核酶的催化核心；所有核苷酸均进行硫代修饰。
2.根据权利要求1所述反义抗菌脱氧核酶，其特征在于：核苷酸单体中的碱基为鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶。
3.权利要求1所述反义抗菌脱氧核酶在制备抗耐药菌的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的耐药菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
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