CN101914538A

CN101914538A - 一种促进肿瘤细胞凋亡的脱氧核酶

Info

Publication number: CN101914538A
Application number: CN 201010246035
Authority: CN
Inventors: 孙仑泉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-08-03
Filing date: 2010-08-03
Publication date: 2010-12-15

Abstract

本发明公开了一种促进肿瘤细胞凋亡的脱氧核酶，包含：一具有催化功能的脱氧核苷酸序列5’-GGCTAGCTACAACGA-3’；分别连接催化功能序列5’端和3’端的第一和第二结合序列，分别由7-12个核苷酸组成，互补于bcl-2家族中细胞凋亡抑制基因mRNA或pre-mRNA的R*Y切割位点的3’端和5’端序列。本发明的脱氧核酶通过特异性识别并切割凋亡抑制基因的mRNA或pre-mRNA，降低凋亡抑制基因的表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤的生长。

Description

一种促进肿瘤细胞凋亡的脱氧核酶

技术领域

本发明涉及一类靶向肿瘤细胞凋亡基因家族的脱氧核酶，具体地说涉及一类可抑制bcl家族基因表达，促进肿瘤细胞凋亡的脱氧核酶。

背景技术

细胞凋亡是一种机体发育、应急和清除变异细胞等的重要生理过程。这一过程的异常可导致机体发生许多病理改变，包括肿瘤、病毒感染、神经性疾病等。细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶(caspase)，一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。细胞凋亡的调控涉及许多基因产物，包括ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。

bcl-2为凋亡抑制基因，编码膜整合蛋白，现已发现至少19个同源物，统称为bcl-2家族，它们在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用，能控制线粒体中细胞色素C等凋亡因子的释放。Bcl-2家族成员都含有1-4个Bcl-2同源结构域(BH1-4)，并且通常有一个羧端跨膜结构域(transmembrane region，TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域，BH3是与促进凋亡有关的结构域。根据功能和结构可将Bcl-2家族分为两类：一类是抗凋亡的(anti-apoptotic)，如：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1；一类是促进凋亡的(pro-apoptotic)，如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim。在促凋亡蛋白中还有一类仅含BH3结构域的，如Bid、Bad。虽然Bcl-2蛋白存在于线粒体膜、内质网膜以及外核膜上，但主要定位于线粒体外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。而大多数促凋亡蛋白则主要定位于细胞质，一旦细胞受到凋亡因子的诱导，它们可以向线粒体转位，通过寡聚化在线粒体外膜形成跨膜通道，或者开启线粒体的PT孔，从而导致线粒体中的细胞色素C的释放，激活caspases，导致细胞凋亡。研究表明，许多肿瘤均出现细胞凋亡的失调，并伴随着抗凋亡基因的高表达，导致肿瘤细胞过度生长。特异性地抑制抗凋亡基因表达可达到抑制肿瘤生长的效果。

脱氧核酶(deoxyribozyme，又称DNAzyme)是利用体外分子进化技术获得的一种具有催化功能的短片段单链DNA，具有高效的催化活性和结构识别能力。脱氧核酶将高效的催化降解能力与反义的靶向识别能力结合，能够特异地针对靶标从mRNA水平关闭靶基因，从而调控目标蛋白质的表达，是一种高效特异的靶向基因治疗的新策略。脱氧核酶独特的化学本质为脱氧寡核苷酸，性质相对稳定；分子量小，结构相对简单，对底物的趋近性好；催化效率及特异性高，副作用低；靶位点选择的限制更少；易于合成，价格低廉。研究表明，与其他几种从mRNA水平关闭致病基因的方法相比，脱氧核酶能够特异地针对靶标从mRNA水平关闭靶基因，是一种高效的靶向基因治疗的新的策略，并已在抗病毒及抗肿瘤等领域广泛应用。利用脱氧核酶抑制疾病相关基因，例如，癌基因和抗细胞凋亡基因，是一种新型的靶向治疗肿瘤的手段。

发明内容

本发明的目的是提供一类有效的通过诱导细胞凋亡治疗肿瘤的靶向药物。

本发明的脱氧核酶是通过下调bcl-2家族中细胞凋亡抑制基因的表达以促进肿瘤细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的生长。脱氧核酶是一种新型的基因抑制剂，其具有反义寡核苷酸的化学稳定性，同时又具有核酶的催化切割RNA的功能，且其合成费用很低。基于这些独特的优点，该技术已被广泛用于体内和体外的基因调控(Sun等pharmacol.Rev.52(3)：325-347)。

本发明的促进肿瘤细胞凋亡的脱氧核酶，特征是包含：

一催化功能序列，为脱氧核苷酸序列5’-GGCTAGCTACAACGA-3’；

连接催化功能序列5’端的第一结合序列，由7-12个核苷酸组成，互补于bcl-2家族中细胞凋亡抑制基因mRNA或pre-mRNA的R*Y切割位点的3’端序列，其中*代表切割点，R代表A或G，Y代表U或C；和

连接催化功能序列3’端的第二结合序列，由7-12个核苷酸组成，互补于bcl-2家族中细胞凋亡抑制基因mRNA或pre-mRNA的R*Y切割位点的5’端序列。

所述脱氧核酶是一种DNA分子，可特异性地识别并切割靶mRNA或pre-mRNA中任一嘌呤核苷酸与嘧啶核苷酸的连接键，其结构和作用机制如图1所示。其中N＝G，U，C或A；R*Y为切割位点；R＝A或G；Y＝U或C；5’端结合序列(即上述第一结合序列)互补于包括所述Y在内的切割位点的3’端序列；3’端结合序列(即上述第二结合序列)互补于不包括所述R在内的切割位点的5’端序列。

本发明脱氧核酶靶向的bcl-2家族基因包括Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-w，Bfl-1，brag-1，Mcl-1，A1等细胞凋亡抑制基因。Bcl-2家族基因的异常表达可引起细胞高度增殖和凋亡受阻。对Bcl-2家族基因表达的抑制可促进肿瘤细胞的凋亡。首选的靶基因为Bcl-2和Bcl-xL。代表性的脱氧核酶序列如表1和表2所列。

本发明的脱氧核酶一般由29～39核苷酸组成，自5’到3’的方向由磷酸二酯键连接。为增强脱氧核酶的稳定性，可对其结合序列中的磷酸二酯键进行化学修饰以提高脱氧核酶的抗酸和抗酶降解的能力，例如采用硫代磷酸二酯键，使所述第一结合序列和/或第二结合序列各含有1-6个硫代磷酸二酯键。采用锁核酸(Locked nucleic acids，LNA)和肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)形式的修饰也能够提高脱氧核酶的稳定性。此外，脱氧核酶稳定性的增强还可以通过对结合序列进行其他化学修饰实现，包括：

1)对碱基、糖基的修饰和主干结构的修饰。对碱基的修饰，例如：甲基化碱基、羟甲基化碱基等。对糖基的修饰，例如2’位、3’位取代的核糖核酸或脱氧核糖核酸。核糖基和单核苷酸之间的连接键称为核酸的主干结构。对主干结构的修饰包括连接键以及其它可以增强稳定性和亲和性的修饰，例如，对糖基结构的修饰。具体的例子有，在碱基相对于天然右旋异构体糖为反向时，可使用左旋(L-)异构体脱氧核糖；或将糖基的2’-羟基用2’-卤素元素，’-O-烷基，2’-O-烷基-n(O-烷基)取代；或者使用下列连接键：2’-O-甲基磷酸二酯键。本发明的脱氧核酶可具有部分修饰，或全部修饰，或是不同修饰的组合。优选的是2’-O-甲基修饰。

2)末端保护：在分子的末端加入保护基因，以防止分子的降解。这种保护可以是5’端，也可以是3’端，或是两端均被保护。例如，在末端反向连接核苷酸残基；末端核苷酸为双脱氧核苷酸；末端肽键连接；在末端核苷酸的糖基2’或3’位添加甲磷酸基、烷基、芳基，虫草素(cordycepin)、阿糖胞苷(cytosine arabanoside)、烷氧基(如甲氧基、乙氧基等)、荧光素、二氮苯基、胆固醇、生物素、吖啶(acridine)、罗丹明补骨脂素(rhodamine psoralen)、甘油基(glyceryl)、丁醇基、丁基或已醇基。优选的是在3’端3’-3’反向连接。

靶向bcl-2家族基因的脱氧核酶的设计方法是：通过分析靶基因的mRNA序列，筛选出AU和GU位点，进一步分析位点区域的自由能水平，选出-AG°-25kcal/mol的靶向位点。针对这些位点设计出对应的脱氧核酶。应用DNA合成仪器，合成所设计的脱氧核酶，并进行体外切割实验，获得具有高切割活性的脱氧核酶。

脱氧核酶的生物学活性可以利用肿瘤细胞模型进行实验验证。实验指标包括，Western blots分析验证对靶基因表达的抑制；采用流式细胞仪分析脱氧核酶对肿瘤细胞凋亡的促进；Westernblots分析验证脱氧核酶对细胞色素C释放的促进。实验证明，本发明的脱氧核酶能特异性识别和抑制靶基因的表达，诱导肿瘤细胞凋亡，从而能够应用于制备治疗肿瘤的靶向药物。

附图说明

图1是脱氧核酶的结构和作用机制示意图。

图2显示了靶向Bcl-2的脱氧核酶在前列腺癌细胞PC3(A)和膀胱癌细胞T24(B)中对Bcl-2表达的抑制作用。

图3显示了靶向Bcl-xL的脱氧核酶在前列腺癌细胞PC3(A)、膀胱癌细胞T24(B)、肺癌细胞A549(C)、结肠癌细胞HCT116(D)中对Bcl-xL表达的抑制作用，其中：Cells指未对细胞进行转染的情况；TMP指只用转染试剂TMP转染细胞的情况；ctrl指无关对照；DT882等指利用转染试剂TMP用2mM浓度的脱氧核酶转染细胞的情况。

具体实施方式

以下通过实施例进一步详细描述本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。如表1、表2中所列的脱氧核酶序列为代表性的分子，任何其它靶向bcl-2家族中细胞凋亡抑制基因的脱氧核酶，均可用于制备治疗肿瘤的靶向药物。

实施例1：靶向bcl-2和bcl-xL mRNA脱氧核酶切割位点的分析与筛选

Bcl-2和Bcl-xL在许多肿瘤中均为高表达，抑制Bcl-2或Bcl-xL表达可促进肿瘤细胞凋亡。

本实施例中，用于脱氧核酶设计的Bcl-2的cDNA克隆包含31bp的5’UTR，720bp的ORF，2.2kb的3’UTR序列。通过对bcl-2mRNA的扫描，鉴定出141潜在的AU和GU切割位点。在这些切割位点5’端取9个核苷酸(不包括切割位点R*Y处的R)和3’端取9个核苷酸(包括切割位点R*Y处的Y)组成序列，对该序列进行酶-底物复合物热动力学稳定性分析(-ΔG°kcal/mol)，获得每个位点处序列的杂交自由能。进一步分析获得了Tm值，以确保脱氧核酶不形成分子内结构。通过以上分析，基于-25kcal/mol为筛选参数，共产生55个靶向位点。针对这些位点，设计了55个脱氧核酶，并对脱氧核酶的活性进行体外切割能力的评价。根据体外活性，挑选出26个脱氧核酶，并对其进行了化学修饰(在最5’端和最3’端，分别引入3个硫代磷酸二酯键；3’端引入一个反向连接的T)。将26个靶向bcl-2的脱氧核酶分别转染至细胞，提取细胞蛋白，利用Western blot分析脱氧核酶对bcl-2表达的抑制效应。结果发现，26个脱氧核酶中有8个具有显著的抑制靶基因表达的活性。以上结果总结于表1。

表1.靶向bcl-2的脱氧核酶的设计分析结果

本实施例中，用于脱氧核酶设计的Bcl-xL的cDNA克隆包含926bp核苷酸。通过对bcl-xL mRNA的扫描，鉴定出81个潜在的AU和GU切割位点。在这些切割位点5’端取9个核苷酸(不包括切割位点R*Y处的R)和3’端取9个核苷酸(包括切割位点R*Y处的Y)组成序列，对该序列进行酶-底物复合物热动力学稳定性分析(-ΔG°kcal/mol)，获得每个位点处序列的杂交自由能。进一步分析获得了Tm值，以确保脱氧核酶不形成分子内结构。通过以上分析，基于-25kcal/mol为筛选参数，共产生26个靶向位点。针对这些位点，设计了26个脱氧核酶，并对脱氧核酶的活性进行体外切割能力的评价。根据体外活性，挑选出11个脱氧核酶，并对其进行了化学修饰(在最5’端和最3’端，分别引入3个硫代磷酸二酯键；3’端引入一个反向连接的T)。将11个靶向bcl-2的脱氧核酶分别转染至细胞，提取细胞蛋白，利用Western blot分析脱氧核酶对bcl-2表达的抑制效应。结果发现，11个脱氧核酶中有4个具有显著的抑制靶基因表达的活性。以上结果总结于表2。

表2.靶向bcl-xL的脱氧核酶的设计分析结果

实施例2：脱氧核酶对肿瘤细胞bcl-2表达的抑制作用

Bcl-2和Bcl-xL在许多肿瘤中均表现为高表达。为了验证体外筛选出的脱氧核酶在细胞中的活性，我们选择了体外活性较高的靶向Bcl-2的脱氧核酶，利用转染试剂TMP，以2mM脱氧核酶的浓度转染不同的肿瘤细胞。24小时后，提取细胞蛋白进行Western Blot分析。图2显示结果表明，靶向Bcl-2的脱氧核酶DT895、DT899、DT908、DT910、DT912均可抑制Bcl-2在前列腺癌细胞PC3和膀胱癌细胞T24中的表达。

实施例3：脱氧核酶对肿瘤细胞bcl-xL表达的抑制作用

对靶向Bcl-xL的脱氧核酶进行相同分析结果显示(图3)，DT888，DT884，DT883，DT882在前列腺癌细胞PC3中表现出很强的抑制效果。进一步选用DT882在膀胱癌细胞系T24，肺癌细胞系A549，结肠癌细胞系HCT116中进行了分析，结果表明DT882在这些细胞中均可有效抑制Bcl-xL的表达。

实施例4：靶向Bcl-2和Bcl-xL的脱氧核酶诱导肿瘤细胞凋亡效应

在确认了靶向Bcl-2和Bcl-xL的脱氧核酶在细胞内可特异性地抑制靶基因的表达后，我们分别选择了DT895(靶向Bcl-2)和DT882(靶向Bcl-xL)脱氧核酶，以2mM的浓度转染进入一系列肿瘤细胞，以无关序列为对照，观察脱氧核酶对肿瘤细胞凋亡的影响。细胞凋亡分析采用流式细胞仪，以PI染色方法测定sub-G1细胞群(凋亡细胞群)的比例。同时，应用Western blots方法分析了处理细胞中线粒体细胞色素C的相对释放，进一步证实细胞凋亡的发生。如表3所示，靶向Bcl-2和Bcl-xL脱氧核酶均可诱导肿瘤细胞发生凋亡。

表3.靶向Bcl-2和Bcl-xL的脱氧核酶诱导肿瘤细胞凋亡