CN101987197B

CN101987197B - 抑制癌细胞侵袭性的方法和试剂

Info

Publication number: CN101987197B
Application number: CN200910055694A
Authority: CN
Inventors: 金由辛; 史毅; 赵波涛
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shandong Yikang Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2009-07-31
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2012-09-12
Anticipated expiration: 2029-07-31
Also published as: CN101987197A

Abstract

本发明涉及抑制癌细胞侵袭性的方法和试剂。公开了一种miR-320a的抑制剂的用途，用于制备抑制肿瘤细胞的组合物；还公开了一种Pfn1抑制剂的用途，用于制备抑制肿瘤细胞的组合物；还公开了一种筛选抑制肿瘤的潜在物质的方法。本发明首次揭示了miR-320a与肿瘤细胞的迁移与侵袭的相关性，并且Pfn1参与介导了该过程，从而为肿瘤的防治提供了新的靶点。

Description

抑制癌细胞侵袭性的方法和试剂

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及抑制癌细胞侵袭性的方法和试剂。

背景技术

肿瘤转移是肿瘤病人致死的一个重要的原因。肿瘤转移要经历一个复杂的过程：首先原发肿瘤细胞侵入相邻组织并进入淋巴管或血管，即进入血管内渗(Intravasation)；然后通过血管迁移到远端毛细管中；转移出血管，即外渗(Extravasation)，最终经过增殖从微小转移(Micrometastases)变为肉眼可见的转移瘤。目前已鉴定了一些与肿瘤转移相关的因子，如生长因子、细胞因子、趋化因子、血管形成因子前体、胞外基质重塑分子和某些转录因子。但到目前为止，对肿瘤转移的分子机制和细胞机制的了解还很有限。

肿瘤细胞侵袭和迁移的一个重要过程是细胞迁移能力的变化，该过程包含肌动蛋白细胞骨架的动态重塑，其中各种肌动蛋白结合蛋白(ABPs)起着重要的作用。Profilin-1(简写为Pfn1，肌动蛋白抑制蛋白)就是其中的一员，它是一种广泛存在的球形肌动蛋白结合蛋白。近些年来的研究表明Pfn1参与了哺乳动物细胞的迁移过程。Pfn家族蛋白大小约为14-17kDa，广泛存在于脊椎动物、无脊椎动物、原生生物、真菌、植物及某些病毒中。大多数真核生物含有多种Pfn基因，而且通过选择性剪切可以产生多种异构体。到目前为止鉴定出了四种不同的Pfn基因：Pfn1、Pfn2(主要存在于神经细胞中，存在两种剪切异构体)、Pfn3(特异性存在于肾脏和睾丸中)和Pfn4(特异性存在于睾丸中)。生化分析表明Pfn家族蛋白能和众多的配体结合，如肌动蛋白，肌动蛋白相关蛋白(Arp)2，管蛋白结合蛋白Gephyrin，二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)以及一些含多聚脯氨酸的蛋白质。正因为能与多种配体结合，Pfn1能参与多种细胞活动，如细胞增殖、迁移、细胞内吞、mRNA剪切以及基因转录。最初显示Pfn在细胞迁移中发挥功能的证据来源于阿米巴变形虫(Dictyostelium amebae)中的研究。Pfn I和Pfn II缺陷的阿米巴虫突变体表现出运动障碍和细胞浆移动缺陷。在chickadee(一种Pfn同源基因)突变的果蝇(Drosophila)中也发现类似的发育缺陷。在细胞迁移过程中首先会有一基于肌动蛋白的突触伸出过程，许多病理模型的研究也表明Pfn1在这一过程中发挥作用。最近在人血管内皮细胞中的证据直接表明了Pfn1在细胞迁移过程中的起促进作用。然而另外一些研究表明Pfn1在癌细胞转移中起负调控作用，如在人类乳腺癌组织和细胞系、胰腺癌和肝癌中发现Pfn1表达水平显著降低。在乳腺癌细胞CAL51中过表达Pfn1能阻止该细胞在裸鼠皮下成瘤。此外，在高转移性乳腺癌细胞系BT474中过表达Pfn1也能减弱其迁移能力，而通过RNAi技术沉默Pfn1基因表达能增强乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移能力和侵袭能力。从这一点上Pfn1被认为是抑癌蛋白质。因此，目前认为Pfn1在细胞迁移中的作用比较复杂，具体起什么作用因细胞种类而异。

近些年来，越来越多的证据表明在肿瘤的形成过程中有一类被称之为microRNA(miRNA)的小分子调控RNA起着重要的作用。成熟的miRNA是体内自然产生的一种单链RNA分子，长约21-24个核苷酸。在哺乳动物中，成熟的miRNA能进入一种RISC复合体(即RNA诱导的沉默复合体)中，引导该复合体与特异的靶mRNA结合从而阻滞以该mRNA为模板的蛋白质翻译过程或是促使mRNA降解。越来越多的证据表明miRNA能调控众多的细胞活动，如分化、代谢、增殖以及凋亡。目前，一些能有着致癌或抑癌功能的miRNA已被鉴定出来，然而关于miRNA在肿瘤转移过程中的作用的研究刚刚起步。近来已鉴定了一些和肿瘤迁移相关的miRNA，如miR-10b、miR-373、miR-520c和miR-21能促进肿瘤迁移，而let-7、miR-335和miR-126能抑制肿瘤转移。MiRNA是通过抑制一些与细胞迁移、侵袭和增殖相关的靶基因而调节肿瘤转移。例如，miR-10b的一个已鉴定的靶基因是HOXD10，该基因编码的一个转录抑制子能抑制一些在细胞迁移和侵袭中发挥作用的蛋白质的表达，如小G蛋白质RhoC。在MCF-7乳腺癌细胞中，miR-373诱发的转移是通过直接抑制CD44(已知在结肠癌和前列腺癌中能抑制转移)而实现的。

目前通过miRNA芯片检测的技术已发现miR-320在许多的人类肿瘤中异常表达，如结肠癌、视网膜细胞瘤、胆管癌、乳腺癌、前列腺癌和恶性转化的支气管上皮细胞。此外，在人类的其它一些疾病中也发现了miR-320的异常表达，如神经退行性病变和镰刀形红细胞贫血病。然而，目前本领域对于miR-320在肿瘤发生、迁移、侵袭中的作用还没有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供癌细胞迁移性和侵袭性相关的靶点，以及抑制癌细胞迁移和侵袭的方法和试剂。

在本发明的第一方面，提供一种miR-320a的抑制剂的用途，用于制备抑制肿瘤细胞的组合物。

在一个优选例中，所述的肿瘤细胞是表达Pfn1蛋白的细胞；更佳的，所述的肿瘤细胞是Pfn1蛋白表达后迁移性和/或侵袭性降低的细胞。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞是乳腺癌细胞或肺癌细胞。

在另一优选例中，所述的组合物还用于提高肿瘤细胞中Pfn1的表达水平。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞是(高)表达miR-320a的肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述的miR-320a的抑制剂是miR-320a的反义核苷酸。

在另一优选例中，miR-320a的反义核苷酸选自：

(a)序列如SEQ ID NO：1所示的反义核苷酸；或者

(b)序列与SEQ ID NO：1所示的序列具有80％以上的相同性、且具有(a)指定的反义核苷酸功能的反义核苷酸；或者

(c)序列与SEQ ID NO：1所示的序列在严格条件下杂交、且具有(a)指定的反义核苷酸功能的反义核苷酸。

在另一优选例中，所述的反义核苷酸是包括但不限于甲氧基化修饰、锁核酸修饰、肽核酸修饰、硫代修饰以及磷酸骨架由磷脂连接代替的反义核苷酸。

更优选地，所述的反义核苷酸是甲氧基化修饰的反义核苷酸，即核糖骨架2位羟基上的氢用甲基取代。

在另一优选例中，所述的抑制肿瘤细胞包括：抑制肿瘤细胞的迁移和/或侵袭。

在本发明的另一方面，提供一种Pfn1抑制剂的用途，用于制备抑制肿瘤细胞的组合物。

在一个优选例中，所述的肿瘤细胞是表达Pfn1蛋白的细胞；更佳的，所述的肿瘤细胞是Pfn1蛋白表达被抑制后迁移性和/或侵袭性降低的细胞。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞是前列腺癌细胞或肝癌细胞。

在另一优选例中，所述的Pfn1的抑制剂选自：

(i)序列如SEQ ID NO：2所示的miRNA(miR-320a)；或者

(ii)序列与SEQ ID NO：2所示的序列具有80％以上的相同性、且具有(i)指定的miRNA功能的miRNA；或者

(iii)序列与SEQ ID NO：2所示的序列在严格条件下杂交、且具有(i)指定的miRNA功能的miRNA。

在另一方面，本发明还提供一种筛选抑制肿瘤的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)在测试组中，向表达miR-320a的体系中添加待筛选的候选物，并检测miR-320a的表达或活性；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、表达miR-320a的体系中，检测miR-320a的表达或活性；

(2)将步骤(1)测试组中miR-320a的表达或活性与对照组中miR-320a的表达或活性进行比较，

如果测试组中miR-320a的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，较佳的低20％或更低；更佳的低40％或更低；进一步更佳的低60％或更低)对照组，就表明该候选物是抑制肿瘤的潜在物质。

(a)在测试组中，向包含miR-320a和Pfn1 mRNA的体系中添加待筛选的候选物，并检测miR-320与Pfn1 mRNA的结合情况；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、包含miR-320a和Pfn1的体系中，检测miR-320与Pfn1mRNA的结合情况；

(b)将步骤(a)测试组中miR-320与Pfn1 mRNA的结合情况与对照组中miR-320与Pfn1 mRNA的结合情况进行比较，

如果测试组中miR-320与Pfn1 mRNA的结合在统计学上低于(优选显著低于，较佳的低20％或更低；更佳的低40％或更低；进一步更佳的低60％或更低)对照组，就表明该候选物是抑制肿瘤的潜在物质。

在一个优选例中，所述的体系是肿瘤细胞体系。

在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制肿瘤有用的物质。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、在Pfn1 mRNA的3’UTR的第20-41位核苷酸是miR-320a的靶位点。

(a)预测到的miR-320a的靶位点的位置。miR-320a的5’的第2-8位核苷酸配对的区域(即种子区域)以粗体字母表示，非配对的核苷酸分列在上下行。

(b)九种不同物种中(从上到下依次为：人、大鼠、小鼠、恒河猴、黑猩猩、果蝇、线虫、马和狗)的miR-320a的种子配对区的序列比较。

图2、在不同肿瘤细胞系中的MiR-320a和Pfn1的蛋白质表达呈负相关性。

(a)Western blot检测不同细胞中的Pfn1蛋白质。

(b)Western blot电泳图的灰度扫描定量(FUJIFILM-Multi Gauge V3.0)。以Pfn1/β-Actin的比值做柱形图。

(c)以实时定量RT-PCR法(qRT-PCR)测定Pfn1的mRNA在各种细胞中的相对表达水平。

(d)以实时定量RT-PCR法测定miR-320a在各种细胞中的相对表达水平。

图3、Pfn1的3’UTR是miR-320a的有效作用靶位。

(a)插入了Pfn1-3’UTR的报告基因示意图。Wt：含有野生型的Pfn1 3’UTR；Mut：种子区有3个核苷酸突变(以斜体并带下划线的字母标出)的Pfn13’UTR。

(b)荧光素酶报告基因的表达分析。20ng的Wt或Mut报告基因载体转染1×10⁵的293T细胞，同时转染50nM的control-miR、或miR-320a、或再同时转染50nM的对照反义核酸(control anti-miR)或是miR-320a的反义核酸(anti-miR-320a)，均为瞬时转染。24小时后用Dual luciferaseassay system(Promega)检测荧光素酶活性。柱形图表示的值代表3组独立实验的平均值±SE。Wt UTR：含有野生型Pfn1-3’-UTR的报告基因质粒；Mut UTR：含有突变型Pfn1-3’-UTR的报告基因质粒。miR-n.c.表示用作负对照的control-miR。

(c)Flag标记的Pfn1蛋白编码区(ORF)和野生型(Wt)或突变的(Mut)的3’UTR插入pCDNA3.1载体。10ng的上述载体转染1×10⁵的293T细胞，同时转染不同剂量的control-miR或miR-320a，均为瞬时转染。48小时后用westernblot检测外源表达的Pfn1蛋白质的水平。pcDNA3.1-Pfn1/wt：含有野生型Pfn1-3’-UTR的Pfn1 mRNA的蛋白编码区质粒。miR-n.c.表示用作负对照的control-miR。

(d)100nM的con-miR或miR-320a或其反义核酸瞬时转染DU-145、PC-3、Hela和95D细胞，48小时后用western blot检测内源表达的Pfn1蛋白质的水平。miR-n.c.表示用作负对照的control-miR。

图4、MiR-320a能正向调控乳腺癌细胞的迁移性和侵袭性。

(a)qRT-PCR检测miR-320a稳定转染的MCF-7细胞能高水平表达miR-320a，con-miR稳转细胞作为对照。

(b)Western blot检测稳定转染miR-320a或con-miR的MCF-7细胞以及瞬时转染100nM miR-320a反义核酸或对照反义核酸的MDA-MB-231细胞的Pfn1蛋白质表达量。

(c-f)伤口愈合实验测定瞬时转染anti-miR-320a或anti-con-miR的MDA-MB-231细胞的迁移性(c，d)和稳定转染miR-320a或con-miR的MCF-7细胞的迁移性(e，f)。细胞图片(c、e：标尺200μμm)，柱形图(d，f)表示3组独立实验的平均值±SE。

(g-j)Transwell迁移实验测定瞬时转染anti-miR-320a或anti-con-miR的MDA-MB-231细胞的迁移性(g，h)和稳定转染miR-320a或con-miR的MCF-7细胞的迁移性(i，j)。细胞图片(g、i：标尺200μm)，柱形图(h，j)表示3组独立实验的平均值±SE。

(k-n)Transwell侵袭实验测定瞬时转染anti-miR-320a或anti-con-miR的MDA-MB-231细胞的侵袭性(k，l)和稳定转染miR-320a或con-miR的MCF-7细胞的侵袭性(m，n)。细胞图片(k、m：标尺200μm)。柱形图(l，n)表示3组独立实验的平均值±SE。

图5、MiR-320a对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的影响部分是由下调Pfn1介导的。100nM的anti-miR-320a或anti-con-miR转染MDA-MB-231细胞，或再同时转染100nM的对照组siRNA(si-con)或Pfn1特异性siRNA(si-Pfn1)，均为瞬时转染。用western blot检测Pfn1的表达量(a)，用Transwell实验测定细胞迁移性和侵袭性(b)。柱形图表示三组的独立实验的平均值±SE。

图6、伤口愈合实验测定瞬时转染anti-miR-320a或anti-con-miR的95D细胞的迁移性(a)和瞬时转染miR-320a或con-miR的DU145细胞的迁移性(b)。细胞图片(标尺200μm)。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示了miR-320a与肿瘤细胞的迁移与侵袭的相关性，其能够调控(促进)肿瘤细胞的迁移与侵袭。所述的肿瘤细胞特别是表达Pfn1蛋白的细胞，更特别是Pfn1蛋白表达后迁移性和/或侵袭性降低的细胞。本发明为肿瘤的防治提供了新的靶点。

miR-320a及其用途

miR-320a为一种本领域已知的microRNA(miRNA)小分子，其对于调控RNA是有用的。然而，对于miR-320a结合的靶点和其与肿瘤的迁移性和/或侵袭性之间的关系目前并不清楚。

miR-320a具有如SEQ ID NO：2所示的序列。其可以被分离自细胞，或者可通过人工合成的方式获得。在得知了miR-320a的序列后，本领域人员可以方便地制备获得miR-320a。

基于本发明人的新发现，提供了一种miR-320a的用途，用于制备抑制Pfn1蛋白表达的组合物。在本领域中，Pfn1蛋白在肿瘤细胞中的作用已经有所揭示，在一些肿瘤细胞(如乳腺癌细胞、胰腺癌细胞)中，Pfn1蛋白的高表达抑制的肿瘤细胞的迁移和侵袭；而本发明人发现，在另一些肿瘤细胞(如前列腺癌细胞)中，Pfn1蛋白的高表达促进的肿瘤细胞的迁移和侵袭。因此很显然，miR-320a可通过抑制Pfn1蛋白的表达而调控这些肿瘤细胞的迁移和侵袭。

Pfn1

Profilin-1(简写为Pfn1)属于Profilin家族的成员，广泛存在于脊椎动物、无脊椎动物、原生生物、真菌、植物及某些病毒中。已有研究表明Pfn1参与了哺乳动物细胞的迁移过程。

Pfn1蛋白的序列可以与GenBank登录号NP_005013所示的序列基本上相同，其编码分子可以与GenBank登录号NM_005022所示的序列基本上相同。Pfn1蛋白或基因可以被分离自细胞，或者可通过人工合成的方式获得。在得知了Pfn1蛋白或编码基因的序列后，本领域人员可以方便地制备获得Pfn1蛋白或基因。

miR-320a抑制剂及其用途

本发明人从鉴定miR-320a的靶基因入手，通过一种基于免疫共沉淀的方法纯化出RISC复合体从而进一步鉴定出miR-320a的一个靶基因为Pfn1基因。根据这一发现，本发明人以乳腺癌细胞为模型进一步研究了miR-320对肿瘤细胞迁移和侵袭的调控作用。结果表明miR-320a能促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭，这种作用部分是通过miR-320a直接抑制Pfn1而实现的。因此，miR-320a可以作为肿瘤治疗的靶点。

更具体地，本发明人的研究表明在Pfn1 mRNA的3’-UTR(即3’端非翻译区)的第20至第41个核苷酸区域为miR-320a的识别靶位点，该靶位点在多个物种的Pfn1 mRNA中保守存在。将Pfn1的3’UTR克隆到荧光素酶报告基因的3’非翻译区后与miR-320a共转染入293T细胞中，24小时后检测发现miR-320a能显著抑制报告基因的表达。在一些肿瘤细胞系中过表达miR-320a后发现细胞内源的Pfn1蛋白水平被下调。而在乳腺癌细胞MDA-MB-231(本身高表达内源的miR-320a)转染miR-320a的反义核酸抑制其功能时Pfn1蛋白水平被上调。上述结果充分证明了Pfn1是miR-320a的靶基因。已有研究表明Pfn1能对乳腺癌细胞的侵袭性起负调控作用，因此本发明人接着研究了miR-320a和乳腺癌细胞侵袭性的关系。MCF-7本身内源表达的miR-320a很少，过表达miR-320a后，其迁移性和侵袭性都得到增强。而在本身高表达miR-320a的MDA-MB-231细胞中转入其反义核酸后，不仅Pfn1的蛋白表达上调，该细胞的迁移性和侵袭性都被减弱；但当再转入Pfn1的特异性siRNA将Pfn1的水平回复到原先的水平后，该细胞的迁移性和侵袭性也都部分回复。上述结果表明，miR-320a能促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，而且该作用部分是由于miR-320a能靶向调控Pfn1蛋白的表达。

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种miR-320a的抑制剂的用途，用于制备抑制肿瘤细胞的组合物。所述的抑制肿瘤细胞更特别地是指抑制肿瘤细胞的迁移和/或侵袭。所述的肿瘤细胞是表达Pfn1蛋白的细胞，更特别是指Pfn1蛋白表达后迁移性和/或侵袭性降低的细胞。优选地，所述的肿瘤细胞是乳腺癌细胞。

如本文所用，所述的miR-320a抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。任何可下调miR-320a的表达、加速miR-320a降解、下调miR-320a的活性、阻止miR-320a与靶分子结合的物质，均可作为miR-320a的抑制剂，用于通过抑制miR-320a来抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。

在得知了miR-320a对于肿瘤细胞迁移和侵袭的调控作用后，本领域人员可以方便地得知miR-320a抑制剂可以通过抑制miR-320a来抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。因此，任何miR-320a的抑制剂都可用于本发明。根据miR-320a的特性，本领域人员可以获得多种miR-320a的抑制剂。

作为本发明的优选方式，所述的miR-320a的抑制剂是miR-320a的反义核苷酸。

如本文所用，“反义核苷酸”又称为“反义核酸”或“反义寡核苷酸(AS-ONs，antisense-oligonucleotides)”或“反义药物”，是指长度约为15-24个碱基的DNA分子、RNA分子它们的经修饰的形式或它们的类似物，可与mRNA互补。从理论上来讲，根据反义技术获得的反义分子可用于治疗任何由基因表达或者基因缺失引起的疾病，比如病毒感染、癌症和炎症。

本领域人员均了解，根据本发明提供的反义核苷酸，可以进行适当的变化并保留其活性，这些变化形式均可用于本发明。任何可起到抑制或沉默miR-320a的作用的反义核苷酸都是可用于本发明的，其类型不限于DNA或是RNA。例如，所述的miR-320a的反义核苷酸具有与SEQ ID NO：1所示的序列在严格条件下杂交的序列；或者所述的miR-320a的反义核苷酸与SEQ ID NO：1所示的序列具有80％以上的相同性，较佳地具有85％以上的相同性，更佳地具有90％以上的相同性，最佳地具有95％以上的相同性，如具有96％、97％、98％或99％以上的相同性；或者所述的miR-320a的反义核苷酸是SEQ ID NO：1所示序列的片段。它们均具有SEQ ID NO：1所示序列的反义核苷酸相同的功能。

现有技术中已经指出了一些反义核苷酸的变化形式是可取的，它们也可以针对相应的靶序列发挥抑制作用。如Improved targeting of miRNA with antisenseoligonucleotides(2294-2304 Nucleic Acids Research，2006，Vol.34，No.8)文献中提到，在反义核酸的两个末端截短1个碱基是可以保留其活性的。又如Designand delivery of antisense oligonucleotides to block microRNA function in culturedDrosophila and human cells(NATURE PROTOCOLS；VOL.3 NO.10；2008；1537-1549)文献综述了多个研究，认为一般而言，在反义核酸的两边延长一些碱基是可以的。而在反义核酸和miRNA间亲和性很高(如锁核酸修饰)时，反义核酸可以被截短到约2/3长度。

如本文所用，所述的“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：1所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

作为本发明的更优选的方式，所述的miR-320a的反义核苷酸具有SEQ IDNO：1所示的序列。

在本发明中，所述的“反义核苷酸”还包括经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义核苷酸的活性、稳定性或治疗效果。对反义核苷酸的修饰包括但不限于：甲氧基化修饰、锁核酸修饰、肽核酸修饰、硫代修饰、磷酸骨架由磷脂连接骨架代替，这些修饰均是本领域技术人员易于实现的。优选地，所述的修饰为甲氧基化修饰，即：在核糖骨架的2位羟基上的氢被甲基取代。

Pfn1抑制剂及其用途

本发明人意外地发现，Pfn1在一些细胞中表达或活性的下调(例如以rniR-320a下调其表达)可以抑制肿瘤细胞的迁移或侵袭。所述的细胞是Pfn1蛋白表达被抑制后迁移性和/或侵袭性降低的细胞，如前列腺癌细胞。

因此，本发明还提供了Pfn1抑制剂的用途，用于制备抑制肿瘤细胞的组合物。

如本文所用，所述的Pfn1的抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。任何可降低Pfn1蛋白的活性、降低Pfn1蛋白的稳定性、抑制Pfn1蛋白的表达、减少Pfn1蛋白有效作用时间、抑制Pfn1蛋白的分泌、或抑制Pfn1的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于抑制肿瘤细胞的有效物质。所述的Pfn1的抑制剂也可以是经过修饰的形式。

在Pfn1蛋白或核酸序列已知的情况下，本领域人员能够根据一般的手段来获得Pfn1的抑制剂。所述的抑制剂例如包括但不限于：特异性结合Pfn1蛋白的抗体或配体；特异性干扰Pfn1表达的小干扰分子，如siRNA分子、miRNA分子等。

作为本发明的优选方式，所述的Pfn1的抑制剂是miR-320a；或是序列与miR-320a的序列具有80％以上的相同性(较佳地具有85％以上的相同性，更佳地具有90％以上的相同性，最佳地具有95％以上的相同性，如具有96％、97％、98％或99％以上的相同性)的miRNA；或是序列与miR-320a序列在严格条件下杂交的miRNA；它们均具有miR-320a相同的功能。

筛选方法

在得知了所述的miR-320a对于调控肿瘤细胞的迁移和/或侵袭的用途后，可以基于该特征来筛选调节miR-320a的表达或活性，进而调节肿瘤细胞的迁移和/或侵袭的物质；或者，可以筛选调节miR-320a的表达或活性，进而调节Pfn1的表达或活性，最终调节肿瘤细胞的迁移和/或侵袭的物质。

因此，本发明提供一种筛选可用于抑制肿瘤(特别是抑制肿瘤细胞的迁移和/或侵袭)的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达miR-320a的体系接触；和检测候选物质对miR-320a的影响；若所述候选物质可降低miR-320a的表达或活性，就表明该候选物是抑制肿瘤的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到miR-320a的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达miR-320a的体系。

本发明还提供一种筛选抑制肿瘤的潜在物质的方法，所述方法包括：将候选物质与包含miR-320a和Pfn1 rnRNA的体系接触，并检测miR-320与Pfn1mRNA的结合情况；如果miR-320与Pfn1 mRNA的结合在统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制肿瘤的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到miR-320与Pfn1 mRNA的结合的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的包含miR-320与Pfn1mRNA的体系。

所述的体系包括(但不限于)：溶液体系、亚细胞体系、细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。优选地，所述的体系是肿瘤细胞体系。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制肿瘤真正有用的物质。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于抑制肿瘤的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出真正有用的物质。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效量的所述的反义核苷酸，以及药学上可接受的载体。

所述“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

本发明的反义核苷酸的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：反义核苷酸的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的反义核苷酸每天以约0.001-100mg/kg(优选的为0.01-20mg/kg)动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以2-4次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为0.005-100mg，较佳地约为0.008-50mg。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

任何适用的给药途径都是可以的，包括但不限于：口服、静脉内注射、皮下注射、肌肉给予、局部给予、植入、缓释给予、肿瘤内给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I、材料和方法

材料，抗体和细胞

培养基DMEM和胎牛血清购自Invitrogen/Gibco(Karlsruhe，Germany)。24孔Transwell小室和基质胶包被的小室(8μm孔径)购自BD Biosciences(Bedford，MA，USA)。对照的miRNA(control-miR，Ambion货号：AM17110)、miR320a(序列为5’-AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA-3’(SEQ ID NO：2))、对照的2’甲氧基化修饰的反义核酸(control-anti-miR或anti-control-miR，Ambion货号：AM17010)、miR-320a的甲氧基化修饰的反义核酸(anti-miR-320a，序列为5’-UCGCCCUCUCAACCCAGCUUUU-3’(SEQ ID NO：1)，修饰位点为核糖的2位羟基)、对照siRNA(si-con或control-siRNA，Ambion货号：4390843)和Pfn1特异的siRNA(si-Pfn1，Ambion货号：AM16810，SiRNA ID：S10375)购自Ambion(Austin，TX，USA)。

用于稳定转染MCF-7细胞的过表达miR-320的慢病毒载体构建所用引物：

Lmi320a+(SEQ ID NO：7)：

GATCCGCTTCGCTCCCCTCCGCCTTCTCTTCCCGGTTCTTCCCGGAGTCGG；

Lmi320a-(SEQ ID NO：8)：

GGGAAGAACCGGGAAGAGAAGGCGGAGGGGAGCGAAGCG；

Lmi320b+(SEQ ID NO：9)：

GAAAAGCTGGGTTGAGAGGGCGAAAAAGGATGAGGTTTTTTC；

Lmi320b-(SEQ ID NO：10)：

TCGAGAAAAAACCTCATCCTTTTTCGCCCTCTCAACCCAGCTTTTCCCGACTCC；

Lmi-con-a+(SEQ ID NO：11)：

GATCCGCTTCGCTCCCCTCCGGCGTCTCTTGCGTGGTCTTCCCGGAGTCGG；

Lmi-con-a-(SEQ ID NO：12)：

GGGAAGACCACGCAAGAGACGCCGGAGGGGGCGAAGCG；

Lmi-con-b+(SEQ ID NO：13)：

GAACACCACGCTTGAGACGCCGAAAAAGGATGAGGTTTTTTC；

Lmi-con-b-(SEQ ID NO：14)：

TCGAGAAAAAACCTCATCCTTTTTCGGCGTCTCAAGCGTGGTGTTCCCGACTCC。

Pfn1的抗体购自Abcam，β-actin的抗体和Flag的抗体购自Sigma，GAPDH的抗体购自康成生物公司。细胞系293，293T，Hela，HFL1，HL-7702，BEL-7404，肝癌细胞株LO2，肝癌细胞株HepG2，肺癌细胞株A549，肺癌细胞株95-D，乳腺癌细胞株MCF-7，乳腺癌细胞株MDA-MB-231，乳腺癌细胞株MDA-MB-435S，前列腺癌细胞株DU-145和前列腺癌细胞株PC-3均购自中国科学院上海生命科学院生化细胞所细胞库。

3’-UTR-荧光素酶报告质粒及pLenti慢病毒稳定表达质粒的构建和报告基因表达检测方法

Pfn1全长的3’-UTR通过PCR扩增得到：以MCF-7细胞的cDNA为模板(用Trizol试剂抽提MCF-7细胞的总RNA。用oligo dT(即连续20个dT核苷酸)作反转录引物，用SuperScript III(Invitrogen)按其说明书进行反转录合成出cDNA)，引物为：上游引物5’-TCACATATGTCTGTCCCTTCCCCTTCACCGCTCC-3’(SEQ ID NO：3)，下游引物5’-TCACATATGAACAAAAGTTT TCCAACCACACACG-3’(SEQ ID NO：4)，扩增产物克隆到pGL3(Promega，Madison，WI，USA)的Xba I位点，构建野生型Pfn1-3’-UTR的报告基因质粒。miR-320a结合位点突变的Pfn1-3’-UTR用Quick change-mutagenesis kit(Stratagene，Heidelberg，Germany)试剂盒产生，突变所用的引物为5’-CTTCCCCTTCACCGCTCCCCACTGATCTGCACCCCTTTCCTCCCCATAC-3’(SEQ ID NO：15)；5’-GTATGGGGAGGAAAGGGGTGCAGATCAGTGGGGAGCGGTGAAGGGGAAG-3’(SEQ ID NO：16)。

扩增Pfn1的Pfn1 mRNA的蛋白编码区(ORF)加上3’-UTR所用引物：5’-CCTGCTAGCATGGACTACAAAGACGATGACGATAAAATGGCCGGGTGGAACGCCTAC-3’(SEQ ID NO：17)和SEQ ID NO：4，扩增产物克隆到pcDNA3.1(Invitrogen)的Nhe I和Xba I位点，获得携带Pfn1 mRNA的蛋白编码区加上3’UTR区的pCDNA3.1载体。

用于稳定转染的pLenti-320a及pLenti-control质粒的构建：分别把Lmi320和Lmi-con中a+和a-，b+和b-退火形成双链。退火后，a片段和b片段之间有互补的粘性位点，a片段的另一端有BamH I粘性位点，b片段另一端有Xho I粘性位点。把pLenti空载体(参见Ge等的文献：PCAF Acetylates β-Catenin andImproves Its Stability.Mol Biol Cell.2009 January 1；20(1)：419-427)用BamH I和Xho I酶切后，分别将Lmi320的a，b片段和Lmi-con的a，b片段和载体连接，转化后，鉴定正确的克隆。

报告基因表达检测方法：将含有野生型或突变型Pfn1-3’-UTR的报告基因质粒(20ng)与转染内参质粒pRL-SV40(20ng)(Promega)以及miRNA或反义核酸用脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)瞬时共转染入293T细胞(2-5×10⁵)。24小时后用Dual luciferaseassay system(Promega)检测荧光素酶活性。

细胞瞬时转染和筛选稳定转染的细胞

瞬时转染的前一天把细胞用胰酶消化分散后，按1×10⁵个细胞/孔接种于12孔板。单独转染合成的小RNA分子或反义核酸分子、共转染质粒和合成的小RNA分子或反义核酸分子均按Lipofectamine 2000的说明书进行。转染24小时后，进行迁移性、侵袭性实验分析。转染48小时后，收获细胞，进行WesternBlot分析。

稳定转染细胞的筛选：转染前一天将细胞按2×10⁶个细胞/皿接种于10cm细胞培养皿。转染含miR-320a或对照miRNA的pLenti载体过程按Lipofectamine 2000的说明书进行。转染24小时后，用流式细胞仪筛选出GFP阳性的细胞。筛选出的GFP阳性细胞再次接种于10cm细胞培养皿。等细胞长满时，再次用流式细胞仪筛选出GFP阳性的细胞。之后再重复一次培养/筛选。三次富集所得的细胞即为用作实验的稳定转染细胞。

细胞裂解制备蛋白样品及Western Blot分析

细胞用磷酸缓冲液(PBS)洗涤后，裂解于Laemmli Sample Buffer(BIO-RAD，Hercules，CA，USA)。蛋白质浓度用RC DC Protein Assay kit(BIO-RAD)测定。约取40μg总蛋白于15％ SDS-PAGE进行电泳并电转印到PVDF膜上。用相应抗体对膜进行杂交，最后用化学发光法(SuperSignal WestPico Chemiluminescent Substrate，Thermo，Rockford，USA)检测杂交信号。

RNA抽提，反转录反应以及实时定量PCR

用Trizol试剂(Invitrogen)抽提细胞的总RNA。以总RNA为模板用NCodemiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和SuperScript III CellDirect cDNASynthesis Kit(Invitrogen)合成出相应的cDNA。实时定量PCR在AppliedBiosystems 7500 Fast Real Time PCR system仪器上进行，miR-320a定量时所用上游引物为miR-320a特异性引物(即miR-320a的对应DNA序列)，下游引物为试剂盒中的通用引物，所用试剂为SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal(Invitrogen)。检测Pfn1表达的引物用Primer premier v5.0软件设计，序列为：5’-GCCATCGTGGGCTACAAGG-3’(上游引物，SEQ ID NO：5)和5’-CCATCAGCAGGACTAGCGTCTT-3’(下游引物，SEQ ID NO：6)。PCR反应程序为：95℃预变性4min，然后是45步循环反应：95℃变性3sec.，60℃退火并延伸40sec.。最后，miR-320a和Pfn1的定量按照2^-ΔΔCt法计算，分别以U6 snRNA和GAPDH为内参。

细胞迁移性和侵袭性检测

伤口愈合实验参照文献Ding Z等，Silencing profilin-1 inhibits endothelialcell proliferation，migration and cord morphogenesis.Journal of cell science2006；119(Pt 19)：4127-37中所述。测定3-4个不同视野下的伤口宽度。伤口闭合的定量是测量伤口宽度的变化数值，一般每孔细胞测3个视野，取平均值。

Transwell细胞迁移实验参见文献Roy P，Jacobson K.Overexpression ofprofilin reduces the migration of invasive breast cancer cells.Cell motility and thecytoskeleton 2004；57(2)：84-95中所述。简而言之，待细胞生长至75-80％汇合度时，换无血清培养基继续培养，血清饥饿24小时。胰酶消化下来后，用PBS洗涤3次，重悬于无血清培养基中，取5×10⁴个细胞加入Transwell的上室中，下室加入完全培养基(含10％胎牛血清)。培养12小时后，用棉签擦去上室底膜上方的细胞，而穿到膜下方的细胞则固定后用结晶紫染色，并于显微镜下拍照，取3个不同视野用FUJIFILM Colony V1.1软件对细胞计数。用包被了基质胶的小室按照同样的方法进行细胞侵袭实验。

统计分析方法

数据的统计作图用软件Sigma Plot 10.0进行。数据表示为平均值±SE。组间差异用Student’s t-test分析，P＜0.05时为显著差异。

II、实施例

实施例1、Pfn1 3’UTR含有保守的miR-320a的靶位点

为了研究miR-320a在肿瘤发生过程中的作用，本发明人首先用最近报道的一种生化方法(参见Karginov FV et al.A biochemical approach to identifyingmicroRNA targets.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 2007；104(49)：19291-6)鉴定了miR-320a的靶基因，该方法的主要原理是用抗RISC核心组分Ago2的抗体免疫共沉淀出RISC中的miRNA和其靶基因mRNA，然后鉴定出相应的miRNA的靶基因的种类。结果，本发明人鉴定到Pfn1是miR-320a的候选靶基因。

然后，本发明人用miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)、TargetScan(http://www.targetscan.org/)和PicTar(http://www.pictar.org/)等miRNA靶基因预测软件也预测到Pfn1是miR-320a的靶基因。

进一步分析发现，在Pfn1 mRNA(NM_005022)的3’UTR区第20-41个核苷酸存在一个靶位点，如图1a，通过mFold软件(http://mfold.bioinfo.rpi.edu/)分析可得Pfn1 3’UTR和miR-320a结合自由能为-17.6 kcal/mol，这符合miRNA与靶基因结合的原则。而且，该靶位点的序列，特别是种子区(即与miRNA 5’端2-8位核苷酸配对的区域)在9种物种中保守存在，如图1b。

实施例2、Pfn1蛋白表达量和miR-320a表达量呈负相关性

首先，本发明人检测了在一些细胞系中miR-320a与Pfn1表达量的关系，如图2a-d。在肺癌细胞系A549和95-D中，95-D细胞中的Pfn1 mRNA表达水平比A549高5倍，而95-D细胞中Pfn1蛋白水平比A549低，这表明在95-D中Pfn1的蛋白翻译过程可能受阻。与此相比较，95-D细胞中miR-320a表达水平比A549细胞高6倍。在前列腺细胞PC-3和DU-145中也观察到类似的结果。总而言之，在检测的这些细胞中都能观察到Pfn1的蛋白表达水平与miR-320a的表达水平呈负相关性。

上述这些结果提示，miR-320a在转录后翻译水平对Pfn1的蛋白表达起负调控作用。

实施例3、MiR-320a能作用于Pfn1 mRNA的3’UTR，抑制Pfn1的表达

为了进一步证实miR-320a能直接靶向调控Pfn1，本发明人接着检测了miR-320a是否能结合到Pfn1 mRNA的3’UTR并阻止蛋白质翻译。为此本发明人构建了如下的报告基因载体：将人的Pfn1全长的3’UTR克隆到荧光素酶报告基因的3’UTR区(Wt UTR，图3a)，同时还构建了一个对照载体，即在miR-320a的靶位点的种子区有3个核苷酸突变的载体(Mut UTR，图3a)以去除miR-320a与该位点的结合。

将上述载体与miR-320a或对照miRNA共转染293T细胞，或在此基础上再转染miR-320a的反义核酸(anti-miR-320a)或对照的反义核酸(Controlanti-miR)以抑制miR-320a的功能，均为瞬时转染。结果如图3b所示，与对照的miRNA相比，miR-320a能显著降低报告基因的表达，而3’UTR带有突变的报告基因的表达几乎不受miR-320a的影响。当用反义核酸抑制了miR-320a的功能后，报告基因的表达得到恢复。这些数据表明在293T细胞中Pfn1的3’UTR区含有miR-320a的有效的作用靶点。

考虑到靶基因mRNA的高级结构可能会影响miRNA的结合，本发明人接着又将Pfn1 mRNA的蛋白编码区加上3’UTR区一起克隆到了pCDNA3.1载体(购自Invitrogen公司)里，同样构建了一份miR-320a靶位点种子区带有突变的质粒作为对照。将不同浓度的上述质粒瞬时转染293T细胞，结果如图3c所示，miR-320a能剂量依赖性的特异下调人为构建的野生型Pfn1的表达，而带有突变位点的Pfn1则不受miR-320的影响。这些结果进一步证明在293T细胞中，miR-320a能调控Pfn1的表达。

为了研究miR-320a能否调控内源的Pfn1蛋白的表达，本发明人将人工合成的miR-320a瞬时转染不同的肿瘤细胞系中。结果如图3d所示，转染miR-320a48小时后，DU-145、PC-3和Hela细胞中的内源Pfn1蛋白被显著下调。

综上所述，miR-320能于转录后水平通过与Pfn1 mRNA 3’UTR的结合而下调其表达。

实施例4、MiR-320a能促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭

最近有研究表明Pfn1能负调控乳腺肿瘤细胞的侵袭性，在结肠癌中miR-320与肿瘤转移性复发相关。这些研究结果促使本发明人推测miR-320a可能调控肿瘤细胞的侵袭性，因此本发明人接着在两株乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中检验该假设。MCF-7是公认的迁移性和转移性很低的细胞，而MDA-MB-231是具有转移性的乳腺癌细胞。结果见图2d，表明了miR-320a在MDA-MB-231中表达远高于MCF-7。因此，本发明人在MCF-7中过表达miR-320a，然后再检测细胞迁移性和侵袭性的变化。为此，用病毒载体表达miR-320a的前体，即pre-miR-320a，然后转染MCF-7细胞筛选出稳定转染细胞株，如图4a所示，稳转的MCF-7细胞中高表达miR-320a，而Pfn1蛋白的水平受到下调(图4b)。

随后，本发明人首先用伤口愈合实验检测了细胞迁移性的变化。在MCF-7细胞中，过表达miR-320a能导致细胞迁移性上升40％(图4e，4f)。Transwell细胞迁移测试和基质胶侵袭实验也表明过表达miR-320a后MCF-7细胞的迁移性增加60％(图4i和4j)，侵袭性约增强3-4倍(图4m和4n)。这些结果表明，miR-320a能增强肿瘤细胞的迁移性和侵袭性。

实施例5、MiR-320a的反义核苷酸提高Pfn1表达，抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭

MDA-MB-231是具有转移性的乳腺癌细胞，在MDA-MB-231中用miR-320a的反义核酸(anti-miR-320a)抑制miR-320a的功能，然后再检测细胞迁移性和侵袭性的变化。miR-320a的反义核酸瞬时转染MDA-MB-231，结果Pfn1蛋白水平上调(图4b)。随后，本发明人首先用伤口愈合实验检测了细胞迁移性的变化。转染miR-320a的反义核酸后，MDA-MB-231细胞的迁移性下降60％(图4c，4d)。Transwell细胞迁移测试和基质胶侵袭实验也表明，抑制miR-320a活性后MDA-MB-231细胞的迁移性减弱40％(图4g和4h)，侵袭性则被减弱60％(图4k和4l)。这些结果表明，miR-320a反义核酸能抑制肿瘤细胞的迁移性和侵袭性。

实施例6、MiR-320a对乳腺癌细胞的迁移和侵袭的作用是通过调控Pfn1蛋白表达而实现的

为了验证miR-320a对乳腺癌细胞迁移性和侵袭性的影响是否是通过Pfn1来介导的，本发明人又采用了Pfn1特异性的siRNA(si-Pfn1)来抵消由miR-320a反义核酸在MDA-MB-231细胞中引起的Pfn1蛋白质表达的上升作用，然后检测该细胞的迁移性和侵袭性是否能恢复到原来的水平。结果如图5a所示，如前所述miR-320a反义核酸能引起Pfn1蛋白质水平的上升，但当加入Pfn1特异的siRNA(si-Pfn1)后，Pfn1蛋白质被重新降回到原来的水平。而此时，MDA-MB-231细胞的迁移性和侵袭性被部分的恢复(图5b)，非特异性的对照siRNA(control-siRNA，si-con)则没有这种作用。这些数据表明Pfn1介导了miR-320a对乳腺癌细胞的迁移性和侵袭性的调控作用。

实施例7、MiR-320a的反义核苷酸提高Pfn1表达，抑制肺癌细胞的迁移

95D是高迁移的肺癌细胞株，本发明人将miR-320a的反义核酸瞬时转染95D肺癌细胞，结果如图3d所示，转染miR-320a的反义核酸后，95D细胞的Pfn1蛋白水平上调。

用伤口愈合实验检测细胞迁移性的变化，将miR-320a的反义核酸以及对照分别瞬时转染95D高迁移的肺癌细胞株，结果如图6a所示，miR-320a的反义核酸可以明显抑制肺癌细胞的迁移性。

实施例8、过表达MiR-320a能抑制前列腺癌细胞Pfn1的表达，并抑制前列腺癌细胞的迁移

DU-145是高迁移前列腺癌细胞株，本发明人将人工合成的miR-320a瞬时转染DU-145前列腺癌细胞，结果如图3d所示，转染miR-320a 48小时后，DU-145细胞中的内源Pfn1蛋白被显著下调。

用伤口愈合实验检测细胞迁移性的变化，将miR-320a及对照分别瞬时转染DU-145细胞，结果如图6b所示，过表达miR-320a可以明显抑制前列腺癌细胞的迁移性。

实施例9、筛选方法

方法1：

设置：测试组：乳腺癌细胞MDA-MB-231(其中高表达miR-320a)，并给予候选物质；对照组：乳腺癌细胞MDA-MB-231(其中高表达miR-320a)，不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中miR-320a的表达情况，并进行比较。如果测试组中miR-320a的表达在统计学上低于(如低50％或更低)对照组，就表明该候选物是抑制肿瘤的潜在物质。

将miR-320a的反义核苷酸miR-320a和对照control-anti-miR分别作为候选物质，加入到乳腺癌细胞MDA-MB-231培养物中，观察胞内miR-320a的表达情况，结果发现miR-320a可有效地降低miR-320a的表达，而control-anti-miR不能有效地降低miR-320a的表达。

方法2：

如前所述构建报告基因载体，其中将人的Pfn1全长的3’UTR克隆到荧光素酶报告基因的3’UTR区。将上述载体与miR-320a共转染293T细胞，获得包含miR-320a以及Pfn1 mRNA的细胞。

设置：测试组：上述包含miR-320a以及Pfn1 mRNA的细胞，并给予候选物质；对照组：上述包含miR-320a以及Pfn1 mRNA的细胞，不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中miR-320a以及Pfn1 mRNA的结合情况，并进行比较。如果测试组中miR-320a以及Pfn1 mRNA的结合在统计学上低于(如低50％或更低)对照组，就表明该候选物是抑制肿瘤的潜在物质。

将miR-320a的反义核苷酸miR-320a和对照control-anti-miR分别作为候选物质，分别加入到上述包含miR-320a以及Pfn1 mRNA的细胞中，观察胞内miR-320a以及Pfn1 mRNA的结合情况，结果发现miR-320a可有效地减少miR-320a以及Pfn1 mRNA的结合，而control-anti-miR不能有效地减少miR-320a的表达。

讨论

肿瘤转移是肿瘤病人致死的主要原因之一，然而对其中的分子机制还知之甚少。已有研究表明一些在原发肿瘤中表达的基因与肿瘤治疗后的转移性复发密切相关。但是关于导致这些基因异常表达的调控网络方面的了解还很有限。miRNA由于能在转录后水平调控一系列基因的表达，因此是肿瘤迁移性发生过程中的上游调控因子的理想的候选因子。目前已经报道了一些miRNA在致癌或抑癌方面的功能，然而关于miRNA对肿瘤转移过程中的作用的研究刚刚起步。本发明关于与肿瘤转移相关的一个蛋白质Pfn1是miR-320a的一个靶基因。本发明人的研究表明了miR-320a能促进乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的迁移性和侵袭性，而这一作用部分是由于miR-320a对Pfn1的调控引起的。

作为肌动蛋白结合蛋白质，Profilin参与了许多肌动蛋白相关的细胞活动，如运动、细胞连接、细胞浆移动和细胞形态变化和维持。遗传学的研究表明了Profilin在正常细胞的增殖和发育中发挥重要作用。Profilin基因缺陷会导致单个细胞的生长、运动和胞浆移动出现障碍甚至胚胎致死。此外，近年在乳腺癌中的研究表明Pfn1能作为抑癌基因并能抑制肿瘤细胞的侵袭性。用siRNA沉默Pfn1能增强乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞的移动性和侵袭性。本发明人发现了Pfn1的一个内源的调控小分子RNA，即miR-320a。这本身就提示了miR-320a可能调控细胞的迁移和侵袭。本发明人的研究也发现了miR-320a在高迁移性的乳腺癌细胞MDA-MB-231中高表达。随后的研究发现用反义核酸抑制了miR-320a功能后，MDA-MB-231的迁移和侵袭都被抑制。而相反，在低迁移乳腺癌细胞MCF-7中过表达miR-320a能促进该细胞的迁移和侵袭。这与前人关于Pfn1抑制乳腺癌细胞侵袭性的研究结论正好吻合。

总而言之，本发明人的研究表明，Pfn1是miR-320a的靶基因，而且，miR-320a能促进乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的迁移性和侵袭性。在高侵袭的乳腺癌细胞MDA-MB-231中用反义核酸抑制miR-320a能有效抑制其迁移性和侵袭性，这意味着抑制miR-320a的活性这种方法能成为遏制乳腺癌细胞转移的治疗方案。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>抑制癌细胞侵袭性的方法和试剂

<130>093922

<160>17

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>寡核苷酸

<400>1

ucgcccucuc aacccagcuu uu 22

<210>2

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>寡核苷酸

<400>2

aaaagcuggg uugagagggc ga 22

<210>3

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

tcacatatgt ctgtcccttc cccttcaccg ctcc 34

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

tcacatatga acaaaagttt tccaaccaca cacg 34

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

gccatcgtgg gctacaagg 19

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

ccatcagcag gactagcgtc tt 22

<210>7

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

gatccgcttc gctcccctcc gccttctctt cccggttctt cccggagtcg g 51

<210>8

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

gggaagaacc gggaagagaa ggcggagggg agcgaagcg 39

<210>9

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

gaaaagctgg gttgagaggg cgaaaaagga tgaggttttt tc 42

<210>10

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

tcgagaaaaa acctcatcct ttttcgccct ctcaacccag cttttcccga ctcc 54

<210>11

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>11

gatccgcttc gctcccctcc ggcgtctctt gcgtggtctt cccggagtcg g 51

<210>12

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>12

gggaagacca cgcaagagac gccggagggg gcgaagcg 38

<210>13

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>13

gaacaccacg cttgagacgc cgaaaaagga tgaggttttt tc 42

<210>14

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>14

tcgagaaaaa acctcatcct ttttcggcgt ctcaagcgtg gtgttcccga ctcc 54

<210>15

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>15

cttccccttc accgctcccc actgatctgc acccctttcc tccccatac 49

<210>16

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>16

gtatggggag gaaaggggtg cagatcagtg gggagcggtg aaggggaag 49

<210>17

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>17

cctgctagca tggactacaa agacgatgac gataaaatgg ccgggtggaa cgcctac 57

Claims

1.一种miR-320a的抑制剂的用途，用于制备抑制肿瘤细胞的组合物；

其中，所述的miR-320a的抑制剂是miR-320a的反义核苷酸；

其中，所述的肿瘤细胞是表达Pfn1蛋白的细胞。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤细胞是Pfn1蛋白表达后迁移性和/或侵袭性降低的细胞。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤细胞是乳腺癌细胞或肺癌细胞。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于提高肿瘤细胞中Pfn1的表达水平。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，miR-320a的反义核苷酸选自：

(a)序列如SEQ ID NO：1所示的反义核苷酸；或者

(b)序列与SEQ ID NO：1所示的序列具有90％以上的相同性、且具有(a)指定的反义核苷酸功能的反义核苷酸；或者

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制肿瘤细胞包括：抑制肿瘤细胞的迁移和/或侵袭。