CN102018959B

CN102018959B - 防治心脏疾病的方法和试剂

Info

Publication number: CN102018959B
Application number: CN200910195395A
Authority: CN
Inventors: 荆清; 李青; 宋晓伟; 邹俊
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Priority date: 2009-09-09
Filing date: 2009-09-09
Publication date: 2012-09-12
Anticipated expiration: 2029-09-09
Also published as: CN102018959A

Abstract

本发明涉及防治心脏疾病的方法和试剂。公开了一种TWF-1抑制剂的用途，用于制备预防或治疗心脏疾病的组合物；还公开了miR-1的用途，用于制备抑制twf-1基因表达的组合物；还公开了筛选预防或治疗心脏疾病的潜在物质的方法。本发明首次揭示了miR-1可特异性地抑制twf-1基因表达，并且首次揭示了TWF-1蛋白的表达与心脏疾病密切相关，从而为心脏疾病的防治提供了新的靶点。

Description

防治心脏疾病的方法和试剂

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及防治心脏疾病的方法和试剂。

背景技术

心脏病是心脏疾病的总称，包括风湿性心脏病、先天性心脏病、高血压性心脏病、冠心病、心肌疾病等各种心脏病。心脏病是目前危害人类健康的主要疾病之一。

心脏在受到各种生理刺激，组织损伤或者内分泌失调的情况下会产生肥厚性生长以维持心脏血输出量。心肌肥厚在功能上是一个初始的适应性反应，但是持续的心肌肥厚会导致心衰和猝死。心肌肥厚是一个复杂的病理过程，伴随着心肌细胞蛋白含量增加，胎儿期基因重新表达，心肌细胞骨架重排。微丝骨架在心肌病的发病过程中发挥了重要的功能，不仅参与维持细胞形态完整性和机械阻力，而且参与了胞外信号向胞内的传导以调节心肌基因的表达和功能。

微丝骨架的动态变化受到多种微丝结合蛋白的调控。Twinfilin是一个在进化上很保守的微丝结合蛋白，在从酵母到哺乳动物的有机体中参与细胞骨架结构及其动态变化。Twinfilin与微丝单体高亲和力结合，抑制其结合到微丝增长端。它也可以与另一个保守的骨架调控子帽子蛋白结合于微丝末端。在细胞内，twinfilin呈现胞浆弥散定位，并且聚集于微丝骨架动态区。在出芽酵母中敲除twinfilin导致皮质微丝斑增多以及双极出芽方式异常。果蝇twinfilin基因突变导致依赖于微丝骨架的发育过程缺陷。哺乳动物中有两个twinfilin基因。Twinfilin-1(TWF-1)主要表达于非肌肉细胞；而twinfilin-2(TWF-2)主要表达于骨骼肌和心肌。在小鼠非肌细胞系中，过表达TWF-1引起应力纤维减少和蠕虫状异常纤维的出现。在培养的大鼠原代心肌细胞中，TWF-1呈点状胞浆定位，并沿肌纤维分布。然而，TWF-1在心肌疾病中的调控和功能尚不清楚。

最近，一种新的基因调控子，microRNA(miRNA)被报道在心肌肥厚中发挥重要功能。MiRNA是一类长18～22碱基的保守的单链非编码RNA。它们通过剪接mRNA或者抑制mRNA翻译参与基因表达负调控。Dicer是miRNA成熟过程中的一个关键RNase III内切酶。在新生小鼠心肌中特异敲除Dicer导致猝死和轻微的心肌重构，在成年小鼠心肌中敲除则导致心肌功能失调及肥厚相关基因的表达。最近研究表明一些miRNA，包括miR-133，miR-208，miR-195，和miR-1主动参与心肌细胞肥厚。其中，miR-1是一个肌组织特异的miRNA，在心脏的发育和分化过程中发挥重要功能。MiR-1也可通过调控心肌生长，电传导，钙离子依赖的信号通路参与心肌肥厚。然而，在心肌肥厚过程中miRNA是否参与心肌细胞骨架调控仍未证实。

因此，本领域还有必要研究心肌肥厚等心肌疾病的发生发展机制，进一步找到心肌疾病相关的药物靶点，从而为这类疾病的预防或治疗提供行之有效的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供防治心脏疾病的方法和试剂。

在本发明的第一方面，提供一种TWF-1抑制剂的用途，用于制备预防或治疗心脏疾病的组合物。

在一个优选例中，所述的TWF-1抑制剂选自：特异性干扰twf-1基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷酸；或特异性与TWF-1结合的抗体或配体。

在另一优选例中，所述的TWF-1抑制剂是miR-1。

在另一优选例中，所述的TWF-1抑制剂是特异性干扰twf-1基因表达的小干扰RNA分子，其序列如SEQ ID NO：15所示。

在另一优选例中，所述的组合物用于降低骨骼肌α-肌动蛋白基因(acta1)，β-肌球蛋白重链基因(myh7)或心房钠尿肽基因(nppa)的表达。

在另一优选例中，所述的组合物用于减小心肌细胞的大小。

在另一优选例中，所述的心脏疾病是心肌疾病。

在另一优选例中，所述的心脏疾病选自：心肌肥厚或心衰。

在本发明的另一方面，提供一种TWF-1的抑制剂，其是一种小干扰RNA分子，序列如SEQ ID NO：15所示。

在本发明的另一方面，提供一种miR-1的用途，用于制备抑制twf-1基因表达的组合物。

在一个优选例中，所述的miR-1的序列如下式所示：

N₁UGN₂AAUGUAAAGAAGUAUGUN₃N₄N₅N₆；

其中，N₁为A或无；N₂为G或A；N₃为A或无；N₄为U或无；N₅为C或U或无；N₆为U或无。

在另一优选例中，所述的miR-1的序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的另一方面，提供一种筛选预防或治疗心脏疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理表达TWF-1蛋白的体系；和

(2)检测所述体系中TWF-1蛋白的表达或活性；

其中，若所述候选物质可降低TWF-1蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗心脏疾病的潜在物质。

在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达TWF-1蛋白的体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中TWF-1蛋白的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达TWF-1蛋白的体系；

如果测试组中TWF-1蛋白的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)对照组，就表明该候选物是预防或治疗心脏疾病的潜在物质。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如表达TWF-1蛋白的NIH3T3细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防或治疗心脏疾病有用的物质。

在本发明的另一方面，提供一种预防或治疗哺乳动物心脏疾病的方法，所述方法包括：下调所述哺乳动物体内TWF-1蛋白的表达或活性。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.芯片分析人心脏miRNA表达谱。信号值代表芯片上五次重复的平均值。图中显示为23个信号值高于4000的miRNA。

图2.MiR-1在骨骼肌和心脏中高表达，并且特异表达在心肌细胞中，而在非肌肉细胞中几乎没有表达。A，Northern blot检测小鼠各组织中miR-1的表达水平。B，Real-time PCR检测大鼠的各组织中miR-1的表达水平。C，Northernblot检测miR-1在图中所示各种细胞类型中的表达。ECs，人冠状动脉内皮细胞。SMCs，人冠状动脉平滑肌细胞。心肌细胞和和成纤维细胞从成年大鼠的心脏中分离得到。D，Real-time PCR分析miR-1在大鼠心脏心肌细胞和成纤维细胞中的表达。

图3.使用生物信息学预测靶基因。A，miR-1与位于twf-1 3 UTR的结合位点的互补性及结合位点在人、小鼠和大鼠间的保守性分析。MBS，miR-1结合位点。B，Real-time PCR分析在小鼠(左)和大鼠(右)如图所示组织中twf-1和twf-2的表达水平。

图4.TWF-1是miR-1的一个靶基因。A，将包含twf-1或twf-2 3 UTR的荧光素酶报告质粒与所示miRNA表达质粒共同转染293T细胞进行荧光素酶报告基因实验。转染24小时后测定荧光素酶活性。B，将twf-1 3 UTR的miR-1互补位点进行点突变，突变的核苷酸用下划线表示。C，荧光素酶报告基因实验操作同A，报告质粒分别包含野生型(WT)或突变型twf-1 3 UTR。MBS1+2-MT，两个miR-1结合位点的同时突变。相对于空载体(vector)，^*P＜0.05，^**P＜0.01。D，过表达miR-1可降低TWF-1的蛋白水平，过表达miR-126对TWF-1的蛋白水平没有影响。用表达miR-1(Lenti-miR-1)或miR-126(Lenti-miR-126)的慢病毒感染NIH3T3细胞，挑选稳定表达的克隆。Mock表示没有感染慢病毒的NIH3T3细胞对照。通过Western blot检测TWF-1，TWF-2及GAPDH的蛋白水平。

图5.与miR-1的下调相反，TWF-1在肥厚的大鼠心脏中表达升高。对大鼠进行腹主动脉缩窄(AAC)或假手术(Sham)7天后，分离心脏进行分析。A，Sham及AAC大鼠心脏的H&E染色。标尺为2mm。B，Real-time PCR分析miR-1在Sham及AAC大鼠心脏的表达(Sham组n＝8，AAC组n＝9)。与sham组相比，^**P＜0.01。C，Northern blot分析miR-1在Sham及AAC大鼠心脏的表达，5.8srRNA为上样量对照。D，Western blot检测TWF-1在AAC大鼠心脏中表达上调。

图6.与miR-1的降低相反，TWF-1在肥大的心肌细胞中表达上调。A，α-actinin染色显示用100μmol/L苯肾上腺素(PE)处理48小时后，新生大鼠心肌细胞肥大。图示为confocal照片。标尺为10μm。B，细胞大小的定量分析。从各组中随机选择约200个用anti-α-actinin抗体标记的细胞进行细胞表面积计算。C，Real-time PCR检测PE处理的心肌细胞中miR-1表达水平降低。与对照(Control，未用PE处理的细胞)相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。D，Western blot检测TWF-1在PE处理的心肌细胞中表达上调。

图7.过表达miR-1或TWF-1对心肌细胞的影响。用表达miR-1的重组腺病毒(Ad-miR-1)或对照腺病毒(Ad-vector)感染心肌细胞12小时后用20μmol/LPE再处理36小时，收获细胞进行分析(A-C)。A，在PE处理的新生大鼠心肌细胞中过表达miR-1减小细胞大小。图示为α-actinin免疫荧光染色的confocal图片，标尺为10μm。B，细胞表面积定量分析。C，定量PCR结果显示miR-1抑制PE处理的心肌细胞中肥厚标志分子的表达。D，用表达twf-1的重组腺病毒(Ad-twf-1)或病毒载体对照(Ad-vector)感染新生大鼠心肌细胞48小时。α-actinin染色表明过表达TWF-1可增大心肌细胞大小。图示为confocal照片。标尺为10μm。E，细胞表面积定量分析。F，定量PCR分析感染Ad-twf-1或Ad-vector 48小时后心肌细胞肥厚标志分子的表达。与Ad空载体相比(Ad-vector)，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

图8.AAC一周后大鼠心脏明显肥厚。A，与sham组相比，AAC组大鼠心重/体重(HW/BW)升高。B，定量PCR检测心肌肥厚标志分子表达水平。Gapdh做内参。结果表示为与sham对照相比的倍数变化值(sham组n＝8，AAC组n＝9)。与Sham组对比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

图9.在培养的原代心肌细胞中过表达miR-1减小细胞大小。A，ad-miR-1感染的心肌细胞中miR-1的表达水平约为ad-vector感染的心肌细胞的10倍。B，α-actinin染色显示在心肌细胞中过表达miR-1减小细胞大小。图示为共聚焦照片。标尺为10μm。C，定量分析心肌细胞表面积。从各组中随机选择约200个用抗α-actinin抗体标记的细胞进行细胞表面积计算。与Ad空载体相比(Ad-vector)，^**P＜0.01。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示了miR-1可特异性地抑制twf-1基因表达，并且首次揭示了TWF-1蛋白的表达与心脏疾病密切相关，其高表达促进心肌肥厚，从而可诱发心衰等疾病。本发明为心脏疾病的防治提供了新的靶点。

MiR-1

microRNA-1(miR-1)为一种本领域已知的microRNA(miRNA)小分子，其对于调控RNA是有用的。然而，现有技术中对于miR-1结合的靶点目前并不清楚，对其功能也没有完整的阐述。

miR-1具有如N₁UGN₂AAUGUAAAGAAGUAUGUN₃N₄N₅N₆(其中，N₁为A或无；N₂为G或A；N₃为A或无；N₄为U或无；N₅为C或U或无；N₆为U或无)所示的序列。其可以被分离自细胞，或者可通过人工合成的方式获得。在得知了miR-1的序列后，本领域人员可以方便地制备获得miR-1。

TWF-1

Twinfilin-1(简写为TWF-1)是一种现有技术中已知的蛋白，保守地存在于许多哺乳动物中，属于Twinfilin家族的成员，主要表达于非肌细胞中。现有技术中对于TWF-1在心肌疾病中的调控和功能尚没有报导。

TWF-1蛋白的序列可以与GenBank登录号NP_032997.3所示的序列基本上相同，其编码分子可以与GenBank登录号GeneID：19230所示的序列基本上相同。TWF-1蛋白或基因可以被分离自细胞，或者可通过人工合成的方式获得。在得知了TWF-1蛋白或编码基因的序列后，本领域人员可以方便地制备获得TWF-1蛋白或基因。

MiR-1的用途

MiRNA参与心肌肥厚的多个方面包括心肌增殖，电传导和纤维化等。然而，miRNA是否参与心肌肥厚过程中心肌细胞骨架调控仍未见报道。通过miRNA芯片和小RNA文库测序的方法，本发明人确定了心脏和骨骼肌特异的microRNA-1(miR-1)是心脏表达丰度最高的miRNA。MiR-1主要表达于心肌细胞，在心脏的其他细胞包括心肌成纤维细胞仅有微量表达。通过生物信息学靶点预测，本发明人确认了细胞骨架调控蛋白TWF-1是miR-1的一个靶基因。过表达miR-1不仅可以降低包含TWF-1 3非翻译区的荧光素酶活性，并且可以降低内源性TWF-1的表达，说明TWF-1是miR-1的直接靶基因。在大鼠肥厚的心脏左室和苯肾上腺素诱导的肥大的心肌细胞中，miR-1表达显著下调，与之相对应，TWF-1的蛋白水平表达升高。此外，在肥大的心肌细胞中过表达miR-1可减小细胞大小，并降低肥厚特异标志分子的表达水平。相反地，在心肌细胞中过表达twinfilin-1可增大细胞大小，并促进肥厚特异标志分子的表达。因此，本发明证明了细胞骨架调控蛋白TWF-1是miR-1的一个新的靶基因，心脏在受到肥厚性刺激后，miR-1的降低引起TWF-1的表达上调，从而通过调控心肌细胞骨架导致心肌肥厚。

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种miR-1的用途，用于制备抑制twf-1基因表达的组合物。TWF-1蛋白的高表达可引起心脏疾病(特别是心肌疾病，如心肌肥厚、心衰等)的发生。因此，很显然，可通过抑制twf-1基因表达来达到预防或治疗这些疾病的目的。

TWF-1抑制剂及其用途

本发明人在深入研究后发现细胞骨架调控蛋白TWF-1是miR-1的直接靶基因。在心肌肥厚过程中，伴随miR-1的下调，TWF-1表达上调。在心肌细胞中过表达miR-1可抑制苯肾上腺素(PE)诱导的肥大表型。本发明人还进一步证明了TWF-1的上调可促进心肌细胞肥大。

因此，本发明还提供了TWF-1抑制剂的用途，用于制备预防或治疗心脏疾病的组合物。所述的心脏疾病特别是心肌疾病。所述的心脏疾病选自但不限于：心肌肥厚或心衰。

如本文所用，所述的TWF-1的抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。任何可降低TWF-1蛋白的活性、降低TWF-1蛋白的稳定性、抑制TWF-1蛋白的表达、减少TWF-1蛋白有效作用时间、抑制TWF-1蛋白的分泌、或抑制TWF-1的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于预防或治疗心脏疾病的有效物质。所述的TWF-1的抑制剂也可以是经过修饰的形式。

在得知了TWF-1对于心脏疾病的作用后，本领域人员可以方便地得知TWF-1抑制剂可以通过抑制TWF-1来防治心脏疾病的发生或发展。因此，任何TWF-1的抑制剂都可用于本发明。根据TWF-1的特性，本领域人员可以获得多种TWF-1的抑制剂。

所述的TWF-1的抑制剂例如包括但不限于：特异性结合TWF-1蛋白的抗体或配体；特异性干扰twf-1基因表达的小干扰分子，如siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸等。

作为本发明的优选方式，所述的TWF-1的抑制剂是miR-1；或是序列与miR-1的序列具有80％以上的相同性(较佳地具有85％以上的相同性，更佳地具有90％以上的相同性，最佳地具有95％以上的相同性，如具有96％、97％、98％或99％以上的相同性)的miRNA；或是序列与miR-1序列在严格条件下杂交的miRNA；它们均具有miR-1相同的功能。如本文所用，所述的“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：1所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

所述的TWF-1的抑制剂可以是twf-1的反义核苷酸。如本文所用，“反义核苷酸”又称为“反义核酸”或“反义寡核苷酸(AS-ONs，antisense-oligonucleotides)”或“反义药物”，是指长度约为15-24个碱基的DNA分子、RNA分子它们的经修饰的形式或它们的类似物，可与mRNA互补。从理论上来讲，根据反义技术获得的反义分子可用于治疗任何由基因表达或者基因缺失引起的疾病。所述的“反义核苷酸”还包括经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义核苷酸的活性、稳定性或治疗效果。对反义核苷酸的修饰包括但不限于：甲氧基化修饰、锁核酸修饰、肽核酸修饰、硫代修饰、磷酸骨架由磷脂连接骨架代替。

作为本发明的优选方式，所述的TWF-1的抑制剂是特异性针对于TWF-1的mRNA的小干扰RNA(siRNA)。如本文所用，术语“RNA干扰(RNAinterference，RNAi)”是指一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，也被称为RNA干预或者RNA干扰。RNA干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默，它是体内抵御外在感染的重要保护机制之一。简要地说，RNA干扰包含一个由小型干扰RNA(siRNA)所激发的机制，造成靶mRNA的降解。如本文所用，术语“小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径(RNA interference pathway)。

作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果良好的twf-1的小干扰RNA分子，所述的小干扰RNA分子具有SEQ ID NO：15(GGGAAAUACCGACUUCUAA)所示的序列。可特异性的干扰twf-1基因的表达，干扰效果良好。

本发明对小干扰RNA的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了本发明所提供的siRNA的序列以后，可以以各种途径方便地制备或表达所述的小干扰RNA。例如，在本发明的一种优选例中，所述的小干扰RNA是化学合成的。

小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

所述的小干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

此外，小干扰RNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链和反义链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它们可以从生成的转录物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链小干扰RNA。

筛选方法

在得知了所述的TWF-1与心脏疾病的相关性后，可以基于该特征来筛选调节TWF-1的表达或活性，进而可预防或治疗心脏疾病的物质。

因此，本发明提供一种筛选可用于预防或治疗心脏疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达TWF-1的体系接触；和检测候选物质对TWF-1的影响；若所述候选物质可降低TWF-1的表达或活性，就表明该候选物是预防或治疗心脏疾病的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到TWF-1的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达TWF-1的体系。

本发明还提供一种筛选预防或治疗心脏疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：将候选物质与包含miR-1和TWF-1mRNA的体系接触，并检测miR-1与TWF-1mRNA的结合情况；如果miR-1与TWF-1mRNA的结合在统计学上低于对照组，就表明该候选物是预防或治疗心脏疾病的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到miR-1与TWF-1mRNA的结合的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的包含miR-1与TWF-1mRNA的体系。

所述的体系包括(但不限于)：溶液体系、亚细胞体系、细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于预防或治疗心脏疾病真正有用的物质。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于预防或治疗心脏疾病的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出真正有用的物质。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效量的所述的TWF-1抑制剂，以及药学上可接受的载体。

所述“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

本发明的TWF-1抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：TWF-1抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的TWF-1抑制剂每天以约0.001-100mg/kg(优选的为0.01-20mg/kg)动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以2-4次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为0.005-100mg，较佳地约为0.008-50mg。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

任何适用的给药途径都是可以的，包括但不限于：口服、静脉内注射、皮下注射、肌肉给予、局部给予、植入、缓释给予、心脏内给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料和方法

RNA制备

人心脏总RNA购于Ambion，Inc.，小鼠、大鼠组织以及培养细胞的总RNA用TRIzol(Invitrogen)抽提。

MiRNA芯片

MiRNA表达谱通过人miRNA芯片(LC Sciences，Houston，TX)测定。该芯片包括718个人的成熟miRNA探针(Sanger miRBase，release 10.1)。

小RNA文库构建

小RNA克隆文库构建：用15％的变性聚丙烯酰胺胶电泳分离人心脏总RNA，回收长度在18-到25-nt范围内的RNA。将回收产物连接一个5末端磷酸化的3接头(5pUUUaaccgcgaattccagx：大写，RNA；小写，DNA；p，磷酸；x，3-氨基-修饰C-7)和一个5接头(5acggaattcctcactAAA：大写，RNA；小写，DNA)。用3引物(5-GACTAGCTGGAATTCGCGGTTAAA(SEQ ID NO：3))和5引物(5-CAGCCAACGGAATTCCTCACTAAA(SEQ ID NO：4))进行RT-PCR。回收后，PCR产物的3端用Taq酶在72℃处理15分钟加A，缓冲液为标准PCR反应液。将产物稀释3倍后直接连入T载体(购自Takara)。随机挑选克隆通过PCR验证有插入片段，并送公司测序。

Northern Blot检测miRNA

取40μg总RNA进行15％的聚丙烯酰胺胶电泳，转至Hybond-N+(Amersham Biosciences)尼龙膜。紫外交联后预杂交30分钟，继而用γ-³²P标记的特异探针杂交12小时。洗去探针，洗两次，每次10分钟，然后在-80℃X-ray胶片曝光。

定量PCR(RT-PCR)

组织及细胞的总RNA用Super Script II反转录为cDNA，以oligo-dT为引物反转录mRNA，用特异茎环结构引物反转录miRNA。用SYBR Green(TOYOBO Co)的方法进行实时定量PCR。

生物信息学分析

MiR-1潜在靶基因预测用miRanda算法(参见John B等，Human MicroRNAtargets.PLoS Biol.2004；2(11)：e363.分析。mRNA3非翻译区(UTR)的miR-1结合位点通过RNA-hybrid(参见Rehmsmeier M等，Fast and effective prediction ofmicroRNA/target duplexes.Rna.2004；10(10)：1507-1517.程序预测。

质粒构建及特异位点突变

以人基因组DNA为模板，通过PCR扩增miR-1(上游引物：GCAGATCTCTTCTCTACATCGCAGTG(SEQ ID NO：5)；下游引物：GAGATCTTTTTGTCCACCAACGCCCAGGC(SEQ ID NO：6))或miR-126(上游引物：GCAGATCTTTGCCCGGAGCCTCATATC(SEQ ID NO：7)；下游引物：CGAAGCTTTTTCAGAGGTCTCAGGGCTATGC(SEQ ID NO：8))的前体序列，将PCR产物分别以BglII/BglII和BglII/HindIII酶切后装入psuper载体(购自Ambion)，构建过表达质粒。

荧光素酶报告基因质粒构建如下：以小鼠基因组为模板，通过PCR扩增twf-1(上游引物：GCCCTAGGTGAGCTGACTGCGGATT(SEQ ID NO：9)；下游引物：GCCCTAGGTCGTTAGTAGGGTTACAGGATC(SEQ ID NO：10))或twf-2(上游引物：TTGGGTACCGCCACAAGCGCCTCATCC(SEQ ID NO：11)；下游引物：GCCGAGATCTAATACAGCATTCAACCATCCCTTC(SEQ ID NO：12))的全长3UTR，分别以AvrII/AvrII和KpnI/BglII酶切后，装入PGL3载体(购自Promega)荧光素酶基因的3UTR。

Twf-1 3UTR中miR-1结合位点突变的荧光素酶报告基因质粒采用QuikChange site-directed mutagenesis试剂盒(Stratagene)定点突变。

细胞培养

人原代冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)，内皮细胞(HCAEC)，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购于Cascade Biologics Inc.Oregon，USA。细胞培养用由生产厂商提供的添加生长因子的特殊培养液。293T，293A，293FT和NIH3T3(分别购自ATCC)用添加10％胎牛血清的Dubecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)培养。

荧光素酶报告基因试验

将荧光素酶报告质粒和miRNA表达质粒共同转染293T细胞，转染24小时后收获细胞，用双荧光素酶检测试剂盒(Promega)检测荧光素酶活性。荧光素酶检测仪型号为Lumat LB9507

Western Blot

Western blotting具体操作流程按照常规方法。Anti-TWF-1和anti-TWF-2的抗体制备见参考文献(Vartiainen MK等，Mammals have two twinfilinisoforms whose subcellular localizations and tissue distributions are differentiallyregulated.J Biol Chem.2003；278(36)：34347-34355.)。Anti-GAPDH抗体购于GenScript。

大鼠心肌肥厚模型

以体重为150-180克雄性Sprague-Dawley大鼠为实验动物，采用腹主动脉缩窄(AAC)制作大鼠心肌肥厚模型(参见Ruetten H等，Concentric leftventricular remodeling in endothelial nitric oxide synthase knockout mice bychronic pressure overload.Cardiovasc Res.2005；66(3)：444-453.。简言之，用水合氯醛(0.2mg/g)麻醉大鼠，开胸后分离腹主动脉，用4-0尼龙绳将之束缚于24号枕头。取出针头后缝合切口。假手术组(Sham)对照包括除了动脉缩窄的其他手术操作。手术后给大鼠连续注射3天青霉素，每天2次。手术1周后处死大鼠。

组织学分析

取sham和AAC组大鼠心脏，用4％多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋。石蜡切片(4μm)后用苏木精&伊红染色(H&E)，观察分析。

腺病毒和慢病毒构建

重组腺病毒的构建，扩增和滴度测定如文献所述(参见He TC等，Asimplified system for generating recombinant adenoviruses.Proc Natl Acad Sci U SA.1998；95(5)：2509-2514.)。以GCCTCGAGAGCAGAGTGGCATTGATGG(SEQID NO：13)和AAGCTTGAAGGTCACCCTCCTGGAA(SEQ ID NO：14)为引物，从大鼠基因组DNA扩增miR-1的前体序列，以XhoI/HindIII酶切后装入pAdTrack-CMV载体(Qbiogene，USA)构建pAdTrack-CMV-miR-1质粒。从质粒pPL 144(参见Vartiainen MK等，Mammals have two twinfilin isoforms whosesubcellular localizations and tissue distributions are differentially regulated.J BiolChem.2003；278(36)：34347-34355.)上酶切下小鼠twf-1 cDNA片段装入pAdTrack-CMV载体KpnI/HindIII酶切位点构建pAdTrack-CMV-twf-1。将pAdTrack-CMV-miR-1或pAdTrack-CMV-twf-1与pAdEasy(购自Qbiogene，USA)同时转化BJ5183菌株重组产生ad-miR-1和ad-twf-1病毒载体。用Pac I线性化后，转染293A细胞包装重组腺病毒。病毒滴度用病斑形成实验测定。

慢病毒构建以改造过的pLentiLox 3.7载体(参见Sun C等，SIRT1improvesinsulin sensitivity under insulin-resistant conditions by repressing PTP1B.CellMetab.2007；6(4)：307-319)为骨架，将miR-1或miR-126的前体序列克隆入该载体的BamHI/XhoI位点，与包装质粒VSVG和Δ8.9(参见Sun C等，SIRT1improves insulin sensitivity under insulin-resistant conditions by repressing PTP 1B.Cell Metab.2007；6(4)：307-319)共转染入293FT细胞包装过表达miR-1或miR-126的病毒。

原代心肌细胞培养及腺病毒感染

新生大鼠心肌细胞分离于1-3天的Sprague-Dawley大鼠。分离心脏，用0.2％的胰酶在37℃摇床上(100rpm)消化。细胞分散后首先通过离心富集心肌细胞，然后通过差速贴壁进一步去除非肌细胞。用添加BrdU的含20％胎牛血清的DMEM，以3-5×10⁵/ml的密度将心肌细胞铺入培养板。铺板48小时后，改为无血清培养，用感染复数(MOI)为100的腺病毒感染心肌细胞。48小时后，收获细胞，进行形态学观察，RNA或蛋白表达分析。

成年Sprague-Dawley大鼠的心肌细胞和成纤维细胞用Langendorff方法分离。大鼠麻醉后迅速取出心脏，在含Ca²⁺的Krebs-Henseleit(KH)溶液中洗5分钟，再用没有Ca²⁺的KH溶液终止心脏自发收缩。用含0.05％胶原酶的KH溶液灌流20分钟，然后分离心室，在KH溶液中剪碎。孵育20分钟后，用尼龙筛过滤细胞上清。而后在含6％牛血清白蛋白的199培养液中沉淀，将心肌细胞从其它细胞中分离出来。心脏呈纤维细胞分离。

细胞免疫荧光及细胞表面积分析

4％多聚甲醛细胞固定15分钟后用0.1％Triton X-100通透15分钟，5％山羊血清室温封闭1小时，以1∶500稀释度加入anti-α-actinin抗体(Sigma)4℃孵育过夜。用PBS洗三遍后加入Alexa-555(Molecular Probes)标记的二抗，室温孵育1小时。细胞核用4，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)标记，最后封片。细胞表面积用软件AxioVision 4.7.1(Carl Zeiss，Inc)进行计算。Confocal照片用Olympus confocal microscope(FV 1000)拍摄。

统计学分析

所有的试验重复了至少三次。数据以平均值±标准误表示。对于相对基因表达分析，对照组的平均值定义为1。用非配对Student’s t test进行数据统计分析。Sigma plot程序用于数据分析。P＜0.05为显著差异。

II.实施例

实施例1、人心脏miRNA表达谱分析

关于哪个miRNA在心脏表达丰度最高，以往不同实验室的研究结果有所不同。因此，本发明人用小RNA芯片的方法进行了人心脏总RNA中miRNA的表达谱分析。在检测的718个人miRNA中，只有236个miRNA被检测到。在检测到的miRNA中，信号值在1000以上的41个为心脏表达丰度较高的miRNA。图1显示了信号值高于4000的23个miRNA。其中，miR-1信号值最高，说明miR-1为心脏中表达量最高的miRNA。几个miRNA家族包括let-7，miR-26，miR-126和miR-133表达丰度也较高。

实施例2、心脏富集的miRNA鉴定及心脏miRNA序列末端异质性

为验证心脏富集的miRNA，本发明人用人心脏总RNA构建了一个小RNA文库，并测序所得到的小RNA克隆。在测序的251个克隆中，113个(45％)为已知miRNA序列，其余小RNA克隆为rRNA，tRNA，mRNA以及人基因组重复序列片段(数据未显示)。在miRNA克隆中，本发明人确定了27个不同的miRNA，其中15个克隆到多次，其余12个仅克隆到一次。克隆所得的大多数miRNA(22/27)都在上文的芯片数据结果的高丰度miRNA列表中，说明通过两种方法所得结果的一致性。重要的是，miR-1的克隆数占总miRNA克隆数的24％(27/113)，说明至少在本发明人的研究中miR-1确实是心脏丰度最高的miRNA。

进一步分析表明，与miRBase(release 13.0)中miRNA的成熟序列相比，本发明人克隆到的miRNA具有丰富的序列多态性，包括3和5末端碱基删除或延长。部分序列变异见表1。例如，27个miR-1克隆的5个在3末端AU缺失，2个在5末端多一个A。MiR-126最普遍的变异体是5末端的U缺失。总体上，3末端变异(46.9％)远远高于5末端变异(21.2％)；当A或U为最末端碱基时3末端碱基缺失更为突出。

表1

其中，miRBase中的成熟miRNA序列加下划线表示，同时显示了成熟miRNA序列侧翼的几个核苷酸。非模板或突变的核苷酸用小写字母表示。

接下来，在小鼠组织中进行Northern验证。结果发现，MiR-1为心脏和骨骼肌特异表达。另外，在大鼠组织中验证结果与在上述小鼠组织中结果一致。见图2。

实施例3、心脏丰度最高的miRNA即MiR-1特异表达于心肌细胞

Northern blot结果表明，miR-1特异表达于心脏和骨骼肌(图2A)，在大鼠(图2B)和小鼠组织中，定量PCR进一步证明了miR-1的心脏特异表达。为了进一步分析miR-1在心脏各个细胞类型的表达谱，本发明人分离了大鼠心脏的心肌细胞和成纤维细胞，并检测了miR-1的表达水平。通过Northern blot方法，miR-1主要在心肌细胞检测到，而在成纤维细胞未检测到(图2C)。定量PCR分析得到类似的实验结果(图2D)。在培养的原代心血管细胞包括人冠状动脉平滑肌细胞，内皮细胞(图2C)和人脐静脉内皮细胞以及一些非心肌细胞系：293T，HeLa，小鼠胚胎成纤维细胞中，均未检测到miR-1的表达。因此本发明人的结果表明，miR-1是心肌细胞特异表达的miRNA。

实施例4、Twf-1是miR-1的靶基因

已知miRNA通过抑制其靶基因表达行使功能。因此，本发明人通过生物信息学方法寻找miR-1的潜在靶基因。结合几种算法，twf-1被选为miR-1的可能靶基因。RNA-hybrid program(参见Rehmsmeier M等，Fast and effectiveprediction of microRNA/target duplexes.Rna.2004；10(10)：1507-1517)(图3A)预测到在twf-1 3 UTR有两个miR-1结合位点(图中标记为MBS1和MBS2)。与miR-1互补的种子序列在人、小鼠和大鼠中高度保守，表明miR-1与twf-1关系的普遍性。在哺乳动物细胞中有一个twf-1的同源基因twf-2，在其3UTR没有miR-1的结合位点。有趣的是，这两个转录本具有不同的组织表达谱(图3B)：twf-1是非肌组织包括肝，肺和肾等的主要表达形式，而在心肌和骨骼肌仅有少量表达，其表达谱与miR-1的表达谱呈反相关关系；相反的，twf-2主要表达于心肌和骨骼肌，并且与miR-1的表达谱没有类似关系。

为了验证miR-1是否通过3UTR调控twf-1的表达，本发明人构建了包含小鼠twf-1或twf-2 3 UTR的荧光素酶报告基因质粒。过表达miR-1(其序列为UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU(SEQ ID NO：1))可显著降低包含twf-13UTR的荧光素酶活性，而过表达miR-126没有改变包含twf-1 3 UTR的荧光素酶活性。而miR-1和miR-126过表达都不能降低包含twf-2 3 UTR的荧光素酶活性(图4A)。为确定miR-1对荧光素酶活性的抑制是由哪个潜在miR-1结合位点所介导的，本发明人用点突变的方法分别或同时突变了twf-1 3 UTR的两个MBS(图4B)。结果显示，每一个MBS突变都可以部分解除miR-1对荧光素酶活性的抑制效应。当两个MBS同时突变时，miR-1对荧光素酶活性的抑制效应几乎全部消失(图4C)。因此miR-1对荧光素酶活性的抑制主要由这两个MBS介导，且这两个MBS作用相当，但仍不能排除其它潜在MBS的存在。

为证明miR-1是否能抑制内源性TWF-1的蛋白表达，本发明人用表达miR-1(Lenti-miR-1)(表达出的miR-1序列为UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU(SEQ ID NO：1))或者miR-126(Lenti-miR-126)(表达出的miR-126序列为UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG(SEQ ID NO：2))的慢病毒感染NIH3T3细胞(内源性TWF-1表达较高)，并建立了稳定表达miR-1或miR-126的细胞系。正如预期的，TWF-1的蛋白表达水平在感染Lenti-miR-1的细胞系中明显降低，而在感染Lenti-miR-126的细胞系中没有明显变化。过表达miR-1或对内源性TWF-2蛋白水平没有影响(图4D)。

综上所述，本发明人的结果表明，twf-1是miR-1的直接靶基因，并且miR-1对twf-1的抑制作用由其3UTR介导。

实施例5、在肥厚的大鼠心脏和PE-诱导的肥大的心肌细胞中，相应于miR-1的下调，TWF-1表达升高

为了阐明miR-1与心肌肥厚相关，本发明人首先在大鼠腹主动脉缩窄(AAC)的心肌肥厚模型中检测了心脏miR-1的表达水平。在缩窄一周后，大鼠心脏体重比明显升高(图8A)，HE染色表明，与假手术(sham)组相比缩窄组(AAC)大鼠心脏明显肥厚(图5A)。一些肥厚的标志物包括心房钠尿肽(nppa)，骨骼肌和心肌α-肌动蛋白(acta1和actc1)，α-和β-肌球蛋白重链(myh6和myh7)同时通过定量PCR方法检测。与预期结果一致，acta1，myh7和nppa表达上调，而myh6表达下调(图8B)。定量PCR结果表明，miR-1在肥厚左室的表达水平比假手术组降低36％(图5B)。Northern blot进一步证明了miR-1在肥厚的心脏表达下调(图5C)。为了研究miR-1对TWF-1的抑制作用在心肌肥厚过程中是否有病理意义，本发明人检测了肥厚左室的TWF-1表达水平。TWF-1的蛋白水平明显升高(图5D)。

此外，本发明人用苯肾上腺素(PE)处理心肌细胞，诱导心肌细胞肥大。处理48小时后，心肌细胞表面积变大(图6A，B)，说明心肌细胞肥大。定量PCR结果显示，与对照相比，在肥大的心肌细胞中miR-1的表达水平降低了30％(P＜0.05；图6C)。与此相应的，内源性TWF-1蛋白水平在PE诱导的肥大的心肌细胞中升高(图6D)。这些结果说明，在心肌肥厚病理过程中miR-1对TWF-1的表达去抑制。

实施例6、过表达miR-1可减轻PE诱导的心肌细胞肥大

为了进一步研究miR-1对心肌细胞肥大的作用，本发明人构建了表达miR-1的腺病毒(Ad-miR-1)(表达出的miR-1序列为UGGAAUGUAAAGAAGUGUGUAU(SEQ ID NO：1))，感染心肌细胞后检测miR-1的过表达水平，腺病毒空载体(Ad-vector)作为对照。定量PCR结果证明，Ad-miR-1感染的心肌细胞内miR-1的水平比内源性高10倍(图9A)。

心肌细胞用Ad-miR-1或Ad-vector感染12小时后，继而用PE处理36小时。过表达miR-1抑制了由PE刺激引起的细胞表面积增大(图7A，B)。而且，在没有PE刺激的情况下，miR-1过表达可减小细胞的基本大小(图9B，C)。

这些结果表明，miR-1过表达可影响心肌细胞形态和结构，可能是通过调节细胞骨架。为确定miR-1对心肌细胞肥大在分子水平的影响，本发明人检测了肥厚标志分子acta1，myh7和nppa。这3个基因在Ad-miR-1感染的细胞中的表达明显降低(图7C)。

综上所述，本发明人的结果提示，miR-1水平的升高可抑制心肌肥厚，并支持miR-1具有抗肥厚功能的观点。

实施例7、过表达TWF-1促进心肌细胞肥大

为检测TWF-1水平升高是否足以引起心肌肥厚，本发明人构建了表达TWF-1的腺病毒(Ad-twf-1)，并感染了新生大鼠心肌细胞。感染48小时后，与空载体感染的细胞相比，Ad-twf-1感染的心肌细胞表面积增大(图7D，7E)。接下来，肥厚标志分子在Ad-twf-1或Ad-vector感染的心肌细胞的表达水平通过定量PCR进行检测。结果表明，感染Ad-twf-1后，nppa的表达水平明显升高(图7F)，说明TWF-1水平的升高可直接促进心肌细胞肥大的病理过程。

实施例8、twf-1的小干扰RNA抑制心肌细胞肥大

基于twf-1的mRNA序列，本发明人设计合成了多条针对twf-1的siRNA，结果找到了干扰效果良好的siRNA，其序列如下：

GGGAAAUACCGACUUCUAA(SEQ ID NO：15)；

首先用PE处理新生大鼠心肌细胞，诱导心肌细胞肥厚，然后将上述siRNA常规方法转染该细胞，以转染阴性对照siRNA(序列为UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(SEQ ID NO：16))心肌细胞作为对照。结果发现，与对照组相比，siRNA转染的细胞内TWF-1的表达显著下降，并且心肌细胞明显减小。

实施例9、筛选方法

设置：测试组：NIH3T3细胞(内源性TWF-1表达较高)，并给予候选物质；对照组：NIH3T3细胞，不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中TWF-1的表达情况，并进行比较。如果测试组中TWF-1的表达在统计学上低于(如低50％或更低)对照组，就表明该候选物是抑制心脏疾病的潜在物质。

将miR-1和对照control-miR(miR-126)分别作为候选物质，加入到NIH3T3培养物中，观察胞内TWF-1的表达情况。

结果发现，miR-1可有效地降低TWF-1蛋白的表达，而control-miR不能有效地降低TWF-1的表达。

讨论

MiRNA在心脏功能调控的多个方面发挥了重要功能。在本发明中，通过miRNA芯片的方法检测了心脏miRNA表达谱，并获得了一些在人心脏表达的miRNA。心脏高丰度表达的miRNA通过小RNA克隆文库和Northern blot方法进行了验证。结果显示，miR-1是心脏丰度最高的miRNA，且miR-1仅在心肌细胞表达。重要的是，本发明确认了一个微丝结合蛋白TWF-1是miR-1的直接靶基因，并证明了miR-1水平的下调及由其引起的TWF-1的升高会导致心肌肥厚。

有趣的是，本发明揭示了心脏表达的miRNA成熟序列具有大量的末端多态性。这类末端序列变异在其它物种和组织中也曾有过报道，但是本发明人所观察到的多态性较以往报道更为丰富：所得克隆的68.1％都有3或5末端多态性。这些序列末端多态性可能反映了Drosha或Dicer的不精确剪切。而且，3末端多态性出现次数比5末端高，可能由于这两个酶剪切的不精确性或者3末端易于降解。非模板性核苷酸的增加说明在心脏中，Drosha和Dicer剪切后有其他酶参与修饰miRNA末端序列。近年来，新发展的深度测序(deepsequencing)可用于大规模探索新的miRNA。这个高通量的方法可获得大量的小RNA序列以发现低丰度的miRNA.，并且确认miRNA的序列末端多态性。

MiR-1是心脏丰度最高的miRNA，本发明进一步证明了miR-1特异表达于心肌细胞，说明miR-1可能对心肌细胞的形态和/或功能调节有重要的意义。在本发明中，发现miR-1在AAC肥厚的大鼠心脏和PE诱导的肥大的心肌细胞中明显下调。结果过表达miR-1可减轻心肌细胞的肥大表型，结合以前的文献报道明确表明miR-1对心肌肥厚的抑制作用，miR-1水平的降低可导致心肌肥厚。

众所周知，miRNA通过调控多个靶基因行使其功能。因而，寻找靶基因对理解miRNA调控各种生物学过程的机制至关重要。本发明通过应用多种方法证明了细胞骨架调控蛋白TWF-1是miR-1的一个新的靶基因。首先，通过生物信息学分析，在twf-1的3UTR有两个MBS位点。其次，TWF-1在心脏表达水平很低，与miR-1在心脏的高表达水平相反。再次，过表达miR-1可显著降低包含twf-1 3 UTR的报告基因的荧光素酶活性。此外，在NIH3T3细胞中过表达miR-1可降低内源性TWF-1的蛋白水平。更重要的是，在肥厚的心脏和肥大的心肌细胞中，相应于miR-1水平降低，TWF-1蛋白水平的升高。综上所述，本发明的结果提示在心肌肥厚的病理过程中miR-1直接靶向TWF-1。而且，在心肌细胞中过表达TWF-1可诱导心肌细胞肥大。因而本发明首次证明了TWF-1水平升高会诱发心肌肥厚。因为TWF-1是一个微丝单体结合蛋白，调控细胞骨架结构和动力学变化。在培养的新生大鼠原代心肌细胞中TWF-1沿肌丝分布，所以TWF-1可能通过调控微丝细胞骨架参与心肌肥厚。

总之，本发明确认了一些心脏高表达的miRNA，并报道了这些miRNA序列末端的多态性。心肌细胞特异的miRNA，miR-1在肥厚的心脏和肥大的心肌细胞中下调。在肥大的心肌细胞中升高miR-1的水平抑制心肌细胞肥大的表型。细胞骨架调控蛋白TWF-1被确认为miR-1的靶基因，TWF-1水平升高可导致心肌细胞肥大。因此，本发明人推测在肥厚因子的刺激下miR-1表达下调，引起TWF-1表达上调，从而通过调控细胞骨架导致心肌肥厚。本发明人的结果揭示了miRNA调控细胞骨架可作为进一步研究心肌肥厚分子机制的新方向。因此，在心肌细胞中适当操控TWF-1的水平有助于防止心肌肥厚的发生和发展。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>防治心脏疾病的方法和试剂

<130>094274

<160>15

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>1

uggaauguaa agaagugugu au 22

<210>2

<211>22

<212>RNA

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>2

ucguaccgug aguaauaaug cg 22

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

gactagctgg aattcgcggt taaa 24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

cagccaacgg aattcctcac taaa 24

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

gcagatctct tctctacatc gcagtg 26

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

gagatctttt tgtccaccaa cgcccaggc 29

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

gcagatcttt gcccggagcc tcatatc 27

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

cgaagctttt tcagaggtct cagggctatg c 31

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

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<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

gccctaggtg agctgactgc ggatt 25

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

gccctaggtc gttagtaggg ttacaggatc 30

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>引物

<400>11

ttgggtaccg ccacaagcgc ctcatcc 27

<210>12

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<223>引物

<400>12

gccgagatct aatacagcat tcaaccatcc cttc 34

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>13

gcctcgagag cagagtggca ttgatgg 27

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>14

aagcttgaag gtcaccctcc tggaa 25

<210>15

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>小干扰RNA

<400>15

gggaaauacc gacuucuaa 19

<210>16

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>小干扰RNA

<400>16

uucuccgaac gugucacgut t 21

Claims

1.一种TWF-1抑制剂的用途，用于制备预防或治疗心脏疾病的组合物；所述的TWF-1抑制剂是小干扰RNA分子，序列如SEQ ID NO：15所示。

2.如权利要求1的用途，其特征在于，所述的心脏疾病是心肌疾病。

3.如权利要求1的用途，其特征在于，所述的心脏疾病选自：心肌肥厚或心衰。

4.一种TWF-1的抑制剂，其是一种小干扰RNA分子，序列如SEQ ID NO：15所示。