CN102499987A - miR-1在制备治疗原发性青光眼制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种miR-1在制备治疗原发性青光眼制剂中的应用、miR-1在制备抑制人眼小梁网细胞细胞增殖试剂中的应用、miR-1在制备抑制人眼小梁网细胞细胞粘附试剂中的应用、miR-1在制备增强人眼小梁网细胞的迁移能力的试剂中的应用、miR-1在制备抑制人眼小梁网细胞中纤维连接蛋白的表达水平的试剂中的应用。本发明在观察氧化应激状态下的小梁网细胞中miR-1的表达情况的基础上，证明了miR-1对小梁网细胞增殖、迁移、粘附功能的调节作用，并进一步确定了miR-1直接靶定FN，确定了miR-1对POAG的治疗价值。

Description

miR-1在制备治疗原发性青光眼制剂中的应用

技术领域

本发明属于眼病治疗药物领域，尤其是一种miR-1在制备治疗原发性青光眼制剂中的应用。

背景技术

原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)是常见的致盲性眼病之一，以进行性视神经损害和视野缺损为特征，迄今为止，其发病机制尚未完全清楚，限制了治疗手段的发展。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约22nt，对细胞内基因表达进行转录后调控的高度保守的非编码单链RNA分子。成熟的miRNA可以作为一种引导性分子，依据碱基互补配对原则，与靶mRNA结合而在转录后水平引起靶mRNA的剪切或翻译抑制。目前的研究表明，miRNA不仅参与生物体的正常发育，在疾病的发生和发展中也起着极为重要的作用。miRNA的发现和运用，为人类了解疾病的发生机制提供了新的线索，并为治疗疾病提供新的手段。

原发性开角型青光眼的发病原因可能与小梁网细胞从小梁支架上的脱落、丢失有关，而小梁细胞的脱落、丢失等异常改变则可能会阻塞小梁网网眼，影响房水流出通道的通畅性。目前有研究发现原发性开角型青光眼患者小梁网组织中纤维连接蛋白(FN)积聚过多，提示这也可能是网发病原因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种miR-1在制备治疗原发性青光眼制剂中的应用，本发明通过miR-1(microRNA-1)在氧化应激下的人眼小梁网细胞中的表达水平，miR-1对细胞增殖、粘附、迁移功能的调节作用，以及使用miR-1抑制细胞中纤维连接蛋白(FN)的表达水平来确定miR-1对原发性青光眼的影响，进一步确定miR-1在制备治疗原发性青光眼制剂中的应用。

本发明实现目的的技术方案如下：

miR-1在制备治疗原发性青光眼制剂中的应用。

miR-1在制备抑制人眼小梁网细胞细胞增殖试剂中的应用。

miR-1在制备抑制人眼小梁网细胞细胞粘附试剂中的应用。

miR-1在制备增强人眼小梁网细胞的迁移能力的试剂中的应用。

miR-1在制备抑制人眼小梁网细胞中纤维连接蛋白的表达水平的试剂中的应用。

本发明的优点和积极效果如下：

1、本发明通过上调miR-1，降低小梁网细胞增殖和粘附功能，从而减少细胞脱落；增强其迁移活性，从而降低脱落的细胞阻塞小梁网网眼的几率；降低小梁网细胞中FN的表达水平，减少小梁网基质的异常沉积，增加房水的回流，降低眼压，从而减少高眼压对视神经的损害，这对于POAG的治疗具有重要意义。

2、本发明在观察氧化应激状态下的小梁网细胞中miR-1的表达情况的基础上，证明了miR-1对小梁网细胞增殖、迁移、粘附功能的调节作用，并进一步确定了miR-1直接靶定FN，确定了miR-1对POAG的治疗价值。

附图说明

图1为本发明在氧化应激状态下的小梁网细胞中，miR-1的表达水平下调；

图2为本发明转染pcDNA3/pri-miR-1质粒后，miR-1成熟体在小梁网细胞中的表达水平显著上调；

图3为本发明在小梁网细胞中上调miR-1后，MTT实验显示细胞增殖能力下降；

图4为本发明在小梁网细胞中上调miR-1后，MTT粘附力实验显示细胞粘附能力下降；

图5为本发明在小梁网细胞中上调miR-1后，划痕实验显示细胞迁移能力显著增强，其中图5-1至5-4分别为0小时、12小时、24小时、36小时；

图6为本发明双荧光报告基因实验显示在小梁网细胞中miR-1直接靶定FN，图中的“+”表示添加该质粒，“-”表示未添加该质粒，对应的柱状图的值；

图7为本发明在小梁网细胞中上调miR-1后，FN的mRNA表达水平降低；

图8为本发明在小梁网细胞中上调miR-1后，FN的蛋白表达水平降低电泳图；

图9为本发明在小梁网细胞中上调miR-1后，FN的蛋白表达水平降低柱状图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明首先通过检测氧化应激状态下的小梁网细胞中miRNA-1的表达水平，了解模拟高眼压状态下miR-1的改变情况。用200μM的H₂O₂处理小梁网细胞24小时，提取RNA，实时定量PCR检测了miR-1的表达情况。结果发现，与正常小梁网细胞相比，miR-1在氧化应激状态下的小梁网细胞中显著下调，提示miR-1可能与POAG的发病中发挥调控作用。

本发明为了了解miR-1对细胞功能的影响，我们将miR-1的初始转录本pri-miR-1克隆到pcDNA3载体上，成功构建pcDNA3/pri-miR-1质粒。将质粒转染入小梁网细胞后，pri-miR-1将被剪切为成熟的miR-1，从而实现miR-1在细胞中的上调。然后检测了miR-1对细胞增殖、迁移、粘附功能的影响。结果表明，在氧化应激状态下的小梁网细胞中上调miR-1后，细胞增殖、对基质的粘附功能减弱，迁移能力增强。

本发明为了进一步了解miR-1发挥调控功能的途径，应用生物信息学方法对miR-1靶定的基因进行了初步预测，发现FN-一种小梁网基质的重要组成部分可能为miR-1的靶基因。接下来通过双荧光素报告基因实验进行了验证，证实在小梁网细胞中，miR-1直接靶定FN发挥调控作用。并在上调miR-1后，从基因水平和蛋白水平对FN进行了检测，证实上调miR-1可抑制FN的表达水平。

本发明通过上调miR-1：降低小梁网细胞增殖和粘附功能，从而减少细胞脱落；增强其迁移活性，从而降低脱落的细胞阻塞小梁网网眼的几率；降低小梁网细胞中FN的表达水平，减少小梁网基质的异常沉积，增加房水的回流，降低眼压，从而减少高眼压对视神经的损害，这对于POAG的治疗具有重要意义。

本发明在观察氧化应激状态下的小梁网细胞中miR-1的表达情况的基础上，证明了miR-1对小梁网细胞增殖、迁移、粘附功能的调节作用，并进一步确定了miR-1直接靶定FN，旨在寻找miR-1对POAG的治疗价值。

具体实验过程叙述如下：

实验1

在氧化应激状态下的小梁网细胞中，miR-1的表达水平的检测。

体外培养小梁网细胞并建立细胞氧化应激模型。细胞培养方法：采用冻存的3-6代小梁网细胞进行实验。15％胎牛血清DMEM培养基，0.25％(质量分数)胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)消化、传代。

氧化应激模型的培养：将细胞种于96孔板5000个/孔，37℃孵育过夜。24h后细胞融合约90-95％，200μmol/L H₂O₂处理24h，Trizol法提取小RNA。U6作为内参。

结果发现氧化应激状态下的小梁网细胞中miR-1的表达水平下调，比正常细胞下降40％，见图1。

实时定量PCR引物序列：

miR-1-Fwd：5’-GCCCGCTGGAATGTAAAGAAG-3’

U6-Fwd：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’

Reverse：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

反应体系为：

循环温度为：

进行数据处理分析，绘制柱状图

Folds＝2^-ΔΔCt

ΔΔCt＝(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)

Ct1：处理样品待测基因(miR-1)的临界循环数

Ct2：处理样品持家基因(U6)的临界循环数

Ct3：对照样品待测基因(miR-1)的临界循环数

Ct4：对照样品持家基因(U6)的临界循环数

实验2

转染pcDNA3/pri-miR-1质粒后，miR-1成熟体在小梁网细胞中的表达水平显著上调。

设空质粒对照组和实验组，每组设3个平行孔。以5ug pcDNA3或pcDNA3/pri-miR-1转染小梁网细胞后，以每孔3×10⁶个细胞接种于6孔培养板内，培养48h后，Trizol法提取小RNA。

U6作为内参。以实施例1中引物序列检测miR-1的表达水平。

实验结果显示，miR-1表达水平上升3.5倍，pcDNA3/pri-miR-1可有效上调miR-1在细胞中的表达。见图2。

实验3

设空质粒对照组和实验组，每组设3个平行孔。以1ug pcDNA3或pcDNA3/pri-miR-1转染小梁网细胞后，以每孔3×10⁴个细胞接种于96孔培养板内，培养48h后，加入MTT 20ul，4h后吸去培养液，每孔加入DMSO 150ul，振荡器上振荡5-10min，在酶标仪上分别测490nm和570nm处光吸收值(OD值)，进行统计学分析。

实验结果显示，上调miR-1后，小梁网细胞增殖能力下降。见图3。

实验4

设空质粒对照组和实验组。以每孔3×10⁶个细胞接种于6孔培养板内，以5ug pcDNA3或pcDNA3/pri-miR-1转染小梁网细胞，48小时后，消化细胞，计数。将0.1％gelatin铺于96孔板底部，60μl每孔，37℃孵育1小时，弃上清。将消化下来的细胞接种于96孔板，每孔1×10⁴个细胞，通过MTT实验分别于0h、1h、0.5h、1.5h、2h检测OD值。

实验结果表明，上调miR-1后，OD值于0.5h、1h、1.5h、2h均有统计学差异，细胞粘附能力下降。见图4。

实验5：

设空质粒对照组和实验组，每组设3个平行孔。以2μg pcDNA3或pcDNA3/pri-miR-1转染小梁网细胞后，以每孔2×10⁵个细胞接种于12孔培养板内，用10μl移液器枪头在孔底划痕，以opti-MEM孵育，分别在0h、12h、24h、36h拍照。

观察结果表明，在小梁网细胞中上调miR-1后，细胞的迁移能力增强。见图5-1至5-4。

实验6：

双荧光素报告基因实验。

构建绿色荧光蛋白质粒pcDNA3/EGFP-FN 3’UTR、pcDNA3/EGFP-FN 3’UTR mut及内参红色荧光蛋白质粒pCDNA3/EGFP。分为四组：1.空质粒对照组：转染pcDNA3和pcDNA3/EGFP-FN3’UTR；2.实验组：转染pcDNA3/pri-1和pcDNA3/EGFP-FN 3’UTR；3.突变组：转染pcDNA3/pri-1和pcDNA3/EGFP-FN 3’UTR mut；4.空质粒加突变组：pcDNA3和pcDNA3/EGFP-FN3’UTR mut。将对数生长期的小梁细胞接种于24孔板中，每组设立3个平行孔，转染细胞，培养48小时后进行荧光值的测定。用RIPA裂解细胞，取上清用于EGFP和RFP荧光值测定。

荧光值测定：运用荧光分光光度计，在激发光为488nm，发射光为507nm的条件下测量样品中EGFP的荧光值。在激发光为582nm，发射光为625nm的条件下测量样品中RFP的荧光值。

实验结果显示，空质粒组与实验组相比荧光值下降，有统计学差异；空质粒组与突变组荧光值相比无统计学差异；空质粒组与空质粒突变组荧光值相比无统计学差异。说明在小梁网细胞中，miR-1直接靶定FN。

实验7

设空质粒对照组和实验组，每组设3个平行孔。以5ug pcDNA3或pcDNA3/pri-miR-1转染小梁网细胞后，以每孔3×10⁶个细胞接种于6孔培养板内，培养48h后，Trizol法提取小RNA。β-actin作为内参。

实时定量PCR结果显示，上调miR-1后，FN在小梁网细胞中的mRNA表达水平下调。见图7。

引物序列：

FN-3’UTR-S：5’-CGCGGATCCAGTTGATAAGAGGAATTTG-3’

FN-3’UTR-A：5’-CGGAATTCTAAAGCTATCTCCATTAGTGAAG-3’

反应体系为：

循环温度为：

进行数据处理分析，绘制柱状图

Folds＝2^-ΔΔCt    ΔΔCt＝(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)

Ct1：处理样品待测基因(FN1)的临界循环数

Ct2：处理样品持家基因(β-actin)的临界循环数

Ct3：对照样品待测基因(FN1)的临界循环数

Ct4：对照样品持家基因(β-actin)的临界循环数

实验8

western blot：分两组：空质粒组(转染pcDNA3)，实验组(转染pcDNA3/pri-1)。分别转染细胞，待大瓶长满后用RIPA裂解蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳，western blot比较分析FN蛋白表达水平。

实验结果表明，在小梁网细胞中上调miR-1后，FN的蛋白表达水平下降。见图8和图9。

Claims (5)

1.miR-1在制备治疗原发性青光眼制剂中的应用。

2.miR-1在制备抑制人眼小梁网细胞细胞增殖试剂中的应用。

3.miR-1在制备抑制人眼小梁网细胞细胞粘附试剂中的应用。

4.miR-1在制备增强人眼小梁网细胞的迁移能力的试剂中的应用。

5.miR-1在制备抑制人眼小梁网细胞中纤维连接蛋白的表达水平的试剂中的应用。

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