CN101333529A - 抗HCMV UL122基因的siRNA序列及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗人巨细胞病毒UL122基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是：5’－GCGTGGAGCCTCAAAGAATTG－3’。本发明根据siRNA设计原则，选择的siRNA其cDNA序列的GC含量为52.4％，对应UL122 mRNA中1414－1434核苷酸位点；通过转化大肠杆菌后提取质粒，转染AD293细胞，可有效抑制UL122基因mRNA和蛋白表达水平，可在制备治疗人巨细胞病毒感染的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术，涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及针对人巨细胞病毒(HCMV)UL122基因的siRNA序列的设计、筛选及其在体内外抑制HCMV的应用。
背景技术
1.HCMV的治疗现状
HCMV属β疱疹病毒亚科，在人群中感染广泛，但大多为无症状的亚临床感染。HCMV感染在免疫功能低下的人群(如AIDS、器官移植患者等)中则可引起多系统的严重疾病，且可能与多种恶性肿瘤的发生有关。同时，HCMV也是导致先天畸形和新生儿出生缺陷的最主要的感染性因素。因此，防治HCMV感染一直是国内外医学关注的热点之一。目前，HCMV的治疗药物主要包括更昔洛韦(ganciclovir，GCV)、膦甲酸钠(fascarnet，FOS)和西多福韦(cidofovir，CDV)，但是由于药物毒副作用和HCMV耐药株的出现，急需探索新的治疗途径控制HCMV感染。
2.UL122基因及其表达蛋白的研究现状
HCMV的基因组表达具有一定时序性，可分为即刻早期(IE)、早期(E)和晚期(L)三种时相蛋白。主要IE基因UL122经过选择性剪接产生长度分别为2.25kb(外显子1，2，3，5)和1.70kb(外显子1，2，3，5’)的mRNA，分别编码IE286(86kDa，580个aa)和IE255(55kDa，425个aa)两种核磷蛋白。研究表明，UL122基因是HCMV的增殖必需基因，缺失UL122的HCMV突变株不能产生增殖性感染。UL122基因编码的IE286蛋白在病毒复制和调节宿主细胞周期等方面发挥关键作用。IE286不仅能够反式激活多种病毒和细胞的启动子，而且也能作为抑制子下调主要IE蛋白的表达。另外，IE286通过多种途径抑制被感染宿主细胞的凋亡，包括：与凋亡诱导因子p53结合使其失活；通过干扰p53的修饰抑制其激活；阻止不依赖p53的凋亡通路如TNF调节的死亡受体信号途径；诱导NF-κB转录，在适当条件下NF-κB通过诱导cIAPs阻止细胞凋亡。
3.RNA干扰的研究现状
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是序列特异的双链RNA(dsRNA)使细胞内同源mRNA降解，从而产生特异性基因表达沉默的过程。它是机体的一种小分子RNA介导的序列特异性免疫保护机制，可以对抗侵入性遗传因子的作用。自1998年首次被报道以来，RNAi技术以其特有的优越性而被迅速应用于抗病毒及其相关方面的研究中，目前已在HIV、HBV、HCV、流感病毒等的抗病毒研究中取得重要进展。
RNAi的作用主要由长约21～23nt的dsRNA介导，其中一类称为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，它和目的mRNA序列具有严格的配对，能引起相应mRNA降解。由于RNAi是siRNA靶向作用mRNA引起的特异性降解，因此要产生有效RNAi的关键是选择合适的siRNA作用靶点。目前RNAi靶点的选择原则可以概括为以下几点：①选择GC含量在50％左右的mRNA区域；②避免选择启动子起始部位下游50～100nt以内或终止子上游50～100nt内的区域；③避免超过三个G或三个C的重叠，因为多聚G或多聚C能形成类聚物而干扰RNAi的沉默机制；④选择以两个AA开始的序列，这将使合成siRNA更加容易；⑤保证靶序列与其他基因没有同源性。目前，制备siRNA的方法主要包括化学合成法、体外转录法、长片段dsRNA经RNase III降解法、siRNA表达载体转录法及PCR制备的siRNA表达框法等5种。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗人巨细胞病毒(HCMV)UL122基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是：5’-GCGTGGAGCCTCAAAGAATTG-3’。
本发明的另一个目的是提供该cDNA序列在制备治疗人巨细胞病毒感染的药物中的应用。
本发明根据siRNA设计原则，构建针对HCMV UL122基因的siRNA真核表达载体，选择的siRNA其cDNA序列的GC含量为52.4％，对应UL122 mRNA中1414-1434核苷酸位点；通过转化大肠杆菌后提取质粒，转染AD293细胞，可有效抑制UL122基因mRNA和蛋白表达水平，因此可应用于HCMV治疗药物的制备。
本发明的有益之处是：提供的siRNA序列针对HCMV的增殖必需基因UL122，目前国内外尚无以此基因作为RNAi靶点的报道。以此序列为基础的真核表达载体在细胞中能有效抑制UL122基因mRNA水平和蛋白表达水平，因此可作为HCMV治疗药物开发的一个新靶点。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步说明。
实施例一siRNA真核表达载体体外抑制UL122-EGFP融合蛋白的表达
1.siRNA的设计：根据siRNA设计原则，从UL122 mRNA起始密码子AUG下游100nt处搜索AA序列，其3’端相邻21nt序列作为候选靶点，从中选择GC含量在40～55％的siRNA序列，并通过GenBank数据库的Blast功能与人类基因组序列进行比对，确保无同源性。最终选择的siRNA其cDNA序列为5’-GCGTGGAGCCTCAAAGAATTG-3’，GC含量为52.4％，对应UL122 mRNA中1414-1434核苷酸位点。
2.表达siRNA所需shDNA的合成与制备：表达siRNA所需shDNA的正义链序列为5’-GATCCGCGTGGAGCCTCAAAGAATTGTTCGCAATTCTTTGAGGCTCCA CGCTTTTTA-3’，反义链序列为5’-AGCTTAAAAAGCGTGGAGCCTCAAAGAATTGCGAACAATTCTTTGAG GCTCCACGCG-3’，委托生物公司合成后，将正、反义链退火形成双链。
3.siRNA真核表达载体的构建：具有U6启动子的真核表达质粒pSilencer2.0-U6(美国Ambion公司)用BamH I和Hind III双酶切，与退火后的shDNA双链连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃培养过夜，挑取克隆抽提质粒送上海英骏公司进行DNA测序鉴定，选取测序结果正确的质粒扩增、保存。
4.siRNA表达质粒体外抑制UL122-EGFP融合蛋白表达的实验
(1)报告质粒pUL122-EGFP：为表达绿色荧光蛋白(EGFP)和UL122融合蛋白的质粒，由UL122基因cDNA插入pEGFP-N1(美国Clontech公司)的Hind III和EcoR I位点构建而成，由于EGFP位于UL122的下游，且共用一个启动子，故EGFP的表达情况可间接反映UL122的表达。
(2)siRNA表达质粒与报告质粒共转染AD293细胞：人胚肾细胞AD293接种12孔细胞培养板后，待细胞达到80％～90％融合率，用Invitrogen公司Lipofectamine 2000试剂将siRNA表达质粒与报告质粒pUL122-EGFP共转染细胞，操作方法参照试剂说明书，同时设转染空质粒pSilencer 2.0-U6的阴性对照组和不转染质粒的空白对照组，5小时后换培养液(含10％新生牛血清的DMEM)继续培养。
(3)荧光定量RT-PCR检测AD293细胞中UL122 mRNA的表达：质粒转染后48h，收集AD293细胞，Trizol法抽提细胞总RNA，采用TAKARA公司的SYBR PrimeScript RT-RCP Kit检测病毒UL122的mRNA，实验方法参照试剂盒说明书。UL122基因PCR 引物序列为：上游5’-CGGCTGTATCGTGATCTCTG-3’，下游5’-CAGGAGGAGGAAGACGAAGA-3’。内参照采用GAPDH，PCR引物序列为：上游5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。结果显示，与阴性对照组相比，siRNA表达质粒对UL122mRNA表达的抑制率为48.2％。
(4)流式细胞仪检测AD293细胞中UL122蛋白表达情况：质粒转染后72h，收集每孔内细胞，用PBS缓冲液洗涤2次后重悬于PBS中。用流式细胞仪在488nm激发波长下检测每孔细胞平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)及荧光阳性细胞比率α，计算每孔细胞的总荧光强度(total fluorescenceintensity，TFI)＝MFI×α。结果显示，与阴性对照组相比，siRNA表达质粒对UL122蛋白表达的抑制率为53.5％。
本发明系结合最佳实施例进行描述，在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价形式同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围内。
本发明涉及的序列
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据HCMV UL122基因设计的siRNA的cDNA序列
<400>1
GCGTGGAGCC TCAAAGAATT G 21
<210>2
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>制备UL122基因siRNA所需shDNA正义链的序列
<400>2
GATCCGCGTG GAGCCTCAAA GAATTGTTCG CAATTCTTTG AGGCTCCACG CTTTTTA 57
<210>3
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>制备UL122基因siRNA所需shDNA反义链的序列
<400>3
AGCTTAAAAA GCGTGGAGCC TCAAAGAATT GCGAACAATT CTTTGAGGCT CCACGCG 57
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>UL122基因PCR上游引物序列
<400>4
CGGCTGTATC GTGATCTCTG 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>UL122基因PCR下游引物序列
<400>5
CAGGAGGAGG AAGACGAAGA 20
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GAPDH基因PCR上游引物序列
<400>6
GAAGGTGAAG GTCGGAGTC 19
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GAPDH基因PCR下游引物序列
<400>7
GAAGATGGTG ATGGGATTTC 20
Claims (2)
1.一种抗人巨细胞病毒UL122基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是：5’-GCGTGGAGCCTCAAAGAATTG-3’。
2.权利要求1所述的cDNA序列在制备治疗人巨细胞病毒感染的药物中的应用。
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| CN102115794A (zh) * | 2009-12-30 | 2011-07-06 | 上海复星医学科技发展有限公司 | 含内参的hcmv荧光定量pcr检测试剂盒 |
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