CN115998868A - 核仁素在阻断猪繁殖与呼吸综合症病毒感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了核仁素在阻断猪繁殖与呼吸综合症病毒感染中的应用，属于生物技术领域。本发明发现了一个新的PRRSV细胞靶蛋白‑‑Nucleolin蛋白(NCL)，针对NCL的特异性的siRNA和NCL特异性亲和的单链寡核苷酸AS1411均能显著性的抑制PRRSV感染，二者联合应用能显著性的提高抗PRRSV感染能力。NCL的特异性的siRNA和AS1411可以开发成防治PRRSV感染的药物，从而为PRRVS研究和防治提供了一个全新的思路，扩大了研究范围，对实际生产有着极为重要的意义。

Description

核仁素在阻断猪繁殖与呼吸综合症病毒感染中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及核仁素在阻断猪繁殖与呼吸综合症病毒感染中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称为猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种急性传染病，该病主要特征为母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸困难，对养猪业造成巨大的经济损失。PRRSV分PRRSV-1(欧洲型)和PRRSV-2(北美型)两种类型病毒，在我国主要以PRRSV-2流行为主。

PRRSV基因组具有高变异性。我国于1996年首次报道并分离到第一株毒株CH-1a(1)，2007年出现了高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，2013年出现NADC30-like PRRSV，其临床检出率逐年升高，到2020年，NADC30-like型毒株占到临床分离毒株的50％以上。2017年NADC34-like PRRSV在我国出现，到2021年检出率明显升高。这些变异毒株的不断出现使PRRSV的流行形式变得错综复杂。更为严重的是这些新毒株与原有毒株、疫苗毒株可以重组产生毒力和免疫特性发生改变的新的毒株，致使现有疫苗的保护力不理想，加上缺乏有效药物，致病机制尚不完全清楚，使得该病更加难以防控。

核仁素(nucleolin，NCL)作为一种应激反应性RNA结合蛋白，可通过识别、结合特定mRNA的特殊基序(富含AU或G序列)或IRES元件来影响其稳定性和翻译活性，显著调控细胞增殖、肿瘤发生和病毒感染等过程。但目前还未见有核仁素在调控PRRSV感染方面的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供核仁素在阻断PRRSV感染中的应用。本发明研究发现，NCL具有促进PRRSV感染的作用，阻断NCL的功能可以抑制PRRSV感染，由此，本发明针对NCL设计了系列物质以阻断PRRSV感染，并取得了显著的效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供编码核仁素的基因作为靶标在制备抑制PRRSV感染的阻断剂。

优选的，所述编码核仁素的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：ATGGTGAAGCTCGCGAAGGCAGGTAAAAATCAAAGTGACCCCAAGAAAATGGCTCCTCCTCCAAAGGAGGTAGAAGAAGATAGTGAAGATGAAGAAATGTCAGAAGATGAAGAAGATGATAGCAGTGGAGAAGAGGTTGTCATACCTCAGAAGAAAGGCAAGAAGGCTGCTGCAACCTCAGCAAAGAAGGTGGTAGTTTCCCCAACAAAAAAGGTTGCAGTTGCCACACCAGCCAAGAAAGCAGCTGTCACTCCAGGCAAAAAGGCAGCAGCAACACCTGCCAAGAAGACAGTTACACCAGCCAAAGCAGTTGCCACACCTGGCAAGGAGGGAGCCACACCAGGCAAAGTATTGGTAGCAACCCCTGGTAAGAAGGGTGCTGCCATCCCAGCCAAGGGGGCAAAGAATGGTAAGAATGCCAAGAAGGAAGACAGTGATGAAGAGGAGGAGGATGACAGTGAGGAAGATGATGAGGATGATGAGGACGAAGATGAGGATGAAGATGAAATTGAACCAGCAGTGATGAAAGCAGCAGCTGCTGCCCCTGCCTCAGAGGATGAGGATGATGAGGATGATGAAGATGATGAGGATGAGGATGATGAGGAGGAGGAAGATGACTCTGAAGAAGAAGCTATGGAGACTACACCAGCCAAAGGAAGGAAAGCTGCAAAAGTTGTTCCTGTGAAAGCCAAGAACGTGGCTGAGGATGAAGATGAAGAAGAGGATGATGAGGACGAGGATGACGACGACGATGAAGATGATGAGGATGAAGATGATGATGATGAAGATGAGGAGGAAGAAGAGGAGGAGGAAGAGCCTGTCAAAGAAGCACCTGGAAAACGAAAGAAGGAAATGGCCAAACAGAAAGCAGCTCCTGAAGCCAAGAAACAGAAAGTGGAAGGCACAGAACCGACTACGGCTTTCAATCTCTTTGTTGGAAACCTAAACTTTAACAAATCTGCTCCTGAGTTAAAAACTGGTATCAGCGATGTTTTTGCTAAAAATGATCTTGCTGTTGTGGATGTCAGAATTGGTATGACTAGGAAATTTGGTTATGTGGATTTTGAATCTGCTGAAGACCTGGAGAAAGCCTTGGAACTCACTGGTTTGAAAGTCTTTGGCAATGAAATTAAACTAGAGAAACCAAAAGGAAAAGACAGTAAGAAGGAGCGAGATGCGAGAACGCTTTTGGCTAAAAATCTCCCTTACAAAGTTACTCAGGATGAATTGAAAGAAGTGTTTGAAGATGCTGCGGAGATCAGATTAGTCAGCAAGGATGGGAAAAGTAAAGGGATTGCTTATATTGAATTTAAGACAGAAGCTGATGCAGAGAAAACCTTTGAGGAAAAGCAGGGAACAGAGATTGATGGGCGATCTATTTCCCTGTACTATACCGGAGAGAAAGGTCAAAATCAAGACTATAGAGGTGGAAAGAATAGCACTTGGAGTGGTGAATCAAAAACTCTGGTTTTAAGCAACCTCTCCTACAGTGCAACAGAAGAAACTCTTCAGGAAGTATTTGAGAAAGCAACTTTTATCAAAGTACCCCAGAACCAAAATGGCAAATCTAAAGGGTATGCATTTATAGAGTTTGCTTCATTCGAAGATGCTAAAGAAGCTTTAAACTCCTGTAATAAAAGGGAAATTGAGGGCAGAGCAATCAGGCTGGAGTTGCAAGGACCCAGGGGATCACCTAATGCCAGAAGCCAACCATCCAAAACTCTGTTTGTCAAAGGCCTGTCTGAGGATACCACTGAAGAGACATTAAAGGAGTCATTTGACGGCTCTGTTCGGGCAAGGATAGTCACTGACCGGGAAACTGGGTCCTCCAAAGGGTTTGGTTTTGTAGACTTCAACAGTGAGGAGGATGCCAAAGCTGCCAAGGAGGCCATGGAAGATGGTGAAATTGATGGAAATAAAGTTACCTTGGACTGGGCCAAACCTAAGGGTGAAGGTGGCTTTGGGGGTCGTGGTGGAGGCAGAGGCGGCTTTGGAGGACGAGGTGGTGGCAGAGGAGGCCGAGGAGGATTTGGTGGCAGAGGCCGGGGAGGCTTTGGAGGGCGAGGCGGCTTCCGAGGAGGCAGAGGAGGAGGAGGTGACCACAAGCCACAAGGAAAGAAGACGAAGTTTGAATAG(SEQ ID NO.1)

本发明的第二方面，提供靶向核仁素编码基因的siRNA，所述siRNA的正义链如SEQID NO.2所示，反义链如SEQ ID NO.3所示；具体如下：

正义链：GGCGATCTATTTCCCTGTATT；(SEQ ID NO.2)

反义链：TACAGGGAAATAGATCGCCTT。(SEQ ID NO.3)

说明：上述标粗的“T”碱基也可全部替换成“U”碱基。

本发明的第三方面，提供上述siRNA在降低编码NCL基因的转录和/或降低核仁素的表达中的应用。

本发明的第四方面，提供上述siRNA在制备阻断PRRSV感染的药物中的应用。

本发明的第五方面，提供核仁素(NCL)作为影响PRRSV感染的靶蛋白在制备抑制PRRSV感染的阻断剂中的应用。

本发明的第六方面，提供NCL功能抑制剂在制备阻断PRRSV感染的药物中的应用。

优选的，所述NCL功能抑制剂为核酸适配体AS1411，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：

AS1411：TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG。(SEQ ID NO.4)。

上述核酸适配体AS1411为在已公开序列(26个碱基)的基础上获得的改进型核酸适配体(28个碱基)，其结构为T碱基-AS1411。可通过其与细胞外囊泡(evs)的偶联，提高evs的靶向性，有利于通过evs携带药物的功能治疗相关疾病。

本发明的第七方面，提供一种阻断PRRSV感染的药物，所述药物以上述siRNA和/或AS1411为有效成分。

优选的，所述药物由1μM的siRNA和2.5μM的核酸适配体AS1411按体积比1:1配制而成。

本发明研究发现，将靶向核仁素编码基因的siRNA和核酸适配体AS1411联合使用，与单独使用siRNA和核酸适配体AS1411相比，在阻断PRRSV感染方面具有显著的协同增效作用。

本发明的有益效果：

本发明发现了一个新的PRRSV细胞靶蛋白--NCL蛋白，并找到了该受体基因的特异性siRNA和亲和单链寡核苷酸AS1411，NCL蛋白能够参与PRRSV的感染，因此，敲低NCL基因或降低蛋白表达可显著的降低高致病性PRRSV(HP-PRRSV)、NADC30-like、重组毒(HP-PRRSV和NADC30-LIKE重组后形成的毒)感染细胞的能力；AS1411处理也能抑制PRRSV的感染。因此，针对NCL编码基因设计的特异性siRNA和AS1411可开发成防治PRRSV感染的药物。本发明为PRRS研究和防治提供了一个全新的思路，扩大了研究范围，对于实际生产有着极为重要的意义。

附图说明

图1：Marc-145细胞上siRNA-NC和siRNA-NCL对细胞毒性影响(A)、siRNA-NCL沉默效果检测(B)、对TA-12感染的real-time PCR(C)、Western blot(D)和病毒滴度TCID50(E)检测结果。

图2：Marc-145细胞上不同剂量AS1411及对照核酸适配体(cApt)24h和48h对细胞毒性影响(A)、AS1411在感染或不感染TA-12时对NCL影响real-time PCR(B)、先接种TA-12后用AS1411治疗的real-time PCR(C)、Western blot(D)和病毒滴度TCID50(E)检测结果。

图3：Marc-145细胞上AS1411在感染或不感染TA-12时对NCL影响real-time PCR(A)、AS1411先处理后接种TA-12的real-time PCR(B)、Western blot(C)和病毒滴度TCID50(D)检测结果。

图4：AS1411对不同类型PRRSV感染的影响。不同剂量AS1411对TA-01的预防real-time PCR和Western blot结果(A)，对TA-01的治疗real-time PCR和Western blot结果(B)。不同剂量AS1411对TA-02的预防real-time PCR和Western blot结果(C)，对TA-02的治疗real-time PCR和Western blot结果(D)。

图5：AS1411在PAM上对TA-12感染的预防real-time PCR(A)、Western blot(C)和治疗real-time PCR(B)、Western blot(D)。

图6：siRNA和AS1411组合使用对TA-12的影响。siRNA沉默后感染TA-12，再用AS1411处理对NCL的影响real-time PCR(A)，对TA-12的real-time PCR(B)和病毒滴度TCID50(C)检测结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如前所述，HP-PRRSV与PRRSV的普通株交叉免疫保护力低，给HP-PRRSV的预防和治疗带来了极大的困难。因此需要寻找新的防控该病的途径。以蛋白质组学为技术手段，寻找参与病毒感染过程的细胞蛋白，以这些细胞蛋白为靶标的药物或抑制剂的研究成为目前研究的热点。

在所有的真核细胞中，核仁素(又简称NCL，C23)是真核细胞核仁中最主要的一种蛋白质。发明人首次发现NCL蛋白可以作为影响HP-PRRSV感染的靶蛋白，NCL具有促进PRRSV感染的作用，阻断NCL的功能可以抑制PRRSV感染。

因此，以编码核仁素的基因或者核仁素作为靶标，开发设计NCL siRNA和NCL功能抑制剂，可以阻断或抑制HP-PRRSV的感染。

RNA干扰是由双链RNA诱发的同源mRNA特异性降解，主要通过设计对应基因的siRNA来实现，而设计的siRNA的优劣将显著影响RNA干扰的效果，进而影响试验的成败。本发明基于NCL基因(GenBank登录号：XM_015111344.2)的序列特征，并考虑靶结构对siRNA干扰效率的影响，预测出多个对NCL高干扰效率的siRNA，然后根据NCL蛋白的结构特征和靶点附近的局部特征，选出了NCL第566位siRNA基因沉默位点。

具体如下：

正义链：GGCGATCTATTTCCCTGTATT；(SEQ ID NO.2)

反义链：TACAGGGAAATAGATCGCCTT。(SEQ ID NO.3)

说明：上述标粗的“T”碱基也可全部替换成“U”碱基。

上述设计得到的siRNA的干扰效果优异，具有显著的抑制HP-PRRSV感染的效果。

AS1411是一种富含鸟嘌呤的核酸适配体，可形成G-四链体结构并因此具有很多特殊的生物活性。本发明在已公开AS1411序列(26个碱基)的基础上获得的改进型核酸适配体(28个碱基)，其结构为T碱基-AS1411。可通过其与细胞外囊泡(evs)的偶联，提高evs的靶向性，有利于通过evs携带药物的功能治疗相关疾病。

细胞蛋白NCL的siRNA和特异性亲和单链寡核苷酸AS1411可抑制上述病毒受体(靶蛋白)及受体特异性亲和单链寡核苷酸针对高致病性毒株(HP-PRRSV)(代表毒株为TA-12，GenBank的登录号为HQ416720)。该抑制剂主要抑制HP-PRRSV感染细胞。经过试验验证出NCLsiRNA及其特异性亲和单链寡核苷酸能够稳定地作为HP-PRRSV感染细胞的阻断剂，这在之前的研究中一直未见应用。

在本发明的一种实施方案中，给出了病毒靶细胞蛋白NCL蛋白及其特异性亲和单链寡核苷酸具体鉴定过程为：

根据NCBI公布的NCL(GenBank登录号：XM_015111344.2)设计SiRNA沉默位点序列，荧光定量和Western blot的结果显示，NCL基因沉默后能显著性的降低NCL的mRNA和蛋白的表达(见图1B、1D)，然后将基因沉默后接种HP-PRRSV，24h后收集样品，用real-time PCR、Western blot和TCID50法分别检测病毒拷贝数、病毒N蛋白表达量和上清培养液中病毒拷贝数。结果发现，沉默NCL基因后能显著的降低HP-PRRSV感染(见图1C、1D、1E)。

将AS1411在Marc-145细胞上做细胞毒性实验，最终选定0-5μM为安全浓度范围(图2A)，并选择在接种HP-PRRSV6h后用5μM的AS1411处理，24h后收取样品用real-time PCR、Western blot和TCID50进行检测，结果显示，5μM的AS1411处理能显著的降低HP-PRRSV感染(见图2C、2D、2E)。同时又先用5μM的AS1411预处理细胞6h，然后接种HP-PRRSV，24h后收取样品用real-time PCR、Western blot和Titration检测，结果显示，5μM的AS1411预处理能显著的降低HP-PRRSV感染(见图3B、3C、3D)。为进一步验证该结果，用1μM、2.5μM、5μMAS1411对TA-01和TA-02两毒株分别进行预防和治疗实验，结果表明，1μM和5μM的AS1411对TA-01感染细胞具有预防作用(见图4A)，1μM、2.5μM、5μM都对TA-01在细胞内的感染具有明显的治疗作用(见图4B)。1μM、2.5μM的AS1411处理对TA-02毒株能起到有效预防作用(见图4C)。1μM、2.5μM的AS1411处理对TA-02毒株的感染没有任何治疗作用，5μM的AS1411能极显著的抑制TA-02毒株的感染(见图4D)。

为进一步验证AS1411在HP-PRRSV感染过程中的作用，在PAM细胞上用1μM、2.5μM的AS1411进行预防和治疗实验，结果发现2.5μM的AS1411可以对TA-12的感染有预防作用(见图5A、5C)，1μM和2.5μM的AS1411都能对TA-12的感染有治疗的作用(见图5B、5D)。

通过以上研究发现了一个新的HP-PRRSV细胞靶蛋白，并找到了该受体的抑制靶点和特异性亲和单链寡核苷酸AS1411。对NCL基因进行干扰，或者利用AS1411处理均可对PRRSV感染细胞有显著的抑制作用，可开发成防治PRRSV感染的药物，从而为PRRS研究和防治提供了一个全新的思路，扩大了研究范围，对于实际生产有着极为重要的意义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。其中：本发明中所用的PRRSV毒株，HP-PRRSV型以TA-12株为代表，NADC30-like型以TA-01株为代表，重组毒(HP-PRRSV和NADC30-LIKE重组后形成的毒)型以TA-02株为代表。公众自申请日起20年内可从申请人处获得上述毒株以用于重复本发明。

实施例1：NCL的siRNA设计及其对PRRSV感染的影响

针对编码核仁素的基因(SEQ ID NO.1所示)选择第566基因沉默位点合成siRNA及其阴性对照序列(见表1)，合成序列用DEPC水稀释成1μM分装到无RNA酶的1.5mL离心管中，保存于-20℃。

选择状态良好的Marc-145细胞以1.5×10⁵个/mL密度铺于6孔板，等细胞密度为70％左右进行转染siRNA。根据

RNAiMAX Reagent说明书，每孔加入25μL浓度为1μM的siRNA分别进行转染siRNA，混匀，于37℃，5％CO2培养箱培养24h。弃旧细胞培养基，用预冷的PBS清洗细胞，用移液枪把全部细胞吹打下来，转移到新的离心管中，2000rpm离心3min，弃上清，留沉淀。用细胞裂解液裂解细胞收取蛋白进行Western blot验证，同时提取细胞RNA并进行反转录进行荧光定量PCR验证(荧光定量PCR所用的引物见表1)。

表1：研究所需的siRNA序列及引物序列

注：表1中，本发明中使用了Marc-145细胞和PAM细胞，Marc-145细胞是PRRSV的易感细胞系，来自于猴肾上皮细胞，PAM是原代猪肺巨噬细胞，这两个细胞系用于检测GAPDH的引物序列是不同的，所以分别列了出来。NCL的基因序列找的是人和猴共同保守的序列，只用于Marc-145细胞实验研究。

表1中siRNA中标粗的“T”碱基可全部替换成“U”碱基，后续实施例中所使用的siRNA NCL和NC均是将标粗的“T”碱基全部替换成“U”碱基。

细胞存活率的结果显示NCL第566位siRNA基因沉默后对细胞生长没有影响(图1A)。将NCL基因沉默后接种TA-12，24h后收集样品，用real-time PCR检测NCL的mRNA、TA-12病毒拷贝数(图1B、图1C)；Western blot检测NCL和TA-12病毒N蛋白表达量(图1D)；TCID50法检测上清培养液中TA-12病毒拷贝数(图1E)。结果表明：沉默NCL基因后能显著的降低TA-12感染。

实施例2：AS1411的制备及其对PRRSV的影响

(1)AS1411制备及对细胞活性影响

设计扩增AS1411及其对照序列cApt，具体序列如下所示：

AS1411：TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG。

对照(cApt)：TTCCTCCTCCTCCTTCTCCTCCTCCTCC。

用DEPC水稀释成100μM分装到无RNA酶的1.5mL离心管中，作为母液保存于-20℃。取100μM的母液稀释成不同浓度的AS1411(或cApt)工作液。选择状态良好的Marc-145细胞铺于96孔板，等细胞密度为70％左右时加入不同浓度工作液，分别在24h和48h时用CCK-8法测定AS1411对细胞毒性的影响(见图2A)，并发现0-5μM为无毒性的作用浓度。

(2)AS1411对TA-12的治疗作用

将状态良好的Marc-145细胞铺于6孔板，于37℃、5％CO₂培养箱培养24h后接种TA-12，接种病毒6h后每孔滴加25μl浓度为5μM的AS1411，并在处理后24h收取蛋白质、总RNA和上清培养液，并使用real-time PCR用引物对扩增TA-12的N基因，研究病毒感染情况。

对照组滴加等量、等浓度的cApt，其他处理保持一致。

结果表明，在不接毒或接种病毒的情况下AS1411处理不会影响NCL的mRNA变化(图2B)，却能显著降低TA-12在细胞内的感染(图2C)。用Western blot检测蛋白表达，也发现在对NCL不产生影响的情况下，AS1411处理能够抑制TA-12在细胞内的感染(图2D)。用TCID50方法检测到上清培养液中TA-12病毒拷贝数，AS1411组TA-12的拷贝数低于对照组(图2E)。

实施例3：AS1411的预处理对TA-12的预防作用

将状态良好的Marc-145细胞铺于6孔板，于37℃、5％CO₂培养箱培养24h后以5μM的浓度每孔滴加25μl的AS1411，处理6h后接种TA-12，在接种病毒后24h收取蛋白质、总RNA和上清培养液。分别用Western blot、real-time PCR和TCID50进行检测。

对照组滴加等量、等浓度的cApt，其他处理保持一致。

结果表明，在不接毒或接种病毒的情况下AS1411处理不会影响NCL的mRNA和蛋白质变化(图3A、3C)，AS1411预处理会抑制TA-12在细胞内的感染(图3B、3C、3D)。

实施例4：AS1411对TA-01/TA-02的预防和治疗作用

为进一步验证该结果，我们在浓度0-5μM之间选择了三个不同浓度，分别为1μM、2.5μM、5μM。并分别在TA-01和TA-02两种毒株上进行了如上述相同操作的AS1411对PRRSV治疗实验。

结果显示，1μM和5μM的AS1411对NADC30-like感染细胞具有预防作用，其中5μM时效果极显著(图4A)。1μM、2.5μM、5μM都对TA-01在细胞内的感染具有明显的治疗作用(图4B)。1μM、2.5μM的AS1411处理对TA-02毒株能起到有效预防作用(图4C)，5μM的AS1411没能产生作用。而对于治疗，1μM、2.5μM的AS1411处理对TA-02毒株的感染没有任何影响，5μM的AS1411却能极显著的抑制TA-02毒株的感染(图4D)。

实施例5：在PAM上AS1411对TA-12的影响

为了进一步验证该结果，取原代猪肺巨噬细胞(PAM)进行验证。将50日龄的SPF仔猪放血，结扎气管后无菌摘取其肺脏，先用高压灭菌后的PBS(加入1/25体积PBS的1640培养基和5×双抗)洗涤外表面，将pH7.2的PBS 30.0ml-50ml从气管灌入肺脏，轻轻拍打肺表面，1-2min后回收灌洗液，如此反复进行，直至灌洗液清亮为止。将回收的支气管肺泡灌洗液用吸管轻轻吹打，将细胞团块打散，用单层无菌100目不锈钢筛过滤，收集全部灌洗液，1500r/min离心5-10min，收集沉淀。用含有5×双抗的PBS洗涤两次，每次要轻轻混匀后离心。后加入适量含10％胎牛血清的1×RPMI1640(含有2×双抗)营养液吹散细胞，置培养瓶或培养皿中于37℃，5％CO₂培养箱中培养，待其贴壁后弃去上清及非粘附细胞继续用含10％胎牛血清的1×RPMI1640培养液培养备用。在PAM细胞上分别在接种病毒前和接种病毒后6h用AS1411处理，24h后收取样品，用real-time PCR和Western blot检测对TA-12感染的影响。

结果显示，2.5μM的AS1411接毒前处理可以抑制TA-12的感染(图5A、5C)，作为对照的1μM的AS1411处理没有产生影响。1μM和2.5μM的AS1411接毒后处理都能抑制TA-12的感染(图5B、5D)。

实施例6：AS1411和siRNA组合使用对TA-12复制的影响

将状态良好的Marc-145细胞铺于6孔板，于37℃、5％CO₂培养箱培养24h后，分别进行如下处理：

处理1(Si-NCL+AS1411)：以每孔25μl的量转染浓度为1μM的siRNA(Si-NCL)，继续放入细胞培养箱中培养24h后接种TA-12，接种后6h以2.5μM的浓度每孔滴加25μl的AS1411，继续放入细胞培养箱中培养18h，收取样品，用real-time PCR和TCID50检测对TA-12感染的影响。

处理2(Si-NCL+cApt)：以每孔25μl的量转染浓度为1μM的siRNA(Si-NCL)，继续放入细胞培养箱中培养24h后接种TA-12，接种后6h以2.5μM的浓度每孔滴加25μl的cApt，继续放入细胞培养箱中培养18h，收取样品，用real-time PCR和TCID50检测对TA-12感染的影响。

处理3(Si-NC+AS1411)：以每孔25μl的量转染浓度为1μM的siRNA(Si-NC)，继续放入细胞培养箱中培养24h后接种TA-12，接种后6h以2.5μM的浓度每孔滴加25μl的AS1411，继续放入细胞培养箱中培养18h，收取样品，用real-time PCR和TCID50检测对TA-12感染的影响。

处理4(Si-NC+cApt)：以每孔25μl的量转染浓度为1μM的siRNA(Si-NC)，继续放入细胞培养箱中培养24h后接种TA-12，接种后6h以2.5μM的浓度每孔滴加25μl的cApt，继续放入细胞培养箱中培养18h，收取样品，用real-time PCR和TCID50检测对TA-12感染的影响。

结果显示，siRNA和AS1411组合使用能降低NCL的mRNA表达(图6A)，siRNA和AS1411组合使用(处理1)相较于处理4对TA-12的抑制作用的改善效果，比siRNA和AS1411单独使用(处理2、处理3)相较于处理4对TA-12的抑制作用的改善效果之和还要优越(图6B、6C)。因此，siRNA和AS1411组合使用TA-12感染的防治具有协同增效作用。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.编码核仁素的基因作为靶标在制备抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的阻断剂。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述编码核仁素的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.靶向核仁素编码基因的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链如SEQ ID NO.2所示，反义链如SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求3所述的siRNA在降低编码核仁素基因的转录和/或降低核仁素的表达中的应用。

5.权利要求3所述的siRNA在制备阻断猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的药物中的应用。

6.核仁素作为影响PRRSV感染的靶蛋白在制备抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的阻断剂中的应用。

7.NCL功能抑制剂在制备阻断PRRSV感染的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述NCL功能抑制剂为核酸适配体AS1411，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

9.一种阻断猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的药物，其特征在于，所述药物以权利要求3所述的siRNA和/或核酸适配体AS1411为有效成分。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物由1μM的siRNA和2.5μM的核酸适配体AS1411按体积比1:1配制而成。

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